Laboratóriumok minőségbiztosítása, módszervalidálás Analitikai módszerek validálása ( Dr. Bezur László egy. doc. BME ÁAKT)

Laboratóriumok minőségbiztosítása, módszervalidálás Analitikai módszerek validálása ( Dr. Bezur László egy. doc. BME ÁAKT)

A laboratóriumok jó gyakorlatát rögzítő dokumentumok hat követelményt fogalmaznak meg laboratoriumok számára: (i)

„Az analitikai vizsgálatokat úgy kell végezni, hogy azok kielégítsék a megállapodásban rögzített feltételeket.” Azaz adott követelményeket.

(ii)

„Az analitikai vizsgálatokat olyan módszerekkel, olyan készülékekkel kell végezni, amiket ellenőriztünk, hogy megfelelnek az adott feladatnak.

(iii)

„Az elemzéseket végző személyzetnek megfelelően képzettnek és alkalmasnak (kompetensnek) kell lenni a feladat elvégzésére.” (és demonstrálnia kell, hogy az elemzést helyesen el tudja végezni).

(iv)

„A laboratórium szakmai színvonalát rendszeres, független vizsgálattal kell ellenőrizni.”

(v)

„Az adott laboratóriumban végzett vizsgálatoknak azonos eredményt kell szolgáltatni a más laboratóriumokban végzett vizsgálatokkal”

(vi)

„Az analitikai vizsgálatokat végző szervezetnek jól megfogalmazott minőségellenőrzési és minőségbiztosítási eljárásokkal kell rendelkeznie”

Laboratóriumok minőségbiztosítása, módszervalidálás Analitikai módszerek validálása ( Dr. Bezur László egy. doc. BME ÁAKT)

A módszervalidálás egy fontos követelmény a kémiai analízis gyakorlatában (i) A validálás fontosságának megítélése: • miért is kell csinálni, • milyen esetben kell csinálni, • pontosan mit is kell csinálni. (ii) Az irodalomban találunk útmutatókat a módszervalidálás elvégzésére, különösen bizonyos módszerekre, de ezek alkalmazása nem eléggé általános. (iii) A módszervalidálás során fontos az egyszerűbb statisztikai módszerek használata. (iv)Az analitikai módszerek jellemzésére ha lehet az ISO, illetve IUPAC értelmezéseket használjuk (nincsenek univerzális megállapodások). (v)Ha kétségek merülnek fel, célszerű megadni a fogalom általunk alkalmazott értelmezését.

Analitikai módszerek validálása ( Dr. Bezur László egy. doc. BME ÁAKT)

Mi a módszervalidálás ? (i) A módszervalidálás egy eljárás, amiben megfogalmazzuk az analitikai feladat követelményeit és igazoljuk, hogy a vizsgált módszer rendelkezik azokkal a teljesítményjellemzőkkel, amit az adott alkalmazás megkövetel. • A validálás során a módszeralkalmasság (Fitness to Purpose of Analytical Method) komplex értékelése kell megtörténjen. • Korábban a módszer ellenőrzés során a csak a teljesítményjellemzők vizsgálatára koncentráltak.


Mi a módszervalidálás ? (ii) Követelmények a műszerrel szemben (Rendszeralkalmasság) A validálás során használt műszerek és eszközök: • feleljenek meg a specifikációnak • működjenek megfelelően • legyenek elfogadhatóan „kalibráltak” (alap paraméterek ellenőrzése) • ha a vizsgáló rendszer analitikai jellemzői nem állandóak a vizsgálat megkezdése előtt ellenőrizni kell a rendszeralkalmasságot. Pl. kromatográfiás rendszereknél az elválasztás és detektálás pillanatnyi jellemzőit. (iii) Követelmények az analitikussal szemben: • legyen kompetens az adott területen, • rendelkezzen elegendő ismerettel, hogy döntéseket hozzon


A módszerkidolgozás és validálás kapcsolata

• A módszerkidolgozás és a módszeralkalmasság vizsgálatának lépései és folyamatábrája : (a) Az analitikai feladat részletes megfogalmazása és jellemzése analitikai paraméterekkel (b) Az analitikai feladat megoldására alkalmas módszer kiválasztása (c) Az analitikai módszer részletes dokumentálása (d) A módszer teljesítmény jellemzőinek meghatározása az adott körülmények között (validálás)


•

A módszerkidolgozás és a módszeralkalmasság vizsgálatának lépései és folyamatábrája : (e) A teljesítmény jellemzők összevetése az elvárásokkal ~IGEN~ ha a teljesítmény megfelelő a módszer validálható ~ NEM~ ha a teljesítmény nem megfelelő megvizsgáljuk, hogy a módszer tovább fejleszthető-e. ~ Ha a módszer tovább fejleszthető (IGEN) elvégezzük a fejlesztést és a „fejlesztett módszert” újra vizsgáljuk. Ha megfelelőnek bizonyul a módszer validálható. ~ Ha a módszer nem fejleszthető tovább megvizsgáljuk lehet-e az analitikai követelményeket enyhíteni. - ha igen újra fogalmazzuk a követelményeket és értékeljük a teljesítményt. Ha megfelelő (IGEN) a módszer validálható. ~ Ha az analitikai követelmények nem enyhíthetők (NEM) a módszer nem alkalmas a feladatra, nem validálható (VÉGE). Ilyen esetben pl. egy jobb műszer beszerzése jelenthet megoldást.

Az analitikai feladat megfogalmazása. Analitikai követelmények felállítása.

A módszer fejlesztése

Igen Igen

Választás a meglévő módszerekből vagy új módszer kidolgozása

Módszeralkalmasság vizsgálata, validálás.

Igen A módszervalidálás tartalmazza ezt a vizsgálati szakaszt, de használjuk a módszerfejlesztés során vizsgált analitikai paramétereket is. „Módszer alkalmasság” -függetlenül attól, hogy milyen teljesítményadatok állnak rendelkezésre amódszerről azt vizsgáljuk, hogy az adott módszer milyen teljesítményt nyújt az adott körülmények kötött (személyzet, műszer, technikai feltételek stb.)

Nem

Lehetséges a továbbfejlesztés ?

Nem

Enyhíthetők az analitikai követelmények ?

Nem

Az analitikai vizsgálatok elvégzése

A feladatot a labor nem tudja megoldani!

Az analitikai követelmények újrafogalmazása a validálási eredmények alapján

Vége


A módszerkidolgozás és validálás kapcsolata Magyarázat az ábrához

• Ez a szakasz a módszervalidálás, amit kiegészítenek a módszerfejlesztés kapcsán meghatározott analitikai paraméterek is. • A módszeralkalmasság (fitness to purpose) vizsgálatakor azt tanulmányozzuk, hogy a módszer az adott alkalmazási körülmények között ( analitikus, műszer, vegyszer, eszközök, feltételek stb.) milyen analitikai jellemzőket nyújt. A vizsgálatot akkor is el kell végezni, ha publikált adatok állnak rendelkezésre a módszerre.


Miért szükséges a validálás?

Miért szükséges a validálás?

Az analitikai vizsgálatok fontossága – sok ilyen vizsgálat történik, sok laboratórium alkalmazza a módszert – kereskedelmi érték megállapítása a vizsgálat célja, a vizsgálati eredmény közvetlen, jelentős gazdasági kihatással bír – egészségügyi vizsgálatokra alkalmazzák a módszer, közvetlen emberi hatás – ivóvíz vizsgálatra alkalmazzák, az eredmény az emberek széles körét érinti. – fémötvözetek vizsgálata, ipari, biztonsági kérdések – kriminalisztikai vizsgálatok stb. (büntetőügyek) – fontos döntéseket alapoz meg a vizsgálat

Az analízis költségei, az analízisre alapozott döntések anyagi és egyéb konzekvenciái • döntések az analitikai eredmények alapján -- pl. hibásnak deklarált élelmiszer ––– kártérítési követelések -- pl. tiltott drogok jelenlétének igazolása egy drogelfogásban ––– bírósági ügy, börtön, akár halálos ítélet • az analitikus szakmai felelőssége


A mintavétel és a vizsgálati minták minták

A mintavétel és a vizsgálati minták minták • a mintavétel és a vizsgálati minták feleljenek meg az adott analitikai feladatnak • a mintavétel nagy gyakorlatot és szakmai hozzáértést igényel • a mintavételt végzőnek érteni kell a megoldandó problémát • ismerni kell a kapcsolódó kémiai folyamatokat • a laboratóriumnak általában fel kell ajánlani a szakszerű mintavételt, a közreműködést • ha nem a laboratórium veszi a mintát ezt jelezni kell az eredménynél a jegyzőkönyvben


Milyen esetben kell a egy módszert validálni ? (i) Ha igazolni kell az új módszer megfelelősségét • új módszer bevezetésekor • elismert módszer új feladatra történő kiterjesztésekor • ha a módszer ellenőrzése (QC) stabilitási hibát jelez • ha az elismert módszert különböző laborok, analitikusok használják, különböző műszereken alkalmazzák (ii) Mitől függ az újra validálás szintje • a változtatás jellegétől: laboratóriumok, személyzet, műszer • valamilyen szintű ellenőrzés, validálás mindig szükséges szabvány- vagy publikált módszerek bevezetésénél is


Hogyan kell a módszerteket validálni ? Ki végzi a validálást ? Milyen szintű vadiálás szükséges?

