IDENTIFIKASI BEGOMOVIRUS INDONESIA PADA TOMAT DAN ANALISIS DIVERSITAS GENETIK GEN AV1 SERTA PEMANFAATANNYA UNTUK PENGEMBANGAN TANAMAN TAHAN VIRUS
TRI JOKO SANTOSO
`
SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2008
PERNYATAAN MENGENAI DISERTASI DAN SUMBER INFORMASI Dengan ini saya menyatakan bahwa Identifikasi Begomovirus
Indonesia Pada Tomat Dan Analisis Diversitas Genetik Gen AV1 serta Pemanfaatannya Untuk Pengembangan Tanaman Tahan Virus adalah karya saya dengan arahan komisi pembimbing dan belum pernah diajukan dalam bentuk apapun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir disertasi ini.
Bogor,
November 2008
Tri Joko Santoso NRP A361040091
ii
ABSTRACT TRI JOKO SANTOSO. Identification of Indonesian Begomoviruses in Tomato and Genetic Diversity Analysis of AV1 Gene as well Its Use for Developing Virus Resistant Plant. Under directions of SUDARSONO, HAJRIAL ASWIDINNOOR, SRI HENDRASTUTI HIDAYAT, and MUHAMMAD HERMAN. Tomato (Lycopersicon esculentum, Mill) is one of the most important vegetables in Indonesia, both economically and nutritionally. Production, however, is severely hampered by a leaf curl disease caused by Tomato (yellow) leaf curl virus (TYLCV/ToLCV), one of members of the genus Begomovirus, the family Geminiviridae. Recently, there is no effectively way to control this disease. The use of resistant tomato plants is undoubtedly the best way to control Begomovirus. Genetic engineering technologies give the opportunity to develop transgenic tomatoes resistant to Begomovirus through pathogen derived resistance (PDR) approach. Begomovirus AV1 gene is a gene expressing coat protein which responsible for particle encapsidation and have a role in specivicity determinant of virus transmission and symptom developmment. The objectives of this research were (1) to detect Begomoviruses infecting tomato in several of tomato production areas of East Java, Central Java, Special Province of Jogjakarta and West Java by using PCR technique. (2) to analyze genetic diversity of Begomovirus isolates infecting tomato based on the PCR-RFLP technique, (3) to identify and analyze the genetic diversity of Begomovirus isolates infecting tomato based on nucleic acid and amino acid of AV1 gene, (4) to construct the AV1 gene of Begomovirus into pBI121 expression vector plasmid and generate tobacco transformants through A. tumefaciens-mediated transformation with AV1 gene cassette, (5) to obtain transgenic tobacco plants carrying AV1 gene and resistant to Begomovirus, (6) to generate tomato lines carrying resistance against Begomovirus (TYLCV) combined with resistance to CMV through conventional breeding program. The results of this research showed that the symptomed plants collected from several tomato production areas of East Java, Central Java, Special Province of Jogjakarta and West Java indicated that those plants have been infected by Begomovirus following PCR detection using a pair of degenerate primers. Phylogenetic analysis based on the PCR-RFLP technique showed that the eight Begomovirus isolates were divided into three different groups. Meanwhile, identity of nucleic and amino acid of AV1 gene among Begomoviruses indicated that the isolates determined in this research were Indonesian isolates of AYVV and phylogenetic analysis of the eight Begomovirus isolates based on the nucleotide and predicted amino acid sequence analysis of AV1 gene indicated they belonged into two different clades. In the experiments of genetic transformation, results of the experiments showed that (i) Indonesian Begomovirus AV1 gene was successfully amplified and inserted in pBI121 expression vector plasmid, (ii) tobacco transformants carrying kanamycin-resistant gene (nptII gene) were regenerated and established in glasshouse, (iii) there was a positive correlation between the presence of the AV1 gene in T0 generation putative transgenic tobacco plants and the resistant phenotype to Begomovirus, (iv) transgenic plants with a single copy integration of the transgene exhibited more resistant than the multiple copy one and non transgenic plant. The resistance phenotype of AV1 gene expression was indicated with no symptom in T0 generation putative
