INZULÍN: CHEMIE A CHEMICI V JEHO HISTORII

diabetologie

INZULÍN: CHEMIE A CHEMICI V JEHO HISTORII CHEMISTRY AND CHEMISTS IN THE STORY OF INSULIN VLADIMÍR PLISKA, GERD FOLKERS Collegium Helveticum, Eidg. Technische Hochschule (ETH) Zürich & Universität Zürich SOUHRN Prvá léková forma inzulínu extrahovaného z hovězích a vepřových pankreatů byla ke klinickému použití k dispozici počátkem 20. let minulého století. Prvé snahy identifikovat inzulín jako chemickou substanci počínají vzápětí nato – zjištěním jeho peptidické povahy a krystalizací inzulínu z tkáňových extraktů v polovině stejného desítiletí. Objev a zavedení chromatografického dělení do laboratorní praxe ve 40.–50. létech umožnily Fredericku Sangerovi získat dostatečné množství čisté substance a určit počátkem padesátých let aminokyselinovou sekvenci hovězího inzulínu. Na ni navazující krystalografická (rentgenologická) studie v londýnské laboratoři Dorothy Hodgkin objasnila počátkem 60. let jeho prostorovou strukturu. V 60. letech byly pak publikovány prvé syntézy inzulínu, v roce 1974 pak totální syntéza inzulínu lidského, jehož klinické testy vzápětí následovaly. Náročnost syntéz však téměř vylučovala rutinní produkci lékových forem. Nadto se v tomto období rýsoval problém nedostatku inzulínu již kolem roku 1995. Problém byl vyřešen zavedením rekombinantních genových technologií, prvé z nich roku 1978 kalifornskou firmou Genentech. V následujících letech byly touto cestou připraveny analogy inzulínu s rozdílným farmakokinetickým spektrem, poskytující diabetologům možnost volby optimální, pro jednotlivé diabetiky individualizované substituční terapie. Klíčová slova: inzulín, vasopressin, du Vigneaud Vincent, Sanger Frederick, diabetes mellitus, proinsulin, rekombinantní DNA technologie; inzulín-analoga s prodlouženým účinkem, Aspart, Lispro, Detemir, Glargine, Hagedorn-inzulín SUMMARY First therapeutic form of insulin isolated from bovine or porcine pancreatic tissue was available for clinical use in early twenties of the last century. First attempts to identify insulin as chemical entity started shortly afterwards, by assessment of its peptide nature and by crystallization of insulin from tissue extracts (1925–1927). Discovery of chromatographic distribution technique and its introduction into the laboratory practice in 1940s and 1950s yielded sufficient amount of pure substance used by Frederick Sanger and his group for amino acid sequence determination of bovine insulin in early 1950s. Subsequent X-ray dispersion analysis in the laboratory of Dorothy Hodgkin clarified its 3D-conformation. Then, first attempts to synthesize animal insulins (and properly combine six subsistent SH-groups into the three disulphide bonds) started in 1960s. Total synthesis of human insulin was accomplished in 1974, followed by its clinical trials. Due to its arduous character, total synthesis of insulin (as any other longer peptide) is indeed not a suitable way for its up-scaling production. Moreover, already in nineteen seventies appeared the oncoming logistic problem of insufficient insulin supply around 1995. The problem was solved by introduction of recombinant DNA technology, first used for insulin synthesis by Californian company Genentech in 1978. In the following years, several structural analogs of insulin with different pharmacokinetic features (in particular prolonged action) were prepared; they enable diabetologists to propose a specific individual therapy for each diabetic patient. Key words: insulin, vasopressin, du Vigneaud Vincent, Sanger Frederick, diabetes mellitus, proinsulin, recombinant DNA technology, insulin analogs with prolonged action, Aspart, Lispro, Detemir, Glargine, Hagedorn-insulin

INZULÍN

JAKO

IDENTIFIKOVANÁ LÁTKA PO PADESÁTI LETECH

Prvé období historie inzulínu, jehož nespornými protagonisty byli Frederick G. Banting, Charles H. Best1, John J. R. Macleod a James B. Collip, bylo zakončeno průmyslovou přípravou vysoce účinného antidiabetického preparátu firmou Eli Lilly, Indianopilis – především zásluhou ředitele jejího výzkumu George H. A. Clowese. To bylo předmětem našeho

předcházejícího sdělení (Pliska, 2010). Jeho proteinový charakter byl z empirické zkušenosti zúčastněných chemiků přinejmenším předpokládán. Mostem k období dalšímu, které později uzavřela identifikace molekulární struktury inzulínu a jeho syntéza, byla krystalizace inzulínu, které v letech 1924–1927 dosáhli J. J. Abel, E. M. K. Geiling a jejich spolupracovníci na Johns Hopkins University v  Baltimore (Abel et al., 1927). Z elementární analýzy krystalů pak poprvé dospěli k souhrnnému (atomovému) vzorci inzulínu; tato jejich

1

V „souhrnu“ prvého sdělení (Pliska, 2010) je Bestovo křestní jméno nesprávně uvedeno jako „Georg“. Za toto přehlédnutí se autor omlouvá.

