Penelitian II: Introgresi Gen Resesif Mutan o2 ke Galur Jagung Resisten tehadap Penyakit Bulai dengan Pendekatan MAS Pendahuluan Kegiatan pemuliaan dengan cara konvensional untuk merakit jagung yang bermutu protein tinggi cukup rumit karena memerlukan waktu yang lama dan bahan genetik yang banyak. Hal ini disebabkan karena alel-alel mutan o2 dikendalikan oleh gen resesif (AMBIONET, 2002), sehingga menyulitkan seleksi galur-galur potensial unggul QPM dalam kondisi heterosigot. Kemajuan di bidang pemuliaan molekuler (molecular breeding) dengan memanfaatkan marka DNA sebagai alat bantu seleksi (MAS = Marker Assisted Selection) diharapkan dapat membantu mengatasi masalah yang dihadapi dalam pemuliaan konvensional. Salah satu syarat utama yang harus dipenuhi suatu marka DNA dalam kegiatan MAS untuk mengintrogresikan alel-alel yang dinginkan adalah posisi marka tersebut sangat dekat dengan gen target, dan akan lebih baik lagi jika DNA berbasis marka diperoleh dari sekuen gen target itu sendiri. Untuk kegiatan MAS pada kegiatan pemuliaan jagung bermutu protein tinggi menggunakan marka SSR yang didesain dengan menggunakan informasi sekuen DNA yang tersedia untuk alel opaque-2 yang mengendalikan peningkatan lisin dan triptofan pada biji jagung. Ketiga marka DNA tersebut terletak pada kromosom 7, bin 7.01 yaitu: phi057 dan phi 112 yang dikembangkan oleh Pioneer Hibreed, serta umc1066 yang dikembangkan oleh proyek jagung Universitas Missouri, Columbia (Chin et al. 1996). Sekuen ketiga pasangan primer tersebut dapat diperoleh dari situs www.agron.missouri.edu/ssr.htm sebagai berikut: Phi112
F:5’ -TGCCCTGCAGGTTCACATTGAGT-3’ R:5’ -AGGAGTACGCTTGGATGCTCTTC-3’
Umc 1066F:5’ - ATGGAGCACGTCATCTCA ATGG-3’ R:5’ - AGCAGCAGCAACGTCTATGACACT-3’ Phi057
F:5’ - CTCATCAGT GCCGTCGTCCAT-3’ R:5’ - CAGTCGCAAGAAACCGTTGCC-3’
Primer phi057 memiliki tingkat polimorfisme yang rendah sehingga polimorfisnya hanya dapat divisualisasi dengan menggunakan gel poliakrilamid, sedangkan phi112, dan umc1066 selain dapat divisualisasi dengan gel poliakrilamid, juga dapat divisualisasi
35
dengan menggunakan super fine agarose (metafor) dengan konsentrasi 3 –4 % (Mereille, 2002). Ketiga marka SSR tersebut memiliki kemampuan untuk membedakan alel mutant o2 dengan alel O2 sehingga kegiatan introgresi gen o2 dari galur QPM ke galur jagung normal yang resisten terhadap penyakit bulai pada skema silang balik dapat menjadi lebih efektif dan efisien. Oleh karena ketiga marka DNA tersebut di desain dari daerah amplifikasi sekuen DNA yang tersedia
untuk alel opaque-2, maka tingkat akurasi
deteksinya cukup tinggi. Berdasarkan hal tersebut, pada penelitian ini dipilih dua marka SSR yaitu phi057 dan umc1066 sebagai alat bantu seleksi genotip yang membawa alel resesif mutan opaque-2 pada setiap generasi silang balik dan penyerbukan sendiri. Tujuan penelitian ini adalah mengintrogresikan gen resesif mutan opaque-2 dari galur QPM ke galur jagung normal yang resisten terhadap penyakit bulai dengan menggunakan marka SSR sebagai alat bantu seleksi dan mengevaluasi penampilan galur-galur yang telah memilik gen homosigot resesif opaque-2. Bahan dan Metode Penelitian Tempat dan Waktu Penelitian Penelitian dilaksanakan di Laboratorium Biologi Molekuler dan di Kebun Percobaan Cikeumeuh Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Bioteknologi dan Sumber Daya Genetik (BBPP Biogen), Laboratorium AMBIONET di IRRI, Los Banos dan Laboratorium Tanah dan Biokimia CIMMYT, Mexico. Kegiatan penelitian MAS (Marker Assisted Selection) berlangsung dari September tahun 2004 sampai Februari 2006, sedangkan kegiatan penampilan galur yang terseleksi memiliki gen homosigot opaque-2 berlangsung dari akhir Februari –Juni 2006. Bahan Penelitian Bahan genetik yang digunakan untuk introgresi gen resesif o2 adalah galur CML 161 sebagai tetua donor gen o2 (oo), galur resisten terhadap penyakit bulai sebagai tetua pemulih, yaitu Nei9008 dan MR10, hibrida CML-161 x Mr-10 dan CML-161 x Nei 9008 serta progeni silang balik CML-161 x Mr-10 // Mr-10 dan CML-161 x Nei 9008 // Nei 9008 (BC1F1, BC2F1, BC3F1, BC3F2). Diskripsi galur-galur tetua persilangan disajikan pada Lampiran 10. Marka SSR yang digunakan sebagai marka penyeleksi gen opaque-2
