DETEKSI DAN IDENTIFIKASI SPESIES NEMATODA PURU AKAR Meloidogyne PENYEBAB UMBI BERBINTIL PADA KENTANG
APRILYANI
SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2015
iii
PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA* Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis berjudul Deteksi dan Identifikasi Spesies Nematoda Puru Akar Meloidogyne Penyebab Umbi Berbintil pada Kentang adalah benar karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir tesis ini. Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut Pertanian Bogor. Bogor, Mei 2015 Aprilyani NIM A351130324
RINGKASAN APRILYANI. Deteksi dan Identifikasi Spesies Nematoda Puru Akar Meloidogyne Penyebab Umbi Berbintil pada Kentang. Dibimbing oleh SUPRAMANA dan GEDE SUASTIKA. Kentang (Solanum tuberosum L.) adalah tanaman dari famili Solanaceae yang merupakan tanaman pangan keempat utama dunia sesudah gandum, jagung dan padi. Indonesia merupakan salah satu produsen kentang di Asia Tenggara dengan sentra produksi utama di Pulau Jawa, yaitu di provinsi Jawa Barat, Jawa Tengah, dan Jawa Timur. Produksi kentang mengalami penurunan yang disebabkan oleh beberapa faktor salah satunya adalah gangguan hama dan penyakit. Nematoda puru akar/NPA (Meloidogyne spp.) adalah salah satu patogen pada kentang yang berdampak nyata dalam mengurangi kualitas dan kuantitas umbi kentang. Penelitian untuk mendeteksi dan mengidentifikasi spesies Meloidogyne pada kentang di pulau Jawa dilaksanakan di Laboratorium Nematologi Departemen Proteksi Tanaman IPB, Laboratorium Karantina Tumbuhan Tanjung Priok Wilker Pos Bogor, dan Laboratorium Karantina Tumbuhan BBKP Soekarno-Hatta. Contoh umbi kentang yang sakit yaitu umbi berbintil diambil dari Pangalengan (Jawa Barat), Banjarnegara (Jawa Tengah), dan Kota Batu (Jawa Timur). Penelitian dilaksanakan dari bulan Oktober 2014 hingga Maret 2015. Identifikasi secara morfologi dilakukan terhadap pola perineal (sidik pantat) nematoda betina. Identifikasi secara molekuler menggunakan teknik Polymerase Chain Reaction (PCR) dilanjutkan dengan sikuensing fragmen DNA dan analisis filogenetik. DNA nematoda berasal dari ekstraksi nematoda betina dan diamplifikasi dengan PCR menggunakan primer spesifik untuk Meloidogyne incognita (MI-F dan MI-R), M. arenaria (Far dan Rar), dan M. javanica (Fjav dan Rjav). Primer multipleks, yaitu JMV1, JMV2, dan JMV-hapla digunakan untuk mendeteksi M. hapla, M. falax, dan M. chitwoodi. Gejala penyakit oleh NPA di lapangan ditemukan bervariasi, antara lain permukaan umbi tidak rata, bergelombang, tidak normal, dan berbintil dan terkadang disertai dengan adanya infeksi dari patogen lain sehingga umumnya umbi cepat busuk. Pada bagian dalam umbi terdapat bercak-bercak berwarna krem kekuningan (nekrosis) yang terdiri atas nematoda betina dan massa telur. Hasil identifikasi berdasarkan karakter morfologi diikuti (konfirmasi) identifikasi secara molekuler dengan PCR menunjukkan bahwa spesies yang berasosiasi dengan umbi berbintil pada kentang di tiga sentra produksi kentang di Pulau Jawa adalah M. arenaria, M. javanica, dan M. incognita. M. incognita dan M. javanica terdeteksi di Pangalengan, Banjarnegara, dan Kota Batu sedangkan M. arenaria hanya terdeteksi di Pangalengan dan Banjarnegara. Produk PCR kemudian digunakan untuk sikeunsing untuk menunjukkan adanya hubungan filogenetik dan homologi dengan isolat dari negara lain. Isolat M. javanica asal Pangalengan berkerabat sangat dekat dengan isolat M. javanica asal Cina dan Malaysia dengan tingkat homologi yang tinggi yaitu berturut-turut sebesar 95.7% dan 95.4%. Isolat M. incognita asal Pangalengan memiliki hubungan kekerabatan yang sangat dekat dengan isolat asal Cina, India, dan
5
Malaysia dan memiliki nilai homologi yang tinggi dengan M. incognita asal Cina, India, dan Malaysia berturut-turut sebesar 99.8%, 99.6%, dan 99.2%. Kata kunci: filogenetik, M. arenaria, M. javanica, M. incognita, pola perineal.
SUMMARY APRILYANI. Detection and Identification of the Root-knot Nematodes Species Meloidogyne Causing the Pimple-like Knot on Potato Tuber. Supervised by SUPRAMANA and GEDE SUASTIKA. Potato (Solanum tuberosum L.) is one of the Solanaceous plant considered as the forth main staple food after wheat, corn, and rice. Indonesia is a potato producer country in Southeast Asia with production areas mainly location in Java Island, i.e. West Java, Central Java, and East Java. Potatoes production are decreasing recently due to by many factors including pests and diseases. Root knot nematode (Meloidogyne spp.) is one of the pathogen which might contribute to a significant loss of the quality and quantity of potato tubers. This research was aimed to detect and identify the species of Meloidogyne on potato in Java island. The infected potato tubers, showing pimple-like knot, were collected from Pangalengan (West Java), Banjarnegara (Central Java), and Kota Batu (East Java). The research was conducted in Nematology Laboratory, Department Plant Protection, IPB; Plant Quarantine Laboratory Tanjung Priok Agriculture Quarantine; and Soekarno-Hatta Plant Quarantine from October 2014 to March 2015. Nematode identification was carried out based on morphological perineal pattern of adult female. Molecular identification was conducted by Polymerase Chain Reaction (PCR) technique and followed by DNA fragmen sequencing and phylogenetic analysis. Nematode DNA is extracted from adult female and amplified by PCR using spesific primer for Meloidogyne incognita (MI-F dan MI-R), M. arenaria (Far dan Rar), and M. javanica (Fjav dan Rjav). A multiplex primer JMV1, JMV2, and JMV-hapla was used to detect M. hapla, M. falax, and M. chitwoodi. Variation of the infected tuber by Meloidogyne was observed in the field, involving unsmoothing, wavy, blemish and pimple-like skin of potato tuber even followed later infection by other pathogens so that tuber decayed quickly. Necrosis occurred inside the infected tuber which consisted of adult female of Meloidogyne and egg masses. Identification based on morphological character was further confirmated by molecular identification using PCR technique. Three Meloidogyne species was found i.e. M. arenaria, M. javanica, and M. incognita. M. incognita and M. javanica were detected in Pangalengan, Banjarnegara, and Kota Batu while M. arenaria was only detected in Pangalengan and Banjarnegara. Based on the DNA fragment sequencing and phylogenetic analysis, M. javanica isolate from Pangalengan was closely related to M. javanica isolates from China and Malaysia with homology of 95.7% and 95.4%, respectively. M. incognita isolate from Pangalengan was closely related to isolates from China, India, and Malaysia with high homology level of 99.8%, 99.6%, and 99.2%, respectively. Key words: M. arenaria, M. javanica, M. incognita, perineal pattern, phylogenetic.
© Hak Cipta Milik IPB, Tahun 2015 Hak Cipta Dilindungi Undang-Undang Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan, penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan IPB Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis ini dalam bentuk apa pun tanpa izin IPB
DETEKSI DAN IDENTIFIKASI SPESIES NEMATODA PURU AKAR Meloidogyne PENYEBAB UMBI BERBINTIL PADA KENTANG
APRILYANI
Tesis sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Magister Sains pada Program Studi Fitopatologi
SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2015
Penguji Luar Komis pada Ujian Tesis: Dr Ir Arifin Tasrif, MSc MM.
PRAKATA Alhamdulillahirobbil’alamiin. Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah Subhanahu Wa Ta’ala atas segala karunia-Nya sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Tema yang dipilih dalam penelitian yang dilaksanakan sejak bulan Oktober 2014 ini ialah Deteksi dan Identifikasi Spesies Nematoda Puru Akar Meloidogyne Penyebab Umbi Berbintil pada Kentang. Terima kasih banyak penulis ucapkan kepada Dr Ir Supramana, MSi dan Dr Ir Gede Suastika, MSc selaku pembimbing yang telah banyak memberikan bimbingan, arahan, saran dan juga motivasi selama penelitian hingga penulisan akhir karya tulis ini. Di samping itu, penghargaan penulis sampaikan kepada Prof Dr Ir Sri Hendrastuti Hidayat, MSc selaku Ketua Program Studi Fitopatologi Sekolah Pascasarjana IPB, Dr Ir Pudjianto, MSi selaku Ketua Program Studi Entomologi Sekolah Pascasarjana IPB, dan Dr Ir Abdul Muin Adnan, MS selaku Kepala Laboratorium Nematologi. Penulis juga mengucapkan terima kasih kepada Dr Ir Arifin Tasrif MSc MM selaku Kepala Pusat Kepatuhan Kerjasama dan Informasi Perkarantinaan sekaligus sebagai Penguji Luar Komisi. Penulis mengucapkan terima kasih kepada Dr Ir H M. Musyaffak Fauzi, SH MSi selaku Kepala Balai Besar Karantina Pertanian Soekarno-Hatta yang telah memberi ijin kepada penulis untuk mengikuti tugas belajar ini. Ucapan terima kasih penulis sampaikan kepada Dr Ir Nina Maryana, MSi atas rekomendasinya hingga penulis dapat melanjutkan studi pada Sekolah Pascasarjana IPB. Tidak lupa penulis ucapkan terima kasih kepada seluruh staf pengajar Departemen Proteksi Tanaman IPB. Ucapan terima kasih juga disampaikan kepada Badan Karantina Pertanian yang telah memberikan beasiswa dan Kepala Balai Besar Karantina Pertanian Tanjung Priok. Selain itu, penulis sampaikan terima kasih atas bantuannya kepada Dra Endang Winarni dan rekan-rekan di Karantina Tumbuhan BBKP SoekarnoHatta, juga kepada Ibu Iyar SP dan rekan-rekan di Wilker Pos Bogor BBKP Tanjung Priok. Penulis juga ucapkan terima kasih kepada Pak Alit di Pangalengan (Bandung), Miftahul Huda SP dan Agus Susilo di Banjarnegara, rekan-rekan BBKP Surabaya Wilker Malang (Mba Silvi, Mba Siska dkk) atas bantuannya, Fitrianingrum Kurniawati SP MSi, Hishar Mirsam SP MSi, dan Bapak Gatut Heru Bromo atas bantuannya, juga teman-teman satu angkatan (2013-2015) atas bantuan dan dukungannya. Ungkapan terima kasih yang tak terhingga juga penulis sampaikan kepada kedua orang tua yaitu Bapak Sutan Busman (alm), Ibunda Cinenah, serta seluruh keluarga, atas segala doa dan kasih sayangnya. Akhir kata penulis persembahkan untuk suami tercinta serta ananda Busmannisa Hilmalia Rizky. Semoga tulisan ini bermanfaat. Bogor, Mei 2015 Aprilyani A351130324
DAFTAR ISI DAFTAR TABEL DAFTAR GAMBAR DAFTAR LAMPIRAN PENDAHULUAN Latar Belakang Tujuan Penelitian Manfaat penelitian Hipotesis TINJAUAN PUSTAKA Kentang (Solanum tuberosum L.) Nematoda Puru Akar (Meloidogyne spp.) Spesies-spesies Meloidogyne Deteksi dan Identifikasi Meloidogyne BAHAN DAN METODE Pengambilan Sampel Umbi Identifikasi Spesies Meloidogyne berdasarkan Karakter Morfologi Identifikasi NPA berdasarkan PCR ITS r-DNA HASIL DAN PEMBAHASAN Lokasi Pengambilan Sampel Gejala Penyakit Meloidogyne spp. Spesies Meloidogyne berdasarkan ITS r-DNA Pembahasan Umum SIMPULAN DAN SARAN Simpulan Saran DAFTAR PUSTAKA LAMPIRAN RIWAYAT HIDUP
xv xv xvi 1 1 2 2 2 3 3 4 7 9 11 11 11 11 14 14 14 17 21 24 24 24 25 29 34
DAFTAR TABEL 1. Amplifikasi fragmen ITS-rDNA spesies Meloidogyne menggunakan PCR 2. Homologi sikuen nukleotida M. javanica asal Pangalengan dengan M. javanica yang ada di GenBank 3. Homologi sikuen nukleotida M. incognita asal Pangalengan dengan M. incognita yang ada di GenBank
12 18 20
DAFTAR GAMBAR 1. Gejala infeksi Meloiodogyne spp. pada umbi kentang 2. Siklus hidup Meloidogyne spp. 3. Lokasi pertanaman kentang (a) Pangalengan (Jawa Barat); (b) Banjarnegara (Jawa Tengah); (c) Kota Batu (Jawa Timur) 4. Variasi gejala yang disebabkan oleh Meloidogyne spp. pada umbi (a) permukaan kulit umbi tidak rata; (b) bergelombang; (c) berbintil 5. Gejala nekrosis pada umbi kentang yang terinfeksi Meloidogyne spp. 6. Nematoda betina Meloidogyne spp. dengan massa telur (a) nematoda betina; (b) massa telur 7. Pola perineal M. incognita (Perbesaran 400x). (a) M. incognita menurut Eissenback et al. (1981); (b) M. incognita asal Pangalengan; (c) M. incognita asal Banjarnegara; (d) M. incognita asal Kota Batu 8. Pola perineal M. javanica (Perbesaran 400x). (a) M. javanica menurut Eissenback et al. (1981); (b) M. javanica asal Pangalengan; (c) M. javanica asal Banjarnegara; (d) M. javanica asal Kota Batu 9. Pola perineal M.arenaria (Perbesaran 400x). (a) M. arenaria menurut Eissenback et al. (1981); (b) M. arenaria asal Pangalengan 10. Hasil amplifikasi DNA Meloidogyne spp. dengan menggunakan primer spesifik M. javanica (M: Marker 100 pb; 1: Pangalengan; 2: Banjarnegara; 3: Kota Batu 11. Pohon filogeni M. javanica yang menginfeksi kentang di Pangalengan, Jawa Barat 12. Hasil amplifikasi DNA Meloidogyne spp. dengan menggunakan primer spesifik M. incognita (M: Marker 100 pb; 1: Pangalengan; 2: Banjarnegara; 3: Kota Batu) 13. Pohon filogeni M. incognita yang menginfeksi kentang di Pangalengan, Jawa Barat 14. Hasil amplifikasi DNA Meloidogyne spp. dengan menggunakan primer spesifik M. arenaria (M: Marker 100 pb; 1: Pangalengan; 2: Banjarnegara; 3: Kota Batu)