DMEV • ROČNÍK 15 • 2012 • ČÍSLO 2

111

diabetologie analýza dnes překvapuje svojí relativní přesností, především pokud jde o určení počtu dusíkových atomů:

analýza autorů vztažená na 1 atom síry C45H69N11O14S přepočet analýzy na 6 atomů síry

mol. hmotnost 1020,165

C270H414N66O84S6

6120,99

syntetický vepřový inzulín

C256H381N65O76S6

5777,55

syntetický hovězí inzulín

C254H377N65O75S6

5733,50

dnešní stav:

Teprve pozdější studie prokázaly ve všech izolovaných inzulínových preparátech přítomnost zinku (mezi 0,45–0,9 %), který byl zcela jistě obsažen i v Abelových a Geilingových krystalech. Elementární analýza polymerů nemá ovšem, pokud jde o určení jejich složení či čistoty získaných preparátů, téměř žádnou průkaznou hodnotu. Ve dvacátých letech však sotva existovala jiná metoda k určení základních chemických vlastností. Nicméně vede přepočet molekulových vah Abelova a Geilingova preparátu a stechiometrických poměrů prvých čtyř prvků na zinku prostý inzulín přibližně k hodnotám pro syntetický vepřový inzulín: získané krystaly obsahovaly tedy pravděpodobně již velmi čistý inzulín.2 Jeho chemická povaha však zůstávala nadále neznámá. Bylo zřejmé jen to, že jde o látku obsahující síru, podobnou proteinům, a že její molekulová hmotnost je poměrně malá (počet atomů síry byl určen až mnohem později). Z těchto důvodů se dostala do ohniska zájmu chemiků studujících peptidy. Již na začátku 50. let 20. století měla chemie bílkovin solidní základy. Bylo známo, že molekuly bílkovin pozůstávají ze zřetězených aminokyselin a že se v  těchto řetězcích vyskytuje dvacet různých aminokyselin. Na konci 40. let zavedl Archer John Porter Martin (1910–2002) a Richard Laurence Millington Synge (1914–1994) dělení látek ve směsi pomocí chromatografie na pevných nosičích. Ta pak velmi urychlila jejich získávání v  čistém stavu a později i studium jejich aminokyselinového složení (Gordon et al., 1943). Oba Angličané, kteří za tento objev v roce 1952 získali Nobelovu cenu za chemii, využili rozdílů dělení jednotlivých látek ve směsi mezi polárními (voda) a nepolárními (zpravidla organickými, ve vodě málo rozpustnými) rozpouštědly k  dělení na pevném nosiči, např. celulóze nebo silikagelu. Takto oddělené bílkoviny mohly pak být v slabých kyselinách či zásadách rozštěpeny na jednotlivé aminokyseliny; jejich identifikace následovala chromatografií na papíře. Pořadí aminokyselin v bílkovině nebo peptidu3 pomocí této metody však přímo a rychle určeno být nemohlo. Zhruba od konce 2. světové války byly v popředí zájmu dva takové peptidové hormony: hormony neurohypofýzy – oxytocin a vasopresin – v laboratoři Vincenta du Vigneauda (1901–1978) na Rockefellerově institutu v  New Yorku, a inzulín v  týmu Fredericka Sangera (*1918) na univerzitě v  Cambridgi (Anglie). Obě skupiny kombinovaly zavedené experimentální metody a pokoušely se, tehdy ještě velmi