36
adalah umc1066 untuk menyeleksi progeni CML 161 x Mr-10 dan phi057 untuk menyeleksi progeni CML 161 x Nei9008. Pemilihan marka didasarkan pada studi pendahuluan dimana marka tersebut secara konsisten polimorfis antara masing-masing alel opaque2 dari tetua persilangan yang digunakan. Materi genetik yang digunakan pada penelitian evaluasi penampilan agronomis galur-galur hasil introgresi gen homosigot resesif o2 adalah 42 galur Nei9008+o2 dan 36 galur MR10+o2 serta empat galur sebagai cek yaitu CML161, MR10, Nei9008 dan CML165. Pelaksanaan Penelitian Pelaksanaan penelitian menggunakan metode MAS 1 (Parsial) (Dreher et al, 2000) seperti yang disajikan pada skema penelitian Lampiran 1. Kegiatan penelitian terdiri atas: 1) introgresi gen resesif o2 dengan metode silang balik; 2) deteksi gen resesif o2 pada individu tanaman generasi silang balik dengan mengunakan marka SSR; 3) evaluasi penampilan agronomis dari galur-galur yang terseleksi memiliki gen homosigot resesif o2 Introgresi gen resesif o2 dengan metode silang balik Dua puluh satu genotip (tongkol) galur CML161 (tetua donor gen oo) dan masingmasing lima galur MR10 dan Nei9008 (tetua pemulih) ditanam pada petakan baris tunggal dengan jarak tanam 70 cm x 20 cm. Galur CML 161 masing-masing disilangkan dengan tetua pemulihnya untuk mendapatkan masing-masing 105 tongkol F1, kemudian benih tersebut ditanam kembali dan disilangkan dengan tetua pemulihnya untuk membentuk genotip silang balik (BC1F1). Individu tanaman BC1F1 yang teridentifikasi memiliki gen heterosigot untuk gen opaque (Oo) dengan menggunakan marka SSR spesifik, disilang balik ke tetua pemulihnya untuk membentuk BC2F1. Kegiatan seperti ini diulangi untuk membentuk BC3F1. Individu tanaman BC3F1 yang teridentifikasi memiliki gen heterosigot untuk gen opaque disegregasikan untuk membentuk genotip BC3F2, kemudian benih BC3F2 ditanam kembali untuk diskrining dengan menggunakan marka SSR spesifik untuk gen opaque. Tanaman BC3F2 yang teridentifikasi memiliki gen homosigot resesif untuk gen opaque (oo) diserbuksendirikan untuk membentuk galur BC3F3 .
37
Deteksi gen resesif o2 pada individu tanaman generasi silang balik dengan mengunakan marka SSR Kegiatan di laboratorium meliputi isolasi DNA, analisis PCR dan elektroforesis. Isolasi DNA daun jagung dilakukan dengan cara miniprep berdasarkan metode SaghaiMaroof et al. (1984) yang telah dimodifikasi oleh AMBIONET Service Laboratory untuk tanaman jagung (George dan Regalado, 2003). Isolasi DNA dilakukan pada setiap generasi silang balik dan penyerbukan sendiri. Daun muda dengan panjang kurang lebih 10 cm dipanen paling lambat 30 hari setelah tanam. Daun yang dipanen dimasukkan ke dalam plastik yang telah diberi nomor sesuai dengan nomor label yang ada di lapangan, kemudian dimasukkan ke dalam box berisi es. Sampel daun tersebut diisolasi DNAnya dengan bantuan liquid nitrogen di laboratorium. Sampel daun per nomor digerus sampai terbentuk serbuk halus dalam tabung eppendorf berukuran 2.0 mL dengan menggunakan sumpit. Setelah daun menjadi serbuk halus, ditambahkan 0.5 ml buffer ekstraksi CTAB (Cetyltrimethylammonium bromide) panas yang mengandung -mercaptoethanol dengan konsentrasi 2l/ml larutan (komposisi larutan pada Tabel 8) kemudian diinkubasi pada suhu 65o C dalam waterbath selama 30 menit. Selama proses inkubasi, tabung ependorf dijentik-jentik setiap 10 menit. Setelah proses inkubasi selesai, tabung ependorf dikeluarkan dari waterbath dan didinginkan pada suhu ruang (10 menit) kemudian ditambahkan 500 l Chloroform isoamylalcohol (Chisam, 24:1 v/v). Tabung ependorf dijentik-jentik hingga larutan tercampur dengan baik kemudian disentrifugasi pada 12000 rpm selama 10 menit. Supernatan DNA (larutan bening bagian atas) dipindahkan ke tabung ependorf steril 1.5 ml dan ditambahkan 500 l isoprophanol dingin kemudian disimpan dalam freezer -20oC selama 2 jam hingga satu malam. Tabung digoyang secara perlahan hingga muncul