Dr. Abrankó László – Dr. Dernovics Mihály
Analitikai mérések minőségbiztosítása
Mi a minőség? A mindennapok során a minőség kifejezést sokféleképpen értelmezik: megfelelő paraméterek, megbízhatóság, megfelelés az előírásoknak, jogszabályoknak, jó szervizhálózat, tartósság, kényelem, szaktudás, kedves, udvarias, gyors kiszolgálás, esztétikai megjelenés, csomagolás, versenyképesség, jó hírnév, műtárgyak, régiségek energiatakarékosság, környezetbarát termék, megfelelő ár, gazdaságosság, időben, határidőre történő szállítás, stb.
magyar nyelvben: minőség = jó minőség!!!
„Minőségügyi-szakmai” megközelítések a minőségről •Crosby, Philip : megfelelés a követelményeknek. •Juran, Joseph M.: használatra való alkalmasság, a felhasználó megítélésnek megfelelően. •Deming, W. Edwards: az egyenetlenség és megbízhatóság előre meghatározott mértéke, a piacnak megfelelő alacsony ár mellett.
Miért fontos a mérések minősége? Az analízis során kapott információt döntések alátámasztására használjuk fel. • Megfelel-e egy adott termék a (saját, hatósági, vevői stb.) specifikációknak? • Egy adott technológiai lépés valóban a kívánt hatást eredményezte? • Megtalálható-e az adott termékben egy bizonyos komponens?
Kinek fontos a mérések minősége?! A „value-for-money” elv alapján a megrendelő dönt, a mérést végrehajtó útmutatásai alapján. • célkomponensek száma • „ócsítási” eljárások • jogi behatároltság • elvárható gondosság • állandó kompromisszumkényszer! válasz: az analitikusnak...
Mikor tekintjük analitikai módszert jó minőségűnek? •Megbízható? •Pontos? •Olcsó? •Gyors? •Kvantitatív, vagy kvalitatív? •Minél több komponenst tud kimutatni? •Robusztus (pl.: terepen is használható)? •Egyszerű? Gyorsteszt – gyors, olcsóbb de kevésbé megbízható. Referenciamódszer – drágább, lassabb, de megbízhatóbb.
Mikor tekintjük analitikai módszert jó minőségűnek? A „Fit-for-purpose” elv 1.
Az analitikai méréseket úgy kell végezni, hogy azok kielégítsék az egyeztetett (vevői célokhoz igazított) követelményeket.
2.
Az analitikai méréseket olyan módszerekkel és eszközökkel kell végezni, amelyek igazoltan megfelelőek a kívánt cél eléréséhez.
3.
Az analitikai méréseket végző személyzetnek képzettnek és kompetensnek kell lennie a feladatok elvégzésére (és igazolniuk kell, hogy az analitikai feladatot megfelelően el tudják végezni).
4.
Az analitikai méréseket végző szervezeteknek jól meghatározott minőségbiztosítási eljárásokat kell alkalmazniuk.
5.
A laboratórium felkészültségét rendszeres és független felülvizsgálatnak kell alávetni.
6.
Az egyik helyen elvégzett analitikai mérésnek egyeznie kell egy másik helyen elvégzettel (azaz az eredménynek következetesnek kell lennie).
The Fitness for Purpose of Analytical Methods, EURACHEM, 1998
Az analitikai méréseket úgy kell végezni, hogy azok kielégítsék az egyeztetett (vevői célokhoz igazított) követelményeket. Mire kíváncsi a megrendelő? Mik a mérendő mutatók, alkotók? •Hozzáadott, vagy összes vitamin? •Összes ólom vagy biológiailag hozzáférhető ólom? Fontos-e a mért komponensek mennyisége? •Igen/nem válasz (pl.: tiltott növényvédőszer alkalmazása, vagy allergén jelenléte) •Félkvantitatív vizsgálat (pl.: kétszer annyi van az egyikban, mint a másikban) •Kvantitatív vizsgálat. Mennyire megbízható eredményre van szükség? •Milyen határértékek vonatkoznak az adott mérendő alkotókra?
Az analitikai méréseket olyan módszerekkel és eszközökkel kell végezni, amelyek igazoltan megfelelőek a kívánt cél eléréséhez.
A módszer (és az alkalmazott eszközök) megfelelőségének bizonyítása a validálás (érvényesítés; lásd később).
Az analitikai módszer validálása során megbizonyosodunk arról, hogy az alkalmazott eljárás megfelel-e egy adott felhasználási célhoz rendelt követelményeknek. Mindez oly módon valósul meg, hogy az egyes lépések külön-külön is megbízhatóan kielégítenek minden megadott jellemzőt, minőségmutatót.
Általában validált módszereknek tekintik: •A szabványos módszereket (miért „hasznosak”? miért „károsak”?) •Az elismert intézmények, szervezetek által publikált módszereket •Rangos tudományos folyóiratokban publikált módszereket Saját fejlesztésű, vagy átvett, de módosított módszereket validálni kell (lásd később) Amennyiben a validált módszereket alkalmazunk, akkor az első lépést megtettük a megbízhatóság irányába.
Az analitikai méréseket végző személyzetnek képzettnek és kompetensnek kell lennie a feladatok elvégzésére (és igazolniuk kell, hogy az analitikai feladatot megfelelően el tudják végezni). Kompetencia: A megtanult ismeretek új helyzetben való alkalmazásán túl, született adottságok, élettapasztalatok, egyéb tényezők, ösztönös mechanizmusok összetett működése. Jártasság, készség: egy adott feladat vagy munka során felhasználható, ahhoz szükséges tudás, mely oktatás, képzés (tanulás) és egyéni tapasztalatszerzés során alakul ki (vö. rutin!) Tudás: az egyén által megszerzett (megszerezhető) ismeretek (vö. jártasság)!)
Személyzet felkészültségének igazolása: •Körelemzések, jártassági vizsgálatok (lásd később) •Végzettség és tapasztalat
Az analitikai méréseket végző szervezeteknek jól meghatározott minőségbiztosítási eljárásokat kell alkalmazniuk. Minőségbiztosítás: minőségmutatók, vagy minőségtulajdonságok teljesítése érdekében érdekében tett tevékenységek, intézkedések összessége.
Minőségirányítási rendszer: egy olyan szervezeti és működési rendszer, amely magába foglalja azokat a szükséges folyamatokat, eljárásokat, tevékenységeket, eszközöket, felelősségeket és hatásköröket amelyek együttesen szükségesek a kívánt minőség megvalósításához. Kulcsszavak (további): visszavezethetőség, nyomonkövethetőség, deviancia („shift”)
A laboratórium felkészültségét rendszeres és független felülvizsgálatnak kell alávetni.
Minőségirányítási rendszerek bevezetése és azok tanúsítása •Általános (tevékenység- és szektorfüggetlen) rendszermodellek. Például ISO 9001 •Szakma, vagy tevékenységspecifikus minőségirányítási rendszermodellek. Vizsgálólaboratóriumok esetében például: ISO/IEC 17025 (általános analitika), vagy ISO/IEC 15189 (orvosi analitika) és AABB
Az akkreditálás annak hivatalos elismerése, hogy egy adott szervezet (esetünkben ez alatt vizsgálólaboratóriumot értünk) alkalmas bizonyos tevékenységek (itt vizsgálatok vagy vizsgálattípusok) elvégzésére. A hivatalos elismerés alatt azt értjük, hogy erre jogszabály alapján felhatalmazott szerv (akkreditáló szervezet) elismeri és igazolja, hogy a kérelmező szervezet alkalmas meghatározott feladatok szabályszerű elvégzésére. Az akkreditálás célja az egységes európai elvekre épülő akkreditálási rendszerekben elismerést nyert szervezetek iránti bizalom megszerzése, a vizsgálati tevékenység megbízhatóságának növelése, a vizsgálati eredmények kölcsönös elfogadásának elősegítése. Az egyik helyen elvégzett analitikai mérésnek egyeznie kell egy másik helyen elvégzettel (azaz az eredménynek következetesnek kell lennie)
Minőségellenőrzés? Minőségszabályozás? Minőségbiztosítás?
1900 előtt
Mesteremberek kora: minden darabot ő maga megvizsgál; a hibást (selejtet) keresi meg, és nem az okot. A termelés és az ellenőrzés nem válik szét.