zdlouhavými postupy, určit struktury těchto substancí. Jednou z  metod byla již zmíněná chromatografie na papíře nebo na škrobovém nosiči. Další metodou byl čisticí proces, který spočíval na stejném fyzikálním principu jako chromatografie, umožňoval však oddělení a izolaci látek pomocí vícestupňové dělicí procedury mezi dvěma tekutými fázemi – takzvané protiproudné dělení (counter-current distribution). Tuto průkopnickou metodu zavedl kolem roku 1950 Lyman Creighton Craig (1906–1974); mezi chemiky, zvláště peptidovými, je pro proces protiproudného dělení stále vžitý pojem „craigování“ (Craig et al., 1950; Craig, 1952). Významný krok ve studiu proteinových sekvencí učinil Frederick Sanger. Navrhl a syntetizoval jednoduchou sloučeninu, která se v  alkalických podmínkách váže na aminokyselinu takzvaného N-konce bílkoviny (tam, kde se vyskytuje volná aminoskupina): 1-fluoro-2,4-dinitrobenzol (dinitrofluorobenzen, DNFB), známou dnes jako Sangerovo činidlo (Sanger, 1945) (obr. 1). Štěpí-li se pak peptid (v  kyselém prostředí) na jednotlivé aminokyseliny, zůstává tato „značkovací“ molekula (označovaná jako „marker“) vázána na N-koncovou aminokyselinu a její žluté zabarvení ji umožňuje na chromatogramu okamžitě identifikovat. V roce 1954 se du Vigneaudovi podařilo tímto způsobem chemicky objasnit strukturu obou zmíněných hypofyzárních hormonů a potvrdit jejich složení zpětným procesem – tzv. totální syntézou. O roku později, v roce 1955, obdržel Nobelovu cenu za chemii – „for the first synthesis for a polypeptide hormone“, jak zní v laudatiu Výboru pro Nobelovu cenu. Oxytocin a vasopresin jsou ovšem spíše jednodušší peptidy: jejich molekuly obsahují devět aminokyselin. Inzulín byl pro chemiky náročnější výzvou. Brzy se totiž zjistilo, že se jeho molekula skládá ze dvou peptidových řetězců spojených disulfidovými můstky. Oba řetězce lze od sebe celkem snadno oddělit mírnou oxidací a analyzovat je odděleně. Rychle se zjistilo, že kratší řetězec A (dříve nazývaný glycinový řetězec) se skládá z  21 aminokyselin, delší řetězec B (fenylalaninový řetězec) ze 30 aminokyselin. To bylo východisko pro práce Fredericka Sangera. Sanger a jeho spolupracovníci nejprve označili N-terminální aminokyseliny obou izolovaných řetězců Sangerovým činidlem a pak je buď pomocí kyseliny, nebo enzymů (trypsin, chymotrypsin, papain) štěpili na menší části. Podle podmínek procedury štěpení získali buď jednotlivé aminokyseliny, nebo kratší peptidy. Ty byly potom chromatograficky rozděleny a dále zkoumány. Pokud se jednalo o aminokyseliny, mohly být určeny už na základě své pozice na chromatografickém papíru. Peptidy musely být opět přeneseny do roztoku a podrobeny téže proceduře značení a štěpení. Nakonec se dospělo k velkému počtu parciálních sekvencí, které představovaly kaménky v mozaice úplné struktury. Dále bylo nutno určit, kde dochází k  překryvu těchto jednotlivých peptidových sekvencí (tehdy ještě vizuálně a  subjektivně, dnes pomocí počítačových programů) a – při troše štěstí – se tak podařilo sestavit sekvenci aminokyselin v obou inzulínových řetězcích; šlo o jakousi „dominovou“ strategii. Analýza sama byla geniální myšlenka, vyžadovala však mnoho namáhavé chemické práce.

2

Krystalografická studie bezzinečnatého inzulínu byla uveřejněna později (Dodson et al., 1978). Peptid: protein s kratším aminokyselinovým řetězcem.

3

112

DMEV • ROČNÍK 15 • 2012 • ČÍSLO 2

diabetologie

Obr. 1: Značení N-terminální aminoskupiny Sangerovým činidlem (1-fluoro-2,4-dinitrobenzol, DNFB).

Ve své nobelovské přednášce se Sanger zmínil, že struktura mohla být objasněna v relativně krátkém čase jen díky spolupráci s významným vídeňským biochemikem a pozdějším profesorem biochemie ve Vídni Hansem Tuppym4 (*1924), který v 50. letech hostoval v Sangerově laboratoři v Cambridgi. Výsledkem této spolupráce byly v roce 1951 dvě publikace v The Biochemical Journal o struktuře inzulinového B-řetězce (Sanger et al., 1951; Sanger et al., 1951). Kratší řetězec A byl zveřejněn o rok později v tomtéž časopise (Sanger et al., 1953; Sanger et al., 1953). Tím však nebyla struktura definitivně objasněna: základní struktury dvou aminokyselin se totiž vyskytují ve dvou formách odlišujících se jen amidovou skupinou.5 Tyto amidové skupiny se při kyselé hydrolýze štěpí a obě formy nelze tudíž rozlišit. Jejich analýzu v  Cambridgi bylo nutno provést pomocí komplikované techniky enzymatického štěpení a dělení substancí na základě jejich elektrického náboje (elektroforéza). K  úplné identifikaci stavby inzulínové molekuly zbývalo ještě identifikovat pozici obou disulfidových můstků mezi řetězci a pozici jednoho můstku (tzv. intramolekulárního) v  řetězci A. Disulfidové můstky se nacházejí mezi dvěma cysteinovými molekulami. Řetězec A obsahuje čtyři cysteiny, řetězec B dva. Z  jednoduchého výpočtu vyplývá, že by bylo možno očekávat nejméně 72 různých kombinací dvou externích (mezi řetězci) a jednoho vnitřního můstku (uprostřed řetězce A). Rovněž tento úkol vyřešil Sanger a jeho tým před více než padesáti lety, v roce 1955 (Ryle et al., 1955). Aminokyselinová sekvence hovězího inzulínu, ve srovnání s později identifikovanými sekvencemi vepřového a lidského inzulínu, je znázorněna na obr. 2. O tři roky později obdržel Frederick Sanger svou první Nobelovu cenu za chemii – „for his work on the structure of

