I S O L A S I DAN P E R H I T U N G A N KUMAN PATOGEN Pemeriksaan laboratorium merupakan bagian dari rangkaian pemeriksaan untuk mengetahui penyebab penyakit, menilai perkembangan penyakit setelah diberikan pengobatan atau menyakinkan kebenaran penyebab penyakit yang diduga berdasarkan gejala klinisnya yang khas (gejala pathognomonic). Untuk mengetahui penyakit infeksi, diusahakan isolasi dan identifikasi mikroorganisme dari spesimen (sampel) yang diambil dari penderita. Hasil pemeriksaan ini dipakai sebagai pedoman dalam pengobatan, perawatan ataupun tindakan lainnya pada penderita. Mengingat hasilnya yang sangat penting ini, maka pengambilan dan penanganan spesimen harus dilakukan dengan benar. Secara umum pemeriksaan yang dilakukan di laboratorium, adalah : a. Pemeriksaan mikroskopis b. Ditanam pada perbenihan buatan, binatang percobaan atau perbenihan jaringan c. Test serologis Adapun medium yang digunakan untuk menumbuhkan mikroorgansime tergantung dari tujuan isolasi. Untuk isolasi bakteri, misalnya Staphylococcus aureus menggunakan media MSA, Salmonella dan Shigella menggunakan media SSA, Escherichia coli menggunakan Mac Conkey/Endo Agar/EMBA/BGLBA, Candida albicans menggunakan media SDA, Neserria gonorrhoae menggunakan media Coklar Agar, golongan kapang menggunakan media PDA dll. PENGAMBILAN DAN PENGIRIMAN SPESIMEN Pengambilan Spesimen merupakan langkah awal yang penting untuk keberhasilan isolasi dan identifikasi kuman, karena seringkali kegagalan usaha ini bukan disebabkan kesalahan teknik di laboratorium, melainkan dalam pengambilan spesimen. Untuk menghindari kesalahan tersebut, maka pengambilan dan pengiriman spesimen harus dilakukan sebagai berikut : 1. Pengambilan harus dilakukan sebelum penderita diberi pengobatan antibiotik atau kemoterapeutika. Kadang-kadang dokter memberikan obat antibiotik berdasarkan gejala penyakitnya, tanpa melakukan identifikasi kumannya, sehingga isolasi kuman menjadi sulit atau menjadi tidak mungkin. Karena itu, pengambilan spesimen harus dilakkan sebelum obat diberikan. 2. Pengambilan harus dilakukan pada saat di mana kemungkinan besar kumannya bisa ditemukan. Spesimen harus diambil pada saat dimana kemungkinan besar kuman bisa ditemukan. Misalnya untuk mengisolasi Plasmodiium sp. pengambilan darah harus dilakukan saat penderita sedang deman. Beberapa laboratorium melakukan pengambilan spesimen 3 hari berturut-turut untuk memperbesar kemungkinan mendapatkan kumannya. Beberapa jenis kuman patogen hanya bisa ditemukan pada stadium tertentu dari penyakitnya. Misalnya Treponema pallidum, sangat mudah di isolasi pada saat stadium
3.
4.
5.
6.
7. 8.
awal sipilis dan sukar sekali ditemukan pada stadium lanjut. T. pallidum dengan mudah bisa diisolasi dari spesimen yang berasal dari ulcus durum (gejala sipilis primer) dan langsung dilihat dengan mikroskop Dark Field. Telihat bakteri yang berbentuk spiral dan dapat bergerak. Pengambilan harus dilakukan pada tempat dimana infeksinya sedang berlangsung. Spesimen harus diambil dari bagian tubuh yang mengalami infeksi aktif karena kadangkadang kumannya hanya terdapat dibagian tersebut. Misalnya, penyakit karena jamur Epidhermophyton floccusum yang menyebabkan tinea cruris, jamurnya akan mudah diisolasi dari bagian kullit yang mengalami infeksi aktif, yaitu pada pinggir dari kelainan kulitnya. Spesimen harus diambil dalam jumlah yang cukup. Spesimen harus diambil dalam jumlah yang cukup agar bisa memenuhi kebutuhan berbagai jenis pemeriksaan yang diperlukan. Misalnya sputum biasanya dibagi menjadi dua (2) bagian masing-masing 5 cc (ml) untuk perbenihan, sehingga paling sedikit dibutuhkan 10 cc. Pengambilan harus dilakukan dengan alat dan tempat penampungan yang tepat sebelum dikirim ke laboratorium. Alat untuk mengambil spesimen, misalnya kapas untuk apusan (swab) atau jarum suntik dan tabungnya tidak boleh mengandung daya hidup kumannya. Alat penyimpanan spesimen untuk pengiriman ke laboratorium harus steril dan terhindar dari kontaminasi oleh mikroorganisme lain. Harus segera dikirim ke laboratorium untuk analisis. Spesimen haru segera dikirim ke laboratorium, apabila tidak memungkinkan harus disimpan dalam medium khusus dalam pengirimannya agar kuman tetap hidup. Harus disimpan dalam lingkungan atau medium yang tepat sebelum saatnya diproses. Spesimen harus segera diproses agar kemungkinan untuk berhasilnya proses isolasi lebih besar.
