MASARYKOVA UNIVERZITA PŘÍRODOVĚDECKÁ FAKULTA ÚSTAV BIOCHEMIE
Stanovení karboxylových kyselin pomocí plynové chromatografie v kombinaci s plamenově ionizačním detektorem - optimalizace metody Bakalářská práce
Aneta Šrajerová
Vedoucí práce: Mgr. Jiří Žeravík, Ph.D.
Brno 2014
Bibliografický záznam Autor:
Aneta Šrajerová Přírodovědecká fakulta, Masarykova univerzita Ústav biochemie
Název práce:
Stanovení karboxylových kyselin pomocí plynové chromatografie v kombinaci s plamenově ionizačním detektorem – optimalizace metody
Studijní program:
Biochemie
Studijní obor:
Biochemie
Vedoucí práce:
Mrg. Jiří Žeravík, Ph.D.
Akademický rok:
2013/2014
Počet stran:
58 + 2
Klíčová slova:
Alkyl chloroformiáty; derivatizace; karboxylové kyseliny; plynová chromatografie; plamenově ionizační detektor
Bibliographic Entry Author:
Aneta Šrajerová Faculty of Science, Masaryk University Department of biochemistry
Title of Thesis:
Determination of carboxylic acids using GC-FID – optimization of method
Degree programme:
Biochemistry
Field of Study:
Biochemistry
Supervisor:
Mgr. Jiří Žeravík, Ph.D.
Academic Year:
2013/2014
Number of Pages:
58 + 2
Keyword:
Alkyl chloroformates; derivatization; carboxylic acids; gas chromatography; flame ionization detector
Abstrakt V této bakalářské práci se věnujeme stanovení vybraných karboxylových kyselin. Byl vytvořen přehled derivatizačních metod pro úpravu karboxylových kyselin a následně byla vybrána a optimalizována metoda, která využívala specifických reakcí alkyl chloroformiátů. K analýze byla použita plynová chromatografie s plamenově ionizačním detektorem. U stanovovaných karboxylových kyselin byly určeny retenční časy, limit detekce a vytvořeny kalibrační křivky.
Abstract In this thesis we study the determination of selected carboxylic acids. There has been created an overview of derivatization methods for carboxylic acids. Subsequently methods based on alkylchloroformates derivatization reaction were selected and optimized. Gas chromatography with a flame ionization detector was used for analysis. For the determined carboxylic acids retention times, limit of detection and calibration curves were observed.
Poděkování Na tomto místě bych chtěla poděkovat panu Mgr. Jiřímu Žeravíkovi, Ph.D., vedoucímu mé bakalářské práce, za odborné rady, cenné připomínky a čas, který mi věnoval při vedení bakalářské práce. Dále bych chtěla poděkovat své rodině, která mě podporuje ve studiu.
Prohlášení Prohlašuji, že jsem svoji bakalářskou práci vypracovala samostatně s využitím informačních zdrojů, které jsou v práci citovány.
Brno 19. května 2014
……………………………… Aneta Šrajerová
Obsah Seznam použitých zkratek .............................................................................................. 11 I.
Teoretická část ......................................................................................................... 13
1.
Úvod ........................................................................................................................ 13
2.
Karboxylové kyseliny .............................................................................................. 14
3.
4.
2.1.
Význam a výskyt karboxylových kyselin ........................................................ 14
2.2.
Využití karboxylových kyselin ........................................................................ 15
2.3.
Charakteristika vybraných zástupců karboxylových kyselin ........................... 16
2.3.1.
Kyselina citrónová .................................................................................... 16
2.3.2.
Kyselina fumarová .................................................................................... 16
2.3.3.
Kyselina jablečná ...................................................................................... 17
2.3.4.
Kyselina jantarová .................................................................................... 17
2.3.5.
Kyselina malonová ................................................................................... 18
2.3.6.
Kyselina mléčná ........................................................................................ 18
2.3.7.
Kyselina octová......................................................................................... 19
2.3.8.
Kyselina oxaloctová .................................................................................. 19
2.3.9.
Kyselina vinná .......................................................................................... 19
Metody stanovení karboxylových kyselin ............................................................... 21 3.1.
Plynová chromatografie ................................................................................... 21
3.2.
Kapalinová chromatografie .............................................................................. 22
3.3.
Enzymové metody............................................................................................ 22
3.4.
Elektromigrační metody ................................................................................... 23
Použití GC pro stanovení karboxylových kyselin ................................................... 24 4.1.
Princip metody GC ........................................................................................... 24
4.2.
Instrumentace ................................................................................................... 25
4.2.1.
Nosný plyn – mobilní fáze ........................................................................ 25
8
4.2.2.
Injektor ...................................................................................................... 25
4.2.3.
Kolona ....................................................................................................... 26
4.2.4.
Detektor .................................................................................................... 27
4.2.5.
Pomocné plyny ......................................................................................... 28
4.3.
Záznam chromatogramu................................................................................... 29
4.3.1.
Kvalitativní vyhodnocování metody v GC ............................................... 29
4.3.2.
Kvantitativní vyhodnocování metody v GC ............................................. 29
4.4.