iii
transgenic tobacco plants and the accumulation of the virus in the transgenic plants tissue. Result of conventional breeding showed that F1-doublecross plants (crossing between F1-TYLCV and F1-CMV plants) revealed a resistant phenotype indicating integration of both two resistance genes in one plant has been occured following effication and PCR analysis. The resistant-doublecross F1 plants then were selected for the horticultural traits and subjected to performing the advanced breeding for developing Indonesian multiple virus resistance tomatoes. Keywords : Begomovirus, genetic diversity, PCR-RFLP technique, TYLCV, AV1 gene, genetic transformation, Nicotiana tabaccum, transgenic plant
iv
RINGKASAN TRI JOKO SANTOSO. Identifikasi Begomovirus Indonesia Pada Tomat dan Analisis Diversitas Genetik Gen AV1 serta Pemanfaatannya Untuk Pengembangan Tanaman Tahan Virus. Dibimbing oleh SUDARSONO, HAJRIAL ASWIDINNOOR, SRI HENDRASTUTI HIDAYAT, dan MUHAMMAD HERMAN. Tomat (Lycopersicon esculentum, Mill) merupakan salah satu tanaman sayuran yang penting di Indonesia, baik secara ekonomi atau kandungan nutrisinya. Produksi tomat sangat dipengaruhi oleh penyakit keriting daun yang disebabkan oleh Tomato (yellow) leaf curl virus (TYLCV/ToLCV), salah satu anggota dari genus Begomovirus, famili Geminiviridae. Pada saat ini, belum ada cara yang secara efektif mengendalikan penyakit ini. Penggunaan tanaman tomat tahan merupakan cara yang terbaik untuk mengendalikan Begomovirus. Teknik rekayasa genetik memberikan peluang untuk mengembangkan tomat transgenik tahan terhadap Begomovirus melalui pendekatan ketahanan yang berasal dari patogen (PDR). Gen AV1 dari Begomovirus merupakan gen yang mengekspresikan protein selubung yaitu suatu protein yang bertanggung jawab dalam enkapsidasi partikel virus dan berperan di dalam penentuan spesifisitas penularan virus dan perkembangan gejala. Tujuan penelitian ini adalah (1) untuk mendeteksi Begomovirus yang menginfeksi tanaman tomat pada beberapa daerah area produksi tomat di Jawa Timur, Jawa Tengah, Daerah Istimewa Jogjakarta dan Jawa Barat menggunakan teknik PCR, (2) mempelajari keragaman genetik isolatisolat Begomovirus yang menginfeksi tomat dari beberapa area produksi di Indonesia berdasarkan teknik PCR-RFLP, (3) mengidentifikasi dan menganalisis diversitas Begomovirus yang berasosiasi dengan penyakit keriting daun pada tomat berdasarkan sekuen asam nukleat dan asam amino prediksi dari gen AV1, (4) untuk mendapatkan konstruksi gen AV1 pada vektor ekspresi dan transforman tembakau hasil transformasi genetik dengan gen AV1 menggunakan vektor bakteri A. tumefaciens, (5) untuk mendapatkan tanaman tembakau transgenik yang membawa gen AV1 dan tahan terhadap Begomovirus, (6) untuk mendapatkan galur-galur tanaman tomat yang tahan terhadap Begomovirus (TYLCV) yang dikombinasikan dengan ketahanan terhadap CMV. Deteksi Begomovirus dilakukan dengan mengamplifikasi genom Begomovirus dengan teknik PCR menggunakan sepasang primer degenerate yang universal (top primer) untuk Begomovirus yaitu primer PAL1v1978-F dan PAR1c715-R. Hasil percobaan menunjukkan bahwa sampel-sampel tanaman tomat sakit yang dikoleksi dari beberapa daerah di Jawa Timur, Jawa Tengah, Daerah Istimewa Jogjakarta dan Jawa Barat mengindikasikan adanya infeksi oleh Begomovirus setelah dideteksi menggunakan teknik PCR dengan primer universal. Infeksi Begomovirus ditunjukkan oleh adanya pita DNA hasil amplifikasi PCR yang berukuran 1500 bp. Frekuensi kejadian penyakit yang berasosiasi dengan Begomovirus bervariasi antara 0-100%. Frekuensi kejadian penyakit tertinggi (100%) terjadi di daerah Cibitung (Bogor) dan terendah (0%) terjadi di Pagerwangi (Lembang). Fragmen DNA berukuran 1500 bp produk amplifikasi PCR menggunakan