PROSEDUR ENUMERASI/PERHITUNGAN KOLONI 1) Sampel urin dilakukan pengenceran sampai 10-5, dengan cara : a. 1 mL urin dimasukkan dalam aquadest/garam fisiologis steril 9 mL menggunakan mikropipet biru (1000 µL) sebagai pengenceran 10-1 (I) b. 1 mL pengenceran 10-1 (I) dimasukkan dalam aquadest/garam fisiologis steril 9 mL menggunakan mikropipet biru (1000 µL) sebagai pengenceran 10 -2 (II) c. 1 mL pengenceran 10-2 (II) dimasukkan dalam aquadest/garam fisiologis steril 9 mL menggunakan mikropipet biru (1000 µL) sebagai pengenceran 10 -2 (III) seterusnya sampai pengenceran 10-5. 2) Dua pengenceran terakhir dilakukan penanaman dengan duplo (masing–masing pengenceran 2 cawan) pada media Mc Conkey Agar cawan secara spread plate (100 µL) 3) Inkubasi dilakukan selama 2 x 24 jam pada suhu 370C. 4) Dihitung jumlah pertumbuhan koloni E. coli (koloni sedang, merah bata/tua, smooth, keping/sedikit cembung) pada masing-masing cawan.
5). Pertumbuhan koloni dihitung dengan metode Total Plate Count (TPC), yaitu : jumlah koloni (CFU / mL) a x 1 / n x faktor koreksi Keterangan : a : jumlah koloni n : faktor pengenceran (10-1, 10-2, 10-3 dst) faktor koreksi : metode penanaman (Spread plate : 10; pour plate : 1) (Lay, 1994). A. Escherichia coli E. coli merupakan flora normal, hidup komersial di dalam kolon manusia dan di duga membantu pembuatan vitamin K yang penting untuk pembekuan darah. E. coli dapat digunakan untuk/sebagai indikator pencemaran air oleh tinja, terutama untuk air yang digunakan keperluan rumah tangga. E. coli dapat menyebabkan epidemi penyakit saluran pencernaan, seperti kolera, tipus, disentri dan penyakit cacing. E. coli juga dapat menyebabkan pneumonia, endokarditis, infeksi pada luka-luka dan abses pada berbagai organ. E. coli juga merupakan penyebab utama meningitis pada bayi yang baru lahir dan penyebab infeksi tractus urinarius (pyelonephritis, cystisis). 60-90% E. Coli menyebabkan ISK E.coli yang biasanya menyebabkan infeksi saluran kemih ialah jenis O1, O2, O4, O6, O7. Jenis-jenis pembawa antigen K dapat menyebabkan timbulnya pielonefritis.Terjadinya gangguan ginjal berhubungan dengan E. coli nefropatogenik yang memproduksi hemolisisn, dan antigen K merupakan hal penting pada dapat patogenesis infeksi saluran kemih bagian atas. Ini berhubungan dengan adanya fimbria-P. Jumlah E. coli 105 atau lebih CFU/ml urin adalah bakteriuria signifikan,walaupun pasien bisa simptomatik atau asimptomaik. Uretra anterior pria dan wanita mengandung sedikit organisme yang berjenis sama seperti yang terdapat pada kulit dan perinemium yang biasanya terdapat dalam air kemih normal dalam jumlah 102 – 104 CFU/mL. Diagnosis laboratorium : a) Sediaan Endapan air kemih yang dipusingkan diperiksa untuk melihat adanya lekosit, sel darah merah dan kuman.Sedimen ini dibuat sedian Gram untuk melihat adanya sejumlah besar lekosit dan kuman Gram negative. b) Biakan a) Bahan pemeriksaan dibiakkan pada lempeng agar darah dan lempeng agar Mc Conkey. Jika ditemukan kuman peragi laktosa, Gram negative, bergerak aktif, indol positif, merah metal positif, VP negative dan sitrat negative, di duga sebagai E. coli b) Jumlah kuman di dalam air kemih yang melebihi 10 5 CFU/mL dianggap sebagai infeksi saluran kemih (bakteriuria nyata). B. Genus Pseudomonas Genus Pseudomonas terdiri dari sejumlah kuman batang gram negatif, obligat aerob, berflegella polar satu atau lebih, umumnya tidak meragi karbohidrat dan mudah tumbuh pada berbagai medium pembiakan. Organisme ini merupakan flora normal di usus dan kulit.
