METODY ANALÝZY NUKLEOVÝCH KYSELIN Polymerázová řetězová reakce Většina metod analýzy DNA využívá možnost amplifikace DNA v in vitro podmínkách. Polymerázová řetězová reakce - PCR (polymerase chain reaction) je metoda, která umožňuje z komplexní (celkové) DNA namnožit vybraný úsek, např. určitý exon analyzovaného genu, bez předchozího klonování ve vektorech (viz dále). Předpokladem je znalost pořadí basí na začátku a na konci požadované sekvence DNA pro syntézu krátkého (oligonukleotidového) jednovláknového úseku DNA; primeru dlouhého 20-30 bp. Princip PCR je obdobou replikace nukleových kyselin. Během PCR reakce dochází k cyklickému opakování enzymové syntézy nových řetězců vybraných úseků dvouřetězcové DNA ve směru 5'→3', která je zprostředkovaná DNApolymerasou. Syntetizovaný úsek DNA je tepelně denaturován (při 95 oC) a se vzniklými dvěmi jednovláknovými molekulami DNA následně hybridizují primery (při 45 – 65 oC). Napojením primerů je umožněna syntéza komplementárních vláken DNA (při 65 - 75 oC), kterou zajišťuje DNA-dependentní-DNA-polymerasa Taq. Taq-polymerasa je izolovaná z bakterie vyskytující se v teplých pramenech a není proto inaktivována při vyšších teplotách
o k DNA jen od místa navázání primerů (navazováním nukleotidů k primeru - viz replikace). ja é a k Časové omezení PCR reakce určuje délku nově syntetizovaného vlákna DNA. or c i t g u a a celý cyklus Po 1. cyklu je replikovaný úsek DNA zdvojnásoben. Následuje další denaturace lo o m Po 30ti nbývá se opakuje. Množení vybraného úseku pokračuje geometrickou řadou. cyklech l e h á s c i velkého r la relativně te množství ní DNA zmnožena řádově 105 - 106. Tím, že PCR umožňuje h získání e t o biologie.ře a molekulární u oblastech k DNA z velmi malých vzorků, nachází uplatnění v mnoha o í s í m ic š e Metodu PCR schematicky znázorňuje následujícísobrázek.jn í m š i e l í a no ž v dpřístrojichoznačovaném thermocykler. PCR je automatizovaný proces, který uprobíhátu d á o y a s l z l . s á Thermocykler je naprogramován tak, aby v jednotlivých byly automaticky e krocích t ový škoteplotních m k z a n a připojení lůprimerůz a (c) tvorbu dodržované tepelné podmínky e pro (a) denaturaciéDNA, (b)rpro k e e který udržuje Pobsahujeúčpufr (roztok, kpro PCR m lň směs j komplementárních vláken DNA. Reakční o u v a s k DNA,opdostatečné r y m o o stabilní pH), vzorek množství všech čtyř typů nukleotidů (2'd V t ý d u n a o deoxyribonukleosid-5'-trifosfáty –ůdNTP), primery jia DNA-dependentní-DNA-polymerasu r t ov optimalizovanéí koncentraci n směsi jsou dále k supřítomny hořečnaté ionty Mg , e b Taq. V reakční o T it hla ž u i u ou d o p zs tu s o e h b e ke J
v průběhu PCR reakce. DNA-polymerasa tvoří komplementární vlákna DNA podle matrice
2+
které tvoří rozpustný komplex s dNTP, který rozpoznává DNA-polymerasa a chelační činidla (např. EDTA), která inhibují deoxyribonukleasy.
PRINCIP METODY PCR 5´ 3´
3´ 5´
(1 MOLEKULA)
1. C Y K L U S
DENATURACE 5´
3´
3´
5´ PRIMERY
5´
3´
3´
5´ Taq-POLYMERASA
5´ 3´ 5´ 3´
3´ 5´
(2 MOLEKULY)
3´ 5´
o k ja é a k r c i to g u a lo o m l n e h á s c a eri te l í h at Taq-POLYMERASA n o u e o m ick ř í s š e j ní m í s š l o í di he (4 MOLEKULY) a ž d án u stu y c o a sl ý kol e. m káz t a n kov é š raz elůDENATURACE e z 3. C Y K L U S e m lň ok v P úč PRIMERY j u Taq-POLYMERASA a k op ys r m o (8 MOLEKUL) o d V t ý d u ů in a o j r t 4. C Y K LnU S o (16 MOLEKUL) k su e b í o T it hla ž 5. C Y K L U S u (32 MOLEKUL) i u u d o so u p t s o ez h e b k Je
2. C Y K L U S
DENATURACE PRIMERY