Az adott módszert alkalamazó laboratórium felelős, hogy a módszer megfelelően validált. Ha szükséges a meglévő validálási adatokat ki kell egészítenie. • pl. ha a laboratórium ellenőrzött, validált szabvány módszert alkalmaz (ISO, AOAC, MSZ stb.) a módszer teljes körű validálását nem kell elvégeznie. • az adaptált, a saját alkalmazásába átültetett módszer analitikai teljesítményjellemzőit a laboratóriumnak meg kell határoznia és értékelni kell a megfelelőségüket. (ez egy szűkített validálás: nem vizsgálunk mindent)

• Előfordulhat, hogy a módszer az adott laboratórium körülményei között (műszer, eszközök, analitikusok, vegyszerek, műveletek stb) nem bizonyul megfelelőnek !!


Validálás bizonyos elemeit szektoronként, szakmai területenként fogalmazzák meg (i) terminológia, statisztikai módszerek, értékelési elvek stb. • kötelezően előirt módszerek • kötelező kollaborácós validálás (ii) Példa: gyógyszergyártáshoz kapcsolódó analitikai módszerek validálásának szabályai: ICH Harmonised Tripatite Guideline International Conference on Harmonisation of Technical Requrements for Registration of Pharmaceutica for Human Use (1996) Validálási ajánlás (iii) Példa: analitikai módszerek validálása, kémiai laboratóriumokban The Fittnes for Purpose of Analitical Methods A Laboratory Guide to Method Validation and Related Topics (ld. EURACHEM honlap) EURACHEM Working Group ( A laboratóriumok minőségbiztosításának európai szervezete) (iv) Példa: analitikai módszerek validálása Harmonized Guidelines for Single Laboratory Validation of Methods of Analysis IUPAC Technical Report (A kémikusok nemzetközi szervezete) (v) A validálás megtervezésénél vegyük figyelembe az adott terület elvárásait, szabályait !!!


Validáció kollaborációban • ha széleskörű, több laborra kiterjedő a módszer felhasználása — jó a kollaboráció a validálásban • egyedi alkalmazásnál nincs érdekelt partner ( konkurencia) • képes-e a labor maga validálni a módszert • elfogadják-e más laborok a validálást • milyen szintű elismertség várató Validáció egy laboratóriumban • az adatok mennyisége korlátozott • nem kapunk adatot arra, hogyan működik a módszer más laboratóriumban • hiteles anyagminta elemzésével az előbbi pótolható


A validálás során tanulmányozott, értékelt analitikai jellemzők (1) Azonosság, szelektivitás, specifikusság (2) Kimutatási határ (3) Meghatározási határ (4) Mérési tartomány (5) Analitikai függvény, illetve kiértékelő függvény jellemzése – egyenes (lineáris) közelítés esetén, linearitás vizsgálata – nem lineáris közelítés esetén, a választott függvény illeszkedésének vizsgálata (6) Pontosság, helyesség (7) Precizitás (ismétlőképesség, reprodukálhatóság) (8) Mérési bizonytalanság (9) Robosztusság


A validálás dokumentumai

gy módszer validálása során az alábbi három dokumentumot kell elkészíteni:

) A validált módszer részletes, teljes körű dokumentálása az alkalmazó laboratórium körülményeihez adaptálva (műszerek, vegyszerek, eszközök, műveletek, standardok, oldatok készítése, minta-előkészítés, mérés menete, adato kezelése, adatok feldolgozása stb.). A módszerleírásban szerepel a rendszeralkalmasság vizsgálatának dokumentálása is.

) Validálási terv, validálási protokol. A terv tartalmazza: a vizsgált analitikai paramétereket a megfelelési adatokkal; az egyes paraméterek meghatározásához tartozó eljárások teljes körű leírását; a elemzési eredmények feldolgozásának menetét.

i) Validálási jegyzőkönyv. A jegyzőkönyvben: dokumentáljuk a protokol szerin végrehajtott vizsgálatokat; megadjuk a primer vizsgálati adatokat; bemutatjuk az adatok feldolgozását, bemutatjuk és értékeljük a validálás eredményeit.


Rendszeralkalmasság és módszeralkalmasság

Rendszeralkalmasság tanulmányozása a validálás során: A vizsgáló rendszer, műszer adott feladatra való alkalmasságát vizsgáljuk értékeljük: (A) a vizsgáló rendszer jellemzői stabilak, hosszabb használat alatt sem változnak lényegesen (UV-VIS, L-AAS, GK-AAS, ICP-OES, ICP-MS, automata-titráló, termoanalitikai módszerek stb. • ilyen esetekben csak a validálást megelőzően kell vizsgálni a rendszeralkalmasságot, a validált módszer napi alkalmazása során már nem (B) a vizsgáló rendszer jellemzői nem kellően stabilak, a vizsgálatok során a jellemzők jelentősen megváltozhatnak (elválasztási módszerek általában, GC-FID, GC-MS, HPLC stb.) • ilyen esetben a napi vizsgálatokat megelőzően a rendszer alkalmasságot ellenőrizni kell. A rendszer alkalmasság ellenőrzésének eljárása a módszer részét képezi (módszer dokumentálás). Módszeralkalmasság tanulmányozása a validálás során: A laboratórium adaptált, dokumentált módszerének analitikai jellemzőit vizsgáljuk és értékeljük


A RENDSZERALKALMASSÁG VIZSGÁLATA (System Suitability)

Működési kvalifikálási tényezők ellenőrzése (OQ: Operational Qualification) A GC készülék gyártója: A GC készülék típusa: Az alkalmazott kolonna adatai: Szériaszáma: kolonnahossz: belső átmérő: megosztófolyadék: Az injektor hőmérséklete: A kolonnatér izoterm hőmérséklete: A kolonna hőmérsékletprogramja: A kolonnafej nyomása:



A kolonna nyomáspróbája: A vivőgáz lineáris áramlási sebessége (cm/s): 3 A vivőgáz térfogati áramlási sebessége (cm /min.): Az inert anyag átfutási ideje (tM): Áramlási sebesség a split ágban (cm3/min.): 3 Purge áramlási sebesség (cm /min.): Mintaáram elosztási arány (split arány):



Detektor (FID) alapionárama (µA): A vivőgáz és minősége: H2 áramlási sebessége: A make-up gáz áramlási sebessége: A levegő áramlási sebessége: A detektálás jel/zaj viszonya: A gyári tesztelegy mérése. Elméleti tányérszám egyezése Elválasztási szám: Felbontóképesség


A RENDSZERALKALMASSÁG VIZSGÁLATA (System Suitability) Az ismételhatőség meghatározása, az egyes készülékelemek használhatóságának az ellenőrzése: (System Performance Qualification) 5 ismételt méréssel • • • • • • • • •

Retenciós idő ismételhetősége (SD, RSD) Retenciós idő ismételhetősége (SD, RSD) PTGC Retenciós idő ismételhetősége (SD, RSD) gradiens HPLC esetén Ciklusidő ismételhetősége (SD, RSD) HS-GC esetén Bemérés ismételhetősége Csúcsterület ismételhetősége (SD, RSD) Relatív csúcsterület ismételhetősége (SD, RSD) Jel/Zaj meghatározása Kimutatási határ (LoD), a mennyiségmérés alsó határa (LoQ)


Milyen analitikai paramétereket kell vizsgálni egy adott módszer validálásánál ? Egy adott módszer validálásánál az analitikai követelményekhez igazodóan kell a validálásba bevont analitikai paramétereket kiválasztani ! Analitikai követelmények Kvalitatív vagy kvantitatív elemzés szükséges?

Több formában is jelen van az analit a mintában? Szükséges-e a különböző formák megkülönböztetése? Kioldható, szabad, összes, oxidációs fok Cr(III)/Cr(VI), kémiai forma Se-ion, Se-metionin, Se-cukor. Milyen komponensek meghatározása szükséges, az alnalit várható koncentrációja (%, µg/g, ng/g stb.)

A kapcsolódó analitikai paraméter Azonosság igazolása Szelektivitás/specifikusság Kimutatási határ Meghatározási határ Azonosság igazolása Visszanyerés

Azonosság igazolása Kimutatási határ Meghatározási határ Analitikai tartomány


Milyen analitikai paramétereket kell vizsgálni egy adott módszer validálásánál ? (folytatás)

Analitikai követelmények Milyen pontosságú és precizitású elemzésre van szükség? Milyen mérési bizonytalanság engedhető meg? (főkomponens, mellékalkotó, nyomnyi komponens) Milyen zavaróhatásokkal kell számolni? A módszert több laboratórium is használja, Az elemzési eredményeket összevetik.

