HALOECETSAVAK ÉS FÉM-KELÁT KOMPLEXEK ANALITIKAI ELVÁLASZTÁSA NAGYHATÉKONYSÁGÚ IONKROMATOGRÁFIÁVAL
Doktori (PhD) értekezés
Készítette
Tófalvi Renáta okleveles vegyész, német-kémia szakos középiskolai tanár
Témavezető
Dr. Hajós Péter egyetemi docens
Készült a Pannon Egyetem Kémiai és Környezettudományi Doktori Iskolája keretében
Pannon Egyetem Mérnöki Kar Környezetmérnöki Intézet Analitikai Kémia Intézeti Tanszék
2012. 2
HALOECETSAVAK ÉS FÉM-KELÁT KOMPLEXEK ANALITIKAI ELVÁLASZTÁSA NAGYHATÉKONYSÁGÚ IONKROMATOGRÁFIÁVAL Értekezés doktori (PhD) fokozat elnyerése érdekében Írta: Tófalvi Renáta Készült a Pannon Egyetem Kémiai és Környezettudományi Doktori Iskolája keretében Témavezető: Dr. Hajós Péter Elfogadásra javaslom (igen / nem) (aláírás)** A jelölt a doktori szigorlaton ........%-ot ért el,
Az értekezést bírálóként elfogadásra javaslom: Bíráló neve: Dr. Idei Miklós
igen /nem ………………………. (aláírás)
Bíráló neve: Dr. Kertész Vilmos
igen /nem ………………………. (aláírás)
***Bíráló neve: …........................ ….................) igen /nem ………………………. (aláírás) A jelölt az értekezés nyilvános vitáján …..........%-ot ért el. Veszprém,
…………………………. a Bíráló Bizottság elnöke
A doktori (PhD) oklevél minősítése…................................. ………………………… Az EDHT elnöke
Megjegyzés: a * közötti részt az egyéni felkészülők, a ** közötti részt a képzésben résztvevők használják, *** esetleges
3
Kivonat A szerző a dolgozat első felében az ivóvíz fertőtlenítése során keletkező haloecetsavak (HAA) analitikai elválasztásának kapacitás gradiens optimalizálását végezte el. Az elválasztásokhoz Cryptand A1 típusú makrociklusos állófázist (n-decil-2.2.2.) tartalmazó analitikai oszlopot használt, amelynek ioncsere-kapacitása az elúció során változtatható. Új, nagyhatékonyságú ionkromatográfiás módszert fejlesztett ki kilenc klórozott-brómozott haloecetsav elválasztására. A gradiens módszert elméleti és kísérleti megfontolások alapján optimalizálta. Optimális módszernek a 10mM NaOH-10mM LiOH lépcső gradiens bizonyult, amelyben az eluensváltás az analízis harmadik percében történt. Az optimalizált módszer lehetővé teszi a kilenc haloecetsav és hét lehetséges interferáló szervetlen anion elválasztását kevesebb, mint 25 perc retenciós idő alatt megfelelő felbontással. A módszert alkalmazták csapvíz analízisére, amely során az érzékenység növelése érdekében előzetes dúsítást végeztek fordított fázisú szubsztráton (LiChrolut EN). A dolgozat második részében az átmenetifémek anioncserés elválasztását tanulmányozta. A nyommennyiségű fémkomplexek és ligandumaik azonosítása, ill. gyors analízise egyre inkább az analitikusok és a környezetkutatók érdeklődésének középpontjában áll. Ha az oldat a nagy töltésű komplexképző aniont, pl. etilén-diamin-tetraecetsav (EDTA), transz-1,2diamin-ciklohexán-tetraecetsav (DCTA), feleslegben tartalmazza, akkor a fémionok többsége anionos komplexként van jelen, ezért anioncserével elválaszthatók és vezetőképességi detektálás alkalmazásával a komponensek követhetők. Különböző koncentrációjú és pH értékű karbonát eluenst használt ioncserélő rendszerben, figyelembe véve a mintában jelenlévő komplexképződési mellékreakciókat. A módszer előnyös körülménye, hogy mind a fémkomplexek stabilitása, mind a komponensek elúciója szempontjából ugyanaz a lúgos pHtartomány a kedvező. Mivel a poliaminokarbonsavak a környezetre potenciális veszélyt jelentenek, fontos, hogy hatékony analitikai technikát fejlesszünk ki nemcsak a fémkomplexek, hanem a feleslegben jelenlévő ligandumok meghatározására is. Ennek a munkának a célja volt az EDTA és DCTA ligandummal komplexált fémionok, ligandumok és szerves anionok szimultán kromatográfiás elválasztásának és azonosításának optimalizálása szuppresszált anioncsere kromatográfiában. Az eluens pH értékeinek és koncentrációinak széles tartományára meghatározta a komplex ionok kapacitási tényezőit és az elválasztások paramétereit. A csúcsok azonosítását ICP-AS és FTIR-ATR vizsgálat is igazolta.
4
Abstract „Analytical Separation of Haloacetic Acids and Metal-chelate Complexes by Highperformance Ionchromatography” In the first part of the thesis the capacity gradient optimize of analytical separation of haloacetic acids was performed. A macrocycle-based adjustable capacity anion-exchange IonPac Cryptand A1 separator column (n-decil-2.2.2.) was used to the separations. A new high performance ion chromatographic method has been developed for the separation of the nine chlorinated–brominated haloacetic acids (HAAs) that are the disinfection by-products of chlorination of drinking water. A gradient method based on theoretical and experimental considerations has been optimized in which 10mM NaOH–10mM LiOH step gradient was performed at the third minute of the analysis. The optimized method allowed us to separate the nine HAAs and seven possibly interfering inorganic anions in less than 25 min retention times with acceptable resolution. Application of this method to the analysis of haloacetic acids in real tap water samples is illustrated. To increase sensitivity, a preconcentration step on a reversed phase substrate (LiChrolut EN) has been coupled. In the second part of the work the anion exchange separation of transition metals was studied. The trace analysis of metal-complexes and their ligands has long been an area of interest for analytical chemists and environmental researchers. Complexing eluents have been used to improve the selectivity of the chromatographic separation of metal ions. When basic solution contains an excess of a strong complexing anion of high charge such as ethylenediaminetetraacetate (EDTA) and trans-1,2-diamine-cyclohexane-tetraacetate (DCTA) ion, most metal ions will occur as anionic complexes and can be separated by anion exchange using suppressed conductivity detection. The compounds can be followed using this detection system. This study incorporates an ion-exchange system with a carbonate eluent at various concentrations and pH levels. A theoretical framework is developed when complexation effects are present in the sample. An advantageous condition of the method is that the same basic pH-range is favourable to the stability of the metal complexes and also to elution of the components. Because polyaminocarboxylic acids are a potential risk to the environment, it is important also to develop an effective analytical technique for their determination. The aim of this work was the optimization of a simultaneous chromatographic separation and identification of metal ions precomplexed by the ligand EDTA or DCTA and non-metallic species by suppressed anion-exchange chromatography. The capacity factors of complex ions
5
and the conditions of separations were determined for wide ranges of pH values and eluent concentrations. The identification of the peaks was verified using ICP-AS and FTIR-ATR method, too.
6
Kurzfassung „Analytische
Trennung
der
Haloessigsäuren
und
Metallkomplexen
mit
Hochleistungender Ionchromatographie” Im ersten Teil der Arbeit wurde die Optimierung der Kapazität-Gradienttrennung der Haloessigsäuren (HAA) durchgeführt, die während der Desinfektion des Trinkwassers entstehen. Zu den Trennungen wurde eine IonPac Cryptand A1 analytische Kolonne benutzt, die eine makrozyklische stationäre Phase enthält, und die Kapazität der Säule kann geändert werden. Eine neue analytische Methode mit hoher Leistung wurde für die Trennung der neun chlorierten und bromierten Haloessigsäuren entwickelt. Die Gradient-Methode wurde durch theoretische und experimentelle Berücksichtigungen optimiert. Das 10mM NaOH-10mM LiOH Stufegradient erwies sich als optimale Methode, in der die Eluentänderung in dem dritten Minuten der Analyse passiert. Die optimierte Methode ermöglichte die Trennung der neun Haloessigsäuren und der sieben möglichen interferierenden anorganischen Anionen in weniger als 25 Minuten mit geeigneter Auflösung. Diese Methode wurde für die Analyse des Leitungswassers anwendet. Für die Erhöhung der Sensitivität wurde Pre-Anreicherung in Substrat mit reversen Phase (LiChrolut EN) durchgeführt. Im zweiten Teil der Arbeit wurde die anionenaustauschende Trennung der Übergangselementen studiert, weil die schnelle Analyse der in Spuren vorkommenden Metallkomplexen immer mehr im Mittelpunkt des Interesses der Analytiker und Umweltforscher steht. Wenn die Lösung die komplexbildenden Anionen mit größer Ladung z.B. Äthylendiamintetraessigsäure (EDTA), Trans-1,2-Diaminocyclohexantetraessigsäure (DCTA) im Überschuss beinhaltet, vorhanden die meisten Metallionen als anionische Komplexe, deshalb können sie mit der anionenaustauschenden Trennung mit der Anwendung der suppressierten Leitfähigkeit-Detektierung separieren werden. Die Karbonat-Eluenten mit unterschiedlichen Konzentrationen und pH-Werten wurden im ionenaustauschenden System genutzt, die komplexbildenden Nebenreaktionen in der Probe wurden berücksichtigt. Der vorteilhafte Umstand der Methode ist es, dass das gleiche pH-Bereich sowohl für die Stabilität der Komplexe als auch für die Elution der Komponenten güngstig ist. Weil die Polyaminocarbonsäuren potenzielle Gefahr für die Umwelt bedeuten, ist es wichtig, eine wirksame Technik für die Analyse nicht nur der Metallkomplexe, sondern auch der im Überschuss wesenden Ligands entwickelt zu werden. Die Retention wird durch mehrere Faktoren bei der Separation der Anionen beeinflusst: komplexbildende Reaktionen, 7
ionenaustauschende Gleichgewichte und Protolyse können auch während der Separation abhängig von pH vorkommen. Das Ziel dieser Arbeit ist die Optimierung der simultanen chromatographischen Trennung und Identifizierung der mit EDTA und DCTA Ligands komplexierten Metallionen, Ligands und der organischen Anionen in suppressierten anionenaustauschenden Chromatographie. Die Kapazitätfaktoren der Komplexionen und die Parameters der Separationen wurden im breiten Bereich der pH-Werten und Konzentrationen des Eluents bestimmt. Die Identifizierung der Peaks werden auch durch ICP-AS und FTIRATR Messungen rechtfertigt.
8
Tartalomjegyzék Kivonat ....................................................................................................................................... 4 Abstract ...................................................................................................................................... 5 Kurzfassung................................................................................................................................ 7 Tartalomjegyzék......................................................................................................................... 9 Bevezetés.................................................................................................................................. 11 1. Irodalmi összefoglaló ........................................................................................................... 13 1.1. A folyadékkromatográfia típusai................................................................................... 13 1.2. A kromatográfia alapfogalmai ...................................................................................... 14 1.3. Ionkromatográfia........................................................................................................... 16 1.3.1. Az ioncsere-kromatográfia elve ............................................................................. 18 1.3.2. Az ionkromatográfiában használt eluensek és mintakomponensek....................... 19 1.3.3. Az ionkromatográfia eszközei................................................................................ 20 1.4. Az ionkromatográfiában alkalmazható vezetőképességi detektálás ............................. 22 1.5. Az ionkromatográfiában használt állófázisok fizikai-kémiai szerkezete...................... 23 1.5.1. A makrociklusos állófázist tartalmazó oszlop működési elve ............................... 24 1.6. Az ionkromatográfia alkalmazásai................................................................................ 26 1.7. A retencióra ható tényezők............................................................................................ 28 1.7.1. A pH szerepe .......................................................................................................... 28 1.7.2. Az eluens koncentrációjának hatása....................................................................... 28 1.7.3. Az állófázis szerepe................................................................................................ 29 1.8. A haloecetsavak jelentősége és analitikai elválasztási lehetőségei ............................... 30 1.9. Az átmenetifémek és a poliaminokarbonsavak környezeti jelentősége ........................ 34 1.10. A fém-kelátok kialakulása, jellemzői.......................................................................... 36 1.11. A fém-kelátok elválasztásának mechanizmusa többkomponensű karbonát eluens alkalmazásával ..................................................................................................................... 39 1.12. A fémkomplexek elválasztásának egyéb (HPLC) módszerei ..................................... 42 1.13. Célkitűzés .................................................................................................................... 44 2. Kísérleti rész......................................................................................................................... 45 2.1. Felhasznált eszközök, anyagok ..................................................................................... 45 2.1.1. Haloecetsavak elválasztása kriptand bázisú oszlopon ........................................... 45 2.1.2. Átmenetifém kelátok elválasztása pellikuláris töltetű oszlopon ............................ 46 2.2. A haloecetsavak elválasztása ........................................................................................ 47 2.2.1. A haloecetsavak izokratikus elválasztása............................................................... 48 2.2.2. A haloecetsavak optimalizált gradiens elúciója ..................................................... 59 2.2.3 Analitikai jellemzők ................................................................................................ 65 2.2.4 Az elválasztások alapján tett következtetések........................................................ 66 2.3. A fém-kelátok anioncsere-kromatográfiás elválasztása és retenciós jellemzői ............ 68 2.3.1. A kromatográfiás rendszer kémiai jellemzői ......................................................... 68 2.3.2. A fém-kelát komplexek retenciójának vizsgálata .................................................. 71 2.3.3. Komponens csúcsok azonosítása ........................................................................... 75 2.3.3.1. Komponens csúcsok azonosítása a retencióprofil alapján .................................. 75 2.3.3.2. Komponens csúcsok azonosítása a fémion és a ligandum mólarányának változtatása alapján .......................................................................................................... 78 2.3.4. A komponenscsúcs-azonosítás helyességének igazolása csatolt analitikai módszerekkel.................................................................................................................... 85 2.3.4.1. A fémtartalom igazolása ICP atomspektroszkópiás mérésekkel......................... 85 9
2.3.4.2. A szabad ligandumok igazolása infravörös spektroszkópiás mérésekkel ........... 87 2.3.5. A módszer érzékenységének és linearitásának vizsgálata...................................... 88 2.3.6. Az elválasztások alapján tett következtetések........................................................ 90 3. Összefoglalás........................................................................................................................ 92 4. Függelék ............................................................................................................................... 94 5. A szerző tudományos munkássága....................................................................................... 97 5.1. Publikációk.................................................................................................................... 97 5.2. Konferencia előadások .................................................................................................. 97 6. Tézispontok ........................................................................................................................ 100 6. Theses................................................................................................................................. 104 7. Az eredmények hasznosítása.............................................................................................. 108 Irodalomjegyzék..................................................................................................................... 109 Köszönetnyilvánítás ............................................................................................................... 114
10
Bevezetés A természetben kis, esetleg nyomnyi mennyiségben jelenlévő káros hatású anyagok és különböző konfigurációinak, komplexeinek felismerése, mennyiségi kimutatása egyre fokozódó mértékben foglalkoztatja mind a szakértőket, mind a lakosságot. A vizekben előforduló halogénezett szerves anyagok, főleg a haloecetsavak a termékek széles variációit mutatják, amelyeknek biológiai aktivitása, környezetszennyező tulajdonságai is különbözőek. A haloecetsavakhoz hasonlóan lényeges a természetes vizekben előforduló fémek és poliaminokarbonsavak nyomon követése, mivel vízoldható komplexeket képeznek, miáltal bekerülhetnek az ivóvízcikluson át az emberi szervezetbe is. Az elmúlt évszázad második felében az elválasztástudományok minden területén jelentős fejlődés volt tapasztalható. A kémiai elválasztások változatossága és bonyolultsága, sebessége, hatékonysága növekedett, a szelektivitás, a felbontás jelentősen javult. A kromatográfia történetében a legjelentősebb áttörésre az intenzív folyadékkromatográfia bevezetésekor került sor a hetvenes években, amellyel az addigi módszerekhez képest sokkal gyorsabban, pontosabban, reprodukálhatóan és szelektíven lehet igen bonyolult elválasztási feladatokat megoldani [1, 2, 3, 4, 5]. Napjainkban a humán-genommal kapcsolatos kutatások, a bioanalitikai módszerek fejlesztése egyre nagyobb követelményeket támasztanak az elválasztástudomány alapkutatásaival szemben. A környezeti kémiai hatások, a természetes és ivóvizek kémiai összetételének fluktuáló változása nagy szelektivitású, gyors működésű vizsgálatokat igényelnek. A haloecetsavak (HAA) az ivóvíz klóros fertőtlenítésekor keletkező melléktermékek fontos csoportját alkotják. Az utóbbi években egyre inkább felismerik ennek a vegyületcsoportnak az emberi egészségre gyakorolt káros hatásait. A dolgozat első részében bemutatom azt az új, nagyhatékonyságú ionkromatográfiás módszert, amelyet kilenc klórozott, ill. brómozott haloecetsav elválasztására fejlesztettünk ki, a mérésekhez makrociklusos alapú, szabályozható kapacitású anioncserélő elválasztó oszlopot használva. A fémkomplexek analízise régóta az analitikusok és a környezettel foglalkozó kémikusok érdeklődésének középpontjában áll. A fémek és ligandumaik biológiai és toxikus tulajdonságai bonyolult, sokkomponensű folyamatban alakulnak ki. A dolgozat második felében bemutatandó módszer lehetővé teszi a fém kationok, komplexek és a szervetlen, ill. szerves anionok szimultán felismerését, elválasztását anioncsere kromatográfiával. A módszer nagy töltésű, erős kelátképző anion használatán alapul. A poliaminokarbonsavak, köztük az
11
EDTA és a DCTA, a komplexképzés révén mobilizálhatják az átmeneti- és nehézfémeket. Ezáltal a poliaminokarbonsavak potenciális veszélyt jelentenek a környezetre.
12
1. Irodalmi összefoglaló 1.1. A folyadékkromatográfia típusai A folyadékkromatográfiás áramló rendszerekben a különféle kémiai komponensek áthaladva az elválasztó oszlopon a mozgófázissal együtt a detektorba jutnak. A detektor az elválasztás kezdete óta eltelt idő függvényében regisztrálja a koncentrációjukat. Ideális esetben minden komponens Gauss-görbe alakú csúcs formájában lép ki az oszlopból. Minden csúcs az illető anyagra jellemző idő után hagyja el az oszlopot. A minta injektálása és a csúcsmaximum megjelenése között eltelt idő a retenciós idő, jele tR, amely a kémiai komponens szerkezetére jellemző, minőségi információ. Minél nagyobb két anyag retenciós ideje közti különbség, annál könnyebben elválaszthatók egymástól. Minél keskenyebbek a csúcsok, azaz minél kisebb a sávszélesség, annál hatékonyabb az elválasztás. A kromatográfiás elválasztás a minta, valamint az álló- és mozgófázis molekulái között kialakuló specifikus kölcsönhatások eredményeként jön létre [1]. A különböző állófázisok szelektív kölcsönhatások kiválasztását teszik lehetővé és többféle elválasztás valósítható meg. A normál fázisú kromatográfiában az állófázis poláris, mozgófázisként apoláris fázist használnak. Ez a rendszer jól használható poláris komponensek elválasztásához, mert azok számára kedvezőbbek a körülmények az állófázisban. A két fázis fel is cserélhető, ekkor a kevésbé poláris fázis lesz az álló-, a polárisabb pedig a mozgófázis. Ezzel az utóbbi, ún. fordított fázisú (RP) rendszerrel elsősorban apoláris komponenseket tudunk elválasztani. Manapság ez a domináns LC módszer. A folyadékkromatográfiás elválasztások során az illékonyság vagy a hőstabilitás nem jelent problémát, tehát ideális módszer a biokémiai szempontból érdekes makromolekulák és ionos anyagok, a bomlékony, természetes eredetű termékek, és egyéb, változatos eredetű és összetételű, nagy molekulatömegű és / vagy kevésbé stabilis vegyületek, pl. fehérjék, nukleinsavak, aminosavak, gyógyszerek, vitaminok, poliszacharidok, poláris lipidek, szteroidok, színezékek, stb. analitikai elválasztására, ill. széleskörű vízanalitikai problémák megoldására [2].
13
1.2. A kromatográfia alapfogalmai Egy komponens visszatartásának mértéke jellemző az adott vegyületre, így annak minőségi azonosítására is szolgál. A legegyszerűbb módszer a retenció, azaz visszatartás számszerűsítésére az injektálás kezdete és az adott komponens detektorban történő megjelenése közti idő mérése, amit retenciós időnek (tR) hívunk [6]. A retenciós idő arányos a komponens visszatartásával és fordítottan arányos az eluens térfogatáramával. A VR retenciós térfogat az az eluenstérfogat, amely az X komponens csúcsközéppontjának eluálásához szükséges. Ez a minta injektálása és a csúcsmaximum detektorban való megjelenése között átáramló folyadék térfogata [7]. A retenciós térfogat két részből tevődik össze: - Holttérfogat (V0): az az eluens térfogat, amely az idő alatt áramlik keresztül az oszlopon, amíg a mintakomponens a mozgófázisban tartózkodik, értéke minden mintakomponensre nézve állandó. - Korrigált retenciós térfogat: az a mozgófázis térfogat, amely az idő alatt áramlik keresztül az oszlopon,
amíg
a
mintakomponens
az
állófázison
tartózkodik.
Értéke
minden
mintakomponensre más. A retenciót univerzálisan jellemzi a retenciós tényező (k’), amely a komponens álló- és mozgófázisbeli mennyiségének hányadosa és megadható a retenciós idő és a holtidő segítségével [6, 8]:
k'=
ns t − t0 = R nm t0
/1.1./
ahol ns a vizsgált komponens állófázison, nm a mozgófázisban lévő móljainak száma, t0 a holtidő. Adott oszlop, eluens, elválasztási hőmérséklet és X komponens esetén, kis mintamennyiséget alkalmazva k’ állandó, ezáltal lehetővé teszi az adott mintakomponens minőségi azonosítását. Az elválasztó oszlopban a komponensek vándorlási sebessége azok álló- és mozgófázis közötti egyensúlyi megoszlásától függ. 1 dx = dv M D M
/1.2./
ahol dx az állófázis infinitezimálisan kis mennyisége, amelyen a megoszló anyag dv ml fluid fázis bejuttatásának hatására előrehalad, DM a megoszlási hányados. Az elválasztandó
14
komponensek oldódnak a mozgófázisban, ill. megkötődnek az állófázison. Ezt a folyamatot a megoszlási hányadossal jellemezzük. DM =
(M) [M]
/1.3./
ahol (M) a minta állófázisbeli, [M] pedig a mozgófázisbeli koncentrációja. DM értéke a két fázis kémiai tulajdonságaitól függ, így általában egytől különböző értékeket vesz fel. DM nagy, ha nagy az ion affinitása az állófázishoz, és kicsi, ha az inkább a mozgó fázisban tartózkodik. A retenciós viselkedés leírására a gyakorlatban alkalmasabb a már ismertetett retenciós tényező, k’:
k ' = DM
Válló t R − t 0 = V0 t0
/1.4./
Az elválasztás hatékonysága a komponens retenciójától és kromatográfiás csúcsának szélességétől függ. Egy mintakomponens retenciója a molekula és az állófázis közötti kölcsönhatás erősségére, valamint az állófázis fajlagos felületére utal. A komponens sávjának szélesedése ellenben alapvetően kinetika által szabályozott, és az állófázis részecskéinek átmérőjétől, porozitásától, pórusméretétől és az oszlop méretétől függ. A kromatográfiás oszlop hatékonyságára jellemző fontos mérőszám az elméleti tányérszám, amely a kromatográfia tányérelméletéből eredeztethető [9]. Értéke a következő összefüggés segítségével számítható:
t N = 16 R w
2
/1.5./
ahol tR a retenciós idő és w a csúcs bázisszélessége. Minél nagyobb egy elválasztó rendszer hatékonysága, annál keskenyebb csúcsokat kaphatunk adott retenciós idő esetén, azaz annál több komponens kromatográfiás csúcsát tudjuk megkülönböztetni egy adott retenciósidő-tartományban. Két különböző komponens szelektivitásán azok retenciós tényezőinek vagy korrigált retenciós időinek hányadosát értjük [2, 10]. A szelektivitás egy kromatográfiás rendszer elválasztási erejét mutatja meg adott komponensekre vonatkozóan. Értéke nagyobb 1-nél, mivel mindig a nagyobb retenciójú komponens retenciós tényezőjét osztjuk a kisebbével:
α=
k 'B tB = k 'A tA
/1.6./
Ez a paraméter független az oszlop hatékonyságától, értéke csak az elválasztott komponensek természetétől, az eluens fajtájától és összetételétől, valamint az állófázis tulajdonságaitól függ.
15
Ha két komponens szelektivitása 1, akkor az adott kromatográfiás rendszerben nincs mód azok elválasztására. A komponensek kielégítő mértékű elválasztásához megfelelő felbontást kell biztosítani. Két szomszédos A és B sáv felbontása definíciószerűen a két sáv középpontja közti távolság és az átlagos sávszélesség hányadosával egyenlő [6]: RS = 2
t RA − t RB
( twA − twB )
/1.7./
ahol tRA és tRB az A és B sáv tR értéke, twA és twB pedig a sávok alaplapi szélessége ugyanabban az időegységben, mint a tR értékek. Ha RS = 1, akkor a két sáv jól elválik egymástól, maximum 2 %-ban fednek át. Nagyobb felbontás érték jobb, kisebb kevésbé hatékony elválasztást jelent.
1.1. ábra. Az elválasztás mechanizmusa a kromatográfiában
1.3. Ionkromatográfia Az ionkromatográfiát (IC) mint új módszert 1975-ben vezette be Small, Stevens és Baumann. Az ionkromatográfia a folyadékkromatográfia egy kiemelt részterülete. E módszernek három típusát ismerjük:
16
- Ioncsere-kromatográfia (HPIC: High Performance Ion-Exchange Chromatography): Ez az elválasztási eljárás az állófázison kötött ionos csoportok és a mozgófázis közti ioncserefolyamaton alapul. Az állófázis polisztirol-gyanta, amelyet divinil-benzollal kopolimerizáltak. Az ioncsere-kromatográfia felhasználható szervetlen és szerves anionok és kationok elválasztására. Az anion-kromatográfiában a funkciós csoport többnyire kvaterner ammóniumion,
a
kation-kromatográfiában
pedig
szulfonátcsoport.
