Laboratorní diagnostika bakteriálních infekcí GIT prasat MVDr. Ivana Kucharovičová Oddělení bakteriologie
Státní veterinární ústav Jihlava
Obsah přednášky 1) Správný odběr vzorků u infekcí GIT prasat 2) Výběr laboratorních metod a interpretace výsledků 3) Vybraná etiologická agens (+ bakteriologické diagnostické metody) infekcí GIT prasat
Státní veterinární ústav Jihlava
Komplexní diagnostika chorob GIT prasat ODDĚLENÍ bakteriologie
bakteriologická vyšetření virologická a sérologická vyšetření molekulárně-biologická vyšetření
virologie
histologická a imunohist. vyšetření
patologie
patologicko–anatomická vyšetření
chemie parazitologie krmiva
biochemická, toxikologická a hematologická vyšetření parazitologická vyšetření mikrobiologická, mykologická a chemická vyšetření
Výsledek vyšetření + interpretace, konzultace a návrh řešení.
Spolehlivá a včasná laboratorní diagnostika
nezbytná pro správnou volbu terapie, prevence a profylaxe
Výsledek laboratorní diagnostiky ovlivněn mnoha faktory: • odběrem a transportem vzorků • zpracováním a uchováváním vzorků • výběrem laboratorních metod
Odběr vzorků pro bakteriologické vyšetření - obecně Správné vzorkování musí být: • kvalitní (odběr a skladování) – jak?, do čeho?, kde?, při jaké teplotě? • správný počet vzorků – kolik? • reprezentativní popř. náhodné - jak? Dále je důležité: • načasování odběru – kdy? (vzhledem k průběhu onemocnění) • frekvence vzorkování – jak často? (někdy důležitější než počet vzorků) Před odběrem - správně definované cíle = proč? vyšetřuji (diagnostika choroby, monitoring) a k čemu bude vzorek sloužit (i virologie? parazitologie? PCR? apod.) => různé vzorkování za různým účelem
Kvalitní vzorek/ odběr je základem pro kvalitní diagnostiku Správné vzorkování = validní výsledek
Správný odběr vzorků: Kolik? Výpočet POČTU VZORKŮ (SAMPLE SIZE) pro diagnostiku: průkaz choroby/terénní infekce Požadované proměnné: • velikost (četnost) populace (hala/farma) • odhad prevalence (procento infikovaných zvířat) • požadovaná jistota detekce infekce - tzv. interval spolehlivosti nebo též konfidenční interval. Hodnota spolehlivosti (značená jako 1- α) se nejčastěji volí 0,95 (95 %) a udává pravděpodobnost, s níž je skutečná hodnota parametru XY nalezeným intervalem pokryta.
• citlivost používané metody - tzv. senzitivita – procento infikovaných zvířat, která jsou testem detekovaná (pozitivně) NEBOLI: pravděpodobnost, že test bude pozitivní u nemocných zvířat. Senzitivita < 100% je příčinou nesprávně (falešně) negativních výsledků.
Počet vzorků k potvrzení nákazy – Excel tabulka (včetně vlivu sensitivity použitého testu)
Velikost populace (ks) Požadovaná spolehlivost (95%) Citlivost metody (%) Předpokládaná prevalence (%) Počet vzorků (ks) n
n= α= D= N=
1 000 95% 90% 10% 32
potřebný počet vzorků požadovaná jistota detekce infekce (většinou 0,95) počet infikovaných zvířat (odhad prevalence) velikost (četnost) populace
Počet vzorků pro 95% jistotu detekce infekce (1 nebo více) s testem se 100% senzitivitou Prevalence (%) Velikost
populace
50
40
30
25
20
15
10
5
2
1
0.5 0.1
20
4
6
7
9
10
12
16
19
20
20
20
20
30
4
6
8
9
11
14
19
26
30
30
30
30
40
5
6
8
10
12
15
21
31
40
40
40
40
50
5
6
8
10
12
16
22
35
46
50
50
50
60
5
6
8
10
12
16
23
38
55
60
60
60
70
5
6
8
10
13
17
24
40
62
70
70
70
80
5
6
8
10
13
17
24
42
68
79
80
80
90
5
6
8
10
13
17
25
43
73
87
90
90
100
5
6
9
10
13
17
25
45
78
96
100
100
150
5
6
9
11
13
18
27
49
95
130
148
150
200
5
6
9
11
13
18
27
51
105
155
190
200
500
5
6
9
11
14
19
28
56
129
225
349
500
1000
5
6
9
11
14
19
29
57
138
258
450
950
5000
5
6
9
11
14
19
29
59
147
290
564 2253
10000
5
6
9
11
14
19
29
59
148
294
581 2588
∞
5
6
9
11
14
19
29
59
149
299
596 2995
Správný počet vzorků Používáme malé množství vzorků, abychom získali informace o velkém množství zvířat. Výsledek má zajistit relevantní informaci aplikovatelnou na celou populaci (halu, farmu). • statistika – určuje ideální počet vzorků • praxe – bere v úvahu také ekonomickou stránku Chovatel/majitel tlačí počet vzorků a frekvenci vzorkování dolů. Potom přichází klíčové otázky:
Kolik informací ztrácím? Jaká rizika vznikají snížením počtu vzorků (popř. frekvence) ?
