Metody analýzy alkaloidů a organických kyselin
ALKALOIDY Heterogenní skupina - více než 5000 látek Typické charakteristiky alkaloidů: a) bázické sloučeniny rostlinného původu (výjimečně živočiš.) b) obsahují dusík v heterocyklické struktuře (ne vždy) c) vykazují fyziologickou aktivitu (často jsou jedovaté) d) vykazují optickou aktivitu e) rozpustnost ve vodě je vysoká až praktický nulová
Klasifikace alkaloidů: botanická ...X... farmakologická ...X... chemická Potravinářské třídění podle výskytu: 1. methylxanthiny, hypoxanthiny, puriny, pyrimidiny 2. chinolinové alkaloidy 3. alkaloidy koření 4. glykoalkaloidy 5. námelové alkaloidy 6. pyrrolizidinové a chinolizidinové alkaloidy Metody analýzy alkaloidů: a) identifikační metody - UV, IČ, NMR, MS b) kvantifikační metody - HPLC/UV, CZE/UV, TLC, elektromigrační, GC-FID a NPD, GC/MS, LC/MS, senzory (elektrochemické, enzymové apod.)
1a. Methylxanthiny (I) Výskyt: káva, čaj, kakaové boby, ořechy kola atd. Nápoje: vodné výluhy, extrakty („energetické drinky“) Obsahy: 50 - 250 mg/l nápoje (kofein)
1a. Methylxanthiny (II) Analytické metody - příklady Analyt, matrice
Izolace
Stanovení
LOD
Kofein v nápojích a potravinách
Extrakce vodou + filtrace
CZE nebo C18-HPLC + UV 214 nm, (MS)
0,1 - 2 mg/l
Kofein, theobromin, theofyllin v potravinách
Extrakce vodou a EtOH, RVO, rozp. fosf.pufr C18 SPE
C18-HPLC + UV 207nm, (MS)
0,1 - 2,5 μg/ml
Kofein v nápojích
Přímá SPME s příd. MeOH
GC-MS
2 μg/ml
Kofein v kávě přírodní, syntetický, původ kávy
Horká voda, PbCO3 + MgO, filtrace, CHCl3 extrakce, srážení krystalizace
D,C,N - izotopová analýza MS - 13C/12C, 15N/14N NMR - 2H/1H
-
1a. Methylxanthiny (III) Analytické metody - příklady Analyt, matrice
Izolace
Stanovení
LOD
Kofein + AMK, polyfenoly v zeleném čaji
-
NIR - reflexní
-
Kofein v kávových zrnech
SFC (CO2, 5 ml/min, 40°C, silikagel)
IR, NMR
-
Kofein v nápojích
příd. NH3 a H2O extrakce CHCl3
GC-NPD, FID
ng - μg/g
1b. Hypoxanthiny, puriny, pyrimidiny (I) Výskyt: Hlavně maso, kvasinky(-nice) apod.
Ryby, maso apod. - hodnocení čerstvosti
1b. Hypoxanthiny, puriny, pyrimidiny (II) Analytické metody - příklady Analyt, matrice
Izolace
Stanovení
LOD
Hypoxantin v rybách
Homogenizace s CCl3COOH, centrifugace, neutr. NaOH, do fosf. pufru
CZE + UV 250 nm 30 kV
-
Hypoxantin v rybách
HClO4 extr., do fosf. pufru pH 7,3
Kyslíková mikroelektroda - hypoxantinový senzor
6,7 μM
Hypoxantin v rybách
HClO4 extr., + filtrace, pH 6,5 - 6,8
C18-HPLC + UV 254 nm, (MS)
-
Amperometrická enzymová elektroda
0,06 mM
Hypoxantin v mase a v rybách
1b. Hypoxanthiny, puriny, pyrimidiny (III) Analytické metody - příklady Analyt, matrice
Izolace
Stanovení
LOD
Purinové deriváty, nukleové kyseliny v pivě a v potravinách
Kyselá a enzymová hydrolýza
C18-HPLC + UV 254 nm
-
Purinové báze v potr. bohatých na sacharidy
Hydrolýza s CF3COOH a HCOOH, 15 min, 240°C
Katex-HPLC + UV 260 nm
-
Degradační produkty nukl.bází v mléce, kávě, čokoládě apod.