Az
ioncsere-
kromatográfiát nevezik a gyakorlatban ionkromatográfiának [3]. Az atomenergia-ipar kifejlődésében fontos része volt az ioncserés kromatográfiának a hasadási termékek és a ritkaföldfémek elválasztása révén. Ioncsere kromatográfiával határozzák meg a fehérjék összetételét is. Az aminosavszekvencia-analízis az 50-es évek végén szelektív HPIC elválasztásokkal vált lehetővé. - Ionkizárásos kromatográfia (HPICE: High Performance Ion Chromatography Exclusion): Az elválasztás mechanizmusát a Donnan-kizárás, a sztérikus kizárás és az adszorpció határozza meg. Az elválasztáshoz nagy kapacitású teljesen szulfonált kationcserélőt használnak polisztirol-divinil-benzol bázison. Az ionkizárásos kromatográfia elsősorban gyenge szerves savak teljesen disszociált erős ásványi savaktól való elválasztására alkalmas, valamint aminosavak, karbonát és borát meghatározására. Ezt a módszert alkalmazzák az élelmiszeriparban, borászatban és tartósítóiparban, valamint ily módon végzik a vér analízisét is. Az ionkizárásos kromatográfia elsősorban alifás és aromás savak (ecetsav, citromsav, ftálsav, laktát, piruvát) elválasztására alkalmas. Segítségével a di- vagy trikarboxilsavak is elemezhetők. Lényeges szempont az elválasztandó anyagok kiválasztásánál, hogy a pK jól megkülönböztethető legyen az erős ásványi savak pK-jától. - Ionpár-kromatográfia (MPIC: Mobile Phase Ion Chromatography): A domináló mechanizmus az adszorpció. Az MPIC segítségével elválaszthatók a fémkomplexek, valamint a felületaktív anionok és kationok. Az eluenshez a szervetlen és szerves moderátorok mellett ionpár-reagenst is kell adni. Az állófázis semleges makropórusú polisztirol / divinil-benzol gyanta, amely apoláris. Ionpár-kromatográfiával neutrális és ionos komponensek egyidejűleg elválaszthatók egymástól ionpárképzés révén. A pH és a párképző típusa nagymértékben befolyásolja a párképzést. Az ionkromatográfia kitűnik a korábbi analitikai módszerek közül szelektivitása és a detektálás érzékenysége révén. A módszer sokoldalúságát felhasználási lehetőségeinek nagy száma
igazolja:
vízvizsgálatok,
félvezetőipar,
galvánelemek
gyártása,
gyógyászat,
mezőgazdaság, erőművek kémiája, gyógyszerészet, papíripar, bányászat és fémfeldolgozás, élelmiszeripar, környezetvédelem [4]. Különös jelentőségre tett szert az ionkromatográfia a 17
vízben található anionok mennyiségi analízisének területén [5]. A különféle ionok rövid időn belül, szimultán meghatározhatók. Az ionkromatográfia céljaira intenzív, reprodukálható ioncserélő gyantát fejlesztettek ki. Az injektálási térfogatot 10-100 µl-re csökkentették. A legjelentősebb újítás a szuppresszált elektrokémiai detektálás volt, amely lehetővé tette a kromatográfiás jelek érzékeny feldolgozását. A vezetőképességen alapuló detektálás bevezetésével egyre nagyobb alkalmazási teret nyert az ionkromatográfia.
1.3.1. Az ioncsere-kromatográfia elve Elúciós oszlopkromatográfiás elválasztás esetén kis mennyiségű mintát juttatunk az elválasztó oszlopra, amelyben az ioncserélő tulajdonságú állófázis található. Az oszlop irányába áramoltatjuk a mozgófázist, amely az ellenionokat tartalmazza. Az ioncserélő gyantán töltéssel rendelkező funkciós csoportok találhatók, amelyek kívülről elektromosan semlegesek az ellenionok miatt. Az elúció folyamán a funkciós csoport ellenionja kicserélődik a mintaionra, ezáltal a gyanta visszatartja az illető iont. A minta komponensei az állófázishoz való különböző affinitásuk alapján választhatók el egymástól. Anioncsere esetén a következő reakció játszódik le a gyantán:
yR x − E + xA y – ↔ xR y - A + yE x –
/1.8./
yR x - E + xK y + ↔ xR y - K + yE x +
/1.9./
Kationcsere esetén:
ahol A és K a minta anion, ill. kation, E az eluensben levő ion, R az ioncserélő töltéssel rendelkező funkciós csoportja. Az anioncserélő kromatográfiában a vizsgált A y − -ion verseng a mozgófázisban levő E x − -ionnal az ioncserélő gyantán levő R kationos csoportért. Kationcserés kromatográfia esetén a minta K y + -kationjai versengenek az eluens E x + ionjaival az ioncserélő gyanta R anionos csoportjaiért. Az elválasztásnak az az alapja, hogy az így
kialakuló
ionpár-kölcsönhatások
különböző
erősségűek.
A
gyantával
gyenge
kölcsönhatásba lépő ionoknak kicsi a retenciója, ezért ezek az ionok a kromatogram elején jelennek meg. A gyantával erős kölcsönhatásba lépő ionok retenciója nagyobb, ezért csak később eluálódnak (1.1. ábra). Az ioncserélő gyantán néhány mikron vastagságban vannak az aktív csoportok. A réteg vastagságának növekedésével nő az oszlop kapacitása, és ezáltal a retenció.
18
1.3.2. Az ionkromatográfiában használt eluensek és mintakomponensek Az eluens kiválasztása döntően az elvégzendő elemzés fajtájától függ. Az eluens állófázishoz való affinitása hasonló kell legyen a mintaion affinitásához. A minta molekuláinak retenciója erősen függ a mozgófázisban levő ion típusától, mert a különböző ellenionok különböző mértékben lépnek kölcsönhatásba a gyantafázissal. Az eluens koncentrációja a legfontosabb retenciót meghatározó paraméterek közé tartozik, növelése gyorsítja a retenciót. A mozgófázis növekvő sókoncentrációjával csökken a komponensek retenciója, mivel a minta ionjai így kevésbé tudnak versenyre kelni az ioncserélő funkciós csoportjaiért. A szelektivitás pH-függő, de ennek mértékét nehéz előre megállapítani. Az eluens összetételének változtatásával az elválasztás szelektivitása is változtatható [2]. Az eluens átfolyási sebessége és a retenciós idő között fordított arányosság van. Ha az eluensnek nagy a vezetőképessége, akkor részt kell vennie a szuppresszorban egy reakcióban, amely során csekély vezetőképességű anyag keletkezik. Erre a reakcióra nincs szükség, ha az eluensnek olyan kicsi a vezetőképessége, hogy az amúgy is érzékeny vezetőképességi detektálást tesz lehetővé [3]. Ioncsere-kromatográfiával savak és bázisok egyaránt elválaszthatók. A HA gyenge sav disszociál:
HA ↔ H + + A –
/1.10./
A disszociációfok az oldat pH-jának változtatásával befolyásolható. A legtöbb ioncserés elválasztást vizes közegben végzik, mert a víz oldó és ionizáló képessége nagyon jó. Az 1.1. táblázat bemutatja, hogy adott mintaion csoportokat milyen kísérleti körülmények mellett célszerű elválasztani, detektálni. 1.1. táblázat: Főbb ionkromatográfiás módszerek Minta / Irodalom Szervetlen anion ( Cl – , Br – , NO 3− , SO 24− ) [3] Szerves anion (formiát, acetát, laktát, oxalát) [18] Szervetlen kation (alkáli, alkáliföldfém) [10] Szerves kationok aminszármazékok, (metil, etil, amin) [11]
Eluens
Detektor
Elválasztó oszlop
Na2CO3
elektromos vezetőképességi
anioncserélő
NaOH
elektromos vezetőképességi
anioncserélő
aminosav + HNO3
elektromos vezetőképességi
felületi kationcserélő
aminosav + HNO3
elektromos vezetőképességi
felületi kationcserélő
19
1.3.3. Az ionkromatográfia eszközei
1.2. ábra. Az ionkromatográf szerkezete [12] 20
A mozgófázist az egész kromatográfiás rendszerben egy kettősdugattyús pumpa mozgatja, amely állandó áramlási sebességet biztosít. A mintát mikrofecskendővel visszük a rendszerbe. A kromatográfiás készülékben található mintabemérő hurok (loop) állandó térfogatának köszönhetően igen kis térfogatú minták is reprodukálhatóan injektálhatók, miközben igen kis sávszélesedéssel kell számolni. A mintabemérő hurok használata egyszerű, kényelmes, olcsó. A kromatográf legfontosabb része az elválasztó oszlop. A megfelelő állófázis és a megfelelő kromatográfiás feltételek kiválasztása meghatározza az analízis minőségét. Az előkolonna (guard) azt a célt szolgálja, hogy megvédje a szennyeződésektől az analitikai oszlopot, amelyben a töltéssel rendelkező funkciós csoportokat tartalmazó ioncserélő gyanta található. A detektor a vizsgált minta minőségi és mennyiségi kimutatására szolgál. Az ionkromatográfiában leggyakrabban elektromos vezetőképességi detektorokat használnak. A vezetőképességet váltóáramú ellenállásmérésre vezetjük vissza. A detektorban annál nagyobb a jel, minél nagyobb különbség van a minta és az eluens vezetőképessége között, azaz minél nagyobb a jel-zaj viszony. A detektor elé helyezett szuppresszornak az a szerepe, hogy az ionok elúciójához használt elektrolit vezetőképességét kémiailag csökkentse. Tehát a szuppresszor elnyomja az eluens vezetőképességét, ezáltal növeli a jel-zaj viszonyt és ezzel összefüggésben a detektor érzékenységét is. Lúg eluens (pl. NaOH) esetén szükséges a szuppresszálás, mivel a lúgnak nagy a vezetése. Ekkor a szuppresszorban ioncserélt víz keletkezik, amely gyakorlatilag nem vezet, így a detektálás nagyon érzékeny lesz. R-H+ + NaOH → R-Na+ + H2O
/1.11./
Ebben az esetben a szuppresszor kationcserélő kapilláris cső, amelyben az eluens Na+ionjai H+-ionokra cserélődnek a reakció során. Az ioncserélő membrán regenerálása elektrokémiai úton vagy kénsavval történik, amelynek protonjai biztosítják, hogy H+ -ionok legyenek a membrán felületén. A kromatográfiás jeleket számítógép rögzíti. Minőségi eredményeket kapunk a csúcs helye alapján és mennyiségi eredményeket a csúcsterület kiértékelésével. Ehhez a digitális integrátorok nyújtanak segítséget.
21
1.4. Az ionkromatográfiában alkalmazható vezetőképességi detektálás Az ionos komponensek elektromos vezetőképességük alapján detektálhatók. A vezetőképességi detektálás, amely egy időben viszonylag mellőzött volt, ma az ionok kromatográfiás analízisében a legfőbb detektálási módszerek egyike. Két fontos előnye van: minden ion elektromos vezető, ezért ez a detektálási mód általánosan használható, a másik szempont, hogy viszonylag egyszerű szerkezetű és működésű. A vezetőképességi detektor részei: a cella, amely tartalmazza a mikro-Pt-elektródokat, egy kimenetijel-mérő és a szükséges elektronika, amely méri a vezetőképességet és módosítja az érzékenység szabályozását. A detektor érzékenysége előre megbecsülhető, ha ismerjük a vezetőképességi adatokat. A detektor a koncentrációval arányos jelet ad [2]. A cella holttérfogata kisebb, mint 2 µl. Az oldatban változik az ionok mozgékonysága az oldat hőmérsékletével, ezért azt gondosan termosztálni kell [5]. Az analitikai eljárás érzékenysége azt a jelváltozást jelenti, amely a vizsgált minta egy alkotója koncentráció- vagy tömegegységnyi megváltoztatásának hatására bekövetkezik. Ez tulajdonképpen az analitikai mérőgörbe meredeksége. Definíció szerint: érzékenység = ahol
∆x
a
műszerrel
megállapított
∆x ∆C
mérőszám
/1.12./ (kimenő
jel)
megváltozása
∆C
koncentrációváltozás közben. Az analitikai rendszer érzékenysége a részrendszerek érzékenységének szorzata [14]. T. Okada és T. Kuwamoto szuppresszált rendszerben egyezést talált a mért és a fajlagos vezetőképesség alapján számított érzékenység között [15]. Másrészt Gjerde és munkatársai arról számoltak be, hogy az anionok detektálhatók olyan vezetőképességi detektorral, amely közvetlenül kapcsolódik az elválasztóoszlophoz, amelyben kis vezetőképességű eluens van [16]. Viszont ennek az oszloprendszernek általában kisebb az érzékenysége, mint annak, amelyik szuppresszáló rendszerrel van ellátva.
22
1.5. Az ionkromatográfiában használt állófázisok fizikai-kémiai szerkezete Az ionkromatográfiában elsősorban szerves polimer, pl. sztirol-divinil-benzol alapú állófázisok terjedtek el, de szervetlen alapú tölteteket tartalmazó oszlopok is használatosak [17]. Az anion-kromatográfiában gyakran alkalmaznak latex alapú anioncserélőt, amely szerves polimer alapú és pellikuláris szerkezetű, felépítése az 1.3. ábrán látható.
1.3. ábra. Latex alapú anioncserélő állófázis felépítése A latex alapú anioncserélő 5-25 µm átmérőjű felületileg szulfonált sztirol-divinil-benzol kopolimerből és az erre felvitt, elektrosztatikusan vagy van der Waals kölcsönhatással rögzített teljesen aminált pórusos anioncserélő gyöngyökből áll, melyek polivinil-kloridból vagy polimetakrilátból készülnek Az utóbbi ún. latex részecskék átmérője kb. 0,1 µm. Mindezek alapján a latex alapú állófázis három régióra különíthető el: •
egy inert és mechanikailag ellenálló hordozóra
•
egy vékony szulfonsav borításra a hordozó felületén
•
egy külső aminált latex rétegre, mely az anioncserélő csoportokat hordozza [3]
Egy ilyen ioncserélő pásztázó elektron mikroszkóppal készített felvétele az 1.4. ábrán látható. A latex réteg önmagában véve nagy ioncsere kapacitással rendelkezik, a kisméretű gyöngyök mégis kis ioncsere kapacitású állófázist eredményeznek. A latex alapú állófázisok
23
kémiailag nagyon stabilak, még 4 mol/l koncentrációjú NaOH sem képes megbontani a szulfonált felület és a latex részecske közti kötést.
1.4. ábra. Latex alapú állófázis pásztázó elektronmikroszkópos felvétele [3] Ezen anioncserélők pellikuláris struktúrája felelős a nagy kromatográfiás hatásfokért. A latex-agglomerált anioncserélők szelektivitása megváltoztatható a kvaterner ammónium-bázis kémiai természetének változtatásával. Mivel a latex anyagot külön lépésben szintetizálják, lehetővé válik az elválasztó oszlop szelektivitásának optimalizálása speciális analitikai problémára vagy a latex gyöngyökhöz kötött funkciós csoportok, vagy a térhálósság mértékének változtatásával.
1.5.1. A makrociklusos állófázist tartalmazó oszlop működési elve Anionok elválasztására töltéssel nem rendelkező makrociklikus vegyületek is alkalmasak. Kifejlesztettek egy kriptand-bázisú anioncserélőt (IonPac Cryptand A1) [16, 18], amelyben a kapacitás, és kisebb mértékben a szelektivitás egyszerűen szabályozható a mozgófázis megválasztásával. A makrociklusos ligandumos anioncserélő anioncsere képessége a fém kationok komplexképzésének
köszönhető
a
makrocikluson
belül.
Amint
egy
fém
kation
komplexálódik, kialakul egy pozitív töltésű funkciós csoport. A makrociklus kation-megkötő képességének köszönhetően a pozitív töltésű fém-kriptand komplexek anioncserélő helyekként viselkednek. Az 1.5. ábrán látható az n-decil-2,2,2-kriptand molekula, amely az alkilcsoportján keresztül kovalensen köthető a sztirol-divinil-benzol gyantára.
24
1.5. ábra. Makrociklikus állófázis (n-decil-2.2.2-kriptand molekula) A makrociklikus vegyületek, mint a koronaéterek, kriptandok, kalixarének, jellemző tulajdonsága,
hogy
képesek
fémionokat
szelektíven
megkötni.
Ionkromatográfiás
állófázisként szóba jöhetnek egyrészt kationok elválasztása esetén, ahol a makrociklikus vegyületek említett tulajdonságának köszönhetően az eltérő átmérőjű fémek eltérő mértékben szenvednek visszatartást az oszlopban, így azok ligandcserés mechanizmussal elválaszthatók egymástól, másrészt alkáli hidroxid (LiOH, NaOH, KOH) eluenst használva pozitív töltésű anioncserélő helyek alakulnak ki az oszlopban, mivel a mozgófázis fémionja komplexet képez a makrociklikus vegyülettel, amelyen a mintaionok ioncserés mechanizmussal elválaszthatók egymástól.
A
koronaéterek
felhasználhatók
a
szelektivitás
szabályozásában
a
kationelválasztások során, azonban csak korlátozottan használhatók anioncserélőként [19]. A kriptandokat, annak köszönhetően, hogy sokkal erősebben képesek bizonyos kationokat képezni, messzemenően alkalmasnak találták az anioncserélő elválasztásokhoz. A makrociklikus vegyületek anionkromatográfiás alkalmazásának legfőbb előnye, hogy az alkáli-hidroxid eluens típusának megváltoztatásával befolyásolható az állófázis ioncserekapacitása a fémionok eltérő mértékű megkötődésének köszönhetően. Továbbá az elúció közben az eluens típusának váltásával ún. kapacitás gradiens érhető el, mellyel lehetőség nyílik a jelentősen és kevésbé visszatartott komponensek szimultán elválasztására. A mozgófázis ionkoncentrációját állandónak tartva, de kationjának típusát változtatva az oszlop kapacitása változtatható az elúció során. A kapacitás egyenes arányban van a komplexált kation képződési állandójával. Az elválasztást nátrium-hidroxiddal kezdik (mérsékelt kapacitású mód), majd lítium-hidroxid következik (alacsony kapacitású mód). Lítiumhidroxid eluensnél kicsi az anionok retenciója, mivel a lítiumnak nagyon kicsi a kötési állandója, kevesebb, mint 1,0. Amikor nátrium-hidroxid a mozgó fázis, nagyobb kapacitás észlelhető a nátrium nagyobb kötési állandójának köszönhetően (log K = 3,9). Mivel a káliumnak a legnagyobb a relatív kötési állandója (log K = 5,4), az elválasztási idők ennek megfelelően nőnek. A kapacitás-gradiens használatakor nő az elválasztás hatékonysága, az 25
erősen visszatartott anionok rövidebb idő alatt eluálhatók alacsony eluenskoncentrációkkal, ezáltal a háttérvezetés alacsony marad. Mivel az eluens ionkoncentrációja nem változik, kicsi az alapvonal-torzulás az elúció folyamán. A rendszernek van holttérfogata, így a kapacitás csökkenése csak a holtidő után figyelhető meg. Ezenkívül az oszlopnak is van holttérfogata és az eluensnek időre van szüksége, hogy elérje az oszlop távolabbi részeit. Ezeknek az okoknak köszönhetően minél nagyobb a minták retenciója, annál nagyobb a retenciójuk csökkenése az oszlop kapacitáscsökkenése miatt. Ezidáig a kriptand-bázisú oszlop alkalmazásai szervetlen anionokra korlátozódtak. A makrociklusos kriptand fázis használata haloecetsavak ionkromatográfiájában számos előnyös tulajdonságot kínál. Két lehetőség van a retenció kontrolljára és szabályozására: az állófázis kapacitása és az eluens erőssége. A makrociklus alapú fázisokon különböző szelektivitások érhetők el, míg a tradicionális fixált ioncserélő helyek és alkanol kvaterner ammónium csoportok használatával a HAA-k elválasztásának szelektivitása ily módon nem változtatható. A kriptand oszlop lehetővé teszi az oszlopkapacitás szelektivitási kontrollját egyszerűen az eluens kationjának változtatásával. A szelektivitás javítására szolgáló megfelelő gradiens használatával az erősen visszatartott polarizálható anionok (tioszulfát, jodid, tiocianát, perklorát) és az egyszerű anionok szimultán elválaszthatók [18]. Ez a technika lehetővé teszi a többértékű anionok elválasztását is, mint pl. az oligoszacharidok, a mozgó fázis viszonylag alacsony koncentrációja mellett. Jó elválasztási profilt figyeltek meg több, mint 25 polifoszfát mintára és komplex mátrixokra is, pl. tömény savakra. Konvencionális anioncserélő fázisok használatakor a hasonló szelektivitású eredmények elérése időigényes, többszörös gradiens elúciót és költséges eszközöket igénylő folyamat.
1.6. Az ionkromatográfia alkalmazásai Az ionkromatográfia kitűnik szelektivitásával és érzékenységével a szervetlen és szerves anionok és kationok analízisében [3]. A felhasználási lehetőségek nagy száma bizonyítja ennek a módszernek a sokoldalúságát és fejlesztési irányait. Különös jelentőséget ért el az ionkromatográfia a vizekben lévő anionok mennyiségi analízisének területén. Így kevesebb mint 10 perc alatt szimultán meghatározhatók a klorid, foszfát, nitrát, nitrit és szulfát ionok, amelyek koncentrációjától alapvetően függ a víz minősége. Az ionkromatográfia előnyei az érzékeny detektálás, a gyors elválasztás [20].
26
Azoknál a mintáknál, amelyek részlegesen protonálódnak, figyelembe kell venni a különböző mintaoldatok móltörtjeit is. Mind a karbonsavak, mind a karbonsavak sói széles körben használatosak a vegyiparban és kereskedelmi termékekben [21]. Az ionkromatográfiát sikeresen alkalmazzák karbonsavak analízisére különböző élelmiszermintákban pl. juice, bor, tej rutinanalízisére. A kis móltömegű karbonsavak nagyon fontos szerepet töltenek be, mivel közreműködnek az íz kialakításában és a termék stabilitásában. Az ionkromatográfiát előszeretettel használják a klinikai kémiában, mert gyors analízist tesz lehetővé és minimális mintaelőkészítés szükséges hozzá pl. a vizeletben lévő oxalát meghatározása, humán plazma analízise. A karbonsavakat általában három különböző folyadékkromatográfiás módszerrel választják el: anioncsere, ion-kizárásos és fordított fázisú kromatográfia. [22] A nagyhatékonyságú
szuppresszált
ionkromatográfia
használata
alifás
karbonsavak
elválasztására vonzó és életképes módszerré vált az utóbbi években [23]. Széleskörűen használják számos elméleti és gyakorlati kérdés megválaszolására, alkalmazza a környezeti kémia, élelmiszerkémia és a gyógyszeripar. Az ionkizárásos technika különösen alkalmas az ioncsere-kromatográfia
kiegészítésére,
mivel
az
ezekkel
a
módszerekkel
kapott
szelektivitások meglehetősen különbözőek. Az erős szervetlen sav anionok a Donnan elvnek megfelelően egy egyszerű csúcsban záródnak ki a gyantafázisból és a holttérfogatnál eluálódnak. Gyengébb és protonált minták, amelyek főként molekuláris formában léteznek, visszatartódnak az állófázison az ionkizárás és a hidrofób kölcsönhatások kombinációjaként. A legújabb fejlesztések azt mutatják, hogy a gradiens elúciós ionkromatográfia kiszorítja az ionkizárásos kromatográfiát a szerves és szervetlen minták esetében. A fordított fázisú kromatográfiával sikeresen elválaszthatók a nukleinsavak (Horváth Csaba 1965-1966) [8], a biopolimerek és egyéb, biológiailag fontos molekulák. Nagy hatékonyság és szelektivitás, valamint az egyensúly gyors beállása és rövid analízisidők jellemzők erre a módszerre. Azonban az alkalmazható pH-tartomány 2 – 8 közöttire korlátozódik a szilikagél alapú RP töltetek esetén.
27
1.7. A retencióra ható tényezők
1.7.1. A pH szerepe Az elválasztás körülményeinek megválasztásakor figyelembe kell venni a minta és az eluens pKa értékét, az oldószer alifás természetét, valamint az eluens pH-ját [19]. Az eluens erőssége egyszerűen befolyásolható a pH változtatásával. Amikor karbonát és bikarbonát anionokat használunk, puffer eluens keletkezik és az elúciós ereje könnyen változtatható a két anion arányának változtatásával. Ahogy változik a mozgó fázis pH-ja, egyidejűleg játszódik le az ioncsere-egyensúly és a protonálódás a kromatográfiás rendszerben. A karbonát eluens, mint többfunkciós eluens három versengő aniont tartalmaz ( CO32− , HCO3− és OH − ). A megbízható retenciós viselkedés érdekében figyelembe kell venni adott időpontokban az eluens és az oldatkomponensek minden formáját. Az eluens pH csökkenése a retenció növekedéséhez vezet, mert a karbonát eluens túlsúlyban levő formája az egyértékű HCO3− pH<10 esetében. Mivel a szerves savak, köztük a poliaminokarbonsavak ionizációja függ a pH-tól, az elúciós viselkedésük befolyásolható a mozgó fázis pH-jának változtatásával abban a pHtartományban, amelyet a pKa-értékeik meghatároznak. Az elválasztások tervezésekor figyelembe kell venni az adott oszloptöltetnél alkalmazható pH-tartományt. A munkánk során alkalmazott elválasztó oszlopok (AS9-HC és Cryptand A1) minden pH értéken alkalmazhatók, de a szilikagél alapú állófázisok nem használhatók lúgos pH-jú eluensekkel és mintákkal.
1.7.2. Az eluens koncentrációjának hatása Az eluens koncentrációjának változása jelentős hatást gyakorol a minta retenciós jellemzőire [16]. A növekvő eluenskoncentráció csökkenő kapacitási faktorokhoz (k’) vezet. Az anionok elúciós sorrendje megfordítható az eluens koncentrációjának növelésével. A /1.13./ egyenletből látszik, hogy az egyensúly befolyásolható az eluens koncentrációjának változtatásával, mivel az ioncsere egyensúlyi folyamat. A /1.8./ egyenlettel jellemezhető anioncsere folyamat megoszlási hányadosa a következő alakban is felírható:
28
1
Q DM = K A E x
y
x
x
[E ] x−
−y x
/1.13./
ahol DM a megoszlási hányados, KA/E az egyensúlyi állandó, Q az effektív oszlopkapacitás, E x − az eluens anionja és A y − a vizsgált anion. Az egyenletet logaritmizálva a következő összefüggést kapjuk:
[ ]
y Q y 1 lg DM = lg K A + lg − lg E x − E x x x x
/1.14./
A /1.14./ egyenlet lineáris kapcsolatot mutat a megoszlási hányados és az eluens koncentrációjának logaritmusai között [24]. Ha ábrázoljuk a retenció mértékének logaritmusát (lgDM) az eluens koncentráció logaritmusának (lg[Ex-]) függvényében, és ha csak tisztán ioncsere folyamat játszódik le, egy (-y/x) meredekségű egyenest kapunk, amely a minta-, illetve eluension töltéseinek hányadosa. A tengelymetszetből KA/E értéke meghatározható. Többkomponensű rendszerek és a mellékreakciók figyelembevételével bonyolult retenció egyenletek alakíthatók ki, elsősorban az eluens protolízise, a minta protolízise, ill. komplexálódása révén [19].