A XX. század első fele
Csak művezetői ellenőrzés, MEO. Szétválik a termelés és a minőségellenőrzés. Cél: megtalálni a selejtet.
A XX. század második Statisztikai minőségellenőrzés, majd statisztikai folyamatszabályozás (SPC). Meg kell keresni a hiba okát, fele hogy a folyamatot vissza tudjuk hozni a határok közé. A XX. század utolsó harmada
Minőségirányítás. Minőségirányítási rendszermodellek megjelenése.
A minőségirányítási rendszerek egyik járulékos célja lehet az uniformizálás, és ezáltal a kompatibilitás megteremtése.
Végtermék (minőség) ellenőrzése helyett a folyamatok (minőség)szabályozása: •Meg kell határozni a folyamat paramétereit, Ezeknek mérhető, vagy minősíthető paramétereknek kell lenniük •Meg kell határozni azokat a határértékeket amelyeken belül kell maradniuk annak érdekében, hogy a termék minősége megfelelő legyen •A kijelölt paramétereket figyelemmel kell kísérni (monitorozni kell) •Amennyiben egy adott paraméter a kijelölt tartományon kívülre esik (vagy értékeinek változása ilyen tendenciát mutat) be kell avatkozni (=eljárással kell rendelkezni).
Minőségellenőrzés
Feröer-szigetek és a metil-higany?
Analitikai módszerfejlesztés (ideértve a mintaelőkészítést is)
Ennek megfelelő mintavétel és mintakezelés
validálás
Validált analitikai módszer (ideértve a mintaelőkészítést is)
Eredmény
Nem az eredményt kell ellenőrizni, hanem a módszert.
Megbízható eredmény
Rendszeres minőségellenőrzés
Analitikai cél (pontos kérdésfeltevés)
Mindazon tevékenységeket (ellenőrzés, szabályozás) melyeket azért végzünk, hogy fenntartsuk a bizalmat a módszerünk megfelelőségében: minőségbiztosításnak nevezünk.
Validálás és verifikálás
A módszerről csak egyszer (először) kell bizonyítani, hogy az validnak (érvényesnek) tekinthető, ugyanakkor e meglevő és bizonyított képességét folyamatosan biztosítani kell. Teljesítőképességét rendszeresen ellenőrizni és igazolni (verifikálni) kell.
Egy kis kitérő.... (ugyanis az eredmény megszületése nem a laboratóriumban kezdődik)
Mintavétel (elsődleges mintavétel) Mintavétel tervezésekor az alábbiakat kell átgondolni: •
Átlagminta, pontminta, minták száma (homogenitás)
•
Szükséges helyszíni tartósítási eljárások
•
Lehetséges szennyezők (edények, vegyszerek, körülmények)
•
Szükséges mintamennyiség (mintaelőkészítés, analízis, ismétlése)
Az analízis megfelelőségét legnagyobb részben a mintavétel helyessége határozza meg!
Inhomogenate analyte distribution – representative sampling
The amount of protein and of aflatoxin B1 in a lot of nuts. The theoretical lot consists of 100 pre-packed packets.
Módszervalidálás A módszer első „üzembe helyezése” előtt objektív módon bizonyítani kell, hogy az alkalmas az adott feladatra. Objektív bizonyítékok begyűjtése: 1.
Teljesítményjellemzők meghatározása.
2.
Elfogadási kritériumok meghatározása.
3.
Mérésekkel megállapítjuk a módszerünk adott teljesítményjellemzőit, azok értékeit.
4.
Amennyiben ezek megfelelnek az elfogadási kritériumoknak, megfelelőnek (validáltnak) minősítjük a módszerünket.
Analitikai teljesítményjellemzők lehetnek: •
Szelektivitás
•
Linearitás
•
Méréstartomány (range)
•
Zavartűrés
•
Kimutatási határ (detection limit, DL vagy limit of detection, LOD)
•
Mennyiségi meghatározási határ (LOQ)
•
Precizitás (szorosság)
•
Ismételhetőség (repeatability)
•
Reprodukálhatóság (reproducibility)
•
Helyesség, pontosság (accuracy)
Szelektivitás: A módszer milyen mértékben képes adott alkotó meghatározására egyéb, zavaró alkotók jelenlétében. Az a módszer, mely a meghatározandó alkotók egy csoportjára vagy a meghatározandó alkotóra tökéletesen szelektív, azt specifikusnak nevezzük. Kjeldahl-módszer ...és a melamin?...
Szelektivitás:
Vitaminozott műzli-extraktum 266 nm-en felvett kromatogramja fortified cereal 10 9
fortified cereal
riboflavin
8
absorbance @266
7 6 5 4 1
3 2 1 0 0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
retention time
266nm-es hullámhossz nem szelektív, azaz sok komponensnek van itt elnyelése. Riboflavin (B2-vitamin) abszorpciós spektruma
23
Vitaminozott műzli-extraktum 448 nm-en felvett kromatogramja
Szelektivitás:
fortified cereal
1.8
fortified cereal
1.6
riboflavin
absorbance @ 448
1.4 1.2 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0 0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
retention time
448nm-es hullámhossz szelektívnek tekinthető. Riboflavin (B2-vitamin) abszorpciós spektruma
20
21
22
23
Szelektivitás folyt.
Zn mérésekor, Ni jelenlétében a 64Zn izotóp nem szelektív.
100 90 80 70 60 50 64
Zn
64
Ni
66
Zn
40 30 20 10 0
64Zn-64Ni
izobár interferencia ICP-MS esetén
cts/s
Szelektivitás folyt. A módszer szelektivitása ellenőrizhető olyan modelloldat vizsgálatával, amely tartalmaz várhatóan interferenciát okozó komponenseket, de nem tartalmazza a meghatározandó komponenst (analit). [2] Spectrum No.1
[ 110.528 sec]:001SMPL.D / Tune #2 [CPS] [Linear]
2.0E7
Ar2, Ca2, CaAr, S2O, SO3
ArO, CaO
ArC, ClOH, SO
1.0E7
S2, SO2
ArOH, CaOH
ClO
m/z->
50
52
ClO ArN 54
CaO ArNa CaOH 56
1% HNO3, HCl, H2SO4, BuOH + 100ug/ml Ca és Na mátrixmodell-oldat ICP-MS spektruma
Ha kéntartalmú a minta m/z = 64-nél, ez szintén interferenciát okoz.
58
60
62
64
S2, SO2 66
ArS 68
70
72
ArCl, CaClAr
2
74
76
Ar2 78
80
82
84
Precizitás*, megbízhatóság: A kölcsönösen független megismételt vizsgálatok közötti egyezés mértéke, rendszerint a szórással kifejezve. *Kisebb, rosszabb precizitás = nagyobb szórás Helyesség, pontosság (accuracy): A mérési eredménynek és a mérendő mennyiség valódi értékének a közelsége.
pontosság
precizitás
Ismételhetőség: A precizitás azon fajtája, amely ismételhető körülmények között elvégzett mérésekre vonatkozik, vagyis: azonos minta, azonos műszer, azonos kezelő, azonos laboratórium. Reprodukálhatóság: A precizitás azon fajtája, amely reprodukálható körülmények között elvégzett kísérletekre vonatkozik, vagyis: azonos módszer, különböző műszer, különböző kezelő, különböző laboratórium.
Érzékenység Y = mx + b
(m = ∆y/∆x = tg α)
40 35 30
válaszjel
25
α ∆y2
20
∆x2
15 10
∆y1
∆x1
5 0 0
1
2
3
4
koncentráció
5
6
7
Kimutatási határ: A meghatározandó komponens legkisebb mennyisége mely még detektálható, de nem feltétlenül kvantifikálható pontos értékkel. Az elfogadott definíció szerint számszerűsítve: Az a koncentráció vagy anyagmennyiség, amelyhez tartozó válaszjel értéke megegyezik a vak minta közepes (átlagos) válaszjelének és a vak minta válaszjel háromszoros szórásának összegével.