Štěpení DNA Restrikční endonukleasy Restrikční endonukleasy (restriktasy) jsou sekvenčně specifické bakteriální enzymy (endonukleasy), které chrání baktérii před vniknutím cizorodé DNA, například při infekci baktérie bakteriofágem. Cizí dvouvláknová DNA je restriktasou rozštěpena, vlastní DNA je proti působení enzymu chráněna (obvykle methylací některých basí). Restrikční endonukleasy mohou štěpit dvouvláknové molekuly DNA jakéhokoliv původu, pokud v nich existují pro ně specifická cílová místa štěpení se specifickým pořadím basí pro určitou restriktasu. K rozštěpení molekuly DNA dochází hydrolysou fosfodiesterových vazeb obou řetězců v restrikčním místě (místo štěpení). Cílového místa jsou obvykle sekvence 4-6 bp. Štěpení DNA může být uvnitř této cílové sekvence, případně před nebo za ní. Názvy restrikčních endonukleas jsou odvozovány od jména baktérie, ze které byly získány. V současné době je známo přes 3 500 restriktas. Například restriktasa EcoR I byla získána z bakterie Escherichia coli, kmen RY 13. Cílová sekvence této restriktasy musí být na obou vláknech DNA shodná a štěpení dvouvláknové molekuly DNA je od 5' konce. Pro restriktasu EcoR I to je mezi G a následující sekvencí
o k ja DNA velmi často palindrom (čtení sekvence shodné z obou konců). Pokud dochází ke štěpení é a k r c uprostřed palindromu, vznikají konce bez přesahů, tzv. tupé konce. Pokud tonedochází ke gi u a vazeb DNA štěpení DNA uprostřed palindromu, vznikají přerušením fosfodiesterických lo o m l n kohezní konce (lepivé konce, konce s přesahem), viz následující obrázek. e h á s c a eri te l í h at o n u e 5'-AATGCTAATGCCTAGTCAAGCTTTCATCGAG|AATTCCAGTCGAA-3' o m ick ř í s š e j ní m í s š 3'-TTAGCTTTACGGATCAGTTCGAAAGTAGCTCTTAA|GGTCAGCTT-5' l o í di h e a ž d án u stu y c o a sl ý kol e. m káz t 5'-AATGCTAATGCCTAGTCAAGCTTTCATCGAG lů za en kov é š Praz čeAATTCCAGTCGAA-3' eGGTCAGCTT-5' m lň ok v j 3'-TTAGCTTTACGGATCAGTTCGAAAGTAGCTCTTAA ú u a k op ys r m o o d V ý ut d n ji u a rů to o n k í las t ob Te i ž uh u i u d o so u p t s o ez h e b k Je
AATTC od 5' konce (znázorněno značkou |), tzn. 5'-G|AATTC-3'. Cílové sekvence tvoří
Několik příkladů běžných restrikčních endonukleas a jejich restrikčních míst je uvedeno v následující tabulce. Je uvedeno pouze restrikční místo na jednom vlákně DNA ve směru 5'→3'.
Bakteriální zdroj
Název restriktázy
Cílové místo štěpení (dvouvláknová DNA)
Arthrobacter luteus
Alu I
5'-AG|CT-3'
Bacillus amyloliquefaciens
BamH I
5'-G|GATCC-3' (kohezní konce)
Escherichia coli RY 13
EcoR I
5'-G|AATTC-3' (kohezní konce)
Haemophilus influenzae
Hind III
5'-A|AGCTT-3' (kohezní konce)
Moraxella sp.
Msp I
5'-C|CGG-3'
Streptomyces albus
Sal I
5'-G|TCGAC-3' (kohezní konce)
Staphylococcus aureus
Sau 3A
5'-|GATC-3'
(tupé konce)
(kohezní konce)
(kohezní konce)
o k ja é a k r c Restrikční mapy i to g u Působíme-li na izolovanou DNA určitou restriktasou, dojde k jejímu arozštěpení na úseky lo o m vlmolekulehnDNA. (fragmenty) rozdílné délky podle umístění cílových sekvencí eštěpení s riá ec Restrikční mapa ukazuje pomocí vzniklých fragmentů početla restrikčních tv molekulách ní e míst h t o a Informace DNA a velikost fragmentů pro jednotlivé restrikčních jsou pakře k ouendonukleasy. m c í s i š í kompletovány pro molekuly DNA jednotlivých chromosomů. e í s ijn em š l í DNA rozdělená na jednotlivé fragmenty pak a nnao ž můžeudbýt dálechanalyzována se dzřetelem u t lyPolymorfismy v délce á a polymorfismy v délce restrikčních fragmentů fragmentů lo ývspopulaci. z . s á např. o místyzeštěpení. Jsou tmezi odvěma m k k v jsou podmíněné počtem párů basí cílovými vyvolané a n š ra elů z e é k mutací v cílovém místě štěpení e tandemových č počtem k v Pnebo různým m a ltím ň jehoozrušením j ú u a pmístyyštěpení s atp. m repetitivních sekvencí k mezi dvěma r o o o d V ý ut d n Stanovení polymorfismů genomů ji u a rů to o n k í celé Detekce asgenomové, chromosomové nebo ob se můžežittýkat Tepolymorfismů (rozdílů) l h genů nebo jejich specifických částí, mitochondrální DNA,iaunebo polymorfismů specifických u u d o so u p t s o ez h e b k Je Thermus aquaticus
Taq I
5'-T|CGA-3' (kohezní konce)