1.7.3. Az állófázis szerepe A minták retenciós viselkedését az anion-kromatográfiában használt állófázisok fő jellemzői is meghatározzák: (1) az állófázisok morfológiai szerkezete (pellikuláris, makroporózus, gél-típusok), (2) a mátrix kémiai szerkezete (polisztirén, polimetakrilát, szilika alapú), (3) a funkciós csoportok kémiai szerkezete (dimetil-etilamin, dimetil-allilamin, trimetilamin) és (4) az ioncsere-kapacitások [23]. Az ionkromatográfiában használt állófázisok többsége pellikuláris polisztirén bázisú. Aktív ioncsere kapacitása a pellikuláris gyantának csak a gyöngy felületén vagy annak közelében van. Az állófázis hidrofobicitása és ioncsere-kapacitása jelentősen befolyásolja a karbonsavak elválasztását, különösen kétértékű és telítetlen anionok esetében.
29
1.8.
A haloecetsavak lehetőségei
jelentősége
és
analitikai
elválasztási
A klóros fertőtlenítés hatékonyan semlegesíti az ivóvízben lévő fertőző mikrobiális szennyező anyagokat [25]. Azonban a fertőtlenítési folyamat során a klór reagálhat azokkal a szerves anyagokkal, amelyek természetes módon vannak jelen a tisztítatlan vízben, és számos szerves Cl-tartalmú melléktermék keletkezik. Ha bromidot is tartalmaz a természetes víz, Brtartalmú szerves komponensek is keletkeznek. A természetes vizek nyom-mennyiségű oxobróm vegyületei, amelyek a bromidból keletkezhetnek, a közelmúltban különleges és kiemelt szerepet kaptak humán egészségügyi szempontból. Az esetlegesen jelenlevő vegyületek már ng/l koncentrációban is karcinogén hatásúak. A haloecetsavak a fertőtlenítési melléktermékek fontos csoportját képezik. Az utóbbi években egyre inkább felismerik a haloecetsavak emberi egészségre gyakorolt káros hatásait [26, 27, 28]. Ezek a vegyületek toxikusak az emberre, csecsemőfejlődésre, a növényekre, különösen az algákra. Fordított összefüggés van a HAA-k képződése és a pH növekedése között [35]. A képződési folyamat kinetikájának köszönhetően a hőmérséklet növekedése a nyári hónapok során növekedést okozhat a vízben lévő fertőtlenítési melléktermékek (disinfection byproducts: DBP-k) szintjében. Ráadásul a nyári hónapokban megnövekszik a mikrobiális szaporulat. Az évszakos hatások legyőzése érdekében ilyenkor a klórt nagyobb koncentrációban adagolják a kezelés során, ami a DBP-k nagyobb mennyiségét eredményezi ebben a periódusban. Dojlido és társai tanulmányozták, hogy a HAA tartalmú vízminták kezelés utáni forralása okozza-e a HAA-k bomlását. Arra a következtetésre jutottak, hogy kevesebb, mint 10 perc forralás hatására csökkent a HAA-k mennyisége, a TCA (triklórecetsav) 72 %-kal, az MBA (monobróm-ecetsav) 31 %-kal. Azonban később azt találták, hogy a forralás a HAA-kat a versengő trihalometánokká (THM) alakítja. Ez a felismerés lényeges az előzetes dúsítási folyamatok kiválasztásában. A klór dózisának növekedése a HAA-k szintjének növekedését okozza, szemben a THMekkel. Továbbá a triklórozott szerves anyagok mennyisége nagyobb, mint a di- és monoklórozott részecskéké, ha növeljük a klór mennyiségét. A klórozott szerves anyagok mennyisége nagyobb, mint a brómozottaké. A vízkezelési rendszerben hipobrómossav képződik a bróm és a klór reakciójának köszönhetően. A hipobrómossav hozzávetőleg 25ször gyorsabban reagál, mint a hipoklórossav és DBP-ket képez. A HOBr/HOCl arány fontos
30
szerepet játszik a THM-ek és HAA-k képződésében. A bromidion eltolja a DBP-k eloszlását a jobban brómozott formába. Az utóbbi néhány évben az ionkromatográfia alternatív, ígéretes technikaként jelent meg haloecetsavak meghatározására a mikroextrakció [34] mellett. Az ionkromatográfiás elválasztásukhoz alkalmas az egyszerű működésű és költségkímélő vezetőképességi detektálás, míg a mikroextrakcióhoz ESI-MS detektálást használnak. A HAA-kat erősen savas és hidrofil karakterük alkalmassá teszi hatékony ioncserés elválasztásra. [40] (1.2. táblázat). A HAA-k pKa értékei 0,7-től 2,8-ig terjednek, ami azt jelenti, hogy ezek a savak csak protonált formában léteznek erősen savas feltételek mellett, aminek lényeges hatása van az extrakcióra és az előzetes dúsítási technikákra. 1.2. táblázat: A HAA-k és pKa értékeik Haloecetsav
Rövidítés
Képlet
pKa
monoklór-ecetsav
MCA
ClCH2COOH
2,86
diklór-ecetsav
DCA
Cl2CHCOOH
1,29
triklór-ecetsav
TCA
Cl3CCOOH
0,65
monobróm-ecetsav
MBA
BrCH2COOH
2,87
dibróm-ecetsav
DBA
Br2CHCOOH
1,47
tribróm-ecetsav
TBA
Br3CCOOH
0,66
bróm-klór-ecetsav
BCA
BrClCHCOOH
1,09
klór-dibróm-ecetsav
MCDBA
ClBr2CCOOH
1,39
monobróm-diklór-ecetsav
MBDCA
BrCl2CCOOH
n.a.
Az US EPA a következő öt haloecetsav: MCA, DCA, MBA, DBA, és TCA mennyiségére 60 µgl-1 szintet engedélyez, azzal a kitétellel, hogy a DCA lehetőleg egyáltalán ne legyen jelen. Az öt szabályozás alatt álló haloecetsav meghatározására az EPA jelenleg két módszert hagyott jóvá, ezek a standard Method 6251B [29] és az 552,2 [30], amelyek oldószerextrakción, derivatizáción, gázkromatográfia-elektronbefogásos detektálásos (GCECD) analízisen alapulnak. Az EPA Method 552,3 [31], amelyet nemrégiben fejlesztettek ki a haloecetsavak meghatározására, teljesítményben felülmúlja az említett módszereket, különösen a nem szabályozott brómozott trihaloecetsavaknál, amelyeknél a detektálási határok 3–8-szor kisebbek. A szabályozásokhoz szükséges alacsony detektálási határok eléréséhez az elektroporlasztásos ionizációs tömegspektrometria (ESI-MS) jó kiegészítője a gázkromatográfiának. Ez a technika előnyös módszer, érzékeny és szelektív. Amennyiben 31
folyadék-kromatográfiával és előzetes dúsítással kapcsolják össze, az ESI-MS-sel kevesebb, mint 70 ngl-1 detektálási határokat lehet elérni [32]. Gyakran szükség van mintaelőkészítésre is. Az ionpár LC-ESI-MS-t, amelyet szilárd fázisú extrakció (SPE) lépés előz meg, használták vízmintákban a fent említett HAA-k meghatározására [33]. A szelektivitás fejlesztéséhez, amelyre a természetes mátrix interferáló ionjai miatt van szükség, perfluorozott alkilkarboxilátokat használtak. Ezek a reagensek stabil asszociációs komplexeket képeznek a mintákkal, amelyek detektálhatók ESI-MS-sel [34]. Mivel a HAA-k anionként léteznek az ivóvizekben, az IC nyilvánvaló választás az elválasztásukra és detektálásukra, eltekintve az előzetes dúsítási lépésektől, nem igényel további minta-előkezelést [35, 36]. Az utóbbi időben az elektroporlasztásos ionizációs tömegspektrometriát és az induktív csatolású plazma tömegspektrometriát (ICP-MS) sikeresen alkalmazzák a HAA-k detektálására az IC elválasztást követően. Egy sokkal összetettebb és sokkal érzékenyebb IC alapú módszert fejlesztett ki Lopez-Avila és társai [37]. A módszer kombinál egy többlépéses oldószer mikroextrakciós eljárást, egy on-line anion koncentráló oszlopot, amelyen a teljes extrakció mikroextrakcióból történik, és egy 60 perces, 12 szakaszos gradiens elúciós programot. Ez a módszer egy 25 cm-es microbore Dionex AS11 elválasztóoszlopot használ NaOH eluenssel és szuppresszálást egy 2 mm-es anion önregeneráló szuppresszor modul használatával (ASRS, Dionex). A detektálási határok 0,05 és 1,1 µg/l között voltak. Mint látható, néhány ionkromatográfiás módszert már alkalmaztak HAA-k elválasztására [35, 43]. Azonban meg kell jegyezni, hogy sok esetben hidroxid-szelektív oszlopot használtak [39, 44, 45] és a módszerek többségéhez gradiens elúció szükséges (koncentráció, áramlási sebesség, hőmérséklet vagy hőmérséklet kontroll). NaOH vagy Na2CO3 eluens esetén az volt a tapasztalat, hogy a lényeges haloecetsav-párok felbontása számos esetben nem volt megfelelő. A szelektivitás szempontjából legjobb eredményeket ESI-MS [41, 46, 47] vagy ICP-MS [44] kapcsolással lehet csak elérni, mivel így a szervetlen ionok interferenciája elkerülhető, viszont ezek az eljárások nagyon költségesek. Az utóbbi időben kifejlesztettek egy nagy kapacitású anion-cserélőt, az IonPac AS24-et, kifejezetten haloecetsavak analízisére [47] azzal a céllal, hogy megszüntessék a felbontási problémákat. Ennek az oszlopnak a kémiája, ill. a funkciós csoportjai hasonlók az AS19-AS20 oszlopéhoz. MS/MS technikával kombinálva használták és nagy ionerősségű mátrixokhoz ajánlják mintakezelés nélkül. Ez egy lehetséges jövőbeni irányvonal, habár rutin analízisekhez jelenleg magas költségű, komplex eljárás, valamint az analízis időigényes.
32
Sarzanini és társai [38] NaOH vagy Na2CO3/NaHCO3 eluensekkel azt találták, hogy az MBA és Cl-, valamint a DCA és NO3− felbontása rossz volt az AS11 oszloppal. Az AS9 oszloppal a fenti minták felbontása némiképp javult. Később Liu és Mou [39] megpróbálták javítani a szuppresszált anioncserés módszer (Na2CO3/NaHCO3 gradiens) detektálási határait egy nagy kapacitású oszlop (AS9-HC) használatával és 500 µl minta direkt injektálásával. Standard oldatokban a HAA-k detektálási határa 0,4-32 µg/l tartományban volt. Valódi minták analízisében a mátrix anionok problémákat okoznak számos HAA mennyiségi meghatározásában és a minták egy tisztító szakaszt igényelnek Ag töltetű On-Guard kolonna használatával, hogy csökkenjen a klorid, bromid és foszfát mennyisége a minta analízisének érdekében, amelyben meghatározható a nyommennyiségű DCA, BCA, DBA és TCA. Az ionkromatográfia egyszerűsége HAA-k elválasztási lépéseként (nem igényel minta derivatizálást) kombinálva az ESI-MS detektálás szelektivitásával és érzékenységével, az ICMS-t potenciálisan ideális alkalmazássá teszi az ivóvízben lévő nyommennyiségű HAA-k meghatározására [40]. Az IC-ESI-MS munkához kis áramlási sebességet kell használni olyan eluensekkel, amelyek csak illékony anyagot tartalmaznak. Ezért a hagyományos standard bore IC oszlopokat nem lehet használni. Roehl és társai [41] javasolnak egy módszert anioncsere kromatográfiát használva (Dionex AS 162 mm belső átmérőjű oszlop) 5-70 mM NaOH gradienssel 0,25 ml/min áramlási sebességnél eluens szuppresszálással. Az eluens szuppresszálás
a
hidroxid
eluens
tiszta
vízzé
való
átalakulását
eredményezi
a
tömegspektrométerbe való bevezetést megelőzően. Fontos megjegyezni, hogy a HAA-k nem illékony vegyületek. A szuppresszálás után az eluátum a HAA-k nagyon híg vizes oldatát tartalmazza. Ez az oldat nem teszi lehetővé az oldószer teljes elpárologtatását a elektroporlasztó fúvókánál és alacsony tömegspektrometriai választ eredményez. A probléma megoldásához egy második pumpa szükséges, amely illékony szerves oldószert, pl. metanolt juttat a rendszerbe egy T-illesztésen keresztül az MS előtt, hogy javítsa a minta elpárologtatását és ebből eredően az érzékenységet. A szerves oldószer elválasztás utáni bevezetéséről is igazolták Takino és társai [42], hogy javítja az érzékenységet. Az IC legújabb alkalmazásában HAA-k meghatározására Liu és társai ICP-MS-t használtak nagy érzékenységű és szelektivitású detektálórendszerként. A tanulmányban szuppresszált IC-t használtak hidrofíl anioncserélő oszloppal és NaOH gradienssel, on-line összekapcsolva az ICP-MS-sel. A detektort a klórozott HAA-k 35ClO- ionjainak és a brómozott vegyületek 79Br-jainak szelektív monitorozására használták (a domináns ionok a plazmában alakultak ki). A detektálási határokat a klórozott savaknál 16 és 24 µg/l között és a brómozott savaknál 0,3 és
33
1 µg/l között állapították meg 150 µl injektálási térfogat mellett. Az ivóvízmintákra való alkalmazáshoz a klorid mennyiségét csökkenteni kell, amelyet On-Guard Ag töltetek használatával végeztek el az injektálást megelőzően.
1.9. Az átmenetifémek és a poliaminokarbonsavak környezeti jelentősége
Az átmeneti- és nehézfémek minőségi és mennyiségi kimutatását a környezetben és a biológiai anyagokban való jelenlétük indokolja [48]. Ezek az elemek különböző oxidációs állapotban léteznek, az ezáltal kialakuló különböző fizikai és kémiai tulajdonságok különböző toxicitást eredményeznek. A környezet szennyezésének fő forrásai az ipar, a háztartások, a mezőgazdaság, a nukleáris technikák és más környezeti és globális változások. A szervetlen szennyezők, különösen a fémionok jelenléte a természetben komoly probléma, mivel a fémionok gyakran rákkeltőek. A réz és a cink azon fémek közé tartozik, amelyek az élethez nélkülözhetetlenek, annak ellenére, hogy bizonyos koncentráció felett toxikus hatásúak, mivel a peptidek és fehérjék fémion-koordinációja alapvetően megváltoztatja a biológiailag fontos molekula szerkezetét. [49] Az alumínium valószínűleg szerepet játszik az Alzheimer-kór kialakulásában [24]. A molibdén toxicitása más elemektől függ, mint pl. réz, cink és fehérjék. Az emberi szervezetbe ezek az elemek a víz és más élelmiszerek által kerülnek. Emiatt lényeges a különböző oxidációs fokú fémkomplexek nyomon követése. Az atmoszférában is számos toxikus fémion van jelen, amelyek közvetve hatnak az egészségünkre. Az átmeneti fémek különböző oxidációs fokú állapotokban fordulnak elő az üres d orbitáloknak köszönhetően. A réz jellemző oxidációs állapotai: Cu(I) és Cu(II), cink esetében szintén a Zn(I) és Zn(II) a leggyakrabban előforduló forma. Egy elem oxidációs fokának változása lényeges hatással van a biológiai felvehetőségre és a toxicitás fokára. A különböző oxidációs állapotú fémeknek eltérő a redoxpotenciáljuk, a komplexképzésük és a hidratációs tulajdonságaik. Ennek következtében elvégezhető a speciációs analízis, azaz a különböző oxidációs állapotú fémionok elválasztása és azonosítása, lehetővé válik a differenciálás a komplexált vagy kelát, ill. a szabad fémionok között. A fémion teljes koncentrációjának mérése nem nyújt információt az aktuális fizikai-kémiai formáiról, amely szükséges többek között a toxicitás, a biotranszformáció megértéséhez, emiatt nem kerülhető el az egyes elemek speciációja. Jól használható a speciációs technikákhoz az ionkromatográfia, amely nagy sebességű, érzékeny módszer és reprodukálható eredményeket nyújt. 34
Az ioncsere-kromatográfiában a fémek és anionok szimultán elválasztására szolgáló módszer nagy töltésű, erős komplexképző anion használatán alapul [50, 51]. Az etiléndiamintetraecetsav (EDTA) és a transz-1,2-diamin-ciklohexán-tetraecetsav (DCTA) kitűnő kelátképző ágens, képes kellően stabil kelátok kialakítására különböző fémionokkal. A nagy töltésű, erős komplexképző anionok reagálnak a legtöbb két- és háromértékű fém kationnal és egyszeresen vagy kétszeresen negatív töltésű komplexeket alakítanak ki, ami lehetővé teszi a fém kationok, szerves és szervetlen anionok szimultán elválasztását. A kelátképző ágensek elősegíthetik a radioaktív izotópok környezetbe jutását, a nukleáris szennyvizek kezelésénél figyelembe kell venni, hogy vízoldható komplexet képeznek a legtöbb nehézfémmel [52]. A poliaminokarbonsavakat (pl. EDTA, DCTA) széleskörűen használják az őrlési és papíriparban, detergensekben és a mezőgazdaságban [53] is. Használatosak még pl. az élelmiszerekben az enzimatikus barnulás gátlására, a talajban lévő mikrotápanyagok oldatban maradásának biztosítására és detergensekben alternatív detergens építőelemként foszfátok helyettesítésére, valamint a fémkiválás megelőzésére. Mivel a kelátképző ágensek átjutnak a szennyvíztisztítón, akadálytalanul elérik a felszíni vizeket és ezáltal az ivóvíz-ciklust [54]. A kezelt szennyvizekben az EDTA koncentrációja eléri a 19 mM-t [55]. A poliaminokarbonsavak képesek mobilizálni a nehézfémeket, ezáltal ezek természetbe való kikerülése okozhatja a nehézfémek talajvízbe jutását és növények általi felvételüket. Erős komplexképző tulajdonságuknak köszönhetően az EDTA és a DCTA nem fordul elő szabad savként a környezeti mintákban, csak különböző fémionokkal komplexálódva. A felszíni vizekben az EDTA főleg Fe(III)-mal és Zn(II)-vel asszociálódik, de kisebb mértékben Ca-mal, Mg-mal, Mn-nal és Pb-mal is. A poliaminokarbonsavak érzékeny meghatározásához a különböző fémekkel képződött komplexeket azonos fémet, jellemzően Fe(II)- at tartalmazókká alakítják át. A kelátképző ágensek lebomlása vitatott [56]. Az EDTA komplexek fontos alkalmazási területe az orvosi diagnosztika és pl. metabolikus rendellenességek terápiája, valamint a toxikus fémek emberi szervezetből való eltávolítására is használják az EDTA-t [57]. A talajtudományban a fém-EDTA komplexek iránti érdeklődés Stewart és Leonard felfedezésével kezdődött, amely szerint a Fe(III)-EDTA talajban való alkalmazása enyhíti a citrusfélék Fe klorozisét [58]. Míg a nehézfémek túlzott felvétele korlátozza az EDTA használhatóságát a mezőgazdaságban, ugyanezt a folyamatot elkezdték kutatni amiatt a lehetőség miatt, hogy a nehézfémtartalmú talajok használhatók a növényvédelemben. A fémfelvétel mechanizmusa még nem ismert teljes mértékben. A poliaminokarbonsavakkal képződött fémkomplexek kötéseinek exakt természete a hosszú ideje tartó gyakorlati jelentőségük ellenére még nem ismert [57]. Néhány tanulmány található 35
az irodalomban az EDTA-val képzett komplexekre vonatkozóan, amelyek elsősorban az adott komplexek disszociációs energiájával, szerkezeti és oldódási tulajdonságaival foglalkoznak. Aggodalomra ad okot, hogy sok kelátképző ágens, pl. az EDTA, biológiailag nem bomlik le, ezért tartósan jelen van a környezetben [56]. Mivel a poliaminokarbonsavak potenciális veszélyt jelentenek a környezetre, fontos, hogy jó analitikai technikát fejlesszünk ki az azonosításukra, az egyensúlyi koncentrációk meghatározására. Az International Organization for Standardization (ISO) és a German Institute for Norms (DIN) a különböző poliaminokarbonsavak meghatározására két különböző analitikai módszert hitelesített, amelyek GC-n és LC-n alapulnak [59]. Az LC-meghatározás ionpár-kromatográfiában fordított fázisú oszlopokon történik (IP-RPLC) például tetrabutil-ammónium ionpárképzővel, amely nem illékony, ezért alkalmatlan LC-MS alkalmazásokhoz. Az ESI-MS-sel kapcsolt ionkromatográfiát ajánlják az IP-RPLC alternatívájaként, amely lehetővé teszi különböző fémkomplexek elválasztását, ha stabilak az adott kromatográfiás feltételek mellett. Az ICESI-MS rendszerben az ESI forrás előtt szuppresszort kell használni. Noha a szelektivitás nagyobb, mint LC-UV esetén, előzetes dúsításra van szükség anioncserélő SPE-vel.
1.10. A fém-kelátok kialakulása, jellemzői
A többfogú komplexképző ligandumok, mint például a poliaminokarbonsavak (EDTA, DCTA, DTPA stb.) stabil kelátkomplexeket képeznek a legtöbb két- és háromértékű fém kationnal lúgos pH-n. A pozitív töltésű fémionokból EDTA ligandum hozzáadásával negatív töltésű komplex anion keletkezik a következő egyensúlyi reakció szerint: EDTA 4− + M 2+ ↔ [MEDTA]
2−
+ M2+ ↔
/1.15./
/1.16./ [MEDTA]2-
EDTA
Az EDTA konjugált bázisa hatfogú ligandum, amely hat helyen kapcsolódhat a fémionhoz: a 4 karboxil- és a 2 amino-csoporton keresztül koordinatív kötéssel. Fémkomplex képződése esetén a ligandum 6 donor atomja (4 oxigén és 2 nitrogén) a központi fémion körül egy oktaéder csúcsain helyezkedik el, két oxigén az axiális pozíciókat foglalja el, míg a másik
36
két oxigén és a két nitrogén képezi az ekvatoriális részt. Az EDTA-fémkomplexek nagy stabilitása annak tulajdonítható, hogy a ligandum a fémiont teljes mértékben körülveszi és az oldószer molekuláitól izolálja. Tekintettel arra, hogy az egyes fémionok csak a protonálatlan vagy részben protonált EDTA-ligandumokkal képeznek komplexet, az egyes fémkomplexek stabilitása az oldat pH-jától jelentős mértékben függ. Hasonló módon képez komplexet a DCTA is fém kationokkal, és ezek a komplexek nagyobb stabilitásúak, mint az ugyanannak a fémnek EDTA-val létrejött komplexe [61, 62, 63].
1.6. ábra. A DCTA szerkezeti képlete A
kialakuló
komplexek
töltéssel
rendelkeznek
vagy
töltés
nélküliek
a
komplexképződésben résztvevő ionok természetétől és a körülményektől függően. β Ln− + M m + ←→ [ML]
z−
/1.17./
ahol Ln− a többfogú komplexképző ligandum, M m+ a fém kation, [ML ] kelát komplex és z a nettó töltés
(z = m − n) .
z−
a képződött fém-
A keláthatásnak köszönhetően ezeknek a
komplexeknek lényegesen nagyobb a stabilitási állandójuk, mint az egyfogú ligandumokkal kialakuló hasonló komplexeknek [60]. Ha m < n, akkor az [ML ]
z−
kelátnak negatív töltése
van, így elválasztható anionkromatográfiával [66]. Az elválasztás alapja az eluens és a kelát anionok közötti ioncsere: K ML / E zR − E + [ML] ← → R z − ML + zE − z−
/1.18./
ahol R az állófázis pozitív töltésű ioncserélő funkciós csoportja, E − az elúció folyamán a keláttal versengő eluens anion és K ML / E a fenti reakció ioncsere egyensúlyi állandója. Az elválasztás pH-jától függő mellékreakció is lejátszódhat [65], a koordinálódott ligandum protonálódhat. Viszont ez nem jelenti szükségszerűen a fémion és a ligandum közti kötés szakadását [60], ezáltal lehetőség nyílik protonált komplexek kialakulására: K [ML]z − + H + ←→ [MHL]( z −1)− H
/1.19./
Amennyiben z nagyobb, mint 1, a protonálódott komplex is negatív töltésű és elválasztható anioncserélővel.
37
K (z − 1)R − E + [MHL]( z −1)− ← → R( z −1) − MHL + ( z − 1)E − MHL / E
/1.20./
A fémkomplexek stabilitása nagy jelentőségű, mivel a komplexeket nagyon kis koncentrációban injektálják és a kromatográfiás rendszeren áthaladva disszociációra hajlamosak [64]. A kinetikai stabilitás fontosabb, mint a termodinamikai, mert a kinetikailag inert komplexek nagyobb valószínűséggel mennek keresztül változás nélkül a kromatográfiás rendszeren. A komplex anionok ioncserés elválasztásakor a retenciót több tényező is befolyásolja. Egy időben játszódnak le a komplexképzési reakciók, létrejön az ioncsere egyensúly és a pH-tól függően protolízis is lejátszódhat.
1.7. ábra. Az EDTA fémkomplexeinek stabilitási állandói a pH függvényében [63] Az EDTA különböző fémekkel képzett komplexeinek stabilitási állandóit a pH függvényében ábrázolva az látható, hogy a görbéknek maximumuk van (1.7. ábra). Kezdetben a ligandum protonálódása csökken a pH növekedésével, ami a komplex képződésének kedvez, ezáltal nő a stabilitási állandó. Magasabb pH-értékeken a fémek hidroxokomplexeinek képződése, mint mellékreakció, csökkenti az EDTA-komplexek stabilitási állandóinak értékeit. A Cu(II) görbéjének alakja eltér a többi fémétől, ami bázikus komplexek képződésének köszönhető. Az iontöltés és –sugár tekintetében hasonló kétértékű fémionok komplexképző képességének sorrendje: Mn < Fe < Co < Ni < Cu > Zn. Ez a sorrend magyarázható a fémion sugarának csökkenésével a Mn-tól a Zn-ig, és a kristálytér stabilizációs energia növekedésével a Fe-tól a Cu-ig. A Zn(II) d orbitáljai telítettek, így nem szabadul fel stabilizációs energia a komplexképződéskor. Ez az oka annak, hogy a réz után
38
megváltozik a sorrend. A kialakuló komplexek különösen stabilak, ha a ligandum kelátképző karakterű.