5 6 14 14 15 15
16
17 17
18 19
19 20
21
DAFTAR LAMPIRAN 1. Runutan basa nukleotida M. javanica Pangalengan 2. Runutan basa nukleotida M. incognita Pangalengan
29 31
1
PENDAHULUAN Latar Belakang Kentang (Solanum tuberosum L.) adalah tanaman pangan utama dunia yang menempati urutan keempat sesudah gandum, jagung dan padi (Rubatzky dan Yamaguchi 1998). Kandungan gizi yang lengkap pada kentang menyebabkan kentang dijadikan sebagai pangan alternatif. Kebutuhan akan kentang semakin tinggi seiring meningkatnya jumlah penduduk dan gaya hidup masyarakat (Rukmana 1997). Indonesia merupakan salah satu produsen kentang di Asia Tenggara. Daerah sentra pertanaman kentang di Indonesia adalah Nangroe Aceh Darussalam, Sumatera Utara, Sumatera Barat, Jambi, Jawa Barat, Jawa Tengah, Jawa Timur, Sulawesi Utara, Sulawesi Selatan, dan Nusa Tenggara Barat. Jawa Tengah dan Jawa Barat menempati urutan teratas sebagai produsen kentang di Indonesia. Namun, produksi kentang di Indonesia mengalami penurunan pada tahun 2013 dibandingkan tahun 2012. Pada tahun 2012, luas panen kentang 65 989 ha dengan produksi 1 094 240 ton dan produktivitas 16.58 ton/ha, sedangkan pada tahun 2013 luas panen kentang 62 900 ha, dengan produksi 1 023 381 ton, dan produktivitas 16.27 ton/ha (BPS 2014). Penurunan produksi kentang disebabkan oleh banyak faktor salah satunya gangguan hama dan penyakit tanaman. Penyakit penting pada tanaman kentang diantaranya disebabkan oleh Meloidogyne spp., Globodera sp., Phytophthora infestans, Potato Virus X, Potato Virus Y, Potato Leaf Roll Virus, Ralstonia solanacearum, dan Erwinia carotovora (Luc et al. 1995). Meloidogyne spp. atau nematoda puru akar (NPA) tersebar luas di seluruh dunia dan menyebabkan kehilangan hasil yang substansial di daerah tropis dan subtropis (Tesarova 2003). Menurut Adam et al. (2007), ada enam spesies utama Meloidogyne yang merugikan secara ekonomi yaitu M. incognita, M. arenaria, M. javanica, M. hapla, M. fallax dan M. chitwoodi. Di Indonesia, kehilangan hasil akibat NPA bervariasi tergantung pada varietas tanaman dan keadaan lingkungan. Kurniawan (2010) melaporkan kerugian yang disebabkan oleh Meloidogyne spp. pada wortel sebesar 15% hingga 95%, penyakit yang ditimbulkan berupa umbi bercabang. Kerugian oleh NPA pada tanaman kentang bersifat langsung dan juga tidak langsung. Kerugian langsung berupa penurunan kualitas dan kuantitas umbi sedangkan kerugian tidak langsung yaitu meningkatkan kerentanan tanaman terhadap infeksi cendawan dan bakteri. Gejala pada tanaman yang terinfeksi berat dapat terlihat dengan pertumbuhan tanaman yang kerdil dan menguning, pada bagian perakaran terdapat puru. Tanaman kentang yang terinfeksi M. hapla meningkatkan kerentanan terhadap layu Verticilium di lapangan maupun di rumah kaca (Jacobsen et al. 1979). Pada umbi kentang, M. chitwoodi dan M. fallax menyebabkan bintil-bintil pada permukaan luarnya sedangkan pada M. hapla bintil tidak terlihat. Beberapa kultivar kentang, walaupun terinfestasi berat namun tidak nampak gejala luarnya, gejala hanya terlihat pada jaringan di dalam yaitu berupa nekrotik dan kecoklatan (EPPO 2009). M. chitwoodi dan M. fallax memarasit tanaman monokotil dan juga
2
tanaman dikotil termasuk tanaman kentang, wortel dan juga tomat. M. chitwoodi dan M. fallax adalah termasuk OPTK (organisme pengganggu tumbuhan karantina) di Eropa yang dapat menyebabkan kerusakan yang berat pada inangnya terutama pada tanaman kentang (S. tuberosum). M. hapla dan M. chitwoodi merupakan dua dari spesies Meloidogyne yang termasuk dalam daftar OPTK berdasarkan Lampiran Permentan Republik Indonesia Nomor 93 tahun 2011. M. hapla termasuk ke dalam OPTK A2, yang artinya keberadaannya telah terdeteksi di Indonesia namun daerah penyebarannya masih terbatas. Daerah endemik M. hapla adalah Cipanas, Jawa Barat (Kurniawan 2010), akan tetapi dari dua penelitian yang dilakukan di Jawa Tengah dan Jawa timur, M. hapla telah teridentifikasi menginfeksi tanaman wortel di dua daerah tersebut (Hikmia et al. 2012). Informasi mengenai spesies NPA Meloidogyne yang menginfeksi kentang di Indonesia masih terbatas sehingga perlu dilakukan penelitian mengenai deteksi dan identifikasi spesies nematoda tersebut dengan metode yang tepat dan akurat. Tujuan Penelitian 1. Mendeteksi dan mengidentifikasi spesies Meloidogyne penyebab umbi berbintil pada kentang di tiga sentra produksi kentang di Pulau Jawa 2. Mengetahui hubungan filogenetik antara spesies Meloidogyne yang ada di Indonesia dengan spesies Meloidogyne yang ada di negara lain yang telah terdaftar di GenBank. Manfaat penelitian Penelitian ini dapat memberikan: 1. Data spesies-spesies Meloidogyne pada umbi berbintil kentang di tiga sentra produksi kentang di Pulau Jawa 2. Data distribusi spesies-spesies Meloidogyne pada umbi berbintil kentang di tiga sentra produksi kentang di Pulau Jawa 3. Kebijakan terkait dengan karantina dalam menentukan strategi pengendalian penyakit yang efektif dan efisien Hipotesis 1. Penyakit umbi berbintil pada kentang disebabkan oleh beberapa spesies NPA, Meloidogyne spp. 2. Spesies Meloidogyne dapat diidentifikasi berdasarkan ciri-ciri morfologi dan secara molekuler dengan teknik PCR pada bagian ITS r-DNA.
TINJAUAN PUSTAKA Kentang (Solanum tuberosum L.) Klasifikasi dan Sejarah Kentang Kentang termasuk ke dalam Kingdom Plantae, Divisi Spermatophyta, Kelas Dicotyledonae, Subkelas Asteridae, Ordo Solanales, Famili Solanaceae, Genus Solanum, dan Spesies Solanum tuberosum L. (CABI 2007). Awal mulanya kentang diintroduksi dari Amerika Selatan ke Spanyol sekitar tahun 1570. Pada tahun 1811, kentang sudah tersebar ke daerah pegunungan di Indonesia, yaitu Bukit Tinggi (Sumatera Barat), Tanah Karo (Sumatera Utara), Takengon (Aceh), Curup dan Kapahiang (Bengkulu), Pasemah (Sumatera Selatan), Tomohon dan Mondoinding (Sulawesi Utara), Goa (Sulawesi Selatan), Bali, Flores, Timor, Manusela Seram (Maluku), dan Arfak (Irian Jaya) (Wattimena et al. 2000). Kandungan Gizi Bagian utama kentang yang menjadi bahan makanan adalah umbi, yang merupakan sumber karbohidrat, vitamin dan mineral yang cukup tinggi. Kandungan zat gizi kentang per 100 g adalah kalori 62 kkal, protein 2.10 g dan lemak 0.2 g (Pusdatin 2013). Vitamin yang terkandung di dalam kentang diantaranya adalah Vitamin C, Vitamin B1, B3, dan B6. Beberapa mineral yang terkandung di dalam kentang yaitu Zat Besi, Potasium, Fosfor, dan Magnesium. Selain itu kentang juga dapat dijadikan sebagai anti oksidan yang dapat menghalau penuaan (FAO 2008). Syarat Tumbuh Tanaman kentang menyukai tanah yang berdrainase baik, bertekstur sedang hingga agak sedang, remah dengan pH 5.5-6.5 (agak asam) dan aerasi yang baik. Tekstur dan kepadatan tanah berpengaruh terhadap bentuk, hasil, dan kualitas umbi (Rubatzky dan Yamaguchi 1998). Tanaman kentang adalah tanaman yang membutuhkan suhu malam yang tinggi (15-20 ◦C) untuk dapat membentuk umbi. Oleh karena itu daerah pertanaman kentang di Indonesia terbatas di dataran tinggi dengan ketinggian tempat di atas 1000 meter di atas permukaan laut. Jenis tanah di dataran tinggi di Indonesia, terutama di Pulau Jawa pada umumnya adalah tanah andosol (incepticol) yang rawan erosi sehingga budidaya kentang dilakukan dengan penggunaan mulsa (Wattimena et al. 2000). Pemanenan Kegiatan pemanenan merupakan tahap akhir dari teknik budidaya tanaman yang menentukan produksi yang dihasilkan. Pelaksanaan panen harus dilakukan dengan benar dan tepat waktu, cara, dan kriteria umbi yang dipanen. Panen tanaman kentang dilakukan pada umur 100-110 HST. Sepuluh hari sebelum panen tanaman diberi herbisida. Tujuan pemberian herbisida adalah untuk mematikan tanaman dan membuat batang tanaman kentang menjadi kering sehingga memudahkan pekerjaan panen serta memudahkan umbi lepas dari stolon. Pemanenan yang terlalu awal dapat menyebabkan rendahnya produksi dan kulit umbi dapat terkelupas sehingga terinfeksi busuk umbi dan tidak dapat disimpan lama (Ummah 2010).
4
Hama dan Penyakit Kentang Menurut Luc et al. (1995), penyakit penting pada tanaman kentang diantaranya disebabkan oleh Meloidogyne spp., Globodera spp., Phytophthora infestans, Potato Virus X, Potato Virus Y, Potato Leaf Roll Virus, Ralstonia solanacearum, dan Erwinia carotovora. Selain itu menurut Zitter dan Loria (2001) penyakit pada kentang disebabkan oleh Streptomyces scabies, Spongospora subterranean, Rhizoctonia solani, Helminthosporium solani, Alternaria solani, Fusarium spp., Phytophthora infestans, Pythium spp., Phytophthora erythroseptica, Erwinia carotovora subsp. carotovora, Erwinia carotovora subsp. atroseptica, Corynebacterium sepedonicum, dan Meloidogyne spp. Nematoda parasit tanaman yang telah diketahui memparasit tanaman kentang tercatat sebanyak 67 spesies yang tergabung dalam 24 genus. Dalam skala global, nematoda parasit kentang yang dianggap penting secara ekonomi, berturut-turut adalah Globodera (nematoda sista kentang), Meloidogyne (nematoda bengkak akar), Ditylenchus (nematoda batang dan umbi), Pratylenchus (nematoda peluka akar), Trichodorus dan Paratrichodorus (nematoda akar menjari), dan Nacobbus (nematoda bengkak akar palsu) (Hadisoeganda et al. 2005). Nematoda Puru Akar (Meloidogyne spp.) Klasifikasi Spesies Meloidogyne dikenal dengan “root-knot nematode atau nematoda puru akar”. Kata Meloidogyne berasal dari bahasa Yunani yang artinya betina berbentuk apel (apple-shaped female). Meloidogyne merupakan nematoda endoparasit obligat yang bersifat menetap (sedentary). Nematoda ini adalah endoparasit akar dan patogen penting pada berbagai spesies tanaman di dunia (Dropkin 1991). Meloidogyne spp. termasuk ke dalam Kingdom Metazoa, Filum Nematoda, Kelas Chromadorea, Famili Meloidogynidae, Subfamili Meloidogyninae, dan Genus Meloidogyne (CABI 2007). Arti Penting Nematoda puru akar pertama kali dilaporkan pada tahun 1855 oleh Berkeley (Mitkowski & Abawi 2003). Meloidogyne adalah genus terbesar yang tersebar luas di seluruh dunia dan jumlahnya melimpah dibandingkan dengan nematoda parasit tumbuhan lainnya. M. incognita, M. javanica, dan M. arenaria merupakan spesies Meloidogyne yang paling melimpah dan menyebabkan kerusakan pada tanaman budidaya di daerah beriklim hangat dimana suhu udara pada musim dingin tidak begitu rendah (Singh & Sitaramaiah 1994). Ada enam spesies utama Meloidogyne yang merugikan secara ekonomi yaitu M. incognita, M. arenaria, M. javanica, M. hapla, M. fallax dan M. chitwoodi (Adam et al. 2007). M. chitwoodi (Columbia root-knot nematode) dan M. fallax (false Columbia root-knot nematode) memiliki inang yang luas termasuk tanaman sereal. Hal ini berarti pengendalian terhadap tanaman ini sangat sulit dengan rotasi tanaman dibandingkan dengan tanaman yang memiliki inang yang lebih sempit seperti M. hapla (northern root-knot nematode) (EPPO 2009). Distribusi Sebaran genus Meloidogyne di seluruh dunia berdasarkan survei yang dilakukan oleh Taylor et al.(1982) yaitu M. incognita 46.68%, M. javanica
5
39.73%, M. arenaria 6.65%, M. hapla 6.19, M. exigua 0.45%, M. chitwoodi 0.15%, dan M. oryzae 0.15%. Survei tersebut dilakukan terhadap tanaman pertanian dari 76 negara di dunia yang tersebar di lima benua dan Kepulauan Oceania. Terdapat empat spesies NPA yang sebaran dan perannya penting dalam dunia pertanian, yaitu M. incognita, M. arenaria, M. javanica, dan M. hapla. Di antara empat spesies tersebut, M. incognita merupakan patogen penting pada berbagai jenis tanaman di daerah tropis dan subtropis (Luc et al. 1995). Gejala Penyakit NPA menyerang bagian tanaman di bawah permukaan tanah terutama akar, dan umbi. Gejala pada bagian tanaman tersebut dikenal dengan sebutan puru. Gejala pada bagian tajuk seperti kekurangan nutrisi dan kekurangan air. Secara umum keberadaan nematoda ini tidak mematikan tanaman tetapi dapat mempredisposisikan patogen sekunder lain seperti bakteri dan cendawan untuk menginfeksi dan dapat menyebabkan kematian pada tanaman (Singh & Sitaramaiah 1994). Secara umum gejala pada bagian tajuk menyebabkan tanaman layu, umbi yang dihasilkan pun sedikit (Abawi et al. 2008). Pada tanaman kentang, penampakan gejala yang khas dapat diamati melalui akar atau umbi dengan menunjukkan adanya puru atau tonjolan berbagai ukuran dan bentuk. Terjadinya puru dan ukurannya tergantung pada kerapatan nematoda dan spesiesnya. Dalam keadaan lingkungan yang baik, umbi kentang dari semua bentuk dan ukuran dapat terinfeksi. Umbi yang terinfeksi terbentuk puru sehingga nampak seperti kutil pada permukaannya atau sama sekali tidak berubah bentuk. Umbi kentang yang tidak menampakkan gejala berupa puru tidak menutup kemungkinan bahwa kentang tersebut tidak terinfeksi oleh NPA sehingga perlu dilakukan identifikasi untuk setiap kentang (Jayanti 2011).
