TESIS IDENTIFIKASI SPESIES POTYVIRUS YANG BERASOSIASI DENGAN PENYAKIT MOSAIK PADA TANAMAN KACANG PANJANG (Vignasinensis L.) BERDASARKAN SEKUEN NUKLEOTIDA
I WAYAN SUKADA
PROGRAM PASCASARJANA UNIVERSITAS UDAYANA DENPASAR 2016
TESIS IDENTIFIKASI SPESIES POTYVIRUS YANG BERASOSIASI DENGAN PENYAKIT MOSAIK PADA TANAMAN KACANG PANJANG (Vigna sinensis L.) BERDASARKAN SEKUEN NUKLEOTIDA
I WAYAN SUKADA NIM 1490861007
PROGRAM MAGISTER PROGRAM STUDI BIOTEKNOLOGI PERTANIAN PROGRAM PASCASARJANA UNIVERSITAS UDAYANA DENPASAR 2016 i
IDENTIFIKASI SPESIES POTYVIRUS YANG BERASOSIASI DENGAN PENYAKIT MOSAIK PADA TANAMAN KACANG PANJANG(Vigna sinensis L.) BERDASARKAN SEKUEN NUKLEOTIDA
Tesis untuk Memperoleh Gelar Magister pada Program Magister, Program Studi Bioteknologi Pertanian, Program Pascasarjana Universitas Udayana
I WAYAN SUKADA NIM 1490861007
PROGRAM MAGISTER PROGRAM STUDI BIOTEKNOLOGI PERTANIAN PROGRAM PASCASARJANA UNIVERSITAS UDAYANA DENPASAR 2016 ii
Lembar Pengesahan TESIS INI TELAH DISETUJUI PADA TANGGAL, 12 Juli 2016
Pembimbing I,
Pembimbing II,
Dr. Ir. I Dewa Nyoman Nyana, M.Si NIP : 19540220198503 1 001
Dr. Ir. Gede Suastika, M.Sc NIP : 19620607 198703 1 001
Mengetahui
Ketua Program Studi Bioteknologi PertanianProgram Pascasarjana Universitas Udayana,
Direktur Program Pascasarjana Universitas Udayana,
Prof. Dr. Ir. I Gede Rai Maya Temaja, M.P Prof. Dr. dr. A.A. Raka Sudewi, Sp.S(K). NIP : 19621009 198803 1 002 NIP : 19590215 198510 2 001
iii
PENETAPAN PANITIA PENGUJI
Tesis ini Telah Diuji pada Tanggal 12 Juli 2016
Panitia Penguji Tesis Berdasarkan SK Direktur Program Pascasarjana Universitas Udayana , No.3528/UN14.4/HK/2016, Tanggal 12 Juli 2016
Ketua
: Dr. Ir. I Dewa Nyoman Nyana, M.Si.
Anggota : 1. Dr. Ir. Gede Suastika, M.Sc 2. Prof. Dr. Ir. I Gede Rai Maya Temaja, M.P. 3. Prof. Dr. Ir. I Made Sudana, M.S. 4. I Putu Sudiarta, SP., M.Si., Ph.D
iv
SURAT PERNYATAAN BEBAS PLAGIAT
Saya yang bertanda tangan di bawah ini: Nama
: I Wayan Sukada
NIM
: 1490861007
Program studi : Bioteknologi Pertanian Judul Tesis
: IDENTIFIKASI SPESIES POTYVIRUS YANG BERASOSIASI DENGAN PENYAKIT MOSAIK PADA TANAMAN KACANG PANJANG(Vigna sinensisL.) BERDASARKAN SEKUEN NUKLEOTIDA
Dengan ini menyatakan bahwa karya ilmiah tesis ini bebas plagiat. Apabila dikemudian hari terbukti plagiat dalam karya ilmiah ini, maka saya bersedia menerima sanksi sesuai peraturan Mendiknas RI No. 17 Tahun 2010 dan Peraturan Perundang -undangan yang berlaku.