Odběr vzorků pro bakteriologické vyšetření POSTMORTEM nebo INTRAVITÁLNĚ 1) POSTMORTEM:
• selata - 3 ks utracených selat s typickými klinickými příznaky nebo 3 čerstvě uhynulá selata; • střevo – vždy podvázané a samostatně balené v nepropustném obalu (sáček, kontejner): jejunum, ileum – 10 cm, colon ¼ až ½ • obsah střeva – cca 5 ml v uzavřeném kontejneru, trusovce, plný – vhodné pro anaerobní kultivaci • stěr ze střeva - do transportního media
DORUČIT ČERSTVÉ/CHLAZENÉ DO LABORATOŘE
Odběr vzorků pro bakteriologické vyšetření 2) INTRAVITÁLNĚ • trus: do kontejneru cca 25g trusu (2-3 polévkové lžíce) ü požadavek: čerstvý trus od konkrétního jedince ü vhodné spíše pro virologii (rota/koronaviry) a parazitologii ü nedoporučujeme směsovat (citlivost, kontaminace) • rektální výtěr: vždy do transportního media – nejčastěji: Amies medium a Cary–Blair, popř. spec. výtěrovky: floked swab, eSwab (Copan) aj.
výtěry s trasportním médiem doručit do 48 hod (20°C) do laboratoře
Výběr vhodných laboratorních metod metody laboratoř volí s ohledem na druh vyšetřovaného materiálu, citlivost testů a vybavenost laboratoře: • klasické bakteriologické metody • molekulárně biologické metody (PCR, Real-time PCR,…) ü přímý průkaz patogenu ü druhově specifické potvrzení bakteriálních izolátů ü stanovení faktorů virulence
• druhová identifikace hmotnostní spektrometrií MALDI-TOF Vhodná a správná kombinace přístupů klasické bakteriologie, MALDI-TOF, molekulární biologie a sérologie společně se správnou interpretací je cestou k úspěšné diagnostice.
Rodová a druhová identifikace mikroorganismů hmotnostní spektrometrií MALDI-TOF MS (Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization, s analyzátorem doby letu Time of Flight Mass Spectrometry)
rychlá a přesná identifikace izolovaných bakterií, plísní a kvasinek
MALDI-TOF MS • vzorek (tj. kolonie mikroorganismu) je druhově identifikován porovnáním jeho hmotnostního spektra s databází - obsahujíce tisíce referenčních molekulárních identifikátorů získaných pro jednotlivé referenční kmeny mikroorganismů kombinací hmotnostních spekter z opakovaných analýz.