A kapcsolódó analitikai paraméter Visszanyerés Pontosság, helyesség Ismétlőképességi szórás Reprodukálhatósági szórás Szelektivitás Speifikusság Pontosság Robosztusság Reprodukálhatósági szórás


Analitikai paraméterek

• Az egyes analitikai paraméterek értelmezése. • Az egyes analitikai paraméterek meghatározására javasolt módszerek. (1) Azonosság, szelektivitás, specifikusság (2) Kimutatási határ (3) Meghatározási határ (4) Mérési tartomány (5) Analitikai függvény, linearitás, illeszkedés (6) Pontosság, helyesség (7) Precizitás (ismétlőképesség, reprodukálhatóság) (8) Mérési bizonytalanság (9) Robosztusság

)

Analitikai módszerek validálása ( Dr. Bezur László egy. doc. BME ÁAKT

Azonosság, szelektivitás, specifikusság

Azonosság, szelektivitás, specifikusság ellenőrzése • az analitikai módszer specifikusságát, szelektivitását megszabó folyamatok, elvek, készülékelemek. Az azonosság (identity) bizonyítása: • a jelet a mérési szakasz szolgáltatja vagy más mért jellemző, ami a meghatározandóhoz köthető • a meghatározandótól és csak a meghatározandótól ered a jel és nem valami kémiailag v. fizikailag hasonló anyagtól


Azonosság, szelektivitás, specifikusság Azonosság, szelektivitás, specifikusság ellenőrzése szelektivitás / specifikusság Fogalmak értelmezése: specifikusság = 100%-os szelektivitás specifikus = csak egy komponenst mér szelektív = több komponenst is mér, de a komponenseket megkülönbözteti • (i) az elválasztási művelet hatásossága, illetve (ii) a mérési szakasz szelektivitása, specifikussága döntő abban, hogy a mátrix komponensek zavarják-e a meghatározást • szelektivitás / specifikusság a módszer jóságát / megbízhatóságát jellemzi zavaró komponensek jelenlétében • ha a detektálás nem specifikus bizonyos, vizsgált mátrix komponensekre kijelenthetjük, hogy nem zavarnak, de sokkal nehezebb annak igazolása, hogy semmi sem zavar. Az analitikusnak kell dönteni a zavarásvizsgálat terjedelméről. • szelektivitás / specifikusság vizsgálandó a kvantitatív és kvalitatív módszerekre is


A zavaró komponensek (Z) hatásai

A zavaró komponensek (Z) hatásai:

• a mátrix komponens zavarhatja a mérendő azonosítását, torzíthatja a meghatározandó jelét (a zavarás a nem megfelelő elválasztás következménye)

• a Z-komponensnek lehet növelő (+) vagy csökkentő hatása (-) a jelre, illetve a koncentrációra. (a zavarás nem az elválasztási szakaszban jelentkezik)

• a Z-komponensek altalában másként változtatják a meredekséget, mint meghatározandó. Az addíció során változhat az analitikai függvény linearitása, ez jelezheti a Z-komp. jelenlétét.


A szelektivitás vizsgálata A szelektivitás vizsgálata

• a meghatározandó viselkedésnek tanulmányozása a reális mintában jelenlévő komponens jelenlétében (modell vizsgálatok) • viszonyítás független módszerekkel kapott eredményekhez példák: (1) Kromatográfiás módszerek: • tR összevetése referencia anyaggal (eluálódó anyag ≠ azonos anyag) • ismétlés eltérő oszlopon • GC-MS azonosítás • mátrix zavarás, detektor érzékenység változása • HPLC-ben UV módszerrel csúcstisztaság-vizsgálat


A szelektivitás vizsgálata (2) IR módszer • összevetés könyvtári spektrummal • azonos készülékkel referencia anyag spektrumát felvenni • több hullámhossznál kell azonosítást végezni (3) L-AAS módszert jellemző, vizsgálandó zavarások : (i) spektrális elemzavarás elhanyagolható, (ii) mintabeviteli zavarás, (iii) párolgási zavarás, (iv) ionizációs zavarás, (v) háttérzavarás.


A szelektivitás vizsgálata (4) GK-AAS módszer: (i) veszteség a hőkezelési szakaszban, (ii) párolgási zavarás (eltérő tulajdonságú vegyületek), (iii) háttérzavarás (rossz háttérkorrekció) (5) ICP-OES módszer: (i) vonalzavarás (átlapoló spektrumvonalak vagy zavart háttérkorrekciós hely), (ii) háttérzavarás (rosszul beállított háttérkorrekció), (iii) mintabeviteli zavarás (eltérő sűrűség, viszkozitás, felületi feszültség, hatásfok) (iv) ionizációs zavarás (az ionizáció mértéke változik), (v) párolgási zavarás (eltérő tulajdonságú vegyületek)


Speciáció

Azonosság, szelektivitás/specifikusság – speciáció

A fogalmak értelmezése olyan esetre, amikor az összes meghatározandó egy adott formájá kell meghatározni: Pl. •

kötött, nem kötött,

•

szervetlen, szerves (Hg(II), metil-higany),

•

adott oxidációs állapot (Cr(III), Cr(VI),

•

adott molekula,

•

adott feltételek között oldható anyag stb.

az azonosság, szelektivitás /specifikusság az adott formára vizsgálandó.


Az azonosság, szelektivitás és specifikusság bizonyításának eljárásai (összefoglalás)

1

2

Mit tegyünk? Elemezzük meg a mintát és ref. anyagot a kiválasztott módszerrel és más független módszerrel Elemezzünk olyan mintákat, amelyek a meghatározandó mellett különböző, a mintában jelenlévő, zavaró komponenseket tartalmaznak ismert mennyiségben

ism.

1

1

számítás / értékelés A referencia módszerek eredményei alapján értékeljük a módszert. Mennyire biztosítja az analit azonosítását és a zavarásmentes elemzést? Tanulmányozzuk a zavaróhatásokat megváltoztatja-e a zavaró komponens a detektálhatósá-got, növelie, csökkenti-e a zavaró komponens az analit jelét

Megjegyzések döntsük el mennyi és milyen bizonyíték szükséges a megbízhatósághoz ha a meghatározhatóságot, illetve a mennyiségi meghatározást zavarják a mátrixkomponensek további módszerfejlesztés szükséges


Kimutatási határ (Limit of detection, LoD; Detection Limit, DL; cL , mL)

• Ha a meghatározandó koncentrációja kicsi ( pl. nyomelemzés ) ismerni kell mi a legkisebb koncentráció vagy mennyiség, amit a módszerrel megbízhatóan detektálni lehet. A kimutatási határ megadásánál probléma, hogy a detektálás valószínűsége nem ugrásszerűen változik 0-tól 1-re, hanem egy tartományon belül.

• Különböző konvenciókat használhatunk: meg kell adni melyiket használjuk.

• A kimutatási határ adott jel/zaj viszonyhoz kötődik (J/Z = 3). Zaj = a vakérték szórása.

• A kimutatási határnál várható relatív szórás RSD=33%

• A vakérték szórását (zaj) a mintával azonos feltételek mellett kell meghatározni. Az LoD függ a mátrixtól !


Kimutatási határ (Limit of detection, LoD; Detection Limit, DL; cL , mL) Kvalitatív, fél-kvantitatív módszer

• Kvalitatív, fél-kvantitatív mérésnél a specifikusság egy adott koncentráció szint alatt bizonytalanná válik. • Kimutatási határ meghatározása különböző koncentrációra adalékolt mátrix sorozattal történhet • Minden koncentrációnál 10-10 ismételt észlelést végzünk (igen/nem, +/-) a koncentrációk véletlenszerű kiválasztásával végezve az ismétléseket. • Az adott koncentrációhoz tartozó válaszokat értékeljük, válaszgörbét szerkesztünk ( koncentráció – válasz % +/-)


Kimutatási határ (Limit of detection, LoD; Detection Limit, DL; cL , mL) Kvalitatív, fél-kvantitatív módszer koncentráció, µg/g

ismétlések száma, n

200 100 75 50 25

10 10 10 10 10

pozitív/negatív eredmény, db (igen/nem) 10/0 10/0 5/5 1/9 0/10


Kimutatási határ (Limit of detection, LoD; Detection Limit, DL; cL , mL) Kvalitatív, fél-kvantitatív módszer

100% +

koncenrtráció kimutatási határ 100% 10 25 50 75 100 200 400

mg/l


Kimutatási határ (Limit of detection, LoD; Detection Limit, DL; cL , mL) Kvantitatív módszer

Vizuális értékelésen alapuló módszer (i) nem műszeres módszerekre (ii) műszeres módszerekre eljárás: ismert koncentrációjú mintákkal vizsgáljuk a komponens minimálisan detektálható szintjét.

A jel/zaj viszony vizsgálatán, a vak szórás és meredekség meghatározásán alapuló módszerek (statisztikai módszer) (i) zaj (szórás) meghatározása ismételt blank mérések alapján (stacioner jelek, tranziens jelek, gyors méréseknél használjuk) L-AAS, GK-AAS, ICP-OES, ICP-MS stb. (ii) a jel zajosságának mennyiségi értékelése s=RMS (lassú méréseknél használjuk) - zaj számítása az idő függvényében mért adatsorokból (GC, HPLC) - a zaj számítása a regisztrált zajos jel grafikus értékelésével ( ZAJp-p= 6s, 6s/2=3s, cL=3s/S kromatográfiás módszerek, L-AAS) (iii) számítás a kalibrációs görbe értékelésével -a regresszió számítás reziduális szórása vagy az y-tengelymetszet szórása alapján


Kimutatási határ (Limit of detection, LoD; Detection Limit, DL; cL , mL) A kimutatási meghatározási módszer dokumentálása

(i)

a kimutatási határ meghatározás módszerét meg kell adni

(ii) a vizuális és J/Z viszony mérésen alapuló módszernél pl. bemutató regisztrátumot kell mellékelni