Denpasar, 12 Juli 2016 Yang membuat pernyataan
(I Wayan Sukada)
v
UCAPAN TERIMA KASIH Pertama-tama perkenankanlah penulis memanjatkan puji syukur ke hadapan Ida Sang Hyang Widhi Wasa, karena hanya atas asung wara nugrahaNya, tesis ini dapat diselesaikan. Pada kesempatan ini perkenankanlah penulis mengucapkan terima kasih yang sebesar-besarnya kepada Dr. Ir.I Dewa Nyoman Nyana, M.Si.selaku Pembimbing I yang dengan penuh perhatian dan kesabaran telah memberikan bimbingan dan saran kepada penulis; Dr. Ir. Gede Suastika, M.Sc selaku Pembimbing II yang dengan penuh perhatian dan kesabaran memberikan dorongan, semangat, bimbingan, saran dan pengarahan kepada penulis selama penyusunan tesis ini. Ucapan yang sama juga ditujukan kepada Rektor Universitas Udayana Prof. Dr. dr. Ketut Suastika, SpPD., KEMD dan Ibu Direktur Pascasarjana Universitas Udayana Prof. Dr. dr. A.A. Raka Sudewi, Sp. S(K) serta Prof. Dr. Ir. I Gede Rai Maya Temaja, M.P. selaku Ketua Program Studi Bioteknologi Pertanian Program Pascasarjana Universitas Udayana atas kesempatan yang diberikan kepada penulis untuk menjadi mahasiswa Program Magister pada Program Pascasarjana Universitas Udayana serta seluruh staf dosen dan staf administrasi yang telah banyak membantu penulis selama menempuh pendidikan. Pada kesempatan ini penulis juga mengucapkan terima kasih yang sebesar- besarnya kepada Prof. Dr. Ir. I Made Sudana, M.S selaku ketua Laboratorium Penyakit Tumbuhan Fakultas Pertanian Universitas Udayana atas kesempatan untuk belajar dan kemudahan dalam penggunaan fasilitas Laboratorium Penyakit Tumbuhan Fakultas Pertanian Universitas Udayana, selama penulis melakukan penelitian, serta penulis juga mengucapkan terima kasih yang sebesar-besarmya kepada Dr. Ir. Gede Suastika, M.Sc selaku Dosen serta staf di Institut Pertanian Bogor atas kerjasama dan kesempatan untuk belajar dan kemudahan dalam penggunaan fasilitas laboratorium di Laboratorium Virologi Tumbuhan, Institut Pertanian Bogor, selama penulis melakukan penelitian. Ucapan terima kasih penulis sampaikan pula kepada para penguji tesis Prof. Dr. Ir. I Made Sudana, M.S,Prof. Dr. Ir. I Gede Rai Maya Temaja, M.P, I Putu Sudiarta, S.P., M.Si., Ph.D yang telah dengan sabar memberikan masukan, saran dan koreksi sehingga tesis ini dapat terwujud menjadi lebih baik. Ucapan terima kasih juga penulis ucapkan pada Dr. G.N Alit Susanta Wirya, S.P., M.Agr, Ir. I Ketut Siadi,M.Si. dan Ir. I Gusti Ngurah Raka, M.S telah banyak membantu penulis selama menempuh pendidikan. Ucapan terima kasih yang tulus penulis sampaikan kepada kedua orang tua tercinta Made Runarta dan I Ketut Sunarti, adikku Made Edi Suryawan, dan Kepala Desa Kerta Payangan Gianyar selaku sepupu saya I Made Gunawan. SP.SH.,M.Par.serta sahabat-sahabat di Kerta, bersama seluruh keluarga yang tidak dapat penulis sebutkan satu per satu atas dukungan, semangat dan do’a selama penulis menyelesaikan pendidikan terutama penyusunan tesis ini. Teman-teman Virologi di Fakultas Pertanian Universitas Udayana: Raga, Tude, Gusde, Veni, Awa, Gun, Mbok Putri, Bli Dewa Oging, serta semua teman-teman yang tidak dapat penulis sebutkan satu persatu atas do’a, kerjasama dan loyalitasnya selama
vi
ini.Semoga Ida Sang Hyang Widhi Wasa selalu melimpahkan rahmat-Nya kepada semua pihak yang telah membantu pelaksanaan dan penyelesaian tesis ini.Semoga tesis ini dapat memberikan sumbangan bagi pengembangan ilmu pengetahuan dan bermanfaat bagi semua.
