TESIS
IDENTIFIKASI SPESIES BEGOMOVIRUS YANG BERASOSIASI DENGAN PENYAKIT KUNING PADA TANAMAN KACANG PANJANG (Vigna sinensis L.) BERDASARKAN SEKUEN GEN TRAP DAN REP
I GEDE PUTU DARMAWAN
PROGRAM PASCASARJANA UNIVERSITAS UDAYANA DENPASAR 2016
TESIS
IDENTIFIKASI SPESIES BEGOMOVIRUS YANG BERASOSIASI DENGAN PENYAKIT KUNING PADA TANAMAN KACANG PANJANG (Vigna sinensis L.) BERDASARKAN SEKUEN GEN TRAP DAN REP
I GEDE PUTU DARMAWAN NIM 1490861004
PROGRAM MAGISTER PROGRAM STUDI BIOTEKNOLOGI PERTANIAN PROGRAM PASCASARJANA UNIVERSITAS UDAYANA DENPASAR 2016
i
IDENTIFIKASI SPESIES BEGOMOVIRUS YANG BERASOSIASI DENGAN PENYAKIT KUNING PADA TANAMAN KACANG PANJANG (Vigna sinensis L.) BERDASARKAN SEKUEN GEN TRAP DAN REP
Tesis untuk Memperoleh Gelar Magister pada Program Magister, Program Studi Bioteknologi Pertanian, Program Pascasarjana Universitas Udayana
I GEDE PUTU DARMAWAN NIM 1490861004
PROGRAM MAGISTER PROGRAM STUDI BIOTEKNOLOGI PERTANIAN PROGRAM PASCASARJANA UNIVERSITAS UDAYANA DENPASAR 2016
ii
Lembar Pengesahan
TESIS INI TELAH DISETUJUI TANGGAL 12 Juli 2016
Pembimbing I,
Pembimbing II,
Prof. Dr. Ir. I Gede Rai Maya Temaja, M.P. NIP. 19621009 198803 1 002
Dr. G. N. Alit Susanta Wirya, S.P., M.Agr. NIP. 19680115 199403 1 001
Mengetahui
Ketua Program Studi Bioteknologi Pertanian Program Pascasarjana Universitas Udayana,
Direktur Program Pascasarjana UniversitasUdayana,
Prof. Dr. Ir. I Gede Rai Maya Temaja, M.P. Prof. Dr. dr. A.A. Raka Sudewi, Sp.S(K). NIP. 19621009 198803 1 002 NIP. 19590215 198510 2 001
iii
PENETAPAN PANITIA PENGUJI
Tesis ini Telah Diuji pada Tanggal 12 Juli 2016
Panitia Penguji Tesis Berdasarkan SK Direktur Program Pascasarjana Universitas Udayana, No.3188/UN14.4/HK/2016, Tanggal 12 Juli 2016
Ketua : Prof. Dr. Ir. I Gede Rai Maya Temaja, M.P. Anggota : 1. Dr. Gusti Ngurah Alit Susanta Wirya, S.P., M.Agr. 2. Prof. Dr. Ir. I Made Sudana, M.S. 3. Dr. Ir. I Dewa Nyoman Nyana, M.Si. 4. Putu Sudiarta, S.P., M.Si., Ph.D
iv
SURAT PERNYATAAN BEBAS PLAGIAT
Saya yang bertanda tangan di bawah ini: Nama
: I Gede Putu Darmawan
NIM
: 1490861004
Program studi : Bioteknologi Pertanian Judul Tesis
: IDENTIFIKASI SPESIES BEGOMOVIRUS YANG BERASOSIASI DENGAN PENYAKIT KUNING PADA TANAMAN KACANG PANJANG (Vigna sinensis L.) BERDASARKAN SEKUEN GEN TRAP DAN REP
Dengan ini menyatakan bahwa karya ilmiah tesis ini bebas plagiat. Apabila dikemudian hari terbukti plagiat dalam karya ilmiah ini, maka saya bersedia menerima sanksi sesuai peraturan Mendiknas RI No. 17 Tahun 2010 dan Peraturan Perundang-undangan yang berlaku.