DNA berupa untaian benang berwarna putih. DNA yang terbentuk dipisahkan dari larutan supernatan dan isoprophanol dengan cara mengeluarkan larutan tersebut dari tabung ependorf. Endapan DNA dicuci dengan ethanol absolut dingin kemudian diulangi dengan ethanol 70% dingin. Setelah DNA dicuci kemudian dikeringkan dengan cara membalik tabung ependorf yang berisi DNA di atas meja yang telah dialasi tissu. Setelah pelet DNA tersebut kering, DNA dilarutkan dalam buffer 1xTE sesuai dengan besar kecilnya endapan. Untuk menguji kualitas dan kuantitas DNA, dilakukan pengecekan dengan teknik elektroforesis menggunakan agarose 0,8% (0,8 gram agarose dilarutkan dalam 100 ml 0,5 X TBE). Sebanyak 4 l DNA dan 2 l loading dye dicampur di atas microplate kemudian dimasukkan ke dalam masing-masing hole (sumur) gel agarose yang telah dicetak 38
sebelumnya yang dimulai pada sumur ke empat. Pada tiga sumur pertama dimasukkan DNA standar masing-masing pada konsentrasi 10 ng/l, 20 ng/l dan 100 ng/l yang telah dicampur dengan 2 l loading dye untuk mengestimasi konsentrasi sampel DNA yang dirunning. Elektoforesis dilakukan pada tegangan listrik 100 volt selama 1,5 jam. Setelah proses elektroforesis selesai, gel direndam dalam ethidium bromida dan dipotret dengan menggunakan gel doc. DNA yang bagus akan memiliki gumpalan besar di dekat sumur gel. Tabel 8. Komposisi larutan buffer isolasi DNA jagung (George dan Regalado, 2003). Reagen
Konsentrasi akhir
CTAB 5 M NaCl 1 M Tris, pH 8,0 0,5 M EDTA, pH 8,0 dd H2O
Kuantitas per 500 ml
2,0% 1,4 M 100,0 mM 20,0 mM
10,00 g 40,91 g 50,00 ml 20,00 ml 379,09 ml
Konsentrasi DNA dapat ditentukan dengan membandingkan DNA sampel dengan DNA standar. Sebagian sampel DNA diencerkan dengan TE 1X menjadi 10 ng/l sebanyak 50 l sebagai larutan DNA kerja dan disimpan pada freezer 4oC, sedangkan untuk stok DNA disimpan pada freezer -20oC. Larutan DNA sebagai stok kerja di PCR dengan campuran untuk satu reaksi disajikan pada Tabel 9. Tabel 9. Komposisi reaksi PCR untuk mikrosatelit Reagan Kosentrasi Stok ddH2O steril --Taq buffer (10X; Mg-free) 10X MgCl2 50 mM dNTPmix 2,5 mM Primer mix (F + R) 5,0 M @ Taq Enzim 5 unit/l DNA 10 ng/l Total
Volume (l) 9,25 1,50 0,75 0,90 0,90 0,20 1,50 15
Konsentrasi akhir --1X 2,5 mM 150 M 0,3M * 1 unit 10 ng/l
* Kedua primer sudah dicampur terlebih dahulu pada tabung yang sama
PCR diset sebanyak 30 siklus dengan tahapan sebagai berikut: Denaturasi pertama 1
94oC selama 2 menit
Denaturasi
1
94oC selama 30 detik
Annealing
2
58-60oC selama 1 menit
Extension
3
72oC selama 1 menit
Final extension
1
72oC selama 5 menit
Penyimpanan
1
4oC sampai tak terhingga 39
Hasil PCR dicek pada gel agarose 1%. Bila didapatkan pita maka separasi akan dilanjutkan pada gel agarose ’ s upe rf i ner e s ol ut i on’untuk menyeleksi progeni CML 161 x Mr-10 dan pada gel polyacrilamide untuk menyeleksi progeni CML 161 x Nei 9008. Separasi hasil PCR sampel DNA progeni CML 161 x Mr-10 dilakukan pada gel agarose 3% yang merupakan campuran agarose metaphor dan agarose seakem dengan perbandingan 2:1. Agarose tersebut dilarutkan pada buffer TBE 1 X kemudian dimasukkan dalam cetakan gel elektroforesis menggunakan 4 comb, 200 sumur dengan jarak migrasi masing-masing sekitar 6 cm. Hasil PCR diberi loading buffer sebanyak 4 l per sampel kemudian dimasukkan ke dalam sumur cetakan masing-masing 10l. Selanjutnya sampel dielektroforesis dengan daya 130 Volts sekitar 2 jam atau bromofenol dari loading buffer telah bermigrasi ke gel berikutnya. Setelah selesai dielekroforesis, gel tersebut di de-staining ke dalam etidium bromida selama 15 menit kemudian difoto pada gel doc. Hasil PCR sampel DNA progeni CML 161 x Nei9008 diseperasi pada gel polyacrilamide 6%. Gel dicetak pada alat pencetak gel (glass plate) merek BioRad. Hasil PCR dipindahkan ke mikroplet yang lain, masing-masing sebanyak 4 l kemudian ditambahkan loading buffer 2l pada setiap lubang mikroplet tersebut. Sampel didenaturasi pada mesin PCR dengan suhu 94oC selama 5 menit. Setelah proses denaturasi selesai, secepat mungkin dimasukkan ke dalam box berisi es.