tzn. polymorfismů (rozdílů) v sekvenci (v pořadí nukleotidů) DNA. Rozdíly v sekvenci DNA mohou, ale nemusí ovlivnit určité fenotypové znaky. Identifikace a typizace určitých polymorfismů umožňuje rozlišení jedinců např. s ohledem na preventivní opatření a léčbu choroby. Genotypové diagnostické metody (analýza DNA) jsou, na rozdíl od diagnózy podle fenotypových projevů, přesné. Pro stanovení sekvenčního polymorfismu DNA mohou být použity přímé metody, kdy se stanovuje sekvence variabilní oblasti DNA (viz sekvencování) nebo nepřímé metody, založené na amplifikaci DNA nebo využívající restrikční endonukleasovou analýzu a selektivní hybridizaci restrikčních fragmentů se specifickými sondami. Další techniky pro identifikaci polymorfismů využívají rozdílnou pohyblivost fragmentů DNA se standardní a mutantní formou genu při elektroforéze, která je odrazem konformačních polymorfismů nukleových kyselin. Vysoce rozlišovací techniky umožňují identifikaci i jednonukleotidových polymorfismů (SNP). Polymorfismus délky restrikčních fragmentů (RFLP) Působíme-li na izolovanou DNA jedince určitou restriktasou, dojde k jejímu rozštěpení na úseky (fragmenty) rozdílné délky podle umístění cílových sekvencí štěpení pro použitou
o k počet) buď shodnou, nebo rozdílnou. Pokud mezi jedinci téhož druhu při použití ja téže é a k r restriktázy nacházíme fragmenty rozdílné délky, pak hovoříme o polymorfismu v délce c o i t g u restrikčních fragmentů (RFLP – Restriction Fragment Length Polymorphism). a lo o m být například n Vysvětlením vzniku polymorfismu délky restrikčních fragmentů může mutace l e h á s c i Restriktasa a emísto). r l některého nukleotidu v cílové sekvenci štěpení (variabilní restrikční te pak ní h t u jehoža délkakjeo součtem délekře v takto změněné cílové sekvenci neštěpí a vzniká fragment, o í s í žemmutacíicvznikne nová cílová š dvou sousedních původních fragmentů. Naopak jeetéž možné, í s ijn em š l í o sekvence a tak dojde ke zkrácení délky ž restrikčního a vzniku h Jinou možností d fragmentu. c n d u u t lynebo vyčlenění, nukleotidů á a polymorfismu délky restrikčních fragmentů mezi lo ýje svčlenění, z . s á Pak o zeopakujících t okrátkých m k k v dvěmi cílovými sekvencemi - variabilita tandemově se repetic. a n š ra elů z e é k jsou získány restrikční fragmenty P úč je k kratší). m delší ň(respektive l o u v a příčiny vzniku p úseků s DNA vykazujících k shodných r o y m Schematické znázornění rozdílné o o d V ý ut d n polymorfismuto délky restrikčníchrfragmentů ukazuje následující ů ji u aschéma zobrazující situaci na o n k jednom vlákně í las t Te DNA. ob i ž uh u i u d o so u p t s o ez h e b k Je restriktasu. DNA od různých jedinců stejného druhu pak může mít délku fragmentů (i jejich
a) dvě restrikční místa (3 fragmenty) 5'
TAATGCCTTCTCAAGCTTTCATCGAG|AATTCCAGTCGAAAGCTTTCATCGAG|AATTCCAGT3'
b) první restrikční místo zrušeno záměnou nukleotidů A→C; 2 fragmenty 5'
TAATGCCTTCTCAAGCTTTCATCGAGACTTCCAGTCGAAAGCTTTCATCGAG|AATTCCAGT3'
c) vznik nového (dalšího) restrikčního místa záměnou nukleotidů CC→AA; 4 fragmenty 5'
TAATG|AATTCTCAAGCTTTCATCGAG|AATTCCAGTCGAAAGCTTTCATCGAG|AATTCCAGT3'
d) variabilita krátkých repetitivních sekvencí, zde CGAT, vede v obou molekulách ke štěpení na dva fragmenty, ale odlišné délky 5'
CGAAAGCTTCGATCGATCGATCGATCGATCGATCGATCGATTCATCGAG|AATTCC3'
5'
CGAAAGCTTCGATCGATCGATCGATCGATCGATCGATCGATCGATTCATCGAG|AATTCC3'
Délka restrikčních fragmentů se dědí. Dědičnost se řídí pravidly Mendelovské genetiky (viz Monohybridismus). Velikosti restrikčních fragmentů můžeme hodnotit pomocí gelové elektroforézy. Fragmenty DNA mají záporný náboj, proto všechny fragmenty putují při jednosměrném
o k patří agaróza a polyakrylamid, které působí jako molekulární síto (jsou porézní, velikost ja pórů é a k r určuje jejich hustota). Pomocí gelové elektroforézy můžeme rozdělit jednotlivé fragmenty c i to DNA podle jejich velikosti. Malé molekuly (fragmenty) putují v gelu u rychleji než velké.og a l o O rozložení jednotlivých restrikčních fragmentů v gelu se můžeme přesvědčit obarvením m l n e h á s c i tDNA barvivem ethidiumbromidem. U eukaryotických genomů získáme vysoký a z komplexní r e l e h na elektroforetogramu t o souvislý ení počet fragmentů natolik velikostně rozdílných, že vytvářejí a u k o mkteré ipotřebujeme ř c í pruh. V těchto případech používáme pro identifikacisfragmentů, pro další š í e jn m í s š i analýzu, Southernovu metodu. e l í a no ž ud ch d u a ázá lo ý st oly . s t ov šk ze ům ak n a el e k z r é e č P k m ň j l so v ú u a p k o r y m o o d t ý V d ů in au o j r t o n k su e b í o T it hla ž u i u ou d o p zs tu s o e h b e ke J proudu od záporné elektrody (-) k elektrodě kladné (+). Mezi nejpoužívanější gelové nosiče