Kimutatási határ 1 2 3 4 5
600
átlag (0-300sec) SD (0-300sec) 3SD kimutatási határ (1+3 sor) csúcsmag. @ 340.8 min
Se77 Se78 102 323 11 18 33 54 135 377 125 523
500
jelintenzitás
400
Se77 Se78
300
200
100
0 0
50
10 ng/ml SeMet
100
150
200 retenciós idő
250
300
350
400
Kimutatási határ
2.5
jelintenzitás
2
1.5
3
1
2
0.5
1
0 0
0.05
0.1
0.15
0.2
0.25 koncentráció
0.3
0.35
0.4
0.45
0.5
Meghatározási határ: Az a legkisebb koncentráció v. anyagmennyiség, amely még elfogadható precizitással határozható meg. általában < 10%-ot tekintjük elfogadási kritériumnak 2000 1800
50 ng/ml SeMet (a jel ismételhetősége kb. 5-8%)
1600
jelintenzitás
1400 1200
10 ng/ml SeMet: kimutatási határ (a jel ismételhetősége 20-30%)
1000 800 600 400 200 0 0
50
100
150
200 retenciós idő
250
300
350
400
Meghatározási határ (quantification limit, QL vagy limit of quantification LoQ) 2.5
jelintenzitás
2
1.5
10% 1
QL (DL = 30%)
0.5
0 0
0.05
0.1
0.15
0.2
0.25 koncentráció
0.3
0.35
0.4
(QL ≈ 3DL )
0.45
0.5
Általában ismételhetőség jobb, mint a reprodukálhatóság, ...de vannak kivételek.
Al B Cd Co Cr Cu Fe Li Mn Ni Rb Se Sr
Nem precíz, de pontos
BCE IKI átlag RSD% átlag RSD% 51.0 4.7% 55.0 26.3% 17.8 7.7% 15.2 4.0% 0.26 15.1% 0.07 1.9% 0.27 12.9% 0.21 2.0% 0.19 7.6% 0.20 8.2% 12.8 1.4% 14.2 4.1% 90.5 2.1% 96.0 2.5% 0.49 8.8% 0.51 1.9% 15.3 0.4% 16.7 1.0% 1.40 5.9% 1.44 4.1% 3.26 2.1% 3.45 3.3% 0.35 29.3% 0.12 11.1% 5.25 3.0% 5.68 4.4%
Reprodukálhatóság átlag RSD% 53.0 5.3% 16.5 11.1% 0.16 84.4% 0.24 15.7% 0.19 4.2% 13.5 6.9% 93.3 4.1% 0.50 2.5% 16.0 6.3% 1.42 2.0% 3.36 4.1% 0.23 70.3% 5.46 5.6%
Nem precíz, nem pontos Kalocsai fűszerpaprika őrlemény elemanalitikai vizsgálata.
Linearitás: Az analitikai mérőgörbének az a tartománya, megbízhatósággal egyenesnek (lineárisnak) tekinthető.
ahol
az
adott
12
10
Linearitási tartomány felső határa
jelintenzitás
8
6
Elfogadási kritériumként meghatározott bizonytalansági tartomány.
4
2
0 0
1
2
3
4
koncentráció
5
6
7
Méréstartomány: A felső és alsó meghatározható koncentráció közti tartomány. Az a munkatartomány, melyre az adott feladatnál kielégítő helyesség (pontosság) és precizitás érhető el. Zavartűrés, robusztusság: A a képesség, hogy egyes befolyásoló paraméter változások hatására, hogyan viselkedik, reagál, hogyan módosul a mérési eredmény. Többféle szinten értelmezhető! • módszerre • mintaelőkészítésre • műszerre vagy műszer-összeállításra
Robusztusság: Fenilezési reakció pH függése 1.80 1.60 1.40 7
terület [10 ]
1.20 1.00
A reakció „pH robusztus” pH = 4-5 között
0.80 0.60 0.40 0.20 0.00 2
3
4
5 pH
Metil-Hg (NaBPh4-el történő) fenilezési reakciójának pH függése
6
7
8
A kvantifikálás (mennyiségi kiértékelés/meghatározás) minőségbiztosítása
Kalibráció: a mérendő tulajdonság mért értékének összevetése egy visszavezethető etalon ugyanilyen tulajdonságára mért értékkel.
Összehasonlítás, mely azonos mérési körülményeket, valamint visszavezethető és megbízható etalont igényel.
16 14
jelintenzitás
12 10 8 6 4 2 0 0
1
2
3
4
koncentráció
abszorbancia CuSO4
Kalibrációs függvény: a megfigyelt/mért érték és az analitikai eredmény közötti összefüggés. koncentráció
5
6
7
Kalibrációhoz felhasznált etalonoknak visszavezethetőnek kell lenniük Visszavezethetőség (traceability): Egy mérési eredmény vagy egy referenciaérték azon tulajdonsága, hogy az levezethető vagy kapcsolatba hozható valamilyen magasabb rendű referenciaértékkel. •A visszavezetés nemzeti, vagy nemzetközi etalonokhoz történő összehasonlítások töretlen láncolatán keresztül valósul meg. •Az összehasonlítások szükségszerűen bizonytalanságot eredményeznek, így a referenciaértékhez bizonytalanság is társítható.
Kalibrációhoz felhasznált etalonoknak visszavezethetőnek kell lenniük
Visszavezethetőség (traceability) igazolására az analitikai műbizonylat szolgál.
A szilárd (kristályos) referencia anyag tisztasága. (pl.: >98%) Az oldat koncentrációja. (pl.:100 ± 0.3 mg/l)
A kalibráláshoz felhasznált etalon visszavezethetősége és megbízhatósága. Kalibrált eszközök
A munkaoldat vajon visszavezethető? Visszavezethető törzs standard
hígítás hígítás 1 mg/l ???
Kalibráció megbízhatósága
Kalibráló oldat
Független hígítások
Minta 0,97 mg/l
1 mg/l Minta
Kalibráló oldat
1,02 mg/l
1 mg/l
Kalibráció megbízhatósága II.
Válaszjel
R2 = 1.000
Koncentráció
Kalibrációs függvény becslése: az elméleti mérési összefüggés ismerete alapvető a kapott függvény értékelése szempontjából! (példa: ELISA vs. VIS-fotometria vs. HPLC-VIS) 16 14
jelintenzitás
12 10 8 6 4 2 0 0
1
2
3
4
koncentráció
5
6
7
Lineáris regresszió – a legelterjedtebb függvény-becslés A függvény azt fogja kifejezni, hogy a független változó (x) adott értékéhez átlagosan milyen y érték tartozik. Mikor jó?... 16 14
y = 2.3424x + 0.365 R2 = 0.9855
jelintenzitás
12 10 8 6
Legkisebb négyzetek elve
4
∑ (x
2
− x ) → min 2
i
0 0
1
2
3
4
koncentráció
5
6
7
Pontok súlya (legyen a példában az elméleti összefüggés: y=2x) 9 8.0
y = 1.962x + 0.11 R2 = 0.9986
8 7
6.1
válaszjel
6 5 3.9
4 3
2.1
2 1 0 0
1
2
3
mérendő mennyiség
4
5
Nem azonos súlyú pontok alkalmazásakor az R2 érték hamis mutatóvá válik!
250
válaszjel
198.0
y = 2.0024x - 2.3945 R2 = 0.9998
200
150
100
50 1.5 7.0
16.2
0 0
10
20
30
40
50
60
mérendő mennyiség
70
80
90
100
110
• hol lesz „jó” a kapott összefüggés? A regressziós tartomány közepén. • miért? mit lehet tenni a határpontok bizonytalanságának csökkentése érdekében? 16 14
jelintenzitás
12 10 8 6 4
∑
2
i
2
xik − x → min ∑ 2 σx x ) → min k ∑ (x − i i
0 0
1
2
3
4
koncentráció
5
6
7
• gond: az összefüggés felállításánál a mérési pontok bizonytalansága eltér • megoldás? 16 14
jelintenzitás
12 10 8 6 4
∑ (x
2
− x ) → min 2
i
0 0
1
2
3
4
koncentráció
5
6
7
Lineáris regresszió súlyozás nélkül
Lineáris regresszió súlyozással
...jó ez így?...
Mintaelőkészítés validálása /része a mennyiségi meghatározás minőségbiztosításának!/ Felmerülő kérdések: • Minta homogenitása • Extrakció megfelelősége • (és/vagy) Roncsolás megfelelősége • Meghatározandó komponens(ek) integritásának megőrzése /”No decomposition” elv/ • Származékképzés megfelelősége • Mátrixhatás jelentőssége (mintaelőkészítés befolyása a mérés érzékenységére)
Csak minőségi vizsgálatok esetén ezek nem annyira fontos kérdések, mint mennyiségi elemzés során!