Sampel
dielektroforesis pada suhu 50oC dengan daya 60 watt selama 55 –60 menit, atau bromophenol dari loading buffer telah mencapai bagian bawah plate. Pewarnaan DNA dilakukan dengan metode silver staining. Plat kaca yang mengandung gel berisi DNA direndam dalam baki yang berisi larutan asam asetat glacial 10% (larutan fiksasi) kemudian digoyang selama 20 menit, atau warna loading buffer pada gel menjadi hilang. Plat kaca dicuci dalam ultra pure water (air yang disuling dua kali) sebanyak 2 kali masing-masing 5 menit. Plat kaca direndam dalam larutan pewarna (silver staining) di atas shaker selama 30 menit, kemudian dibilas dalam air ultra pure selama 10 detik. Plat kaca kemudian direndam dalam larutan developer sehingga akan muncul pita-pita. Setelah itu secepatnya direndam dalam larutan asam asetat selama 5 menit dan dibilas dengan air ultra pure lagi, dan dikering anginkan. Seleksi individu tanaman progeni silang balik bergenotip heterozygot (Oo) didasarkan pada munculnya dua pita pada DNA individu yang dianalisis, sedangkan untuk menyeleksi individu tanaman hasil penyerbukan sendiri yang bergenotip homosigot
40
resesif (oo) didasarkan pada munculnya pita hanya satu, yaitu pada posisi pita yang sama dengan tetua donor opaque-2. Hanya tanaman yang bergenotip Oo disilang balik lebih lanjut hingga diperoleh benih BC3F1. Benih tanaman BC3F1 ditanam lalu dilakukan analisis DNA untuk mendeteksi tanaman bergenotip Oo yang akan disegregasikan lebih lanjut untuk mendapatkan biji BC3F2. Biji BC3F2 ditanam untuk menyeleksi tanaman bergenotip oo. Hanya tanaman yang terseleksi yang akan disilangkan untuk memperoleh benih BC3F3. Evaluasi penampilan hasil dan agronomis dari galur-galur yang terseleksi bergenotip homosigot resesif o2 Sebanyak 42 galur Nei9008+o2 dan 36 galur MR10+o2 serta empat galur sebagai cek (CML161, MR10, Nei9008 dan CML165) diuji penampilan hasil dan agronomisnya di Kebun Percobaan Cikemeuh, Balai Besar Litbang Biogen, Bogor pada MK 2006. Galur-galur tersebut masing-masing ditanam 2 baris dengan jarak tanam 70 cm antar baris dan 20 cm dalam baris, menggunakan rancangan perbesaran, tanpa ulangan (Augmented design). Parameter agronomis yang diamati adalah tinggi tanaman, tinggi letak tongkol, umur berbunga jantan dan betina, bobot tongkol panen, kadar air, bobot 1000 biji. Hasil biji kering pada kadar air 15% dianalisis dengan menggunakan persamaan (CIMMYT, 1994): 10000
100-KA
Hasil (kg/ha) = ----------- x ----------- x B x 0,80 L.P
100-15
K.A =Kadar Air biji waktu panen L.P = Luas Panen (m2). B = Bobot Tongkol Kupasan (kg) R = Rata-rata rendemen (shelling percentage) HASIL DAN PEMBAHASAN DNA genomik Secara umum, kualitas DNA yang dihasilkan pada setiap isolasi cukup baik (Gambar 7). Dengan kualitas DNA genomik yang cukup baik tersebut pola pita DNA dapat terdeteksi secara optimal dengan metode SSR, terutama pada hasil PCR yang divisualisasi dengan menggunakan agarose’ s upe rf i ner e s ol ut i on’ . Berbeda halnya dengan 41
visualisasi hasil PCR dengan menggunakan gel polyacrilamide, dimana dengan DNA berkualitas rendah sampai sedang masih cukup optimal untuk divisualisasi (Lee, 1998).
Gambar 7.
Profil DNA pada agarose 0.80% dari tanaman yang telah diekstraksi dengan metode CTAB. No 1 dan 2 adalah DNA dengan konsentrasi masingmasing 100 dan 10 ng/l.
Kuantitas DNA yang diperoleh seperti yang disajikan pada Gambar 7 masih bervariasi mulai dari 10 ng sampai 200 ng/μl. Oleh karena itu masih diperlukan pengenceran sehingga kuantitas DNA yang diperoleh untuk kegiatan PCR berkisar 10 – 15 ng/μl (Gambar 8). Pengalaman menunjukkan bahwa umumnya penyebab terjadinya kegagalan amplifikasi produk PCR adalah karena konsentrasi DNA-nya yang tidak tepat.
1 2
Gambar 8.
1
2
3 4 5…
Profil DNA tanaman yang telah diencerkan pada agarose 0.75% dengan menggunakan pembanding 1= 25 ng/l dan 2 = 10 ng/l. DNA nomor urut 1, 2, 3 dan seterusnya sudah siap untuk di analisis PCR.
Seleksi individu heterosigot opaque (Oo) dengan bantuan marka SSR spesifik Sebelum tanaman disilangkan pada setiap generasi silang balik, DNA yang sudah diencerkan dengan konsentrasi 10 –15 ng/μl diamplifikasi dengan mesin PCR. Untuk generasi silang balik CML 161 x Nei9008 menggunakan primer phi057 dan divisualisasi dengan gel poliakrilamid (vertikal) 6% (Gambar 9), sedangkan untuk generasi silang balik CML 161 x MR10 menggunakan primer umc1066 dan divisualisasi dengan agarose metafor 3% (Gambar 10). Daerah amplikasi kedua primer tersebut berada antara 140 (alel o)-160 bp (alel O).