proteins, especially that of insulin“, jak zní laudatio Nobelovy komise. Určení pořadí aminokyselin v bílkovině je dnes podstatně rychlejší: Pehr Victor Edman (1916–1977) objevil na začátku 50. let jednoduchou metodu postupného odštěpování N-terminálních aminokyselin (Edman, 1950), kterou automatizoval v roce 1967 spolu se svým technikem Geoffrey S. Beggem. Obtížné analýzy řetězce A a B, které musel provádět Frederick Sanger se svými četnými spolupracovníky (a byla to práce na celá léta), by se nyní pravděpodobně daly uskutečnit během několika dnů či týdnů. V současnosti se zpravidla struktura bílkovin určuje nepřímo ze sekvence kódující DNA či příslušné RNA; určení sekvence sestávající ze čtyř DNA nukleotidů (basí) je jednodušší než určení pořadí aminokyselin v bílkovinách z dvaceti různých možných aminokyselin. K  tomu rovněž velice přispěl Frederick Sanger: vypracoval metodu studia sekvence DNA – opět geniálně vymyšlenou – a obdržel za to spolu s Walterem Gilbertem (*1932) v roce 1980 svou druhou Nobelovu cenu za chemii. Bez Sangerovy metody by se dnešní molekulární genetika sotva mohla rozvinout a dostat se v  tak krátkém čase na současnou úroveň. Další Nobelovou cenou za chemii inzulínu byla v  roce 1964 oceněna Angličanka Dorothy Mary Crowfoot Hodgkin (1910–1994): navrhla na podkladě roentgenové analýzy mimo jiné též prostorovou strukturu inzulínu. Nobelovu cenu obdržela „for her determinations by X-ray techniques of the structures of important biochemical substances“ za chemii. Pro studium biologických účinků inzulínu, jeho interakce s  receptory a pro syntézu jeho terapeuticky výhodných analogů má – a v  budoucnu patrně bude mít ve zvýšené míře – její práce zásadní význam.

4

Hans Tuppy (*1924) byl v letech 1963–1994 profesorem biochemie na lékařské fakultě vídeňské univerzity. V letech 1987–1989 byl rakouským ministrem pro vědu a výzkum ve vládě spolkového kancléře F. Vranitzkyho. Vedle práce na inzulínu vynikl také pracemi o určení struktury hormonu oxytocinu ve stejném roce jako V. du Vigneaud a o biochemii tzv. sérové oxytocinázy (enzymu inaktivujícího oxytocin v průběhu nepatologického těhotenství). 5 Jedná se o kyselinu asparagovou – asparagin a kyselinu glutamovou – glutamin. DMEV • ROČNÍK 15 • 2012 • ČÍSLO 2

113

diabetologie

Obr. 2: Struktura hovězího inzulínu a srovnání aminokyselinových sekvencí (aminokyseliny v jednopísmenných symbolech) hovězího, vepřového a lidského inzulínu. Rozdíly jsou v pozicích A8, A10 a B30 (nomenklatura: srov. tab. 1, pozn. b). Jednotlivé struktury vykazují vysoký stupeň strukturní homologie. Amidové skupiny glutaminu a asparaginu jsou označeny tmavými body.

SYNTETICKÝ

INZULÍN

Po určení struktury inzulínu bylo možné uvažovat o jeho syntetické přípravě a zvláště o přípravě lidského inzulínu, který do té doby nebyl pro kliniky k dispozici; nezapomínejme, že veškeré jeho preparáty obsahovaly inzulín izolovaný ze zvířecích tkání, jehož řetězce vykazují menší mezidruhové rozdíly. V  nepříznivém případě by takové strukturní rozdíly mohly vést k různým adverzním reakcím (inaktivace inzulínu vytvořenými protilátkami, alergická reakce), o kterých bylo již v literatuře referováno.6 Nadto stoupající potřebu inzulínu by už nebylo možno zhruba od poloviny devadesátých let minulého století krýt pouze z dosavadních zdrojů – pankreatické tkáně jatečních zvířat. Přestože obtížná cesta k  úplné syntéze peptidů byla už poněkud urovnána syntézou nonapeptidů vasopresinu a oxytocinu, syntéza podstatně delšího inzulínu představovala další nelehký úkol. Obtížného úkolu se hned na konci padesátých let ujaly dvě skupiny: jednu z nich vedl Panayotis G. Katsoyannis (*1924) v Pittsburghu v Pensylvánii (Katsoyannis, 1964; Katsoyannis, 1966), druhou Helmut Gustav Zahn (1916–2004) v  Cáchách (Zahn et al., 1965). Oba syntetizovali dva inzulínové řetězce počátkem 60. let. Získali po celkem více než 220 (!) krocích syntézy a kombinace obou řetězců preparáty, které obsahovaly asi 0,5 až 1 procento aktivního inzulínu.7 Problém spočíval ve správném uzavření disulfidických můstků v posledním stupni oxidace, jelikož kontrola spojení obou řetězců při použité metodě nebyla možná. Jak už bylo zmíněno, existuje zhruba 72 kombinací pro navázání dvou řetězců, z nichž některé mohou ovšem vykazovat větší