Southernův přenos Southernův přenos (blotting = "přepijákování") je metoda, která se používá při zkoumání velikosti restrikčních fragmentů určitého úseku DNA. Principy Southernovy metody jsou následující:
o k ja é a získaná z jaderných buněk jedince. k r c o i t g u b) Získané fragmenty se rozdělí gelovou elektroforézou. a lo o m l membránu n c) Po denaturaci DNA jsou vzorky přeneseny na e hybridizační h á s c i vhodné a nejsou r l (nitrocelulóza nebo nylonová membrána). Gelové nosiče te pro další ní e h t u a ko e postupy protože jsou velmi křehké. o ř m c í s i š e jní se realizuje í m d) Přenos (blotting) fragmentů z gelu nas membránu vzlínáním pufru š l o í di h e a ž z rezervoáru. d án u stu y c o a z l na podložku. . sl fixaceý fragmentů á o e) Po přenesení fragmentů nastupuje e t m n kov é šk raz elů zak e f) Dalším krokem je hybridizace s radioaktivně značenoučsondou (probou). Sondou e P k m ň j l ú o u DNA, vhybridizuje s restrikčními a fragmenty na p s bývá krátká sekvence kteráyspecificky k r o m o o d basí.VPři diagnosticendědičných ý utchorob je vybrána sonda, d základě komplementarity ji ležíu avyšetřovaný gen (extragenová tjeokomplementárníorkůfragmentu, na kkterém která n s e nebo je komplementární í s krátkou t a ob Tsonda) i l přímo sekvencí vyšetřovaného genu ž h u i u ou (intragenovád sonda). o p zs tu s o e h b e ke J
a) Pomocí vybrané restrikční endonukleasy je rozštěpena celková (komplexní) DNA
g) Po opláchnutí nenavázané sondy se autoradiograficky hodnotí lokalizace fragmentů, u kterých došlo k hybridizaci sondy. Jako sondu lze např. používat DNA z knihoven cDNA (viz dále). cDNA (komplementární DNA, copy DNA), je DNA získaná reversní transkripcí mRNA. Takto získaná DNA nenese sekvence odpovídající intronům. V případě, že DNA analýzu nelze vyhodnotit pouze pomocí délky nebo počtu restrikčních fragmentů, je možné využít další metodu založenou na specifické hybridizaci vzorku DNA a to s tzv. alelově specifickou sondou. Alelově specifické sondy jsou oligonukleotidy o délce přibližně 20 bp, které hybridizují s neštěpenou denaturovanou DNA v místě, kde je úplná shoda všech komplementárních nukleotidů. Stačí tedy odchylka v jediném nukleotidu, aby k hybridizaci nedošlo. Alelově specifické sondy mohou tedy velmi citlivě stanovit i velmi malé genetické změny ve zkoumané DNA, pokud jsou lokalizovány v místě hybridizace sondy, nikoliv ale všechny mutace vyšetřovaného genu. Polymorfismus konformace jednořetězcových vláken DNA nebo RNA (SSCP) Polymorfismus jednořetězců nukleových kyselin ukazuje sekvenční rozdíly mezi alelami. Sekvenční rozdíly (i rozdíl jedné base) se odrazí na odlišné pohyblivosti vyšetřovaných
o k ja elektroforetických podmínkách. é a k r c i to Polymorfismus konfirmace dvouřetězců (DSCP) g u o a l o Při pomalé renaturaci fragmentů DNA se vytvářejí duplexy m DNA. Duplexy s úplnou n l e h á s c komplementaritou basí (homoduplexy) mají v nedenaturujících gelech odlišnou (vyšší) a eri te l - úplnou ní h ařetězce t onemají elektroforetickou pohyblivost než heteroduplexy,ujejichž kv genomech. íře obodových m c s komplementaritu basí. Heteroduplexy jsou důkazem mutací i š e j ní m í s š l o í di h e Sekvencování DNA a ž c n d DNA. u pořadíy nukleotidů, ustruktury, t á o Sekvencování DNA je stanovení primární v molekulách a s l ý z l e. s á o t m k Tato Cílem zkoumání je stanovení pořadí nukleotidů z (např.lůprojektzHUGO). a n kov écelého šk genomu a e r a v čperspektivě e je i pro kauzální informace je základ pro m exaktní genetickou diagnostiku P k ň u pl sopacientůvna podáníú léčiva a (farmakogenetika). genetickou terapii a k odezvu jednotlivých r o y m o o d basíVv určitém úsekunýDNA usetpoužívají různé metody d K zjišťování pořadí (sekvence) ji u a rů točasto automatizované. sekvencování, o n k í las t ob Te i ž uh u i u d o so u p t s o ez h e b k Je jednořetězcových úseků DNA nebo RNA ( o velikosti 150 – 400 pb) při nedenaturujících