Denpasar, 12 Juli 2016 Yang membuat pernyataan
(I Gede Putu Darmawan)
v
UCAPAN TERIMA KASIH
Puji syukur penulis panjatkan kepada Ida Sang Hyang Widhi Wasa, karena atas asung kerta wara nugraha-Nya, maka tesis yang berjudul “Identifikasi Spesies Begomovirus Yang Berasosiasi Dengan Penyakit Kuning Pada Tanaman Kacang Panjang (Vigna sinensis L.) Berdasarkan Sekuen Gen Trap dan Rep”. Tesis ini merupakan salah satu syarat untuk memperoleh gelar Magister Bioteknologi Pertanian pada Program Pascasarjana Bioteknologi Pertanian Universitas Udayana. Penyusunan penelitian ini tidak terlepas dari dukungan dan bantuan dari berbagai pihak, pada kesempatan ini perkenankanlah penulis menyampaikan terima kasih kepada Prof. Dr. Ir. I Gede Rai Maya Temaja, M.P., sebagai Pembimbing I, yang telah memberikan dorongan, semangat, bimbingan, dan pengarahan selama penelitian dan penulisan tesis ini; Dr. I Gusti Ngurah Alit Susanta Wirya, S.P., M.Agr selaku Pembimbing II, yang dengan penuh perhatian memberikan semangat, bimbingan dan saran selama penyelesaian tesis ini. Ucapan terima kasih penulis tujukan kepada Rektor Universitas Udayana Prof. Dr. dr. Ketut Suastika, Sp.PD., KEMD, Ibu Direktur Pascasarjana Univeristas Udayana Prof. Dr. dr. A.A. Raka Sudewi, Sp. S(K) dan Prof. Dr. Ir. I Gede Rai Maya Temaja, M.P., selaku Ketua Program Studi Bioteknologi Pertanian Program Pascasarjana Universitas Udayana atas kesempatan yang diberikan kepada penulis untuk menjadi mahasiswa Program Magister pada Program Pascasarjana Universitas Udayana serta seluruh staf dosen dan staf administrasi yang telah banyak membantu penulis selama menempuh pendidikan. Penulis pada kesempatan ini juga mengucapkan terima kasih yang sebesar-besarnya kepada Dr. Ir. Gede Suastika, M.Sc. dan staf Laboratorium Virologi Institut Pertanian Bogor atas kerjasama dan kesempatan untuk belajar dan kemudahan dalam menggunakan fasilitas Laboratorium Virologi selama penulis melakukan penelitian. Ucapan terima kasih penulis sampaikan pula kepada para Penguji tesis, yaitu Prof. Dr. Ir. Made Sudana, M.S., Dr.
vi
Ir. I Dewa Nyoman Nyana, M.Si., dan Putu Sudiarta, S.P., M.Si., Ph.D yang telah memberikan banyak masukan, saran, dan arahan sehingga tesis ini dapat terwujud dengan lebih baik. Ucapan terima kasih yang tulus penulis sampaikan kepada kedua orang tua tercinta Ir. I Gde Made Sukawijaya, M.M., dan Dra. Ni Luh Putu Padmawati, M.Pd., kakak I Gede Made Budi Prasetyawan, S.T., Ni Luh Putu Jatmikawati, S.Par., bersama seluruh keluarga yang tidak dapat penulis sebutkan satu per satu atas dukungan, semangat dan do’a selama penulis menyelesaikan pendidikan terutama penyusunan tesis ini. Akhirnya ucapan terima kasih penulis sampaikan juga atas perhatian dan motivasinya dari teman-teman Agroekoteknologi ’10 ; teman-teman Biotek ’14; teman-teman virologi di Fakultas Pertanian Universitas Udayana. Semoga Ida Sang Hyang Widhi Wasa selalu melimpahkan rahmat-Nya kepada semua pihak yang telah membantu pelaksanaan dan penyelesaian tesis ini. Semoga tesis ini dapat memberikan sumbangan bagi pengembangan ilmu pengetahuan dan bermanfaat bagi semua.