Mátrixhatás: ez most nem az interferenciára utal!!! (nem arról van szó, hogy a mátrix önmagában jelet ad) Minta + standardsor
Csúcs alatti terület
3,E+06
Tiszta oldószer + standardsor
0,E+00 0
2
4
6
8
Koncentráció (µg/ml)
10
Standardok tiszta oldószerben Thiamin (B1)
2.
Ascorbic acid (C)
3.
Unknown
4.
Nicotinic acid (B3)
5.
Unknown
6.
Pantothenic acid (B5)
7.
Folic acid (B9)
8.
Riboflavin (B2)
9.
Methylparaben
C
3 Abszorbancia (mAU
1.
NA
B2
B1 NS B6
B9
0 0
5
10
15
Retenciós idő (perc)
...és a minta mátrixába ágyazva
20
Minta + standard(sor) = standard addíció
oldószer
Old + std.
Old + Több std.
minta
minta
minta
Egy tetszőleges (kezeletlen) laska gomba kromatogramja + 2ppm D2
Természetes + 2ppm D2 = + 20 ug/g sz.a. Természetes D2 vitamin
Mire szolgál itt a standard addíció az érzékenység meghatározásán kívül?... Milyen hibák merülhetnek fel?...
Standard addíció II. 14
y = mx + b
jelintenzitás
x( y =0 )
I’’ 12
−b = m
10
I’
8 6
I 4
x(y=0)
2 0 -2
-1.5
-1
-0.5
0
0.5
1
1.5
koncentráció
0
0.5
1
1.5
2
2.5
2
2.5
5000
y = 1668.5x + 1152.5 R2 = 0.9999
4500 4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500 0 0
0.5
1
1.5
0
1163
1
2800
2
4500
2
2.5
Standard addíció III. Előny (külső kalibrációhoz képest): • Mátrixhatás kiküszöbölhető • Standard oldat vakértékét nem vonjuk le mért értékből (mint ahogy tennénk külső kalibrációnál - negatív rendszeres hiba elkerülhető)
Hátrány: •Lassú, körülményes •Mintaigényes •Mintaelőkészítési eljárás vakértéke külön kezelendő (pozitív rendszeres hibaforrás lehet!)
Mátrix illesztett kalibráció (≠ spiking /adalékolás/!!!) 1. Egy mintát addicionálunk 2. Az ezek alapján kiszámolt meredekséggel kalkuláljuk a többi minta koncentrációját
Belső standard (internal standard) Az analitikai mérések során a mintához adott olyan referenciaanyag, amely: •
nem található meg a mintában,
•
különbözik a célkomponens(ek)től,
•
ugyanakkor bizonyos tulajdonságaiban kellően jól modellezi az(oka)t.
A belső standard használatának célja: a minta-előkészítés és/vagy a mérés megfelelőségének közvetlen ellenőrzésére, illetve bizonyos hibák korrekciója. A belső standard alkalmazásának számos célja és értelmezése lehet.
A belső standard alkalmazási lehetőségei: I) A belső standardo(ka)t az extrakció előtt adagoljuk a mintához - kísérő standard (surrogate)
Vizsgálati mintarész
Extrakció Minta tisztítás
Analitikai minta II) A belső standardo(ka)t közvetlenül a mérés előtt adagoljuk a mintához Mérés
Belső standard korrekció I. A mérendő és a belső standard válaszjelének hányadosa az új mérendő 35 30
válaszjel
25 20 15 10 mérendő belső standard
5
mérendő/belső standard
0 1
2
3
4
5
ismételt mérések
6
7
8
Belső standard korrekció 16 14
I rel
jelintenzitás
12
Im = I std
10 8 6 4
A belső std koncentrációja minden pontban azonos
2 0 0
1
2
3
4
mérendő koncentrációja
5
6
7
Mátrixhatás: A mintában található sótartalom, szerves komponensek jelcsökkenést (jelszupressziót) okozhatnak. 2. Hígítás Megoldási lehetőségek: 1. Belső standard alkalmazása
•Addig kell hígítani a mintát, hogy a belső standardra mért jel visszakerüljön az elfogadható tartományba, azaz nagyobb legyen, mint a mátrix mentes oldatban mért érték 50-70%-a
•belső standardnak hasonló jelszupressziót kell elszenvedni
3. Mintatisztítás
•Ha a jelszupresszió túlságosan nagymértékű (a belső standardra kapott jel nem éri el a mátrixmentes oldatban mért érték 50-70%-át, akkor a módszer nem lesz célravezető.
A hígítás következtében a meghatározandó komponens is hígul. Ha kimutathatósági problémába ütközünk, akkor a mátrixhatás elkerülése érdekében további mintatisztításra van szükség...
Mátrixhatás következtében az érzékenység csökkenhet, ezért a standardokkal számolt kimutatási határokat is újra kell értékelni. 40 35 30
válaszjel
25 20 15 10 5 0 0
1
2
3
4
koncentráció
5
6
7
A mátrixhatás okozta kalibrációs problémák áthidalására szolgál a standard addíciós kalibráció is. 180
y = 33.4x + 100.97 2 R =1
abszorbancia @ 266 nm
160 140
Ebben az esetben nincs mátrixhatás, a két kalibráció meredeksége azonosnak tekinthető.
120 100 80 60 40
y = 31.3x + 0.1 2 R =1
20 0 0
0.5
1
1.5 ppm nikotinsav
Instant kakaópor-extraktum, nikotinsav kalibráció
2
2.5
Belső standard alkalmazásának előnyei és kockázatai Előny: • Jelfluktuáció kiküszöbölése • Drift kiküszöbölése • Extrakciós veszteségek kompenzálása Hátrány: • Többlet munka • Mérendő és belső standard azonos viselkedésének szükségessége
Minták homogenitása A bemért mennyiség növelésével, csökkenthető az inhomogenitás okozta rossz ismételhetőség. (CRM...)
Elemek eloszlás vizsgálata tablettákban, LA-ICP-OES képalkotással
A biológiai mintákban az inhomogenitás természetes jelenség.
Egyes flavonoidok eloszlás-vizsgálata gyökérszövetekben, immunofluoreszcens képalkotással. Forrás: Saslowsky D E et al. J. Biol. Chem. 2005;280:23735-23740
Minta homogenitása és a mérés ismételhetősége Ponty-minta Mn tartalmának szórása 45 40 35 RSD%
30 25 20 15 10 5 0 kevert őrlemény
2mm<
1mm<x<2mm
Homogenitás alapvető követelmény
0.5mm<x<1mm
Extrakció megfelelősége A célkomponensnek a mintából történő kinyerési hatásfoka alapvetően befolyásolja a mérés pontosságát! „Kinyerés” = a mérendő komponensnek a mérés szempontjából nézve „bomlás” nélküli /”no decomposition”/ előhozatala, a mérés céljaira alkalmas halmazállapotban. Extrakciós (izolációs) hatásfok:
miextraktum ⋅ 100 i-dik komponens extrakciós hatásfoka: ri (%) = összes mi
Az extrakciós hatásfok és az extrakciós lépésszám összefüggése 3.
4.
2. Klasszikus extrakciós viselkedés /szervetlen minták, szerves „porok”/ 4.
1.
Feltáró jellegű extrakciós viselkedés /sejtes minták/ 3. 2. 1.
Most akkor meddig?... Honnan tudhatom meg a végét?...
Az extrakciós hatásfok módszerfüggése.
Határérték vs. extrakciós módszer
Extrakció megfelelőségének ellenőrzése (visszanyerés = recovery) -Kinyerés a Referencia mintából (a várható érték ismert) Kinyerés az adalékolásból („spike”, „spiking”) R% = (mért menny. az adalékolt mintában – mért menny. mintában) / adalékolt menny.
Minta
adalékolt mennyiség
50 ± 5
25
Szélső értékek
mintára 45 55
adalékolt minta 75 ± 5
35/25 15/25
adalékolt minta 80 70
R% 140% 60%
Kinyerés adalékolt mintából: Elméletileg és gyakorlatilag is a kinyerési hatásfok nagyobb az adalékolásból (spike) mint az eredeti mintából (miért?) Az EU hitelesítési gyakorlatok alapján az adalékolt koncentráció 1x, 2x és 4x nagyobb, mint az eredeti koncentráció Nincs általános szabály arra, hogyan korrigáljunk a kinyerési hatásfokkal (akkor miért is csináljuk?)