1.11. A fém-kelátok elválasztásának többkomponensű karbonát eluens alkalmazásával
mechanizmusa
Yamamoto és mások [51] tudósítottak szervetlen anionok, valamint Ca2+ és Mg2+ kationok elválasztásáról anioncserélő oszlopon EDTA eluenssel és vezetőképességi detektálással. EDTA-t használva eluensként a Mg- és a Ca- kelátanionok negatív csúcsokként eluálódtak. Ezt a viselkedést okozhatja a kelátanion kisebb vezetése az EDTA eluens anionhoz képest. Hajós és társai ionkromatográfiás komplex módszert és retenciós modellt fejlesztettek ki a komplexek retenciójának tanulmányozására anioncserélő kromatográfiában szimultán egyensúlyi folyamatok figyelembevételével [50, 66]. Ez esetben a szuppresszált vezetőképességi detektálás karbonát eluenssel és EDTA komplexképző ágenssel a mintában több, mint egy nagyságrenddel jobb kimutatási határt biztosít, mint a nem-szuppresszált rendszer EDTA eluenssel. Mind a kalcium-, mind a magnéziumionok eltávoztak az EDTA komplexekből a szuppresszor oszlopban. Ez a viselkedés abból származtatható, hogy ha karbonát eluenst vezetünk a membránszuppresszorba, a karbonát átalakul CO2-dá és H2O-zé, és az eluens pH-ja 3 körülire csökken. Így a szuppresszormembránt elérő [Ca-EDTA]2- és [Mg-EDTA]2- komplexek felbomlanak, és így szabad Ca2+ és Mg2+-ionokat távolít el a szuppresszor oszlop. A k’-értékek csökkentek, amikor a karbonátkoncentráció nőtt, és a retenció lényegesebb csökkenését figyelték meg a kétértékű szervetlen anionoknál. A kalcium és magnézium jeleknél a lineáris görbék meredekségének kísérleti értékei hasonlók a kétértékű anionokhoz ( SO42− , HPO42− ) és kb. kétszer akkorák, mint az egyértékű anionoké, a várt anioncsere-mechanizmusnak megfelelően. Amikor az eluens pH-ja 9,5-re csökkent, a kalcium- és a magnézium-komplexek csúcsszélesedését figyelték meg. Ez a viselkedés különösen figyelemre méltó a [Mg-EDTA]2- komplexnél. Ez valószínűleg annak köszönhető, hogy a komplexek stabilitása csökken a pH csökkenésével, különösen a kisebb képződési állandójú [Mg-EDTA]2- komplexnél. Ez a módszer jó érzékenységet és reprodukálhatóságot kínál. A ppb szintű detektálási határok és az 1%-nál is jobb pontosság hasonlóak a szervetlen anionok elválasztására jellemző értékekhez. A kidolgozott modell [66] a generált ioncsere-egyensúlyon, protolízisen 39
és komplexképződési egyensúlyokon alapul. A minta és az eluens kromatográfiás ioncsere egyensúlyi állandóinak ismeretlen paramétereit a kísérleti retenciós adatokból iterációs minimalizálással határozták meg nem-lineáris regressziós algoritmust használva. A modellt a [CdEDTA]2-, [CoEDTA]2-, [MnEDTA]2- és [NiEDTA]2- retenciós viselkedésének jóslására használták. A kromatográfiás elválasztás függ a komplexek töltésétől, a komplexek stabilitásától, az ioncsere paraméterektől, valamint az eluens típusától és koncentrációjától. Az eluens 9,5 és 10,5 közötti pH-értékeinél az EDTA HY 3− és Y 4− formában létezik. M 2 + + HY 3− ⇔ MY 2 − + H +
/1.21./
M 2 + + Y 4 − ⇔ MY 2 −
/1.22./
Ezeknél a pH-értékeknél nem válik ki ligandumcsapadék. A fémionokat 0,25 mM EDTA-val komplexálták. Ez a koncentráció alkalmas a fémionok komplexálásának biztosítására és a szabad ligandumfelesleg csúcsával való interferencia minimalizálására. Az optimális eluensösszetétel: [ HCO3− ]:[ CO32− ] = 1:3. A mozgófázis pH-ját növelve az eluens erőssége nő a HCO3− -nak CO32− ionná való disszociációjának köszönhetően, ezért k’ csökken. Az eluens
pH-ja hatással van a gyenge savak disszociációjára is. Már 1939-ben Samuelson az átmeneti- és nehézfémek sikeres elválasztásáról számolt be ioncsere-kromatográfia segítségével [3]. Az akkoriban alkalmazott eljárás ioncserélő gyantát használt a fémionok elválasztásához. A minőségi meghatározás az egyes felfogott frakciók manuális spektrofotometriájával történt. A gyenge szerves savak, mint citromsav, oxálsav és borkősav,
fémionokkal
elsősorban
anionos
komplexeket
képeznek.
Mivel
normál
kromatográfiás feltételek mellett az Ln- ligandum komplexképző formájának koncentrációja sokkal nagyobb, mint a fémionkoncentráció, a komplexképződési egyensúlyt a ligandum részleges protonálódása alig befolyásolja. Az egyes átmenetifémek elválasztásának optimalizálása a pH-érték változtatásával történt. Ha komplexképző ligandumként gyenge szerves savat használtak, akkor a pH-érték csökkenése az effektív ligandumkoncentráció csökkenéséhez vezet. A protonkoncentráció ezzel kapcsolatos növekedése a retenciós idő növekedését eredményezte. Mivel az átmeneti- és nehézfémek anionos komplexeket képeznek, ezek a fajta elválasztások a kialakult komplexek stabilitásai közti szignifikáns különbségeken alapultak. A ligandum méretének viszonylag kicsinek kell lennie, hogy a létrejövő komplex körülbelül azonos méretű legyen, mint a fémion hidratált állapotban. Az átmeneti- és nehézfémek elválasztása latex-anioncserélőkön anion- és kationcseremechanizmusokat is magába foglal. Ezeknek az anyagoknak a kationcsere-kapacitása a felületi szulfonáltságukra vezethető vissza. Az alkalmazott állófázis egy anioncserélő latex 40
agglomerátum anyag (Dionex HPIC-CS5), amiben az aminált latex nem teljesen fedi be a magrészecskéken lévő szulfonsav funkcióscsoportokat. Ezért ez az anyag mind anion-, mind kationcserélő tulajdonságokat mutat, úgyhogy mind az anionos komplex, mind a reagálatlan fémion bizonyos mértékig visszatartódik, habár az anioncsere a domináns retenciós mechanizmus. Az anion- és kationcsere-kapacitás közti viszony határozza meg ennek az eljárásnak a szokatlanul nagy szelektivitását. Az ionkromatográfiában a két leggyakoribb mozgófázis a hidroxid (NaOH, KOH, LiOH) és a karbonát (Na2CO3) alapú eluens. Az utóbbi legalább három versengő eluens aniont tartalmaz, a kétértékű karbonátot ( CO32− ), az egyértékű hidrogén-karbonátot ( HCO3− ) és a hidroxidiont ( OH − ). Karbonát eluens használatakor a fémkelát-komplexek elúciós viselkedésének leírásához figyelembe kell venni a következő, egymástól független egyensúlyi reakciókat [19, 50]: K ML / HCO 3 zR − HCO3 + [ML] ← → R z − ML + zHCO3−
/1.23./
K (z − 1)R − HCO3 + [MHL]( z −1)− ← → R( z −1) − MHL + ( z − 1)HCO3−
/1.24./
z−
MHL / HCO 3
K CO 3 / HCO 3 2 R − HCO3 + CO32− ← → R2 − CO3 + 2 HCO3−
/1.25./
K OH / HCO 3 R − HCO3 + OH − ← → R − OH + HCO3−
/1.26./
ahol az /1.25./ és /1.26./ egyenlet az eluens anionok közötti versengést reprezentálja és
K CO
3
/ HCO3
[MHL]( z −1)−
és K OH / HCO3 az úgynevezett intereluens koefficiens [19]. Az
[ML]z −
és az
ioncsere egyensúlyait a másik két eluens-komponens ( CO32− , OH − ) segítségével
fejeztük ki az /1.23./ - /1.26./ egyenletek lineáris kombinációjával. Az állófázis ioncsere kapacitásának ( Q ), az ioncserélő gyanta térfogatának ( VS ) és az oszlopban lévő mozgó fázis térfogatának ( Vm ) ismeretében kiszámítható a fém-kelát anionok retenciós tényezője:
k ML ahol
p2 + q − p V = s K ML / HCO − 3 Vm 4QK CO 2 − / HCO − CO32− 3 3
[
[
]
[
p = HCO3− + K OH − / HCO − OH − 3
[
q = 8QK CO 2 − / HCO − CO32− 3
3
]
41
]
]
z
/1.27./
/1.28./
/1.29./
Ezekben az egyenletekben a szögletes zárójelek az adott komponens mozgó fázisban lévő moláris koncentrációját jelentik. A protonált kelátionra hasonló retenciós egyenlet vezethető le.
1.12. A fémkomplexek elválasztásának egyéb (HPLC) módszerei
A fémionok meghatározására alkalmas és gyakran használt módszer, hogy először egy megfelelő ligandummal a fémionok komplexét képezik, aztán az így kialakuló koordinációs komponenseket elválasztják konvencionális fordított fázisú vagy normál fázisú HPLC-vel [67, 55]. A kialakuló komplexek gyakran töltés nélküliek és ez lehetővé teszi az elválasztás megvalósítását C18 vagy szilika állófázisokon. Lényeges, hogy a ligandum semleges komplexeket képezzen nagyszámú fémmel viszonylag egyszerű preparációs módszereket használva. Az ionos vagy parciálisan ionizált minták általában csak gyengén tartódnak vissza a konvencionális C18 HPLC állófázisokon [64]. A különböző fémekkel képződött komplexek elválaszthatóságának valószínűsége akkor a legnagyobb, ha a kialakult komplexek koordinatíve telítettek. Ezenkívül a ligandum ne legyen túl nagy, hogy a központi fématom specifikus tulajdonságai megmaradjanak a koordinációs komplexben. A ligandumban a donoratomoknak kicsi legyen a teljes elektronegativitásuk, hogy minimalizálják az adszorpciós hatásokat a szilika bázisú fordított fázisokon. Preferált donoratomok a N, O és S. Nő az elválasztás szelektivitása, ha a ligandum szubsztituenseknek nincs nagy indukciós vagy sztérikus effektusuk, és ha elektronegatív atomok léteznek a kelátgyűrű szoros közelségében. A komplexek legyenek nagy stabilitásúak, jól detektálhatóak és nagy oldhatóságúak nempoláris szerves oldószerekben. Fémkelátok HPLC elválasztásában sok ligandum alkalmazható: ditiokarbamátok, 8-hidroxikinolin, β-diketonok, 4-(2-piridilazo)-naftol, 4-(2piridilazo)-rezorcin, dialkil-ditiofoszfátok, xantátok, 2,3-diaminoftalén, pirazolonok és hidrazonok. A legtöbb esetben vízoldhatatlan kelátok képződnek, így ezeket ki kell vonni egy megfelelő szerves oldószerbe a kromatográfiás elválasztási lépést megelőzően. Az alkilditiokarbamát ligandumok a fémionok nagyon nagy sorozatával képeznek komplexeket és ezért nagyobb számú fémion elválasztására nyújtanak lehetőséget, mint más ligandumok. A kelátképzést rendszerint a minta pufferálásával végzik és aztán extrahálják a ligandum oldatával egy megfelelő szerves oldószerbe. Ez a folyamat automatizálható. Az oldatban lévő ligandumfelesleget egy anioncserélő védőoszloppal távolítják el, ami a C18 analitikai oszlop
42
előtt helyezkedik el. Alternatív módszer a ditiokarbamát komplexek kialakítására a fémionok injektálása egy olyan eluensbe, amely tartalmazza a ligandumot. Ezzel a módszerrel a legfőbb probléma a nagy háttér detektorjel, amelyet a mozgó fázisban jelenlévő ligandumok okoznak. További probléma a sok ditiokarbamát komplex rossz oldhatósága a fordított fázisú HPLCben jellemző mozgó fázisokban, de ez kiküszöbölhető kis mennyiségű kloroform mozgó fázishoz való hozzáadásával, vagy olyan ligandum használatával, ami vízoldható komplexeket képez. Poliaminokarbonsavak elválasztását Fe(III) és Cu(II) komplexeik formájában végezték fordított fázisú HPLC analízissel, valamint ionpár kromatográfiával UV detektálással [53]. Leírták már Mn(II), Co(II), Zn, Pb, Cd, Ni, Gd(III) és Lu(III) komplexek meghatározását is. A DTPA, EDTA és NTA szimultán meghatározását végezte pl. Geschke és Zehringer, Rand és társai és Chinnick [53]. Mozgófázisként nátrium-acetátot, nátrium-kloridot, acetonitrilt, formiát-hangyasav puffert és vizes trikloro-ecetsavat használtak. Tetrabutil-ammónium ionpárképző reagens mozgófázishoz való hozzáadása lehetővé teszi valamennyi kelát egy oszlopon való elválasztását. A kapilláris zónaelektroforézis (CZE) és az ionkromatográfia direkt UV-detektálással alkalmas fém-EDTA komplexek mennyiségi meghatározására [58]. LC-MS-MS módszerrel elválasztottak CuEDTA, PbEDTA és CdEDTA komplexeket. Fe(III)EDTA-t fordított fázisú ionpár-kromatográfiával C18 oszlopon szeparáltak 1-5 mM tetrabutilammónium-hidroxid és 5-40% (v/v) acetonitril mozgófázissal. Krokhin és társai Mn2+, Cd2+, Fe3+, Pb2+, Ni2+, Co2+, Zn2+ és Cu2+ ionokat választottak el EDTA és DCTA kelátképző ligandumokkal
ionkromatográfia
és
elektrokinetikus
kromatográfia
felhasználásával,
szuppresszált vezetőképességi, ill. direkt UV-detektálás alkalmazásával [68]. Shcheglova és Popova az ionkromatográfiás elválasztás során kapott, komplex anionokra vonatkozó retenciós paramétereket a komplex részecskék töltésének és összetételének meghatározására használta [69]. A karbonát eluens koncentrációját és pH-ját változtatva vizsgálták Cu(II), Ni(II), Co(II) és Pb(II) EDTA-val képzett komplexeinek retencióját. Baron és Hering ESI-MS technikával határozott meg fém-EDTA komplexeket [70], amit az tesz lehetővé, hogy a nem komplexálódott EDTA és a fém-EDTA komplexek is változatlanok maradnak az elektroporlasztási folyamat során és szimultán detektálhatók tömegspektrometriával. Dodi és Monnier HPLC-ES-MS technikát használt EDTA komplexek meghatározására [71], Owens és tsai az EDTA-t kapilláris elektroforézissel vizsgálta. Az EDTA humán plazmában és vizeletben való mérésére Sheppard és Henion kapilláris elektroforézis/tömegspektrometria analízist fejlesztett ki. Quintana és Reemtsma az EDTA és a DTPA Fe(III)-komplexeit képezték, majd LC-ESI-MS-MS technikával meghatározták őket [59].
43
1.13. Célkitűzés
Munkánk céljának meghatározásakor fontosnak tartottuk az ivóvíz fertőtlenítésekor keletkező halogenizált ionos melléktermékek kimutatására alkalmas módszer kidolgozását, amellyel rövid analízisidővel, nagy szelektivitással elvégezhető a haloecetsavak és a vízben jelenlévő egyéb anionok minőségi és mennyiségi elemzése. Ezen kívül módszert kívántunk kifejleszteni a fémkomplexek és ligandumaik azonosítására komplex-kémiai és ioncsere kémiai megfontolások alapján. Toxikus tulajdonságaik miatt lényeges, hogy jó analitikai technikát fejlesszünk ki nemcsak a fémkomplexek, hanem a lehetséges ligandumaik azonosítására is. A folyadék fázisú analitikai elválasztások tervezése komplikált feladat, mivel egyidejűleg több tényezőt; az eluens összetételét, a pH-t, az elválasztó oszlop kémiai szerkezetét, fizikai-kémiai tulajdonságainak hatásait, továbbá a detektálhatóság paramétereit kell figyelembe vennünk. Ezek tervszerű összehangolása, és a retenciót kedvezően alakító elválasztási mechanizmusok megismerése nyomán érhető el az optimális eredmény.
44
2. Kísérleti rész 2.1. Felhasznált eszközök, anyagok 2.1.1. Haloecetsavak elválasztása kriptand bázisú oszlopon A
vizsgálatok
során
Dionex
2010i
(Dionex
Co.
Sunnyvale,
USA)
típusú
ionkromatográfiás rendszert alkalmaztunk, amely tartalmazott egy IonPac Cryptand A1 5 µm analitikai oszlopot (150 mm × 3 mm) (Dionex), egy Dionex EDM eluens gázmentesítő modult, egy AGP gradiens pumpát, egy Dionex AMMS-1 kation mikromembrán szuppresszort és egy vezetőképességi detektort. A kromatogramokat digitálisan rögzítettük Dionex ACI számítógépes interface és Dionex AI 450 software használatával. Model 9125 injektáló egységet (Rheodyne, Rohnert Park, CA, USA) alkalmaztunk, amely 10 µl injektáló hurkot tartalmaz. Az eluens vezetésének elnyomására szolgáló szuppresszort folyamatosan regeneráltunk 3,5 ml/min áramlási sebességű 0,025 M kénsavoldattal. Az adatfeldolgozást PeakNet 6.0 és Excel XP Version (Microsoft Corp.) szoftverek felhasználásával végeztük. Az IonPac Cryptand A1 analitikai oszlop 2.2.2. kriptand molekulákat tartalmazott. Az eluens áramlási sebessége 0,5 ml/min volt az elválasztások során. Az eluensben lévő karbonát eltávolításához egy IonPac ATC-2 (Dionex) 2mm csapda kolonnát helyeztünk in-line a pumpa és az injektor közé, amelyet naponta mostunk 1 ml/min áramlási sebességű 50 ml 2 M NaOH-, majd 10 mM NaOH oldattal, és a kromatográfiás rendszerhez való csatlakoztatás után az eluenssel kondicionáltuk, miközben az elválasztó oszlopot még nem csatlakoztattuk. Amennyiben szükségessé vált az oszlop tisztítása, 100 mM NaOH oldatot áramoltattunk át rajta 20 percen keresztül. A minta- és az eluensoldatokat analitikai tisztaságú anyagokból készítettük Milli-Q víztisztító rendszerrel (Millipore, Bedford, MA, USA) kezelt vizet használva, melynek vezetőképessége 18,2 MΩcm-1 25 °C-on. Ezáltal az oldatokban a minta-, ill. az eluensionon kívül nem voltak jelen más ionok, amelyek módosíthatták volna a mérési eredményeket. A NaOH, LiOH és KOH eluenseket naponta készítettük az adott bázisból (Merck, Darmstadt, Németország). A mintaoldatokat (MCA, MBA, DCA, DBA, TCA, TBA, MBDCA, MCDBA, BCA) 1000 mg/l törzsoldatokból higítottuk. Mindegyik haloecetsav a Sigma-Aldrich (Chicago, IL, USA)-tól származott, kivéve a BCA (Fluka, Svájc), a MCDBA és a MBDCA
45
(Supelco, Bellefonte, PA, USA). A szervetlen standard törzsoldatokat (1000 mg/l) nátrium sóik (Merck, Darmstadt, Németország) higításával készítettük. Az elválasztás érzékenységének növelése érdekében 25-szörös előzetes dúsítást végeztünk fordított fázisú szubsztráton. Ehhez 125 ml mintát használtunk, amely 5 µgl-1 MCA-, 4 µgl-1 MBA-, 15 µgl-1 DCA-, 25 µgl-1 BCA-, 15 µgl-1 DBA-, 25 µgl-1 TCA-, 35 µgl-1 MBDCA-, 40 µgl-1 MCDBA-, 105 µgl-1 TBA- és 11,25 ml kénsavoldatot tartalmazott és pH-értéke 0,3 volt. Betöltöttük 2 ml/min áramlási sebességgel a LiChrolut EN (Merck) extrakciós patronba, amelyet előzőleg 3 ml CH3OH- és 3 ml 200 mM H2SO4 oldatokkal aktiváltunk, majd átöblítettük 1 ml H2O-val. A mintaoldatot 5 ml eluenssel (10 mM NaOH) eluáltuk, amelyhez 195 µl 2571 mgl-1 Mg2+ (MgCl2) oldatot adtunk, hogy elérjük a 100 mgl-1 Mg2+ végső koncentrációt, amely az ezt követő tisztítási lépéshez szükséges. Az eluátumot átáramoltattuk két OnGuard-Ba, egy OnGuard-Ag és egy OnGuard-H patronsorozaton (Dionex, a gyártó ajánlása szerint aktiválva). A bárium-tartalmú patron a szulfátionokat kötötte meg, az ezüsttartalmú a kloridionokat, majd az utolsó az oldat pH-értékét növelte. 3 ml átbocsátása után az eluátumot (2 ml) szűrtük (0,45 µm) és injektáltuk a kromatográfiás rendszerbe. Ezzel párhuzamosan üres mintával is elvégeztük ezt a folyamatot.
2.1.2. Átmenetifém kelátok elválasztása pellikuláris töltetű oszlopon Az átmenetifémek poliaminokarbonsavakkal képzett komplexeinek elválasztásai Dionex DX-300 ionkromatográffal (Sunnyvale, CA, USA) készültek, amely tartalmazott egy AS9-HC (Dionex Co. Sunnyvale, USA) nagykapacitású anioncserélő elválasztó oszlopot (250 mm × 4mm i.d.), egy Dionex AMMS-I kation mikromembrán szuppresszort, és egy vezetőképességi detektort. Az injektálási hurok térfogata 50 µl volt. A szuppresszort folyamatosan regeneráltuk 0,025 M kénsavval (Fluka, Svájc), 3,5 ml/min áramlási sebességgel. Az adatfeldolgozást Excel XP version (Microsoft Corp.) segítségével végeztük. Az eluenseket naponta készítettük Na 2 CO3 és NaHCO3 (mindkettő Fluka, Svájc) felhasználásával Milli-Q víztisztító berendezéssel (Millipore, Bedford, MA, USA) kezelt vízzel. A fémek törzsoldatait kloridsóikból készítettük (Reanal, Magyarország), a poliaminokarbonsavak törzsoldatait nátriumsókból (Fluka, Svájc). Az AS9-HC analitikai oszlop polimer bázisú anioncserélő oszlop, amelyben 20% térhálósított poliakrilátot tartalmazó MicroBead rétegen találhatók az ioncserélő helyek. Az oszlophoz használható ajánlott eluens pH-tartomány 0 és 14 közötti. Az oszlop kapacitása:
46
190 µeq / oszlop (Q = 0.253 mequiv/ml), Vs = 0.75 ml, Vm = 2.39 ml. Az AS9-HC oszlop közepes hidrofobicitású, szemcseátmérője 9,0 µm, a tölteten alkil/alkanol kvaterner ammónium funkciós csoportok találhatók. Az induktív csatolású plazma atomemissziós módszer (ICP-AES) során a folyadék halmazállapotú mintát áramló argonplazmába juttatjuk pneumatikus porlasztással. A plazmában a minta atomjaira disszociál, az atomok gerjesztődnek (ionizálódnak, az ionok is gerjesztődnek), majd alapállapotba visszatérve az atom a rá jellemző vonalas színképet kisugározza. A kisugárzott összetett fényt felbontva a meghatározott hullámhosszúságú fény (elemzővonal) intenzitását mérve következtetünk az elem koncentrációjára. A Zn elemzővonalának hullámhossza λ = 206.200 nm, a Cu elemzővonalának hullámhossza λ = 327.393 nm. Az analitikai mérőgörbék elkészítéséhez az elemek ismert koncentrációjú oldatait használjuk, melyeket 1000 mg/l-es hiteles törzsoldatokból higítottunk. Az ICP-AES készülék típusa: Perkin Elmer Optima 2000 DV (USA). Az infravörös színképek felvétele ATR (Attenuated Total Reflection = csillapított totálreflexió) reflexiós módszerrel történt, MCT (Higany-kádmium-tellur) detektorral ellátott Varian Scimitar 2000 Fourier Transzformációs infravörös (FTIR) spektrométer segítségével. A vizsgált hullámszám tartomány 4000-550 cm-1. Az ATR feltét (kereskedelmi neve: SPECAC “Golden Gate”) optikai eleme egy 2x2 mm-es gyémánt ATR kristály (aktív felülete 0,6 x 0,6 mm). Az oldatokat az ATR kristályra rácseppentve az oldószer (víz) elpárologtatása után közvetlenül mértük. Minden mérés 4 cm-1 hullámszám felbontással és 256 mérés átlagolásával történt. A spektrumokban a 2300-2000 cm-1 közötti hullámszám tartomány nem értékelhető a gyémánt ATR optikai elem elnyelése miatt. Általában ebben a hullámszám tartományban nincsenek szignifikáns sávok – kivételt képeznek a tiol-, tiazid-, nitril- és azidcsoportok -, így ez a kiértékelést általában nem befolyásolja. A kiértékelés előtt ATR sávintenzitás-korrekciót alkalmaztunk, így a színképek összevethetőek transzmissziós technikával készült felvételekkel.
2.2. A haloecetsavak elválasztása
Kilenc, egymással rokon szerkezetű haloecetsavat vizsgáltunk, amelyek klórt vagy brómot, vagy mindkettőt tartalmaznak: monoklór-ecetsav (MCA), monobróm-ecetsav (MBA), diklórecetsav (DCA), bróm-klór-ecetsav (BCA), dibrómecetsav (DBA), triklór-
47
ecetsav (TCA), monoklór-dibróm-ecetsav (MCDBA), monobróm-diklór-ecetsav (MBDCA) és tribrómecetsav (TBA). A különböző eluens kationok (K+, Na+, Li+) oszlopkapacitásra való hatásának tanulmányozása lehetővé tette a kapacitás gradiens elúció optimalizálását, amely során elválasztottuk a kilenc HAA-t azoktól a szervetlen anionoktól, amelyek az ivóvízben előfordulhatnak ( F − , Cl − , NO3− , Br − , SO42 − , PO43− ) [38]. A módszert ivóvízen teszteltük előzetes dúsítás után. Ismereteink szerint ez az első eset az irodalomban a HAA-k makrociklus által szabályozott nagy hatékonyságú anioncsere elválasztására. A kilenc haloecetsav elválasztásának optimalizálását egyszerű szervetlen anionok jelenlétében ( F − , Cl − , NO3− , NO2− , Br − , SO42 − , PO43− ) a különböző eluensek (KOH, NaOH, LiOH) elválasztásra való hatásának elméleti és kísérleti tanulmányozásával értük el. A mechanizmus megértéséhez és a szelektivitás szabályozásának mikéntjéhez kezdetben mindegyik eluenst izokratikus körülmények között tanulmányoztuk.
2.2.1. A haloecetsavak izokratikus elválasztása A kriptand oszlopban, amikor a kationok megkötődnek a makrociklusok üregeiben, kavitásaiban vagy a makrociklusok protonálódnak, pozitív töltésű funkciós csoportok jönnek létre, amelyek aztán helyet biztosítanak az anioncserének (2.1. ábra).