Denpasar, 12 Juli 2016
Penulis
vii
ABSTRAK IDENTIFIKASI SPESIES BEGOMOVIRUS YANG BERASOSIASI DENGAN PENYAKIT KUNING PADA TANAMAN KACANG PANJANG (Vigna sinensis L.) BERDASARKAN SEKUEN GEN TRAP DAN REP
Kacang panjang merupakan salah satu sayuran yang memiliki nilai gizi serta kandungan vitamin yang baik bagi kesehatan. Seiring dengan pertambahan penduduk yang semakin tinggi maka secara otomatis kebutuhan akan sayuran khususnya kacang panjang akan semakin meningkat, sehingga diperlukan peningkatan produksi kacang panjang. Virus merupakan salah satu penyakit utama pada kacang panjang yang menginduksi gejala kuning dan menurunkan produksi kacang panjang di Bali. Identitas dari virus yang berasosiasi dengan penyakit tersebut perlu diteliti agar tindakan penanganannya dapat dilakukan dengan tepat. Penelitian ini dilakukan untuk mengetahui jenis virus penyebab penyakit kuning pada tanaman kacang panjang di Bali dan kedekatan sekuen nukleotida isolat Begomovirus yang menginfeksi pertanaman kacang panjang di Bali dengan jenis Begomovirus dari daerah lain. Penelitian ini menggunakan teknik PCR untuk mendeteksi virus tanaman dan dilanjutkan dengan perunutan sikuen nukleotida gen Trap dan Rep untuk dianalisis kedekatannya dengan beberapa isolat dari GeneBank. Hasil penelitian menunjukkan bahwa gejala kuning pada kacang panjang di Bali tersebut merupakan infeksi dari spesies Begomovirus yaitu Mungbean yellow mosaic india virus (MYMIV) dengan ukuran pita DNA sekitar 912 bp, dan berdasarkan analisis filogenetika sikuen nukleotida gen Trap dan Rep, isolat Bali K1 memiliki similaritas yang tinggi (98%) dan jarak genetik yang kecil (0.017) dengan isolat asal Brebes 2 dan Brebes 4. Kata kunci : Kacang Panjang, kuning, Begomovirus, MYMIV.
viii
ABSTRACT IDENTIFICATION OF BEGOMOVIRUS SPESIES ASSOCIATED WITH YELLOWING DISEASES IN YARD LONG BEAN (Vigna sinensis L.) BASED ON TRAP AND REP GENE SEQUENCES Yard long bean is the vegetable that has nutritional value and contain vitamins that is good for health. Along with the higher population growth then automatically the need for vegetables, especially yard long beans will be increased, so that the necessary an increase in the production of yard long bean. Virus is one of the major diseases in the yard long beans that induces yellowing symptoms and reduce the production of yard long beans in Bali. The identity of the virus associated with the disease need to be researched so that action can be done with the right handling. This research was conducted to determine the type of virus that causes yellowing diseases in the yard long bean plants in Bali and the similarity of the nucleotide sequence Begomovirus isolates that infect crop yard long beans in Bali with Begomovirus kinds of other areas. This study using PCR techniques to detect plant viruses and continued with tracking the nucleotide sequences of Trap and rep genes to be analyzed and its similirity to some of the isolates from GeneBank. The results showed that the symptoms of yellowing on yard long beans in Bali is an infected by Begomovirus species is Mungbean yellow mosaic india virus (MYMIV) with the size of the DNA band of about 912 bp, and based on the analysis of phylogenetic sequence of nucleotides of Trap and rep genes and isolate Bali has a high similarity (98%) and small genetic distance (0.017) with isolates from Brebes 2 and Brebes 4. Keywords : Yard Long Bean, yellowing, Begomovirus, MYMIV.