Extrakciós hatásfok: mikor „jó”? 1. ökölszabály: 1 extrakció nem extrakció /főleg az első alkalommal!/ 2. ökölszabály: az extrakció nem „termelhet” mintát: 110% ± 5% ? 3. ökölszabály: 70% alatti kinyerés nem fogadható el - miért nem?... 4. ökölszabály: az extrakciós hatásfok megbízhatósága nem lehet rosszabb 20%-nál 5. biológiai hozzáférhetőség – bioaccessibility 6. 70% felett a megbízhatóság fontosabb a kinyerésnél
Extrakció hatásfoka:
Csak minőségi elemzés: Elégséges a kimutathatósághoz elegendő mennyiségű komponens kivonása
Mennyiségi elemzés: r% közelítsen a 100%-hoz! Extr. hatásfok
kivétel: standardizált, empirikus módszerek. pl.: 60°C-on, 30 perc alatt, 0,1M HCl-ben kioldható XX mennyisége...)
Eljárásvak: A válaszjel azon részét nevezzük eljárásvaknak (procedure blank), melyet ugyan a mérendő komponens indukált, de eredendően nem a mérni kívánt mintából származik. • Edényzetből, vegyszerekből a mintába jutó mérendő komponens • Mintaelőkészítés során történő szennyezés
Ha ez a koncentráció optimális esetben legfeljebb tizede a mintában mérhetőnek, vagy ennél ugyan nagyobb, de nagyon stabilan mérhető, akkor levonható. • Ne keverjük a „zaj”-jal • value-for-money vs. „van-e értelme egyáltalán” (bébiétel Cd, Pb vs. füst) • Meglepő szennyezési források!!!
Meghatározandó komponensek integritásának megőrzése /no decomposition/: Azaz a mintaelőkészítési eljárás során (miatt) bekövetkező komponens-degradáció elkerülése. Alkalmazható dózis: 20-100 W és 2-10 perc
1.8 1.6
(nincs degradáció)
Peak area
1.4 1.2 1.0 0.8 2
0.6 0.4
6
0.2 0.0 20
10
Irradiation time (min)
40 60 80 100 130 160 Microwave power (W)
Mikrohullámú besugárzással végzett feltárás hatása a metil-Hg stabilitására
Meghatározandó komponensek integritásának megőrzése /no decomposition/: Azaz a mintaelőkészítési eljárás során (miatt) bekövetkező komponens-degradáció elkerülése. Alkalmazható dózis: 1.2
max.: 40 W és 6 perc
Peak area
1.0 0.8 0.6 2
0.4 6
0.2 0.0 20
10
Irradiation time (min)
40 60 80 100 130 160 Microwave power (W)
Mikrohullámú besugárzással végzett feltárás hatása a etil-Hg stabilitására
Származékképzés megfelelősége:
5 4.5
• A lehető legnagyobb derivatizációs hatásfok elérésére kell törekedni (miért?)
csúcsterület [106]
4 3.5 3 2.5 2 1.5 1
• Szintén szempont a robusztusság (vö. kalibráció, „indirekt” mérések – miért?)
0.5 0 0
20
40
60
80
100
120
derivatizáció ideje [perc] 16
csúcsterület [10EXP6]
14 12
A hatásfok számszerűsítve nem ismert, de az adott körülmények között maximális és robusztus (=?)
10 8 6 4 2 0 0.0
2.0
4.0
6.0
8.0
HTFA koncentrációja az oldatban [mmol/l]
10.0
12.0
(6-10 mmol/l derivatizálószer és 80-120 perc reakcióidő)
Az analitikai teljesítményjellemzők vizsgálati lehetőségei standard oldatok
Interferenciaellenőrző oldatok (analit-mentes mátrixmodellező oldatok) •Szelektivitás
(a mintát modellező) anyagminták (QCM, CRM)
Utólag is ellenőrizendő!
•Mátrixhatás •Linearitás •Méréstartomány •Zavartűrés •Kimutatási határ •Ismételhetőség Csak a mérőrendszer minősíthető
•Reprodukálhatóság •Pontosság
Mintaelőkészítést is magában foglalja
Analitikai mérések minőségbiztosítási szintjei
Módszer validálása
Mérési bizonytalanság becslése (számítása) Önellenőrzés: • Referencia anyagok
Az analitikai mérések megfelelőségének rendszeres igazolása (verifikálása) Mikor kell a módszereket validálni? (mi is az, hogy validálás?...)
• Kontroll kártyák
Összehasonlító ellenőrzés: • Jártassági vizsgálatok
Ismétlések száma
Mérési bizonytalanság: A mérési eredményhez társított paraméter, amely a mérendő mennyiségnek indokoltan tulajdonítható értékek szóródását jellemzi. 18 17 16 15 14 13 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1
-3s
-2s
-1s
0
1s
2s
3s
1s
2s
3s
99% 95% 67% -3s
-2s
-1s
0
Mérési bizonytalanság értelmezése
• A mérések természetes velejárója. • A mérési eljárás folyamán elvégzett műveletek ismételhetősége természetes (random) szóródást eredményez. • Ezek „egymásra rakódása” (kombinálódása) következtében alakul ki a mérés teljes bizonytalansága. • A mérés teljes bizonytalansága matematikai statisztikai módszerekkel becsülhető, hiszen statisztikus jelenségeken alapszik.
Mérési bizonytalanság meghatározásának menete: 1. Határozzuk meg a mérendő mennyiséget, továbbá azt a függvényt, amely szerint a mérendő mennyiség függ a mért paraméterektől. 2. Határozzuk meg az egyes paraméterekhez tartozó bizonytalanságok nagyságát. 3. Számoljuk ki a standard bizonytalanságokat. 4. Az egyes bizonytalansági források nagyságának és a mérési függvény ismeretében számoljuk ki a teljes (kombinált) mérési bizonytalanságot.
1.
Határozzuk meg a mérendő mennyiséget, továbbá azt a függvényt, amely szerint a mérendő mennyiség függ a mért paraméterektől.
c old ⋅ Vold r= mb r
a keresett komponens koncentrációja a mintában [ug/g]
cold
a mért koncentráció az oldatban [ug/ml]
Vold
az oldat térfogata [ml]
mb
a bemért minta tömege [g]
Az egyes paraméterek bizonytalansága hatással van az eredő mérési bizonytalanságra
Koncentrációmérés bizonytalansága
Jelretöltés bizonytalansága u(V)
u(c)
Minta bemérésének bizonytalansága u(m)
Végeredmény bizonytalansága U(r)
2. Határozzuk meg a paraméterekhez tartozó bizonytalanságok nagyságát. A-típusú becslés: az adott (bemeneti) mennyiség értéke több ismételt méréssel került meghatározásra. A mérési eredményekből így szórás számolható. Ez a (korrigált tapasztalati) szórásérték tekinthető az adott paraméter bizonytalanságának. Példa: 10 ml-es lombik jelretöltésének ismételhetősége: I II III IV Átlag SD
10.0248 ml 10.0079 ml 10.0168 ml 9.9873 ml 10.0092 ml 0.0161 ml
Amikor azt hisszük, hogy „pontosan” 10 ml folyadék van a lombikban, valójában (átlagosan) 10.0 ± 0.016 ml tartományba eső mennyiség van benne.
2. Határozzuk meg a paraméterekhez tartozó bizonytalanságok nagyságát. (folyt.) B-típusú becslés: minden olyan becslés ide sorolandó, amely nem saját mérési (észlelési) sorozatból származó eredményeken alapul. Ilyenek lehetnek pl.: •Gyártó által rendelkezésre bocsátott bizonytalansági adatok (eszköz, standard). •Kalibrálási bizonyítványokban található adatok. •Irodalmi adatok. •A mérési módszer, valamint a felhasznált műszerek, eszközök tulajdonságainak, jellemzőinek általános ismeretéből, velük kapcsolatos tapasztalatokból származó ismeretek.
Példa: A műszer gyártója szerint a vizsgált komponens esetében a koncentrációmérés bizonytalansága 10-100 ug/ml tartományban ≈ 5%.
3.
Számoljuk ki a standard bizonytalanságokat.