Analitikai módszerek validálása ( Dr. Bezur László egy. doc. BME ÁAKT) A kimutatási és meghatározási határ számítása az ismételt mérésekkel kapott szórás és a kalibrációs függvény kezdeti meredeksége felhasználásával. RSD értelmezése a kimutatási határnál A kimutatási határ koncentráció (cL) A meghatározási határ koncentráció (cQ) cL =

cL =

ahol S

ks B S

3sB S

cQ =

10 s B cQ = S

,

a kalibrációs egyenes meredeksége RSD = 33 % ( k=3)

ks B S

ahol S

,



RSD becslése a kimutatási határ felhasználásával !! Meghatározási határ és RSD

kimutatási határ koncentráció (cL) A meghatározási határ koncentráció (cQ

hol S

cL =

ks B S

3s B cL = S

c Q = pc L

,


c Q = 2c L c Q = 3c L c Q = 6c L

33 p 33 RSD = ≈ 16% 2 33 RSD = = 11% ≈ 10% 3 33 RSD = = 5,5% ≈ 5% 6 RSD =


Kimutatási határ (Limit of detection, LoD; Detection Limit, DL; cL , mL) Az RSD, a koncentráció és a kimutatási határ kapcsolata

Az RSD % változása a koncentráció c/cL függvényében Feltételzés: a Zaj=szórás nem változik a koncentrációval 35

RSD=33%, C=CL

30

C/CL-RSD becslés

RSD, %

25

c/cL=33/RSD%

20 15 10 5

RSD=10%, c=3cL RSD=10%, c=6cL

0 10

20

30

c/cL

40

50


A kimutatási határ és meghatározási határ értelmezése sűrűség fügvénnyekkel 10s

meghatározási határ

kimutatási határ

3s

a jel sűrűségfüggvénye

s s

s s

40

RSD = (s/10s)100 = 10 %

RSD = (s/3s)100 = 33 %

30

20

10

0 -2

0

c(vak)

2

c1

4

6

jel

8

10

c2

12

14

A válaszjel eloszlás-sűrűségfüggvénye a vak mintára és két kis koncentrációra (c1, c2)


A kimutatási határ bemutatása szórásképpel kimutatási határ c = 3s/S L

6

3s

5 4

p-p

3

jel

2

3s

6s

1

3s

1s

0 -1 -2 -3

3s 0

50

100

150

200

250

300

350

400

ismételt mérések (n=200), normál eloszlás, s=1

Az ismételt mérések szórásképe a vak mintával és a kimutatási határnak megfelelő koncentrációnál mérve (a leolvasott pontok feltüntetve)


Kimutatási határ számítása ismételt blank méréssel (n=10)

n=200, x(átlag)=0, s=1 3s=3 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0

s=+/-0,79 (n1-10=10)

1.5

3s=+/-2,37 n1-10=10

1.0 0.5

Jel

0.0 -0.5 -1.0 -1.5 -2.0 -2.5 -3.0 -3.5 -4.0 0

2

4

6

8

ismételt blank mérések, n=10

10


A kimutatási határhoz tartozó ZAJ-kép c = 3s/S

kimutatási határ 6

c=c

5

L

L

3s

jel = 3s

4

6s

3

jel

2

p-p

3s

1

3s

s

0 -1 -2

3s

-3 0

50

100

150

200

250

300

350

400

ismételt mérések (n=200)

Az ismételt mérések szórásképe a vak mintával és a kimutatási határnak megfelelő koncentrációnál mérve


• (stacioner jelek, tranziens jelek). Kimutatási határ (LoD, DL) , meghatározási határ (LoQ, QL) (feltételezések: normál eloszlás, állandó szórás )

A kimutatási határhoz tartozó jel (y) :

A meghatározási határhoz tartozó jel (y) y = y B + ks B

y = y B + ks B y = y B + 3sB ,

ahol yB a vak jele sB a vak szórása k=3, állandó

y = y B + 10 s B

ahol yB sB k

a vak jele a vak szórása állandó ( 5, 6, 10 )


A kimutatási határ „leolvasása” vakértéket is tartalmazó kalibrációs egyenesről (minden standard oldat és a minták azonos vakot tartalmaznak, yB

y y + 10sB B

y + 3s B

y

B

S B

c

L

c

Q

c


Kimutatási határ (LoD, DL). összefoglalás

1

2

mit elemzünk ismétlés mit számítunk a) vak minta 10 független a minta vak szórása "s" vak mintát mérünk 1-1 ismétléssel a szórásból számítjuk a kimutatási határt LoD a xsb(átlag)+3s jelből a kalibrációs görbéről leolvassuk b) a vak mintát 10 független az addicionált vak minta a legkisebb addicionált szórása "s" elfogadott vak mintát koncentrációig mérünk a szórásból számítjuk a addicionáljuk 1-1 kimutatási határt LoD a ismétléssel xsb(átlag)+4.65s jelből

megjegyzés - valódi vak minta előállítása problematikus (mátrix jelenlétében történik az LoD meghatározása) - akkor értelmezhető, ha a vak minta jele nem nulla és nem korrigálunk a vakértékkel - a legkisebb elfogadott koncentráció az, ahol már elfogadható a mérési bizonytalanság - ha a méréseket az ismétlőképesség feltételei között végezzük az ismétlőképességi percizitásra kapunk adatot


Meghatározási határ (LoQ, QL)

• A mennyiségi meghatározás határa vagy meghatározási határ (LoQ) az a legkisebb koncentráció, amelynél egy adott, elfogadható ismétlőképesség (RSD %), és helyesség érhető el a módszerrel. • Az LoQ becsülhető a kimutatási határ LoD alapján . • Az LoQ meghatározható a kísérletileg felvett RSD-c függvényből.


Meghatározási határ ( LoQ, QL, cQ), összefoglalás mit elemzünk ismétlés 1 a) vak minta 10 független vak mintát mérünk 1-1 ismétléssel

2 b)a vak mintákat addicioná-lunk néhány az LoDhoz közeli koncentrációra és ezeket ismétléssel mérjük

10 független mérés minden koncentrációnál

mit számítunk a minta vak szórása "s" a szórásból számítjuk a kimutatási határt LoD az LoQ számítása: i) xsb(átlag)+5s jelből ii) xsb(átlag)+6s jelből iii) xsb(átlag)+10s jelből vagy cQ= 1,65 cL (RSD 20%) cQ= 2 cL (RSD 15%) cQ= 3 cL (RSD 10%) kiszámítjuk az addicionált vak minták szórását "s"

megjegyzés - valódi vak minta előállítása problematikus (mátrix jelenlétében történik az LoD meghatározása)

- az extrapoláció a legkisebb koncentráció alá nem megengedett

Az LoQ az a legkisebb koncentrációt, ahol a mérési - ha a méréseket az bizonytalanság már ismétlőképesség feltételei elfogadható között végezzük az ismétlőképességi precizitásra is kapunk ennél a koncentrációnál - rendesen a mérési tartomány meghatározása során kapunk ilyen adatokat

Meghatározási határ az a koncentráció, amelynél (amelytől) egy meghatározott ismétlőképességgel (s) lehet a meghatározást elvégezni. Ha zaj normális eloszlású és állandó a cQ becsülhető (k = 5, 6, 10 ,


Mérési tartomány, lineáris tartomány (Working Range, Linear Range)

• Kvalitiatív módszereknél ki kell jelölni azt tartományt, amelyben a módszer alkalmazható. • A mérési tartomány jellemzően a mintaoldat koncentrációra vonatkozik nem a mintakoncentrációra (szilárd minta, törzsoldat). • Az alsó határ az LoQ • A felső határt megszabják : • a követelmények (mit kell még mérni tudni) • az analitkai függvény tulajdonságai, linearitás, RSD%=f(c) • az RSD % növekedése


ineáris tartomány a mérési tartományon belül lehet egy lineáris tartomány, ahol a cA– jel függvény lineáris, amit a mérési tartomány vizsgálata során határolunk be módszerek a linearitás ellenőrzésére:

) regresszió számítás, (R) megadása nem elégséges. (R) nem nagyon alkalmas, nem jelez elég érzékenyen;

i) az „illesztés jóságának vizsgálata” szükséges (kalibráció vizuális ellenőrzése)

ii) a rezidumok vizuális értékelése;

v) objektív statisztikai tesztek, F-próba sr2 (reziduális) , se2 (csoportokon belüli) összevetése; F = sr2/se2 –– Fα kritikus


Línearitás, illetve illeszkedés vizsgálata F-próbával (iv) objektív statisztikai tesztek, F-próba sr2 (reziduális) , se2 (csoportokon belüli) összevetése; F = sr2/se2 –– Fα kritikus (táblázatból)

reziduális szórásnégyzet

sr2 =

∑ pi ( yi − Y$i )

csoportokon belüli szórásnégyzet (error szórásnégyzet) se2 =

i

n−2

∑ ∑ ( yik − yi ) 2 i

p az i-edik mérési pont párhuzamos méréseinek a száma, y a mérési pontokra illesztett regressziós egyenes értéke az i-edik pontban, Y a tapasztalati regressziós egyenes értéke az i-edik pontban, n a kalibrációs pontok száma, i a kalibrációs pontok sorszáma k az adott kalibrációs pont párhuzamosan mért értékeinek a sorszáma.

k

∑ pi − n


Lneáris tartomány meghatározása

(v) sxy minimalizálása a tartomány szűkítésével

__________________________________________________________________

Koncentrációk, általános követelmények:

(i) 10 kalibrációs pont javasolt; (ICH-ban 6 kalibrációs pontot javasolnak)

(ii) az oldatok koncentrációhibája legyen elhanyagolható,

(iii) az egyes kalibráló oldatok készítése lehetőleg legyen független

• fontos ismerni a kalibrációs függvény varianciáját a teljes tartományban (változik-e a kal függvény napról napra).