2.1. ábra. A kriptand oszlopban lejátszódó egyensúlyi reakciók A mintaanionok elválaszthatók ezeken a helyeken alkálifém-hidroxid eluensek használatával az anioncsere mechanizmusa szerint: KH KM CryH + ←→ Cry ← → CryM +
/2.1./
ahol KH a protonálódási állandó és KM az alkáli-kriptát komplex (CryM+) stabilitási állandója. Lényeges ismernünk az alkáli komplexált és a protonált kriptandok megoszlását az eluens koncentrációjának függvényében, hogy megértsük az oszlop elválasztó kapacitását. Az 48
állófázison lévő kriptand molekulák versengő protonált és komplexált formáinak móltörtjei (Φ) kiszámolhatók a komplex stabilitási és a protonálódási állandók (KH, KM) ismeretében [75]: Φ Cry =
1 1 + K H H + K M M +
/2.2./
Φ CryM
K M M + = 1 + K H H + + K M M +
/2.3./
Φ CryH
K H H + = 1 + K H H + + K M M +
/2.4./
+
ahol [H+] és [M+] a hidrogén- és az alkálifém-ionok moláris koncentrációi, KH és KM a retenciós adatbázis alapján iterációs úton határozható meg [75]. Ahogy a 2.2. ábrán látható, az eluens koncentrációjának változtatásával a kriptand oszlop moláris összetétele egyszerűen módosítható 10-4 és 10-1 M között. Amennyiben az eluens koncentrációja nagyon alacsony (CMOH ≤ 10-5 M), az állófázis összetétele mindhárom alkálifém-hidroxid eluens (LiOH, NaOH, KOH) esetén hasonló, ezáltal a kapacitás is hasonló az izokratikus elválasztások során.
49
2.2. ábra. Az állófázison lévő kriptand molekulák protonált és komplexált frakciói (a) a LiOH koncentráció; (b) a NaOH koncentráció; és (c) a KOH koncentráció függvényében (számított értékek, ld. [75])
50
Az oszlop ioncsere kapacitásának változása az alkáli-hidroxid eluens koncentrációjának gyakorlatban alkalmazott tartományában látható a 2.3. ábrán. Az ioncsere kapacitást a kriptand molekulák komplexált és protonált frakciójának összegeként számoltuk, és megszoroztuk az állófázishoz kémiailag köthető kriptand molekulák számával, ami 0,073 mequiv/oszlop [76].
2.3. ábra. Az oszlop ioncsere-kapacitása (µequiv.) (a ΦCry, ΦCryM, ΦCryH összegeként számolva, szorozva 0,073 mequiv-sel) az eluens típusának és koncentrációjának függvényében Látható, hogy az oszlop kapacitása LiOH eluens használatakor nagyon alacsony. 10 mM LiOH használatakor a teljes oszlop ioncsere-kapacitása nem több, mint 1,5 µequiv. A 2.2. ábrán látható, hogy gyengén lúgos pH esetén a kriptand molekulák nagy része protonált formában van jelen, azonban a pH növekedésekor a protonált komplexek mennyisége csökken, majd a Li+ ionokkal képez komplexet a kriptand. A pozitív töltéssel rendelkező kriptand móltörtjének minimuma 10-2 M LiOH koncentrációnál van, ezért itt van az oszlop kapacitásának is minimális értéke. KOH eluens esetén ennek az ellenkezője látható, az állófázis kapacitása közelít a maximális értékéhez (73 µequiv) az eluens koncentráció teljes tartományában. NaOH eluens alkalmazásakor az oszlop kapacitása szignifikánsan nő az eluens koncentrációjának növekedésével. Az ábrából az következik, hogy egy adott haloecetsav retenciója jelentősen eltér a három eluens használatakor. A mintaanionok nátrium- és kálium-kriptát funkciós csoportokhoz való affinitása jelentősen különbözik. A kálium-kriptát erős anioncserélőként viselkedik, míg a nátrium-kriptát komplexek gyenge vagy mérsékelt ioncserélőknek tekinthetők. Ez a két hatás (kavitás és affinitás különbözősége)
51
együtt eredményezi az adott anion retenciós idejének lényeges különbségét a különböző típusú eluensek használatakor. Izokratikus elválasztással megvizsgáltuk, hogy az eluens fajtája és koncentrációja hogyan befolyásolja a haloecetsavak retencióját. Tanulmányoztuk, hogy izokratikus módon lehetséges-e a haloecetsavak és az ivóvizekben előforduló szervetlen ionok szimultán elválasztása. A munkát NaOH eluens alkalmazásával kezdtük, a koncentrációja 2,5; 5; 7,5; 10; 20; 75 és 100 mM volt. Az elválasztások eredményeit a 2.1. táblázat, valamint a 2.4. - 2.9. ábrák foglalják össze. 2.1. táblázat: Haloecetsavak retenciós adatai (NaOH eluens) Retenciós idő [min] Minta acetát MCA MBA DCA BCA DBA TCA MCDBA TBA klorid bromid nitrát szulfát
2.5 n.a. 2,83 3,07 4,78 5,52 6,82 20,35 n.a. >120 2,50 3,04 3,50 5,19
5 n.a. 2,89 3,14 5,52 6,26 8,17 25,11 46,23 >120 n.a. n.a. n.a. n.a.
NaOH koncentráció [mM] 7.5 10 20 50 2,52 n.a. 2,20 2,22 3,02 2,91 2,80 2,43 3,29 3,27 3,11 2,71 5,90 5,90 6,00 5,04 6,91 7,07 7,07 6,18 9,05 9,09 9,61 8,00 29,57 31,47 35,21 31,09 55,01 n.a. 64,03 55,08 >120 >120 >120 >120 2,68 n.a. 2,47 2,23 3,53 n.a. 3,35 2,96 4,07 n.a. 4,01 3,50 5,06 n.a. 3,35 2,23
75 100 1,89 1,82 2,32 2,20 2,58 2,43 4,73 4,43 5,80 5,32 7,49 7,01 29,70 27,33 51,20 49,29 >120 >120 2,08 2,00 2,80 2,62 3,30 3,07 2,08 2,00
70 acetát
Retenciós idő [min]
60
MCA
50
MBA 40
DCA
30
BCA
20
DBA
10
TCA MCDBA
0 0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
NaOH koncentráció [mM]
2.4. ábra. A NaOH eluens koncentrációjának hatása a haloecetsavak retenciós idejére
52
2.5. ábra. Haloecetsavak izokratikus elválasztása. Elválasztó oszlop: Cryptand A1, eluens: 5,0 mM NaOH. Az elválasztott HAA-k a csúcsok sorrendjében: MBA (tR=3,14min), BCA (tR= 6,26min), TCA (tR=25,11min) és TBA (tR>120min).
2.6. ábra. Haloecetsavak izokratikus elválasztása. Elválasztó oszlop: Cryptand A1, eluens: 20,0 mM NaOH. Az elválasztott HAA-k a csúcsok sorrendjében: (1): MBA (tR=3,11min), (2): BCA (tR= 7,07min), (3): TCA (tR=35,21min) és TBA (tR>120min).
53
2.7. ábra. Haloecetsavak izokratikus elválasztása. Elválasztó oszlop: Cryptand A1, eluens: 5,0 mM NaOH. Az elválasztott HAA-k a csúcsok sorrendjében: (1): MCA (tR=2,88min), (2): DCA (tR= 5,52min), (3): DBA (tR=8,17min) és (4): MCDBA (tR=46,23min).
2.8. ábra. Haloecetsavak izokratikus elválasztása. Elválasztó oszlop: Cryptand A1, eluens: 7,5 mM NaOH. Az elválasztott HAA-k a csúcsok sorrendjében: MCA (tR=3,02min), DCA (tR= 5,90min), DBA (tR=9,05min) és MCDBA (tR=55,01min).
54
6,00
retenciós idő [min]
5,00 4,00
klorid bromid
3,00
nitrát szulfát
2,00 1,00 0,00 0
20
40
60
80
100
NaOH koncentráció [mM]
2.9. ábra. A NaOH eluens koncentrációjának hatása a szervetlen anionok retenciós idejére Az adatokból jól látható, hogy a haloecetsavak retenciós ideje között szignifikáns eltérések vannak, jó felbontással elválaszthatók egymástól. A kromatogramokból és a retenciós
adatokból
ugyanakkor
az
is
látható,
hogy
az
izokratikus
elválasztás
teljesítőképessége limitált. A rendszer szelektivitásának teljes hasznosítása nem nélkülözheti a gradiens kapacitás előnyeinek kihasználását, hiszen ez a makrociklikus elválasztás speciálisan előnyös tulajdonsága (ld. 2.2. és 2.3. ábrák, ill. a 2.2.2. fejezet). A TBA NaOH eluenssel nem választható el 120 min-en belül. A vizsgált szervetlen anionok retenciós idejének változása a NaOH eluens koncentrációjával a haloecetsavakéhoz hasonló. A szulfát kétértékű anion, ezért az eluens koncentrációjának növekedésével meredekebben csökken a retenciós ideje. A haloecetsavak szervetlen ionokkal történő szimultán elválasztása is lehetséges. Egy ion-pár kivétel van, a MBA és a Br- retenciós ideje között nincs lényeges különbség. Megvizsgáltuk, hogy a LiOH eluens különböző koncentrációinak hatása a retenciós időkre mennyiben különbözik a NaOH eluensétől. A LiOH eluenst 2,5; 5; 7,5; 10 és 20 mM koncentrációban alkalmaztuk. Az elúciók eredményeit a 2.2. táblázat, valamint a 2.10. és 2.11. ábra mutatja be.
55
2.2. táblázat: Haloecetsavak retenciós adatai (LiOH eluens) Retenciós idő [min] Minta acetát MCA MBA DCA BCA DBA TCA MCDBA TBA klorid bromid nitrát szulfát
2,5 1,38 1,37 1,38 1,42 1,43 1,45 1,70 2,02 2,29 1,39 1,39 1,39 1,39
LiOH koncentráció [mM] 5 7,5 10 1,42 1,43 1,45 1,41 1,43 1,45 1,42 1,43 1,46 1,45 1,48 1,51 1,47 1,51 1,53 1,50 1,53 1,57 1,78 1,85 1,88 2,12 2,15 2,20 2,39 2,37 2,72 1,42 1,43 1,45 1,42 1,43 1,45 1,42 1,43 1,45 1,42 1,43 1,45
20 1,48 1,5 1,52 1,57 1,60 1,65 2,33 2,99 3,66 1,50 1,50 1,50 1,50
retenciós idő [min]
4 3,5
acetát
3
MCA MBA
2,5
DCA
2
BCA DBA
1,5
T CA 1
MCDBA T BA
0,5 0 0
5
10
15
20
LiOH koncentráció [mM]
2.10. ábra. A LiOH eluens koncentrációjának hatása a haloecetsavak retenciós idejére Az elválasztások eredményeiből egyértelműen látszik, hogy LiOH eluens alkalmazásával lényegesen rövidebbek a retenciós idők az ugyanolyan koncentrációban alkalmazott NaOH eluensnél tapasztalthoz képest, a TBA is elválasztható az alkalmazott LiOH koncentrációkkal 5 percen belül (2.11. ábra). Ennek az az oka, hogy a lítium sokkal kevésbé kötődik az állófázishoz, mint a nátrium, ezáltal kisebb lesz az oszlop anioncserélő kapacitása, de az eluens hajtóereje nem változik. Azonban ezáltal minimálisra csökken
56
a haloacetátok
retenciós ideje közti különbség, ami nem teszi lehetővé a nyolc haloecetsav szimultán elválasztását.
2.11. ábra. TBA izokratikus elválasztása, Elválasztó oszlop: Cryptand A1, eluens: 5,0 mM LiOH, tR=2,72min. Mind a NaOH, mind a LiOH eluens esetében elmondható, hogy a növekvő eluenskoncentrációval nőnek a retenciós idők, de az NaOH esetében csak egy bizonyos eluenskoncentrációig, utána csökkennek. Ennek a jelenségnek az az oka, hogy az eluens koncentrációjának növekedésével a hajtóereje exponenciálisan csökken, míg az oszlop kapacitása Langmuir-görbe szerint nő. Az eluens koncentrációjának növelésével először a kapacitás növekedése a domináns, majd egy adott koncentrációtól az eluens hajtóerejének növekedése válik meghatározóvá. A retenciós adatokból az is jól látható, hogy annak ellenére, hogy valamennyi haloacetát egyértékű anion, lényeges különbség van a legkisebb és a legnagyobb retenciós idő között (pl. 100 mM NaOH eluens: MCA: 2,20 min, ill. TBA >120 min). A túl hosszú retenciós idő nem szerencsés a csúcsok torzulása miatt. A TBA nem is határozható meg izokratikusan 2 órán belül, ezért célszerű a haloecetsavak elválasztására kapacitás-gradiens elúciót alkalmazni. Az izokratikus elúciók kromatográfiás eredményeit foglalja össze a 2.3. táblázat LiOH, NaOH és KOH használatakor.
57
2.3. táblázat: KOH, NaOH és LiOH eluensekkel történő izokratikus elúciók során kapott főbb kromatográfiás eredmények
Komplexképződési állandóa Relatív oszlopkapacitás az eluens feltételek mellett Fő kromatográfiás eredmények
KOH (2,5–10mM) K K + = 23,860
Eluens NaOH (2,5–100mM) K Na + = 755
LiOH (2,5–20 mM) K Li + = 1
Magas
Közepes
Alacsony
F − , NO2− , Br − , NO3− , MCA és MBA elúciója
Az összes szervetlen anion és HAA elúciója (kivéve TBA) 10 mM NaOH-dal 100 min alattb Felbontás: MCA / NO2− = 0,1;
A szervetlen anionok és mindegyik HAA eluálhatób
Koelúció: MCA / NO2− és MBA / Br − 2,5 mM KOHdal Felbontás javítása [KOH] > 2,5 mM
Rossz szelektivitás
MBA / Br − = 0,4; DCA / SO42− = 0,42; DBA / PO43− = 0,06 Nem javult a felbontás különböző [NaOH]-nál 100 mM NaOH esetén 70 min elúciós időnél a TBA nem eluálódik; nagy a háttérzaj
a
az adatok a [75] irodalomból származnak
b
A megfigyelt retenciós sorrend hasonló a következő oszlopoknál megfigyeltekhez: IonPac
AS11 és AS10 [38], AS11-HC és AS16 [77] és IonPac AS9 [38] (pellikuláris anioncserélők) A táblázatban összefoglalt eredmények alapján azt mondhatjuk, hogy a HAA-k retenciója a KOH-tól a LiOH-ig sorrendben csökkent, a kriptand oszlop kapacitásának és a minták alkáli-kriptát funkciós csoportokhoz való affinitásának megfelelően. KOH eluenssel túl nagy retenciós időket kaptunk (csak két HAA eluálódott), míg LiOH eluenssel nagyon alacsony volt a kapacitás (minden HAA eluálódott, de rossz szelektivitással). Az izokratikus elúciókkal nem kaptunk kielégítően értékelhető elválasztást, de az eredmények azt mutatták, hogy az
58
eluens típusának és koncentrációjának szisztematikus változtatása fontos paraméterek lehetnek a HAA-k meghatározásában lépcső gradiens program használatakor.
2.2.2. A haloecetsavak optimalizált gradiens elúciója A makrociklus alapú oszlopok legnagyobb előnye a kapacitás gradiens kialakításának lehetősége az elúció során. Az eluens kationját változtattuk az elválasztás során a makrociklushoz való nagy affinitásútól a kis affinitású felé. Mivel a lépcső gradiens felbontása hasonló a lineáris gradienséhez, de csökkenti a kriptand bázisú oszlopok elválasztási idejét, egy lépcső gradiens módszert optimalizáltunk a nyolc HAA elválasztására hét egyszerű szervetlen anion jelenlétében. Több paramétert optimalizáltunk: a gradiens lépcsők számát és idejét, az eluensek típusát és koncentrációját, valamint az oszlopban az egyensúly beállásához szükséges időt. Az előzetes kísérletekben azt tapasztaltuk, hogy az MCA / NO2− és az MBA / Br − közti elválasztás kritikus, azonban meg kell jegyezni, hogy a vízminták analízisében az MCA és a NO2− közti részleges koelúció nem jelent valódi gyakorlati problémát. A nitrit anion, amely nagyon ritkán van jelen az ivóvízben, nitráttá alakul természetes körülmények között is. Az optimalizálás célja az volt, hogy a nyolc HAA és az interferáló anionok elválaszthatók legyenek legfeljebb harminc perces elúciós idővel, és hogy a koeluálódó ionok között (kivéve az MCA / NO2− ) legalább RS ~ 0,8-1 felbontást érjünk el. Ez a felbontás azt jelenti, hogy az egymást követő közel azonos magasságú Gauss-csúcsok átlapoló részeinek magassága megközelítőleg a csúcsmagasságok 50 %-ával egyenlő [78]. Az optimalizálás célja ennek a minimális felbontásnak az elérése volt. A TCA, MCDBA és TBA hidrofób anionok, nagyon erős az affinitásuk az elválasztó oszlop állófázisához. Ahhoz, hogy ezek a komponensek gyors elúcióban vegyenek részt, szerves módosítókat [38] vagy gradiens elúciót [39] kell használni. Ezekben az esetekben csökken a mennyiségi meghatározás pontossága a szerves módosítók használata miatt, vagy mivel a koncentráció gradiens alapvonal-torzulást okoz. Munkánk során kifejlesztettünk egy módszert a haloecetsavak nagyteljesítményű meghatározására rövid retencióval, a mennyiségi meghatározás zavara nélkül makrociklust tartalmazó állófázist használva. Az izokratikus elválasztás eredményei alapján 10 mM eluens koncentrációt választottunk a gradiens módszer optimalizálásához. A K-kriptand komplex komplexképződési állandója a legnagyobb, ennél kisebb a Na-kriptand komplexé és a Li-komplexé a legkisebb. Ennek megfelelően KOH eluens alkalmazásakor a legnagyobb az oszlop kapacitása és LiOH esetén a legkisebb. Az eluensváltások során az OH--koncentráció állandó marad, így az alapvonal nem
59
torzul. A kisebb kapacitás azt eredményezi, hogy az erősen visszatartott ionok retenciós ideje csökken és megfelelő ezen komponensek felbontása. A 2.12. ábra a gradiens elúciók eredményeit mutatja be. Látható az utolsóként eluálódó csúcs retenciós ideje és azoknak a csúcsoknak a felbontása, amelyek mindegyik gradiens program alkalmazásakor koeluálódnak.
2.12. ábra. A haloecetsavak elválasztásának optimalizálására használt gradiens programok. A gradiens lépcsők idejét körrel jelöltük. Az eluens koncentrációja minden esetben 10 mM, kivéve a G05 (0,5 mM KOH, 9,5 mM NaOH, 10 mM LiOH), G06 (0,25 mM KOH, 9,75 mM NaOH, 10 mM LiOH) és G07 (0,1 mM KOH, 9,9 mM NaOH, 10 mM LiOH). A koeluálódó ionok közti felbontást és az utolsóként eluálódó komponens (TBA) retenciós idejét is megadtuk. a: felbontás > 1,5. Látható, hogy ha az oszlopot 10 mM KOH oldattal hoztuk egyensúlyba (G01-G04), az analízis idők 70 percnél hosszabbak a gradiens program további részétől függetlenül, mivel az oszlop teljes kapacitása túl nagy. Amennyiben az oszlopot KOH és NaOH tartalmú eluenssel hoztuk egyensúlyba (G05-G07), az analízis ideje jelentősen csökkent, azonban a MBA / Br − és a DCA / SO42− felbontása elfogadhatatlanul kicsi volt. Az itt bemutatott eredmények alapján két gradiens programmal: G09 és G10 értük el az előzetesen kitűzött célt. Noha a G09 gradiens program analízisideje két perccel rövidebb, mint a G10-é, az utóbbi esetben jobb a
60
gyengén visszatartott komponensek felbontása. A különbség oka, hogy a G10 gradiens program esetén a NaOH eluensről LiOH eluensre történő váltás 1 perccel később következik be, ami 1 perccel hosszabb időt eredményez az oszlop nagyobb kapacitású állapotában. A HAA-k és az interferáló szervetlen anionok elválasztására optimális módszerként azt találtuk, ha 8 percig hozzuk egyensúlyba az elválasztó oszlopot 10 mM NaOH eluenssel, majd 3 perc elteltével 10 mM LiOH eluensre váltunk. A 2.4. táblázatban bemutatjuk az izokratikus és a gradiens (G10 program) elválasztások során kapott retenciós időket, ill. a NaOH eluenssel végzett izokratikus elválasztások és a gradiens elválasztás időszükséglete közti különbséget. A 2.13. - 2.16. ábrákon az optimális elúciós feltételek mellett kapott kromatogramok láthatók, amelyek tartalmazzák az általunk vizsgált valamennyi haloecetsavat és szervetlen aniont. 2.4. táblázat: Haloecetsavak retenciós idejének összehasonlítása izokratikus és kapacitás gradiens elválasztás esetén Retenciós idő [min] Izokratikus elv. Izokratikus elv. Haloecetsav
20 mM NaOH eluens
20 mM LiOH eluens
Kapacitás ∆ gradiens [tR(NaOH) – elválasztás tR(gradiens)] (G10 program) 2,70 0,1
MCA
2,80
1,50
MBA
3,11
1,52
3,03
0,08
DCA
6,00
1,57
5,42
0,58
BCA
7,07
1,60
6,28
0,79
DBA
9,61
1,65
7,07
2,54
TCA
35,21
2,33
12,20
23,01
MCDBA
64,03
2,99
15,07
48,96
TBA
>120
3,66
18,05
>102
61
2.13. ábra. Haloecetsavak gradiens elválasztása, eluens: 7,5 mM NaOH / 7,5 mM LiOH, eluensváltás: 0,1 min, minták a csúcsok sorrendjében: MCA (tR=2,92min), MBA (tR=3,25min),
DCA
(tR=5,55min),
BCA
(tR=6,28min),
DBA
(tR=7,20min),
TCA
(tR=11,68min), MCDBA (tR=14,77min) és TBA (tR=17,08min)
2.14. ábra. Haloecetsavak gradiens elválasztásának kromatogramja. Eluens: 20 mM NaOH / 20 mM LiOH. Az eluensváltás 0,1 percnél történt. MCA (tR=2,70min), DCA (tR=5,42min), DBA (tR=7,07min) és MCDBA (tR=15,07min).
62
2.15. ábra. Haloecetsavak gradiens elválasztása. Eluens: 20 mM NaOH / 20 mM LiOH. Az eluensváltás 0,1 percnél történt. MBA (tR=3,03min), BCA (tR=6,15min), TCA (tR=11,82min), és TBA (tR=17,63min)
2.16. ábra. Haloecetsavak és szervetlen anionok elválasztása. Kísérleti körülmények: oszlop: Cryptand A1 5µm (150mm×3 mm); eluens gradiens, G08: −8-tól 3 min-ig 10mM NaOH; t = 3 min 10mM LiOH. Detektálás: szuppresszált vezetőképességi ASRS-sel (áram: 50 mA). Injektálási térfogat: 25µl; Koncentrációk: F− (0.4 mg l−1); Cl− (0.6 mg l−1); MCA (5 mg l−1); NO2− (1 mg l−1); MBA (5mgl−1); Br− (1 mg l−1); NO3− (2 mg l−1); SO42− (1 mg l−1); DCA (7.5 mg l−1); BCA (7.5 mg l−1); DBA (7.5 mg l−1); PO43− (5 mg l−1); TCA (25 mg l−1); MBDCA (25 mg l−1); MCDBA (25 mg l−1); TBA (75 mg l−1).
63
A kifejlesztett módszer főbb előnyei az irodalomban található eddigi módszerekhez képest: •
Rövidebb az analízisidő.
•
A TBA is eluálódik és analízise megoldható.
•
Hagyományos szuppresszált vezetőképességi detektor használható, ami jóval kisebb költséget és műszerezettséget jelent, mint az ESI-MS vagy az ICP-MS alkalmazása.
•
A szervetlen interferenciák a gradiens összetétel optimalizálásával korlátozhatók, nem MS berendezéssel.
•
Kis eluens koncentrációk szükségesek az analízishez.
•
Alapvonal torzulástól mentes az eljárás, tekintve, hogy a gradiens során az eluens OH − -koncentrációja konstans, az alkáli ionok komplexálódnak. Gradiens hatás csak
az állófázis által alakul ki. A kifejlesztett módszerrel elvégeztük egy csapvíz minta analízisét előzetes dúsítás után. Az ekkor kapott kromatogramm látható a 2.17. ábrán.
2.17. ábra. Csapvízben lévő haloecetsavak előzetes dúsítása és elválasztása. Kísérleti körülmények: oszlop: Cryptand A1 5µm (150mm×3 mm); eluens gradiens, G10: −8-tól 3 min-ig 10mM NaOH; t = 3 min 10mM LiOH. Detektálás: szuppresszált vezetőképességi ASRS-sel (áram: 13 mA). (a): Csapvíz; (b): csapvíz hozzáadott HAA-kal: 5µgl−1 MCA, 4µgl−1MBA, 15µgl−1 DCA, 25µgl−1 BCA, 15µgl−1 DBA, 25µgl−1 TCA, 35µgl−1 MBDCA, 40µgl−1 MCDBA, 105µgl−1 TBA.
64
2.2.3 Analitikai jellemzők Az optimális elúciós körülmények alkalmazásakor (G10 gradiens program) értékeltük a módszer linearitását, a kapott értékeket a 2.5. táblázatban foglaltuk össze. Mindegyik injektált minta koncentrációja megegyezett az adott mintaion detektálási határával. A legkisebb koncentrációjú oldatban kapott csúcsterületre számított RSD% (n=3) 3% (TCA) és 11% (TBA) között volt. Az injektált térfogatot 200 µl-re növelve csökkent a detektálási határ, de romlott a felbontás. 2.5. táblázat: A haloecetsavak linearitási adatai Minták
Lineáris tartomány
R2
RSDa (%)
[mgl-1] MCA
0,010-0,25
0,9997
4,8
MBA
0,008-0,4
0,9996
4,2
DCA
0,032-0,4
0,9993
5,1
BCA
0,048-0,6
0,9995
4,7
DBA
0,028-0,7
0,9998
4,5
TCA
0,050-12,5
0,9985
3,1
MBDCA
0,070-12,5
0,9975
4,5
MCDBA
0,080-12,5
0,9959
5,2
TBA
0,21-37,5
0,9947
11,0
Oszlop: Cryptand A1 5 µm (150 mm×3 mm); eluens G10: -8-tól 3 percig 10 mM NaOH; t=3 min 10 mM LiOH. Injektáló hurok: 25 µl. a
RSD% (n=3): az injektált koncentráció legalacsonyabb értékére számolva, amely megfelel a
detektálási határnak. A 2.5. táblázatban közölt koncentráció-adatok, ahol lehetséges az összehasonlítás, szignifikánsan jobbak, mint a korábban közöltek [74] ASRS Ultra szuppresszorral: 100 µl injektálásakor a LOD értékek: 65,1 µgl-1 MCA, 130 µgl-1 DBA, 522 µgl-1 TCA, 443 µgl-1 MBDCA és 379 µgl-1 MCDBA. A táblázatban látható koncentráció-értékek hasonlóak, ill. jobbak, mint ugyanezen szerzők adatai AAES Atlas szuppresszorral [74]: 100 µl injektálásakor a LOD értékek: 1,4 µgl-1 MCA, 5,4 µgl-1 MBA, 8,2 µgl-1 DCA, 12 µgl-1 DBA, 16 µgl-1 TCA, 43 µgl-1 MBDCA és 73 µgl-1 MCDBA, amelynek a technológiája lehetővé teszi a zaj jelentős csökkentését és ezáltal a detektálási határokét is. 65
Értékeltük a haloecetsavak detektálási határait csapvíz mintában (ld. 2.16. ábra). A koncentrációkat a TCA, MBDCA, MCDBA és TBA esetében a 2.5. táblázatban közölt értékeken tartottuk, míg a MCA esetében 10-szeresére, MBA esetén 5-szörösére és BCA, valamint DBA esetében 2-szeresére növeltük a Cl − , NO3− , SO42− interferenciája miatt, amelyek 21 mgl-l (RSD 3%), 13 mgl-l (RSD 4%), ill. 49 mgl-l (RSD 1%) koncentrációban voltak jelen. A módszer érzékenységének növelése céljából előzetes dúsítást végeztünk. Az ivóvíz minták előzetes dúsítását megelőzően kiszámoltuk a minták visszanyerési értékeit ionmentes vízben a 2.1.1. fejezetben leírtak szerint. A kapott visszanyerési értékek (%, n=3): MCA 22±2, MBA 74±9, DCA 65±11, BCA 55±2, DBA 101±17, TCA 106±7, MBDCA 75±3, MCDBA 67±3 és TBA 37±8. Összehasonlítva ezeket az értékeket a [74] irodalomban megjelentekkel azt látjuk, hogy magasabb visszanyerést értünk el ebben a munkában TCA, MBA, MBDCA és MCDBA esetében, de alacsonyabbat MCA-nál és DCA-nál. A relatív standard deviációk hasonlók mindkét esetben. Ezt az eljárást használtuk a hozzáadott HAA-kat tartalmazó csapvíz minták előzetes dúsítására (2.17. ábra). A visszanyerési hozam hasonló volt az ionmentes vízben előzőleg kapott értékekhez.