Jedna z používaných metod je enzymová Sangerova metoda, která je založena na enzymově katalyzované terminaci syntézy DNA po zabudování dideoxyribonukleotidu (ddNTP - 2',3'dideoxyribonukleosid-5'-trifosfát) do nově vznikajícího komplementárního vlákna. Při sekvencování Sangerovou metodou je DNA, která má být sekvencována, použita jako matrice pro syntézu komplementárního vlákna. Dideoxyribonukleotidy se začleňují do vlákna syntetizované DNA náhodně na místo příslušného nukleotidu (2'-deoxyribonukleosid-5'trifosfátu). Po zabudování dideoxyribonukleotidu, který postrádá 3'-OH skupinu, nemůže DNA-polymerasa k němu v důsledku nepřítomnosti 3'-OH skupiny připojit další nukleotid a syntetizovaný řetězec DNA se nemůže dále prodlužovat. Výsledkem enzymové Sangerovy metody je vznik různě dlouhých fragmentů DNA, které nesou na konci určitý, fluorochromy nebo radioaktivně značený, dideoxyribonukleotid – ddGTP, ddATP, ddTTP, ddCTP. Délka fragmentu a jeho koncový dideoxyribonukleotid informuje o sekvenci nukleotidů v analyzovaném vzorku DNA. Metoda je schematicky znázorněna na následujícím obrázku. Sekvencování je prováděno ve čtyřech vzorcích, kdy každý analyzovaný vzorek stanovuje pořadí jednoho ze čtyř nukleotidů. Každý analyzovaný vzorek obsahuje směs (i) čisté DNA, která má být sekvencována, (ii) značený primer, připojující se k vláknu analyzované DNA, (iii) směs všech čtyř nukleotidů (A, G, C, T) a v každém vzorku jeden
o k ja é a k r c i to g u a lo o m l n e h á s c a eri te l í h at o n u e o m ick ř í s š e j ní m í s š l o í di h e a ž d án u stu y c o a sl ý kol e. m káz t en kov é š Praz čelů e za m lň ok v j ú u a p s k o r y m o o d t ý V d ů in au o j r t o n k su e b í o T it hla ž u i u ou d o p zs tu s o e h b e ke J
ze čtyř ddNTP, který je koncový inhibitor syntézy DNA a (iiii) DNA-polymerasu.
3'
5'
5'
*
Analyzovaná DNA (jednovláknová)
3'
Značený primer
DNA-polymerasa, primer, nukleotidy - rozdělení do čtyř zkumavek. Přidány jednotlivé ddNTP: ddATP, ddCTP, ddGTP, ddTTP Následuje syntéza komplementárního vlákna (značeno barevně pro jednotlivé ddNTP) ve směru 5'→3' podle analyzovaného vzorku jednovláknové DNA (černá čára; směr 3'→5')
* * *
A
* C A
C
* A
* G
*
C
*
G
*
*
G
*
*
T T T
Elektroforéza A
C
G
T
-
o k ja é a k r c i to g u a lo o m l n Sekvence nukleotidů je odečtena z gelu podle délky fragmentů e h á s s příslušnými koncovými ddNTP c a eri te l í h at o n u Výsledná sekvence na syntetizovaném vlákně: e o m ick ř í 5'- C T A G T A G G T C C A - 3's š e j ní m í s š e basí): al o í di párování Sekvence analyzované DNA (komplementarita h ž d án uG Ts-t5'u y c 3'- G A T C A T C C A G o a sl ý kol e. m káz t en kov é š Praz čelů e za m lň ok v j Automatické sekvencování ú u a p s k jeoplně automatizovaný r rychlou analýzu y m o o Automatickém sekvencování proces, který umožňuje d t ý V d utyto odlišnosti: (i) syntéza ů enzymovou metodou in má o a j vzorků. Při srovnání s výše uvedenou r t o řetězováí reakce, n u probíhá v termocykleru za k skterá e b DNA je asymetrická polymerasová o T it hla ž u účasti Taq DNA-polymerasy; (ii) pro stanovení i u ouproduktů zakončených specifickou basí se d o p zs tu s o e h b e ke J +
používají čtyři odlišné fluorescenční značky; (iii) délka stanovené sekvence je mezi 500 – 1000 basemi. Detekce produktů sekvenčních reakcí probíhá v průběhu elektroforézy automaticky pomocí laserového detektoru napojeného na počítač, který z pořadí signálů přímo hodnotí sekvenci DNA.