• a mátrixtól függhet a linearitás (ld. zavarások)

• a meredekség (S) meghatározása, megadása bizonyos módszereknél hasznos (felbontás)


Maximális koncentráció, a mérési tartomány felső határa •

műszerparaméterhez kötve, pl. max. 0,8 - 1 abszorbancia

•

relatív szóráshoz kötve, pl. RSD 5%

•

lehajló kalibrációs görbék esetén (pl. AAS, ICP-OES stb.) az induló és lokális meredekség viszonyából Sl (cmax) = Si/3 —> s (cmax) = 3sopt


Mérési tartomány, lineáris tartomány

1

2

3

elemzés 1) vak és referencia minták vagy különböző koncentrációra addicionált vak minták Vak és legalább 6 koncentráció szükséges 2) referencia minták vagy addicionált vak minták vak és legalább 6 különböző koncentráció a lineáris tartományban

LoQ meghatározása

ism.

1

3

10 per konc.

számítás (i) ábrázoljuk a mért jeleket (y) a mérendő koncent-rációja függvényében (x)

megjegyzés (i) az ideális, ha a különböző koncentrációjú kalibrálókat egyedileg készítjük és nem egy azonos törzsoldat alikvot (ii) értékeljük vizuálisan részeiből. kalibrációs függvényt, (ii) ezzel az eljárással határoljuk be a lineáris vizuálisan megállapíthatjuk, tartományt és a mérési hogy a tartományban lineáris tartomány alsó és fölső határát vagy nem lineáris a – azután ..... kalibrációs függvény (i) ábrázoljuk a mért jeleket (i) ez lépés szükséges ahhoz, (y) a mérendő koncent-rációja hogy azonosítsuk az a függvényében (x). Vizuálisan tartományt, ahol lineárisnak véljük a kalibrációs függvényt válasszuk ki a kiugró értékeket, amelyeket nem és ahol "egypontos" kalibrációt szeretnénk használunk a regressziós használni számításban (ii) nem biztonságos a kiugró pontok kizárása, mielőtt a (ii) illesszünk egyenest közeli koncentrációknál (lineáris regresszió, regressziós koefficiens), vizsgálatokat végeznénk határozzuk meg a rezidumokat – ha az ismételt mérések ( a számított egyenes ysz varianciája arányos a értékei és a mért ym értékek koncentrációval használjunk súlyozott regressziót nem különbsége minden x ertéknél). A rezidumok súlyozott helyett egyeneshez viszonyított (iii) bizonyos esetekben célszerűbb a lineáris helyett véletlen eloszlása igazolja a linearitást. A rezidumok nem lineáris függvényt trendje nem-lineáris függvényt illeszteni a kalibrációs igazol pontokra. A másodfokúnál magasabb fokú függvény használata általában nem ajánlott (i) szórások meghatározása (i) mérjünk egyre kisebb minden koncentrációnál koncentrációkat, amíg a (ii) LoQ adja a kalibrációs pontosság és precizitás nem


Lineáris kalibrációs függvény + L.O.D.


Reziduumok értelmezése


Súlyozott regresszió alkalmazása az analitikában

Az ábrán bemutatott kalibrációnál súlyozott regresszió alkalmazása indokolt, mert a szórás változik (nő) a koncentrációval (pl. AAS, ICP-OES, ICP-MS stb.)


Példa: az „r” korrelációs tényező használata a linearitás jellemzésére

• analitikai függvényeknél nem igazán jó az „r” használata az illeszkedés jóságának jellemzésére ! • Az ábrán r = 0,986 elég jó, annak ellenére, hogy a reziduum-x mutatja, hogy az egyenes illeszkedése nem jó!


Példa: linearitás vizsgálata ICP-OES kiértékelő függvényeken (reziduumok) (a)

(b) 12 10

Y=0,831X R=0,97016

Y=0,998X R=0,99944

10

8

mért jellemzõ

mért jellemzõ

8

6

4

6

4

2

2

0

0 0

2

4

6

8

10

12

0

2

4

koncentráció

6

8

10

12

koncentráció

(c )

(d) 1,5

0,2

1,0 0,1

rezidum

rezidum

0,5 0,0

0,0

-0,5

-0,1

-1,0 -0,2 -1,5 0

2

4

6

koncentráció

8

10

0

2

4

6

8

10

koncentráció

5. ábra. Mérési eredményekre illesztett egyenes reziduumainak alakulása a koncentráció függvényében


Kalibrációs függvény értékelése ICH szerint

Linearitás, „kalibrációs függvény” vizsgálata (ICH szerint) • a módszer tartományára vizsgálandó vizsgálható: (i) a készítményből előállított oldatokkal (ii) szintetikus oldatokkal linearitás értékelése vizsgálathoz legalább 5 koncentráció pont szükséges (egyéb esetek igazolandók) (1) Lineáris összefüggéssel leírható módszerek esetén: (i) vizuális értékeléssel ---koncentráció-jel diagramm (ii) ha lineáris összefüggést találunk matematikai statisztikai értékelés szükséges: pl regresszió számítás legkisebb négyzetek módszere (iii) esetenként matematikai transzformáció előzi meg az egyenes illesztést (iv) a regresszió számítás adatokat ad a linearitás értékeléséhez ( R, R2, (y-tengelymetszet, S meredekség, reziduális négyzetösszeg, grafikus ábrázolás, reziduumok vizsgálata, Fproba). (2) Nem lineáris összefüggéssel közelíthető módszerek esetén: (pl. immunoassay, AAS, ICP-OES) (i)

alkalmas y=f(x) függvénnyel kell leírni az összefüggést

(ii)

a leíró függvény illeszkedésének jóságát kell vizsgálni

(R, R2, grafikus ábrázolás, reziduumok vizsgálata, F-proba)


Mérési tartomány ICH szerint Mérési tartomány (ICH szerint) A tartományra általában a linearitás tanulmányozása során következtetünk. A tartomány értékelése:

(i) linearitás, (ii) pontosság, (iii) precizitás alapján

A tartományra vonatkozó követelmények: (i) hatóanyagra: 80-120 % -a a várt koncentrációnak (ii) hatóanyag homogenitás vizsgálatra: 70-130%-a mért koncentrációnak (iii) kioldódás vizsgálatnál: +/- 20% a várt értékhez pl. ha egy retard készítményre 1h-20%, 24h 90% a várt érték a validált tartomány a megadott tartalom (0-110%-a 20%20%=0%, 90%+20%=110%) (iv) szennyezés meghatározáskor: határérték+ 20% (v) az ismert toxikus és nem várt fiziológiai hatású komponensekre a kimutatási/meghatározási határ a limit

Helyesség, torzítatlanság, módszeres hiba, H, (trueness) Analitikai módszerek validálása ( Dr. Bezur László egy. doc. BME ÁAKT)

A helyességet nagyszámú ismételt mérés átlagértéként kifejezett mérési eredmény és egy elfogadott referencia érték („valódi érték”) közötti egyezés mértékeként értelmezzük.

• a helyesség meghatározása:

– a mért értéket összevetjük, a referencia értékkel

• visszanyerés, R % (recovery):

• visszanyerési hatásfok:

x mért R= 100% x ref

x mért η= x ref

H = x mért − x ref

A helyesség vizsgálatának módszerei Analitikai módszerek validálása ( Dr. Bezur László egy. doc. BME ÁAKT)

A helyesség vizsgálatának főbb módszerei: (1) Hiteles v. tanúsított referencia minták vizsgálata (CRM, SRM, RM) (2) Összevetés független módszerrel (3) Összevetés ismert helyességű módszerrel (4) Interkalibrációs vizsgálatok, körvizsgálatok (5) Visszanyerés vizsgálat standard anyag addíciójával A módszerek alapvetően abban különböznek, hogyan nyerjük a referencia értéket (xref)


(1) Hiteles v. tanúsított referencia minták vizsgálata (CRM, SRM, RM), visszanyerés meghatározása • A legelfogadottabb módszer a helyesség vizsgálatára • A CRM, SRM, RM a vizsgált mintával azonos vagy nagyon hasonló összetételű, gondosan előkészített, jellemzett és több módszerrel, több jól felkészült laboratóriumban, kooperációban megelemzett minta. A CRM, RM minta dokumentációjában megadott értéket x±kU tekintjük referencia értéknek. U= kiterjesztett mérési bizonytalanság. • A tanulmányozott módszerrel megelemezzük a CRM mintát, majd számítjuk a visszanyerést !


2. Összevetés független módszerrel • Ugyanazt a mintát megelemezzük egy más mérési elvet használó „független módszerrel” és a két módszerrel kapott eredményt vetjük össze. • A kiválasztott módszer akkor tekinthető függetlennek, ha a módszer terhelő, hibaforrások mátrix hatások eltérőek és ezért várható hibák eltérőek. Pl. AAS, ICP-OES, XRF


3. Összevetés ismert helyességű módszerrel Ugyanazt a mintát megelemezzük ugyanolyan elven működő készülékkel egy olyan laboratóriumban, ahol az adott mintatípusra validált (ismert helyességű) módszer áll rendelkezésre. A két elemzési eredményt vetjük össze.