Pemilihan marka SSR spesifik phi057 didasarkan pada hasil survei sebelumnya, dimana marka tersebut memberikan amplifikasi yang polimorfis antara galur CML161 sebagai tetua donor gen resesif opaque-2 dengan galur Nei9008 (Pabendon et al., 2006). Dari penelitian pendahuluan, ternyata hasil produk PCR dengan menggunakan marka SSR spesifik phi057, gen resesif dan dominan opaque-2 hanya dapat diserperasi dengan
42
menggunakan PAGE, sedangkan pada agarose metafor 3% visualisasinya monomorfis. Hal ini menunjukkan bahwa kemampuan deteksi gel agarose ’ s upe rf i ner e s ol ut i on’hanya terbatas pada alel dengan polimorfisme yang cukup tinggi. Oleh karena tingkat resolusi gel akrilamid lebih tinggi dari pada gel agarose, maka gel tersebut
mempunyai
kemampuan yang lebih besar untuk mendeteksi sejumlah besar alel per lokus (Macaulay et al., 2001). 200 bp o M
P1
P2 O 100 bp 12 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 Gambar 9. Profil pita DNA individu tanaman generasi BC2F1 (progeny CML 161 (P2) x Nei9008 (P1) // Nei9008) hasil PCR yang divisualisasi dengan gel polyacrilamid dengan menggunakan primer SSR spesifik phi 057 Walaupun penggunaan gel agarose ’ s upe rf i ner e s ol ut i on’dalam visualisasi hasil produk PCR SSR memiliki keterbatasan (terutama pada DNA dengan panjang fragmen >4 bp (pasang basa)), namun jika suatu fragmen DNA dapat divisualisasi tingkat folimorfisnya dengan agarose, maka pekerjaan teknik SSR bisa lebih cepat dan relatif lebih mudah dilakukan (Prasanna dan Gark, 2002).
P1123456… P2
Gambar 10. Profil pita DNA individu tanaman generasi BC2F1 (progeny CML 161 (P2) x Mr-10 (P1) // MR10) hasil PCR yang divisualisasi pada pada gel Agarose Methapor 3% dengan menggunakan primer SSR spesifik umc1066. Pada Gambar 9 dan 10, terlihat pola pita ganda yang berarti salah satu alelnya sama dengan tetua donor dan alel yang lainnya sama dengan tetua pemulihnya. Individu tanaman yang memiliki heterosigositas (Oo) diseleksi untuk disilangbalikkan lebih lanjut sampai terbentuk genotip BC3F1. Sedangkan pola pita tunggal artinya adalah alel genotip silang balik tersebut mengikuti pola alel tetua pemulihnya (Nei9008 atau Mr-10) yaitu individu homosigot dominan untuk alel opaque.
43
Seleksi individu homosigot opaque (oo) dengan bantuan marka SSR spesifik Benih BC3F2 yang diperoleh pada kegiatan percobaan sebelumnya ditanam masingmasing satu baris per genotip untuk menyaring idividu-individu tanaman yang telah memiliki gen
homosigot resesif opaque-2 (oo) kemudian disilangdalamkan untuk
membentuk genotip BC3F3. Visualisasi hasil PCR genotip BC3F3 disajikan pada Gambar 11 dan 12.
P2
P1
1
2
3
4
5
6
7
8
.
9
Gambar 11. Profil pita DNA individu tanaman generasi BC3F2 (progeni CML 161 (P2) x Nei9008 (P1) // Nei9008) hasil PCR yang divisualisasi dengan gel polyacrilamid dengan menggunakan primer SSR spesifik phi 057 individu tanaman terseleksi
P1 1 2 3 4 M P2 5 6…
Gambar 12. Profil pita DNA individu tanaman generasi BC2F1 (progeny CML 161 (P2) x Mr-10 (P1) // MR10) hasil PCR yang divisualisasi pada pada gel Agarose Methapor 3% dengan menggunakan primer SSR spesifik umc1066. Tabel 10. Nilai Chi-kuadrat rata-rata untuk derajat kecocokan nisbah segregasi silang balik dan penyerbukan sendiri terhadap beberapa nisbah hipotetik. Persilangan CML161 x Nei9008
CML161 x MR10
Jumlah tanaman bergenotip OO Oo oo
Generasi
Nisbah yang diuji
BC1F1
1:1
104
101
BC2F1
1:1
100
BC3F1
1:1
BC3F2
X2
P
-
0.12
0.70-0.90
108
-
0.24
0.50-0.70
104
96
-
0.24
0.50-0.70
1:2:1
48
102
50
0.05
0.90-0.95
BC1F1
1:1
100
96
-
0.05
0.95-1.00
BC2F1
1:1
110
97
-
0.69
0.30-0.50
BC3F1
1:1
98
104
-
0.12
0.70-0.90
BC3F2
1:2:1
57
102
42
1.93
0.30-0.50