Obrázek ukazuje výsledek automatického sekvenování; převzato – otevřená encyklopedie www.Wikipedia. com). DNA čipy (expresní profilování), DNA microarrays DNA čipy jsou skleněné destičky, na které je umístěno velké množství cDNA (desítky tisíc) nebo krátkých specifických sekvencí jednotlivých genů (mikromnožství pro každý vzorek). Hybridizace s fluorescenčním barvivem značenou sondou cDNA, vytvořenou z mRNA
o k (aktivní) a i intenzitu jejich transkripční aktivity. Vizualizace hybridizace seja provádí é a v zařízení využívajícím počítačovou analýzu. Metoda expresního profilování o narDNA čipech ick t u pomáhá stanovit v jednom vzorku souboru aktivitu velkého počtu genů, og a mnohdy i všech l o je známých genů daného organismu. Hodnocení může být zaměřenom na různé situace jako n e iál ch s a např. reakce organismu na působení nepříznivých vnějších r nebo l podmínek tena expresi ní e h t komplexu genů při různých onemocněních i s možnostíu posoudit agenovou o expresi při jejich e k o ř m c í s i š léčbě a to i se zřetelem k věku jedince (viz dále Prenatální vývoj a stárnutí organismu). í e jn m í s š i e l í o h Vyžadujedazakoupení žrutinně,udje velmicnákladná. V současné době není tato metoda využívána n u á y i provedení a st primerů ljeotakéýsyntéza PCR pro vytvoření drahého technického vybavení a drahá z l . s t ov ško ze ům aká DNA čipu. n a el e k z r é e č P k m ň j l so v ú u a p k o r y m o o d t ý V d ů in au o j r t o n k su e b í o T it hla ž u i u ou d o p zs tu s o e h b e ke J sledované tkáně, umožní stanovit, které geny jsou v této tkáni v daném období exprimovány
Převzato – otevřená encyklopedie www.Wikipedia. com
Genové inženýrství Kohezní konce jsou jednovláknové úseky DNA, které mohou na principu komplementarity bází hybridizovat s kohezním koncem i jiné DNA. Může tak dojít i k hybridizaci s cizí molekulou DNA, například plasmidu a eukaryotní buňky, pokud obě DNA byly štěpeny
o k ja é a rekombinantní DNA. k r c to molekuly gi u Pokud jde o kruhovou DNA plasmidu, musí hybridizaci předcházet linearizace a lo o DNA. Ke štěpení a linearizaci je zvolena restriktasa, která DNA štěpí n pouze mplasmidu l e h c má iá DNAte(insert) v jednom místě a vytváří v místě štěpení kohezní konce. Fragment as lidské r l h cožaumožňuje te o-hybridizaci na ení shodné kohezní konce jako linearizovaná DNA plasmidu, u k komplementarityíř o DNAmna základě c s koncích rozštěpené DNA plasmidu s fragmentem lidské i š e j ní m í s š iligasa,hkterý e zajišťuje spojení basí. Při hybridizaci se uplatňuje také, mimo jiné, l vlákeno í enzym a d ž d án u stu y c DNA. o a sl ý kol e. m káz t en kov é š Praz čelů e za m lň ok v j ú u a p s k o r y m o o d t ý V d ů in au o j r t o n k su e b í o T it hla ž u i u ou d o p zs tu s o e h b e ke J
stejnou restriktasou. Použitím enzymu ligasy je možné vytvořit fosfodiesterovou vazbu a tak
napojit úsek jedné DNA molekuly s úsekem jiné molekuly DNA. Tímto způsobem vzniká
působení restrikční endonukleasy na DNA plasmidu
DNA plasmidu
působení restrikční endonukleasy na lidskou DNA DNA plasmidu s inzertem lidské DNA
Klonování lidské DNA Velikost genomu lidských buněk vyžaduje při molekulárně genetické analýze využití klonování DNA. Klonování DNA umožňuje např. štěpení DNA restrikčními endonukleasami
o k ja é a například bakteriofágy. k r c o i t g u Po vpravení vektoru, například plasmidu do baktérie, je možné množitaklony baktérií (tedyo l o potomky jedné baktérie) s tímto vektorem a tím zapojit do procesu m replikace zkoumaný núsek l e h s riábaktériíecs různými DNA. Touto metodou lze vytvořit genomové knihovny, tzn.la různé klony e o-t genomu. ní h t fragmenty DNA. Soubor klonů pak může představovat DNA celého eukaryotického u a k e o ř m c í s i Pro vytváření genomové knihovny savců je optimální pro vpravení šdo í fragmentů e jdélka í n m s i e í plasmidového vektoru okolo 40 kb. Jednotlivé fragmenty jsou připraveny tak, abyalseš jejicho ž ud ch d DNA),ánve u t koncové sekvence navzájem překrývaly.oTím vznikají klony (knihovny genomové y a s z l e. sl nejen á o ý kterých fragmenty DNA vytvářejí tinformaci o jednotlivých fragmentech, ale tím, m k že se k az lů v a n š o z Genomová r v komplexní é (sledu) vzájemně překrývají, i o jejichevzájemném k sousedství e jDNA. e č P k m ň l jehosobuněčných uje ve všech v DNA jednoho jedince typechústejná a(s výjimkou buněk p k r o y m o o d t ý V imunitního systému da nádorových buněk). ů in au o j r t n genomovýchboknihoven se v současné Při konstrukci u používají i uměle vytvořené k době s e í o T it hla vektory. ž u i u ou d o p zs tu s o e h b e ke J
na fragmenty a vytvoření rekombinantní DNA s DNA vhodného vektoru (nosiče). Jako vektory se používají bakteriální plasmidy, jinou možností je využití virového nosiče, jako jsou
cDNA knihovny jsou vhodné pro zkoumání transkripčně aktivních genů. Principem je získání mRNA z určitého typu buněk (určité tkáně, orgánu), které jsou specializované na tvorbu některého polypeptidu. Pomocí reverzní transkripce je pak získána cDNA (komplementární), která je začleněna do vhodného vektoru a následně namnožena. cDNA knihovny obsahují, na rozdíl od knihoven genomových, pouze informaci o funkčních genech. Informace obsažená v cDNA knihovnách je omezena pouze na exony příslušného genu (viz úpravy mRNA – transkripce). Knihovny cDNA buněk odlišných tkání nejsou identické, závisí na expresi genů v konkrétních buňkách určité tkáně. To znamená, že se bude lišit cDNA knihovna např. buněk jater a svalové tkáně. DNA diagnostika Metody molekulární genetiky umožňují zpřesnění rizika onemocnění pro členy rodin s výskytem Mendelovsky děděných chorob. Metody DNA diagnostiky můžeme rozdělit na metody přímé a nepřímé. Přímé metody Pomocí metody PCR se amplifikují jednotlivé úseky genu, ve kterém je očekáván nález mutace, a jednotlivé části genu (fragmenty) se pak vyšetří na přítomnost mutace.