4. Interkalibrációs vizsgálatok, körvizsgálatok • Ugyanazokat a mintákat (RM) több laboratórium megelemzi a saját módszerével. Az elemzési eredményeket statisztikai módszerrel (Round Robin Test) kiértékelve kapjuk a minta jellemzésére alkalmas átlagértéket és konfidencia intervallumot. Az eljárásban az adatok statisztikai feldolgozása során a kiugró értékeket kiejtik, majd ezt követően számítják az átlagértéket és a konfidencia intervallumot. • Az eljárás hátterében az áll, hogy a független laboratóriumokban végzett mérések véletlenszerűen szórnak a valódi érték közül. Így a kapott átlagérték sokkal jobban közelíti a „valódi értéket”.


Az eltérések értékelése, a hibák értelmezése: • Egy CRM mintát (valódi érték) elemeznek laboratóriumok egy adott módszerrel. • Azonos minta sok laborban elemezve körvizsgálatban: Eredmény: körvizsgálati átlag ≠ valódi érték • Az adott labor eredménye eltér:

a körvizsgálati átlagtól

a valódi értéktől mért érték (laborátlag)

valódi érték összes hiba körvizsgálat átlaga

a laboratórium

a módszer

hibája

hibája


5. Visszanyerés vizsgálat standard anyag addíciójával •

Sok esetben nem áll rendelkezésre CRM, vagy RM anyag a vizsgálathoz. Ilyen esetben tiszta standard anyag adagolásával (spike) hozhatunk létre ismert analit koncentráció növekedést a mintában. Az eredeti mintát és standarddal addícionált mintákat (több koncentráció szint is szokásos) megelemezve számítjuk a visszanyerést.

•

Az addicionált mintákat a teljes elemzési folyamaton végig kell vinni.

Hibalehetőségek: Ha szilárd fázisú mintához adagolunk oldatban standard anyagot, a standard nem azonos módon viselkedik a minta eredeti analit tartalmával. Pl. más hatásfokkal extrahálható.


Referencia anyagok alaptípusai: (i) Tiszta anyagok (egy komponensű): kémiai tisztaság vagy szennyezések jellemzésével (ii) Standard oldatok vagy gázelegyek: gravimertiás eljárással készülnek tiszta anyagokból (iii) Mátrix referencia anyagok (anyagminták): összetételüket főalkotókra, mellékalkotókra, nyomkomponesekre jellemzik. Készülhetnek anyagmintákból adalékolás nélkül vagy komponensek szintetikus adagolásával is. (iv) Fiziko-kémia referencia anyagok: Pl. olvadáspont, viszkozitás stb. (v) Referencia objektum, tárgy: Pl. szag, iz, oktánszám, lobbanáspont, mikroszkópiás objektumok, szál típus stb. Referencia anyagok „minőség” szerinti besorolása: (1) CRM = Certified Reference Material , SRM = Standard Reference Material (NIST) (2) Hiteles anyagminta kötelezően visszavezethető kell legyen SI-re. A deklarált értékeket mérési bizonytalansággal kell megadni. (2) RM = Reference Matrial, Tanúsított anyagminta kellően stabil és homogén anyagminták, amik felhasználhatók készülék kalibrálásra, módszerek vizsgálatára, elemzési eredmények igazolására


Referencia anyagok további csoportjai: (1) Elsődleges referencia anyag (Primary reference material) (2) Másodlagos referencia anyag (secondary reference material) (3) Házi referencia anyag (In-house reference material) Megbízhatóság romlik: 1

3

Referencia anyagok kiválasztásánál fontos tényezők: • az analit tulajdonságai, • a koncentráció tartomány, • mátrix összetétele, potenciális zavaróhatások, • mintaméret, • homogenitás, stabilitás, • mérési bizonytalanság.


Helyesség ( Trueness) • a helyesség meghatározásának lényege : x (módszer) <—> x (ismert)

(i)

összevetése

összevetés független módszerrel kapott referencia értékkel, amelyek célszerűen visszavezethetők nemzetközi standardokra (traceable). a CRM-k általában elfogadhatók. A x (ismert) = a CRM tanúsított

értéke (ii)

ellenőrzés CRM-el x + (konfidencia tartomány) ; x , s - ideális CRM : tanúsított, természetes mátrixú anyag, a vizsgált mintával közel azonos (limitált) - RM-k a gyakorlatban: (a)

tipikus anyag adalékolása megfelelő tisztaságú és stabilitású anyagokkal, gondos elemzés megfelelő felkészültségű laborokban (CRM)

(b)

tipikus, jól jellemzett anyag, vizsgálat a laboratóriumban, használat a laboratóriumon belül minőségellenőrzésre (RM)


Alkalmas referencia anyag választása validáláshoz: - hatósági vizsgálathoz: CRM (megfelelően illeszkedő mátrix) - igényes házi módszerekhez: CRM vagy jó minőségű házi RM - nem kritikus módszerekhez: szintetikus standard v. addicionált minta


A validálandó módszer összevetése független módszerrel: - 2 módszer, azonos minta vagy minták vizsgálata - a minta lehet: CRM, RM, tipikus minta - CRM előnye: ismert stabilitású és homogenitású - CRM hátránya: drága, esetleg nem megfelelő a mátrix


Az eltérések számszerű értékelése - általában az összes hiba alapján értékeljük a módszert (CRM) - figyelembe vesszük a: (i) a módszer szórását, (ii) a RM-ra megadott értékek mérési bizonytalanságát (iii) a módszertől megkívánt pontosságot (iv) az értékelés statisztikai tesztekkel célszerű végezni (egymintás t-próba, kétmintás t-próba, stb.)


Pontosság (Accuracy) • a PONTOSSÁG = a valódi értékhez való közelség mértéke PONTOSSÁG = szisztematikus hibák + véletlenszerű hibák PONTOSSÁG = helyesség és precizitás (Accuracy = trueness & precision)

f(x)

helyesség és precizitás (eltérés) (szórás)

c (valódi)

c (mért)

mérési bizonytalanság (measurement uncertainity) = a pontosság mérőszáma


Pontosság (Accuracy) ICH-szerint

4. Pontosság (Accuracy) ICH A pontosságot a tartományra kell vizsgálni ! 4.1. Hatóanyag (Assay) 4.1.1. Gyógyszer hatóanyag vizsgálatakor (a) ismert tisztaságú anyag elemzése (referencia minta, RM) (b) összevetés ismert pontosságú módszerrel (független vizsgálat)

(c) a pontosságra következtethetünk a precizitás, linearitás és specifikusság vizsgál adataiból



4.1.2. Gyógyszer készítmény vizsgálatakor

a) a készítmény ismert összetevőiből előállított szintetikus keverékkel

b) ha a készítmény minden összetevője nem alkalmazható: (b1) a készítményhez adott hatóanyag visszanyerés vizsgálat, (b2) összevetés ismert pontosságú módszerrel (független vizsgálat).

c) a pontosságra következtethetünk a precizitás, linearitás és specifikusság vizsgálat adataiból



4.2. Szennyezés mennyiségi meghatározásakor

• A pontosságot a minta (hatóanyag/készítmény) ismert mennyiségű szennyezővel történő adalékolással (spike) vizsgáljuk

• Ha a szennyezők nem állnak rendelkezésre összevetés ismert pontosságú módszerrel (független vizsgálat) használható.

4.3. Pontosság meghatározás adatai

• legalább 9 meghatározást kell végezni min. 3 koncentrációnál (pl. 3 koncentrációnál, 3-3 ismétlés a teljes eljárásra)

• Precizitás jellemzése: (i) visszanyerés % adattal (ii) cátl-cvalódi (konfidencia tartományokkal)


Helyesség vizsgálata. Két módszerrel kapott eredmények grafikus összevetése


Helyesség vizsgálata. Két módszerrel kapott eredmények grafikus összevetése. Példák a lehetséges esetekre A és B módszer eredményeinek összevetése:

(a) a két módszer eredmény teljesen egyezik, a=0, b=r=1 (b)a B módszer additív hibával terhelt a>0 (c) a B módszer arányos hibával terhelt b<1 (d)a B módszer additív és arányos hibával is terhelt a>0, b<1 (e) a B módszer a kis koncentrációk tartományában hibás

(f) mintáról-mintára változó eredmény pl., Pl. speciációs probléma, a módszer egy adott formát mér, de a mintákban két forma található


Pontosság, helyesség (összefoglalás)

1

2

elemzés ism. számítás (a) reagens vak • a vakmérések átlagát és referencia levonjuk a referencia anyag elemzése a 10 anyaggal mért átlagból. választott • az értéket hasonlítsuk módszerrel össze a valódi vagy a várt valódi értékkel • megkapjuk a módszer hibáját (b) reagens vak • a vakmérések átlagát és referencia levonjuk a referencia anyag vagy teszt 10 anyaggal/ teszt anyaggal anyag elemzése a mért átlagból. választott • az értéket hasonlítsuk módszerrel és össze a hasonló módon a független független módszerrel módszerrel kapott értékkel (ha lehet • megkapjuk a módszer közvetlen hibáját a független módszerrel) módszerhez viszonyítva

megjegyzés • a reagens vak, igazi vak • referencia anyag jellemzése

• a független módszernek is lehet hibája, ezért ez az eredmény nem abszolút mérőszáma a pontosságnak • egy direkt módszer ideális esetben hibamentes ezért jobb módszer a pontosság meghatározására