Příprava vzorku k analýze ................................................................................ 30
4.4.1.
Silylace...................................................................................................... 30
4.4.2.
Acylace ..................................................................................................... 31
4.4.3.
Alkylace .................................................................................................... 32
4.4.4.
Reakce s alkyl chloroformiáty .................................................................. 32
Cíle práce ........................................................................................................................ 34 II. Experimentální část ................................................................................................. 35 5.
Použité přístroje ....................................................................................................... 35
6.
Použité chemikálie a materiál .................................................................................. 36
7.
Metody přípravy vzorku .......................................................................................... 37 7.1.
Metoda I ........................................................................................................... 37
7.2.
Metoda II .......................................................................................................... 37
7.3.
Metoda III......................................................................................................... 38
7.4.
Metoda IV ........................................................................................................ 39
7.5.
Metoda V .......................................................................................................... 39
7.6.
Metoda VI ........................................................................................................ 40
7.7.
Metoda VII ....................................................................................................... 41
8.
Optimalizace metody ............................................................................................... 42
9.
Výsledky .................................................................................................................. 43 9.1.
Výsledky měření testovaných postupů ............................................................. 43
9
9.2.
Výsledky optimalizace metody VI ................................................................... 44
9.3.
Identifikace karboxylových kyselin ................................................................. 45
9.3.1.
Retenční časy ............................................................................................ 45
9.3.2.
Limit detekce ............................................................................................ 45
9.3.3.
Kalibrační křivky ...................................................................................... 47
Diskuze ........................................................................................................................... 50 Souhrn ............................................................................................................................. 52 Summary ......................................................................................................................... 53 Seznam použité literatury ............................................................................................... 54 Seznam grafů .................................................................................................................. 57 Seznam obrázků .............................................................................................................. 57 Seznam tabulek ............................................................................................................... 58 Seznam příloh ................................................................................................................. 58
10
Seznam použitých zkratek ACF
alkyl chloroformiáty
AED
atomově emisní detektor
AMK
aminokyseliny
CA
karboxylové kyseliny
CE
kapilární elektroforéza
Citr
citrát, citrónová kyselina
Citram
citramalát, citramalová kyselina
DES
diethylsulfát
DMS
dimethylsulfát
ECD
detektor elektronového záchytu
ECF
ethyl chloroformiát
EtOH
ethanol
FID
plamenově ionizační detektor
Fum
fumarát, fumarová kyselina
GC
plynová chromatografie
GLC
plynová rozdělovací chromatografie
GSC
plynová adsorbční chromatografie
GTP
glutamát-pyruvát transamináza
HPLC
vysokoúčinná kapalinová chromatografie
IDP
inosin-5-difosfát
IEC
iontově výměnná chromatografie
IS
interní standard
ITP
inosin-5-trifosfát
Lac
laktát, mléčná kyselina
LC
kapalinová chromatografie
L-LDH
L-laktát dehydrogenáza
LOD
limit detekce
Mal
malát, jablečná kyselina
Malon
malonát, malonová kyselina
MS
hmotnostní spektrometrie
Oct
octová kyselina
Oxal
oxaloctová kyselina 11
P
monofosfát
PrCF
propyl chloroformiát
PEP
fosfoenolpyruvát
Ph-But
fenylbutanová kyselina
PID
fotoionizační detektor
PK
pyruvátkináza
PrOH
1-propanol
RP
separace na reverzní fázi
SCS
sukcinyl-koenzym A-syntetáza
Suc
sukcinát, jantarová kyselina
Tar
tartarát, vinná kyselina
TCD
tepelně vodivostní detektor
TLC
tenkovrstvá chromatografie
12
I.
Teoretická část
1. Úvod Karboxylové kyseliny a jejich deriváty patří k biochemicky velmi významným látkám, účastní se většiny životních funkcí (energetický metabolismus, regulační mechanismy, výstavba struktur organismu). Jednou z možností, jak stanovit tyto látky, je využití standardní metody - plynové chromatografie ve spojení s plamenově ionizačním detektorem (GC-FID). Přímé stanovení pomocí GC-FID je výrazně omezeno, vzhledem k nízké těkavosti těchto látek. V tomto případě se využívá různých derivatizačních postupů, které tyto látky převádí na látky s vyšší těkavostí, což už vyhovuje podmínkám stanovení pomocí GC-FID. Stanovení karboxylových kyselin je zde rozebráno z hlediska přístrojových možností i potřebných derivatizačních úprav vzorků.