Denpasar, 12 Juli 2016
Penulis
vii
ABSTRAK IDENTIFIKASI SPESIES POTYVIRUS YANG BERASOSIASI DENGAN PENYAKIT MOSAIK PADA TANAMAN KACANG PANJANG(Vigna sinensis L.) BERDASARKAN SEKUEN NUKLEOTIDA Survei yang dilakukan pada beberapa area penanaman kacang panjang di Bali menemukan kejadian penyakit mosaik yang cukup tinggi. Gejala penyakit dicirikan dengan mosaik vein banding, terjadi perubahan warna pada daun, mosaik hijau dan hijau muda kekuningan menyebar pada helaian daun, namun jaringan sepanjang tulang daun masih tetap berwarna hijau normal (vein banding). Untuk mengetahui virus penyebab penyakit mosaik ini, telah dilakukan sampling terhadap tanaman sakit kemudian dilakukan identifikasi secara molekuler. RNA total diekstraksi dari daun bergejala menggunakan RNA Extraction Kit. Complementary (c) DNA disintesis melalui reaksi reverse transcription (RT) menggunakan total RNA sebagai cetakan dan primer Oligo-dT.Polymerase chain reaction (PCR) dilakukan menggunakan cDNA dan pasangan primer MJ1 dan MJ2 yang dapat mengamplifikasi sebagian gen coat protein (CP) semua anggota Potyvirus. Terlihat pada gel agarose, setelah dielektroporesis, satu pita DNA berukuran sekitar 327 bp, yang sesuai dengan yang diharapkan. Hasil ini mengindikasikan bahwa salah satu Potyvirus berasosiasi dengan penyakit mosaik pada tanaman kacang panjang di Bali.Produk RT-PCR berhasil disekuen dengan pembacaan dari kedua arah primer forward dan reverse. Analisis menggunakan BLAST yang dilakukan terhadap sekuen nukleotida mendapatkan bahwa isolat virus ini merupakan Bean common mosaic virus (BCMV) karena mempunyai homologi yang sangat tinggi (90 – 92%) dengan isolat BCMV asal negara lain yang telah dilaporkan di GenBank. Analisis pohon filogeni memperlihatkan bahwa BMCV asal Bali mempunyai hubungan kekerabatan yang sangat dekat dengan BCMV asal China. Kata kunci :Bean common mosaic virus (BCMV), potyvirus,kacang panjang.
viii
ABSTRACT IDENTIFICATION OF APOTYVIRUS SPECIES ASSOCIATED WITH MOSAIC DISEASE ON YARD LONG BEAN (Vigna sinensis L.)BASED ON NUCLEOTIDE SEQUENCE Surveys conducted on several areas cultivating yard long bean (Vigna sinensisL.) in Bali found high incidence of mosaic disease. The disease symptoms were characterized by mosaic vein banding:green and yellowish green mosaic on the leaves but the tissues along the veins were still normal green. To know the causal virus, some diseased plants were collected and then were molecularly identified. Total RNAs were extracted from the symptom showing leaves using RNA Extraction Kit. Complementary (c) DNAs were syntized using total RNA as template and Oligo dT primer in reverse transcription (RT) reaction. Polymerase chain reaction (PCR) were conducted using cDNA as template and primer pairs of MJ1 and MJ2 that would be used to amplified a part of coat protein (CP) gene of all members of Potyvirus. It is found on agarose gel, after electrophoresed,one band of approximatly 327 bp DNA that accordant with the expected one. This result indicated that a Potyvirus was associated with mosaic disease on yard long bean in Bali. The RT-PCR products were successfully sequenced by reading from both direction of forward and riverse primers. BLASTanalyses of the nucleotide sequences reveal that the virus isolate was Bean common mosaic virus (BCMV) according to high homology of the sequence with BMCV isolates from other country that were reported in GenBank. Phologenetic tree analyses reveal that BCMV from Bali having close relationship with that of from China. Keywords: Bean common mosaic virus (BCMV), potyvirus, yard long bean.