Helyesség, visszanyerés (összefoglalás)

elemzés ism. számítás megjegyzés mátrix vak vagy nem • határozzuk meg visszanyerést különböző • az adalékolt mintákban ddicionált minta, illetve a koncentrációknál mért koncentrációt az izsgált komponensekkel, Visszanyerés(%)= =(C1-C2)/C3 X 100, azonos, nem adalékolt ülönböző koncentrációban 6 ahol mintában mért ddicionált vak, illetve C1 = mért konc. az addicionált mintában koncentrációhoz minta viszonyítva tudjuk C2 = mért konc. a nem addicionált mintában meghatározni a C3 = hozzáadott koncentráció visszanyerést

iteles standard minta CRM)

határozzuk meg a visszanyerést a tanúsított értékre vonatkoztatva

• – az adalékolt mátrix vak, illetve minta elemzésével nyert visszanyerés általában jobb (pozitív hiba), mint a valódi mintákkal kapott érték, mert a meghatá-rozandó kötöttsége eltérő • attól függően, hogyan készült a CRM előfordulhat, hogy a mért visszanyerés >100%-nál


Precizitás

• A precizitás a mérés, a vizsgálat véletlenszerű változásait jellemző adat • A precizitás jellemzésére szolgáló adatok: szórás (s; SD), korrigált empirikus szórás, relatív szórás sr, RSD) (a) ismétlőképesség (precizitás ismétlőképességi körülmények között) az ismétlőképesség körülményei: azonos készülék, azonos személyzet, rövid idő (pl. ismételt mérés a készüléken) (b) reprodukálhatóság (precizitás a reprodukálhatóság körülményei között) (b1) a reprodukálhatóság körülményei: azonos módszer, eltérő laboratórium, eltérő személyzet, hosszabb idő. Ezt akkor van értelme meghatározni, ha a egy módszert több laboratórium is használ. (b2) a reprodukálhatóság egyszerűsített feltételei: azonos módszer, azonos készülék, eltérő analitikus, hosszabb vizsgálati időszak (egy laborban is értelmezhető pl. day to day reproducibility) • Mivel a szórás függ a koncentrációtól is, több koncentrációnál is meg kell határozni az ismétlőképességet, illetve reprodukálhatóságot (tartomány).


Ismétlőképesség

Ismétlőképesség (repeatability), (r)

• az ismétlőképességi szórásból σr, célszerű kiszámítani az ismétlőképességet (r), ami módot ad az analitikusnak annak megállapítására, hogy az ismétlőképességi körülmények között végzett ismételt mérések eltérései szignifikánsak-e r = t∞ ⋅ 2 ⋅ σ r

,

r = 1,96 x 1,41 σr = 2,76 x σr ,

ahol t∞ a student tényező nagyszámú ismételt mérésre, adott konfidencia limit, pl. 95 % , t∞=1,96

• ismétlőképesség a módszerre - azonos mintával végzett ismétlések, azonos körülmények között

• ismétlőképesség a mérésre (műszeres mérési szakasz) - azonos, előkészített mintával végzett, azonos körülmények között a műszeres mérés ismétlése

Ismétlőképesség szórás, sism , SDism

a módszer korrigált empirikus szórása az ismétlőképességi feltételek között

Ismétlőképességi limit, "r" " r"≤#

,

ahol a # a megfigyelt abszolút eltérés két elemzési eredmény között 95%-os konfidencia szinten.


Reprodukálhatóság • az reprodukálhatóság szórásból σR, célszerű kiszámítani az reprodukálhatóságot (R) R = t∞ ⋅ 2 ⋅ σ R

R = 1,96 x 1,41 σr = 2,76 x σR ahol t∞ a student tényező nagyszámú ismételt mérésre, adott konfidencia limit pl. 95 % , t∞=1,96 • Reprodukálhatóság a módszerre - azonos minta, azonos körülmények • Reprodukálhatóság a mérésre (műszeres mérési szakasz) - azonos előkészített minta, azonos körülmények Reprodukálhatóság szórás, srep , SDrep a módszer korrigált empirikus szórása az reprodukálhatósági feltételek között Reprodukálhatósági limit, "R" " R" ≤ #

,

ahol a # a megfigyelt abszolút eltérés két elemzési eredmény között 95%-os konfidencia szinten.


Precizitás, ICH szerint

5. Precizitás (precision) ICH

5.1. Ismétlőképesség (repeatability) (a) legalább 9 meghatározás az alkalmazott tartományra (pl. 3 konc. 3-3 ismétlés) (b) minimum 6 meghatározás a 100% -nál


Precizitás ICH-szerint

5.2. Kiterjesztett (átmeneti) ismétlőképesség (Intermediate precision) átmenet, közbülső állapot az ismétlőképességi és reprodukálhatósági körülmények között akkor alkalmazzuk, ha a vizsgálatot csak jellemzően csak egy laboratórium használja a kiterjesztés iránya függ attól, hogyan használja az adott laboratórium a módszert. A vizsgálónak értékelni kell a módszert befolyásoló további véletlen hatásokat: vizsgálati napok, változó analitikusok, változó készülékek változó vegyszerek stb. Az egyes tényezők hatását nem kell egyenként vizsgálni. Ajánlott a kísérlettervezési módszerek (mátrix) alkalmazása


Reprodukálhatóság ICH-szerint

.3. Reprodukálhatóság (reproducibility)

Reprodukálhatósággal a több laboratórium azonos vizsgálatait jellemezzük.

Az analitikai módszerek standardizálásakor alkalmazzuk.

.4. Precizitás jellemzése

SD, RSD, konfidencia tartomány.


Eljárások egy módszer szórásának meghatározására C.2.1. Szórás becslése egy minta ismételt elemzéseinek adataiból Egy minta n független ismételt elemzésével kapott eredményei: x1, x2, x3,............................xn Az átlagérték:

A korrigált empirikus szórás:

+ + + ........... + x n x = x1 x2 x3 n

s=

x1 15.2 14.7 15.1 15.0 15.3 15.2 14.9 x = 15.057 n=7

1

(x1 − x )

(x1 − x )2

0.143 -0.357 0.043 -0.057 0.243 0.143 -0.157

0.0204 0.1257 0.0018 0.0033 0.0590 0.0204 0.0247 ∑ = 0.2572

ν=n-1= 6

s=

− x) 2 n −1

∑ (x

0.2572 = 0.207 6


Eljárások egy módszer szórásának meghatározására C.2.2. Szórás becslése különböző minták két ismétléssel (duplikált) végzett elemzésével s=

∑ 2d

2

,ahol

2k

k = a duplikát mérések száma d = a két ismétléssel kapott eredmények különbsége ν = k a szabadsági fok xf , xs a duplikát mérés eredményei Megjegyzés: nem szükséges, hogy a k számú duplikát mérést azonos mintával végezzük el. Csak az szükséges, hogy vizsgált minták elemzésének várható szórása azonos legyen. Példa A: C.2.2. Azonos minta kétismétléses elemzés sorozata k

xf

xs

1 2 3 4 5 6 7

14.7 15.1 15.0 14.9 15.3 14.9 14.9

15.0 14.9 15.1 14.9 14.8 15.1 15.0

s=

0.44

= 0.18 ,

d 0.3 0.2 0.1 0.0 0.5 0.2 0.1

ν= 7 szabadsági fok

d2 0.09 0.04 0.01 0.0 0.25 0.04 0.01 ∑ = 0.44


Eljárások egy módszer szórásának meghatározására Példa B: C.2.2. Különböző minták kétismétléses elemzés sorozata xf , xs a duplikát mérés eredményei xf

xs

14.7 20.1 12.5 23.6 15.1 18.2 20.7

15.0 19.8 13.0 23.3 14.9 18.0 20.9

d2

d 0.3 0.3 0.5 0.3 0.2 0.2 0.2

0.09 0.09 0.25 0.09 0.04 0.04 0.04

∑ = 0.64 s=

0.64 = 0,21 , 14

ν= 7 szabadsági fok


Eljárások egy módszer szórásának meghatározására C.2.3. Szórás becslések összevonása Több szórásbecslés összevonható, hogy egy jobb becslést kapjunk. A megadott s1 - sk szórás meghatározás különböző alkalmakkor került elvégzésre az adott módszerrel:

s1 s2 s3

n1 n2 n3

v1 = n1 − 1 v 2 = n3 − 1 v 3 = n3 − 1

• • sk

• • nk

• • v k = nk − 1

s

Az s

p

p

=

v s2 + v s2 + ⋅⋅⋅⋅⋅ + v s2 11 2 2 k k v + v + ⋅ ⋅ ⋅ ⋅ +v 1 2 k

szóráshoz (ν1 + ν2 + ν3

νk ) szabadsági fok tartozik


Eljárások egy módszer szórásának meghatározására C.2.3. Szórások összevonása, példa Egy adott módszerrel a szórás mérése 5 alkalommal került megismétlésre. Ezeket a szórásokat kell összevonni, hogy javítsuk a σ becslés jóságát:

sp =

Ismétlés

s

n

1 2 3 4 5

0.171 0.205 0.185 0.222 0.180

7 5 7 4 5

ν (n-1) 6 4 6 3 4

6(0.171) 2 + 4(0.205) 2 + 6(0.185) 2 + 3(0.222) 2 + 4(0.180) 2 6+ 4+ 6+3+ 4 s p = 0.1755 + 0.1681 + 0.2054 + 0.1479 + 0.1296 23 s p = 0.190 (szabadsági fok 23)


Precizitás ismétlőképességi körülményekkel , precizitás reprodukálhatósági körülményekkel (összefoglalás) elemzés

független ism.