Kegiatan MAS pada Gambar 11 dan 12 memperlihatkan bahwa kegiatan seleksi dilakukan dengan cara menyaring individu tanaman yang memiliki pola pita tunggal yang sama dengan tetua donor gen opaque-2 (oo). Jumlah genotip yang tersaring berdasarkan 44
pola pita DNAnya adalah 50 dari 200 individu tanaman genotip BC3F2 dari progeni CML161 x Nei9008 dan 42 dari 201 individu tanaman genotip B3F2
dari progeni
CML161 x MR10 (Tabel 10). Berdasarkan hasil uji Chi-kuadrat, nisbah segregasi genotip BC3F2 dari kedua pasangan persilangan tersebut sesuai dengan nisbah 1 : 2 : 1. Nisbah segregasi tersebut sama dengan yang dilaporkan oleh Babu (2005) yang menggunakan marka spesifik yang sama untuk menyaring materi genetik yang berbeda pada generasi BC2F2. Penampilan agronomis galur hasil introgresi Untuk mengetahui penampilan dari galur-galur hasi introgresi gen opaque-2 (oo), telah dilakukan evaluasi lapangan terhadap beberapa karakter agronomis dan hasil. Dari 50 progeni CML161 x Nei9008 dan 42 progeni CML161 x MR10 yang tersaring, masing –masing hanya 42 dan 36 genotip yang bisa ditanam kembali. Hal ini disebabkan karena beberapa tongkol yang bijinya tidak bisa dipanen karena busuk dan atau kurang berisi. Hasil evaluasi beberapa karakter agronomis dan potensi hasil biji dari galur-galur hasil introgresi gen opaque-2 (oo) disajikan pada Tabel 11 dan 12. Komponen agronomi yang diamati meliputi tinggi tanaman, tinggi letak tongkol, umur keluar serbuk sari dan rambut. Pada pengamatan tinggi tanaman, hanya beberapa genotip yang nyata lebih tinggi dari salah satu pembanding (CML161), yaitu MR10+o217, MR10+o2-25, MR10+o2-26, dan MR10+o2-35. Tidak satupun genotip yang memiliki tinggi letak tongkol yang berbeda nyata dari galur pembanding. Galur MR10+o2 umumnya memiliki tinggi tanaman yang relatif lebih tinggi dari galur Nei9008+o2. Hal ini berarti bahwa jika terdapat salah satu pasangan heterotik yang sesuai antara kedua kelompok galur ini, maka galur MR10+o2 sangat cocok untuk dijadikan sebagai tanaman pejantan. Pada karakter 50% umur berbunga, hanya galur Nei9008+o2-13 dan Nei9008+o2-37 yang nyata lebih genjah dibandingkan dengan kedua pembanding. Hasil Uji LSI untuk karakter hasil seperti yang disajikan pada Tabel 11, terlihat bahwa beberapa galur Nei9008+o2 yang memiliki potensi hasil lebih tinggi dari salah satu dan atau kedua galur pembanding. Tiga galur memperlihatkan hasil biji nyata lebih tinggi dari kedua galur pembanding yaitu Nei9008+o2-12 (3.8 t/ha), Nei9008+o2-15 dan Nei9008+o2-12 (3.9 t/ha). Berbeda halnya dengan hasil uji LSI pada Tabel 12, tidak terdapat galur MR10+o2 yang memiliki potensi hasil yang nyata lebih tinggi dari pembanding.
45
Tabel 11. Komponen agronomi dan hasil galur-galur hasi introgresi gen opaque-2 (oo) progeni CML161 x Nei9008 di lahan kering KP. Cikemeuh, Bogor, MK 2006. Genotip
TT cm
T_Tk cm
UBJ hari
UBB hari
Bobot Tkl
KA %
Y t/ha
Bobot 1000 biji g
Nei9008+o2-1 Nei9008+o2-2 Nei9008+o2-3 Nei9008+o2-4 Nei9008+o2-5 Nei9008+o2-6 Nei9008+o2-7 Nei9008+o2-8 Nei9008+o2-9 Nei9008+o2-10 Nei9008+o2-11 Nei9008+o2-12 Nei9008+o2-13 Nei9008+o2-14 Nei9008+o2-15 Nei9008+o2-16 Nei9008+o2-17 Nei9008+o2-18 Nei9008+o2-19 Nei9008+o2-20 Nei9008+o2-21 Nei9008+o2-22 Nei9008+o2-23 Nei9008+o2-24 Nei9008+o2-25 Nei9008+o2-26 Nei9008+o2-27 Nei9008+o2-28 Nei9008+o2-29 Nei9008+o2-30 Nei9008+o2-31 Nei9008+o2-32 Nei9008+o2-33 Nei9008+o2-34 Nei9008+o2-35 Nei9008+o2-36 Nei9008+o2-37 Nei9008+o2-38 Nei9008+o2-39 Nei9008+o2-40 Nei9008+o2-41 Nei9008+o2-42 CML161 (Cek-1) Nei9008 (Cek-2) LSI 5% KK %
90 84 104 93 83 103 94 103 94 83 90 88 113 101 118 94 100 109 97 103 100 85 97 105 98 92 108 80 105 102 111 111 81 97 106 97 99 94 99 103 109 110 101 99 18.4 6.6
36 30 46 47 33 47 34 43 41 31 36 33 46 48 59 47 46 53 42 52 47 42 58 52 33 44 53 37 57 52 47 52 33 48 50 42 52 44 44 53 52 51 50 47 19.3 15.9