o k ja chemickém chování molekul DNA nesoucích mutaci v porovnání seastandardní é k r c molekulou DNA (bez mutace), kdy změna sekvence mění konformaci to fragmentu gi u a DNA a tím i rychlost pohybu fragmentu v gelu. lo o m V některých n l e h (ii) Přítomnost variabilního restrikčního místa (viz RFLP). genech á s c la eri -te(přítomnost í vzniká mutací nové restrikční místo pro h určitou trestriktasu omutací zaniká.řen u místoakauzální k o variabilního restrikčního místa) nebo restrikční í s í m ic š e í Přítomnost nebo nepřítomnost tohotosrestrikčního jn místaemje pak přímým důkazem š i l í a no d v našíchpopulaci nejfrekventovanější ž uvádíme mutace. Jako příklad takové situace d u u st oly . (PAH).aMutaceávytváří loenzymýfenylalaninhydroxylasu zá mutaci v genu, který kóduje s t restriktasu m genuakPAH vede kMutaceazv eobou lalelách v n š ů nové restrikční místo pro Sty I. o e k é Pr če j e z k m ň ke vzniku fenylketonurie. ú ra u pl so v k o zachycuje (iii) Sekvencování Tato metoda se do konkrétní to ým unukleotidů. Vy změnu vnsekvenci d rů využívákažjikdyž uje ave sledovaném genu nalezena to diagnosticeovětšinou v přímé n s pohyblivosti určitého fragmentu í změnou t a ob mutace, například Tepřibližná lokalizace i l žcelý gen hje pracné a finančně nákladné. u Sekvencovat i genu v elektoforéze. u u d o so u p t s o ez h e b k Je (i)
Metody SSCP a DSCP (viz výše), které využívají rozdíly ve fyzikálně-
Nepřímá diagnostika Nepřímá metoda je metodou rodokmenovou, kdy je třeba získat DNA od postiženého jedince, jeho rodičů, sourozenců, případně dalších členů rodiny. Nepřímá metoda je založena na polymorfismu délky restrikčních fragmentů - RFLP (viz výše, dále Mendelovská dědičnost, Vazba genů). Další součástí molekulárně genetické analýzy situace v rodině je použití vhodné sondy (próby), která hybridizuje s úsekem vyšetřovaného genu (vnitrogenová sonda) nebo v jeho blízkosti (mimogenová sonda) (viz Vazba genů, Metoda Southern-blot). Princip vyšetření spočívá v tom, že od jednotlivých osob získáme jaderné buňky, ze kterých izolujeme DNA. DNA je rozštěpena vhodnou restrikasou. Další postup je založený na Southernově metodě (viz výše). Pomocí DNA postiženého jedince je možné stanovit lokalizaci alel sledovaného genu na fragmentu určité délky. Délka restrikčních fragmentů je děděna podle Mendelových pravidel. Na základě těchto pravidel je možné, při existenci polymorfismu délky restrikčních fragmentů v rodině, stanovit genotypy členů rodiny. Jestliže lze pomocí RFLP jednoznačně stanovit genotyp všech členů rodiny, je vyšetření plně informativní. V případě, kdy vyšetření není informativní nebo je informativní pouze částečně, je nutné použít jinou restrikční
o k ja mezi Následující obrázky uvádějí příklady konkrétní rodinné situace. Všimněte si rozdílu é a k r c situací, kdy gen je lokalizován na autosomu a na heterochromosomu X, kdy toženy mají dva gi u chromosomy X a muži pouze jeden X chromosom. Výskyt choroby je vaobrázcích znázorněn lo o m n se genealogickými značkami. V dolní polovině obrázku jsou výsledky vyšetřeníl RFLP. h Jedná e á s c i majíteodpovídající a osoby r l o schematické znázornění výsledků elektroforézy, kdy jednotlivé e í h at o n u e elektroforetogram znázorněn čárou pod svou rodokmenovou k o značkou. ř m c í s i š e jnjsouí využívány í m Poznatky získané na základě metod molekulárnísgenetiky ve farmaceutickém š l o í di h e a ž průmyslu a v prenatální i postnatální diagnostice c děděných chorob. n d Výhodou u stumonogenně á o y a z l spolehlivost, molekulárně genetických technik jesljejich relativně vysoká rychlostázískání . o ý e t m kbuňkami k tkáně, v množstvím z nebolůs jadernými a š výsledků. Je možné pracovat iesnvelmi malým o a z r če j e k metodkégenového P m ň vzorků krve. Perspektivou je využití při kauzální terapii l so v inženýrství ú u a p k o r y m genetických chorob.o o d t ý V d Pro procvičení genetických zákonitostí ů uvádíme v jnásledujících in au obrázcích schematicky o r t nmetodou RFLP.bo k su diagnostiku e í o T it hla ž u i u ou d o p zs tu s o e h b e ke J endonukleasu, která by informativní výsledek poskytla.
A) V rodině, ve které je matka a dcera postižena brachydaktylií (AD) bylo provedeno DNA vyšetření členů rodiny metodou RFLP. Výsledek vyšetření je graficky znázorněn (rodokmen a elektroforéza fragmentů DNA – Southern-blot). a) Posuďte, zda je vyšetření informativní a pokud ano, jaký je genotyp plodu, u které se zatím choroba neprojevila. b) v případě, že vyšetření není informativní, vypočítejte pravděpodobnost, že plod bude postižen pomocí Mendlových zákonitostí o dědičnosti.