A-típusú becslés esetén ez nem más, mint a bizonytalanságként meghatározott ez a mért értékek (korrigált tapasztalati) szórása.
s=
∑ (x
i
−x
)
2
n −1
B-típusú becsléseknél több eset is lehetséges: •a rendelkezésre álló bizonytalansági adatot (tartományt) 95%-os konfidencia intervallumként adták meg: Ezt vagy megadják, vagy (k=2) ún. kiterjesztési tényező feltüntetésével jelzik*.
Pl.: standard esetén: koncentráció 1000 ± 2 mg/l (k=2) Ekkor a megadott bizonytalanság fele tekinthető standard bizonytalanságnak.
±a u (x ) = 2
*normál eloszlás esetén a mért értékek ≈ 95%-a a várható érték ± 2 szórás tartományba esnek.
3.
Számoljuk ki a standard bizonytalanságokat.
B-típusú becsléseknél (folyt.) A változó, melynek bizonytalanságát becsültük négyszögletes (egyenletes) eloszlású. (Azaz a mért érték azonos valószínűséggel fordul elő a megbecsült bizonytalansági határok között) Példa: A digitális analitikai mérleg 12,3 mg-ot mutat. A mért érték 12,25 és 12,34 között van, vagyis a mutatott érték leolvasási bizonytalansága ±0,05mg, eloszlása négyszögletes, mert a mért érték azonos valószínűséggel lehet bárhol 12,25-12,34mg között.
Ebben az esetben a standard bizonytalanság:
u (x ) =
±a 3
3.
Számoljuk ki a standard bizonytalanságokat.
B-típusú becsléseknél (folyt.) A változó, melynek bizonytalanságát becsültük háromszög eloszlású. (Ebben az esetben a mért érték nagyobb valószínűséggel fordul elő a megbecsült bizonytalansági határok közepén, azaz a szélső értékek valószínűsége kisebb.) A legtöbb gyakorlati esetben ilyen eloszlással számolunk. Ebben az esetben a standard bizonytalanság:
u (x ) =
±a 6
4. Az egyes bizonytalansági források nagyságának és a mérési függvény ismeretében számoljuk ki a teljes (kombinált) mérési bizonytalanságot. A végeredmény és a változók között függvénykapcsolat van:
c old ⋅ Vold r= mb
, vagyis r = f(cold, Vold, mb)
Pl.: Az oldat jelre töltését nem pontosan végezzük, majd ezt az oldatot mérjük, akkor ez hibát okoz a végeredményben. Egy független változóban (a példában a térfogatmérésben) tapasztalható eltérés és ennek az eltérésnek a végeredményben megjelenő hatása a fenti mérési függvény alapján számszerűsíthető.
4. Az egyes bizonytalansági források nagyságának és a mérési függvény ismeretében számoljuk ki a teljes (kombinált) mérési bizonytalanságot. A jelre töltésünk, bemérésünk (és általánosítva: minden független változó) bizonytalansággal terhelt, vagyis ezek bizonytalansága mind-mind megjelenik a végeredményben.
Eredmény 4.5
4
3.5
3
2.5
2
1.5
1 11 9
0.5 7
Vold
5
0 1
2
3
4
3 5
mb
6
7
8
9
10
1 11
Névleges térfogat
4. Az egyes bizonytalansági források nagyságának és a mérési függvény ismeretében számoljuk ki a teljes (kombinált) mérési bizonytalanságot. Az egyes változók bizonytalansága miatt, a végeredményben megjelenő eltérést a mérési függvény változók szerinti parciális deriválásával határozhatjuk meg:
∂f u( yi ) = ⋅ u ( xi ) ∂x i
Példa: változó átlagos stdandard eredményben érték bizonytalanság okozott eltérés mb 0.2 0.0005 -0.0623 Vold 10 0.0161 0.0402 cold 0.5 0.02 1.0000 0.1000 25.0 r
4. Az egyes bizonytalansági források nagyságának és a mérési függvény ismeretében számoljuk ki a teljes (kombinált) mérési bizonytalanságot. A végeredményben okozott bizonytalanságok az alábbi képlet szerint kombinálhatók:
u c ( y ) = u ( y1 ) + u ( y 2 ) + ... + u ( y n ) 2
2
2
uc(y): az eredő mérési bizonytalanság u(yi): a mérendő mennyiség standard bizonytalanságának az a hányada, amelyet az i-dik bizonytalansági forrás okoz n: az összegzett bizonytalansági források száma
4. Az egyes bizonytalansági források nagyságának és a mérési függvény ismeretében számoljuk ki a teljes (kombinált) mérési bizonytalanságot. változó átlagos stdandard eredményben érték bizonytalanság okozott eltérés mb 0.2 0.0005 -0.0623 Vold 10 0.0161 0.0402 cold 0.5 0.02 0.1000 25.0 r 2 2 u Σ ( yn )
Σ u ( yn )
u 2 ( yn ) 0.0039 0.0016 0.0100 0.0155 0.1245 0.25 (k=2)
U: a kiterjesztett mérési bizonytalanság uc(y): az eredő mérési bizonytalanság k: a kiterjesztési tényező
U = k ⋅ u c ( y)
4. Az egyes bizonytalansági források nagyságának és a mérési függvény ismeretében számoljuk ki a teljes (kombinált) mérési bizonytalanságot.
Az eredmény megadása:
r = 25,0 ± 0,25 ug/g (k=2)
Azaz a várható érték 95%-os valószínűséggel 24,75-25,25 között van.
Eredmények összevethetősége
bizonytalansági tartományok 95% valószínűséget jelölnek
Pontosság ellenőrzése Hiteles anyagminták (Certified Reference Material, CRM) •Hitelesített értékek •Tanúsított homogenitás (CRM-ek használata gyakorlatilag a teljes módszer megfelelőségének ellenőrzésére is alkalmazható)
Visszavezethetőség (Traceability) •Kalibráláshoz felhasznált etalonok visszavezethetők legyenek nemzetközi etalonokra (rendszeres kalibrálás)
Pontosság javítása / igazolása CRM-ERM-SRM használatával (Certified Reference Material, European Reference Material, Standard Reference Material) Olyan tanúsítvánnyal ellátott referencia anyag, amelynek egy vagy több tulajdonságát olyan eljárás segítségével határozták meg, melynél igazolt a kérdéses tulajdonság visszavezethetősége /tracebility/ ahhoz a mértékegységhez, melyben a tulajdonságot kifejezték, és minden egyes hitelesített értékhez bizonytalansági érték is adott.
(ISO Guide 30, VIM 6.14)
CRM: Elfogadott referencia értéket (tulajdonságot) hordoz Összehasonlítás!!! • Elméleti értékkel, mely tudományos alapokkal bizonyítható • Hiteles értékkel, mely a nemzeti és nemzetközi szervezetek kísérletei alapján, megegyezésen alapul • Ha mindez nem érhető el, a mérendő mennyiség becslése az alap
CRM: Visszavezethető
Egy mérési eredménynek vagy egy etalon értéknek az a tulajdonsága, hogy ismert bizonytalanságú összehasonlítások megszakíthatatlan láncolatán keresztül kapcsolódik megadott referenciákhoz, általában nemzetközi etalonokhoz. ( VIM 6.10)
CRM: gyártók & beszerzés, választék • IRMM, NIST, NRC, NMIJ: „a négy muskétás” • kisebb, specializált gyártók (pl. RECIPE) http://www.nmij.jp/english/ http://irmm.jrc.ec.europa.eu/html/homepage.htm http://www.nist.gov/index.html http://www.nrc-cnrc.gc.ca/eng/services/inms/reference-materials.html http://www.recipe.de/en/updates.html
• keresőprogramok: http://www.virm.net/
• Példák: DOLT-4, BCR-143 /gyártás, információk/
CRM: Felhasználási szerepek • Módszer fejlesztés és értékelés (validálás) • Belső és külső mérési eredmények minőségbiztosítása • Visszavezethetőség ellenőrzése • A laboratórium megbízhatóságának ellenőrzése (vásárló vagy ellenőrző szerv)
CRM típusok • Mátrix CRM • Vegyület CRM
CRM: Helyes kiválasztás I. • Célkitűzés: a lehető legjobb egyezés a minta és a CRM között • Nincs olyan CRM amelyik pontosan: ugyanaz a mátrix ugyanaz a koncentráció mint a meghatározandó mintában • Megoldás: elfogadható kompromisszum • Limitálók: A mátrix okozta zavaró hatások eltérők A meghatározandó /analyte/ kimutathatósága vagy extrahálhatósága eltérő
CRM: Helyes kiválasztás II. Gyakori hibák: - A mátrix eltérő (pl): a talaj és a szálló por lehet nagyon eltérő, vagy vizes oldattal nehéz bormintákat kalibrálni. - A koncentráció eltérő: ha az RM koncentrációja nagyságrenddel eltér, vigyázzunk -a bizonylatban bemutatott mintaelőkészítési módszer különböző /pl. HF vs. királyvíz vs. HNO3/: - FIGYELEM: az indikatív /”informative”/ értékek nem hitelesítettek!