v
primer universal untuk Begomovirus dipotong dengan menggunakan empat macam enzim restriksi, yaitu DraI, EcoRI, RsaI dan PstI untuk melihat keragaman genetiknya. Pola pemotongan dengan enzim restriksi dari delapan isolat Begomovirus dan fragmen RFLP prediksi isolat Begomovirus dari DNA database GenBank digunakan untuk menentukan identitas genetik dan keragaman di antara isolat-isolat Begomovirus tersebut. Produk amplifikasi PCR yang dipotong dengan empat macam enzim restriksi mengindikasikan bahwa ada polimorfisme dari fragmen-fragmen DNA di antara 8 isolat Begomovirus yang berasal dari daerah-daerah di Jawa dan Sumatera tersebut. Analisis filogenetik menunjukkan bahwa isolat-isolat Begomovirus terbagi menjadi 3 kelompok yang berbeda. Isolat-isolat Brastagi, Bogor, Sragen, Ketep dan Boyolali berkerabat dekat dengan Tomato Leaf Curl Virus-Java (ToLCV-Java) atau ToLCV-Java (A), isolat Malang dan Blitar berkerabat dekat dengan Ageratum Yellow Vein VirusChina (AYVV-China), sedangkan isolat Kaliurang berkerabat dengan Tomato Yellow Leaf Curl Virus-China (TYLCV-China) atau ToLCV-Laos. Amplifikasi PCR menggunakan asam nukleat total dan primer spesifik untuk gen AV1 Begomovirus, sekuensing secara langsung dari produk PCR, dan analisis sekuen asam nukleotida dan asam amino menggunakan BLAST telah dilakukan. Hasil dari percobaan adalah (i) adanya pita DNA hasil amplifikasi PCR membuktikan bahwa sampel-sampel tomat yang sakit terinfeksi oleh Begomovirus (ii) hasil analisis BLAST menggunakan sekuen nukelotida dan asam amino menunjukkan bahwa fragmen DNA hasil amplifikasi PCR adalah gen AV1 dari Begomovirus, (iii) identitas asam nukleat dan asam amino dari gen AV1 di antara isolat-isolat Begomovirus mengindikasikan bahwa isolat-isolat tersebut adalah isolat Ageratum yellow vein virus (AYVV) Indonesia, dan (iv) hasil analisis filogenetik mengindikasikan bahwa delapan isolat Begomovirus tersebut terbagi menjadi dua kelompok yang berbeda. Serangkaian tahapan untuk konstruksi gen AV1 Begomovirus juga telah dilakukan diantaranya adalah amplifikasi gen AV1 menggunakan primer spesifik, transformasi ke bakteri E. coli DH5α dan kloning gen tersebut ke vektor ekspresi pBI121. Transformasi genetik dilakukan dengan cara eksplan potongan daun tanaman tembakau yang ditumbuhkan secara in vitro ditransformasi melalui kokultivasi dengan A. tumefaciens yang mengandung konstruksi gen AV1. Hasil percobaan menunjukan bahwa gen AV1-Begomovirus berhasil diamplifikasi dan disisipkan ke dalam vektor ekspresi pBI121. Tanaman-tanaman tembakau hasil transformasi genetik dengan gen AV1 telah dihasilkan dan diaklimatisasi di rumah kaca dan diketahui telah membawa gen ketahanan terhadap kanamisin (gen nptII) dan gen AV1. Analisis molekuler dan uji keefektifan gen AV1 pada tanaman-tanaman tembakau transgenik putatif generasi T0 untuk mendapatkan ketahanan terhadap Begomovirus menunjukkan bahwa terdapat korelasi yang positif antara keberadaan atau integrasi gen AV1 Begomovirus pada tanaman tembakau transgenik dengan fenotipe ketahanan terhadap infeksi virus. Integrasi gen AV1 yang bersifat kopi tunggal lebih tahan terhadap infeksi virus dibandingkan integrasi gen yang multi-kopi. Ketahanan yang diperoleh dari ekspresi gen AV1 Begomovirus diindikasikan dengan tidak adanya gejala dan akumulasi virus pada jaringan tanaman. Analisis hibridisasi Northern atau Western perlu dilakukan untuk mengetahui ada tidaknya akumulasi mRNA atau protein, sehingga
vi