• výstupem srovnávacího algoritmu je druhová identifikace mikroorganismu s přiřazenou hodnotou skóre vyjadřujícího shodu hmotnostního spektra vyšetřovaného vzorku s referenčním molekulárním identifikátorem v databázi MALDI Biotyper. • vlastní interpretaci výsledků provádí vždy mikrobiolog. (vyšetření se v některých případech neobejde bez dalších konfirmačních vyšetření)
MALDI-TOF MS Výhody metody: • vysoce přesná • aplikovatelná pro široké spektrum mikroorganismů • výrazně rychlejší ve srovnání s tradičními metodami (provedení samotné analýzy v řádu minut) • ekonomicky efektivní • robustní
Obecné zásady interpretace výsledků Před interpretací laboratorních výsledků je třeba znát mnohá fakta a to jak z laboratoře tak z terénu, jinak: nebezpečí nesprávné interpretace!
laboratorní výsledek ≠ diagnóza Data z terénu: • anamnéza? • věk zvířat? • fáze infekce? – akutní, chronická,.. • vzorkování? – původ vzorků, jak odebíráno, jak jsou vzorky staré,…
• prevalence? epizootologická situace
Data z laboratoře: • co test detekuje? antigen, NK,… • senzitivita testu? • specifita testu? • robustnost a opakovatelnost testu?
Etiologie bakteriálních infekcí GIT prasat Průjmová bakteriální onemocnění selat do věku 4 týdnů: • • • •
kolibacilóza - Escherichia coli – nástup v prvních dnech klostridiové enteritidy – C. perfringens typ A a C, C. difficile – v prvních dnech samonelóza - Salmonella sp. – nástup po prvním týdnu enterokokóza - Enterococcus durans
Průjmová bakteriální onemocnění prasat starších 4 týdnů: • • • • • •
kolibacilóza - Escherichia coli klostridiové enteritidy – C. perfringens typ A a C, C. difficile samonelóza - Salmonella sp. dyzentérie prasat - Brachyspira sp. proliferativní ileitida – Lawsonia intracelularis Yersinia sp.
Diagnostika Escherichia coli Postup: 1) detekce bakterie - základní a selektivní kultivační media: Krevní agar, Columbia agar, Endův agar, TSI, Mac Conkay ,chromogenní agary atd.
2) přesná identifikace E. coli – selektivní média , biochemické testy a MALDI MS
3) diagnostika faktorů virulence – PCR a sérotypizace CÍL = DETEKOVAT A IDENTIFIKOVAT PATOGENNÍ KMEN E.coli a následně provést testaci citlivosti na antimikrobiální látky cíleně pouze na patogenní kmen E. coli
Diagnostika faktorů virulence Escherichia coli exotoxiny, endotoxiny, fimbrie, intimin Metody: PCR a serotypizace PCR - detekce faktorů virulence metodou multiplex - PCR – průkaz genů = nositelů faktorů virulence. ü kvalitativní metoda - detekovány geny jednotlivých faktorů virulence v jedné reakci ü výhodou oproti sérologickým metodám je nezávislost na expresi antigenů in vitro, která je u některých fimbriových antigenů velmi slabá
Diagnostika faktorů virulence E. coli - průkaz genů pro jednotlivé faktory – kombinace 3 Multiplex PCR
Multiplex PCR I. : STEC (VTEC) Shiga-like toxin typ 1 (Stx1) – kódóván genem stx1 Shiga-like toxin typ 2 (Stx2) – kódóván genem stx2 STEC+EPEC adherenční faktor intimin eae – kódóván genem eaeA EHEC enterohemolysin – kódóván genem hlyA Multiplex PCR II. : ETEC termolabilní toxin LT termostabilní toxin typ A (STa) termostabilní toxin typ B (STb) Multiplex PCR III. : ETEC 5 fimbriálních adhezinů (pili) - F4(K88), F5(K99), 987P(F6), F41(F7), F18
Sérotypizace E. coli Sérotypy mají také souvislost s faktory virulence determinace: O - somatického antigenu (173) K - kapsulárního antigenu (80) H - bičíkového antigenu (56) F - fimbriového antigenu, adhezinu
METODA: rychlá sklíčková nebo pomalá aglutinace Komplikace: ü velké množství kmenů /sér – laboratoř většinou diagnostikuje jen některé ü ztráta faktorů virulence vázaných na plazmidy při práci s kmenem ü rozdílná kvalita a dostupnost antisér ü subjektivní posouzení výsledků