CRM: Helyes kiválasztás III.
ERM- BC382 WHEAT FLOUR
BCR-563 COMMON WHEAT FLOUR
Hamutartalom: 0.60 ±0.10 g/100g
Hamutartalom: 0.562 ±0.008 g/100g
170 Euro / 37 gramm
245 Euro / 360 gramm
CRM: Helyes kiválasztás IV. Példa a helytelen módszerválasztásra: Talaj extrakció CaCl2
HNO3
Cr mg/kg
0.1
36.6
67.5
Co mg/kg
-
9.5
12.2
Cu mg/kg
0.5
117
120
Pb mg/kg
3.0
64.6
64.2
királyvíz
Ha a feladat célkitűzése más (környezet, agrár, talaj, geo-kémia) akkor a módszernek is ehhez kell idomulnia.
CRM: gyakorlati használat
• • • • • • • •
Tárolás Polcontarthatóság Az edények nyitás-zárása Szárítás Oldás Extrakció (kinyerés) Készülék kalibrálás (külön!) Adatértékelés
CRM: gyakorlati használat I.: Tárolás • Kövessük a tárolási instrukciókat (pl. eredeti edény, hőmérséklet, fény, páratartalom, mágneses tér, stb. ) • Ha kinyitottuk polcontarthatóság nem garantált összetétel nem garantált (víztartalom, illékonyság, oxidáció) zárjuk vissza (ha szükséges sterilizáljuk, gamma besugárzással...) • A tárolási idő a szervetlen komponenseknél hosszú (kivétel az oxidációs állapot) • A tárolás idő rövid a szerves és a fémorganikus komponenseknél
Tárolás példa: As ivóvízben As(V)
µV 1.0E+05
Sample stored at ambient temperature 8.0E+04
As(III) Sample stored at + 4 C°
6.0E+04
4.0E+04
2.0E+04
0.0E+00
1.00
2.00
3.00
[m in]
A gyártó elvileg értesít, ha a CRM nem stabil (vagy stabilitási tesztet javasol)
CRM: gyakorlati használat II.: Nyitás • Kövessük az edény nyitási előírásokat • Felmelegedési idő tartása: miért? • Részmintavétel vagy az összes minta elemzése /CRM típus: mátrix CRM ?/ • Homogenizáljuk (hosszasan!) nyitás előtt (Teflon golyó, rázógéppel vagy kézzel?...) • Kövessük a részmintavétel előírásait (mennyiség, eszköz) – miért? • Ampulla esetén speciális eszközök • Részminta esetén rögtön a mintavétel után zárjunk • Soha ne töltsük vissza a mintát az eredeti edénybe, SZENNYEZÉS VESZÉLY
CRM: gyakorlati használat II.: Szárítás (főleg szervetlen CRM-ek esetén!!!) • Miért kell(het) szárítani? • Kövessük az előírásokat! • Ha nincsenek, a lehetőségek: szárítás 105 °C-n állandó tömegig szárítás 60 °C-on állandó tömegig liofilizálás • Csökkentsük a stabilitást (illékonyságot javító) rontó tényezőket • A CRM-et a mérendő és a mátrix számára megfelelő körülmények között szárítsuk! • A nedvességtartalom-meghatározásra szánt CRM alminta nem feltétlenül alkalmas validálásra!
Szárítás • példa a szárítási instrukciókra: A BCR-679 ‘fehér káposzta’ kézikönyvéből: szárítsunk ki 100 mg-os adagokat 105 °C-on állandó tömegig (= az egymást követő mérések eltérése < 0.2 mg) A minta szabad levegőn nedvszívó!
Nedvességtartalom korrigálás • A hiteles minták analitikai eredményei legtöbbször szárazanyag tartalomra vannak megadva, de sok esetben a nedvességtartalom is adott (por CRM) • Mennyi az „átlagos” nedvességtartalom? Honnan tudom, hogy baj lehet és szárítanom kell? Hogyan is? • A gyakorlati mintákat a nedvesség tartalommal korrigálni kell /VAGY NEM KELL!/ • Ha a megadott és a mért nedvesség tartalom között eltérés van, akkor szintén korrekciót kell végezni • Ha nagy a nedvesség tartalom bizonytalansága, növelni kell a mérések számát, ezzel csökkentve a bizonytalanságot
„Oldás” /Oldatba vitel/ (vegyület CRM, standard) • Kövessük a használati utasításokat • Ellenőrizzük a oldás hatásfokát, teljességét (mindig látom?...; < 5 mg alatti esetek? Mikortól érdemes részleges oldást végrehajtani?) • A hitelesítési-körelemzési-publikálási folyamat során összegyűjtött megfigyelések rendkívül hasznosak, pl.
“A minta ubikinon /Q10/ tartalma nagy koncentrációban hexánban oldható, ezt követően metanollal vagy 1-propanollal hígítható”. (miért jó ez?...)
Extrakció • Kövessük a használati előírásokat – de melyeket? • Emlékezzünk, hogy még a 100%-os kinyerésnél is van bizonytalanság • (lásd IUPAC, 1996, Harmonized Guidelines for use of Recovery Information ...) • Kétféle kinyerés van: - Kinyerés a Referencia mintából - Kinyerés az adalékolásból („Spiking” ≠ standard addíció)
Extrakció – ha nem működik • Ellenőrizendő, hogy: - a mintaelőkészítés kézben tartott-e? /= dokumentált, reprodukálható/ - a mérés kézben tartott-e? /= dokumentált, reprodukálható/ - az analitikai eredmény esetleg a két hiba kiegyensúlyozott eredője-e?!!!
Extrakció példa
Extrakció • Kinyerés CRM-ből: - Ha az extrakciós folyamatot lépésről lépésre betartottuk, a CRM nem járt le és az eredmény nem egyezik a megadott értékkel, akkor + / - rendszeres hiba terheli a meghatározást (zavaró hatások) - Ha meghatároztuk, hogy melyik paraméter milyen hatással van a mérési eredményre, az ismeretlen minta komponensének mérési eredménye korrigálható a faktorral PÉLDA: ENZIMES MINTAELŐKÉSZÍTÉS
Extrakció • Kinyerés CRM-ből: - Ha az extrakció hatásfoka eltér a mintánál és a CRMnél, és az eltérés oka nem ismert: - akkor az ismeretlen minta mérési eredménye elvileg faktorral korrigálható, de a hiba akár nagyobb is lehet mint a korrigálatlan mérési eredmény hibája – tehát nem érdemes korrigálni, inkább a hibát kell tisztázni. PÉLDA: NEM MEGFELELŐ CRM (LISZT vs. ÉLESZTŐ)
Extrakciós hatásfok: mikor „jó”? 1. ökölszabály: 1 extrakció nem extrakció /főleg az első alkalommal!/ 2. ökölszabály: az extrakció nem „termelhet” mintát: 110% ± 5% ? 3. ökölszabály: 70% alatti kinyerés nem fogadható el - miért nem?... /lásd IMEP-107, nem lineáris – nem extrapolálható extrakció/ 4. ökölszabály: az extrakciós hatásfok megbízhatósága nem lehet rosszabb 20%-nál
PÉLDÁK: <60%; 105 ± 10%; 110 ± 20%; 95 ± 5%; 110 ± 5%; 70 ± 10%; 70 ± 30%
80 ± 20%;
Pontosság javítása, igazolása (L)RM / QCM használatával (/Laboratory/ Reference Material, Quality Control Material) Olyan minta, amelynek egy vagy több tulajdonsága eléggé homogén és jól meghatározott ahhoz, hogy készülék kalibrálásához, egy mérési módszer minősítéséhez vagy anyagjellemzők meghatározásához használják.