pravděpodobnost. Patrně však jen zlomek z nich (případně jen jedna) je biologicky aktivní. Také dva řetězce A nebo dva řetězce B se mohou navzájem vázat a z toho vyplývá dalších 76 kombinací (72 pro řetězec A, 4 pro B). Vedle toho existují ještě další možnosti zřetězení, takže biologická aktivity prvých syntetických preparátů – kolem jednoho procenta aktivity izolovaného inzulínu – byla vlastně nečekaně vysoká. Pro průmyslovou výrobu inzulínu toto ovšem nedostačovalo. Volbou podmínek při reakci bylo možné v příštích letech aktivitu preparátů stupňovat, takže v roce 1966 už Katsoyannisova skupina dosáhla 60–80 procentní biologické aktivity. Z tohoto produktu bylo možno získávat krystalický syntetický inzulín. Ještě účinnější syntézu inzulínu pak umožnily dvě další inovace. Jedna spočívala v  možnosti syntetizovat nejprve příslušné krátké sekvence kolem disulfidových můstků a  syntetizovat k  nim oba řetězce zároveň – tedy nikoli odděleně, jako tomu bylo dříve. Takto provedenou totální syntézou lidského inzulínu získali v roce 1974 bazilejští chemici firmy Ciba-Geigy AG (Sieber et al., 1974) prakticky čistý lidský inzulín.8 Dalším zjednodušením bylo zavedením automatizované syntézy peptidů na pevném nosiči – umělé pryskyřici, které umožnilo kontinuální syntézu peptidového řetězce bez pracných mezistupňů při čištění jednotlivých meziproduktů. Základ této metody vyvinul v 60. letech Robert Bruce Merrifield (1921–2006) a v  roce 1966 jej využil spolu s A. Marglinem k syntéze hovězího inzulínu (Merrifield et al., 1966). Toto zlepšení teprve umožnilo rutinní syntézu peptidů s vysokou molekulární hmotností. Bruce Merrifield za něj obdržel v roce 1984 Nobelovu cenu za chemii.

6

Viz např. http://www.immunocapinvitrosight.com/dia_templates/ImmunoCAP/Allergen____28558.aspx V prvém případě se jednalo o ovčí, v druhém o lidský inzulín. 8 To rozpoutalo diskuzi o terapeutické využitelnosti lidského inzulínu. Lidský inzulín byl aktivnější než dosud používané preparáty zvířecího inzulínu, což u diabetiků, kteří si běžně inzulín aplikují sami, zpočátku působilo problémy, dnes již překonané. Hovořilo se také o problémech při přechodu od prasečího k lidskému inzulínu. Zato však bylo zamezeno nebezpečí imunitní reakce (i když klinicky velice vzácné) na druhově rozdílný inzulín, který pro člověka představuje cizí látku. 7

114

DMEV • ROČNÍK 15 • 2012 • ČÍSLO 2

diabetologie

Obr. 3: US produkce inzulínu z jatečních prasat (od r. 1982 možná produkce, v reálné produkci však již postupně nahrazovaná rekombinantní technologií; plná čára) a jeho stoupající potřeba (přerušovaná čára) v biliónech inzulínových jednotek. Data: A Study of Insulin Supply and Demand, NIH 1976, E. Ehlers: Beiträge der Biotechnologie zur Therapie des Diabetes mellitus (2009). http://dev.gdch.de/strukturen/sec/tagung/ehlers.pdf

V  zásadě byla nyní průmyslová výroba inzulínu možná, byla však drahá a náročná. Ciba-Geigy proto využívala své patenty na syntézu jen na produkci malých množství látky. Průlomem pak bylo zavedení genových technologií do farmaceutického průmyslu.

GENOVÉ

TECHNOLOGIE A VÝROBA INZULÍNU

Jak bylo uvedeno, výroba inzulínu ze zvířecích zdrojů se setkávala už v polovině 70. let 20. století s nesnázemi souvisejícími s nedostačujícími zdroji výchozího materiálu. Jediný pacient může být léčen po dobu deseti dní dávkou prasečího inzulínu, který se ještě nedávno jevil jako terapeuticky nejvhodnější, z pankreatu jednoho jatečního zvířete. Zatímco počet porážených zvířat nelze libovolně zvyšovat, počet diabetiků každým rokem vzrůstá. Z  dat na obr. 3 plyne, že produkce inzulínu závislá pouze na izolaci z vepřových pankreatů by v USA kolem roku 1995 nekryla jeho nutnou produkci. Podobnou situaci by bylo možné očekávat i v ostatních zemích. Farmaka připravovaná z  mikroorganizmů za pomoci genových technologií tedy přinesla nejen čistě technologické výhody, ale umožnila i překonat logistický problém nedostačujících kapacit (obr. 3). K tomuto účelu jsou v zásadě možné dvě cesty: – Bakteriální syntéza jednotlivých inzulínových řetězců a jejich dodatečné spojení pomocí oxidace, jak bylo prováděno již během prvních syntetických pokusů. – Biosyntéza inzulínového prekurzoru, takzvaného proinzulínu (obr. 4). První cesta má tytéž nevýhody jako klasická chemická syntéza, je však jednodušší a byla proto zvolena pro první pokusy. Druhá však byla daleko slibnější. Na začátku 60. let Donald F. Steiner (*1930) v  New Yorku zjistil, že se inzulín DMEV • ROČNÍK 15 • 2012 • ČÍSLO 2