59 59 60 60 60 58 59 60 59 61 59 58 58 58 61 61 60 60 60 61 61 61 61 60 60 60 61 61 61 62 60 60 60 61 61 60 57 61 60 61 61 61 59 60 1.6 1.1
60 60 62 61 61 60 60 61 60 62 61 60 58ab 59 62 62 62 60 61 62 63 61 62 60 62 61 62 62 60 64 60 60 60 61 61 60 58 ab 61 60 61 61 61 61 61 1.4 1.1
3.3 a 3.7 a 3.1 a 2.8 2.5 2.6 1.9 3.4 a 3.4 a 2.6 2.5 3.6 a 3.3 a 3.4 a 3.8 ab 2.6 2.6 3.7 a 2.1 3.2 a 3.3 a 2.8 3.2 a 3.5 a 2.7 3.5 a 2.1 2.1 3.6 a 3.7 a 4.0 a b 2.3 2.8 2.6 2.7 2.9 2.2 3.3 a 3.1 a 3.3 a 3.1 a 3.5 a 2.6 3.4 0.4 5.1
24.8 25.2 21.5 ab 31.6 25.5 26.5 22.0 ab 34.4 27.5 28.2 18.3 ab 21.1 ab 20.6ab 20.7 ab 25.2 24.9 24.2 25.5 24.4 21.2 ab 31.4 22.2 ab 25 25.7 24 28.7 24.9 22.0 ab 27.3 25 27.3 27.4 28.3 26.2 26.4 28.1 21.6 28.3 34.9 35.5 26.2 32 26.2 25.8 3.7 5.5
3.3 a 3.7 3.3 a 2.5 2.5 2.5 2.1 2.9 3.3 a 2.5 2.8 3.8 ab 3.5 a 3.6 a 3.9 ab 2.6 2.6 3.7 a 2.1 3.4 a 3.1 a 2.9 3.2 a 3.5 a 2.7 3.4 a 2.2 2.2 3.6 a 3.7 a 3.9 ab 2.2 2.7 2.6 2.6 2.8 2.3 3.2 a 2.7 2.8 3.1 a 3.2 a 2.5 3.3 0.3 5.0
284.8 204.8 234.8 294.8 294.8 314.8 a 224.8 344.8 ab 254.8 294.8 214.8 314.8 a 274.8 202.8 260.5 300.5 320.5 ab 260.5 245.5 320.5 ab 280.5 340.5 ab 340.5 ab 210.5 250.5 280.5 270.5 290.5 284.8 324.8 ab 254.8 164.8 304.8 114.8 246.8 224.8 344.8 ab 282.8 254.8 264.8 194.8 184.8 260.0 271.0 46.6 6.9
a
=nyata lebih baik dari cek-1(CML161) dan b = nyata lebih baik dari cek-2 (Nei9008) pada taraf 5 % LSI. Keterangan: TT = Tinggi tanaman (cm), (2) T_Tkl = Tinggi letak tongkol (cm), UBJ = Umur 50 % keluarnya pollen (hari), UBB = Umur50 % keluarnya rambut (hari), KA = kadar air, Y = hasil biji pada kadar air 15 % , (5) Bbj = bobot 1000 biji pada kadar air 15 % (g); Inf = Infeksi.
46
Tabel 12. Komponen agronomi dan hasil galur-galur hasi introgresi gen opaque-2 (oo) progeni CML161 x MR10 di lahan kering KP. Cikemeuh, Bogor, MK 2006. Genotip
MR10+o2-1 MR10+o2-2 MR10+o2-3 MR10+o2-4 MR10+o2-5 MR10+o2-6 MR10+o2-7 MR10+o2-8 MR10+o2-9 MR10+o2-10 MR10+o2-11 MR10+o2-12 MR10+o2-13 MR10+o2-14 MR10+o2-15 MR10+o2-16 MR10+o2-17 MR10+o2-18 MR10+o2-19 MR10+o2-20 MR10+o2-21 MR10+o2-22 MR10+o2-23 MR10+o2-24 MR10+o2-25 MR10+o2-26 MR10+o2-27 MR10+o2-28 MR10+o2-29 MR10+o2-30 MR10+o2-31 MR10+o2-32 MR10+o2-33 MR10+o2-34 MR10+o2-35 MR10+o2-36 CML161 (cek-1) MR10 (Cek-2) LSI 5% KK % a
TT
T_Tk
UBJ
UBB
Bobot
KA
Y
Bobot 1000 biji
cm
cm
hari
hari
Tkl
%
t/ha
g
104 113 116 114 126 131 126 120 113 103 108 106 116 107 129 126 140 a 120 124 105 131 111 121 121 137 a 150 a 114 126 109 107 110 126 111 105 136 a 134 116 126 17.8 5.7
40 53 52 44 52 56 57 56 58 44 45 48 55 50 60 59 58 48 50 48 50 55 55 55 58 73 55 60 50 48 45 49 47 48 57 60 52 52 25.0 19.9
57 55 57 57 57 56 57 58 57 57 58 57 58 58 58 56 55 56 56 57 56 57 57 57 57 57 58 57 58 57 57 57 57 56 57 57 57 56 2.9 2.0
59 58 58 59 58 57 58 60 59 58 59 58 60 59 60 58 56 57 57 58 57 59 58 58 59 58 60 59 59 58 58 58 58 57 59 58 58 56 4.1 2.8
1.8 3.5 2.8 2.9 2.7 2.3 3.7 2.5 2.9 2.5 2.9 4 2 3.1 3.4 3.6 2.4 3.2 2.7 3.8 2.4 2.8 2.2 3.5 3.6 3.7 2.9 2.1 3.9 3.1 4.3 2.5 3.6 4.6 a 3.9 1.8 3.1 3.8 1.2 14.0
23.4 22.9 24.8 23.5 21.4 25 23.8 23.5 23.1 25.7 21.7 25.6 22.2 23.2 24.8 24.1 19.9 21.3 25 18.7b 20.7 23 22.1 22 24.2 21.5 25.7 21 22.3 23.2 25.5 24.2 24.5 19.7 19.5 a 16.9 22.7 19.5 3.1 5.8
1.9 3.6 2.8 3.0 2.9 2.2 3.8 2.6 3.0 2.5 3.1 4.0 2.1 3.2 3.4 3.7 2.6 3.4 2.8 4.2 2.6 2.9 2.3 3.7 3.7 4 2.9 2.2 4.0 3.1 4.3 2.6 3.7 3.9 4.2 2.1 3.3 4.1 1.3 14.4
260.4 234.4 267.7 228.3 278.1 224.4 271.2 258.9 270.3 311.3 237.5 300.2 262.7 261.4 224.9 252.2 248.1 235.2 293.8 265.6 244.9 288.5 254.3 263.3 195.3 221.3 279 262.4 270.1 261 261.4 253.8 286.6 226.7 248.5 282.1 239.8 259.8 73.7 11.9
= nyata lebih tinggi dari cek-1(CML161) dan
Keterangan:
b
= nyata lebih baik dari cek-2 (MR10) pada taraf 5 % LSI.