(ISO Guide 30, VIM 6.13) MIKOR VAN SZÜKSÉG LRM-RE? • nincs egyező analyte/mátrix/koncentráció CRM-ből • a CRM kifogyott, „drága”, rosszul osztható be, nem stabil kibontás után • mi a különbség a CRM és az LRM között?...
LRM: gyártók & beszerzés, választék • több mint száz gyártó, számuk folyamatosan nő • több mint 10000 termék • megvásárolható, „megmaradó” vagy legyártható • nagyon gyakran laboratóriumi körelemzéseket szervező vagy CRM-eket gyártó cégekhez kapcsolódva http://www.fapas.com/ http://irmm.jrc.ec.europa.eu/html/homepage.htm
• keresőprogramok: http://www.virm.net/
• Példák: SEAS projekt /gyártás, információk/
LRM: Felhasználási szerepek
• Módszer fejlesztés és értékelés (validálás – vigyázat!) • Belső és külső mérési eredmények minőségbiztosítása • A laboratórium megbízhatóságának ellenőrzése (vásárló vagy ellenőrző szerv)
LRM típusok • Kalibrációs (L)RM • Minőségbiztosítási LRM (QCM)
(L)RM I.: KALIBRÁCIÓS TÍPUS • Átmenet figyelhető meg a standardok gyártóinál a CRM/RM irányába • A végső hitelesítés hiánya nem feltétlenül akadálya a kalibrációnak! (ld. bekerülési függvény) LRM II.: MINŐSÉGBIZTOSÍTÁSI TÍPUS (QCM) • Egy adott CRM egyben LRM is a nem hitelesített paramétereire („indicative values” + utólagos bővítési kampányok) • Kellően stabil paraméterekkel jellemezhető anyagminta esetén nem a pontosság, hanem a reprodukálhatóság számít!!! – kontrollkártyák, stb. • Használatuk mellőzése megfizethetetlen kárt okozhat (megbízók elvesztése – „egyéni szociális probléma”)
LRM: mikor és hogyan gyártsuk? • ma már csak akkor érdemes, ha (I) nem túl bonyolult, mivel a homogenitás-stabilitás páros nehezen garantálható „házilagos” eszközökkel, vagy (II) speciális /ritka/ célkomponensről van szó • sertésmáj, folyami iszap, brazil dió, házi pálinka és „cukorlé-mátrixú fémvizsgálat” LRM példája: reprezentativitás, homogenitás, stabilitási esetpéldák • saját rutin elemzésből visszamaradó, „jó”, „szennyezett” minták megtartása és feldolgozása (példa: „tojásmentes” tészta tojásszennyezettség mérésekhez) • Magyarországon a körelemzések szervezéséhez kapcsolódóan számuk növekedőben van
LRM: megjegyzések • tilos „kijelölt” edényzettel dolgozni. Ez érvényes a vakmintákra és az LRM mintákra is! • az állandó és rendszeres kontrol az egyetlen módszer arra, hogy a „nem normális” problémákat időben kiszűrje (pl. 6.0 tisztaságú He-palack oxigén-szennyezése)
Körelemzések (InterLaboratory Comparisons): akkreditált laboratóriumok számára kötelező! 1. PT, proficiency testing, jártassági vizsgálat: cél a résztvevő laboratóriumok felkészültségének értékelése 2. CC, certification campaign, hitelesítési gyakorlat: bizonyos anyag vagy minta objektiv jellemzése
cél
3. MET, method validation study, módszervalidálási vizsgálatok: a cél a módszer(ek) teljesítőképességének kritikája, standardizációja 4. Összemérés: ☺ („néhány laboratórium javítani kívánja teljesítményét vagy módszerét”) http://www.eptis.bam.de/ , http://www.iisnl.com/ , http://www.irmm.jrc.be/ , http://www.fapas.com/
Körelemzések (InterLaboratory Comparisons): akkreditált laboratóriumok számára kötelező! • a gyakorlati analízisek 95%-át lefedik • kijelölt nemzeti laboratóriumok (pl. hitelesítést végzők, hivatalok) számára PT
igazolja
a
„fit
for
purpose”
érvényesülését
és
azt,
hogy
referenciapontként szolgálhatnak nemzeti és nemzetközi (pl. CRM gyártási) feladatoknál • lehet meghívásos / nyitott, zárt körű / nyitott, ingyenes / költségtérítéses • Kiemelten fontos akkor, ha nincs CRM, RM, vagy nem igazolható más eljárással a pontosság • a „telefonos körelemzések okosba’ ” elkerülendők! • Példa a lefutásra és kiértékelésre: IMEP-107
Körelemzések lefutása: IMEP-107 • Probléma: a legnagyobb mennyiségben fogyasztott gabonaféle, a rizs arzéntartalmának egy része toxikus (melyik része?) /4-6. old./ • Kína: szárazanyagra vetítve legfeljebb 0,15 mg/kg „szervetlen” As (As III + As V)
• http://irmm.jrc.ec.europa.eu/html/interlaboratory_comparisons/ • döntéstől kiírásig: 14 hónap • 20 kg rizs /előszűrés/ - 10 kg rizs – 5 kg végtermék • kriogén darálás – szitálás nincs – homogenizálás – csomagolás • homogenitás- és stabilitásvizsgálat • referenciaértékek bekérése (NAA!) 7 „expert” laborból
Körelemzések lefutása: IMEP-107 • Referencia összes As és szervetlen As + bizonytalanságok bekérése (titkos) /11. old./ (NAA eredmény!) • Referenciamódszerek bekérése (titkos) /12-13.old./ • z-érték meghatározás kijelölt szórás alapján /16. old./ • résztvevők eredményeinek bekérése, értékelése, értesítése (kódszám!) • jelentés kiadása • igazolás a NAT felé részvételről • LRM-ként vagy CRM-ként használható minta • módszerek összevetése, hibák feltérképezése „A laboratóriumoknak eljárással kell rendelkezniük a laboratóriumközi vizsgálatok eredményeinek értékelésére és megfelelő javító és megelőző tevékenység bevezetésére. A laboratórium kötelezettsége a NAT írásbeli értesítése PT/ILC programokban való részvételtől és annak eredményéről. A jelentésnek tartalmaznia kell a nevet, a program jelét, a szervező nevét, a területet, amelyen a laboratórium részt vett, beleértve az eredményeket és a szervező értékelését a vizsgálat elvégzéséről, továbbá a helyesbítő/megelőző intézkedésekről, amelyeket a laboratórium tett.” /forrás: http://www.nat.hu/hirek/jartassagi-vizsgalat.php /
Laboratóriumok közötti összehasonlítás (összemérés) – mikor?.. Labor 1.
Labor 4.
Tesztminta (homogén és stabil)
Labor 3.
Labor 2.
Minőségbiztosítás a mérések után (GLP...?)
Minőségbiztosítás a mérések után (GLP...?) • kimutatási határok és bizonytalanságok figyelembe vétele • leolvasási pontosság kérdése („tizedesjegyek”) • hígítás • párhuzamosok átlagolása (mikor lehet?) • eredmény vonatkoztatása (szárazanyag-tartalom?) • mértékegység • „adminisztrációs” hibák és kivédésük • jelentési űrlapok kezelése (akkreditált folyamatok) • archiválás, nyomonkövetés kérdése
Irodalom •
Anon, 1997. Guidelines for the production and certification of BCR reference materials. EC Doc. BCR/01/97, Part A, EC-SM&T Programme, Brussels.
•
Cortez, L., 2001. Use of LRM in Quality Control: Control Charts & Interlaboratory Testing. K.J.M. Kramer (Ed.) MERMAYDE Publ., Bergen, Netherlands (CD-ROM).
•
EURACHEM, 2000. Quantifying Uncertainty, LGC, Teddington, UK.
•
ISO Guide 30, 1992. Terms and definitions used in connection with reference materials. International Organisation for Standardization, Geneva, Switzerland
•
ISO Guide 33, 1989. Uses of certified reference materials. ISO 5725-1, 1986. Accuracy of measurement methods and results.
•
NIST, 1998. Handbook for SRM Users, Gaitersburg, USA.
•
Stoeppler, M., W.R. Wolf, P.Jenks, 2001. Reference Materials for Chemical Analysis, Wiley-VCH, Weinheim.
•
VIM, 1993. International vocabulary of basic and general terms in metrology (2nd edition), BIPM/IEC/IFCC/ISO/IUPAC/IUPAP/OIML. Geneva, Switzerland.