Gambar 1 Gejala infeksi Meloiodogyne spp. pada umbi kentang (Jayanti 2011) Biologi Meloidogyne spp. Nematoda betina dari genus Meloidogyne berbentuk seperti buah pir, membengkak kecuali pada bagian ujung anteriornya memanjang. Hidup pada jaringan inangnya sebagai endoparasit menetap (sedentary endoparasite). Dinding tubuhnya lunak dan berwarna putih dan tidak membentuk sista. Esofagus berkembang baik dengan metakorpus yang membesar yang terdiri atas katup (valve), isthmus yang pendek dan juga kelenjar yang membesar yang tumpang tindih dengan usus secara ventral. Kutikula beranulasi, tidak berekor, anus dan vulva pada bagian ujung. Stilet betina memanjang dengan basal knob yang berkembang baik. Telur diletakkan dalam matriks gelatin. Ganti kulit pertama terjadi dalam telur. Nematoda jantan berbentuk seperti cacing (vermiform) dan
6
J2 menginisiasi pembentukan feeding site dengan bantuan sekeresi kelenjar esofagus ke dalam selsel akar, membentuk sel raksasa
J2 berkembang menjadi J3, J4 dan nematoda dewasa. Puru terbentuk sebagai respon parasitisme nematoda
Sel raksasa
J2 masuk ke akar dan ke area perpanjangan akar
J2 yang infektif tertarik pada ujung akar yang sedang tumbuh J1 ganti kulit dalam telur
telur
Telur terbungkus pada massa telur pada bagian luar betina dewasa
Massa telur
Akar yang berpuru tidak cukup menyediakan nutrisi bagi tanamanan
Betina dewasa memproduksi lebih dari 1000 telur. Jantan kurang dibutuhkan
Gambar 2 Siklus hidup Meloidogyne spp. (Sumber: Mitkowski & Abawi 2003) berpindah (migratory). Ekor jantan membulat, tanpa kaudal alae, memiliki satu atau dua testes, spikula yang ramping, dan gubernakulum yang sederhana. Juvenil 2 (J2) setelah keluar dari telur kemudian berpindah dan infektif. Panjang J2 kirakira 280-500 µm, stiletnya ramping dengan panjang stilet 10 µm dengan basal knob yang membulat. Juvenil 3 dan juvenil 4 membengkak (Singh & Sitaramaiah 1994). Siklus Hidup Siklus hidup nematoda puru akar (Meloidogyne spp.) diawali dengan pembentukan telur oleh nematoda betina dewasa yang terdapat dalam massa telur (Gambar 2). Massa telur yang baru terbentuk biasanya tidak berwarna dan berubah menjadi coklat setelah tua. Nematoda betina dapat menghasilkan hingga 500 telur dalam massa gelatinus. Telur-telur mengandung zigot sel tunggal apabila baru diletakkan. Embrio berkembang menjadi juvenil 1 (J1) yang mengalami pergantian kulit pertama di dalam telur. Telur menetas dan J1 mengalami perubahan menjadi J2 yang muncul pada suhu dan kelembaban yang sesuai dan bergerak di dalam tanah menuju ke ujung akar yang sedang tumbuh. J2 masuk ke dalam akar dan merusak sel-sel akar dengan stiletnya. Setelah masuk ke dalam akar, J2 bergerak diantara sel-sel sampai tiba di tempat dekat silinder pusat atau berada di daerah pertumbuhan akar samping. J2 akan hidup menetap pada sel-sel tersebut, mengalami pertumbuhan dan pergantian kulit menjadi J3 dan J4 yang selanjutnya akan menjadi nematoda jantan atau betina dewasa (Dropkin 1991) . Nematoda jantan dewasa berbentuk memanjang seperti cacing dan hidup di dalam tanah atau pada jaringan akar. Betina dewasa tetap tertambat pada daerah
7
makanannya atau sel awal di dalam stele dengan bagian posterior tubuhnya berada pada permukaan akar. Selama hidupnya, nematoda betina akan terus-menerus menghasilkan telur hingga mencapai 1000 telur. Keberadaan nematoda akan merangsang sel-sel untuk membelah, sehingga terbentuklah puru (Luc et al. 1995). Spesies-spesies Meloidogyne Nematoda puru akar (Meloidogyne spp.) adalah patogen tumbuhan yang sangat penting secara ekonomi dan tersebar luas di seluruh dunia. Nematoda ini bersifat parasit obligat dan memparasit ribuan jenis tanaman termasuk monokotil, dikotil, herba, dan tanaman berkayu. Spesies-spesies dari genus Meloidogyne ini merupakan patogen utama pada tanaman pangan, sayuran, buah, dan tanaman hias di daerah tropis, subtropis dan juga daerah beriklim empat musim (Eissenback & Triantaphyllou 1991). M. arenaria M. arenaria tersebar di seluruh dunia, terutama pada daerah yang beriklim lebih hangat sedangkan pada daerah yang bersuhu lebih dingin terdapat pada tanaman di rumah kaca. M. arenaria bersifat polifag, menginfeksi baik dikotil maupun monokotil. Secara morfologi, nematoda betina berbentuk seperti buah pir, bagian posterior membengkak. Panjang stilet 13-17 µm, ujung stilet melengkung ke arah dorsal, secara bertahap menyempit dan menumpul ke ujung anterior, membulat, secara bertahap melebar ke ujung posterior. Basal knob membulat, offset. Pola perineal bervariasi, membulat hingga lonjong dengan striae yang halus. Lengkung dorsal rendah, rata dengan striae yang halus atau membengkok mengarah ke ujung ekor pada garis lateral membentuk bahu pada bagian lengkung lateral. Striae bagian dorsal dan ventral bertemu pada sebuah sudut di garis lateral. Nematoda jantan seperti cacing (vermiform), bagian mulut tidak offset, halus, lateral lip biasanya tidak ada. Panjang stilet 20-28 µm dengan basal knob offset. Panjang tubuh juvenil 2 (J2) 392-605 µm, panjang ekor 44-69 µm dengan ujung ekor yang membulat dengan panjang daerah hialin 6-13 µm (Hunt & Hundoo 2009). M. chitwoodi M. chitwoodi atau lebih dikenal sebagai Columbia root knot nematode adalah spesies Meloidogyne yang banyak menginfeksi kentang di daerah beriklim dingin. M. chitwoodi (Columbia root-knot nematode) dan M. fallax (false Columbia root-knot nematode) memiliki inang yang luas termasuk tanaman sereal (EPPO 2013). Kentang dan tomat adalah tanaman inang yang utama (Hunt & Handoo 2009). M. chitwoodi tercatat pertama kali pada tahun 1980 di Amerika Serikat. Spesies ini dideteksi di wilayah EPPO pada tahun 1980-an namun kemungkinan telah berada di daerah tersebut pada akhir 1930-an. Daerah asal M. chitwoodi tidak diketahui (EPPO 2013). Secara morfologi, betina berwarna putih seperti mutiara, membulat hingga berbentuk seperti buah pear. Pola perineal pada dasarnya bulat hingga oval yang nyata dan terbelah, striae yang membelit dan keriting di sekitar bagian atas anus. Vulva terletak pada bagian tanpa striae. Struktur seperti vesikel berada pada bagian median bulb nematoda betina. Panjang nematoda betina 430-740 µm
8
(mean 591 µm: SD 60 µm), lebar 344-518 µm (mean 422 µm: SD 42 µm). panjang stilet 11.2 – 12.5 µm(mean 11.9 µm: SD 0.3 µm), lebar knob stilet 3.44.3 µm (3.8 µm: SD 0.3 µm). panjang mulut kelenjar esofagus dorsal hingga pangkal stilet 3.4 – 5.5 µm. Jarak vulva ke anus 13-22 µm (mean 18 V: SD 2 µm) (Golden et al.1980). M. fallax M. fallax pertama kali ditemukan tahun 1996 di Belanda dan setelah itu ditemukan pula di negara-negara lain di wilayah EPPO (EPPO 2013). Persebarannya terutama di daerah Australia, Selandia Baru, dan juga Eropa (Belgia, Prancis, Jerman, dan Belanda). Inang utama dari nematoda ini adalah kentang, tomat, dan wortel, selain itu juga menyerang tanaman dikotil dan monokotil (Hunt & Hundoo 2009). Betina beranulasi, putih seperti mutiara dengan betntuk membulat hingga seperti buah pear, panjang 400-720 μm dan lebar 250-460 μm. Stilet melengkung ke arah dorsal, panjang stilet 13.9-15.2 μm, dengan knob yang membulat hingga lonjong. Jantan M. fallax memiliki ciri berbentuk vermiform, beranulasi, menyempit ke arah anterior, posterior membulat, panjangnya 735-1520 μm dan lebarnya 27-44 μm. Stilet memiliki panjang 18.9-20.9, knob yang besar dan membulat (Karssen 1996). M. hapla M. hapla biasanya terdapat pada daerah empat musim dan pada dataran tinggi di daerah tropis. Inang utamanya adalah tanaman dikotil. Secara morfologi, betina berbentuk seperti buah pir, membengkak ke arah ujung. Panjang stilet 1317 µm,basal knob kecil, bulat, offset. Pola perineal membulat, lengkung dorsal rendah, dan striae halus, memiliki tonjolan pada bagian dekat anus. Nematoda jantan memiliki bagian lateral lip ada, dan bagian labial offset. Panjang stilet 1922 µm, basal knob kecil, membulat dan offset. Panjang juvenil 2 360-500 µm, panjang ekor 48-70 µm, bagian hialin tidak teratur bentuknya, ujung ekor membulat (Hunt & Hundoo 2009). M. incognita M. incognita tersebar di seluruh dunia, terbatas persebarannya pada tanaman yang dibudidayakan di daerah yang beriklim empat musim. Umumnya sangat polifag, menginfeksi baik tanaman dikotil maupun monokotil. Secara morfologi, betina seperti buah pir, membengkak pada bagian posterior. Panjang stilet 15-16 µm,basal knob membulat, offset. Pola perineal berbentuk oval hingga bulat, lengkung dorsal persegi, tinggi, straie biasanya bergelombang, daerah lateral ada atau sangat tipis dengan striae yang menggarpu. Nematoda jantan memiliki panjang stilet 23-26 µm, basal knob offset, bentuknya bulat dan memanjang secara transversal. Panjang juvenil 2 (J2) 350-450 µm, panjang ekor 43-65 µm dengan panjang daerah hialin 6-14 µm, ujung ekor membulat (Hunt & Hundoo 2009). M. javanica M. javanica tersebar di seluruh dunia, terbatas persebarannya pada tanaman yang dibudidayakan di daerah yang beriklim empat musim. Umumnya sangat polifag, menginfeksi baik tanaman dikotil maupun monokotil. Secara morfologi, betina seperti buah pir, membengkak pada bagian posterior. Panjang stilet 14-18
9
µm, basal knob stilet lonjong, dan offset. Pola perineal membulat, lengkung dorsal rendah, striae halus, bagian lateral jelas, garis pembatas yang jelas dari striae yang terbentuk dari garis paralel. Nematoda jantan seperti cacing (vermiform), bagian bibir offset dan memiliki lateral lip. Panjang stilet 19-24 µm, basal knob lonjong dan offset. Panjang juvenil 2 (J2) 400-560 µm, panjang ekor 47-60 µm dengan panjang daerah hialin 9-18 µm, membulat pada ujung ekor (Hunt & Hundoo 2009). Deteksi dan Identifikasi Meloidogyne Metode deteksi dan identifikasi Meloidogyne spp. awalnya dengan cara konvensional. Eissenback et al. (1980) telah mencoba membedakan antar spesies M. arenaria, M. javanica, M. hapla, dan M. incognita berdasarkan karakter morfologi dari struktur kepala, pola perineal (perineal pattern), dan juga stilet nematoda betina. Identifikasi karakter morfologi terhadap nematoda jantan pun dilakukan berdasarkan bentuk kepala dan juga stilet (Eissenback et al. 1981). Karakter utama yang digunakan untuk pengidentifikasian spesies Meloidogyne yaitu perbedaan pola kutikular pada bagian vulva dan anus (perineal pattern), perbedaan jarak antara bagian depan kelenjar esofaghus dengan pangkal stilet, dan perbedaan bentuk dan ukuran stilet (Decker 1988). Namun, pengidentifikasian secara morfologi memerlukan keahlian yang tinggi karena antar spesies memiliki karakter morfologi yang hampir sama. Selain dengan cara konvensional, saat ini pengidentifikasian nematoda dilakukan dengan cara molekuler yaitu dengan metode PCR (polymerase chain reaction). Metode PCR tersebut sangat sensitif, dan dapat digunakan untuk melipatgandakan satu molekul DNA (Yuwono 2006). Identifikasi dengan metode PCR merupakan alternatif deteksi untuk spesies Meloidogyne (Zijlstra et al. 2000). Tidak dapat dipungkiri bahwa metode berbasis PCR meningkatkan arti penting dalam diagnosis spesies dan filogeni dalam genus Meloidogyne. Teknik-teknik itu termasuk RFLP (restriction fragment length polymorphism) pada ITS (internal transcribed spacer) wilayah rDNA, fragmen RAPD (random amplified polymorphic DNA), sekuen 18S rDNA, probe DNA satelit dan primer-primer spesifik (Hunt & Handoo 2009). Harris et al.( 1990) berhasil melakukan amplifikasi DNA mitokondria dari larva dan telur nematoda dengan reaksi PCR. Power dan Harris (1993) merancang primer untuk amplifikasi daerah antara kode gen mitokondria untuk oksidasi sitokrom sub unit II dan primer 16S rRNA untuk membedakan M. incognita, M. javanica, M. arenaria, M. hapla dan M. chitwoodi. Sampel DNA yang digunakan berasal dari juvenil Meloidogyne yang berasal dari 70 negara. Williamson et al. (1997) menggunakan primer khusus sequence characterized amplified region (SCAR) untuk amplifikasi ekstrak DNA dari larva nematoda menggunakan metode gabungan proteinase K untuk mengidentifikasi M. hapla dan M. chitwoodi. Ziljstra et al. (2000) menggunakan wilayah ITS rDNA sebagai target PCR untuk mengidentifikasi M. arenaria, M. javanica dan M. incognita dengan primer SCAR dengan sampel DNA yang berasal dari massa telur, juvenil, dan nematoda betina. Wishart et al. (2000) mendesain primer multipleks yang
10
memungkinkan untuk mengidentifikasi tiga spesies sekaligus yaitu M. fallax, M. hapla, dan M. chitwoodi dengan tiga pasang primer. De Lay et al. (2002) menggunakan sekuen 18S rDNA untuk membuat filogeni, bahkan Tigano et al. (2005) selain menggunakan sekuen 18S rDNA juga menggunakan sekuen wilayah IGS (intergenic spacer) rDNA mitokondria. Carta et al. (2006) merekomendasikan protokol molekuler untuk mengidentifikasi nematoda puru akar pada kentang. Qiu et al. (2006) mengembangkan protokol untuk PCR dalam mengidentifikasi M. arenaria, M. javanica, dan M. incognita dari ekstrak tanah dengan target amplifikasi pada wilayah ITS rDNA.