Odtučnění extrakce tuku (n-hexan apod.)
C18-HPLC + UV 254 nm
-
2. Chinolinové alkaloidy (I) Chinin
Chinidin
Cinchonin
Cinchonidin
Výskyt: kůra chinovníku lékařského
Nápoje a farmaceutické využití (chinin): typické hořké ochucovadlo - především nápoje, antimalarikum
2. Chinolinové alkaloidy (II) Analytické metody - příklady Stanovení
LOD
Chinolinové Alkalizace (NaOH) alkaloidy v nealk. extrakce CHCl3 nápojích
GC-FID
-
Chinin v hořkých nápojích a tonicích
Odplynění (ultrazvuková lázeň)
ITP- EC(vod.) 5 mg/kg + UV 254, 280 nm (MS)
Chinolinové alkaloidy v kůře chinovníku
Kůra usušena při 80°C, rozemleta s CaOH a 5% NaOH, extrakce podle Soxhleta 7h toluenem, RVO, do fosf. pufru pH 3
C8-HPLC + UV 220 nm, (MS)
Analyt, matrice
Izolace
-
3. Alkaloidy koření (I) Výskyt (kapsaicinoidy): pálivá paprika – kapsaicin (kpc) typické ochucovadlo, slabé antimikrobní účinky apod. Scovilleho stupnice: Jednotka pálivosti - SHU (Scovilleho Heat Unit; 15 SHU ≈ 1 ppm kpc) 15 000 000 – čistý kapsaicin, dihydro-kpc (subj. 16 mil. SHU)
2500-8000 – Jalapeno, Tabasco sauce
Piperin
Výskyt: pepř černý (různé úpravy) typické ochucovadlo, dráždí nerv.soustavu, slabé antipyretické účinky apod.
3. Alkaloidy koření (II) Analytické metody - příklady Analyt, matrice
Izolace
Stanovení
LOD
Kapsaicinoidy v ostrých omáčkách, extraktech, pryskyřicích
Extrakce MeOH, filtrace, čištění silikagelem: n-hexan promytí, MeOH eluce
C18-HPLC + UV 280 nm + FLD (nm Ex/Em : 220/320)
-
Kapsaicinoidy v plodinách
Extrakce podle Soxhleta acetonem, reextr. Et2O, derivatizace pentafluorbenzylbromidem
GC/ECD, DB-5
-
GC/FID pro methylderiváty (trimethylaniliniumhydroxid)
3. Alkaloidy koření (III) Analytické metody - příklady Analyt, matrice
Izolace
Stanovení
LOD
Kapsaicinoidy a piperin v kořeněných potravinách
-
MECC, SPFM, EC 0,05M SDS
-
Piperin v černém pepři
Extrakce EtOH
C18-HPLC + UV 343 nm
-
Piperin a další příbuzné alkaloidy v koření a pryskyřicích
1,2-dichlorethan
SPFM: 342-345 nm
-
4. Glykoalkaloidy (I)
4. Glykoalkaloidy (II)
4. Glykoalkaloidy (III) Lykotetraosa (D-xylosa, D-glukosa, D-galaktosa, D-Glukosa)
Tomatidin
4. Glykoalkaloidy (IV) Výskyt a vlastnosti: Steroidní alkaloidy Rody Solanum a Lycopersicon - hlavně brambory - MRL 200 mg/kg baklažány (lilky vejcoplodé) a rajčata Typická hořká chuť - vyšší dávky jedovaté (zelené části, nebezpečí: zelené hlízy)
4. Glykoalkaloidy (V) Analytické metody - příklady Stanovení
Analyt, matrice
Izolace
-solanin a -chaconin v bramborách (popř. i β izomery)