mekanisme ketahanan yang terjadi dapat dijelaskan lebih detail. Pemuliaan konvensional dilakukan untuk mendapatkan galur-galur tomat yang tahan TYLCV (Begomovirus) yang dikombinasikan dengan ketahanan terhadap CMV. Materi tanaman yang digunakan dalam percobaan adalah tanaman generasi F1-TYLCV (hasil persilangan galur tahan dan rentan TYLCV) dan tanaman generasi F1-CMV (hasil persilangan galur rentan dan galur transgenik tahan CMV). Hasil percobaan menunjukkan bahwa bioasai tanaman-tanaman F1doublecross (F1DC-Intan/R8-110-11//FLA456/Intan dan F1DC-CL6046/R8-11011//FLA456/CL6046) dengan TYLCV diperoleh masing-masing 10 dan 9 tanaman yang menunjukkan fenotipe tahan. Hal ini mengindikasikan bahwa tanaman-tanaman F1-kombinasi tersebut telah membawa gen ketahanan terhadap TYLCV. Deteksi gen CP-CMV dengan teknik PCR mengindikasikan bahwa gen tersebut juga telah terbawa pada tanaman-tanaman F1-DC. Dengan demikian, pada penelitian ini telah diperoleh tanaman-tanaman F1-doublecross/F1-DC (hasil persilangan antara F1-TYLCV tahan dan F1-CMV tahan) yang memperlihatkan fenotipe yang tahan terhadap TYLCV dan membawa gen ketahanan terhadap CMV. Tanaman-tanaman F1-DC ini akan dijadikan sebagai materi untuk pengembangan varietas tomat tahan TYLCV dan CMV selanjutnya. Kata kunci: Tomat (Lycopersicon esculentum, Mill), Begomovirus, teknik PCRRFLP, gen AV1, TYLCV, keragaman genetik, transformasi genetik, tembakau (Nicotiana tabaccum), tanaman transgenik
vii
© Hak Cipta milik IPB, tahun 2008 Hak Cipta dilindungi Undang-Undang Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan, penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan yang wajar IPB. Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh Karya tulis dalam bentuk apapun tanpa izin IPB
viii
IDENTIFIKASI BEGOMOVIRUS INDONESIA PADA TOMAT DAN ANALISIS DIVERSITAS GENETIK GEN AV1 SERTA PEMANFAATANNYA UNTUK PENGEMBANGAN TANAMAN TAHAN VIRUS
TRI JOKO SANTOSO
Disertasi sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Doktor pada Program Studi Agronomi
SEKOLAH PASCA SARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2008
ix
x
Penguji pada Ujian Tertutup : Dr. Ir. Endang Nurhayati, MS
Penguji pada Ujian Terbuka : Dr. Ir. Agus Purwito, MSc.Agr Dr. Ir. Ati Srie Duriat, APU (Profesor riset)
xi
PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan pada Allah SWT atas segala karuniaNya sehingga karya ilmiah ini dapat diselesaikan. Disertasi ini berjudul “Identifikasi Begomovirus Indonesia Pada Tomat dan Analisis Diversitas Genetik Gen AV1 serta Pemanfaatannya Untuk Pengembangan Tanaman Tahan Virus”. Disertasi ini memuat dua bab yang merupakan pengembangan dari naskah artikel yang diajukan ke jurnal ilmiah. Bab 4 berjudul “Identitas dan keragaman genetik Begomovirus yang berasosiasi dengan penyakit keriting pada tomat berdasarkan teknik PCR-RFLP” telah diterbitkan (AgroBiogen 4[1]: 9-7. April 2008). Bab 5 berjudul “Identity and sequence diversity of Begomovirus associated with yellow leaf curl disease of tomato in Indonesia” juga telah diterbitkan (Microbiology Indonesia 2[1]: 1-7. April 2008). Pada kesempatan ini, penulis menyampaikan terima kasih yang sebesarbesarnya kepada Prof Dr Ir Sudarsono MSc selaku ketua komisi pembimbing, Dr Ir Hajrial Aswidinnoor MSc, Dr Ir Sri Hendrastuti Hidayat MSc dan Dr Muhammad Herman selaku anggota komisi pembimbing yang telah banyak membimbing dan mengarahkan penulis selama menjalani pendidikan dan penelitian di Sekolah Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor. Terima kasih juga disampaikan kepada Dr Ir Endang Nurhayati MS, Dr Ir Agus Purwito MSc dan Dr Ir Ati Srie Duriat, APU (Profesor Riset) selaku dosen penguji luar komisi pada ujian tertutup dan terbuka yang telah banyak memberi masukan dan saran. Di samping itu, penulis juga menyampaikan terima kasih yang tidak terkira kepada Kepala Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Bioteknologi dan Sumberdaya Genetik Pertanian dan Sekretaris Badan Litbang Pertanian atas ijin dan kesempatan yang diberikan kepada penulis untuk melanjutkan studi di Sekolah Pasca Sarjana, IPB. Demikian juga kepada pimpinan proyek USAID-ABSP II dan PTAAP II Badan Litbang Pertanian beserta staf yang