TT = Tinggi tanaman (cm), (2) T_Tkl = Tinggi letak tongkol (cm), UBJ = Umur 50 % keluarnya pollen (hari), UBB = Umur50 % keluarnya rambut (hari), KA = kadar air, Y = hasil biji pada kadar air 15 % ,
Pengetahuan tentang potensi hasil galur sangat penting karena terkait dengan produksi benih hibrida. Salah satu kendala yang sering muncul dalam produksi benih hibrida adalah karena induk betina merupakan galur penyerbukan sendiri yang pada 47
umumnya memiliki produktivitas rendah (Poespodarsono, 1988). Galur yang memiliki potensi hasil tinggi juga memberi produktivitas benih hibrida yang tinggi. Permasalahan yang sering muncul di lapangan adalah tidak selamanya galur yang potensi hasilnya tinggi mendapatkan pasangaan heterotik yang sesuai untuk mendapatkan potensi hasil benih hibrida yang tinggi.
A
B
Gambar 13.
C
Penampilan tongkol galur jagung Nei9008 hasil introgresi gen homosigot resesif opaque-2 pada generasi BC3F3 Tampak dari kiri ke kanan (A) biji dengan opaque berwarna buram, (B) biji dengan opaque-semi buram dan (C) modifikasi opaque sempurna.
Selain potensi hasil, penampilan biji juga perlu mendapat perhatian dalam seleksi karena terkait dengan kelemahan penampilan biji dari QPM yaitu fenotipe biji yang lunak dan berkapur (Bjarnason dan Vasal, 1992). Hasil penelitian menunjukkan bahwa warna biji yang diperoleh bervariasi yaitu modifikasi biji opaque kurang dari 25%, modifikasi biji opaque 25% - 50%, modifikasi biji opaque diatas 50% dan modifikasi opaque sempurna (Gambar 13 dan 14). Hasil pengamatan di lapangan menunjukkan bahwa terdapat lorelasi positif antara warna biji dengan ketahanan galur-galur terhadap penyakit bulai. Galur-galur yang terseleksi resisten terhadap penyakit bulai, juga memililiki warna biji yang lebih jernih, sebaliknya galur yang berwarna biji buram lebih rentan terhadap penyakit bulai.
48
A
Gambar 14.
B
C
D
Penampilan biji jagung hasil introgresi gen homosigot resesif opaque-2 pada generasi BC3F3 di atas cahaya lampu. Tampak dari kiri ke kanan (A) biji jagung normal, (B) biji dengan opaque diatas 50%, (C) biji dengan opaque kurang dari 50% dan (D) modifikasi opaque sempurna. KESIMPULAN
1. Marka SSR spesifik phi057 dan umc1066 secara berturut-turut terbukti efektif dan efisien digunakan menyeleksi galur-galur progeni CML 161 x Nei9008 dan CML 161 x MR10 yang telah terintrogresikan dengan gen homosigot resesif opaque-2 (oo). 2. Uji Chi-kuadrat (2) untuk derajat kecocokan nisbah segregasi pada tiap generasi silang balik dan penyerbukan sendiri pada penelitian ini sesuai dengan nisbah hipotetik yaitu masing-masing 1 : 1 dan 1 : 2 : 1 3. Dari 50 progeni CML161 x Nei9008 tersaring dengan bantuan marka spesifik phi057, diperoleh 42 galur Nei9008+o2 yang bisa dievaluasi lebih lanjut, dan dari 42 progeni CML161 x MR10 yang tersaring dengan marka spesifik umc1066, diperoleh 36 galur MR10+o2. 4. Diperoleh beberapa galur Nei9008+o2 yang memiliki potensi hasil yang lebih tinggi dari salah satu dan atau kedua galur pembanding, sedangkan pada galur MR10+o2 potensi hasilnya tidak berbeda nyata dengan pembanding. 5. Penampilan warna biji galur hasil introgresi yang diperoleh bervariasi yaitu modifikasi biji opaque kurang dari 25%, modifikasi biji opaque 25% - 50%, modifikasi biji opaque diatas 50% dan modifikasi opaque sempurna.
49