Extrakce: 1C18-HPLC heptansulfonát sodný + UV 202 nm + CH3COOH SPE C18, fosf.pufr
Různé sloučeniny jako aglykony: např. solanidin, tomatidin, demissidin, solasodien, solasodin v bramborách
Extrakce - hydrolýza: 2M HCl + CCl4 Promytí NH4OH, RVO MeOH + toluen
GC/FID CP-Sil-5
LOD
-
5. Námelové alkaloidy (I)
5. Námelové alkaloidy (II) Výskyt a vlastnosti: Peptidové alkaloidy, obsahují lysergovou k. a isolysergovou k. Rod Claviceps Claviceps purpurea - Paličkovice nachová: parazit obilovin (námel - ergot) Jedovaté - ergotismus (postižené končetiny, halucinace) Medicínské použití
5. Námelové alkaloidy (III) Analytické metody - příklady Stanovení
LOD
Námelové Odtučnění Et2O, alkaloidy v námelu extrakce: 1,2-dichlorethanem vinná k., H2SO4, NaOH, CHCl3, RVO
NP-GPC + UV 280 nm
-
Námelové Inkubace: alkaloidy v pšenici fosf.pufr pH 7,4 a semenech trav + Tween 20 (PBST) 30 min + protilátka inkubace + ofenylendiamin.2HCl v citrát.pufru a H2O2 ustálení zbarvení 3M H2SO4
ELISA + SPFM 490 nm
Analyt, matrice
Izolace
10 ng/g
5. Námelové alkaloidy (IV) Analytické metody - příklady Analyt, matrice
Izolace
Stanovení
LOD
Námelové alkaloidy v mouce
Extrakce: DCM, EtAc, MeOH, NH4OH + filtrace, RVO Et2O + MeOH HCl extrakce promytí n-hexanem alkalizace extrakce DCM, RVO MeOH - filtrace
C8-HPLC + FLD - nm Ex/Em : 235/254
0,1 - 0,5 ng/g
Námelové alkaloidy
-
Sonda - Pos/Neg Isobutan reagenční plyn MS/MS (QqQ)
6. Pyrrolizidinové a chinolizidinové alkaloidy (I) Výskyt a vlastnosti: Léčivé rostliny - kostival, podběl Krmiva a příměsy krmiv:
echimidin
starček přímětník (otravy skotu)
vlčí bob - krmiva
chinolizidin
6. Pyrrolizidinové a chinolizidinové alkaloidy (II) Analytické metody - příklady Stanovení
Analyt, matrice
Izolace
Pyrrolizidinové alkaloidy v kozím mléce
Alkalická konverze GC/ECD na retronecin, filtrace, čištění IEC, RP, GPC
Lupanin a jeho deriváty v semenech vlčího bobu
Mouka ze semen + 5% CCl3COOH, neutralizace + pufr na pH 7,4
LOD 0,1 mg/kg
ELISA < 60 mg/kg + SPFM 405 nm
ORGANICKÉ KYSELINY Přítomnost v potravinách: biochemické procesy, acidulanty, stabilizátory, konzervovadla, mikrobiální činnost Typické senzorické vlastnosti (chuť a aroma): kyselá, dráždivá, ostrá, slanohořká, máslová, mléčná apod. Typické chemické charakteristiky: délka řetězce, cyklické a aromatické struktury počet karboxylových skupin a další skupiny (-OH, =O) nasycené a nenasycené - cis, trans izomerie apod. těkavost, disociační konstanta apod.