11
BAHAN DAN METODE Tempat dan Waktu Penelitian dilaksanakan di Laboratorium Nematologi,Departemen Proteksi Tanaman, IPB; Laboratorium Karantina Tumbuhan Tanjung Priok Wilker Pos Bogor; dan Laboratorium Karantina Tumbuhan BBKP Soekarno-Hatta dari bulan Oktober 2014 hingga Maret 2015. Pengambilan Sampel Umbi Pengambilan sampel dilakukan di tiga lokasi, yaitu Desa Marga Mukti, Kecamatan Pangalengan, Kabupaten Bandung (Jawa Barat); Desa Wanayasa, Kecamatan Batur, Kabupaten Banjarnegara (Jawa Tengah); dan Desa Sumber Brantas, Kecamatan Bumiaji, Kota Batu (Jawa Timur). Pengambilan sampel dilakukan pada tempat penangkaran benih kentang yang menunjukkan gejala umbi berbintil. Sampel dimasukkan dalam amplop kertas dan dan disimpan dalam kotak sampel. Identifikasi Spesies Meloidogyne berdasarkan Karakter Morfologi Umbi berbintil yang diduga terinfeksi nematoda dibedah untuk mendapatkan betina dewasa. Nematoda betina diletakkan di dalam cawan Syracuse yang sebelumnya telah diberi air. Nematoda betina dewasa dipisahkan dari jaringan kentang dengan jarum preparat. Pembuatan preparat untuk nematoda betina dilakukan dengan cara memotong bagian anterior dan posterior dengan skalpel kemudian bagian posterior dibersihkan dengan 45% asam laktat menggunakan jarum pengait nematoda. Setelah itu potongan nematoda betina dipindahkan ke atas gelas objek yang telah ditetesi dengan lactophenol blue dan ditutup dengan gelas penutup (Gambar 3). Gelas penutup direkat dengan cat kuku kemudian preparat diamati menggunakan mikroskop kompon dengan perbesaran 400 x. Konfirmasi spesies nematoda berdasarkan kunci identifikasi pada http://nematode.unl.edu, kunci identifikasi Meloidogyne spp. oleh Eissenback et al. (1981) dan kunci identifikasi NPA oleh Eissenback et al. (1991). Identifikasi NPA berdasarkan PCR ITS r-DNA Ekstraksi Nematoda Betina Sebanyak 10-20 nematoda betina yang telah dipisahkan dari umbi berbintil, dimasukkan ke dalam tabung mikro 1.5 mL kemudian ditambahkan 150 μL bufer ekstrak (200 mM Tris-HCl: pH 8.5, 250 mM NaCl, 25 mM EDTA dan SDS 0.5%) kemudian digerus dengan mikropistil steril. Setelah homogen ditambahkan kloroform isoamilalkohol sebanyak 150 μL, divorteks selama 3 menit, kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 11 000 rpm selama 10 menit. Supernatan yang terbentuk dimasukkan ke dalam tabung mikro baru. Ditambahkan larutan sodium asetat 3 M (pH 5.2) 0.5 volume kemudian tabung dibolak-balik dan kemudian disimpan di lemari pendingin pada suhu 20 °C selama 10 menit atau semalam. Suspensi yang didapat disentrifugasi pada kecepatan 12 000 rpm selama 15
12
menit. Supernatan diambil dan tambahkan 2/3 volume isopropanol kemudian dibolak-balik. Supernatan disimpan pada suhu ruang selama 30 menit. Suspensi disentrifugasi dengan kecepatan 12 000 rpm selama 20 menit. Supernatan yang terbentuk dibuang, ditambahkan etanol 80% sebanyak 200 mL etanol untuk mencuci pelet (endapan DNA), kemudian cairan pelet disentrifugasi dengan kecepatan 12 000 rpm selama 15 menit. Cairan etanol dibuang dan endapan DNA dikeringanginkan dengan cara membalik tabung mikro. Bufer TE (10 mM TrisHCl: pH 8.0, 1 mM EDTA) ditambahkan pada tabung mikro sesuai dengan ketebalan endapan DNA, pada endapan yang tipis sebanyak 30-40 μL dan untuk endapan yang tebal 50-100 μL. Amplifikasi DNA Amplifikasi DNA menggunakan primer spesifik dilakukan untuk M. incognita, yaitu MI-F (5’-GTG AGG ATT CAG TCT CCCAG-3’) dan MI-R (5’ACG AGG AAC ATA CTT CTC CGT CC-3’) (Meng et al. 2004); M. arenaria Far (5’-TCG GCG ATA GAG GTA AAT GAC-3’) dan Rar (5’-TCG GCG ATA GAC ACT ACA AAC T-3’), dan M. javanica Fjav (5’-GGT GCG CGA TTG AAC TGA GC-3’) dan Rjav (5’-CAG GCC CTT CAG TGG AAC TAT AC-3’) (Zijlstra et al. 2000). Deteksi M. hapla, M. falax, dan M. chitwoodi menggunakan primer multipleks, yaitu JMV1 (5’-GGA TGG CGT GCT TTC AAC-3’), JMV2 (5’-TTT CCC CTT ATG ATG TTT ACC C-3’), dan JMV-hapla (5’-AAA AAT CC CTC GAA AAA TCC ACC-3’) (Wishart et al. 2002). Reaksi PCR yang digunakan untuk setiap reaksi PCR dengan primer yang spesifik yaitu 12.5 μL 2x master mix (KAPPA), 1 μL primer forward 10 μM, 1 μL primer reverse 10 μM, dan 2 μL DNA, dan 8.5 μL ddH2O sehingga total volume reaksi 25 μL. Reaksi PCR menggunakan primer multipleks terdiri atas 12.5 μL 2x master mix (KAPPA), 1 μL JMV1 10 μM, 1 μL JMV2 10 μM, 1 μL JMV hapla 10 μM, dan 2 μL DNA, dan 7.5 μL ddH2O sehingga total volume reaksi 25 μL. Selanjutnya dilakukan amplifikasi pada mesin PCR (thermo cycler) dengan Program yang berbeda sesuai dengan spesies Meloidogyne yang diinginkan (Tabel 1). Tabel 1 Amplifikasi fragmen ITS-rDNA spesies Meloidogyne menggunakan PCR Spesies M. javanica M.incognita M. arenaria M..chitwoodi, M. fallax, dan M. hapla
Denaturasi awal 940C; 4’ 950C; 2’ 940C; 4’ 940C; 4’
Denaturasi
Annealing
940C;30” 940C;30” 940C;30” 940C;30”
550C;45” 570C;45” 550C;45” 500C ;30”
Pemanjangan pertama 720C; 1’ 720C; 2’ 720C; 1’ 720C; 90’’
Pemanjangan akhir 720C;7’ 720C;10’ 720C;7’ 720C;7’
Jumlah siklus 30 35 35 45
Hasil amplifikasi dianalisis untuk melihat DNA melalui elektroforesis menggunakan gel agarosa 1% dalam 90 mL bufer TAE 2x. Pengukuran fragmen DNA menggunakan penanda 100 pb DNA ladder (Fermentas, United States of America). Sampel disiapkan dengan mencampur 5 μL DNA, 2 μL gel red 1%, dan 2 μL loading dye, kemudian sampel diisikan dalam sumuran gel sebanyak 9 μL menggunakan pipet mikro. Elektroforesis dilakukan pada tegangan 50 volt DC selama 60 menit. Hasil elektroforesis divisualisasikan dengan gel doc (BIORAD).
13
Sikuen hasil PCR Sikuen hasil PCR dilakukan terhadap sampel yang positif. Hasil sikuen dianalisis menggunakan program Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) dengan program optimasi untuk mendapatkan urutan basa DNA yang terdapat dalam situs National Center for Biotechnology Information (NCBI) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi). Pembentukan pohon filogeni dengan software Clustal W (Bioedit version 6.05) dan program Mega version 5.05. berdasarkan pendekatan Neighbour Joining (NJ) (Handayani 2012).
14
HASIL DAN PEMBAHASAN Lokasi Pengambilan Sampel Sampel kentang berasal dari penangkar benih kentang di tiga sentra produksi kentang di Pulau Jawa yaitu pertama Desa Margamukti, Kecamatan Pangalengan, Kabupaten Bandung (Jawa Barat) yang terletak pada ketinggian 1470 mdpl, dengan posisi S: 070 11.876’ dan E: 1070 36.497’ dengan suhu 200C. Lokasi yang kedua berasal Desa Wanayasa, Kecamatan Batur, Kabupaten Banjarnegara (Jawa Tengah) yang terletak pada ketinggian 1400 mdpl, dengan posisi S: 070 12. 087’ dan E: 1090 46.057’ dengan suhu 200C . Lokasi yang ketiga berada di Desa Sumber Brantas, Kecamatan Bumiaji, Kota Batu (Jawa Timur) yang berada pada ketinggian 1635 mdpl dan berada pada posisi S: 070 76. 359’ dan E: 1120 52. 545’ (Gambar 3).
aa
cc
bb
Gambar 3 Lokasi pertanaman kentang (a) Pangalengan (Jawa Barat); (b) Banjarnegara (Jawa Tengah); (c) Kota Batu (Jawa Timur) Gejala Penyakit Meloidogyne spp. Gejala pada umbi kentang yang terinfeksi Meloidogyne spp. yaitu permukaan kulit umbi tidak rata, bergelombang dan berbintil dan terkadang disertai dengan adanya infeksi dari patogen lain sehingga umumnya umbi cepat busuk (Gambar 4). Bentuk dan ukuran puru tergantung kepada spesies nematoda, jenis tanaman dan faktor lingkungan (Decker 1988). Bagian umbi yang sakit bila bagian kulit luarnya dibuka akan tampak bercak-bercak berwarna krem kekuningan dan bila dilihat dengan menggunakan mikroskop cahaya dengan perbesaran rendah akan tampak nematoda betina (Gambar 5).
a Gambar 4
b
c
Variasi gejala yang disebabkan oleh Meloidogyne spp. pada umbi (a) permukaan kulit umbi tidak rata; (b) bergelombang; (c) berbintil
15
Gambar 5 Gejala nekrosis pada umbi kentang yang terinfeksi Meloidogyne spp.. Secara umum, bobot umbi yang terserang Meloidogyne spp. lebih rendah dibandingkan dengan umbi yang sehat. Infeksi M. incognita pada kentang, secara statistik dapat mengurangi bobot umbi pada kentang (Gondal et al. 2012). Nematoda betina Meloidogyne spp. yang terdapat dalam umbi terdiri atas berbagai stadia, mulai stadia muda hingga dewasa dengan massa telur (Gambar 6). Dalam satu umbi, terdapat beberapa spesies Meloidogyne yang dapat menginfeksi bersama. Umbi yang terserang akan berwarna kecoklatan dan neksrosis pada bagian dalam umbi. Nekrosis pada umbi ini terjadi karena adanya reaksi enzimatis yang dikeluarkan oleh nematoda Meloidogyne spp.. Reaksi ini menyebabkan hancurnya jaringan pektin pada umbi. Nematoda parasit umunya menyebabkan terjadinya pektinolitik pada jaringan inang. Pada akar, sekresi enzim selulase dan pektinase juga mampu mendegradasi sel hingga ujung akar luka dan pecah, hal ini menyebabkan auksin tidak aktif. Tidak aktifnya auksin maka pertumbuhan tanaman terhambat (Supramana et al. 2008). Setiap massa telur berisi 300-400 butir telur Meloidogyne spp. Batas toleransi untuk M. incognita pada kentang diperkirakan 1.2 telur dan juvenil/cm3 tanah (Russo et al. 2007) lebih besar dibandingkan untuk M. hapla yaitu 50 telur/250 cm3 tanah (Brodie et al. 1993) dan 0.50-0.64 telur dan juvenil instar 2/cm3 tanah untuk M. javanica dalam pot percobaan di rumah kaca (Vovlas et al. 2005).
b a Gambar 6 Nematoda betina Meloidogyne spp. dengan massa telur (a) nematoda betina; (b) massa telur
16
Spesies Meloidogyne berdasarkan Morfologi Pola Perineal Tiga spesies Meloidogyne, yaitu M. incognita, M. javanica, dan M. arenaria berhasil diidentifikasi secara morfologi melalui sidik pantat (pola perineal) nematoda betina pada ketiga sampel asal Jawa Barat, Jawa Tengah dan JawaTimur. M. incognita dan M. javanica ditemukan pada ketiga lokasi, sedangkan M. arenaria ditemukan pada sampel asal Pangalengan. Gambar 7 memperlihatkan adanya ciri khusus dari M. incognita. Lengkungan striae bagian dorsal berbentuk persegi (sudut ± 90◦) dan merupakan karakter khusus dari M. incognita (Eissenback et al. 1981). M. javanica terlihat menunjukkan adanya garis lateral yang jelas pada daerah yang memisahkan bagian dorsal dan juga ventral (Gambar 8). M. javanica memiliki ciri khusus yaitu adanya dua garis lateral yang memisahkan antara bagian dorsal dan ventral (Eissenback et al. 1991). Secara khusus pola perineal dari M. arenaria sangat bervariasi (Gambar 10). Ciri tersebut ditandai dengan lengkungan tepi yang rendah dan bulat, dengan striae yang halus hingga bergelombang (Eissenback & Triantaphyllou 1991).
Gambar 7
Pola perineal M. incognita (Perbesaran 400x). (a) M. incognita menurut Eissenback et al. (1981); (b) M. incognita asal Pangalengan; (c) M. incognita asal Banjarnegara; (d) M. incognita asal Kota Batu
17
Gambar 8 Pola perineal M. javanica (Perbesaran 400x). (a) M. javanica menurut Eissenback et al. (1981); (b) M. javanica asal Pangalengan; (c) M. javanica asal Banjarnegara; (d) M. javanica asal Kota Batu
Gambar 9 Pola perineal M.arenaria (Perbesaran 400x). (a) M. arenaria menurut Eissenback et al. (1981); (b) M. arenaria asal Pangalengan Namun demikian, pengidentifikasian secara morfologi sangat sulit karena membutuhkan keahlian dan keterampilan karena spesies nematoda puru akar (NPA) secara morfologi sama atau serupa satu dengan yang lain. Selain itu, lebih dari satu jenis NPA menginfeksi bersama dalam satu tanaman sehingga identifikasi NPA secara cepat dan akurat dibutuhkan untuk pengendalian dan pemuliaan tanaman (Devran & Sogut 2009). Spesies Meloidogyne berdasarkan ITS r-DNA PCR menggunakan primer spesifik spesies M. javanica terhadap sampel NPA dari Pangalengan (Jawa Barat), Banjarnegara (Jawa Tengah), dan Kota Batu (Jawa Timur) berhasil mengamplifikasi pita DNA berukuran 720 pb (Gambar 10).