2.2.4 Az elválasztások alapján tett következtetések
A haloecetsavak NaOH eluens használatával, izokratikus elúcióval mind egymástól, mind az ivóvizekben előforduló szervetlen anionoktól elválaszthatók, azonban az elválasztás hosszú időt vesz igénybe.
LiOH eluens használatával csökkenek a retenciós idők, ezáltal nem minden haloecetsav választható el egymástól.
Az optimális megoldás a kapacitás gradiens alkalmazása: jó felbontással és kis retenciós időkkel választhatók el mind a kis retenciójú, mind a nagy retenciójú haloecetsavak.
A haloecetsavak elúciós sorrendje: MCA < MBA < DCA < BCA < DBA < TCA < MCDBA < TBA izokratikus és gradiens elúcióban is. Az azonos mennyiségben Cl-t és Br-t tartalmazó vegyületek közül a Cl-t tartalmazók retenciós ideje kisebb.
A kapacitás gradiens alkalmazása különösen előnyös a nagy retenciójú haloecetsavaknál. Ezeknél nagyobb a retenciós idő csökkenése az izokratikus elválasztásnál tapasztalthoz képest, mint a kis retenciójú komponenseknél.
A kifejlesztett módszernek köszönhetően a HAA-k meghatározásának időszükséglete kevesebb, mint 20 percre csökken, az erősen visszatartott anionok retenciója jelentős
66
mértékben csökkent. A gyengén visszatartott komponensek felbontása változatlan maradt az izokratikus elúció eredményeivel összehasonlítva.
A módszer eredményesen alkalmazható természetes eredetű minták vizsgálatára.
67
2.3. A fém-kelátok anioncsere-kromatográfiás elválasztása és retenciós jellemzői 2.3.1. A kromatográfiás rendszer kémiai jellemzői Az elválasztásokhoz AS9-HC polimer bázisú anioncserélő elválasztó oszlopot (250mm × 4mm) használtunk Dionex AMMS-I kation mikromembrán szuppresszorral. A minta- és eluensoldatokat analitikai tisztaságú anyagokból készítettük Milli-Q víztisztító rendszerrel kezelt vizet használva, melynek vezetőképessége 18,2 MΩcm-1. Ezáltal az oldatokban a minta-, ill. az eluensionon kívül gyakorlatilag nem voltak jelen más ionok, amelyek módosíthatták volna a mérési eredményeket. A mintaoldatok a fém kationok kloridsóit és komplexképzőt tartalmaztak. Az eluenseket karbonát- és hidrogénkarbonát nátriumsóiból készítettük. A vizsgálat során alkalmazott eluens pH-értékei az összetétel függvényében szisztematikusan a következők voltak: 10,00
Celuens [mM]
7,50 HCO3-
5,00
CO32-
2,50
pH
=1 pH 0,27 =1 pH 0,86 =1 1, 0 pH 3 = pH 9,9 =1 0 pH ,27 = pH 10,5 =1 0, pH 86 = pH 9,44 =1 pH 0,27 =1 pH 0,86 =1 1, 03
0,00
2.18. ábra. Az alkalmazott karbonát/hidrogénkarbonát eluensrendszerek egyensúlyi összetétele és pH-ja (szaggatott vonal: HCO3− , folytonos vonal: CO32− )
68
A karbonát/hidrogénkarbonát eluensrendszer használatakor az elválasztó oszlopban a mintakomponensek és az eluens között kialakuló egyensúlyi reakciók: R2 − CO3 + MEDTA 2− ⇔ R2 MEDTA + CO32−
/2.5./
R2 − CO3 + MDCTA 2− ⇔ R2 − MDCTA + CO32−
/2.6./
A szuppresszor-reakcióban az eluensből kis vezetőképességű szénsav keletkezik, amelyhez a H+-iont a kationcserélő szuppresszor membránja biztosítja: CO32− + 2 H + ⇔ H 2 CO3
/2.7./
A rendszer számos ionos komponenst tartalmaz mind az eluensben ( CO32− , HCO3− és OH − ), mind a mintában, ahol a mintaionok különböző komplex formái vannak jelen. Az
anionos fémkomplexek kialakulásakor pH-függő mellékreakciók is lejátszódnak. A karbonát eluens három versengő anionjának ( CO32− , HCO3− és OH − ) aktuális moláris koncentrációi a mozgó fázis pH-ján a két protonálódási állandó segítségével számolhatók. Az eluens ionok jelenlétében szimultán ioncsere egyensúlyok is lejátszódnak. A vizsgált pH-tartományban (9 < pH < 11) jelenlévő ionos komponensek a Φ móltörtek segítségével határozhatók meg. A pH függvényében számított móltörteloszlások a 2.19. – 2.22. ábrán láthatók. Φ
1 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0
CO32HCO3H2CO3
0
2
4
6
8
10
12
14 pH
2.19. ábra. A karbonát eluens móltörteloszlási függvénye 1 Φ 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0
EDTA4EDTA3EDTA2EDTAEDTA HEDTA+ H2EDTA2+ 0
2
4
6
8
10
12
14 pH
2.20. ábra. Az EDTA ligandum móltörteloszlási függvénye
69
1 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0
DCTA4DCTA3DCTA2DCTADCTA
0
2
4
6
8
10
12
14 pH
2.21. ábra. Az DCTA ligandum móltörteloszlási függvénye
Φ
1 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0
Φ
1 0,9 0,8
CuEDTA CuHEDTA CuOH
0,7 0,6
CuDCTA
0,5
CuHDCTA CuOH
0,4 0,3
szabad Cu
szabad Cu
0,2 0,1 0 0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
1
2
3
4
5
6
7
8
9 10 11 12 13 14 pH
pH
Φ
Φ
1
1 0,9
0,9
0,8
0,8
0,7
0,7 0,6
ZnEDTA
0,5
ZnHEDTA
0,4
ZnOH szabad Zn
0,3
0,6
ZnDCTA
0,5 0,4
ZnHDCTA ZnOH
0,3
szabad Zn
0,2
0,2
0,1
0,1
0
0
0
0 1
2 3
4 5
6 7 8
1
2
9 10 11 12 13 14
3
4
5
6
7
8
9 10 11 12 13 14 pH
pH
2.22. ábra. A réz és cink átmenetifémek EDTA és DCTA ligandummal képzett komplexeinek móltörteloszlása.
70
A móltörtszámítások alapján megállapítható, hogy a kísérletek során alkalmazott pHtartományban jelenlévő ionos alkotók a következők: CO32− , HCO3− , OH − , EDTA 4− , HEDTA 3− , DCTA 4− , HDCTA 3− , CuEDTA 2− , ZnEDTA 2− , CuDCTA 2− és ZnDCTA 2− . A komplex anion retenciós tulajdonságainak (log k’) Hajós [50] által levezetett elméleti változása az eluens komponenseinek, ill. a pH-jának függvényében látható az 2.23. ábrán. Az egyes komponensek elúcióban való részvétele a fajlagos ioncsere-tulajdonságok összegeként vezethető le, ill. írható fel. Ezek összege retenciós felületként reprezentálható. Az így megállapított tendenciák irányadók számunkra a vizsgálataink várható eredményeinek értelmezésében. Növekvő eluens koncentráció csökkenő retenciót idéz elő, ill. a pH az aktuális Φ móltörtek arányában fejti ki retenciós hatását. Növekvő pH szintén retenciócsökkenést eredményez a kétértékű karbonát móltörtjének növekedése miatt.
2.23. ábra.
A [ZnEDTA]2- mintaion retenciós tulajdonságainak változása az eluens
összetételének függvényében [50]
2.3.2. A fém-kelát komplexek retenciójának vizsgálata Megvizsgáltuk a karbonát/hidrogénkarbonát eluensrendszer összetételének a retenciós tényezőre kifejtett hatását. Megállapítottuk, hogy a növekvő pH és növekvő koncentráció csökkenő retenciót eredményez mind EDTA, mind DCTA ligandumok alkalmazásakor. Az alkalmazott eluens pH-ja a retenciós időre hatással van, de nem befolyásolja a fémkomplexek elúciós sorrendjét abban az esetben, ha az eluensek összkoncentrációja azonos. (lásd 2.6. táblázat)
71
2.6. táblázat: Az eluens pH-jának hatása a komplexek és ligandumok retenciójára.
k’ Celuens [mM]
5,0
6,5
8,0
9,0
pH
10,27 10,86 11,03 9,90
10,27 10,50 10,86 9,44
10,27 10,86 11,03
Cl-
3,88
3,45
3,60
4,20
3,56
3,42
3,08
5,34
3,53
3,14
2,85
EDTA4-+
12,00 8,06
9,00
11,89 8,16
6,93
5,95
12,27 6,29
5,38
3,92
HEDTA3NaHEDTA2- 26,09 19,38 20,16 25,18 17,78 15,81 14,63 17,29 14,73 12,68 10,58 DCTA4-
+ 12,80 9,28
9,81
13,54 10,04 8,73
7,11
n.r.
7,96
6,32
5,07
HDCTA3NaHDCTA2- 15,86 11,23 11,93 14,36 12,10 10,55 8,62
21,01 16,96 13,27 10,84
CuEDTA2-
30,27 25,98 25,95 22,53 21,67 19,92 18,87 n.r.
ZnEDTA2-
22,87 19,30 19,95 n.r.
17,84 16,12 14,54 18,20 14,62 12,77 10,72
CuDCTA2-
27,60 19,14 20,84 n.r.
20,41 17,08 14,66 20,22 16,96 13,27 10,65
ZnDCTA2-
28,58 20,01 21,31 n.r.
21,45 17,84 15,30 21,90 17,60 13,72 10,50
17,55 15,86 14,28
n.r.: nincs retenció Az elválasztási módszer előnye, hogy a fémkomplexek stabilitása és egyidejűleg az elúció szempontjából is a lúgos pH-tartomány a kedvező. A 10-nél alacsonyabb pH nem kedvezett az elválasztásoknak, nagy volt a komponensek retenciója, ill. a felbontások nem voltak kielégítők. A fémkomplexek stabilitása a Függelékben felsorolt állandók alapján számolható a K' =
K
α M α Ln
képlettel. Az eredményekből látszik, hogy pl. pH = 10,86 esetén a
lg K 'Cu 2+ − EDTA = 18, 69 és a lg K 'Zn2+ − EDTA = 16, 39 , amely érték stabil komplexekre utal. A vizsgált pH-tartományban az EDTA és a DCTA - általános alakban H4Y - HY3- és Y4alakban fordul elő (2.20. ábra). A kétértékű fémionok komplexképződési egyensúlyai: M 2+ + HY 3− ⇔ MHY −
/2.8./
M 2+ + Y 4− ⇔ MY 2−
/2.9./
Ezeken a pH-értékeken a ligandumok nem képeznek csapadékot.
72
Különböző eluens összetételeknél meghatározva a réz- és cink-kelát komplexek retenciós tényezőit (k’) (2.24. és 2.25. ábra) azt tapasztaltuk, hogy a k’ értékek csökkennek a pH, ill. a koncentráció növelésével. 2-
[CuEDTA]
k'
40 35 30 25 20 15 10 5 0
5.0 mM 6.5 mM 8.0 mM 9.0 mM
9
9,5
10
10,5
11
11,5 pH
2-
[ZnEDTA] k'
30 25 5.0 mM 6.5 mM 8.0 mM 9.0 mM
20 15 10 5 0 9
9,5
10
10,5
11
11,5 pH
2.24. ábra. A karbonát/hidrogénkarbonát eluens koncentrációjának és pH-jának hatása a fémEDTA komplexek retenciójára. A jelmagyarázatban az eluens összkoncentrációja látható.
73
2-
[CuDCTA]
k'
40 35 30 25 20 15 10 5 0
5.0 mM 6.5 mM 8.0 mM 9.0 mM
9
9,5
10
10,5
11
11,5 pH
2-
[ZnDCTA] 40 k' 35 30 25 20 15 10 5 0
5.0 mM 6.5 mM 8.0 mM 9.0 mM
9
9,5
10
10,5
11
11,5 pH
2.25. ábra. A karbonát/hidrogénkarbonát eluens koncentrációjának és pH-jának hatása a fémDCTA komplexek retenciójára. A jelmagyarázatban az eluens összkoncentrációja látható.
74
2.3.3. Komponens csúcsok azonosítása 2.3.3.1. Komponens csúcsok azonosítása a retencióprofil alapján A mintakomponensekre vonatkozó lg k’ vs eluens koncentráció függvények meredekség értékeinek azonossága utal a töltések azonosságára és így az elválasztott komponensek, frakciók minőségét, retenciós sorrendjét, a profilt igazolják. Végeztünk méréseket arra vonatkozóan, hogy miként hat az eluens koncentrációjának változása a komponensek retenciójára akkor, ha a pH-t állandó értéken tartjuk. Az állandó pH-értéknek célszerűen az EDTA móltörtek alapján 10,27-t választottuk, a koncentráció 2,5; 5; 6,5; 7; 8 és 9 mM volt.
1,4 log k'
EDTA4-/HEDTA3-
1,2
NaHEDTA2-
1
SO42-
0,8
PO43-
0,6
Cl-
0,4
Br-
0,2
NO3-
0 2
4
6
8
10
Celuens [mM]
Mintaion ClBrNO3SO42NaHEDTA2PO43-/HPO42- z = −2,04 EDTA4-/HEDTA3-
meredekség -0,0343 -0,0349 -0,0358 -0,054 -0,059 -0,0411 -0,0497
z = − 3 , 46
2.26. ábra. Állandó pH-jú (10,27), változó koncentrációjú eluens hatása az EDTA ligandum ionjainak, valamint szervetlen anionok ( Cl − , Br − , NO3− , SO42− , PO43− ) retenciójára.
75
A log k’ értékek eluenskoncentráció függvényében ábrázolt egyeneseinek meredekségei utalnak a komplexben nem kötött, szabad EDTA ligandumok töltésére is. A táblázat adataiból kiderül, hogy az együtt eluálódó EDTA4- és HEDTA3- ion meredeksége a foszfát ionéhoz hasonló (-0,0497 vs. -0,0411), a NaHEDTA2- ioné a szulfát meredekségével vethető össze (0,059 vs. -0,054), amely igazolja, hogy ezek a csúcsok valóban az EDTA különböző töltéssel rendelkező formáit reprezentálják. A fent ismertetett analitikai módszer alkalmazásával elválaszthatók egymástól ugyanannak a fémnek különböző ligandumokkal képzett komplexei (2.27. ábra), valamint különböző fémek komplexei is kimutathatók egymás jelenlétében (2.28. ábra). A negatív töltésű átmenetifém komplex kationok a negatív töltésű karboxilát anionokkal szimultán elválaszthatók
anioncserélő
kromatográfiában
(2.29.
ábra).
A
kísérletek
alapján
megállapítható, hogy az eluens karbonát komponensének elúciós ereje nagyobb, mint a hidrogénkarbonáté. Az eluens összetételében ez a kedvező elúció tervezésénél fontos szempont.
2.27. ábra. A réz EDTA és DCTA ligandumokkal képzett komplexeinek elválasztása. Oszlop: AS9-HC; v=1,0ml/min; Eluens: 9,0 mM Na2CO3; pH = 11,03 (1): Cl- (tR=6,68min), (2): EDTA4-/HEDTA3- (tR=8,73min), (3): DCTA4-/HDCTA3- (tR=8,73min), (4): [Cu-DCTA]2(tR=20,25min), (5): [Cu-EDTA]2- (tR=28,18min); [Cu-EDTA]2-: lgβ2 = 21,8; [Cu-DCTA]2-: lgβ2 = 24,4
76
2.28. ábra. Alumínium- és cink-komplexek, valamint két kelátképző ágens, EDTA és DCTA szimultán elválasztása. Oszlop: AS9-HC; v=1,0ml/min; Eluens: 9,0 mM Na2CO3, pH=11,03, (1): Cl- (tR=6,75min), (2): EDTA4-/HEDTA3- (tR=8,83min), (3): DCTA4-/HDCTA3(tR=10,03min), (4): [AlEDTA]- (tR=14,55min), (5): [AlDCTA]- (tR=17,03min), (6,7): [ZnEDTA]2-/[ZnDCTA]2- (tR=20,87min).
2.29. ábra. Alifás karboxilátok (piruvát és maleát) és réz-EDTA fémkomplex szimultán elválasztásának kromatogramja. Elválasztó oszlop: AS4A-SC, Eluens: 0,71mM Na2CO3 + 1,81mM NaHCO3; pH = 9,66. (1): piruvát (tR=1,46min), (2): klorid (tR=1,62min), (3): EDTA4-/HEDTA3- (tR=3,63min), (4): maleát (tR=6,09min), (5): [Cu-EDTA]2- (tR=7,09min)
77
2.3.3.2. Komponens csúcsok azonosítása a fémion és a ligandum mólarányának változtatása alapján Növelve a mintában a ligandum mennyiségét, a szabad EDTA csúcsok területe lineárisan nőtt, míg a fémkomplex és a kloridion csúcsának területe nem változott, miután a sztöchiometriai arányoknak megfelelő mennyiségű ligandumnál többet tartalmazott a mintaoldat (2.30. ábra). a)
b)
2.30. a) és b) ábra. A Cu-EDTA2- komplex és a szabad EDTA ligandumok csúcsterületének változása az EDTA : fémion arány függvényében. Eluens: 9,0 mM Na2CO3, pH = 11,03.
78
Az 1. mérési pontban, amely a sztöchiometriai számításoknak megfelelő mennyiségű ligandumot tartalmazó mérések eredményeit jeleníti meg, várakozásunknak megfelelően nem kaptunk szabad ligandum csúcsokat. Az EDTA ligandum EDTA4- és HEDTA3-, valamint a NaHEDTA2- formája is kimutatható az anioncsere kromatográfia segítségével, amint a ligandum mintabeli koncentrációja meghaladta a sztöchiometrikusan szükséges mennyiséget. A kloridion csúcsterülete állandó a várakozásnak megfelelően és jelenlétének az az oka, hogy a fémeket kloridsóik formájában használtuk a mintakészítésekhez. A 2.30. ábrán látható, hogy a koeluálódó 3-szorosan és 4szeresen negatív töltésű EDTA csúcs alatti területe meredekebben nő, mint a NaHEDTA2ioné. Az elválasztásokhoz alkalmazott karbonát eluens pH-ja 11,03 volt. Ezen a pH-n az EDTA ligandum móltörteloszlása: 82,95 % EDTA4- és 17,05 % HEDTA3-. A [Cu-EDTA]2csúcsterülete nem változik, mivel koncentrációja a ligandum-fém aránnyal nem változik, mert a minta nem tartalmaz szabad fémiont. Az EDTA 3-szorosan és 4-szeresen negatív formái gyors egyensúlyi reakciókban alakulnak egymásba, ezért ez a két anion egy csúcsban eluálódik. Az egymásba átalakuló ionok (NaEDTA3-, NaHEDTA2- és Na2EDTA2-) átalakulási sebessége jelentős hatással van a minták elválasztására [72, 73]. A komponensek egymástól függetlenül vándorolnak és csak az effektív diffúzió (molekuláris-, örvény diffúzió és tömegtranszfer ellenállás) okozhat sávszélesedést. A Na2H2EDTA oldatában a következő egyensúlyok állnak be [79]:
→ HEDTA 3H 2 EDTA 2- ← K2
→ ← K1
EDTA 4-
↑↓ Na(HL) ↑↓ K NaL → NaEDTA3NaHEDTA 2- ← K
K H(NaL)
↑↓ Na(NaL) Na 2 EDTA 2K
2.31. ábra. Az eluensben létrejövő egyensúlyi viszonyok ahol K1 = 1010,26, K2 = 106,16, KNaL = 101,79, KNa(NaL) = 100,68, KNa(HL) = 100,49, KH(NaL) = 108,96. A KH(NaL)-t K1KNa(HL) / KNaL-ként vezettük le. [79] A 2.32. ábra a különböző EDTA származékok moláris frakcióit ábrázolja a Na+ koncentráció függvényében, a pH = 10,1. Ez az ábra egyértelművé teszi, hogy az elválasztások során használt Na+-koncentrációtartományban (szürkével jelölt terület) az EDTA három fő formája a négy- és háromértékű ligandum és a háromértékű NaEDTA3- kelát komplex. Habár ezek a komponensek az összes EDTA-ion valamivel több, mint 90%-át teszik
79
ki, a protonált (NaHEDTA2-) és a kétmagvú kelát komplex (Na2EDTA2-) is kimutatható az oldatban.
2.32. ábra. Az EDTA ionok móltörtjei a Na+- koncentráció függvényében pH = 10,1 esetén. Szaggatott vonal: EDTA4-; pont-vonal: HEDTA3-; vastag folyamatos vonal: NaEDTA3-; pontozott vonal: NaHEDTA2-; folyamatos vonal: Na2EDTA2-. A szürke terület az elválasztások során alkalmazott eluens-Na+-koncentrációtartományt jelöli. Az egymásba átalakuló ionok elválaszthatók Giddings alapján [72], ha az átalakulás sebessége kellően kicsi, vagy ha nem játszódik le az egymásba alakulás. Ha az egymásba átalakulás sebessége nagy, a két ion azonos időben hagyja el az oszlopot. Mivel az EDTA4- és HEDTA3- protonálódás / disszociáció sebessége nagy (nanoszekundum nagyságrendű), nem lehetséges az elválasztásuk, együtt eluálódnak. A multispeciesz eluens / minta retenciós elméletnek [19] megfelelően a közös csúcsuk retenciós faktora az egyes csúcsok retenciós faktorainak és az elúció pH-jának megfelelő móltörtjeik hányadosának összege. Mivel a fémkelát komplex protonálódása együttjár a komplex szerkezeti változásával, a NaEDTA3- / NaHEDTA2- protonálódás / disszociáció hányadosa elég lassú ahhoz, hogy el lehessen őket választani egy kromatográfiás folyamatban. Ezzel analóg módon a NaEDTA3- és a Na2EDTA2- is elválasztható egymástól. Ennek megfelelően négy különböző EDTA-csúcs azonosítható ionkromatográfiával a mintaoldat összetételétől függően. Ezek a csúcsok: (1) az EDTA4- és HEDTA3- közös csúcsa, (2) NaEDTA3-, (3) NaHEDTA2- és (4) Na2EDTA2-. Az elválasztások során alkalmazott Na+-koncentrációtartományban a két utóbbi komponens móltörtje kicsi (2.32. ábra), ezért ennek a két ionnak a csúcsa a detektálás érzékenységétől függően figyelhető meg.
80
A 2.33. ábrán karbonát eluensben oldott Na2H2EDTA kromatogramja látható. Négy egymástól elhatárolható csúcs található a kromatogramon. Az első a rendszer holttérfogatában megjelenő kationcsúcs. E csúcs megjelenésének az az oka, hogy a szuppresszor a mintával injektált kationokat csak részben távolította el. Ennek eredményeként viszonylag nagy kationcsúcs jelent meg a kromatogramm elején. A maradék négy csúcs az adott körülmények között jelenlévő EDTA ion. A 2.32. ábrán bemutatott móltörtekből kikövetkeztethető, hogy a második csúcs a NaEDTA3- ionnak felel meg, mivel ez a komponens jelenti a második legnagyobb frakciót. A legnagyobb csúcs a két szabad EDTA ligandum közös csúcsa (disszociált négyértékű és protonált háromértékű forma). A negyedik és az ötödik csúcs a protonált és a kétmagvú kelátnak felel meg.
2.33. ábra. Eluensben oldott Na2H2EDTA elválasztása. (1) csúcs: kationok (t0); (2): NaEDTA3- (tR=5,40min) ; (3): EDTA4- és HEDTA3- (tR=6,93min); (4): NaHEDTA2(tR=14,70min); (5): Na2EDTA2- (tR=17,32min). Oszlop: AS9-HC, eluens: 8,0 mM Na2CO3 / NaHCO3, pH = 10,27.
A 2.34. ábrán összefoglaltuk azoknak a méréseknek az eredményeit, amelyek során a ligandum koncentrációját állandónak tartottuk, és a fémion mennyiségét növeltük. Ebben az esetben a komplex csúcs alatti területe lineárisan nőtt, és ennek megfelelően a kloridion csúcsterülete is, míg a szabad ligandum csúcsok mérete csökkent a komplexképződési reakcióban elreagáló mértékben.
81
a)
b)
2.34. a) és b) ábra. A Cu-EDTA2- komplex és a szabad EDTA ligandumok csúcsterületének változása a fémion : EDTA arány függvényében. Eluens: 9,0 mM Na2CO3, pH = 11,03. A 2.30. és 2.34. ábrán bemutatott mérések eredményei bizonyították – a komplexképződés folyamatát figyelembe véve – a csúcsok azonosításának helyességét. Elvégeztük ezeket a kísérleteket a cink esetében is, hasonló eredménnyel. Cu-DCTA2- és Zn-DCTA2komplexekkel is elvégeztük ezeket a vizsgálatokat. A DCTA ligandum az EDTA kelátképzővel analóg módon viselkedett. (2.35., 2.36. ábra) Az elválasztások pH-ján a DCTA ligandum móltörteloszlása: 15,01 % DCTA4- és 84,99 % HDCTA3-.