ix
RINGKASAN
Kacang panjang (Vigna sinensis L.) merupakan salah satu komoditas sayuran yang sudah lama dikenal dan digemari banyak orang. Tanaman kacang panjang sangat berpotensi untuk dikembangkan sebagai komoditi usaha tani, karena selain mudah dibudidayakan, pangsa pasarnya juga cukup tinggi. Berdasarkan data statistik produksi kacang panjang di Bali dari tahun ke tahun berfluktuasi dan cenderung mengalami penururnan. Penurunan produksi kacang panjang disebabkan oleh beberapa hal, salah satunya adalah penyakit tanaman, khususnya dari golongan virus. Penyebaran dari virus sangatlah cepat dan akan menimbulkan gangguan pertumbuhan yang nantinya akan mempengaruhi produksi kacang panjang. Terdapat dua jenis gejala virus yang menginfeksi kacang panjang yaitu mosaik dan kuning. Penyakit kuning yang menginfeksi tanaman kacang panjang di Bali mulai memberikan dampak yang cukup merugikan bagi petani. Karena tanaman yang terinfeksi virus tersebut mengakibatkan penurunan hasil produksi. Kejadian penyakit di lokasi survei menunjukan keseluruhan tanaman terinfeksi, namun ada pula yang sebagian dari populasi tanaman terinfeksi virus mosaik. Infeksi dari virus kuning menyebabkan daun dari tanaman menjadi kuning terang dan tanaman menjadi kerdil, sehingga berdampak pada produksi tanaman. Gejala yang muncul mirip dengan gejala penyakit yang disebabkan oleh Begomovirus. Kejadian penyakit kuning pada tanaman kacang panjang merupakan kejadian baru di daerah Bali, sehingga identitas dari virus yang berasosiasi dengan penyakit tersebut perlu diteliti, agar tindakan pengendalian penyakit dapat dilakukan dengan tepat. Berdasarkan fenomena tersebut, penelitian ini dilakukan untuk mengetahui jenis virus penyebab penyakit daun kuning pada tanaman kacang panjang di Bali dan kedekatan sikuen nukleotida jenis Begomovirus yang menginfeksi pertanaman kacang panjang di Bali dengan jenis Begomovirus dari daerah lain. Identifikasi dan karakterisasi Begomovirus yang menyebabkan penyakit kuning di Indonesia, khususnya untuk kejadian penyakit kuning yang ada di Bali belum dilakukan secara khusus. Untuk mengetahui spesies dari Begomovirus yang menginfeksi tanaman kacang panjang di Bali, maka dilakukan identifikasi yaitu dengan menggunakan metode molekuler. Identifikasi virus secara molekuler dengan analisis sekuen nukleotida serta mencari kedekatan dari sekuen nukleotida virus tersebut dengan sekuen nukleotida dari beberapa daerah lain diharapkan dapat digunakan sebagai acuan untuk tindakan pengendalian penyebaran virus selanjutnya. Penelitian ini dilakukan dengan menggunakan teknik Polymerase Chain Reaction (PCR). Hasil PCR divisualisasikan dalam gel agarosa pada elektroforesis. Hasil PCR yang positif selanjutnya dilakukan sekuensing untuk mendapatkan urutan nukleotida virus. Urutan nukleotida tersebut dijadikan dasar untuk mencari kesamaan isolat virus di Tabanan dengan isolat virus dari daerah lain. Data sekuen nukleotida yang terpilih kemudian dimodifikasi dan analisis spesifisitas nukleotida dilakukan
x
dengan program multiple alignment, Clustal W yang terintegrasi pada program MEGA 6.0. Analisis filogenetika dikonstruksi menggunakan program PAUP 4.9, jModelTest berdasarkan pendekatan Maximum Parsimony. Berdasarkan hasil survei dan pengamatan gejala penyakit kuning beberapa sentra penanaman kacang panjang di Bali maka ditemukan bahwa gejala yang terlihat pada tanaman kacang panjang dengan gejala kuning, adalah helaian daun berwana kuning cerah dan tulang daun mengalami vein clearing. Rata-rata kejadian penyakit mosaik dan kuning beberapa sentra penanaman kacang panjang menunjukan hasil bahwa kejadian penyakit mosaik memperlihatkan persentase sebesar 40,77% dan untuk kejadian penyakit kuning menunjukan persentase sebesar 40,55%. Kondisi ini menunjukan bahwa tingkat prevalensi virus kuning dan mosaik hampir merata pada beberapa sentra penanaman kacang panjang yang diamati. Data pengamatan per kabupaten sedikit mengalami perbedaan yaitu lima Kabupaten yang memiliki kejadian penyakit kuning yang tinggi meliputi, Tabanan, Badung, Klungkung, Karangasem, dan Gianyar. Berdasarkan data kejadian penyakit ini maka kelima kabpaten yang memiliki kejadian penyakit tertinggi ini dilanjutkan dengan proses deteksi dan identifikasi virus melalui PCR. Hasil amplifikasi dari lima sampel daun kacang panjang yang bergejala kuning dari Tabanan, Badung, Klungkung, Karangasem, dan Gianyar dengan menggunakan primer universal Begomovirus (SPG1 dan SPG2) menunjukkan positif pada 912 bp. Sampel-sampel yang menunjukkan positif Begomovirus selanjutnya dilakukan perunutan DNA. Pengujian