számítások

standardok, refe-rencia anyagok vagy adalékolt minta vak különböző koncentrációnál a) azonos analitikus, készülék, laboratórium, rövid időtartam b) eltérő analitikus, készülék, laboratórium, hosszabb időtartam

c) eltérő analitikus, készülék, laboratórium, hosszabb időtartam

10

határozzuk meg a szórást (s) minden koncentrációnál

10


10


megadja az ismétlőképességi szórást minden koncentrációnál ismétlőképesség, repeatability megadja a laboratóriumon belüli reprodukálhatóság szórást minden koncentrációnál kiterjesztett ismétlőképesség, itermediate precision megadja a laboratóriumok közötti reprodukálhatóság szórást minden koncentrációnál reprodukálhatóság, reproducibility együttműködő laboratóriumokat igényel


Mérési bizonytalanság

Mérési bizonytalanság, MB (measurement uncertainty) • A mérési bizonytalanság, MB egy szórás vagy konf. intervallum, ami kifejezi az eredmények lehetséges tartományát, mérési adatokra támaszkodva. • A MB tartalmaz minden lehetséges hatás az eredmény, a bizonytalansági komponenseket a hibaterjedés szabályit használva kombináljuk. Mit veszünk számításba: • a módszer teljes, hosszúidejű precizitását, szórását • az valódi értéktől való eltéréseket és azok statisztikai bizonytalanságát, a CRM bizonytalanságát. A becsült MB érték növelendő, ha szignifikáns eltérést állapítunk meg, de nem korrigálunk. • a kalibráció bizonytalanságát • egyéb tényezők Pl. hőmérséklet, idő stb. hatását a módszerre


Robosztusság (Robustness, Ruggedness) • Az analitikai módszerek egyes fázisai eltérően hatnak az eredményre (pontosság, ismétlőképesség) • Az egyes lépések hibái függenek a végrehajtás (analitikus) és az eszközök megbízhatóságától • A robosztusság vizsgálat az egyes lépések során bekövetkező véletlen ingadozások szerepét vizsgálja a pontosságra, ismétlőképességre, visszanyerésre, a módszert jellemző egyéb paraméterekre (felbontás stb.) • A robosztusság vizsgálat célja, hogy megismerjük a vizsgálat kritikus lépéseit, a kritikus faktorokat és ezt az ismeretet felhasználjuk a módszer javítására, helyes alkalmazására • Az egyes paraméterek véletlen ingadozásai általában kombinálódnak, ezt a robosztusság kísérleti tanulmányozásnál számításba kell venni


Robosztusság (Robustness, Ruggedness,)

Példák

(i) Váltózó paraméterek analitikai műveletekben: • az anlitikai oldatok időbeli stabilitása • műveleti idő (extrakció, rázás, reakció idő stb.)

(ii) HPLC módszerek: • a mobil fázis pH változásának hatása • a mobil fázis összetétel változásának hatása • a kromatográfiás oszlopok eltérései (gyártó, sorozat, használat) • a hőmérséklet változás hatása • az eluens áramlási sebesség változása

(iii) Gázkromatográfiás módszerek: • kromatográfiás oszlopok eltérései (gyártó, sorozat, használat) • hőmérséklet • áramlási sebesség (eluens, split)


Robosztussági teszt (1)

A robosztusság teszt főbb lépései (i) A módszert befolyásoló faktorok kiválasztása (ii) A faktorok jellemző véletlen ingadozása alapján a faktor szintek megválasztása (iii) A kísérlettervezési módszer kiválasztása (iv) A vizsgált válaszok kijelölése (v) A kísérleti beállítások megtervezése és a kísérletek végrehajtása (vi) A faktorok hatásának számítása (vii) A hatások grafikus és statisztikai értékelése, értelmezése (viii) Következtetések levonása



(i) A módszert befolyásoló faktorok kiválasztása • a vizsgált tényezők egy része az analitikai módszerből adódik (módszerleírás) • az egyéb tényezők a környezeti állapotokra vonatkoznak • az eredményt várhatóan legjobban befolyásoló tényezőket választjuk • a faktorok lehetnek (a) kvantitatív faktorok (continuous), Pl. HPLC-re a mobil fázis pH-ja, az oszlop hőmérséklete, az áramlási sebesség, a detektálás hullámhossza stb. (b) kvalitatív faktorok (discrete), Pl. az oszlop gyártója, a vegyszer gyártója (c) kevert faktorok, Pl. a kevert vivőfázisban a vizes vagy szerves módosító frakciók részaránya. p komponens esetés p-1 mennyisége választható függetlenül.


Robosztussági teszt (3) (ii) A faktorok szintjei: • általában a nominális szint mellett két szintet választunk minden faktorra (x(-), x(0), x(+)) • a választott szintek tükrözzék a reális véletlen ingadozásokat, • az x(-), x(+) szintek általában szimmetrikusak, de lehetnek nem szimmetrikusak is, ábra Faktor szintek szimmetrikus és aszimmetrikus választása (hullámhossz)



ábra A tanulmányozott HPLC módszer AC hatóanyag, RC1 és RC2 formázó anyag mennyiségi meghatározása


Robosztussági teszt (5) Táblázat Faktorok és faktor szintek egy HPLC módszernél


Robosztussági teszt (6) (iii)

Kísérletervezési módszer választása

A módszer választása függ a vizsgálandó faktorok számától és a módszer kínálta statisztikai elemzés lehetőségeitől, a várható következtetésektől: • • • • • •

a kétszintes teljes faktoros kísérletterv a kétszintes részfaktoros kísérletterv (fractional factorial design, FF) a Placket-Burman kísérletterv használata a szokásos (PB) ha f faktort vizsgálunk min. f+1 kísérlet szükséges FF esetén a kísérlet: f=7, N=8 tól N=16, N=16 vizsgálat esetén 7 faktor hatására és 8 faktor kölcsönhatásra kapunk információt PB esetén f=7, N=8 vagy N=12


Robosztussági teszt (7) Táblázat HPLC módszer vizsgálata PB kísérlettervezésel. 8 faktor és 3 segédfaktor, N=12 kísérlet. Válaszok: visszanyerés AC% és az Rs(AC-RC1) felbontás A faktorok hatása és a segédfaktorok kritikus hatása



(iv) A vizsgált válaszok: komponens koncentráció és az u.n. SST jellegű válaszokat is vizsgálhatunk. •

A módszer akkor robosztus, ha a faktoroknak nincs szignifikáns hatása a választott válaszokra.

•

SST válaszok elválasztás technikai módszereknél: retenciós idő, retenciós faktor, elméleti tányérszám, csúcsfelbontás, csúcsaszimmetria stb.



(v) A kísérleti beállítások megtervezése és a kísérletek végrehajtása. • a kísérletek végrehajtásakor gyakori a „randomizálás” alkalmazása •

idő függvényében leírható változások (oszlop öregedés) esetén a „randomizálás” nem jó, esetleg drift korrekciót kell alkalmazni


Robosztussági teszt (10) (vi) A faktorok hatásának számítása • X faktor hatása az Y válaszra, Ex = az átlag válaszok különbsége E x = Y (+) − Y (−) , adatok a táblázatban (vii) A hatások grafikus és statisztikai értékelése, értelmezése (t-test, ANOVA, F-test) Ex • t-teszt alkalmazása t= ⇔ t critical , ( SE ) e ahol (SE)e az Ex becslés hibája

E x ⇔ Ecritical = t critical ⋅ ( SE ) e



(i) Következtetések • A módszer robosztus, ha a faktoroknak nincs szignifikáns hatása a koncentráció adatokra (visszanyerés) • az SST válaszokra gyakran szignifikáns hatása van egy-egy tényezőnek, ilyenkor SST limiteket lehet megadnia robosztus koncentráció válasz tartományra.


Robosztusság (Robustness), összefoglalás

elemzés válasszuk ki azokat a paramétereket, amelyek döntően befolyásolják a a módszerrel elérhető analitikai jellemzőket.

Végezzünk méréseket a főbb paraméterek szisztematikus változtatásával (referencia anyag, ismert összetételű minta, CRM elemzése) és határozzuk meg a paraméterek hatását az analitikai jellemzőkre (pontosság, precizitás stb.)

ism. számítás (i) határozzuk meg minden beállításnál minden változtatás 1-1 elemzés hatását az átlagértékre (ii) rendezzük a paramétereket sorrendbe a hatásuk nagysága szerint

megjegyzés (i) tervezzük meg a módszer minőségellenörzését, hogy észleljük a kritikus paraméter hatását (ii) koncentráljunk a módszerfejlesztés során a kritikus paraméterekre


Standard, illetve validált módszerek használata

(1) A meglévő validációs adatok elégségesek-e (2) Ha a meglévő validáció elégséges vizsgálandó: • az alkalmazó laboratórium képes-e a módszerben dokumentált analitikai jellemzőket elérni? • a műszaki feltételek, műszerek megfelelőek-e? • a személyzet felkészültsége megfelelő-e? (3) Az adaptált validált módszereket gondosan ellenőrizni (részleges validálás) kell, hogy az adott körülmények között megfelelőek-e a teljesítményjellemzők ! (4) Ha a mások által validált módszert adaptálni, változtatni kell újra validálás válik szükségessé

Laboratóriumok minőségbiztosítása, módszervalidálás Analitikai módszerek validálása ( Dr. Bezur László egy. doc. BME ÁAKT)

Recommend Documents