telah membiayai sekolah ini. Penulis juga menyampaikan terima kasih kepada Rektor IPB dan Ketua Program Studi Agronomi yang telah menerima penulis untuk menjadi mahasiawa program doktor dan atas bimbingan serta dorongan yang telah diberikan selama penulis menjalani masa studi. Penulis juga mengungkapkan terima kasih yang setulus-tulusnya kepada Bapak dan Ibu, Bapak dan Ibu mertua serta seluruh keluarga atas segala lantunan doa, jerih payah dan kasih sayangnya sehingga penulis mempunyai motivasi untuk menyelesaikan studi dan penelitian. Ungkapan terima kasih juga disampaikan untuk istri tercinta dan anak-anak tersayang atas kesabaran dan ketabahan dalam mendampingi, memberi motivasi dan inspirasi selama penulis menempuh studi. Penulis juga menyampaikan terima kasih kepada rekan-rekan staf peneliti serta para teknisi yang tergabung dalam tim penelitian transformasi padi di Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Bioteknologi dan Sumberdaya Genetik Pertanian. Ucapan terima kasih juga penulis sampaikan kepada semua pihak yang tidak bisa penulis sebutkan satu per satu yang telah memberi dukungan moril dan membantu dalam pelaksanaan penelitian. Penulis menyadari bahwa di dalam penyusunan tulisan ini masih banyak kekurangan dan kelemahan. Maka dari itu, penulis sangat berharap adanya kritik dan saran dari pembaca demi sempurnanya tulisan ini. Semoga tulian karya ilmiah
xii
ini dapat bermanfaat di kemudian hari. Amien.
Bogor, November 2008
Tri Joko Santoso
xiii
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Klaten, Jawa Tengah, pada tanggal 19 Mei 1972 dari pasangan Bapak Ngadimin Hadi Sumarto dan Ibu Sri Natun sebagai anak kedua dari lima bersaudara. Pada tahun 2005 menikah dengan Atmitri Sisharmini MSi dan dikaruniai dua orang anak putri dan putra, Aulia Izzati Putri (2,5 tahun) dan Rais Arkan Nugraha (6 bulan). Pada tahun 1984 penulis menyelesaikan pendidikan SD di SDN II Meger, Ceper, Klaten kemudian melanjutkan ke SMPN I Ceper dan lulus pada tahun 1987. Pada tahun 1990 lulus dari SMAN I Klaten. Penulis memperoleh gelar Sarjana Pertanian dari Fakultas Pertanian, Universitas Gadjah Mada di Yogyakarta pada tahun 1995. Pada tahun 2004 memperoleh gelar Magister Sains dari Program Studi Bioteknologi, Sekolah Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor melalui beasiswa pendidikan dan dana penelitian dari proyek ARMP II, Badan Litbang Pertanian, Departemen Pertanian. Pada tahun 2004 melanjutkan studi program Doktor (S3) dengan biaya dari proyek USAID-ABSP II dan PTAAP (Departemen Pertanian) pada program Studi Agronomi Institut Pertanian Bogor. Penulis saat ini bekerja sebagai staf peneliti di Kelompok Peneliti Biologi Molekuler, Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Bioteknologi dan Sumberdaya Genetik Pertanian (BB BIOGEN) Bogor, sejak tahun 1996 sampai sekarang.
xiv
DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL …………………………………………………......... xviii DAFTAR GAMBAR ................................................................................ xx DAFTAR LAMPIRAN ............................................................................. xxiii I.
PENDAHULUAN Latar Belakang ............................................................................... 1 Tujuan Penelitian ......................................................................... 6 Strategi dan Alur Penelitian .......................................................... 6
II.
TINJAUAN PUSTAKA Famili Geminiviridae ..................................................................... Karakterisasi molekuler dari Begomovirus ...................................... Keragaman genetik dari Begomovirus .......................................... Teknik deteksi dan identifikasi Begomovirus ................. .............. Pemuliaan konvensional untuk ketahanan terhadap Begomovirus .. Rekayasa genetik untuk ketahanan terhadap Begomovirus ............