18
M
1
3
2
720 pb
Hasil amplifikasi DNA Meloidogyne spp. dengan menggunakan primer spesifik M. javanica (M: Marker 100 pb; 1: Pangalengan; 2: Banjarnegara; 3: Kota Batu Hasil ini mengindikasi bahwa NPA yang telah diteliti merupakan salah satu isolat M. javanica. Hasil sampel yang positif terdeteksi M. javanica, kemudian dilakukan Sikuensing untuk mengetahui urutan nukleotida M. javanica yang berasal dari Indonesia, dalam hal ini hanya satu sampel saja yang disekeunsing yaitu sampel yang berasal dari Pangalengan, Jawa Barat. Hasil amplifikasi PCR diperkuat oleh hasil analisis homologi Sikuen nukleotida. Sikuen nukleotida NPA asal Pangalengan, Jawa Barat memiliki tingkat kemiripan yang sangat tinggi (homologi 95.7%) dengan spesies M. javanica asal Cina, sedangkan dengan spesies lain (M. incognnita, M. arenaria dan M. hapla) tingkat kemiripan hanya sebesar 37.0%, 37.4%, dan 31.9% (Tabel 2). Hal ini memperkuat hasil identifikasi, bahwa spesies Meloidogyne asal Pangalengan, Jawa Barat adalah M. javanica. Gambar 10
Tabel 2 Homologi sikuen nukleotida M. javanica asal Pangalengan dengan M. javanica yang ada di Gen Banka) No
1 2 3
4 5
6 7 8
Asal isolate
M. javanica Pangalengan M .javanica China (JN005834) M .javanica Malaysia (KF041327) M. javanica China (JN005835) M . javanica Malaysia (KF041310) M .incognita Pangalengan M.arenaria USA (AF387098.1) M. hapla China (JX024147.1)
Homologi (%) 1 ID
2
3
4
5
6
7
95.7
ID
95.0
98.8
ID
95.4
99.6
98.5
ID
95.4
99.2
99.2
98.8
ID
37.0
37.6
37.9
37.2
37.7
ID
37.4
38.3
37.9
37.9
38.1
39.8
ID
31.9
33.5
33.3
33.3
33.7
34.4
38.5
8
ID
a) Tingkat kemiripan basa nukleotida M. javanica dihitung menggunakan Program Bioedit versi 6.05
19
95 M.javanica_Malaysia_KF041327 85
M.javanica_Malaysia_KF041305
50 M.javanica_Malaysia_KF041310 28 81 99
M.javanica_China_JN005835 M.javanica_China_JN005834 M.javanica_China_JN005837 M.javanica_Pangalengan
M. javanica_India_KP411881 99
M. javanica_India_KP411880 M. hapla_China_JX024147.1
0.2
Gambar 11 Pohon filogeni M. javanica di Pangalengan, Jawa Barat
yang menginfeksi
kentang
Berdasarkan analisis filogenetik, M. javanica asal Pangalengan, Jawa Barat menjadi satu kelompok dengan M. javanica asal Cina dan Malaysia dan terpisah dari M. javanica asal India. Hal ini menunjukkan tingkat kekerabatan yang dekat antara M. javanica asal Pangalengan dengan M. javanica asal Cina dan Malaysia (Gambar 11). PCR menggunakan primer spesifik spesies M. incognita terhadap sampel NPA dari Pangalengan (Jawa Barat) dan Kota Batu (Jawa Timur) berhasil mengamplifikasi pita DNA berukuran 999 pb (Gambar 12). Hasil ini mengindikasi bahwa NPA yang telah diteliti merupakan salah satu isolat M. incognita. Hasil sampel yang positif terdeteksi M. incognita, kemudian dilakukan sikuensing untuk mengetahui urutan nukleotida M. incognita yang berasal dari Indonesia, dalam hal ini hanya satu sampel saja yang disikeunsing yaitu sampel yang berasal dari Pangalengan, Jawa Barat Keberadaan M. incognita juga diperkuat dengan analisis homologi nukleotida. Sikuen nukleotida NPA asal Pangalengan, Jawa Barat memiliki tingkat kemiripan yang sangat tinggi (homologi 99.8%) dengan spesies M.incognita asal Cina, sedangkan dengan spesies lain (M. arenaria, M. hapla dan M. javanica) tingkat kemiripan hanya sebesar 35.8%, 37.0%, dan 32.2% (Tabel 3). Hal ini memperkuat hasil identifikasi, bahwa spesies Meloidogyne asal Pangalengan, Jawa Barat adalah M. incognita.
M
1
2
3
999 pb
Gambar 12
Hasil amplifikasi DNA Meloidogyne spp. dengan menggunakan primer spesifik M. incognita (M: Marker 100 pb; 1: Pangalengan; 2: Banjarnegara; 3: Kota Batu)
20
Tabel 3 No
Homologi sikuen nukleotida M. incognita asal Pangalengan dengan M. incognita yang ada di GenBanka)
Asal isolat
Homologi (%) 1
1 2 3 4 5 6 7
M. incognita Pangalengan M. incognita China (JN005841) M. incognita India (KP411876) M. incognita Malaysia (KF041337) M. arenaria USA (AF387098.1) M. hapla China (JX024147.1) M. javanica Pangalengan
2
3
4
5
6
7
ID 99.8
ID
99.6
99.8
ID
99.2
99.4
99.2
ID
35.8
35.9
35.9
36.1
ID
37.0
36.8
36.8
36.6
33.8
ID
32.2
32
31.9
32.2
36.5
28.9
ID
a) Tingkat kemiripan basa nukleotida M. incognita dihitung menggunakan Program Bioedit versi 6.05 7
M. incognita_Pangalengan
6 M. incognita_China_KF481971 24 M. incognita_China_JN005841 35
M. incognita_India_KP411876 M.incognita_Malaysia_KF041337
75 M. incognita_Malaysia_KF041328
M.incognita_India_KP411875 M. arenaria_USA_AF387098.1
0.2
Gambar 13
Pohon filogeni M. incognita yang menginfeksi kentang di Pangalengan, Jawa Barat
Berdasarkan analisis filogenetik, M. incognita asal Pangalengan, Jawa Barat menjadi satu kelompok dengan M. incognita asal Cina, India, dan Malaysia. Hal ini menunjukkan tingkat kekerabatan yang dekat antara M. incognita asal Pangalengan dengan M.incognita asal Cina, India, dan Malaysia (Gambar 13). PCR menggunakan primer spesifik spesies M. arenaria terhadap sampel NPA dari Pangalengan (Jawa Barat) dan Banjarnegara (Jawa Tengah) berhasil mengamplifikasi pita DNA berukuran 420 pb (Gambar 14). Hasil ini mengindikasi bahwa NPA yang telah diteliti merupakan salah satu isolat M. arenaria. Hasil sampel yang positif terdeteksi M. arenaria, kemudian dilakukan sikuensing untuk mengetahui urutan nukleotida M. arenaria yang berasal dari Indonesia, dalam hal ini hanya satu sampel saja yang disekeunsing yaitu sampel yang berasal dari Banjarnegara, Jawa Tengah. Namun, hasil sikuensing tidak dapat dianalisis homologinya dikarenakan belum tersedianya data di Gen Bank tentang M. arenaria dengan primer SCAR.
21
M
1
2
3 420 pb
Gambar 14
Hasil amplifikasi DNA Meloidogyne spp. dengan menggunakan primer spesifik M. arenaria (M: Marker 100 pb; 1: Pangalengan; 2: Banjarnegara; 3: Kota Batu) Pembahasan Umum
Analisis perbandingan antara bagian yang mengkode dan tidak mengkode pada DNA ribosom (rDNA) menjadi alat yang populer untuk mengidentifikasi spesies dan subspesies pada banyak organisme. DNA ribosom (rDNA) eukariot adalah susunan berulang yang terdiri atas tiga gen (18S, 28S, dan 5.8S), internal dan eksternal transcribed spacer, dan eksternal non transcribed spacer (Zijlstra et al. 1995). Internal transcribed spacer (ITS) adalah wilayah yang terletak antara gen 18S dan 28S daerah DNA ribosom (rDNA). ITS ini dapat digunakan untuk membuat pohon filogeni, memperkirakan struktur genetik populasi, mengevaluasi proses evolusi pada tingkat populasi, dan menentukan identitas taksonomi (Powers et al. 1997). Ukuran wilayah ITS sangat bervariasi diantara genus nematoda dan bahkan diantara beberapa spesies dalam satu genus (Powers et al. 1997). Hal ini menyebabkan penggunaan ITS sebagai target amplifikasi DNA untuk identifikasi pada tingkat spesies sangat berkembang. Secara umum, deteksi dan identifikasi spesies Meloidogyne penyebab umbi berbintil pada kentang di Pulau Jawa dengan ITS rDNA sebagai target amplifikasi mendapatkan tiga spesies Meloidogyne yaitu M. javanica, M. incognita, dan M. arenaria. M. javanica terdeteksi pada tiga lokasi yaitu di Pangalengan, Banjarnegara, dan juga Kota Batu, M. incognita terdeteksi di Pangalengan dan Kota Batu dan M. arenaria hanya terdeteksi di Pangalengan dan Banjarnegara saja. Hal ini sangat berbeda dengan hasil penelitian yang dilakukan oleh Hikmia (2012) pada tanaman wortel di Kota Batu terdapat empat spesies Meloidogyne yaitu M. arenaria, M. hapla, M. javanica, dan M. incognita. Faktor iklim terutama suhu di Kota Batu sangat cocok untuk perkembangan M. hapla dan juga M. arenaria, dimana suhu tanah rata-rata Kota Batu adalah 15 -19◦C (Hikmia 2012). M. arenaria merupakan nematoda puru akar yang disebut juga peanut root knot nematode. Spesies ini terdiri atas dua ras, ras pertama dapat diperbanyak pada kacang tanah sedangkan ras kedua tidak (Eissenback et al.1981). Kentang merupakan salah satu inang yang dominan bagi spesies ini. Nematoda ini memiliki kisaran inang yang luas yaitu tanaman dikotil, monokotil, rumput dan juga tanaman berkayu. M. arenaria juga pernah ditemukan pada wortel di Dataran Tinggi Malino (Sulawesi Selatan) (Mirsam et al. 2015). Tidak terdeteksinya M. arenaria pada tanaman kentang di Kota Batu kemungkinan disebabkan oleh beberapa hal. Pertama, sampel yang digunakan
22
tidak mewakili populasi yang sebenarnya dimana kemungkinan M. arenaria sudah ada di wilayah tersebut namun tidak terdapat pada sampel yang digunakan untuk pengujian. Kedua, daerah Kota Batu tidak terdapat M. arenaria pada umbi kentang berbintil dan kemungkinan bintil yang terdapat pada umbi disebabkan oleh dua spesies Meloidogyne yang lain yaitu M. javanica dan M. incognita. Deteksi dan identifikasi M. chitwoodi, M. fallax, dan M. hapla dengan menggunakan primer multipleks tidak berhasil mengamplifikasi pita DNA pada ukuran masing-masing 670 pb, 540 pb, dan 440 pb. Ini menunjukkan bahwa pada sampel umbi kentang berbintil tersebut tidak terdapatnya ketiga spesies Meloidogyne yang umumnya terdapat pada daerah beriklim dingin. Berdasarkan penelitian yang dilakukan oleh Hikmia (2012), M. hapla terdeteksi dan teridentifikasi pada tanaman wortel yang menunjukkan gejala umbi bercabang di Kota Batu, Jawa Timur. Sementara itu, Kurniawan (2010) mendeteksi keberadaan M. fallax di daerah Cianjur, Jawa Barat pada komoditas wortel. Tidak terdeteksinya ketiga spesies ini (M. chitwoodi, M. fallax, dan M. hapla) pada umbi berbintil kentang tidak menutup kemungkinan bahwa ketiga spesies tersebut sudah ada hanya saja diperlukan teknik pengambilan sampel yang tepat yang dapat mewakili populasi Meloidogyne yang sebenarnya di lapang. Dari ketiga spesies tersebut, M. chitwoodi dan M. hapla termasuk dalam daftar OPTK, dimana M. chitwoodi termasuk OPTK A1 sedangkan M. hapla termasuk OPTK A2. OPTK A1 artinya OPTK tersebut belum terdapat di Indonesia dan dicegah masuk dan tersebarnya di dalam wilayah Negara Kesatuan Republik Indonesia (NKRI), sedangkan OPTK A2 sudah terdapat di Indonesia hanya masih terbatas penyebarannya. M. fallax belum masuk ke dalam daftar OPTK Indonesia, namun di Eropa M. fallax dan M. chitwoodi sudah menjadi target OPTK pada kentang. Menurut Brodie et al. (1993), M. incognita. M. javanica, dan M. arenaria menyebabkan kerusakan pada kentang di daerah tropis dan juga subtropis. Infeksi Meloidogyne spp. pada umbi kentang telah dilaporkan sebelumnya di Arab Saudi (Al-Hazmi et al. 1993) dan Turki (Cinarli & Eterkin 1996). Tercatat perkiraan distribusi penyebaran Meloidogyne spp. pada lahan pertanian di Pakistan yaitu M. incognita sebesar 58%, M. javanica sebesar 31%, M. arenaria sebesar 8%, M. hapla sebesar 7% dan spesies lain kira-kira 2% (Maqbool 1986). Selain itu, M. arenaria dan M. hapla pernah dilaporkan pertama kali menginfeksi pepino (Solanum muricatum Aiton) di Turki (Akyazi et al. 2012). M. incognita merupakan spesies yang berbahaya dari genus Meloidogyne karena sebarannya yang luas. Indonesia merupakan salah satu wilayah persebaran nematoda puru akar ini (Decker 1988). Terdapat empat ras M. incognita di seluruh dunia dan keempatnya dapat bereproduksi pada lada, semangka dan tomat (Eissenback et al. 1981). Spesies ini banyak terdapat pada daerah dengan suhu tahunan rata-rata 18◦C hingga 30◦C, dengan populasi terbanyak terdapat pada suhu 24◦C hingga 27◦C (Taylor et al. 1982). M. javanica pernah dilaporkan sebagai penyebab umbi bercabang pada wortel di daerah Agropolitan Cianjur, Jawa Barat ( Kurniawan 2010), Dieng, Jawa Tengah (Taher et al. 2012), dan Kota Batu, Jawa Timur (Hikmia et al. 2012). Penelitian yang dilakukan oleh Halimah et al. (2014) menunjukkan bahwa M. javanica yang menginfeksi wortel di Cianjur, Jawa Barat berkerabat sangat dekat dengan M. javanica asal Cina dengan tingkat homologi mencapai 91.9%.