Interpretace diagnostiky E. coli NOSOLOGICKÉ JEDNOTKY
Vyhodnocení výsledků z laboratoře molekulárné biologie: ü negativní kmen - na nejfrekventovanější sledované faktory virulence - je to komenzál - antibiogram se neprovádí; ü pozitivní kmen - INTERPRETACE dle nosologických jednotek – provede se antibiogram, kmen se zamrazí, je k dispozici pro eventuální další vyšetření např. další diagnostiku, sérotypizaci, výrobu vakcíny apod.: ENTERÁLNÍ KOLIINFEKCE: • novorozená a sající selata - ETEC: Sta, Stb, Lta, Ltb • selata po odstavu - ETEC + EPEC: Sta, Stb, Lta, Ltb + eae intimin • edémová choroba - STEC (VTEC): Stx1, Stx2 EXTRAINTESTINÁLNÍ KOLIINFEKCE: • kóliseptikémie - SEPEC
Pozitivní typizace E. coli metodou PCR na SVÚ Jihlava patogenní E .coli
2012
2013
k 23.9.2014
2012 - 2014
STEC/VTEC
18,2
13,5
4,0
12,6
EPEC
27,3
23,0
28,0
25,8
ETEC
51,5
55,4
58,0
54,7
koinfekce
3,0
8,1
10,0
6,8
% pozitivních
E. coli - testace citlivosti na antimikrobiální látky 1) disková difusní metoda 2) stanovení MIC diluční metodou Problémy, které řeší laboratoře a terénní veterinární lékaři: Kritéria hodnocení pro veterinární patogeny: CLSI (USA – CLINICAL AND LABORATORY STANDARDS ISTITUTE), nebo humánní evropský EUCAST (European Commitee on Antimicrobial Susceptibility Testing) Rezistence bakterií k některým antimikrobiálním látkám • • •
indikační omezení ochranné lhůty nejsou k dispozici disky
Diagnostika Brachyspira sp. Brachypira hyodysenteriae
patogenní, vyvolává DYSENTERII PRASAT
Brachyspira pilosicoli
patogenní, vyvolává střevní SPIROCHETOZU prasat Ostatní druhy: Brachyspira murdorchii, B. innocens, B. intermedia, B. hampsonii PATOGENNÍ X NEPATOGENNÍ ? ü potencionálně patogenní ü možnost smíšených infekcí ü diferenciální diagnostika
Diagnostika Brachyspira sp. VZOREK: kadáver, tlusté střevo, trus anaerobně odebraný – plná vzorkovnice bez přístupu vzduchu, rektální výtěr. Kvalitní vzorek – základ úspěšné laboratorní diagnostiky!
Laboratorní diagnostické postupy:
1. Mikroskopické vyšetření trusu, histologické vyšetření 2. Sérologické vyšetření (imunoblotting, ELISA) 3. Detekce původce - kultivační vyšetření (izolace, purifikace) 4. Identifikace původce - biochemicky (zdlouhavé a ne vždy přesné) - molekulárně biochemickými metodami - PCR - MALDI-TOF (vlastní knihovna) 5. Testace citlivosti k antimikrobiálním látkám – MIC (jen některé laboratoře)
• komerčně připravené desky – např. VetMIC Brachy • časově a kultivačně náročné
Důležité - NRL Praha: 99% kmenů B.hyodysenteriae je rezistentní k TYLANU = zákaz používat TYLAN
Diagnostika Brachyspira sp. Molekulárně biologické vyšetření 1) real-time PCR – primární test – citlivější a specifičtější než konvenční PCR 2) konvenční PCR – přímý průkaz nebo konfirmační test kultivační metody • 2 nezávislé testy na B. hyodysenterie a B. pilosicoli 3) PCR-RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) ve druhém kroku (RFLP) restrikční analýzou probíhá druhová diferenciace (všechny kmeny)
Diagnostika Lawsonia intracelluraris proliferativní enteropatie prasat, ileitida prasat • INTRACELULÁRNÍ BAKTERIE Důležitý je kvalitní odběr vzorku! = samostatný odběr (střevo, trus, rektální výtěr) Laboratorní diagnostické postupy: 1) histologické a mikroskopické vyšetření 2) kultivační vyšetření (5 laboratoří na světě) - DOSUD SE JI NEPODAŘILO VYKULTIVOVAT na nebuněčných kultivačních mediích 3) nested PCR – základní detekční metoda 4) sérologie (ELISA Ab, IFAT, IPMA) 5) testace citlivosti k antimikrobiálním látkám • neexistuje MIC • použití ABT jen empiricky: VALNEMULIN, LINCOMYCIN, TYLAN, TYLVALOSIN
Diagnostika Salmonella sp.