Klasifikace organických kyselin (I) 1. Alifatické nasycené monokarboxylové kyseliny H - COOH
CH3 - COOH C2H5 - COOH CH3[CH2]2 - COOH
methanová
ethanová
propanová
butanová
mravenčí
octová
propionová
máselná
methanoyl
methanoát
formyl
formiát
ethanoyl
ethanoát
acetyl
acetát
propanoyl
propanoát
propionyl
propionát
butanoyl
butanoát
butyryl
butyrát
CH3[CH2]3 - COOH
pentanová
valerová
pentanoyl
pentanoát
CH3[CH2]4 - COOH
hexanová
kapronová
hexanoyl
hexanoát
CH3[CH2]10 - COOH
dodekanová
laurová
dodekanoyl
dodekanoát
CH3[CH2]14 - COOH
hexadekanová palmitová
palmitoyl
palmitoát
CH3(CH2)16 - COOH
oktadekanová
stearoyl
stearoát
stearová
Klasifikace organických kyselin (II) 2. Alifatické nenasycené monokarboxylové kyseliny C17H33 - COOH oktadec-9-enová
olejová
oleoyl
oleát
C17H31 - COOH oktadeka-9,12-dienová
linolová
linoloyl
linolát
C17H29 - COOH oktadeka-9,12,15-trienová linolenová linolenoyl linolenát
Klasifikace organických kyselin (III) 3. Alifatické dikarboxylové kyseliny HOOC - COOH
HOOC - CH2 - COOH
ethandiová
propandiová
šťavelová
malonová
oxalyl
oxalát
ethandioyl
ethandioát
malonyl
malonát
propandioyl propandioát HOOC - (CH2)2 - COOH butandiová HOOC - (CH2)3 - COOH pentandiová HOOC - (CH2)4 - COOH hexandiová
jantarová
glutarová
adipová
sukcinyl
sukcinát
butandioyl
butandioát
glutaryl
glutarát
pentandioyl
butandioát
adipoyl
adipát
hexandioyl
hexandioát
(Z)-butendiová maleinová maleinyl (E)-butendiová fumarová
maleinát
butendioyl
butendioát
fumaroyl
fumarát
butendioyl
butendioát
Klasifikace organických kyselin (IVa) 4a. Aromatické karboxylové kyseliny benzenkarboxylová
benzoová
benzooyl
benzoát
benzen-1,2dikarboxylová
ftalová
ftaloyl
ftalát
benzen-1,3dikarboxylová
isoftalová
isoftaloyl
isoftalát
benzen-1,4dikarboxylová
tereftalová tereftaloyl
3-fenylpropenová
skořicová
naftalen-1karboxylová
1-naftoová 1-naftoyl
tereftalát
3-fenylpropenoyl 3-fenylpropanoát
1-naftoát
Klasifikace organických kyselin (IVb) 4b. Aromatické karboxylové kyseliny
skořicová kyselina
Klasifikace organických kyselin (V) 5. Heterocyklické karboxylové kyseliny furan-2-karboxylová
2-furoová
pyridin-3-karboxylová nikotinová
2-furoyl
2-furoát
nikotinoyl
nikotinát
Klasifikace organických kyselin (VIa) 6a. Hydroxykyseliny HO-CH2-COOH
hydroxyethanová hydroxyoctová
glykolová glykoloyl
2-hydroxypropanová
mléčná
2,3-dihydroxypropanová
glycerová glyceroyl
2-hydroxybutandiová hydroxyjantarová
jablečná
2,3-dihydroxybutandiová vinná 2,3-dihydroxyjantarová
laktoyl
maloyl
tartaroyl
Klasifikace organických kyselin (VIb) 6b. Hydroxykyseliny
2-hydroxypropan-1,2,3-trikarboxylová citronová
3,4,5-trihydroxybenzoová
gallová
galloyl
kávová kyselina
ferulová kyselina šikimová kyselina
Klasifikace organických kyselin (VII) 7. Oxokyseliny OHC - COOH
oxoethanová
glyoxylová oxalaldehydová
CH3 - CO - COOH
2-oxopropanová
pyrohroznová
Metody analýzy organických kyselin (I) Celková kyselost: titračně - roztok NaOH nebo KOH indikace - fenolftalein nebo potenciometrická pH 8,2 - AOAC, pH - 7,0 EU Vyjádření: různé podle typu matrice - obvykle spotřeba titračního roztoku o příslušné koncentraci vztažená na navážku vzorku a udávaná jako obsah dominantní kyseliny Těkavé kyseliny: destilace (příp. s vodní párou) SPFM: přímo (UV) nebo po reakci s činidlem (UV/VID) skupinově (nenasycené MK) nebo jednotlivě Enzymaticky: využití poměru NAD+/NADH nebo NADP+/NADPH - měření při 340 nm Elektroanalyticky: redoxní titrace nebo polarografie (askorb. k.) popř. kombinace s enzymovou metodou