ix
RINGKASAN Kacang panjang (Vigna sinensis L.) merupakan tanaman hortikultura jenis kacang-kacangan yang dibudidayakan secara luas di Indonesia.Namun akhir-akhir ini terjadi gangguan penyakit yang mempengaruhi hasil panen kacang panjang.Penyakit penting pada kacang panjang sebagain besar disebabkan oleh infeksi virus golongan Potyvirus.Gejala yang disebabkan oleh Potyviruspada kacang panjang di lapangan sangatlah bervariasi karena gejala yang muncul pada tanaman dipengaruhi oleh inang, strain virus, waktu infeksi dan kondisi lingkungan. Survei pada bulan Desember tahun 2015 yang dilakukan di beberapa sentra pertanaman kacang panjang di daerah Bali, menunjukkan adanya insiden penyakit mosaik pada tanaman kacang panjang dengan gejala mosaik vein banding. Insiden penyakit mosaik vein banding pada tanaman kacang panjang merupakan kejadian penyakit baru di daerah Bali.Maka dari itu asal dari virus yang berasosiasi dengan penyakit tersebut perlu dikaji lebih lanjut sehingga dapat dilakukan pencegahan.Selain itu, masuknya virus ke daerah Bali hanya dapat terjadi melalui bibit kacang panjang terinfeksi virus.Untuk mengkaji masalah tersebut penelitian yang dilakukan adalah untuk mencari keragaman genetik Potyvirus berdasarkan perunutan basa.Berkaitan dengan hal tersebut, perlu dilakukan penelitian untuk dapat mengidentifikasi spesies Potyvirus pada tanaman kacang panjang di Bali. Keragaman genetik Potyvirusdi Indonesia berdasarkan perunutan basa nukleotida belum banyak dilaporkan. Informasi yang lebih mendalam mengenai urutan DNA dari Potyvirus yang ada di Indonesia untuk menunjukkan adanya keragaman genetik diantara Potyvirus belum pernah dilakukan. Penelitian ini dilakukan di sentra penanaman kacang panjang di Bali. Proses identifikasi virus dilakukan menggunakan metode molekuler yaitu RTPCR. Hasil PCR tersebut kemudian divisualisasikan melaui metode electrophoresis.Jika hasil PCR tersebut posistif kemudian dilanjutkan dengan Analisa sekuen nukleotida. Data sekuen nukeotida yang terpilih kemudian dimodifikasi dan dianalisis spesifisitas nukleotidanya dengan program multiple alignment, ClustalW dengan MEGA 6.0. Pohon filogenetika dikonstruksi menggunakan program PAUP 4.9, j Model Test berdasarkan pendekatan Maximum Parsimony. Berdasarkan hasil analisis sekuen tersebut, maka didapatkan spesies virus yang menginfeksi tanaman kacang panjang sehingga dapat digunakan sebagai acuan untuk tindakan pencegahan maupun pengendalian penyebaran virus selanjutnya. Hasil pengamatan pada beberapa sentra pertanaman kacang panjang di Bali, tanaman kacang panjang yang diduga terinfeksi Potyvirus menunjukkan gejala belang hijau dan kuning pada helaian daun dan mengalami penebalan tulang daun (vein banding). Hasil elektroforesis menunjukkan bahwa tanaman kacang panjang yang diuji positif terinfeksi oleh Potyvirus.Hal ini berdasarkan hasil dari elektroforesis dari hasil RT-PCR, dimana pita DNA dengan ukuran sekitar 327 bp sesuai dengan primer yang digunakan.Hasil ini memberikan informasi awal, bahwa gejala mosaik yang muncul dilapangan memang benar
x
diinfeksi oleh virus dari golongan Potyvirus. Untuk memastikan spesies Potyvirus yang menginfeksi tanaman kacang panjang maka dilakukanlah sekuen nukleotida pita DNA hasil PCR tersebut. Pengujian tingkat homologi antar isolat menunjukan bahwa isolat PotyvirusBali mempunyai kesamaan sebesar 92 % dengan isolat Potyvirusyang berasal dari Negara-negara lain yaitu Cina, Meksiko, Amerika, Jerman, Korea Australia, Vietnam dan Turky. Hasil penyejajaran sekuen dengan ClustalW mendapatkan hasil, isolat Potyvirus Bali memiliki homologi yang tinggi dengan isolate Potyvirusyang berasal dari Asia timur, Asia Tenggara, Benua