9 12 14 15 17 18
III. DETEKSI BEGOMOVIRUS YANG MENGINFEKSI TOMAT MENGGUNAKAN TEKNIK POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR) Abstrak ........................................................................................... 20 Abstract ........................................................................................... 21 Pendahuluan .................................................................................. 22 Bahan dan Metode .......................................................................... 23 Hasil ............................................................................................... 26 Pembahasan ..................................................................................... 29 Simpulan ......................................................................................... 33 Daftar Pustaka ................................................................................ 34
IV. IDENTITAS DAN KERAGAMAN GENETIK BEGOMOVIRUS YANG BERASOSIASI DENGAN PENYAKIT KERITING PADA TOMAT BERDASARKAN TEKNIK PCR-RFLP Abstrak ........................................................................................... Abstract .......................................................................................... Pendahuluan .................................................................................. Bahan dan Metode ......................................................................... Hasil ............................................................................................... Pembahasan .. ................................................................................. Simpulan ........................................................................................ Daftar Pustaka ................................................................................
36 37 38 39 43 49 51 52
xv
V.
IDENTITY AND SEQUENCE DIVERSITY OF BEGOMOVIRUS ASSOCIATED WITH YELLOW LEAF CURL DISEASE OF TOMATO IN INDONESIA Abstrak ............................................................................................ 54 Abstract ........................................................................................... 55 Introduction ................................................................................... 56 Materials and Method ..................................................................... 57 Results .............................................................................................. 60 Discussions ..................................................................................... 66 Conclusion ....................................................................................... 67 References ....................................................................................... 68
VI. KONSTRUKSI GEN AVI BEGOMOVIRUS PADA VEKTOR EKSPRESI DAN INTRODUKSINYA KE TEMBAKAU MENGGUNAKAN Agrobacterium tumefaciens Abstrak ........................................................................................... Abstract .......................................................................................... Pendahuluan .................................................................................. Bahan dan Metode .......................................................................... Hasil ............................................................................................... Pembahasan .................................................................................... Simpulan ......................................................................................... Daftar Pustaka ................................................................................
70 71 72 74 79 86 88 89
VII. ANALISIS MOLEKULER DAN UJI KEEFEKTIFAN GEN AV1 PADA TANAMAN TEMBAKAU TRANSGENIK UNTUK KETAHAHAN TERHADAP BEGOMOVIRUS Abstrak ............................................................................................ Abstract ........................................................................................... Pendahuluan .................................................................................. Bahan dan Metode .......................................................................... Hasil ............................................................................................... Pembahasan .................................................................................... Simpulan ......................................................................................... Daftar Pustaka .................................................................................
91 92 93 95 97 104 107 107
VIII. PENDEKATAN KONVENSIONAL UNTUK KETAHANAN TOMAT TERHADAP BEGOMOVIRUS YANG DIKOMBINASIKAN DENGAN KETAHANAN TERHADAP CMV Abstrak ........................................................................................... Abstract .......................................................................................... Pendahuluan .................................................................................. Bahan dan Metode ..........................................................................
109 110 111 113
xvi
Hasil ............................................................................................... 119 Pembahasan ..................................................................................... 126 Simpulan ......................................................................................... 130 Daftar Pustaka ................................................................................. 130
IX.
PEMBAHASAN UMUM ................................................................ 133
X.
SIMPULAN UMUM DAN SARAN .............................................. 140
DAFTAR PUSTAKA ................................................................................ 142 LAMPIRAN .............................................................................................. 153
xvii
DAFTAR TABEL
Halaman 1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
Deskripsi gejala dominan pada tanaman tomat sakit yang ditemukan di beberapa lokasi pengambilan sampel .....................
27
Frekuensi kejadian penyakit yang disebabkan oleh infeksi Begomovirus dari beberapa lokasi pengambilan sampel ..............
29
Ukuran fragmen DNA yang dihasilkan dari pemotongan produk PCR dari 8 isolat Begomovirus dan prediksi RFLP isolat-isolat dari DNA database menggunakan enzim restriksi DraI, EcoRI, RsaI dan PstI .......
47
Isolate identity, observed symptoms on collected tomato samples, location of collected samples, and number of determined nucleic acid and predicted amino acid sequences based on the polymerase chain reaction amplified putative AV1 gene ……….………………………...
61
Percentages of sequence identities of AV1 gene among suspected Begomoviruses isolates determined in this research and three Begomoviruses available in the GenBank database ....................
63
Distance matrices (%) based on predicted AV1 gene amino acid sequences of suspected Begomoviruses isolates determined in this research, Ageratum yellow vein virus (AYVV), Soybean crinkle leaf virus (SCLV), Pepper leaf curl virus (PepLCV), Tomato leaf curl virus (ToLCV), and Cassava mosaic virus (CasMV) ........................................