VZOREK: Post-mortem – střevo, játra, MU Intra vitam – trus, rektální výtěr, nebo vzorky z prostředí – stěry apod. Laboratorní diagnostické postupy: 1. DETEKCE PŮVODCE – kultivace a PCR 2. IDENTIFIKACE (podezřelé) ü chromogenní agar ü biochemická identifikace ü MALDI-TOF ü sérologická identifikace sklíčkovou aglutinací 3. SEROTYPIZACE/FAGOTYPIZACE (Kaufmann-White systém) 4. TESTACE CITLIVOSTI k ANTIMIKROBIÁLNÍM LÁTKÁM
Diagnostika Salmonella sp. TESTACE CITLIVOSTI K ANTIMIKROBIÁLNÍM LÁTKÁM a) disková difusní metoda b) stanovení MIC diluční metodou Problémy současné doby: ü rezistence – multirezistence. ü léčba antibiotiky – pouze zmírnění příznaků onemocnění – malá účinnost léčby. Kritéria hodnocení pro veterinární patogeny: CLSI (USA – CLINICAL AND LABORATORY STANDARDS ISTITUTE ) nebo humánní evropský EUCAST (European Commitee on Antimicrobial Susceptibility Testing)
Diagnostika klostridiových infekcí VZOREK: rektální výtěr v transportním médiu, trus, střevo (anaerobní prostředí) Clostridium perfringens typ A: ENTERITIDIS Clostridium perfringens typ C: NEKROTICKÁ ENTERITIDA Clostridium difficile Laboratorní diagnostické postupy: 1. DETEKCE PŮVODCE 2. IDENTIFIKACE 3. DETEKCE TOXINŮ – GENŮ PRO TVORBU TOXINŮ 4. TESTACE CITLIVOSTI k ANTIMIKROBIÁLNÍM LÁTKÁM
Diagnostika klostridiových infekcí Ad 1) DETEKCE PŮVODCE a ) kultivační vyšetření: - anaerobní kultivace na základních i selektivních mediích (krevní agar, TSC, selektivní – Clostridium difficille agar atd.) b) imunoenzymatické rychlotesty Ad 2) IDENTIFIKACE ü MALDI –TOF ü biochemické testy ü selektivní media
Diagnostika klostridiových infekcí DETEKCE TOXINŮ – resp. GENŮ PRO TVORBU TOXINŮ A) PCR Clostridium perfringens – geny pro toxin detekovány multiplex - PCR α, β, β2, enterotoxin, ε, ι
B) ELISA TESTY
Diagnostika klostridiových infekcí TESTACE CITLIVOSTI K ANTIMIKROBIÁLNÍM LÁTKÁM •
problém – běžně se neprovádí
•
citlivost k PNC antibiotikům
•
lze doporučit: PNC, AMP, AMC, ENR. DIF, MARBO, DOX, FFC
•
EUCAST – MIC pro humánní medicínu
Závěrem Spolehlivá a včasná laboratorní diagnostika je nezbytná pro správnou volbu terapie, prevence a profylaxe. Výsledek laboratorní diagnostiky ovlivňuje mnoho faktorů, jako je např. odběr, transport, zpracování a uchovávání vzorků, výběr laboratorních metod apod. K úspěšné diagnostice je nutná vhodná a správná kombinace klasické bakteriologie, MALDI-TOF a molekulární biologie společně se správnou interpretací výsledků. Laboratorní diagnostika, následná léčba a preventivní opatření v chovech jsou úspěšné za předpokladu, že vzájemně spolupracují chovatel, veterinární lékař a laboratoř.
Děkuji za pozornost!
STÁTNÍ VETERINÁRNÍ ÚSTAV JIHLAVA