Absorpční spektra různých forem pyridinových dinukleotidů
Metody analýzy organických kyselin (II) Separační metody 1. Chromatografické: plynová chromatografie - přímá nebo po derivatizaci
kapalinová chromatografie - RP, IEC 2. Elektromigrační: elektroforéza, izotachoforéza
Analýza skupinová nebo individuální Separace bohatých směsí včetně minoritních složek
Možnost sledování profilů
Metody analýzy organických kyselin (III) Analytické metody - příklady Analyt, matrice Mléčná kyselina: vína
mléčné výrobky
Izolace
Stanovení
CuSO4 + Ca(OH)2 + H2SO4
SFPM - VID 560 nm (reakce s phydroxydifenylem)
deproteinace SPFM - VID 570 nm extrakce Et2O (reakce s piperidinem) oxidace na CH3CHO
Citronová kyselina: sýry Extrakce horkou vodou (60-70°C) + deproteinace CCl3COOH
SPFM - VID 428 nm (reakce s pyridinem)
Metody analýzy organických kyselin (IV) Analytické metody - příklady Izolace
Stanovení
zředění a pH 8,0 odbarvení - 1% polyvinylpyrrolidon nebo aktivní uhlí
SFPM - UV 340 nm (NADH)
maso, zelenina, sýry Extrakce horkou vodou, odtučnění podchlazením a deproteinace HClO4
SFPM - UV 340 nm (NADH)
Analyt, matrice Sukcinát: vína, ovocné šťávy
Metody analýzy organických kyselin (V) Analytické metody - příklady Analyt, matrice Fumarová kyselina: ovocné šťávy tuhé potraviny
Izolace
Stanovení
třepání s Celitem + filtrace Extrakce MeOH + filtrace
Polarograficky Potenciál píku: -1.15V
Metody analýzy organických kyselin (VI) Analytické metody - příklady GC/FID,MS : stacionární fáze - těkavost, funkční skupiny (derivatizace: BF3/MeOH, HMDS, TMCS)
- polysiloxany, carbowax - speciální: FFAP = polyethylenglykol-2-nitrotereftalát Úprava vzorku: podle typu matrice: některé nápoje - ředění některé extrakty a nápoje - filtrace, čiření, odstřeďování
složitější matrice a extrakty z nich - kolonová chromatografie, SPE apod.
Metody analýzy organických kyselin (VIa)
Metody analýzy organických kyselin (VII) Analytické metody - příklady HPLC/RID,EC,UV,MS stacionární fáze: RP (C8, C18 silikagel), IEC (anex)
mobilní fáze: voda, organická rozpouštědla, kyseliny (H2SO4, HCOOH), kyselé pufry Úprava vzorku (obecně jednodušší než pro GC): podle typu matrice: některé nápoje - jednoduché ředění některé extrakty a nápoje - filtrace, čiření, odstřeďování
složitější matrice a extrakty z nich - kolonová chromatografie, SPE apod.
Metody analýzy organických kyselin (VIIa)
Metody analýzy organických kyselin (VIIb)
Metody analýzy organických kyselin (VIII) Analytické metody - příklady CZE, ITP/EC,UV Úprava vzorku:
podle typu matrice: - jednoduché ředění, frakcionace, odstranění rušivých složek, filtrace, čiření, odstřeďování, kolonová chromatografie, SPE apod.
Metody analýzy organických kyselin (VIIIa)
Metody analýzy organických kyselin (VIIIb) Isotachophoretic separation of organic acids and inorganic anions present in a model mixture on the CC chip. Zone assignments: LE, leading anion (chloride); 1*, migration position of sulphate; 2, sulphite; 3, phosphate; 4, malonate; 5, tartrate; 6, citrate; 7, malate; 8, lactate; 9, gluconate; 10, aspartate; 11, succinate; 12, ascorbate; 13, acetate; 14, sorbate; TE, terminating anion (capronate). The driving current was 10 μA. The concentrations of the analytes in the injected model sample were 12–42 mg/l. R, increasing resistance.