v Langerhansových buňkách syntetizuje zprvu jako bílkovina s delším řetězcem (proinzulín), pak je však v týchž buňkách štěpen na aktivní inzulín (Steiner, 1967; Steiner et al., 1967; Steiner et al., 1967). „Big insulin“, peptid o větší molekulové váze vykazující stejnou imunochemickou reakci jako inzulín, nalezl o rok později v  krevní plazmě Jesse Roth se spolupracovníky (Roth et al., 1968). Vedle inzulínu se z tohoto inzulínového prekurzoru odštěpí ještě takzvaný peptid C („connecting peptide“, s 33 aminokyselinami), který v proinzulínu spojuje oba funkční řetězce A a B. Oba řetězce tedy původně vznikají jako jediný genový produkt. Předností této zdánlivě zdlouhavé a neekonomické syntézy může být, jak se domníváme, že dlouhá molekula proinzulínu zaujímá v buňce výhodnou prostorovou strukturu pro uzavření „správných“ disulfidových můstků. Rekombinantní DNA, která se při genové syntéze zavádí do genomu produkčních bakterií (většinou jde o Escherichia coli), kóduje tudíž proinzulín jako jediný „cílový“ produkt. Po jeho syntéze se pak – podobně jako v buňce – přemění enzymatickým štěpením enzymy trypsinem a karboxypeptidázou B na aktivní inzulín. Jako první vyrobila v roce 1978 kalifornská firma Genentech inzulín připravený pomocí genových technologií. Genentech syntetizoval oba inzulínové řetězce separátně ve dvou kulturách bakterie Escherichia coli, následně spojených vytvořením disulfidových můstků mírnou oxidací. Takřka zároveň produkci na stejném principu zavedla i firma Eli Lilly, která v dostupnosti inzulínu hrála už v minulosti pionýrskou roli a měla dlouhou zkušenost s produkcí řady terapeutik ze zvířecích zdrojů. Poněkud modifikovanou výrobní metodu zvolila frankfurtská firma Aventis (dříve Hoechst): používá genový konstrukt, který v  jednom kroku poskytne oba řetězce vázané v jedné delší, od proinzulínu se odlišující bílkovině. Ta se pak enzymaticky štěpí na jednotlivé řetězce, které se navzájem navazují výše uvedeným způsobem.

115

diabetologie

Obr. 4: Struktura C-peptidu a typ spojení s řetězci A & B v hovězím proinzulínu.

Druhou cestu nastoupila skandinávská firma Novo Nordisk. Rekombinantní DNA obsahuje sekvenci prekurzoru, který je poněkud jednodušší než již zmiňovaný „přirozený“ proinzulín. Po syntéze a přenesení do kultivačního média je (podobně jako proinzulín v buňce) přeměněn enzymatickým štěpením na aktivní inzulín. Pomocí chromatografických rozdělovacích metod9 je pak izolován čistý produkt. Tyto a některé další inzulínové preparáty, vyráběné pomocí genových technologií, již celosvětově převažují. V Evropě se inzulínové preparáty získané ze zvířecích zdrojů předepisují už jen asi deseti procentům pacientů. Použití genové technologie tedy zamezilo tomu, že by se inzulín mohl stát nedostatkovým produktem. Další výhoda spočívá v tom, že genová technologie nepoužívá téměř žádné agresivní chemikálie, nebo jen ve velmi omezeném množství, a je tudíž podstatně šetrnější k životnímu prostředí než chemická syntéza či izolace.

INZULÍNOVÉ

DERIVÁTY PRO TERAPII

Znalost struktury inzulínu otevřela také možnost její cílené modifikace. Takto získané deriváty inzulínu se od původní struktury často liší modifikovanou intenzitou nebo modifikovaným časovým průběhem antiglykemické aktivity. Podle okolností a podle stavu pacienta je v  substituční terapii zapotřebí docílit jak rychlých a intenzivních, tak i déle působících – méně intenzivních – účinků. Metody chemického pozměnění molekuly peptidu jsou známy od 50. let minulého století a umožnily zkoumání vztahů mezi chemickou strukturou a farmakologickým účinkem látek. V průmyslovém měřítku se však často jeví jako technologicky obtížné a ekonomicky nevýhodné; teprve genová technologie dává v  řadě případů k  dispozici terapeuticky výhodné peptidy. Některé z nich ukazuje tabulka 1. Prodloužení účinku inzulínu lze dosáhnout dnes již klasickou cestou – navázáním inzulínu na bazickou bílkovinu protamin z lososího spermatu. Z této parenterálně aplikované

depotní formy se inzulín v  tkáních uvolňuje jen pomalu. Není to nový princip, umožňuje však kombinací s „volným“ – nevázaným – inzulínem dobrou kontrolu intenzity a trvání jeho účinku. Na jiném principu pozůstává prodloužený účinek preparátu firmy Aventis – „Lantus“ (Glargine-Insulin): prodloužením řetězce B o dvě jednotky bazické aminokyseliny – arginin v pozicích 31 a 32 – se molekula stává méně rozpustnou a působí po intramuskulární injekci jako substance s  depotním účinkem, z  níž se aktivní substance uvolňuje účinkem tkáňových enzymů. Prodlužovat hypoglykemický účinek inzulínu není však vždy účelné: za určitých fyziologických podmínek hladina inzulínu v krvi v postprandiální fázi (po požití potravy) stoupá. Pak jsou zapotřebí spíše inzulínové deriváty, které se vyznačují rychlou a vysokou aktivitou, z nichž některé jsou již běžně dostupné: Lispro-inzulín firmy Eli Lilly, v  němž je zaměněna pozice dvou předposledních aminokyselin řetězce B, prolinu a lyzinu, a „Novo-Rapid“ (Aspart-Insulin) firmy Novo Nordisk, který místo prolinu obsahuje na pozici 29 řetězce B kyselou aminokyselinu (kyselinu asparagovou). Schéma na obr. 5 znázorňuje profil účinku krátkodobých potentních a dlouhodobých forem inzulínu, spolu s možností jejich kombinace.

