Metody používané v MB analýza proteinů, nukleových kyselin
Nukleové kyseliny – analýza a manipulace • Elektroforéza (délka fragmentů, čistota, kvantifikace) • Restrikční štěpení (manipulace s DNA, identifikace specifických sekvencí) • Hybridizace (identifikace specifických sekvencí) • Amplifikace DNA (PCR) • klonování • Sekvenace DNA
Elektroforeza – separace
o o o o o
rozdělení makromolekul dle mobility v elektrickém poli DNA – záporně nabitá vizualizace – interkalační činidla, fluorofory (Et-Br excitace UV, toxický!) Marker : DNA o známé mol. Hmotnosti Nosič: agaroza
galaktóza a 3,6-anhydrogalaktóza
Příklady: Barvení ET-Br Parciální štěpení PFGE
Hybridizace - detekce specifických sekvencí princip
In situ Lokalizace genů na chromosomech
Northen/Southern Blotting – hybridizace elektroforeticky separovaných molekul RNA/DNA
Proba – specificky značená radioaktivně (32P), chemicky (digoxygenin), protilátkou
PCR (polymerase chain reaction) • Namnožení specifického úseku DNA analýza genu (přítomnost, mutace) genové exprese (RT PCR) kvantifikace DNA (qPCR)
• 3 kroky:
1) denaturace – rozpad dvoušroubovicové str. - ssDNA 2) annealing - nasednutí primerů na specifická místa ssDNA 3) polymerace - syntéza DNA (termostabilní DNA polymeraza)
• Např. 30 cyklů (z 1 původní molekuly DNA lze získat po 32 cyklech až 1 miliardu kopií)
Cycler
o Sledujeme expresi genu
na úrovni mRNA – nutno mRNA „převést“ na DNA (cDNA ) o Reversní transkripce (enzym reversní transkriptáza)
Klonování Produkce specifických proteinů Příprava knihoven (sekvenování)
Restrikční štěpení Restrikční endonukleásy štěpení specifické sekvence tupé/kohezní konce
Figure 8-31 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)
Restrikční endonukleasy - příklady
Basic components of a plasmid cloning vector that can replicate within an E. coli cell. Plasmid vectors contain a selectable gene such as ampr, which encodes the enzyme lactamase and confers resistance to ampicillin. Exogenous DNA can be inserted into the bracketed region without disturbing the ability of the plasmid to replicate or express the ampr gene. Plasmid vectors also contain a replication origin (ORI) sequence where DNA replication is initiated by host cell enzymes. Inclusion of a synthetic polylinker containing the recognition sequences for several different restriction enzymes increases the versatility of a plasmid vector. The vector is designed so that each site in the polylinker is unique on the plasmid.
DNA cloning in a plasmid vector permits amplification of a DNA fragment. A fragment of DNA to be cloned is first inserted into a plasmid vector containing an ampicillin-resistance gene (ampr). Only the few cells transformed by incorporation of a plasmid molecule will survive on ampicillincontaining medium. In transformed cells, the plasmid DNA replicates and segregates into daughter cells, resulting in formation of an ampicillin resistant colony.
Sekvenování - Knihovny
Sekvenování DNA
Produkce specifických proteinů Rekombinantní proteiny
Fingerprinting Hypervariabile microsatellite sequence (VNTR)
Proteiny – analýza a manipulace • • • •
Izolace, purifikace (centrifugace, chromatografie) Elektroforéza (separace, kvantifikace) Blotting (identifikace, western blott) Strukturní analýza (MALDI-TOF, X-ray crystallography, NMR)
Centrifugace - frakcionace buněčných lyzátů
chromatografie
ELEKTROFORÉZA Princip dělení nabitých částic na základě různých elektroforetických pohyblivostí Použití analytické i preparativní
Parametry separace náboj
velikost tvar Koncentrace gelu nižší dělení pouze podle náboje vyšší nebo gradient dělení také podle velikosti a tvaru Vliv pH - ovlivňuje náboj, stabilitu, aktivitu "kyselá" (kyselé pH): + "alkalická" (alkalické pH): –
– +
Směr migrace závisí na pI proteinů všechny nemusí "putovat gelem"
SDS-PAGE ELFO na PAGE v přítomnosti SDS (Sodium Dodecyl Sulphate dodecylsíran sodný) SDS se váže na proteiny, uděluje jim uniformní záporný náboj
Vyhodnocení
2D elektroforeza - Isoelektrická fokusace - SDS-PAGE
2D separace Kombinace isoelektrická fokusace/SDS PAGE
WESTERN BLOTTING 1. elektroforéza – rozdělení proteinů, např. SDS-PAGE 2. blotting – přenos na membránu, např. elektroforeticky 3. detekce (většinou imunodetekce)
- Specifické protilátky - SDS PAGE - 2D elfo
Sekvenční analýza proteinů (primární struktura)
Edmanovo odbourávání Z geno(mo)vých sekvencí (bioinformatika) Syntéza peptidů (chemická) Příprava protilátek (mono-, poly-klonální)
hmotnostní spektrometrie (mass spectrometry) MALDI -TOF
Struktura proteinu Rentgenostrukturní analýza (X-ray crystallography) NMR (z roztoků)