Amerika, dan Benua Eropa, dengan tingkat nilai homologi berkisar antara 90-92%. Sedangkan isolate Bali memiliki tingkat homologi yang paling tinggi dengan isolate Potyvirus yang berasal dari Cina. Jarak genetik menunjukan dekat atau tidaknya hubungan kekerabatan antara sekuen nukleotida yang diamati. Isolat Potyvirus Bali dengan memiliki nilai jarak genetik yang paling rendah rendah dengan isolat BCMV Cina yaitu sebesar 0,030. Rendahnya nilai jarak genetik antara Potyvirus isolat Bali dengan isolate BCMV Cina ini menunjukan bahwa tingkat kesamaan gen antara kedua isolat tersebut sangat tinggi. Hasil analisis filogenetika menggunakan pendekatan Maximum parsimony membagi isolat-isolat dalam beberapa kelompok percabangan.Isolat Potyvirus Bali terletak dalam satu clade dengan isolat BCMV yang berasal dari Cina dengan dukngan nilai bootstrap sebesar 79,5%. Berdasarkan hasil tersebut dapat disimpulkan bahwa isolatPotyvirus Bali, merupakan spesies Bean common mosaic virus. Berdasarkan hasil penelitian dapat disimpulkan bahwa Gejala penyakit mosaik pada tanaman kacang panjang di beberapa sentra pertanaman kacang panjang di Bali berasosiasi dengan infeksi virus dari genus Potyvirus.Spesies Potyvirusyang menginfeksi kacang panjang di Bali adalah Bean Common Mosaic Virus. Isolat Bean common mosaic virus Bali memiliki tingkat similiritas 92%, dengan jarak genetik yang rendah (0,030), dan dalam pohon filogeni berada dalam satu clade dengan isolat Bean common mosaic virus yang berasal dari Cina.
xi
DAFTAR ISI Halaman SAMPUL DALAM ..........................................................................................
i
PRASYARAT GELAR ....................................................................................
ii
LEMBAR PENGESAHAN ..............................................................................
iii
PENETAPAN PANITIA PENGUJI ................................................................
iv
SURAT PERNYATAAN BEBAS PLAGIAT .................................................
v
UCAPAN TERIMAKASIH .............................................................................
vi
ABSTRAK ........................................................................................................ viii ABSTRACT .....................................................................................................
ix
RINGKASAN ...................................................................................................
x
DAFTAR ISI ....................................................................................................
xii
DAFTAR TABEL ............................................................................................ xiii DAFTAR GAMBAR ........................................................................................ xvii DAFTAR LAMPIRAN ................................................................................... xviii BAB
I
PENDAHULUAN ....................................................................
1
1.1
Latar Belakang ..........................................................................
1
1.2
Rumusan Masalah ....................................................................
3
1.3
Tujuan Penelitian .....................................................................
3
1.4
Manfaat Penelitian ...................................................................
4
KAJIAN PUSTAKA ...............................................................
5
2.1
Klasifikasi dan Budidaya Tanaman Kacang Panjang ...............
5
2.2
Penyakit Virus pada Kacang Panjang .......................................
8
2.3
Potyvirus ...................................................................................