Kebanyakan spesies Pseudomonas tidak menyebabkan infeksi pada manusia, tetapi kuman ini penting karena bersifat oportunis patogen, dapat menimbulkan infeksi pada individu dengan ketahanan tubuh yang menurun yaitu penderita dengan luka bakar, orang sakit berat atau dengan penyakit metabolik, atau mereka yang sebelumnya memakai atau mempergunakan alat-alat kedokteran. Infeksinya biasanya gawat, susah diobati dan kebanyakan antibiotik tidak efektif terhadapnya dan biasanya merupakan infeksi nosokomial. Beberapa spesies mengandung pigmen. Pseudomonas aeruginosa merupakan satusatunya spesies yang menghasilkan : 1. Piosianin, zat berwarna kebiru-biruan larut dalam kloroform dan air dan mempunyai aktivitas anti jasad renik, 2. Fluoresein, zat yang berwarna kehijau-hijauan berfluoresensi, larut dalam air tidak dalam kloroform. Selain reaksi biokimia, karakteristik laboratorium yang banyak digunakan ialah percobaan oksidasi, dimana P. aeruginosa memberikan hasil yang positif. Pseudomonas aeruginosa dapat menimbulkan infeksi pada saluran pernafasan, kandung kencing, telinga, kulit dan pada luka-luka yang disebabkan terbakar atau luka operasi. Bakterinya dapat diketemukan di dalam sputum, urine, darah, feses, pus, secret telinnga. Juga di dalam makanan, minuman dan air. Pemeriksaan : Morfologi : Gram negative (-) batang, lurus atau bengkok, tidak berspora, tidak berkapsul, bergerak aktif dengan flagella polar/lopotrik. Kultur dan Biokimia : Mudah tumbuh dengan menggunakan medium biasa, strength aerob, tidak meguraikan gula, katalase positif dan pada umumnya oksidase positif. Blood Agar plate : koloni besar, putih abu-abu, smooth/rough, keeping, haemolitis/anhaemolitis, ada yang membuat pigment hijau-biru Mac Conkey Agar plate : koloni sedang, jernih/keruh, smooth, kadang-kadanng sedikit kehijau-hijauan, keeping, tepinya tidak rata, tidak menguraikan gula lactose Cetrimide Agar : tumbuh, memproduksi pigment hijau-biru Nutrient Agar : tumbuh, memproduksi pigment hijau-biru TSIA : lereng : merah, dasar : merah Reaksi positif : oksidase, katalase, motil, simmon’s citrate, arginin dihydrolisa, gelatine, reduksi nitrat, pertumbuhan pada 42OC Reaksi negative : ONPG, D-nase, amylase, lysine dekarboksilase, ornithine dekarboksilase, aesculine hidrolisa Pewarnaan GRAM Dalam pewarnaan gram bakteri diberi zat warna lebih dari satu macam dan diberikan secara berurutan. Melalui pewarnaan gram, bakteri dapat dikelompokan menjadi dua kelompok yaitu : (1). Gram positif, dinding sel akan berwarna ungu dan (2). Gram negatif, dinding sel akan berwarna merah. 1. Buat preparat ulas dari suspensi kuman seperti : E. coli, S. aureus, S. typhi dll. 2. Lakukan fiksasi dengan hati-hati
3. Genangi preparat dengan kristal ungu dan dibiarkan selama 30 detik 4. Cuci dengan air mengalir dan dikeringkan 5. Genangi preparat dengan kalium iodida dan dibiarkan selama 45 detik 6. Cuci dengan air mengalir 7. Cuci dengan alkohol aseton sampai warna ungu hilang dan dikeringkan 8. Genangi preparat dengan safranin dan dibiarkan selama 30 detik 9. Cuci dengan air mengalir dan dikeringkan 10. Amati preparat dengan mikroskop.