64
Jumlah tunas dan planlet yang dihasilkan serta persentase tunas menjadi planlet pada transformasi genetik tembakau dengan gen AV1 Begomovirus melalui bantuan A. tumefaciens ....................
83
Deteksi PCR gen AV1 dan bioasai tanaman tembakau transgenik putatif generasi T0 dengan Begomovirus di rumah kaca ..................................... Kategori respon tanaman tembakau transgenik putatif setelah dianalisis PCR dan bioasai ..........................................................
100
Hubungan antara analisis PCR, bioasai, jumlah kopi dan keberadaan virus target dalam tanaman transgenik ......................
103
11.
Materi tanaman yang digunakan dalam penelitian .......................
113
12.
Skoring keparahan gejala pada tanaman yang terinfeksi
9.
10.
99
xviii
Begomovirus ......
114
13.
Skoring keparahan gejala pada tanaman yang terserang CMV .....
115
14.
Konfirmasi ketahanan tetua terhadap TYLCV melalui penularan dengan serangga vektor kutu kebul di rumah kaca ......................
119
Skrining beberapa galur tomat terhadap TYLCV melalui penularan dengan serangga vektor kutu kebul di rumah kaca ..................................
120
Skrining beberapa tanaman tomat terhadap CMV menggunakan penularan secara mekanis di rumah kaca .....................................
122
15.
16.
17. 18.
19
Berat benih yang dihasilkan dari masing-masing F1-silang ganda ......... Skrining tomat F1-IC-Intan/R8-110-11//FLA456/Intan (39) terhadap TYLCV melalui penularan dengan serangga vektor kutu kebul di rumah kaca ..................................................................... Skrining tomat F1IC-CL6046/R8-110-11//FLA456/CL6046 (38) terhadap TYLCV melalui penularan dengan serangga vektor kutu kebul di rumah kaca tanaman .......................................................
124
125
125
xix
DAFTAR GAMBAR Halaman 1.
Diagram alur strategi penelitian dan keterkaitan antar percobaan dari selutruh kegiatan penelitian ........................................................
8
Taksonomi dari famili Geminiviridae: tipe spesies, organisasi genom, tanaman inang dan vektor serangganya. ...............................
9
Organisasi genom masing-masing genus dari famili Geminiviridae dan serangga vektor utamanya ..........................................................
11
Morfologi gejala pada tanaman tomat yang diduga terinfeksi oleh Begomovirus yang ditemukan di lapang ...........................................
26
Elektroforesis gel dari fragmen DNA hasil optimasi teknik amplifikasi PCR menggunakan primer universal untuk mendeteksi Begomovirus pada sampel koleksi Laboratorium Virologi, PS Proteksi Tanaman, IPB ....................................................................
27
Gel elektroforesis fragmen DNA produk amplifikasi PCR menggunakan primer universal untuk mendeteksi Begomovirus pada tanaman tomat sakit yang dikoleksi dari Malang dan Blitar .............
28
Tipe gejala pada tanaman tomat sakit yang ditemukan di daerah Pagerwangi, Lembang, Jawa Barat ....................................................
30
Tanaman tomat sakit yang diduga terinfeksi Begomovirus yang ditemukan di lapang ..........................................................................
43
Elektroforesis hasil amplifikasi PCR DNA Begomovirus pada sampel tanaman tomat menggunakan primer universal dari 8 daerah yang berbeda pada agarosa gel 1%. ...................................................
44
10. Elektroforesis fragmen DNA produk amplifikasi PCR dari genom Begomovirus yang dipotong dengan ensim restriksi (a) DraI (b) EcoRI (c) RsaI dan (d) PstI pada gel agarosa 1%. ............................
45
11. Dendrogram hasil analisis fragmen DNA restriksi dari isolat-isolat Begomovirus asal tomat dari 8 daerah yang berbeda menggunakan program NTSYSpc-21 ......................................................................
46
12. Dendrogram yang dihasilkan oleh analisis keragaman genetik berdasarkan fragmen situs restriksi dari isolat-isolat Begomovirus yang terdiri dari 8 isolat lokal Indonesia dan isolat-isolat dari database bank gen menggunakan program NTSYSpc-21. ................
48
13. Tomato plants exhibited various leaf-curl symptoms. Subsequent experiment indicated they were infected by Begomoviruses ..............
59
2. 3. 4. 5.
6.
7. 8.