PERSPEKTIVY Úkolem následujících desetiletí bude především prevence a terapie formy diabetu typu II („nezávislého“ na inzulínu, dříve známá pod zkratkou NIDDM – non-insulin dependent diabetes mellitus), dnes zpravidla označovaná jako součást tzv. metabolického syndromu. Tato forma vykazuje ve všech industriálních společnostech, ale i v  některých vývojových zemích, rychle stoupající tendenci. Pro terapii této, též jako „inzulínová rezistence“ apostrofované formě cukrovky, existují tři možné strategie: 1. medikamentózní snižování krevního cukru, např. inhibitory α-glukosidázy (snižování resorpce glukózy z potravy v zažívacím traktu) či deriváty biguanidu (inhibice uvolňování glukózy z jater);

9

Nejčastěji používaná metoda je HPLC – high pressure liquid chromatography.

116

DMEV • ROČNÍK 15 • 2012 • ČÍSLO 2

diabetologie

Obr. 5: Farmakokinetika inzulínových strukturních analogů s prodlouženým účinkem (srov. tab. 1): schematické znázornění plazmatické koncentrace po jednorázové injekci (v čase 0).

Tab. 1: Terapeuticky používaná analoga lidského inzulínu produkovaná genovou rekombinantní technologií substance

strukturab)

terapeutická charakteristika

producent (preparát)

lidský inzulín (nativní forma)

produkční mikroorganizmuse) E. coli S. cerevisiae

HPN-lidský inzulín (Neutral Protamine Hagedorn Insulin)a)

inzulín vázaný na neutrální protaminc)

prodloužený účinek, mísitelný s normálním inzulínem

Eli Lilly, Aventis, Novo Nordisk, Berlin-Chemie, B. Braun

E. coli S. cerevisiae

Insulin Lispro

Pro(B28)Lys; Lys(B29)Arg

rychle působící

Eli Lilly (Humalog 100/ Liprog)

E. coli

Insulin Aspart

Asp(B28)Pro

rychle působící

Novo Nordisk

S. cerevisiae

Insulin Detemir

-(B30) Thr; Lys(Nε-CO-C13H27)(B29)Lysd)

pomalu působící

Novo Nordisk (Levemir)

S. cerevisiae

Insulin Glargine

Asn(A21)Gly; Arg(B31); Arg(B32)

pomalu působící

Aventis (Lantus)

E. coli

a) Mechanizmus zpomalení účinku (vazba peptidu na protamin) navrhl a poprvé použil dánský diabetolog Hans Christian Hagedorn (1888–1971) v roce 1946. Inzulín produkovaný rekombinantní technikou je vázán na přidaný protamin. b) Nomenklatura (příklady): Pro(B28)Lys označuje záměnu aminokyseliny prolinu v pozici 28 inzulínového řetězce B za lysin. Arg(B31) označuje připojení aminokyseliny argininu za poslední (třicátou aminokyselinu řetězce B (tedy do pozice 31). Vypuštění threoninu v pozici B30: -(B30)Thr. c) Protamin: jednoduchá bazická (zásaditá) bílkovina rybího spermatu. d) Threonin v pozici B30 vypuštěn, myristová kyselina (C13H27-COOH) vázaná na Nε-aminoskupinu lysinu v pozici B29. e) Mikroorganizmy použité v produkci: střevní bakterie Escherichia coli a kvasinka Saccharomyces cerevisiae.

2. tzv. „insulin sensitizers“ (např. deriváty glitazonu), zvyšující sorpci glukózy v jaterních a svalových buňkách – a tím snížení krevního cukru; 3. stimulace inzulínové sekrece z  pankreatických buněk (sulfonylurea).

Nadějné terapeutické možnosti slibuje v roce 197910 ze slin americké ještěrky Heloderma suspectum izolovaný peptid GLP-1 (glucagon-like peptide) (Creutzfeldt, 2004) vykazující kombinovanou biologickou aktivitu: podporuje sekreci inzulínu, inhibuje sekreci glukagonu (pankreatický hormon

10

GLP-1 identifikoval ve zmíněném materiálu Werner Creutzfeldt (1924–2006) na univerzitě v Göttingen.

DMEV • ROČNÍK 15 • 2012 • ČÍSLO 2

117

diabetologie vyvolávající opačný fyziologický efekt než inzulín – zvýšení krevní hladiny glukózy) a nadto snižuje resorpci glukózy ze zažívacího traktu. Jeho preparáty, produkované genovou technologií, jsou v současné době uváděny na trh. Při těchto terapiích spolurozhodují ovšem o jejich úspěchu doprovodné faktory, většinou vyžadující změny životních zvyklostí: vhodná dieta, dostatek pohybu a vše, co vede k redukci obezity.