8
BAB II
xii
2.4
Karakter Molekuler Potyvirus ..................................................
9
2.5
Identifikasi Potyvirus ................................................................
12
2.6
Analisis Filogenetika ................................................................
14
2.6.1 Sequence Alignment .........................................................
15
2.6.2 Rekontruksi Pohon Filogenetika......................................
16
2.6.2.1 Distance method ...................................................
16
2.6.2.2 Maximum likelihood dan bayessian inference ......
17
2.6.2.3 Maximum parsimony ............................................
17
2.6.3.4 Evaluasi pohon filogenetika..................................
18
III
KERANGKA BERPIKIR, KONSEP DAN HIPOTESIS ......
20
3.1
Kerangka Berpikir.....................................................................
20
3.2
Konsep Penelitian .....................................................................
21
3.3
Hipotesis ...................................................................................
22
BAB IV
METODE PENELITIAN .........................................................
23
4.1
Tempat dan Waktu Penelitian ..................................................
23
4.2
Bahan dan Alat .........................................................................
23
4.3
Pelaksanaan Penelitian..............................................................
23
4.3.1Pengumpulan Sampel Tanaman Kacang Panjang ............
23
4.3.2Deteksi Virus melalui RT-PCR ........................................
24
4.3.2.1 Ekstrasi Total RNA.......................................................
24
4.3.2.2 Sintesis Complementary (c) DNA ................................
25
4.3.2.3 Amplifikasi Complementary (c) DNA………….
26
4.3.2.4 Visualisasi Hasil RT-PCR ....................................
27
4.3.3 Sekuen Nukleotida dan Analisis Filogenetika .................
28
V
HASIL DAN PEMBAHASAN ...............................................
29
5.1
Gejala Infeksi Potyviruspada Tanaman
BAB
BAB
5.2
Kacang Panjang ........................................................................
29
Deteksi Potyvirus melalui RT-PCR ..........................................
31
i
5.3
Analisis Hubungan Kekerabatan Antara Isolat-Isolat ..............
33
VI
SIMPULAN DAN SARAN .....................................................
38
6.1
Simpulan ...................................................................................
38
6.2
Saran .........................................................................................
38
DAFTAR PUSTAKA ......................................................................................
39
LAMPIRAN …………………………………………………………………
43
BAB
xiv
DAFTAR TABEL
Halaman 2.1
5.1
5.2
Fungsi beberapa protein yang terdapat dala struktur Genom Potyvirus.......................................................
10
HomologiPotyvirus yang menginfeksi tanaman kacang panjang di Bali dengan sekuen homolognya yang ada diGenBank.................................................
34
Jarak genetik Potyvirus yang menginfeksi tanaman Kacang panjang di Bali dengan sekuen homolognya yang ada di GenBank ................................................
35
i xv
DAFTAR GAMBAR Halaman 2.1
Organisasi genom potyvirus..................................
11
3.1
Kerangka konsep penelitian.................................
21
5.1
Variasi gejala infeksi Potyvirus pada kacang panjang (A) Mosaik; (B) Mosaik melepuh (permukaan daun kasar);(C) Mosaik Vin Banding; (D) Klorosis; (E) Malformasi perubahan bentuk daun.........................................
29
Hasil amplifikasi DNA gen CP dengan metode RT-PCR, menggunakan primer MJ1 dan MJ2, dengan produk PCR ~327 bp................................
32
Hubungan kekerabatan 16 isolat virus hasil analisis kelompok berdasarkan pola pita DNA dengan metode Maximum Parsimony. Angka pada cabang merupakan persentase tingkat kepercayaaan.........................................................
36
5.2
5.3
xvi i
DAFTAR LAMPIRAN Halaman Penyejajaran urutan nukleotida fragmen DNA isolat Bean Common Mosaic Virus Bali dengan isolat Bean Common Mosaic Virus lainnya yang terdapat Di GenBank. Tanda * (bintang) menunjukkan basa Nukleotida yang identik.........
xvii
43