Genotyp matky a dcery postižené brachydaktylií je Aa (viz AD děděné choroby), otec s normálně vyvinutými prsty rukou má genotyp aa. Pro prenatální diagnostiku plodu musí být
o k ja é a k r c i to g u a lo o m l n fragmenty e h a a á s c 2 a eri te l 1 í h at o n A a Aa Aa nebo aa u e o m ick ř í s š e určit.jní m í s Vyšetření není informativní. Genotyp plodu nelze š l o í di h e a ž Vysvětlení: d án u stu y c o a z je l e. v alelách (aa). Matka sl fragmenů Otec je heterozygot v délce restrikčních ao homozygot á ý t m kzdědila od k (Aa). v v alelách z Prvorozená a š ů o a homozygotka v délce fragmenů dcera l ena heterozygotka z k ké Pr če je m ň matky dominantní alelu,u která je velvazbě s o fragmentem 1, a odúotce recesivní alelu vázanou v p s k ras fragmentem 1. Od y m na fragment 2. Plodozdědil d odootce recesivní alelu, která je ve vazbě o ý ut V d n matky jeden zto fragmentů 1, ale nelze a s dominantní nebo recesivní rů identifikovatkzdaji ve vazbě o n u s o dědičnosti můžeme pouze alelou. Vetomto případě podle í zákonitostí t a ob Mendelových T i l žkteré uuAD h onemocnění je 50%. u riziko postižení, konstatovat pravděpodobné i u d o so u p t s o ez h e b k Je provedeno vyšetření všech členů rodiny včetně plodu metodou RFLP.
B) Využití RFLP pro nepřímou diagnostiku (vazebná analýza) u autosomálně recesivního onemocnění (např. fenylketonurie, cystická fibróza)
A
2
A
A
a
a
1
aa
a
AA
Vysvětlení: Postižený chlapec je recesivní homozygot aa. Oba rodiče jsou heterozygoti Aa. Oba rodiče jsou zároveň i heterozygoti v délce restrikčních fragmentů; heterozygocie alel
o k a v délce fragmentů 1. To znamená, že od obou rodičů zdědil fragment 1, se kterým je jve vazbě é a k r c recesivní alela sledovaného genu. Na homologních chromosomech u rodičů jeto tedy alela A ve i u og a vazbě s fragmentem 2 a alela a (mutovaná) s fragmentem 1. l o m n S fragmentem 2 u obou rodičů je ve vazbě dominantní alela A. Genotyp druhorozené dcery e iál ch je s a e r te l AA, je homozygota pro fragmenty 2. í h at o n u Vyšetření plodu ukázalo, přítomnost fragment 1 a 2 o (jedem byl zděděnkod otce, druhý odře m ic í s š í matky. Genotyp plodu je Aa. Dítě bude zdravé. e í s ijn em š l í Vyšetření metodou RFLP je plně informativní. a no ž ud ch d u a ázá lo ý st oly . s t ov šk ze ům ak n a el e k z r é e č P k m ň j l so v ú u a p k o r y m o o d t ý V d ů in au o j r t o n k su e b í o T it hla ž u i u ou d o p zs tu s o e h b e ke J
a restrikčních fragmentů jsou dva na sobě nezávislé jevy. Postižený syn je homozygot
C) Využití RFLP pro nepřímou diagnostiku (vazebná analýza) u gonosomálně recesivních onemocnění (např. hemofílie, barvoslepost).
X+
2
X+
X+
X-
X-
X+
1
XVysvětlení:
X chromosom dědí synové od matky. Dcery dědí jeden chromosom X od matky, druhý chromosom X od otce. Ženy mohou být přenašečkami mutované alely (heterozygotky X+X-). Mužové jsou buď zdraví (X+Y) nebo nemocní (X-Y). Při RFLP analýze bude u mužů detekován pouze jeden restrikční fragment (jeden
o k ja Prvorozený syn je postižený (X ). é a k r c oheterozygotní gi Postižený chlapec získal X chromosom s mutací (X ) ve sledovaném genu tod u matky (X X ). Mutovaný gen je u matky ve vazbě s fragmentem 1.aS fragmentem 2 ljeo o m n u matky ve vazbě nemutovaný gen ((X ). e iál ch s a l 2. ter -te Otec je zdráv (X ); nemutovaný gen je ve vazbě s fragmentem í h n o a u e Dcera je heterozygotka v délce fragmentů. Její genotyp o je XmX . ick ř í s š í m e cytogenetickým U plodu mužského pohlaví, které bylo stanoveno vyšetřením buněk plodu, í n s j š l o ígen. di he a byl nalezen fragment 2 nesoucí nemutovaný ž d án u yc u t o a s Tato situace představuje úspěšnou DNA Vyšetření l e. je informativní. áz sl diagnostiku. o ý t k az lům ak v n š o e k é Pr če j e z k m ň ú ra u pl so v k m to o do Vy ý d ů in au o j r t o n k su e b í o T it hla ž u i u ou d o p zs tu s o e h b e ke J chromosom X), u žen dva (dva chromosomy X). -
-
+
-
+
+
+
-