82
csúcsterület [ µSsec]×10
7
70 60 50 40 30 20 10 0 0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
2+
[Cu ] : [DCTA] Cl-
DCTA4- + HDCTA3-
[CuDCTA]2-
NaHDCTA2-
2.35. ábra. A Cu-DCTA2- komplex és a szabad DCTA ligandumok csúcsterületének változása a fémion : DCTA arány függvényében. Eluens: 9,0 mM Na2CO3, pH = 11,03
2.36. ábra. A Zn-DCTA2- komplex és a szabad DCTA ligandumok csúcsterületének változása a DCTA : fémion arány függvényében. Eluens: 9,0 mM Na2CO3, pH = 11,03 A két tanulmányozott fémion a vizsgált pH-tartományban számításaink alapján csak egyféle komplexet képez: MEDTA2- (2.22. ábra). Ezt igazolták a kísérleti eredmények is. Ez azt jelenti, hogy a komplexek retenciójának folyamatát az oszlopban csak az anioncsere egyensúlyok szabályozzák, valamint hogy ebben a pH-tartományban a vizsgált komplexek nagyon stabilak, különösen 10 < pH < 11 intervallumban.
83
Az EDTA ligandum öt formában fordul elő a kísérletekre jellemző pH-tartományban: EDTA4-, HEDTA3-, NaEDTA3-, NaHEDTA2- és Na2EDTA2-, amelyeket kimutattunk az anioncsere
kromatográfiával.
Ezt
a
megállapítást
több
módszerrel
is
igazoltuk
ionkromatográfiás elválasztással. Változtattuk a mintában a fém:ligandum arányt (2.30., 2.342.36. ábra), valamint EDTA-t injektálva az effluensből gyűjtöttük a 6,1–7,4 ill. a 17,7–19,4 min retenciós intervallumban az EDTA4- / HEDTA3- és a Na2EDTA2- frakciókat, 50 °C-on 8 órán keresztül bepároltuk a koncentráció növelése céljából, majd szobahőmérsékleten 8 napig állni hagytuk. A frakciókat a szuppresszoron való áthaladás előtt gyűjtöttük, hogy a komponenseket ne befolyásolja a szuppresszorban megváltozó pH. A két frakciót a gyűjtésre jellemző kísérleti paraméterekkel injektáltuk vissza az ionkromatográfba: eluens: 8,0 mM karbonát/hidrogénkarbonát, pH = 10,27. Az alkalmazott hőmérsékleten az EDTA hőbomlást szenved és a kromatogramon nem beazonosítható bomlástermékek láthatók. A kapott kromatogrammok (2.37. ábra) azonos mintázatúak, csak az intenzitásban van némi eltérés. Ezek az eredmények azt jelzik, hogy a két EDTA-frakció valóban EDTA-t tartalmazott.
2.37. ábra. Az EDTA injektálásakor gyűjtött frakciók visszainjektálásakor kapott kromatogramok. 1. frakció: EDTA4- / HEDTA3-, 2. frakció: Na2EDTA2-. Eluens: 8,0 mM CO32− / HCO3− , pH = 10,27. A csúcsok az EDTA bomlástermékeit képviselik. Kísérleti eredményeink alapján elmondható, hogy mind a fém:ligandum arány változtatása, mind a valószínűsített EDTA-csúcsok visszainjektálása azt igazolta, hogy a nagyhatékonyságú anioncsere-kromatográfiával kimutathatók az EDTA ligandum különböző töltésű formái, az elválasztásokhoz alkalmazott eluens pH-jának megfelelő anionok.
84
2.3.4. A komponenscsúcs-azonosítás helyességének igazolása csatolt analitikai módszerekkel 2.3.4.1. A fémtartalom igazolása ICP atomspektroszkópiás mérésekkel Az ionkromatográfiás mérések alapján fémkomplex csúcsoknak valószínűsített csúcsok fémtartalmát
ICP-AES
mérésekkel
igazoltuk.
Az
atomabszorpciós
spektroszkópiás
vizsgálatokhoz a kromatográfiás csúcs-frakciókat (heart-cutting technika) a szuppresszor előtt gyűjtöttük. Az ICP-AES mérésekkel a fémek koncetrációjára adódott alacsony értékek oka az eluens hígító hatása.
2.38. ábra. Ionkromatográfiás kromatogram ICP-AS vizsgálattal meghatározott Cu-profilja. Minta: 5 ppm CuCl2, 0,2 mM EDTA és 0,2 mM DCTA. Eluens: 9,0 mM Na2CO3, pH = 11,03. Mintavétel retenciós időtartományai: 15,5-17,5 min és 20,1-22,2 min.
85
2.6. táblázat: IC/ICP profil adatok Cu-komplexek esetében
Jel 1
tR [min]
komponens
Cu2+ koncentráció [ppm]
5,23
ClEDTA4/HEDTA3DCTA4/HDCTA3-
0
2 6,73 3/4 8,38 5 6
0 0
16,17
2-
[Cu-DCTA]
0,26
20,97
[Cu-EDTA]2-
0,61
2.39. ábra. Ionkromatográfiás kromatogram ICP-AS vizsgálattal meghatározott Zn-profilja. Minta: 15 ppm ZnCl2, 0,4 mM EDTA és 0,6 mM DCTA. Eluens: 8,0 mM Na2CO3/HCO3, pH = 10,27. Mintavétel retenciós időtartományai: 19,2-21,8 min és 23,0-25,0 min.
86
2.7. táblázat: IC/ICP profil adatok Zn-komplexek esetében Jel 1
tR [min]
Komponens
Zn2+ koncentráció [ppm]
5,75
0
11,48
ClEDTA4/HEDTA3DCTA4/HDCTA3-
20,03
[ZnEDTA]2-
0,4
23,87
2-
2 10,1 3/4 5 6
[ZnDCTA]
0 0 0,18
A [Cu-EDTA]2-, [Cu-DCTA]2-, [ZnEDTA]2- és [ZnDCTA]2- komplexek csúcsát atomspektroszkópiával is azonosítottuk. A 2.38. és 2.39. ábrán látható, hogy a Cu2+, ill. Zn2+ion koncentrációja mindaddig nulla, míg a detektorban meg nem jelent az egyik, majd a másik fémkomplex. Ezek a mérések igazolták, hogy a kromatogramok két utolsó csúcsa valóban fémkomplex csúcs, amelyek különböző ligandumokat tartalmaznak. A ligandumot előzetes, csak az egyik, ill. csak a másik ligandumot tartalmazó minták mérésével határoztuk meg. A rézion EDTA és DCTA komplexei jó felbontással elválaszthatók egymástól, míg a cinkion esetében a kísérleti paraméterektől függően rossz a felbontás vagy koeluálódnak a cinkkomplexek. A cinkion főleg négyes koordinációs számú, tetraéderes komplexek képzésére hajlamos, míg a rézion négyesen kívül hatosra, oktaéderesre is. Az EDTA 4- és 6fogú ligandumként is koordinálódhat, a DCTA viszont csak négyfogúként. Ezért a cinkion mindkét ligandumban csak négyes koordinációs számúként fordulhat elő, miközben a rézion EDTA ligandummal hatos is lehet. Ez okozza a cinkion kétféle ligandummal képzett komplexének hasonló retencióját.
2.3.4.2. A szabad ligandumok igazolása infravörös spektroszkópiás mérésekkel A komplexképző 20 mM EDTA injektálása után, a szuppresszor előtt gyűjtött kromatográfiás frakciókat (lásd 2.33. ábra) FTIR-ATR technikával is megvizsgáltuk. A mintavétel retenciós idő tartományai: EDTA1: 4,5-5,6 min, EDTA2: 6,1-7,4 min, EDTA3: 13,5-14,9 min és EDTA4: 17,7-19,4 min. A frakciókat az FTIR-ATR mérések lebonyolításáig hűtőszekrényben tároltuk, hogy megakadályozzuk az EDTA bomlását. Az EDTA ligandumra jellemző szimmetrikus és aszimmetrikus COO-vegyértékrezgések (1800 – 1300 cm-1) jól
87
láthatók a kinagyított spektrumon (2.40. ábra). Az FTIR-ATR analízis igazolta, hogy az elválasztás körülményei között kialakult EDTA ionok jelen vannak, elválaszthatók és
1327
1671 1743
EDTA3
1339
1669
1740 1737
EDTA1 EDTA2
1341
.04
1357
1406
1357
1401
νsymCOO
1399
1664
EDTA
1607
1670
.06
.02
1594
1620
νasymCOO
.08
1591
detektálhatók anion-kromatográfiával.
EDTA4 0 1800
1700
1600
1500
1400
1300
Absorbance / Wavenumber (cm-1)
2.40. ábra. Az Na2H2EDTA csúcsaiból gyűjtött frakciók kinagyított FTIR-ATR spektruma. EDTA: 20 mM EDTA, EDTA1: a 2.29. ábra kromatogramjának 2. számú; EDTA2: 3. számú; EDTA3: 4. számú és EDTA4: 5. számú csúcsából gyűjtött frakció. A mintavétel retenciós időtartományai: EDTA1: 4,5-5,6 min, EDTA2: 6,1-7,4 min, EDTA3: 13,5-14,9 min és EDTA4: 17,7-19,4 min.
A 2.40. ábra mutatja, hogy az EDTA kromatogramján kapott valamennyi csúcs mérésekor megjelentek az EDTA-ra jellemző kötések sávjai. Az EDTA-val analóg módon igazoltuk a DCTA ligandum mintában jelenlévő ionjainak ionkromatográfiás kimutathatóságát is.
2.3.5. A módszer érzékenységének és linearitásának vizsgálata Végeztünk
kalibrációs
méréseket
az
elválasztási
módszer érzékenységének
és
linearitásának meghatározása érdekében. A fémkomplexek és a szabad poliaminokarbonsav ligandumok kalibrációs görbéit a Cu esetében mutatjuk be, amelyek a 2.41. ábrán és a 2.8.
88
táblázatban láthatók. Az elválasztásokhoz használt Na2CO3 eluens koncentrációja 9,0 mM volt, pH-ja 11,03.
2.41. ábra. Az átmenetifém komplexek és a szabad EDTA és DCTA ligandumok kalibrációs görbéi. Eluens: 9,0 mM Na2CO3, pH = 11,03.
89
Az érzékenység (a kalibrációs görbe meredeksége) és a linearitás megfelelő mind a fémkomplexek, mind a ligandumok esetében. Értékeiket a 2.8. táblázat tartalmazza. 2.8. táblázat: A kalibrációs egyenesek tulajdonságai Minta
Érzékenység
Linearitás (R2)
EDTA4-
2×108
0,9221
NaHEDTA2-
5×108
0,9718
DCTA4-
4×108
0,9291
NaHDCTA2-
4×107
0,9915
[Cu-EDTA]2-
109
0,9931
[Cu-DCTA]2-
109
0,9894
/HEDTA3-
/HDCTA3-
2.3.6. Az elválasztások alapján tett következtetések
•
A vizsgált rendszerben számos ionos komponens van jelen, amelyek a pH-tól függő egyensúlyi reakciókban vesznek részt. Az elválasztások optimalizálása érdekében valamennyit figyelembe kell venni, és kémiai paraméterek alapján hatásukat vizsgálni lehet.
•
A karbonát/hidrogénkarbonát eluens koncentrációja és pH-ja jelentősen befolyásolja az átmenetifém komplexek és a szabad ligandumok retencióját. Növekvő koncentráció és pH csökkenő retenciót eredményez.
•
A csúcsok azonosításának helyességét több módszerrel igazoltuk. Változtattuk a mintában lévő fém:ligandum arányt, aminek megfelelően változott a csúcsok területe, vizsgáltuk a retenciós profilt, amelynek megfelelően változott a log k’ vs. C függvények
meredeksége.
Az
EDTA
injektálásakor
gyűjtött
frakciókat
visszainjektálva minőségileg azonos bomlástermékekre utaló kromatogramokat kaptunk. •
Atomspektroszkópiás mérésekkel igazoltuk a fém-komplex csúcsok fémtartalmát. Infravörös
spektroszkópiás
vizsgálattal
igazoltuk,
hogy
ionkromatográfiával
kimutatható az EDTA4-/HEDTA3- , NaEDTA3-, NaHEDTA2- és a Na2EDTA2- anion.
90
Ezek a megfigyelések összhangban vannak Giddings és Keller elméletével, miszerint ha lassú a különböző ionos töltésű formák egymásba alakulásának sebessége, két csúcsként jelennek meg a kromatogramon. •
Kalibrációs mérésekkel megállapítottuk, hogy a módszer érzékenysége és linearitása megfelelő.
91
3. Összefoglalás Dolgozatomban két, a környezetvédelem és az egészség szempontjából fontos vegyületcsoport, a haloecetsavak és az átmenetifém komplexek és azok ligandumai elválasztási lehetőségeit vizsgáltam nagyhatékonyságú anioncsere kromatográfiával. A haloecetsavak folyadékkromatográfiás elválasztására makrociklikus kölcsönhatáson alapuló új módszert mutattam be. Részletesen vizsgáltam, hogy az eluensben lévő kation típusa milyen hatást gyakorol a makrociklikus anioncserélő elválasztó fázis tulajdonságaira. Tanulmányoztam a haloecetsavak elválasztását izokratikus, majd kapacitás gradiens elválasztási módszer alkalmazásával. A makrociklus alapú anioncserélő elválasztó oszlop (IonPac Cryptand A1) gradiens elúcióval lehetővé teszi a kapacitás és a szelektivitás szabályozását, a kilenc klorid- és bromid-tartalmú haloecetsav: monoklór-ecetsav (MCA), monobróm-ecetsav (MBA), diklórecetsav (DCA), bróm-klór-ecetsav (BCA), dibrómecetsav (DBA), triklór-ecetsav (TCA), monoklór-dibróm-ecetsav (MCDBA), monobróm-diklórecetsav (MBDCA) és tribrómecetsav (TBA) elválasztásának optimalizálását szervetlen anionok ( F − , Cl − , NO2− , NO3− , Br − , SO42− , PO43− ) jelenlétében. Ezek a szervetlen anionok, amelyekre kiterjesztettem vizsgálataimat, az emberi fogyasztásra alkalmas ivóvíz lehetséges szennyezői. A dolgozat második részében a biológiai és élettani szempontból is jelentős átmenetifémek és poliaminokarbonsavak szimultán elválasztását vizsgáltam anioncsere kromatográfiával, amelyhez szükséges volt a fém kationok anionokká alakítása kelátképzés révén. Meghatároztam kelát komplex anionok (Cu2+, Zn2+, EDTA, DCTA) retenciós adatait pellikuláris állófázist tartalmazó anioncserélő oszlopon karbonát/hidrogénkarbonát eluens és szuppresszált vezetőképességi detektálás alkalmazásával. Megállapítottam az elválasztás hasznos paramétereit, figyelembe véve a komplexek stabilitását és az eluens összetételét. Kísérleteim igazolják, hogy az anionok és fém kationok szimultán elválasztása komplexképzésen keresztül megvalósítható, és a komponensek koncentrációváltozása detektálható, a fémkomplexek és a ligandumaik is azonosíthatók. Az ionkromatográfiás elválasztások
paramétereinek
szisztematikus
változtatásával
bizonyítottam,
hogy
a
fémkomplexek csúcsa mellett a szabad ligandumok adott pH-nak megfelelő töltéssel rendelkező formái is kimutathatók a módszerrel. Az ionkromatográfiás elválasztásokon kívül egyéb módszerekkel is igazoltam a csúcsazonosítás helyességét. Atomspektroszkópiás mérések kimutatták a fémionok jelenlétét a fém-kelát komplexek csúcsaiban. Csillapított
92
totálreflekciós infravörös spektrumok felvételével igazoltam az EDTA-ra, ill. DCTA-ra jellemző kötések jelenlétét a különböző formában előforduló EDTA (EDTA4- / EDTA3-, NaEDTA3-, NaHEDTA2-, Na2EDTA2-) és DCTA (DCTA4- / DCTA3-, NaDCTA3-, NaHDCTA2-, Na2DCTA2-) ligandum csúcsaiban. A komplex fémionok szelektív elválasztása tervezhető és a retenciós egyensúlyok alapján jósolható.
93
4. Függelék A dolgozatban előforduló rövidítések Ay-
anion
α
szelektivitás
BCA
bróm-klór-ecetsav
CZE
kapilláris zónaelektroforézis
DA
megoszlási hányados
DBA
dibróm-ecetsav
DBP
fertőtlenítési melléktermék
DCA
diklór-ecetsav
DCTA
transz-1,2-diamin-ciklohexán-tetraecetsav
DIN
German Institute for Norms
DTPA
dietilén-triamin-pentaecetsav
EDTA
etilén-diamin-tetraecetsav
Ex-
eluens anionja
EPA
Environmental Protection Agency
ESI-MS
elektroporlasztásos ionizációs tömegspektrometria
FTIR-ATR
csillapított totálreflexió-Fourier transzformációs infravörös spektroszkópia
Φ
móltört
GC
gázkromatográfia
GC-ECD
gázkromatográfia-elektronbefogásos detektor
HAA
haloecetsav
HEDTA
N-(2-hidroxietil)-etiléndiamin-N,N’,N’-triecetsav
HPIC
ioncsere-kromatográfia
HPICE
ionkizárásos kromatográfia
HPLC
nagyhatékonyságú folyadék-kromatográfia
HPLC-ESI-MS nagyhatékonyságú folyadék-kromatográfia- elektroporlasztásos-ionizációs tömegspektrometria HPLC-UV
nagyhatékonyságú folyadék-kromatográfia ultraibolya detektorral
IC
ionkromatográfia
IC-ESI-MS
ionkromatográfia-elektroporlasztásos ionizációs tömegspektrometria
94
IC-MS
ionkromatográfia-tömegspektrometria
ICP-AES
induktív csatolású plazma atomemisszió
ICP-MS
induktív csatolású plazma tömegspektrometria
IP-RPLC
ionpár-fordított fázisú folyadék-kromatográfia
ISO
International Standard Organisation
k’
retenciós tényező / kapacitási faktor
kc
komplexképződési hányados
kd
disszociációs hányados
Ky+
kation
KA/E
egyensúlyi állandó
L
oszlop hossza
n-
L
többfogú komplexképző ligandum
LC
folyadék-kromatográfia
LC-ESI-MS
folyadék-kromatográfia-elektroporlasztásos ionizációs tömegspektrometria
LC-MS-MS
folyadék-kromatográfia-tömegspektrometria-tömegspektrometria
LC-UV
folyadék-kromatográfia ultraibolya detektorral
(M)
minta állófázisbeli koncentrációja
[M]
minta mozgófázisbeli koncentrációja
Mm+
fém kation
MBA
monobróm-ecetsav
MBDCA
bróm-diklór-ecetsav
MCA
monoklór-ecetsav
MCDBA
monoklór-dibróm-ecetsav
[ML]2-
fém-kelát komplex
MPIC
ionpár-kromatográfia
N
elméleti tányérszám
nm
a vizsgált komponens mozgófázison lévő móljainak száma
nS
a vizsgált komponens állófázison lévő móljainak száma
NTA
2,2',2''-nitro-triecetsav
P1(x)-P4(x)
valószínűségi sűrűségfüggvények
Q
effektív oszlopkapacitás
Q
állófázis ioncsere kapacitása
R
ioncserélő töltéssel rendelkező funkciós csoportja
RS
felbontás 95
SPE
szilárd fázisú extrakció
tR
retenciós idő [min]
TBA
tribróm-ecetsav
TCA
triklór-ecetsav
THM
trihalo-metán
u
mozgófázis áramlási sebessége [cmsec-1]
uA
az A minta részecskéinek átlagos vándorlási sebessége
US EPA
United States Environmental Protection Agency
V0
holttérfogat [ml]
Vm
oszlopban lévő mozgófázis térfogata
VN
nettó retenciós térfogat [ml]
VR
retenciós térfogat [ml]
VS
ioncserélő gyanta térfogata
w
csúcs bázisszélesség
z
nettó töltés (z = m-n)
A dolgozatban felhasznált egyensúlyi állandók [65, 79, 80]: Fémion
Ligandum
lg β
Cu2+
OH-
CuL=6,0; Cu2L2=17,1
DCTA
CuL=21,3; CuHL=24,4
EDTA
CuL=18,8; CuHL=21,8; Cu(OH)L=21,2
Zn
2+
-
OH
ZnL=4,4; ZnL3=14,4; ZnL4=15,5
DCTA
ZnL=18,7; ZnHL=21,7
EDTA
ZnL=16,5; ZnHL=20,9; Zn(OH)L=19,5
EDTA: lg β1=10,34; lg β2=16,58; lg β3=19,33; lg β4=21,40; lg β5=23,0; lg β6=23,9 DCTA: lg β1=11,70; lg β2=17,82; lg β3=21,34; lg β4=23,77 Karbonát: lg β1=10,3; lg β2=16,6 KNaEDTA = 101,79, KNa(NaEDTA) = 100,68, KNa(HEDTA) = 100,49, KH(NaEDTA) = 108,96
96
5. A szerző tudományos munkássága 5.1. Publikációk 1. M. C. Bruzzoniti, R. M. De Carlo, K. Horváth, D. Perrachon, A. Prelle, R. Tófalvi, C. Sarzanini, P. Hajós: High performance ion chromatography of haloacetic acids on macrocyclic cryptand anion exchanger, Journal of Chromatography A, 1187 (2008) 188-196 IF: 3,756 2. R. Tófalvi, A. Sepsey, P. Hajós: Analytical separation and identification of metal-chelate complexes using liquid chromatography, Műszaki Kémiai Napok’2010, Veszprém, Konferencia Kiadvány, ISBN 978-963-9696-93-8, 69-73 3. R.Tófalvi, A.Sepsey, K.Horváth, P.Hajós : Environmental Significance and Identification of Metal- Chelate Complexes Using Ion Chromatography, Hungarian Journal of Industrial Chemistry, Vol.39., No.1.(2011), pp.95-99 IF: 0,196 (2000-es adat) 4. R. Tófalvi, K. Horváth, P. Hajós: High performance ion-chromatography of transition metal-chelate complexes and amino-polycarboxylate ligands, J. of Chromatography A 2012 (közlésre beküldve) IF: 4,100
5.2. Konferencia előadások Nemzetközi konferencia előadások 1. R. Tófalvi, L. Nagy and P. Hajós: Comparative parameters of conductivity detection for the ion chromatography of organic and inorganic ions, Advances in Chromatography and Electrophoresis ACE’98 An International Symposium on Chromatography, Electrophoresis and Related Separation Methods, Szeged, Hungary, June 18-20, 1998 2. R. Tófalvi, K. Horváth, P. Hajós: Prediction of conductivity detection signal of ions in anion chromatography using alkanesulfonate eluents, 12th International Symposium Advances and Applications of Chromatography in Industry, Bratislava, Slovak Republik June 29- July 1. 2004,
97
3. K. Horváth, D. Perrachon, R. Tófalvi, C. Sarzanini, P. Hajós: High performance separation of haloacetic acids on macrocycle-based anion-exchanger, 19th Annual International Ion Chromatography Symposium IICS, Pittsburg, Pennsylvania, USA September 24-27, 2006. 4. R. Tófalvi, R. M. Carlo, K. Horváth, C. Sarzanini, M. Bruzzoniti, P. Hajós: Simultaneous Determination of Chelating Ligands, Anions, and Cations by High Performance Anion Chromatography, 31st International Symposium on High Performance Liquid Phase Separations and Related Techniques, HPLC 2007, International Convention Centre, Ghent, Belgium June 17-21, 2007 5. R. Tófalvi, R. M. Carlo, K. Horváth, C. Sarzanini, M. Bruzzoniti, P. Hajós: High Performance Anion Chromatography of Metal-Chelate Complexes, Organic and Inorganic Anions, 7th Balaton Symposium on High-Performance Separation Methods, In Memoriam Szabolcs Nyiredy, Siófok, Hungary, September 5-7, 2007 6. R. Tófalvi, P. Hajós, K. Horváth, R. M. De Carlo, C. Sarzanini: Simultaneous Analytical Separation of Metal-chelate Complexes, Ligands and Inorganic Anions Using High Performance Ion Chromatography, ISSS 2010, Rome, September. 2010 7. R. Tófalvi, A. Sepsey, K. Horváth, P. Hajós: Simultaneous Analysis of Metal-chelate Complexes and Their Ligands Using High Performance Ion Chromatography, 36th International Symposium on High-Performance Liquid Phase Separations and Related Techniques, HPLC 2011, Budapest, Hungary, 19-23 June, 2011
Nemzeti (magyar nyelvű) konferencia előadások 8. Tófalvi R.: Elektromos vezetőképességi detektor-jel becslése szerves és szervetlen ionok kromatográfiás elválasztási körülményeinek javítása céljából, 2003. évi Intézményi Tudományos Diákköri Konferencia Veszprém, 2003. november 26. 9. Tófalvi R.: Alifás karbonsavak és fém-kelát komplexek folyadékkromatográfiás elválasztása, MTA Anyagtudományi- és Szilikátkémiai Munkabizottsága, MTA VEAB Anyagtudományi Munkabizottsága „PhD hallgatók anyagtudományi napja VI.” című rendezvénye Veszprém, 2006. november 14. 10. Tófalvi R., R. M. Di Carlo, Horváth K., Hajós P.: Komplexképző ligandumok, anionok és kationok szimultán analízise nagyhatékonyságú ionkromatográfiával, Magyar Kémikusok Egyesülete Centenáriumi Vegyészkonferencia, Sopron, 2007. május 29.- június 1.
98
11. Horváth K., D. Perrachon, Tófalvi R., C. Sarzanini, Hajós P.: Haloecetsavak nagy hatékonyságú
ionkromatográfiás
elválasztása
makrociklusos
anioncserélőn,
Magyar
Kémikusok Egyesülete Centenáriumi Vegyészkonferencia, Sopron, 2007. május 29.-június 1. 12. Tófalvi R., Sepsey A., Hajós P.: Fém-kelát komplexek analitikai elválasztása és azonosítása folyadék-kromatográfiás módszerrel, Műszaki Kémiai Napok ’2010, Veszprém, 2010. április 27-29. 13. Tófalvi R., Sepsey A., Horváth K., Hajós P.: Fémkelát komplexek és ligandumaik szimultán
analitikai
elválasztása
nagy
hatékonyságú
ion-kromatográfiával,
Elválasztástudományi Vándorgyűlés, Tapolca, 2010. november 10-12. 14. Tófalvi R., Sepsey A., Horváth K., Hajós P.: Környezeti jelentőségű fémkelát komplexek és ligandumaik szimultán analízise nagyhatékonyságú ionkromatográfiával, „Mobilitás és Környezet: a járműipar kihívásai az energetika, a szerkezeti anyagok és a környezeti kutatások területén” konferencia, Veszprém, 2011. augusztus 29-szeptember 1. 15. Hajós P., Horváth K., M. Bruzzoniti, Tófalvi R., C. Sarzanini: Környezeti jelentőségű haloecetsavak szimultán analízise makrociklusos ionkromatográfiával, X. Környezetvédelmi Analitikai és Technológia Konferencia, Sümeg, 2011. október 5-7.
99
6. Tézispontok Az ionkromatográfia területén az elmúlt évek során elért eredményeim az alábbiak szerint foglalhatók össze:
1.