23
Infeksi yang parah pada kentang yang disebabkan oleh M. javanica terjadi di Zabbar (Malta) dan kerusakan yang parah pada pertanaman kentang yang disebabkan nematoda ini berpotensi tersebar dari tanaman kentang sebelumnya di wilayah Eropa (Vovlas et al. 2005). Rotasi tanaman kentang dengan tanaman wortel juga kemungkinan dapat menjadi penyebab tersebarnya M. javanica. Analisis sekuen nukleotida terhadap M. javanica dan M. incognita menunjukkan hubungan kekerabatan yang dekat antara M. javanica dan M. incognita asal Pangalengan dengan M. javanica dan M. incognita asal Cina. Diduga masuknya M. incognita dan M. javanica pada kentang ke Indonesia khususnya di Pangalengan melalui perdagangan bibit kentang dari Cina. Pusdatin (2013) mencatat bahwa Cina termasuk salah satu negara pengekspor benih kentang ke Indonesia. Terdapatnya ketiga spesies Meloidogyne tersebut (M. arenaria, M. javanica, dan M. incognita) pada tanaman kentang di ketiga sentra kentang di Pulau Jawa memberikan gambaran bahwa nematoda tersebut merupakan ancaman terhadap pertanian Indonesia, mungkin dampaknya bisa seperti Globodera spp. jika tidak dikendalikan terutama saat awal tanam dengan penggunaan benih yang sehat. Menurut BPSPBTH (1997), batas toleransi keberadaan Meloidogyne spp. pada benih pokok (G3) dan benih sebar (G4) sebesar 5.0% sedangkan pada benih dasar (G2) sebesar 3.0%. Pencegahan masuknya OPTK dari spesies Meloidogyne ini pada kentang mutlak dilakukan mengingat pemasukan bibit kentang dari daerah yang endemik terhadap M. chitwoodi dan M. fallax. Deteksi yang dilakukan di Badan Karantina terutama di pintu-pintu pemasukan kentang hendaknya dilakukan dengan metode yang tepat, cepat dan akurat. Metode identifikasi secara molekuler dengan PCR dengan menggunakan ITS rDNA sebagai target amplifikasi dapat dijadikan metode andalan.
SIMPULAN DAN SARAN Simpulan 1. Spesies Meloidogyne yang berasosiasi dengan umbi berbintil pada kentang di Pulau Jawa adalah M. javanica, M. incognita, dan M. arenaria. 2. Metode pendeteksian dan pengidentifikasian dilakukan secara morfologi dengan sidik pantat (perineal pattern) dan molekuler dengan Polymerase Chain Reaction (PCR) untuk mendukung satu sama lain tentang keberadaan ketiga spesies Meloidogyne tersebut di sentra produksi kentang di Pulau Jawa. 3. M. javanica dan M. incognita asal Pangalengan berkerabat sangat dekat dengan isolat yang berasal dari Cina dengan tingkat homologi yaitu masing-masing sebesar 95.7% dan 99.8%. Saran 1. Perlu dilakukan penelitian tentang keberadaan Meloidogyne terutama pada pertanaman kentang di lapang untuk mengetahui besarnya intensitas kerusakan yang ditimbulkan sehingga dapat dilakukan pengendalian yang tepat dan akurat. 2. Perlunya pengawasan terhadap benih kentang yang bebas dari Meloidogyne. 3. Pemasukan benih dari negara-negara yang endemik OPTK baik OPTK A1 (Meloidogyne chitwoodi) maupun OPTK A2 (M. hapla) harus dilakukan secara ketat agar benih yang yang dimasukkan ke dalam wilayah NKRI bebas dari OPTK.
DAFTAR PUSTAKA Adam MAM, Phillips MS, Blok VC. 2007. Molecular diagnostic key for identification of single juveniles of seven common and economically import species of root-knot nematode (Meloidogyne spp.). Plant Pathology (56): 190-197. Abawi GS, Ludwig JW, Gugino BK. 2008. Diagnosis, Biology, and Management of Root-Knot and Lesion Nematodes on Potato. New York (US): Cornell University. Tersedia pada [http://vegetablemdonline.ppath.cornell.edu/ NewsArticles/Pot_Nematodes.htm]. Agrios, George N. 2005. Plant Pathology. Ed ke-5. USA: University of Florida. Akyazi F, Han H, Cetintas R, Felek AF. 2009. First report of root-knot nematodes, Meloidogyne arenaria and M. hapla (nemata: meloidogynidae) from pepino in Turkey. Nematologia meditterania. 40: 107-110. Al-Hazmi AS, Ibrahim AAM, Abdul-Raziq AT. 1993. Distribution, frequency and population density of nematodes associated with potato in Saudi Arabia. Afro-Asian Journal of Nematology 3: 107–11. [BPS] Badan Pusat Statistik. 2014. Luas Panen, Produksi dan Produktivitas Kentang, 2009-2013[internet]. [diacu 2014 April 4]. Tersedia dari: http://www.pbs.go.id/tab_sub/view.php?kat=3dantabel=1dandaftar=1danid_ subyek=55dannotab=62 [BPSBTPH] Balai Pengawasan dan Sertifikasi Benih Tanaman Pangan dan Hortikultura. 1997. Sertifikasi Benih Kentang di Indonesia. Bandung (ID): Dinas Pertanian Tanaman Pangan Provinsi Jawa Barat. Brodie BB, Evans K, Franco J. 1993. Nematode parasites of potatoes. Hlm 87132. Di dalam: Evans K, Trudgill DL, Webster JM, editor. Plant Parasitic Nematodes in Temperate Agriculture. Wallingford (UK): CAB International. [CABI] CABInternational. 2007. Crop Protection Compendium. (CD-Rom). Wallingford (UK): CABI. 2nd CD-Rom dengan penuntun didalamnya. Carta, LK, Handoo ZA, Powers TO, Miller SA, Perez-Zubiri RR, Ramirez-Suarez A. 2006. Guidelines for isolation and identification of regulated nematodes of potato (Solanum tuberosum L.) in North America. Revista Mexicana de Fitopatologia 23: 211-222. Cinarli I, Eterkin NN, 1996. Root-knot nematode Meloidogyne javanica (Treub, 1885) Chitwwod, 1949 damage on russett burbank potato tubers centrifugation-flotation technique. Journal of Turkish Phytopathology 25: 103–7. Decker H. 1988. Plant Nematodes and Their Control (Phytonematology). New Delhi (IN): Pauls Press. De Ley, P, Blaxter ML. 2002. Systematic position and phylogeny. Hlm 1-30. Di dalam: Lee DL. (editor.) The Biology of Nematodes. London(UK): Taylor dan Francis. Devran Z, Sogut M A. 2009. Distribution and Identification of root knot nematodes from Turkey. Journal of Nematology. 41 (2):128-133.
26
Devran, Z., M. Nedim, Ö. Adem, and E.I. Halil. 2009. Identification and genetic diversity of Meloidogyne chitwoodi in potato production areas of Turkey. Nematropica 39:75-83. Dropkin VH. 1991. Pengantar Nematologi Tumbuhan. Supratoyo, penerjemah. Yogyakarta: Gadjah Mada University Press. Terjemahan dari: Introduction of Plant Nematology. Eissenback JD, Hirschmann H, Triantaphyllou CA. 1980. Morphological Comparison of Meloidogyne Female Head Strusture, Perineal Pattern, and Stilets. Journal of Nematology. 12 (4): 300-313. Eissenback JD, Triantaphyllou AC. 1991. Root-knot nematodes: Meloidogyne species and races. Hlm 191- 274. Di dalam: Manuel of Agricultural Nematology, W.R. Nickle, ed. Marcel Dekker, Inc. New York. http://plpnemweb.ucdavis.ed /nemaplex/Taxadata.htm [4 Juni 2014]. [EPPO] European and Mediterranean Plant Protection Organization. 2009. PM 7/41(2) Diagnostics: Meloidogyne chitwoodi and Meloidogyne fallax. EPPO Bulletin (39):5–17. [EPPO] European and Mediterranean Plant Protection Organization. 2013. PM 9/17 (1) Meloidogyne chitwoodi and Meloidogyne fallax. EPPO Bulletin 43(3):527–533. [FAO] Food Agriculture Organization. 2008. Potatoes, Nutrients, and Diet. Roma (IT): IYP. Golden AM, O’ Bannon JH, Santo GS, Finley AM. 1980. Description and SEM observations of Meloidogyne chitwoodi n. sp. (Meloidogynidae), a root knot nematode on potato in Pacific Norhwest. Journal of Nematology 12(4). Gondal AS, Javed N, Khan SA, Hyder S. 2012. Genotypic diversity of potato germplasm against root knot nematode (Meloidogyne incognita) infection in Pakistan. eSci Journal. Plant Pathology. 01: 27-38. Hadisoeganda W, Mulyadi, Supramana, Mustika I, Sulistyowati L. 2005. Nematoda Sista Kentang: Identifikasi, Bioekologi dan Pengelolaanya di Indonesia. Jakarta(ID): Departemen Pertanian. Halimah, Supramana, Suastika G. 2013. Identifikasi spesies Meloidogyne pada wortel berdasarkan sikuen nukleotida. Jurnal Fitopatologi Indonesia. 9(1): 1-6. Handayani ND. 2012. Deteksi Dan Identifikasi Nematoda Puru Akar pada Tanaman Krisan Berdasarkan Karakter Morfologi Dan Molekuler [tesis]. Bogor (ID): Institut Pertanian Bogor. Hikmia Z, Supramana, Suastika G. 2012. Identifikasi spesies Meloidogyne spp. penyebab umbi bercabang pada tanaman wortel di Jawa Timur. Jurnal Fitopatologi Indonesia. 8 (3): 73-78. Hunt DJ, Handoo ZA. 2009. Taxonomy, identification and principal species. Di dalam: Perry RN, Moens M, Starr JL, editor. Root-knot Nematodes. Maryland (US): CAB International. Jacobsen, BJ, Mac Donald DH, Bissonnette HL. 1979. Interaction between Meloidogyne hapla and Verticillium albo-atrum in the Verticillium wilt disease of potato. Phytopathology 69:288-292. Karssen G. 1996. Description of Meloidogyne fallax n.sp. (Nematoda: Heteroderidae), a root-knot nematode from the Netherlands. Fundamental and applied Nematology 19: 593-599.
27
[Kementan] Kementerian Pertanian. 2011. Peraturan Menteri Pertanian Nomor 93/Permentan/OT.140/12/2011 tentang Jenis Organisme Pengganggu Tumbuhan Karantina. Jakarta (ID): Kementerian Pertanian RI. Kurniawan W. 2010. Identifikasi penyakit umbi bercabang pada wortel, Daucus carota (L.), di Indonesia [tesis]. Bogor (ID): Institut Pertanian Bogor. Luc M, Sikora RA , Bridge J. 1995. Nematoda Parasitik Tumbuhan di Pertanian Subtropis dan Tropis. Supratoyo, penerjemah. Yogyakarta (ID): Gajah Mada University Press. Terjemahan dari: Plant Parasitic Nematodes in Subtropical and Tropical Agriculture Maqbool M.A. 1986. Classification and distribution of plant parasitic nematodes in Pakistan. Pakistan Journal Nematology. 5: 15-17. Meng QP, Long H, Xu JH. 2004. PCR assay for rapid and sensitive identification of three major root-knot nematodes, Meloidogyne incognita, M. javanica, and M. arenaria. Acta Phytopathol Sinica. 34(3):204-210. Mirsam H, Supramana, Suastika G. 2015. Deteksi dan identifikasi spesies Meloidogyne pada tanaman wortel dari Dataran Tinggi Malino, Gowa, Sulawesi Selatan. Jurnal Fitopatologi Indonesia 11(1): 1-8. doi: 10.14692/jfi.11.1.1. Mitkowski NA, Abawi GS. 2003. Root-knot nematodes. The Plant Health Instructor. doi:10.1094/PHI-I-2003-0917-01. Powers TO, Todd TC, Burnell AM, Murray PCB, Fleming CC, Szalanski AL, Adams BA, Harris TS. 1997. The rDNA Internal Transcribed Spacer Region as a Taxonomic Marker for Nematodes. Journal of Nematology 29(4): 441-450. [Pusdatin] Pusat Data dan Sistem Informasi Pertanian. 2013. Kentang. Buletin Konsumsi Pangan 4(1):15-24. [Pusdatin] Pusat Data dan Sistem Informasi Pertanian. 2013. Kinerja Perdagangan Komoditas Pertanian. Jakarta(ID): Kementerian Pertanian. Qiu JJ, Westerdahl BB, Anderson C, Williamson VM. 2006. Sensitive PCR detection of Meloidogyne arenaria, M. incognita, and M. javanica extracted from soil. Journal of Nematology 38(4):434–441. Rubatzky VE, Yamaguchi M. 1998. Sayuran Dunia: Prinsip, Produksi, dan Gizi [Jilid 1]. Bandung [ID]: ITB Press. Rukmana R. 1997. Kentang, Budidaya dan Pasca Panen. Yogyakarta (ID): Kanisius. Russo G, Greco N, d’Errico FP, Brandonisio A. 2007. Impact of the root-knot nematode, Meloidogyne incognita, on potato during two different growing seasons. Nematologia Meditterania 35: 29-34. Singh RS, Sitaramaiah. 1994. Plant Patogens: The Plant Parasitic Nematodes. New York (US): International Science Publisher. Supramana, Supriadi, Rita Harni. 2008. Seleksi dan karakterisasi bakteri endofit untuk mengendalikan nematoda peluka akar (Pratylenchus brachyurus) pada tanaman nilam. Laporan Hasil Penelitian. Bogor (ID): Institut Pertanian Bogor. Taher M, Supramana, Gede S. 2012. Identifikasi Meloidogyne penyebab penyakit umbi bercabang pada wortel di Dataran Tinggi Dieng. Jurnal Fitopatologi Indonesia. 8(1):16-21.