tingkat homologi antar isolat menunjukan bahwa Isolat Begomovirus Bali (Tabanan) mempunyai kesamaan sebesar 98 % dengan isolat Begomovirus yang berasal dari Indonesia yaitu Brebes (B2, B4, B3, B1), Purwakarta (P1 dan P2), Bogor, dan Rembang. Sedangkan jika dilihat dari jarak genetiknya, Isolat Begomovirus Bali dengan isolat MYMIV Brebes 2 dan 4 memiliki nilai jarak genetik yang paling rendah yaitu 0,017. Nilai tersebut menunjukan bahwa tingkat kedekatan antara Isolat Begomovirus Bali dengan Isolat MYMIV Brebes 2 dan 4 sangat tinggi. Tingginya kedekatan antara Isolat Begomovirus Bali dengan isolat MYMIV Brebes 2 dan 4 menunjukan bahwa ketiga isolat tersebut memiliki kesamaan gen yang tinggi. Hasil analisis filogenetika dengan 1000 kali ulangan Bootstrap dan pendekatan Maximum parsimony menunjukan bahwa Begomovirus isolat Bali merupakan spesies virus Mungbean yellow mosaic india virus. Bgomovirus isolat Bali 1 berada satu kelompok dengan sekuen-sekuen anggota MYMIV yang berasal dari Indonesia dan Asia Selatan, dengan dukungan 90,5% Bootstrap suport (BS). Secara spesifik Begomovirus isolat Bali tersebut masuk ke dalam kelompok kecil pertama yang terdiri dari MYMIV Brebes 2 dan 4, MYMIV Purwarkarta 1 dan 2, MYMIV Brebes 3 dan 1, dengan dukungan 76,5 Bootstrap Suport.
xi
Berdasarkan hasil penelitian dapat disimpulkan bahwa gejala kuning pada tanaman kacang panjang di beberapa sentra penanaman kacang panjang di Bali berasosiasi dengan infeksi virus dari genus Begomovirus. Spesies Begomovirus yang menginfeksi kacang panjang di Bali adalah Mungbean yellow mosaic india virus. Isolat Mungbean yellow mosaic indiavVirus Bali (isolat asal Kabupaten Tabanan, Bali) mempunyai similaritas sangat tinggi (98%), jarak genetik yang kecil (0,017) dan berada berada dalam subsubsubsubkelompok yang sama dengan isolat Mungbean yellow mosaic india virus Bali yang berasal dari Jawa (Indonesia).
xii
DAFTAR ISI Halaman SAMPUL DALAM ...................................................................................... i PRASYARAT GELAR ................................................................................
ii
LEMBAR PENGESAHAN ..........................................................................
iii
PENETAPAN PANITIA PENGUJI .............................................................
iv
SURAT PERNYATAAN BEBAS PLAGIAT ...............................................
v
UCAPAN TERIMAKASIH ..........................................................................
vi
ABSTRAK ...................................................................................................
viii
ABSTRACT .................................................................................................
ix
RINGKASAN ..............................................................................................
x
DAFTAR ISI ................................................................................................
xiii
DAFTAR TABEL ........................................................................................
xvi
DAFTAR GAMBAR .................................................................................... xvii DAFTAR LAMPIRAN ................................................................................ xviii
BAB
I
PENDAHULUAN ................................................................
1
1.1
Latar Belakang .......................................................................
1
1.2
Rumusan Masalah .................................................................
4
1.3
Tujuan Penelitian ..................................................................
5
1.4
Manfaat Penelitian ................................................................
5
KAJIAN PUSTAKA ............................................................
6
Penyakit pada Kacang Panjang yang Disebabkan oleh Virus .........
6
2.1.1 Bean common mosaic virus (BCMV) ............................
6
2.1.2 Tobaco mosaic virus (TMV) ........................................
7
BAB II 2.1
xiii
BAB
BAB
2.1.3 Cucumber mosaic virus (CMV) ....................................
8
2.1.4 Mungbean yellow mosaic india virus (MYMIV) ..........
9
2.2 Begomovirus Penyebab Penyakit Kuning ....................................
10
2.2.1 Karakter Molekuler Begomovirus .................................
11
2.2.2 Gejala infeksi Begomovirus ..........................................
14
2.2.3 Kisaran Inang Begomovirus .........................................
16
2.2.4 Penularan Begomovirus ................................................
17
2.3
Metode Identifikasi Begomovirus...........................................