POZNÁMKA

NA ZÁVĚR

Výzkum inzulínu a diabetu, který před osmdesáti lety probíhal takřka dramaticky a znovu na sebe upozornil před více než padesáti lety udělením dalších Nobelových cen, se stal historií jednoho z velkých úspěchů medicíny. Nezabránily tomu ani třenice mezi zúčastněnými vědci ani metodické a jiné chyby, bez kterých se vlastně žádný vědecký pokrok neobejde.

LITERATURA 1. Abel JJ, Geiling EMK, Rouiller CA, Bell EK, Wintersberger O. Crystalline insulin. J Pharmacol Exp Ther 1927;31:65-85,. 2. Craig LC. Countercurrent distribution. Methods Med Res 1952;5: 3-24. 3. Bliss M. The Discovery of Insulin. Paul Harris Publishing, Edinburgh 1983. (Historická studie založená na dostupných dokumentech a svědeckých výpovědích, která se zabývá i detaily, často velmi zajímavými.) 4. Craig LC, Gregory JD, Barry GT. Studies on polypeptides and amino acids by countercurrent distribution. Cold Spring Harb Symp Quant Biol 1950;14:24-31. 5. Crapo L M. Hormone. Die chemischen Boten des Körpers, 113 str. („Eine Therapie aus Toronto“). Spektrum der Wissenschaft Verlagsgesellschaft mbH & Co., Heidelberg 1986. 6. Creutzfeldt W. The [pre-] history of the incretin concept. Regul Peptides 2004;128:87-91. 7. Edman P. A method for the determination of amino acid sequence in peptides. Arch BiochemBiophys 1949;22:475-490. 8. Edman P, Högfeldt E, Sillén LG, Kinell P-O. Method of determination of the amino acid sequence in peptides. Acta Chem Scand 1950;4:283-293. 9. Gordon AH, Martin AJP, Synge RLM. Partition chromatography in the study of protein constituents. Biochem J 1943;37: 79-86. 10. Katsoyannis PG. The synthesis of the insuline chains and their combination to biologically active material. Diabetes 1964;13: 339-348.

118

11. Katsoyannis PG. The chemical synthesis of human and sheep insulin. Am J Med 1966;40: 652-661. 12. Merrifield RB, Marglin A. The synthesis of bovine insulin by the solid phase method. J Am Chem Soc 1966;88:5051-5052. 13. Pliska V. Insulin – od objevu ke genové technologii. DMEV 2010;13:69-76. 14. Roth J, Corden P, Pastan I. „Big insulin“: a new component of plasma insulin detected by immunoassay. P Natl Acad Sci USA 1968;61:138-145. 15. Ryle AP, Sanger F, Smith LF, Kitai R. The disulphide bonds of insulin. Biochem J 1955;60:541-556. 16. Sanger F. The free amino groups of insulin. Biochem J 1945; 39: 507-515. 17. Sanger F, Thompson EO. The amino-acid sequence in the glycyl chain of insulin. I. The identification of lower peptides from partial hydrolysates. Biochem J 1953;53:353-366. 18. Sanger F, Thompson EO. The amino-acid sequence in the glycyl chain of insulin. II. The investigation of peptides from enzymic hydrolysates. Biochem J 1953;53:366-374. 19. Sanger F, Tuppy H. The amino-acid sequence in the phenylalanyl chain of insulin. 1. The identification of lower peptides from partial hydrolysates. Biochem J 1951;49:463-481. 20. Sanger F, Tuppy H. The amino-acid sequence in the phenylalanyl chain of insulin. 2. The investigation of peptides from enzymic hydrolysates. Biochem J 1951;49:481-490. 21. Sieber P, Kamber B, Hartmann A, Jöhl A, Riniker B, Rittel W. Totalsynthese von Humaninsulin unter gezielter Bildung der Disulfidbindungen. Helv Chim Acta 1974;57:287-288. 22. Steiner DF. Evidence for a precursor in the biosynthesis of insulin. Trans New York Acad Sci 1967;30:60-68. 23. Steiner DF, Cunningham D, Spigelman L, Aten B. Insulin biosynthesis: Evidence for a precursor. Science 1967;157:697-700. 24. Steiner DF, Oyer PE. The biosynthesis of insulin and a probable precursor of insulin by a human islet cell adenoma. P Natl Acad Sci USA 1967;57:473-480. 25. Wieland T, Bodanszky M. The World of Peptides. Springer-Verlag, Berlin 1991. (Dějiny moderního výzkumu peptidů s detailními údaji a odkazy na chemii inzulínu.) 26. Zahn H, Brinkhoff O, Meienhofer J, Pfeiffer EF, Ditschuneit H, Gloxhuber C. Die Kombination von synthetischen Insulin-Ketten in biologisch aktive Präparate. Z Naturforsch B 1965;20: 666-670.

prof. dr. Vladimir Pliska Allmendstrasse 20 CH-8304 Wallisellen Switzerland e-mail: [email protected]

DMEV • ROČNÍK 15 • 2012 • ČÍSLO 2