HALOECETSAVAK ÉS SZERVETLEN ANIONOK ELVÁLASZTÁSA N-DECIL2.2.2. KRIPTAND ALAPÚ MAKROCIKLUSOS BÁZISOS ANIONCSERÉLŐ ANALITIKAI OSZLOPON Gradiens elúciós módszerrel megoldottuk az izokratikusan el nem választható haloecetsavak
(monoklór-ecetsav
(MCA),
monobróm-ecetsav
(MBA),
diklórecetsav (DCA), bróm-klór-ecetsav (BCA), dibrómecetsav (DBA), triklórecetsav (TCA), monobróm-diklór-ecetsav (MBDCA), monoklór-dibróm-ecetsav (MCDBA) és tribrómecetsav (TBA)) szervetlen anionok ( F − , Cl − , NO3− , Br − , SO42 − , PO43− ) jelenlétében történő elválasztását makrociklusos ioncserélő
állófázison. . A Cryptand A1 N-decil-2.2.2. oszlop kémiai szerkezete miatt kiválóan alkalmas a kapacitás gradiens kivitelezésére az eluens fémionjának változtatása által a host/guest komplexképző folyamatban. Mivel eközben az eluens ionkoncentrációja nem változik, olyan módszert dolgoztunk ki, ahol az alapzaj zavaró hatását számottevően csökkenteni tudtuk.
2.
A GRADIENS ELÚCIÓ OPTIMALIZÁLÁSA A HALOECETSAVAK HATÉKONY ELVÁLASZTÁSÁRA (a)
A
kapacitás
gradiens
elválasztások
retenciós
eredményei
alapján
megállapítottuk, hogy jó felbontással és kis retenciós időkkel választhatók el mind a kis, mind a nagy retenciójú haloecetsavak alkálifém-hidroxid (LiOH, KOH, NaOH) eluensek alkalmazásával. (b)
Az analitikai elválasztó oszlop kapacitásának szisztematikus vizsgálata arra az eredményre vezetett, hogy a LiOH eluens esetén az oszlop kapacitása (Li+kriptát) nagyon alacsony (1,5-8 µekv/oszlop), KOH eluens használatakor (K+kriptát) a kapacitás (70-73 µekv/oszlop) közelít a maximális értékhez és NaOH 100
eluensnél (Na+-kriptát) a kapacitás szignifikánsan nő (35-73 µekv/oszlop) az eluens koncentrációjának növelésével (10-3M < C < 10-1M). A kapacitás és a mintaionok fém-kriptát anionos funkciós csoportokhoz való affinitása együtt eredményezi az adott anion retenciós idejének lényeges eltérését a különböző típusú eluensek (Li-, Na- vagy K-hidroxid) használatakor. (c)
A gradiens elúció optimális értékeinek segítségével megállapítottuk azt az eluensek kombinálásával kialakított gradiens programot, amelyben a gradiens lépcső helye, az eluens minősége és koncentrációja optimális elválasztási feltételeket biztosít. Az optimális körülményeket a felismert komponensek száma, a felbontás és az analízis időigénye alapján állapítottuk meg. A gradiens lépcső időpontja 3 min, előtte 10 mM NaOH, utána 10 mM LiOH oldat az eluens (G10 gradiens program).
3.
FÉM-KELÁT
KOMPLEX
IONOK
RETENCIÓJÁNAK
VIZSGÁLATA
PELLIKULÁRIS ÁLLÓFÁZIST TARTALMAZÓ ANIONCSERÉLŐ OSZLOPON (a)
Az
átmenetifém-komplex
anionok
(Cu2+,
Zn2+,
Co2+,
Al3+)
és
poliaminokarboxilát ligandumaik (EDTA, DCTA) retenciós adatbázisa alapján megállapítottuk az elválasztás hasznos paramétereit AS9-HC anioncserélő oszlopon, figyelembe véve a komplexek stabilitását és az eluens összetételét. A módszer előnyös körülménye, hogy a fémkomplexek stabilitása és az elúció szempontjából azonos lúgos pH-tartomány (9-11) a kedvező. Az eluens koncentrációja, a benne lévő karbonát/hidrogénkarbonát-ionok aránya és pH-ja jelentős hatással van a retencióra, abból adódóan, hogy az eluens pH változása esetén
a
protolízis
szabályozása
révén
a
kétértékű
és
egyértékű
eluenskomponensek eltérő elúciós hajtóerővel rendelkeznek. (b)
Az
eluens
paramétereinek
változtatásakor
megállapítottuk,
hogy
az
eluensrendszer összkoncentrációjának és/vagy pH-jának növelése a retenciós idő csökkenését eredményezi. Ezek ismeretében meghatároztuk az optimális elválasztási körülményeket (9,44 < pH <11,03, C = 9,0 mM Cu-EDTA-ra és CuDCTA-ra, C = 8,0 mM Zn-EDTA-ra és Zn-DCTA-ra). Az egymáshoz közel eluálódó ionok (ZnEDTA2-, ZnDCTA2-) elválasztásához nagyobb arányú
101
hidrogénkarbonátot tartalmazó eluensrendszer használata célszerű, mivel a hidrogénkarbonát elúciós ereje kisebb, mint a karbonáté.
4.
A POLIAMINOKARBOXILÁT ANIONOK, SZERVETLEN IONOK ÉS AZ ÁTMENETIFÉM
KATIONOK
EGYIDEJŰ
ELVÁLASZTÁSA
MEGVALÓSÍTHATÓ (a)
A kromatogramokból vett „heart-cut” mintákon elvégzett ICP-AES mérési eredmények a Cu és Zn fémionok meghatározása alapján is igazolják, hogy az anionok és a fém kationok, ill. azok különböző komplex formáinak szimultán elválasztása a komplexképzésen keresztül megvalósítható, valamint a réz és cink fémionok poliaminokarboxilát anionokkal csak egyféle, kétszeresen negatív töltésű komplexet képeznek.
(b)
A szabad ligandum csúcsok FTIR-ATR spektroszkópiás mérései igazolják, hogy az anionok és a fém kationok szimultán elválasztása megvalósítható, detektálható, a komplexképző reagens koncentrációváltozása nyomon követhető, a
fémkomplexek
és
azok
ligandumai
is
azonosíthatók.
Az
EDTA
kromatogramjának valamennyi csúcsából vett „heart-cut” mintán elvégzett méréskor megjelentek az EDTA-ra jellemző kötések sávjai: szimmetrikus és aszimmetrikus COO-vegyértékrezgések (1800 – 1300 cm-1). (c)
A poliaminokarboxilát ligandumok 2, 3 és 4 negativ töltésű formái elválaszthatók egymástól anioncsere kromatográfiával. EDTA ligandum esetében ezek a komponenesek a koeluálódó EDTA4- / HEDTA3-, ill. a NaEDTA3-, a NaHEDTA2- és a Na2EDTA2-. Elválasztásukat az teszi lehetővé, hogy feltételezhetjük, hogy a különböző formák egymásba való átalakulásának sebessége az elválasztás időszükségletével összemérhető. Eredményünket az FTIR-ATR mérések is alátámasztják.
102
5.
A FÉM-KELÁT KOMPLEX IONOK ÉS HALOECETSAVAK SZELEKTÍV ELVÁLASZTÁSI PARAMÉTEREI TERVEZHETŐK Az átmeneti fém-kelát komplex anionokra vizsgált retenciós adatbázis alapján megállapítható, hogy a komplexek és ligandumaik szimultán analízise megvalósítható
pH = 9,0 − 11,0 és C Na2CO3 = 6,0 − 9,0mM
karbonát eluens
alkalmazásával. A retenciók szervetlen, szerves anionok < komplexképző anionos ligandumok (EDTA < DCTA) < fémkomplex anionok sorrendben adhatók meg. Haloecetsavak esetében az alkalmazott step-gradiens (NaOH / LiOH) lehetőséget ad arra, hogy a retenciók klórozott < brómozott, ill. mono- < di- < tri-halogén-ecetsav sorrendben valósuljanak meg. A kalibrációs linearitások 0,01 – 0,4 mM mintakoncentráció tartományban azonos fémion, különböző ligandum esetén R2=0,9931 CuEDTA ionra, ill. R2=0,9894 értékűek CuDCTA ionra. Hasonló koncentrációtartományban az MCA, MBA esetében R2=0,9997, ill. R2=0,9996 értékek adódtak.
103
6. Theses
The main results of dissertation are summarized in the following thesis points.
1.
SEPARATION OF HALOACETIC ACIDS AND INORGANIC ANIONS ON NDECIL-2.2.2. CRYPTAND BASED MACROCYCLIC ANION EXCHANGE ANALYTICAL COLUMN The analytical separation of haloacetic acids (monochlor-acetic acid (MCA), monobrom-acetic acid (MBA), dichlor-acetic acid (DCA), brom-chlor-acetic acid (BCA), dibrom-acetic acid (DBA), trichlor-acetic acid (TCA), monobromdichlor-acetic acid (MBDCA), monochlor-dibrom-acetic acid (MCDBA) and tribrom-acetic acid (TBA), they can’t be separated by isocratic elution was performed by gradient elution method with the presence of inorganic anions ( F − , Cl − , NO3− , Br − , SO42 − , PO43− ) on macrocyclic ion exchange phase. Due its structure the Cryptand A1 N-decil-2.2.2. column is perfectly suitable to realise the capacity gradient by changing of metal ion of eluent in the host/guest complexforming process. Since the ionic concentration of the eluent remains the same there is minor baseline distortion during the chromatographic run in this method.
2.
OPTIMIZING GRADIENT ELUTION FOR THE EFFECTIVE SEPARATION OF HALOACETIC ACIDS (a)
Based on the retention results of separations using capacity gradient of macrocyclic solid phase it was established that the wide range of haloacetic acids can also be separated with base line resolution and short retention times both with short and long retention by combination of alkaline hydroxid (LiOH, KOH, NaOH) eluents.
104
(b)
The systematical study of capacity of analytical separation column resulted that the LiOH eluent provides a very low (1,5-8 µequiv/column) capacity of the column (Li+-cryptate) by the use of KOH (K+-cryptate) it approximates to the maximum value (70-73 µequiv/column), and with NaOH eluent (Na+-cryptate) the capacity increases significantly (35-73 µequiv/column) with increase of concentration of NaOH eluent (10-3M < C < 10-1M). The system allows the selectivity control of the column capacity by the choice of eluent cation (Li, Na or K). The differences of retention times of haloacetic acids can be governed systematically by the eluent type and concentration.
(c) With the optimal values of gradient elution a gradient program was determined with the combination of eluents. In this method the time of gradient step, the type and concentration of eluent ensures optimal separation conditions. The optimal conditions were determined based on the number of recognized haloacetic compounds, time-consuming and expected resolution of the separation. The gradient method based on these experimental consideration has been optimized in which 10 mM NaOH-LiOH step gradient was performed at the 3rd minute of the separation.
3.
STUDY OF RETENTION OF METAL-CHELATE COMPLEXES ON ANION EXCHANGE COLUMN CONTAINING PELLICULARE STATIONARY PHASE (a)
Based on a systematic retention data set of transition metal (Cu, Zn, Co, Al) chelate complexes and polyamino-carboxylate ligands (EDTA, DCTA) an high performance anion chromatographic method has been developed using alkaline carbonate eluent and AS9-HC anion exchangers functionalized with alkyl-alkanol quaternary ammonium groups. An advantageous condition of the method is that the similar basic pH-range (9-11) is favourable to the stability of the metal complexes and also to their elution. The retention time of complex components was determined as a function of eluent composition and pH of mobile phase.
(b) By the change of eluent parameters it was established that increasing the total concentration of eluent system results decreasing of retention times. Increasing in pH leads to a decrease in retention, because the predominant form of eluent is
105
the divalent carbonate. The optimal separation conditions of eluent were determined (9,44 < pH <11,03, C = 9,0 mM for copper chelates (Cu-EDTA CuDCTA), C = 8,0 mM for zinc chelates (Zn-EDTA, Zn-DCTA)). To the separation of chelate ions with smaller resolution (ZnEDTA2-, ZnDCTA2-) with high rate of hydrogencarbonate in the eluent is necessary because the elution power of hydrogencarbonate is smaller than that of carbonate.
4.
THE SIMULTANEOUS SEPARATION OF POLYAMINO-CARBOXYLATE ANIONS, INORGANIC ANIONS AND TRANSITION METAL CATIONS CAN BE REALIZED (a)
Designated retention interval of the IC column effluent was collected and used to further ICP analysis. Collection protocols for the heart-cutting procedure were applied in the analysis of Cu and Zn containing peaks Aliquots of these fractions of CuEDTA/CuDCTA and ZnEDTA/ZnDCTA peaks were identified and confirmed the retention order by ICP spectroscopy.
(b)
The peaks of free ligands, EDTA were also identified from the effluent at the appropriate retention interval, using FTIR-ATR spectroscopy method. The symmetric and asymmetric COO-valence vibrations (1800-1300
cm-1)
characterizing the EDTA ligands can be followed on the IR spectra. Our experiments verify that the simultaneous separation of anionic ligands and metal chelate complexes can be achieved, and subsequently detected. (c)
The di-, tri-, and tetravalent negative charged forms of polyamino-carboxylate ligands can be separated by anion exchange chromatography. In the case of EDTA ligand these components are the coeluated EDTA4- / EDTA3-, the NaEDTA3-, the NaHEDTA2- and the Na2EDTA2-. This is possible because the rate of interconversion is slow relative to the time of development of the chromatogram. The FTIR-ATR measurements also confirm these results.
106
5.
THE PARAMETERS OF SELECTIVE SEPARATION OF METAL-CHELATE COMPLEXES AND HALOACETIC ACIDS CAN BE PLANNED Based on the retention data of transition metal-chelate complex anions can be established that the simultaneous separations of inorganic anions and complex metalions can be achieved using pH = 9,0 − 11,0 and C Na2CO3 = 6,0 − 9,0mM carbonate eluent. The retentions can be provided in order of inorganic, organic anions < anionic chelate ligands (EDTA < DCTA) < metal chelate complex anions. In the case of haloacetic acids the employed step-gradient (NaOH / LiOH) allows that the retentions are realized in order of chloro < bromo, mono< di- < tri-halogenated acetic acid. The calibration linearities in the range of 0,01 – 0,4 mM sample concentration in the case of the same metal ion, but different ligand R2=0,9931 for CuEDTA ion, R2=0,9894 for CuDCTA ion, respectively. In the same concentration range R2=0,9997, R2=0,9996 are for MCA and MBA.
107
7. Az eredmények hasznosítása
(a)
Analitikai
elválasztási
módszerek
kidolgozása
és
alkalmazása
kondenzátor
elektrolitoldatok kémiai komponenseinek vizsgálatára, GVOP-3.1.1., 2005.02.01. – 2007.07.31. (Alprogramvezető: Dr. Hajós Péter) (b)
Developments of analytical separation methods for environmental pollutants using
selective polymer materials. Italian–Hungarian S&T Programme I-22/03, 2004-2007 (Programvezető: Dr. Hajós Péter)
108
Irodalomjegyzék [1] Willard, H. H.; Merrit, L. L. Jr.; Dean, J. A.: Instrumental methods of analysis, D. van Nostrad: New York, 1974. 781-790. [2] L. R. Snyder, J. J. Kirkland: Bevezetés az intenzív folyadékkromatográfiába, Műszaki Könyvkiadó, Budapest 1979. 21-144. [3] Weiss, J.: Handbuch der Ionenchromatographie, Dionex, Wiley-VCH, Weinnheim,1985 [4] de Kőrösy, F., Shorr, J.; Dechema Monograph 47 (1962) 474-791. [5] Fritz, J. S., Gjerde, D. T., Pohlandt, C.: Ion Chromatography, Dr. Alfred Hüthig Verlag, Heidelberg 1982 26-123. [6] McNaught, A. D., Wilkinson, A., Eds., Compendium of Chemical Terminology, International Union of Pure and Applied Chemistry, 2nd ed., 1997 [7] Harvey, D., Modern Analytical Chemistry, DePauw University, McGraw-Hill Higher Education, 2000 [8]
Kremmer, T., Torkos, K.: Elválasztástechnikai módszerek elmélete és gyakorlata, Akadémiai Kiadó, Budapest, 2010.
[9] Craig, L. C., J. Biol. Chem.; 155 (1944) 984. [10] Snyder, L. R., Elsevier, Amsterdam, 1992; Vol. 51A of Journal of Chromatography Library; chapter 1, pages A2-A65; 1st ed. [11] Hajós, P.: J. Chromatogr. A 789 (1997) 141-148. [12] Hajós, P., Horváth, K., Conca, R.; Chromatographia 56 (2002) 103-107. [13] Olajos, M.: Fehérjék glikozilációjának nyomon követése és peptidek analitikai elválasztásának vizsgálata kapilláris elektroforetikus módszerekkel, Doktori (PhD) értekezés, Pannon Egyetem, 2010. [14] Inczédy János: Folyamatos és automatikus analízis, Műszaki könyvkiadó, Budapest, 1984. 22-51. [15] Okada, T., Kuwamoto, T.; J. Chromatogr., 284 (1984) 149-156. [16] Gjerde, D. T., Fritz, J. S.; Anal. Chem. 53 (1981) 2324-2327.
109
[17] Horváth, K.: Kémiai egyensúlyi és kinetikai kölcsönhatások leírása, alkalmazása az ioncsere-kromatográfiában, Doktori (PhD) értekezés, Pannon Egyetem, 2007. [18] Woodruff, A., Pohl, C. A., Bordunov, A., Avdalovic, N.; J. Chromatogr. A, 956 (2002) 35-41. [19] Hajós, P., Horváth, O., Denke, V.; Anal. Chem. 67 (1995) 434-441. [20] Gennaro, M. C.; J. Chromatogr., 449 (1988) 103-113. [21] Bruzzoniti, M. C., Mentasti, E., Sarzanini, C., Hajós, P.; J. Chromatogr. 770 (1997) 1322. [22] Révész, G., Hajós, P., Csiszár, H.; J. Chromatogr. 753 (1996) 253-260. [23] Hajós, P., Nagy, L.; J. Chromatogr. B, 717 (1998) 27-38. [24] Bruzzoniti, M. C., Mentasti, E., Sarzanini, C.; Analytica Chimica Acta 382 (1999) 291299. [25] Weinberg, H., Anal. Chem. News Features 71 (1999) 801A [26] Hinckley, A.F., Bachand, A. M., Reif, J. S.; Environmental Health Perspectives 113 (12) (2005) 1808-1813. [27] King, W. D., Dodds, L., Allen, A. C., Armson, B. A., Fell, D., Nimrod, C.; Occupational and Environmental Medicine 62 (2) (2005) 124-127. [28] Kuhn, R., Pattard, M.; Water Res. 24 (1990) 31. [29] Eaton, A. D., Clesceri, L. S., Greenburg, A. E.; (Eds.), Standard method 6251B, Disinfection by-products: haloacetic acids and trichlorophenol, micro liquid-liquid extraction gc method, in: Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater, 19th ed., 1995 [30] Much, D. J., Munch, J. W., Pawlecki, A. M.; EPA method 552.2, Revision 1.0, Determination of haloacetic acids and dalapon in drinking water by liquid-liquid extraction, derivatization and gas chromatography with electron capture detection, in: Methods for the Determination of Organic Compounds in Drinking Water, EPA/600/R95/131 (Suppl. III), 1995 [31] Domino, M. M., Pepich, B. V., Munch, D. J., Fair, P. S.; J. Chromatogr. A 1035 (2004) 9. [32] Hashimoto, S., Otsuki, A.; J. High Resolut. Chromatogr. 21 (1998) 55. 110
[33] Loos, R., Barcelò, D.; J. Chromatogr. A 938 (2001) 45. [34] Magnuson, M. L., Kelty, C. A.; Anal. Chem. 72 (2000) 2308. [35] Paull, B., Barron, L.; J. Chromatogr. A, 1046 (2004) 1-9. [36] Nair, L. M., Saari-Nordhaus, R., Anderson, J. M.; J. Chromatogr. A 671 (1994) 309. [37] Lopez-Avila, V., Liu, Y., Charan, C.; J. AOAC Int. 82 (1999) 689. [38] Sarzanini, C., Bruzzoniti, M. C., Mentasti, E.; J. Chromatogr. A 850 (1999) 197. [39] Liu, Y., Mou, S.; J. Chromatogr. A 997 (2003) 225. [40] Bruzzoniti, M. C., De Carlo, R. M., Horváth, K., Perrachon, D., Prelle, A., Tófalvi, R., Sarzanini, C., Hajós, P.; J. Chromatogr. A, 1187 (2008) 188-196. [41] Roehl, R., Slingsby, R., Avdalovic, N., Jackson, P. E.; J. Chromatogr. A 956 (2002) 245. [42] Takino, M., Daishima, S., Yamaguchi, K.; Analyst 125 (2001) 1097. [43] Liu, Y. J., Mou, S.; Chemosphere 55 (9) (2004) 1253-1258. [44] Liu, Y., Mou, S., Chen, D.; J. Chromatogr. A 1039 (2004) 89. [45] Barron, L., Nesterenko, P. N., Paull, B.; J. Chromatogr. A 1072 (2005) 207. [46] Barron, L., Paull, B.; Talanta 69 (2006) 621. [47] Product Manual IonPac AS24, Document no. 065163, Revision 01, June 2007 http://www.dionex.com [48] Ali, I., Aboul-Enein, H. Y.: Instrumental Methods in Metal Ion Speciation, Chromatographic Science Series; Taylor & Francis Group, 2006, 1-16. [49] Sóvágó, I., Farkas, E.; Magyar Kémiai Folyóirat – Kémiai Közlemények 117 (2011) 2.-3. 89-95. [50] Hajós, P., Révész, G., Horváth, O., Peear, J., Sarzanini, C.; J. Chromatogr. Science, Volume 34, Issue 6 (1996) 291-299. [51] García-Fernández, R., García-Alonso, J. I., Sanz-Medel, A.; J. Chromatogr. A, 1033 (2004) 127-133. [52] Dodi, A., Bouscarel, M.; LC/GC Europe October 2006 Vol 19 Number 10 542-550. [53] Laine, P., Matilainen, R.; Anal. Bioanal. Chem. 382 (2005) 1601-1609.
111
[54] Seubert, A., Nette, D., Knoell, J., IICS 2009 Dublin [55] Bedsworth, W. W., Sedlak, D. L.; J. Chromatogr. A, 905 (2001) 157-162. [56] Nowack, B., Environmental Science & Technology 36 (19) (2002) 4009-4016 [57] Kovács, A., Nemcsok, D. S., Kocsis, T., J.; Molecular Structure: Theochem 950 (2010) 93-97. [58] Collins, R. N., Onisko, B. C., McLaughlin, M. J., Merrington, G.; Environ. Sci. Technol. 2001, 35, 2589-2593. [59] Quintana, J. B., Reemtsma, T.; J. Chromatogr. A, 1145 (2007) 110-117. [60] Beck, M. T., Nagypál, I.; Chemistry of Complex Equilibria, John Wiley & Sons, New York, 1990 [61] Hotta, H., Mori, T., Takahashi, A., Kogure, Y., Johno, K., Umemura, T., Tsunoda, K.; Anal. Chem., 81 (15) (2009) 6357-6363. [62] Vorster, C., van der Walt, T. N., Coetzee, P. P.; Anal. Bioanal. Chem. 392 (2008) 287296. [63] Gautier, E. A., Gettar, R. T., Servant, R. E., Batistoni, D. A.; J. Chromatogr. A, 706 (1995) 115-119. [64] Haddad, P. R., Jackson, P. E., J. Chromatogr. Library, Vol 46, Ion Chromatography, Principles and applications, 1990 [65] Inczédy, J.: Analytical Applications of Complex Equilibria, Akadémiai Kiadó, Budapest, 1976. [66] Hajós, P., Révész, G., Sarzanini, C., Sacchero, G., Mentasti, E.; J. Chromatogr. 640 (1993) 15-25. [67] Hajós, P., Horváth, O., Révész, G.; Ion Chromatography Theory and Applications, Advanced in Chromatography, Vol. 39. Marcel Dekker Inc., New York, 1998. [68] Krokhin, O. V., Adamov, A. V., Hoshino, H., Shpigun, O. A., Yotsuyanagi, T.; J. Chromatogr. A, 850 (1999) 269-276. [69] Shcheglova, N. V., Popova, T. V.; Russian Journal of Physical Chemistry A, 82 (6) (2008) 920-923. [70] Baron, D., Hering, J. G.; J. Environ. Qual. 27 (1998) 844-850.
112
[71] Dodi, A., Monnier, V.; J. Chromatogr. A, 1032 (2004) 87-92. [72] Keller, R. A., Giddings, J. C.; J. Chromatogr. 3 (1960) 205-220. [73] Trapp, O., Schurig, V.; J. Chromatogr. A 911 (2001) 167-175. [74] Barron, L., Paull, B.; J. Chromatogr. A 1047 (2004) 205. [75] Bruzzoniti, M. C., Hajós, P., Horváth, K., Sarzanini, C.; Acta Chim. Slov. 54 (2007) 14. [76] Dionex: Columns: IonPac Cryptand A1 Anion-Exchange Column, www.dionex.com [77] Barron, L., Paull, B.; Chim. Acta 522 (2004) 153. [78] Felinger, A., Data Analysis and Signal Processing in Chromatography, Vol. 21 of Data Handling in Science and Technology, Elsevier, Amsterdam, 1998 [79] Botts, J., Chashnin, A., Young, H. L.; Biochemistry, 4 (1965) 1788 [80] Botts, J., Anderegg, G.; Critical Survey of Stability Constants of EDTA Complexes, IUPAC Chemical Data Series No. 14, Pergamon Press, Frankfurt, 1977
113
Köszönetnyilvánítás Köszönettel tartozom témavezetőmnek, Dr. Hajós Péter egyetemi docensnek (Analitikai Kémia Intézeti Tanszék) a támogatásáért, munkám segítéséért. Dr. Horváth Krisztián adjunktusnak (Analitikai Kémia Intézeti Tanszék) a sok szakmai segítségért. Köszönöm Dr. Halmos Pál tudományos főmunkatársnak (Pannon Egyetem) az atomspektroszkópiás méréseket és Dr. Mihály Judithnak (MTA Központi Kémiai Kutató Intézet) az FTIR spektroszkópiás vizsgálatokat. Köszönöm Dr. Kiss Gyula, az MTA doktora korrekciós észrevételeit a dolgozat szerkesztésére, nyelvezetére vonatkozóan. Köszönöm továbbá az ebben a témakörben TDK keretében dolgozó Sepsey Annamária diplomázó egyetemi hallgatónak, hogy munkámat segítette. Köszönettel tartozom az Analitikai Kémia Intézeti Tanszék valamennyi dolgozójának munkám segítéséért. Köszönöm az Országos Tudományos Kutatási Alapprogramok (OTKA K 81843), valamint Magyarország és az Európai Unió Társadalmi Megújulás Operatív Programjának TÁMOP-4.2.1/B-09/1/KONV-2010-0003 és a “Mobilitás és környezet” TÁMOP-4.2.2/B anyagi és infrastrukturális támogatását.
114