19
2.4
Analisis Filogenetika ............................................................
21
2.4.1 Sequence Alignment ......................................................
23
2.4.2 Rekontruksi Pohon Filogenetika....................................
23
2.4.2.1 Distance method .................................................
24
2.4.2.2 Maximum likelihood dan bayessian inference .....
25
2.4.2.3 Maximum parsimony ..........................................
26
2.4.3 Evaluasi pohon filogenetika...................................
27
III
KERANGKA BERPIKIR, KONSEP DAN HIPOTESIS ......
28
3.1
Kerangka Berpikir .................................................................
28
3.2
Konsep Penelitian ..................................................................
31
3.3
Hipotesis ...............................................................................
31
IV
METODE PENELITIAN.......................................................
32
4.1.
Tempat dan Waktu Penelitian ...............................................
32
4.2
Pelaksanaan Penelitian ...........................................................
32
4.2.1 Pengambilan sampel tanaman yang bergejala kuning ....
32
4.2.2 Penghitungan gejala penyakit ........................................
32
4.2.3 Identifikasi virus secara molekuler ................................
33
4.2.3.1 Ekstrasi Total DNA ...........................................
33
xiv
BAB
4.2.3.2 Amplifikasi DNA ............................................
34
4.2.3.3 Visualisasi hasil PCR.......................................
34
4.2.3.4 Sekuen nukleotida dan analisis filogenetika .....
35
V
HASIL DAN PEMBAHASAN .............................................
37
5.1
Gejala Infeksi Begomovirus Pada Tanaman Kacang Panjang .....................................................................
37
5.2
Kejadian Penyakit Kuning di Bali ..........................................
40
5.3
Identifikasi Begomovirus Secara Molekuler ...........................
42
5.4
Analisis Hubungan Kekerabatan Antara Isolat-Isolat .............
44
V
SIMPULAN DAN SARAN ..................................................
50
DAFTAR PUSTAKA ..................................................................................
51
LAMPIRAN …………………………………………………………………
59
BAB
xv
DAFTAR TABEL 2.1
Halaman Jenis dan Fungsi Gen Begomovirus ................................................... 14
5.1
Persentase kejadian penyakit mosaik dan kuning di Bali berdasarkan pengamatan gejala ......................................................... 41
5.2
Homologi Begomovirus yang menginfeksi tanaman kacang panjang di Bali dengan sekuen homolognya yang ada di GenBank ....................................................................................... 44
5.3
Jarak genetik Begomovirus yang menginfeksi tanaman Kacang panjang di Bali dengan sekuen homolognya yang ada di GenBank ....................................................................................... 46
xvi
DAFTAR GAMBAR Halaman 2.1
Organisasi genom DNA-A dan DNA-B Begomovirus .......................
13
3.1
Bagan kerangka konsep penelitian ....................................................
31
5.1
Variasi gejala pada tanaman kacang panjang, A: gejala bercak kuning disepanjang tulang daun, B: vein clearing dan daun kacang panjang berwarna kuning cerah, C: daun kacang panjang menguning mengalami, dengan beberapa bagian daun tetap berwarna hijau dan melepuh D: Malformasi daun, batang mengalami pemendekan/stunting ..........
38
Hasil amplifikasi DNA gen Trap dan Rep dengan metode PCR, menggunakan primer SPG 1 dan SPG 2, dengan produk PCR ~912 bp.. ..................................................................................
43
Hubungan kekerabatan 18 isolat virus hasil analisis kelompok berdasarkan pola pita DNA dengan metode Maximum Parsimony... ......................................................................
48
5.2
5.3
xvii
DAFTAR LAMPIRAN Halaman 1
Penyejajaran urutan nukleotida fragmen DNA isolat Mungbean yellow mosaic india virus Bali dengan isolat Mungbean yellow mosaic india virus lainnya yang terdapat di GenBank. Tanda * (bintang) menunjukkan basa nukleotida yang identik ...................................................................
xviii
59