28
Taylor AL, Sasser JN, Nelson LA. 1985. Relationship of climate and soil characteristics to geographical distribution of Meloidogyne species in agricultural soils. Raleigh (US): North Carolina University. Tesarova B, Zouhar M, Rysanek P. 2003. Development of PCR for specific determination of root-knot nematode Meloidogyne incognita. Plant Protection. 39(1): 23–28. Tigano MST, Carneiro RMDG, Jeyaprakash A, Dickson OW, Adams BJ. 2005. Phylogeny of Meloidogyne spp. based on 185 rNA and the intergenic region of mitochondrial DNA sequences. Nematology (7): 851-862. Ummah K. 2010. Produksi bibit kentang (Solanum tuberosum l.) di Hikmah Farm, Pangalengan, Bandung, Jawa Barat [skripsi]. Bogor (ID): Institut Pertanian Bogor. Vovlas N, Mifsud D, Landa B. B., Castillo P. 2005. Pathogenicity of the root-knot nematode Meloidogyne javanica on potato. Plant Pathology .(54) 657–664. doi: 10.1111/j.1365-3059.2005.01244.x Wattimena GA. 2000. Pengembangan Propagul Kentang Bermutu dan Kultivar Kentang Unggul dalam Mendukung Peningkatan Produksi Kentang di Indonesia [orasi ilmiah]. Bogor [ID]: Institut Pertanian Bogor. Yuwono Triwibowo. 2006. Teori dan Aplikasi Polymerase Chain Reaction. Yogyakarta (ID): ANDI. Ziljstra C, Lever EM, Uenk BJ, Van Silfhout CH. 1995. Differences between ITS Regions of Isolates of Root-knot Nematodes Meloidogyne hapla and M. chitwoodi. Phytopathology 85: 1231-1237. Ziljstra C. 2000. Identification of Meloidogyne chitwoodi, M. fallax and M.hapla based on SCAR- PCR a powerful way of enabling reliable identification of population or individuals that share common traits. European Journal of Plant Pathology (106): 283-290. Zijlstra C, Donkers-Venne DTHM, Fargette M. 2000. Identification of Meloidogyne incognita, M. javanica and M. arenaria using sequence characterised amplified region (SCAR) based PCR assays. Nematology. 2(8):847-853. Zitter TA. 2001. Potato Disease Management in 2001. New York (US): Cornell University.
LAMPIRAN Lampiran 1 Runutan basa nukleotida M. javanica Pangalengan ....|....| 5 ACTTTACAAG -------------------------------------------------------------------------
....|....| 15 TTAGGTTTTT -----TTTTT -----TTTTT -----TTTTT -----TTTTT -----TTTTT -----TTTTT -----TTTTT -----TTTTT *****
....|....| 25 TATAAACCCC TATAAACCCA TATAAACCCA TATAAACCCA TATAAACCCA TATAAACCCA TATAAACCCA TATAAACCCA TATAAACCCA *********
....|....| 35 GCTAGGGACC GCTAGGAACC GCTAGGAACC GCTAGGAACC GCTAGGAACC GCTAGGAACC GCTAGGAACC GCTAGGAACA GCTAGGAACA ****** **
....|....| 45 ATTTTTTGAA ATTTTTTGAA ATTTTTTGAA CTTTTTTGAA CTTTTTTGAA ATTTTTTGAA CTTTTTTGAA ATTTTTTGAA ATTTTTTGAA *********
....|....| 55 AAAATTTTCC ACTATTTTCC ACTATTTTCC ACTATTTTCC ACTATTTTCC ACTATTTTCC ACTATTTTCC ACTATTTTCC ACTATTTTCC * *******
M. javanic China isol China isol Malaysia i Malaysia i China isol Malaysia i Malaysia i Malaysia i Clustal Co
....|....| 65 CCATTTATTC CCATTTATTC CCATTTATTC CCCTTTATTT CCCTTTATTT CCATTTATTC CCCTTTATTT CCATTTATTC CCATTTATTC ** ******
....|....| 75 GCAAGACAAC GCAAGACAAC GCAAGACAAC GCAAGACAAC GCAAGACAAC GCAAGACAAC GCAAGACAAC GCAAGACAAC GCAAGACAAC **********
....|....| 85 ACCCCATTAT ACCCCATTAT ACCCCATTAT ACCCCATTAT ACCCCATTAT ACCCCATTAT ACCCCATTAT ACCCCATTAT ACCCCATTAT **********
....|....| 95 TACCCCCCAC TACCCCCCAT TACCCCCCAT TACCCCCCAT TACCCCCCAT TACCCCCCAT TACCCCCCAT TACCCCCCAT TACCCCCCAT *********
....|....| 105 CAGGGGTCGG CAGGGGTCGG CAGGGGTCGG CAGGGGTCGG CAGGGGTCGG CAGGGGTCGG CAGGGGTCGG CAGGGGTCGG CAGGGGTCGG **********
....|....| 115 CGGGAATTCC CTGGAATTCC CTGGAATTCC CTGGAATTCC CTGGAATTCC CTGGAATTCC CTGGAATTCC CTGGAATTCC CTGGAATTCC * ********
M. javanic China isol China isol Malaysia i Malaysia i China isol Malaysia i Malaysia i Malaysia i Clustal Co
....|....| 125 GATTTCCGAC GATTTCCGAC GATTTCCGAC GATTTCCGAC GATTTCCGAC GATTTCCGAC GATTTCCGAC GATTTCCGAC GATTTCCGAC **********
....|....| 135 ATTTTTTGCT ATTTTTTGCT ATTTTTTGCT ATTTTTTGCT ATTTTTTGCT ATTTTTTGCT ATTTTTTGCT ATTTTTTGCT ATTTTTTGCT **********
....|....| 145 TCCGAATTCC TCCGACTTCC TCCGACTTCC TCCGACTTCC TCCGACTTCC TCCGACTTCC TCCGACTTCC TCCGACTTCC TCCGACTTCC ***** ****
....|....| 155 AAAAAATTTA -GAAAATTTA -GAAAATTTA -GAAAATTTA -GAAAATTTA -GAAAATTTA -GAAAATTTA -GAAAATTTA -GAAAATTTA ********
....|....| 165 GGCTGATTTC GGCTGATTTC GGCTGATTTC GGCTGATTTC GGCTGATTTC GGCTGATTTC GGCTGATTTC GGCTGATTTC GGCTGATTTC **********
....|....| 175 CGATTTCCGA CGATTTCCGA CGATTTCCGA CGATTTCCGA CGATTTCCGA CGATTTCCGA CGATTTCCGA CGATTTCCGA CGATTTCCGA **********
M. javanic China isol China isol Malaysia i Malaysia i China isol Malaysia i Malaysia i Malaysia i Clustal Co
....|....| 185 CTTTTGAGCC CTTTTGAGCC CTTTTGAGCC CTTTTGAGCC CTTTTGAGCC CTTTTGAGCC CTTTTGAGCC CTTTTGAGCC CTTTTGAGCC **********
....|....| 195 ATTTCCGATT ATTTCCGATT ATTTCCGATT ATTTCCGATT ATTTCCGATT ATTTCCGATT ATTTCCGATT ATTTCCGATT ATTTCCGATT **********
....|....| 205 TCCGACAGTT TCCGACAGTT TCCGACAGTT TCCGACAGTT TCCGACAGTT TCCGACAGCT TCCGACAGTT TCCGACAGTT TCCGACAGTT ******** *
....|....| 215 CCCATTTCCG CCCATTTCCG CCCATTTCCG CCCATTTCCG CCCATTTCCG CCCATTTCCG CCCATTTCCG CCCATTTCCG CCCATTTCCG **********
....|....| 225 ACACCTTCGT ACACCTTCGT ACACCTTCGT ACACCTTTGT ACACCTTTGT ACACCTTCGT ACACCTTTGT ACACCTTTGT ACACCTTTGT ******* **
....|....| 235 CATTTCCGAC CATTTCCGAC CATTTCCGAC CATTTCCGAC CATTTCCGAC CATTTCCGAC CATTTCCGAC CATTTCCGAC CATTTCCGAC **********
M. javanic China isol China isol Malaysia i Malaysia i China isol Malaysia i Malaysia i Malaysia i Clustal Co
....|....| 245 CGGCACCTTT CGGCACCTTT CGGCACCTTT CGGCCCCTTT CGGCCCCTTT CGGCACCTTT CGGCCCCTTT CGGCCCCTTT CGGCCCCTTT **** *****
....|....| 255 CTTCCCCTCC CTTCCCCTCC CTTCCCCTCC CTTCCCC--CTTCCCC--CTACCCCTCC CTTCCCC--CTTCCCC--CTTCCCC--** ****
....|....| 265 CCCCCCCCCC CCCCCCCCCC CCCCCCCCCC CCCCCCCCCC CCCCCCCCCC CCCCCCC--CCCCCCCCCC CCCCCCCCCC CCCCCCCCCC *******
....|....| 275 CATTACAAGT -ATTACAAGT -ATTACAAGT CATTACAAGT CATTACAAGT -ATTACAAGT CATTACAAGT CATTACAAGT CATTACAAGT *********
....|....| 285 TGATACGAAA TGATACGTAA TGATACGTAA TGATACGTAA TGATACGTAA TGATACGTAA TGATACGTAA TGATACGTAA TGATACGTAA ******* **
....|....| 295 CAGGGTCTTT CAGTGTCTTT CAGTGTCTTT CAGTGTCTTT CAGTGTCTTT CAGTGTCTTT CAGTGTCTTT CAGTGTCTTT CAGTGTCTTT *** ******
M. javanic China isol China isol Malaysia i Malaysia i China isol Malaysia i Malaysia i Malaysia i Clustal Co
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
30
Lampiran 1 (lanjutan) M. javanic China isol China isol Malaysia i Malaysia i China isol Malaysia i Malaysia i Malaysia i Clustal Co
305 TATACTAGCT TATACTAGCT TATACTAGCT TATACTAGCT TATACTAGCT TATACTAGCT TATACTAGCT TATACTAGCT TATACTAGCT **********
315 AACGCCACCG AACGCCACCG AACGCCACCG AACGCCACCG AACGCCACCG AACGCCACCG AACGCCACCG AACGCCACCG AACGCCACCG **********
325 CAACAAAAAA TAACAGAAAA TAACAGAAAA TAACAGAAAA TAACAGAAAA TAACAGAAAA TAACAGAAAA TAACAGAAAA TAACAGAAAA **** ****
335 CCAAATAAAA CCTAATAAAT CCTAATAAAT CCTAATAAAT CCTAATAAAT CCTAATAAAT CCTAATAAAT CCTAATAAAT CCTAATAAAT ** ******
345 AAATTTATCG AAATTTATCG AAATTTATCG AAATTTATCG AAATTTATCG AAATTTATCG AAATTTATCG AAATTTATCG AAATTTATCG **********
355 AAAAGGCTCT AAAATGCTCT AAAATGCTCT AAAATGCTCT AAAATGCTCT AAAATGCTCT AAAATGCTCT AAAATGCTCT AAAATGCTCT **** *****
M. javanic China isol China isol Malaysia i Malaysia i China isol Malaysia i Malaysia i Malaysia i Clustal Co
....|....| 365 AATTAAAGTC AATTAAAGTC AATTAAAGTC AATTAAAGTC AATTAAAGTC AATTAAAGTC AATTAAAGTC AATTAAAGTC AATTAAAGTC **********
....|....| 375 CTAGGCGTTT CTAGGCGTTT CTAGGCGTTT CTAGGCGTTT CTAGGCGTTT CTAGGCGTTT CTAGGCGTTT CTAGGCGTTT CTAGGCGTTT **********
....|....| 385 ATTTTTCAAT ATTTTTCAAT ATTTTTCAAT ATTTTTCAAT ATTTTTCAAT ATTTTTCAAT ATTTTTCAAT ATTTTTCAAT ATTTTTCAAT **********
....|....| 395 TGGCCTCCTT TGGCCTCCTT TGGCCTCCTT TGGCCTCCTT TGGCCTCCTT TGGCCTCCTT TGGCCTCCTT TGGCCTCCTT TGGCCTCCTT **********
....|....| 405 GAGGGGGCTG GAGTGGGCTT GAGTGGGCTT GAGTGGGCTT GAGTGGGCTT GAGTGGGCTT GAGTGGGCTT GAGTGGGCTT GAGTGGGCTT *** *****
....|....| 415 ATATTAGAGA ATATTAGAGA ATATTAGAGA ATATTAGAGA ATATTAGAGA ATATTAGAGA ATATTAGAGA ATATTAGAGA ATATTAGAGA **********
M. javanic China isol China isol Malaysia i Malaysia i China isol Malaysia i Malaysia i Malaysia i Clustal Co
....|....| 425 GGGGCTTCTA TGGGCTTCTA TGGGCTTCTA TGGGCTTCTA TGGGCTTCTA TGGGCTTCTA TGGGCTTCTA TGGGCTTCTA TGGGCTTCTA *********
....|....| 435 TTAGTGAAGG TTAGTGAAGG TTAGTGAAGG TTAGTGAAGG TTAGTGAAGG TTAGTGAAGG TTAGTGAAGG TTAGTGAAGG TTAGTGAAGG **********
....|....| 445 GCATCTATTA GCATCTATTA GCATCTATTA GCATCTATTA GCATCTATTA GCATCTATTA GCATCTATTA GCATCTATTA GCATCTATTA **********
....|....| 455 GACATGGGCA GACATGGGCA GACATGGGCA GACATGGGCA GACATGGGCA GACATGGGCA GACATGGGCA GACATGGGCA GACATGGGCA **********
....|....| 465 TCTAATAAAA TCTAATAGAA TCTAATAGAA TCTAATAGAA TCTAATAGAA TCTAATAGAA TCTAATAGAA TCTAATAGAA TCTAATAGAA ******* **
....|....| 475 CCGGGCTTTA CCGGGCTTTA CCGGGCTTTA CCGGGCTTTA CCGGGCTTTA CCGGGCTTTA CCGGGCTTTA CCGGGCTTTA CCGGGCTTTA **********
M. javanic China isol China isol Malaysia i Malaysia i China isol Malaysia i Malaysia i Malaysia i Clustal Co
....|....| 485 ATTAGAGCTT ATTAGAGCTT ATTAGAGCTT ATTAGAGCTT ATTAGAGCTT ATTAGAGCTT ATTAGAGCTT ATTAGAGCTT ATTAGAGCTT **********
....|....| 495 TTACGGAATT TTACGGTATT TTACGGTATT TTACGGTATT TTACGGTATT TTACGGTATT TTACGGTATT TTACGGTATT TTACGGTATT ****** ***
....|....| 505 TAATTTTGTA TAATTTTGTA TAATTTTGTA TAATTTTGTA TAATTTTGTA TAATTTTGTA TAATTTTGTA TAATTTTGTA TAATTTTGTA **********