9.
xx
14. Agarose gel electropherogram of polymerase chain reaction (PCR) amplified DNA fragments of putative AV1. The DNA fragments were amplified by PCR using AV1 specific primers and total nucleic acid of diseased tomato sample ….......................................
60
15. Alignment of partial amino acid sequences predicted from determine nucleotide sequences of AV1 gene of eight Begomovirus isolates determined in this research and seven Begomovirus isolates available from GenBank DNA database.............................................
62
16. Phylogenetic relationship based on predicted AV1 gene amino acid sequences of suspected Begomoviruses isolates determined in this research, and other Begomoviruses available in the GenBank DNA database……………............................................................................
65
17
Elektroforesis pada gel agarosa 1%. (a) produk amplifikasi gen AV1 dari dua isolat Begomovirus (CP 8 dan CP11) menggunakan primer spesifik CPPROTEIN-V1 dan CPPROTEIN-C1. (b) DNA plasmid rekombinan pCP8 (1-6) dan pCP11 (1-6) hasil isolasi dari koloni tunggal bakteri E. coli DH5α ………………………………………
79
18. Peta plasmid biner pBI121 yang membawa gen pelapor gus dan gen marker nptII pada struktur T-DNAnya .............................................
80
19. Elektroforesis fragmen gen AV1 yang dipotong dari vektor pGEM-T easy dan fragmen gen GUS dari vektor ekspresi pBI121 dengan enzim restriksi XbaI dan SacI pada gel agarosa 1%. AV1 = fragmen gen AV1 yang berukuran 780 bp; GUS = fragmen gen GUS yang berukuran 2000 bp ...........................................................................
81
20. Elektroforesis hasil verifikasi insersi fragmen gen AV1 dengan enzim restriksi XbaI dan SacI ...........................................................
82
21. Peta konstruksi plasmid biner pBI-CP yang membawa gen AV1 Begomovirus dengan promoter 35S-CaMV dan terminator nos, dan gen marker nptII pada struktur T-DNA ..........................................
82
22. Transformasi genetik tembakau dengan gen AV1 melalui vektor A. tumefaciens ......................................................................................
84
23. Elektroforesis gel hasil amplifikasi gen nptII pada 46 tanaman tembakau transgenik putatif generasi T0 menggunakan primer PCR spesifik. .............................................................................................
85
24. Deteksi PCR gen AV1 pada 46 tanaman tembakau transgenik putatif generasi T0 menggunakan primer spesifik ......................................
98
25. Bioasai tanaman tembakau transgenik menggunakan vektor serangga kutu kebul .........................................................................
100
xxi
26. Analisis hibridisasi Southern Blot pada sampel tanaman tembakau trasngenik putatif generasi T0 yang positif PCR dan 2 tanaman yang negatif PCR (no.10 & 20) dengan pelacak gen AV1 ..........................
102
27. Deteksi keberadaan Begomovirus dengan teknik PCR menggunakan primer universal pada tanaman tembakau transgenik generasi T0 setelah bioasai ..................................................................................
103
28. Skrining tanaman F1-TYLCV (F1 FLA456/Intan dan FLA456/CL6046) dengan TYLCV menggunakan vektor kutu kebul di rumah kaca .....................................................................................
121
29. Beberapa gejala tanaman F1-CMV setelah inokulasi dengan CMV ..
122
30. Amplifikasi gen CP pada tanaman generasi F1 Intan/R8-110-11; Varietas Intan; Air; Galur transgenik R8-110-11 menggunakan teknik PCR ……………………………………………...................
123
31. Amplifikasi gen CP-CMV pada tanaman generasi F1 CL6046/R8110-11; Varietas CL6046; Air; Galur transgenik R8-110-11 menggunakan teknik PCR ………………………………………..
123
32. Amplifikasi gen CP-CMV pada tanaman generasi F1IC-Intan/R8110-11//FLA456/Intan (39); Varietas Intan; Air; Galur transgenik R8-110-11(+) menggunakan teknik PCR ……………………….....
126
33. Amplifikasi gen CP-CMV pada tanaman generasi F1IC-CL6046/R8110-11//FLA456/CL6046 (38); Varietas CL6046; Air; Galur transgenik R8-110-11(+) menggunakan teknik PCR ……………...
126
xxii
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman 1.
Amplifikasi PCR dengan primer universal untuk mendeteksi Begomovirus pada tanaman tomat dari beberapa daerah ..............
153
2.
Komposisi Media Dasar Murashige and Skoog ..........................
154
3.
Deskripsi Varietas/Galur Tomat ...................................................
155
xxiii