....|....| 515 TTTTTTAGTA TTTTTTAGTA TTTTTTAGTA TTTTTTAGTA TTTTTTAGTA TTTTTTAGTA TTTTTTAGTA TTTTTTAGTA TTTTTTAGTA **********
....|....| 525 GGAAAGGAAG GGAAATGCAG GGAAATGCAG GGAAATGCAG GGAAATGCAG GGAAATGCAG GGAAATGCAG GGAAATGCAG GGAAATGCAG ***** * **
....|....| 535 TCTTTCAATT TCTTTCAATT TCTTTCAATT TCTTTCAATT TCTTTCAATT TCTTTCAATT TCTTTCAATT TCTTTCAATT TCTTTCAATT **********
M. javanic China isol China isol Malaysia i Malaysia i China isol Malaysia i Malaysia i Malaysia i Clustal Co
....|....| 545 AAATATTACA AAATATTACA AAATATTACA AAATATTACA AAATATTACA AAATATTACA AAATATTACA AAATATTACA AAATATTACA **********
....|....| 555 AATACTTCAA AATACTTCAA AATACTTCAA AATACTTCAA AATACTTCAA AATACTTCAA AATACTTCAA AATACTTCAA AATACTTCAA **********
....|....| 565 TATACGTAGA TATACGTAGA TATACGTAGA TATACGTAGA TATACGTAGA TATACGTAGA TATACGTAGA TATACGTAGA TATACGTAGA **********
....|....| 575 TACATACACG TACATACACG TACATACACG TACATACACG TACATACACG TACATACACG TACATACACG TACATACACG TACATACACG **********
....|....| 585 GCAGATTAAA GTAGATTAAA GTAGATTAAA GTAGATTAAA GTAGATTAAA GTAGATTAAA GTAGATTAAA GTAGATTAAA GTAGATTAAA * ********
....|....| 595 TTTTGATTTA TTTTGATTTA TTTTGATTTA TTTTGATT-A TTTTGATT-A TTTTGATTTA TTTTGATT-A TTTTGATT-A TTTTGATT-A ******** *
31
Lampiran 1 (lanjutan) ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| . 605 615 625 635 645 M. javanic ATTGGGTACA CCCCGTTTCA GTCTGGGCTC GGTTCATTCG CGCCCCAACA China isol ATTGGGTACA CCTCGTTTCA GTCTGGGCTC AGTTCAATCG CGC------China isol ATTGGGTACA CCTCGTTTCA GTCTGGGCTC AGTTCAATCG CGC------Malaysia i ATTGGGTACA CCCC------ ---------- ---------- ---------Malaysia i ATTGGGTACA CCCC------ ---------- ---------- ---------China isol ATTGGGTACA CCTCGTTTCA GTCTGGGCTC AGTTCAATCG CGC------Malaysia i ATTGGGTACA CCCC------ ---------- ---------- ---------Malaysia i AT-GG-TACA CCCC------ ---------- ---------- ---------Malaysia i AT-GG-TACA CCCC------ ---------- ---------- ---------Clustal Co ** ** **** ** *
A -
Lampiran 2 Runutan basa nukleotida M. incognita Pangalengan M.incognit M. incogni M. incogni M.incognit M. arenari M. hapla_C M. javanic Clustal Co
....|....| 5 CTATTAATTT CTATTAATTT CTATTAATTT CTATTAATTT TTTTCTATTT CCGCCCGTCG TTTTTTATAC *
....|....| 15 CATTCCATTT CATTCCATTT CATTCCATTT CATTCCATTT CTTTCCAATT CTGCCCGGGA CCCGCTAGGG * *
....|....| 25 ATTTTCAATT ATTTTCAATT ATTTTCAATT ATTTTCAATT CCCTGTTCTC CTGAGCCATT ACC-ATTTTT *
....|....| 35 TTGACAAATT TTGACAAATT TTGACAAATT TTGACAAATT TGCACGAATA TCGAGAAATT TGAAAAAATC * * ***
....|....| 45 CTTAAGAAAT CTTAAGAAAT CTTAAGAAAT CTTAAGAAAT ACCATTAAAT GGAGACTGTT CCCATTTATT *
....|....| 55 TGTCTAATTT TGTCTAATTT TGTCTAATTT TGTCTAATTT CATCTAATTC GATCTAATTT CGCAAGACCA *
M.incognit M. incogni M. incogni M.incognit M. arenari M. hapla_C M. javanic Clustal Co
....|....| 65 TTTTTAAATA TTTTTAAATA TTTTTAAATA TTTTTAAATA TTTCAAGTTG TTTTAAGTTA CCCCATTATT *
....|....| 75 CATATATGTA CATATATGTA CATATATGTA CATATATGTA TCCATCCACT CTTTGATGGA ACCCCCCACC
....|....| 85 ACACATATCA ACACATATCA ACACATATCA ACACATATCA CTGAGTTTCA ATTAATCGCA AGGGGTCGCG * *
....|....| 95 AAAATTAAAT AAAATTAAAT AAAATTAAAT AAAATTAAAT GTAATTTTAT GTGGCTTGAA GGAATTCCGA *
....|....| 105 TATCCAATAG TATCCAATAG TATCCAATAG TATCCAATAG TTGTCAATAN CCGGGCAAAA TTTCCGACAT * *
....|....| 115 ATAAATTACT ATAAATTACT ATAAATTACT ATAAATTACT WNAAAGNATT CAAGGTAGCT TTTTTGCTTC
M.incognit M. incogni M. incogni M.incognit M. arenari M. hapla_C M. javanic Clustal Co
....|....| 125 AAGCCTTATT AAGCCTTATT AAGCCTTATT AAGCCTTATT CCATTTCCTT GTAGGTACCT CGAATTCCAA *
....|....| 135 ATACAAATCA ATACAAATCA ATACAAATCA ATACAAATCA GGGTTTGTAN GCTGCTGGAT AAATTTAGGC
....|....| 145 TCTGCTAAAA TCTGCTAAAA TCTGCTAAAA TCTGCTAAAA TGCGCTGGNN CATTCTTTTT TGATTCCGAT
....|....| 155 TTTAAAATTT TTTAAAATTT TTTAAAATTT TTTAAAATTT NTCNCATTNT GTTCAAATTC TTCCGACTTT * * *
....|....| 165 TAGAAAAAAT TAGAAAAAAT TAGAAAAAAT TAGAAAAAAT TCAWGANTTT GAATAGTCTC TGAGCCATTT
....|....| 175 TAATTTTAAT TAATTTTAAT TAATTTTAAT TAATTTTAAT NTACTTAAAN AACTTATCGT CCGTTCCGAC *
....|....| 185 TACTTATTTA TACTTATTTA TACTTATTTA TACTGATTTA AGGAAATTTC TGTGAACGGC AGTTCCCATT
....|....| 195 CCTTTTTAAT CCTTTTTAAT CCTTTTTAAT CCTTTTTAAT TTTAANAAWW TGTCGCTGTG TCCGACACTT
....|....| 205 TTTTCCTTCC TTTTCCTTCC TTTTCCTTCC TTTTCCTTCC TTTTTCTTCA TCTAGGTGTT CGTCATTTCC * *
....|....| 215 AAAAATTAAT AAAAATTAAT AAAAATTAAT AAAAATTAAT GNCAGTWCAG GCTGATTCAG GCCGGCACCT
....|....| 225 TTTCGGTTTC TTTCGGTTTC TTTCGGTTTC TTTCGGTTTC YTNAGTCCNN CTAACGTCCG TTCTTCCCCC *
....|....| 235 TTGATTATTT TTGATTATTT TTGATTATTT TTGATTATTT CCGTNCANTC TGGCTGAATA CCCCCCATTA * *
M.incognit M. incogni M. incogni M.incognit M. arenari M. hapla_C M. javanic Clustal Co
32
Lampiran 2 (lanjutan)
M.incognit M. incogni M. incogni M.incognit M. arenari M. hapla_C M. javanic Clustal Co
....|....| 245 TCAGCTTTCA TCAGCTTTCA TCAGCTTTCA TCAGCTTGCA CNGNATAASG TGAGGTGACA CAAGTTGATA *
....|....| 255 AGTGTAGATA AGTGTAGATA AGTGTAGATA AGTGTAGATA TGNGAAGGTG TGTTAGGATA CGAAACAGGG *
....|....| 265 TTTTCTTTTA TTTTCTTTTA TTTTCTTTTA TTTTCTTTTA GTCATTGGAN ATCGTTTAAG TCTTTTATAC *
....|....| 275 AACTTTTAAT AACTTTTAAT AACTTTTAAT AACTTTTAGT ANNGAATGGN ACTTAATGAG TAGCTAACGC
....|....| 285 TTCTTTTTCA TTCTTTTTCA TTCTTTTTCA TTCTTTTTCA MCNYTCTNCA CCTCTTAAGT CACCGCAACA
....|....| 295 TGTTCTAATT TGTTCTAATT TGTTCTAATT TGTTCTAATT AGAWACCAAA GAGGACGCCA AAAAACCAAA
M.incognit M. incogni M. incogni M.incognit M. arenari M. hapla_C M. javanic Clustal Co
....|....| 305 GGATAAATTT GGATAAATTT GGATAAATTT GGATAAATTT GGATAAGACT GCAATAAACT TAAAAAAATT * * *
....|....| 315 TATTTTCATG TATTTTCATG TATTTTCATG TATTTTCATG GAYCNATATA ATTTTTTTTA TATCGAAAAG
....|....| 325 AAGAATTTGG AAGAATTTGG AAGAATTTGG AAGAATTTGG AATGATCAAA AAAAACGAAA GCTAATTAAA *
....|....| 335 TTTTTGAACT TTTTTGAATT TTTTTGAATT TTTTTGAATT AACTGACTTT ATTTCTATCC GTCCTAGGCG
....|....| 345 TTCTAAAAAA TTCTAAAAAA TTCTAAAAAA TTCTAAAAAA TTCANAAAAG TTATCGGTGG TTTATTTTTC **
....|....| 355 ACAATTTTAA ACAATTTTAA ACAATTTTAA ACAATTTTAA ATVATTTTYG ATCACGCTCG AAGGCCTTGA * *
....|....| 365 GTAACATAGT GTAACATAGT GTAACATAGT GTAACATAGT SNCATTTATS TGGATCCATG GGGGGCTGAT
....|....| 375 AACTGTATAT AACTGTATAT AACTGTATAT AACTGTATAT GATCATAACT AAGAGCAGCT ATTAGAGGGG
....|....| 385 TTTGCAGAGG TTTGCAGAGG TTTGCAGAGG TTTGCAGAGG TTYTTATAAA AACTGCGATA CTTCTATTAG
....|....| 395 ACGTATGGGA ACGTATGGGA ACGTATGGGA ACGTATGGGA NCAGGAAAAA ATTTGGCGAA TGAAGGGCAT
....|....| 405 CGGACGAACC CGGACGAACC CGGACGAACC CGGACGAACC ATTTTGAWTT CTGCAGAAAC CTATTAGACA
....|....| 415 GCGATATTTC GCGATATTTC GCGATATTTC GCGATATTTC TTKGGATCTT ATTGAGCATA TGGGCATCTA *
....|....| 425 AATATATGTA AATATATGTA AATATATGTA AATATATGTA GKAGTTTAAT AAAGTTTGAA ATAACCGGGC
....|....| 435 CATACCATGT CATACCATGT CATACCATGT CATACCATGT YNTATNTTGA TGCAAATTGC TTTAATTAGC * *
....|....| 445 GCCTTTCAGC GCCTTTCAGC GCCTTTCAGC GCCTTTCAGC NMCCANGAAC GGCACTGGGG TTTTACGGAA
....|....| 455 TTTGCCGAAT TTTGCCGAAT TTTGCCGAAT TTTGCCGAAT CNRAAATTAT TAACCCTTTG TTTAATTTTG
....|....| 465 TTTCGTCTTT TTTCGTCTTT TTTCGTCTTT TTTCGTCTTT CCTTCWTAAG CCACGTCTGG TATTTTTTAG
....|....| 475 TTTGGTGCTT TTTGGTGCTT TTTGGTGCTT TTTGGTGCTT TNATAGGTSC TTCAGGGTCA TAGGAAAGGA *
....|....| 485 CGTCTTTTGC CGTCTTTTGC CGTCTTTTGC CGTCTTTTGC NNCTTATNAM TTTTTCTATA AGTCTTTCAA * *
....|....| 495 TTTTATATTA TTTTATATTA TTTTATATTA TTTTATATTA YNNNGKNCTC AAGTTAAATT TTAAATATTA *
....|....| 505 CCTTTTTTTT CCTTTTTTTT CCTTTTTTTT CCTTTTTTTT TNNATNTTWT TTATTTTTTG CAAATACTTC * *
....|....| 515 AAAATCTCGG AAAATCTCGG AAAATCTCGG AAAATCTCGG AAATTNNTTN CCATTGGCAC AATATAGTAG *
....|....| 525 CACACCCCCC CACACCCCCC CACACCCCCC CACACCCCCC WTANGCNCTT TATAACTTTT ATACATACAC
....|....| 535 GGTTTCAGGA GGTTTCAGGA GGTTTCAGGA GGTTTCAGGA NNCTTANTNW ATGTTGGTAC GGCAGATTAA
M.incognit M. incogni M. incogni M.incognit M. arenari M. hapla_C M. javanic Clustal Co
M.incognit M. incogni M. incogni M.incognit M. arenari M. hapla_C M. javanic Clustal Co
M.incognit M. incogni M. incogni M.incognit M. arenari M. hapla_C M. javanic Clustal Co
33
Lampiran 2 (lanjutan)
M.incognit M. incogni M. incogni M.incognit M. arenari M. hapla_C M. javanic Clustal Co
....|....| 545 CCTATGGCCA CCTATGGCCA CCTATGGCCG CCTATGGCCA WCNWTNRYYW GCAGCGATTT ATTTTGATTA
....|....| 555 TTGGGTCTTG TTGGGTCTTG TTGGGTCTTG TTGGGTCTTG TTTGTTTNKK GTAAATGAAT ATGGTACACC *
.. GA GA GA GA TT AA CC
Keterangan: Tanda bintang (*) menunjukkan bahwa basa tersebut sama dengan basa dari negara lain.
RIWAYAT HIDUP Penulis dilahirkan pada tanggal 21 April 1984 di Kota Bogor sebagai anak ketujuh dari sepuluh bersaudara dari pasangan Bapak Sutan Busman (Alm) dan Ibu Cinenah. Pada tahun 2002 penulis menyelesaikan pendidikan di SMU Negeri 1 Bogor dan pada tahun yang sama penulis diterima di Institut Pertanian Bogor pada Jurusan Hama Penyakit Tumbuhan melalui Undangan Seleksi Masuk IPB (USMI). Pada tahun 2007, penulis menyelesaikan pendidikannya dan kemudian bekerja sebagai Tenaga Harian Lepas-Tenaga Bantu Penyuluh Pertanian pada Kementerian Pertanian dengan wilayah kerja Kota Bogor. Pada tahun 2009 hingga sekarang, penulis bertugas sebagai Pengendali Organisme Pengganggu Tumbuhan Ahli (POPT Ahli) di Lingkup Kementerian Pertanian, Badan Karantina Pertanian dengan wilayah kerja di Balai Besar Karantina Pertanian Soekarno-Hatta. Pada tahun 2013 penulis menerima beasiswa tugas belajar dari Badan Karantina Pertanian pada Sekolah Pascasarjana Institut Pertanian Bogor pada jurusan Entomologi. Pada tanggal 24 Nopember 2012, penulis menikah dengan Sugandi dan pada 17 Oktober 2013 dikaruniai seorang putri yang bernama Busmannisa Hilmalia Rizky.