13
2. Karboxylové kyseliny Karboxylové
kyseliny
(CA)
jsou
organické
sloučeniny,
které
jsou
charakteristické přítomností karboxylové funkční skupiny, jejíž vzorec je –C(=O)-OH. Tvoří velmi významnou skupinu organických sloučenin v rostlinné i živočišné říši. Podílejí se na buněčném metabolismu, ale slouží také jako výchozí látky pro přípravu řady derivátů. Karboxylové kyseliny mohou mít ve své molekule jednu nebo více karboxylových skupin. [1,2] Podle počtu karboxylových skupin se organické kyseliny rozdělují na: -
jednosytné (monokarboxylové) obsahující jednu karboxylovou skupinu, např. kyselina octová,
-
vícesytné (di-, trikarboxylové) obsahující dvě a více karboxylových skupin, např. kyselina šťavelová. [3,4] Dle druhu uhlovodíkového zbytku je možno karboxylové kyseliny rozdělit na
alifatické (nasycené, nenasycené) a aromatické. [2]
2.1. Význam a výskyt karboxylových kyselin Karboxylové kyseliny jsou biochemicky velmi významné látky a jsou nepostradatelnou složkou živých organismů. Aminokyseliny jsou základem bílkovin, tedy i enzymů, které umožňují složité metabolické procesy. Estery ve formě triacylglycerolů mají zásobní i strukturní funkci. [4,5] Některé karboxylové kyseliny se v přírodě vyskytují volně (např. kyselina mravenčí v tělech mravenců), velká řada jich je vázaná ve formě svých solí, esterů, amidů či jiných derivátů. Soli kyseliny šťavelové nalezneme v rostlinách (šťavelu, špenátu), esterifikované vyšší mastné kyseliny se nacházejí v tucích a olejích, estery nižších karboxylových kyselin jsou složky vonných esencí (např. v ovoci). Karboxylová skupina je vázána i v několika isoprenoidech, jako jsou žlučové kyseliny. [6] Kyselina octová je hlavní organickou složkou octa. Kyselina butanová způsobuje zápach žluklého másla. Kyselina cholová je hlavní složkou lidské žluči. Alifatické kyseliny s dlouhým řetězcem (např. kyselina palmitová) jsou biologickými prekurzory tuků a dalších lipidů. [2] Karboxylové kyseliny se nacházejí i v ovzduší jak v plynné fázi, tak vázané na částice atmosférického aerosolu. Jsou produkty fotooxidací těkavých organických
14
sloučenin nebo jsou výsledkem lidské činnosti. Zúčastňují se atmosférických transformací a přispívají ke kyselosti srážek. [7] Důležité jsou ketolátky, které vznikají z kyseliny β-hydroxymáselné a acetonu. Ketolátky jsou za určitých podmínek přítomny v krvi nebo v moči (metabolismus tuků, poruchy metabolismu při diabetu). [8,9]
2.2. Využití karboxylových kyselin Organické kyseliny nacházejí využití v mnoha průmyslových odděleních. Je to zejména potravinářský, lékařský, farmaceutický nebo kožedělní průmysl. K rozmanitým průmyslovým účelům se používají kyselina mravenčí a octová (rozpouštědla, výchozí látky pro výrobu esterů, konzervace). Obě koncentrované kyseliny
patří
mezi
látky
žíravé.
Kyselina
mravenčí
má
široké
využití
v konzervárenství, při barvení látek a pro své baktericidní účinky také jako dezinfekční prostředek. Velké množství této kyseliny se spotřebuje i při zpracování kůží v kožedělném průmyslu. [4,11-14] Kyselina šťavelová je považována za toxickou látku. V lidském organismu váže vápenaté ionty do nerozpustné vápenaté soli. Kyselina ftalová se používá k výrobě syntetických vláken (polyesterů). Při výrobě polymerů se také uplatňují kyselina adipová a kyselina akrylová a od ní odvozené sloučeniny. [4,14] V potravinářském průmyslu se organické kyseliny čím dál více uplatňují jako potravinářská aditiva, neboli přídatné látky, které se k potravinám záměrně přidávají při výrobě, zpracování, skladování nebo balení z důvodu zvýšení jejich kvality (zlepšení vůně, chuti, barvy, výživové hodnoty i prodloužení trvanlivosti). [12] Ve farmaceutickém průmyslu je využívána kyselina octová a kyselina mléčná. Kyselina vinná slouží jako dávivý kámen. Kyselina salicylová a především její ester (kyselina acetylsalicylová) jsou významným lékem proti zánětu a horečce. Kyselina acetylsalicylová je účinnou látkou aspirinu. [5] Textilní průmysl využívá kyselinu octovou. Její ester je umělé acetátové hedvábí. Z kyseliny tereftalové se uměle vyrábí vlákno terilen. [5]
15
2.3. Charakteristika vybraných zástupců karboxylových kyselin 2.3.1. Kyselina citrónová
Obr. č. 1: Kyselina citrónová [14]
Jedná se o trikarboxylovou kyselinu, která obvykle krystalizuje jako monohydrát, který však v suchém prostředí snadno ztrácí vodu. Je snadno rozpustná ve vodě, methanolu, ethanolu a podobných polárních rozpouštědlech. [14] Je to kyselina silně hygroskopická, a proto se musí uchovávat v suchu nebo v hermeticky uzavřené sklenici. [11] Kyselina citrónová (Citr) přírodního původu se hojně vyskytuje v ovoci (především v citrónech, kde tvoří 7 – 9 % sušiny), v menším množství je obsažena i v ostatním ovoci, zvláště v rybízu, v malém množství i v bramborách a obilí, ve stopovém množství se vyskytuje v mléce a v mase. [12] V potravinářském
průmyslu
je
kyselina
citrónová
hojně
využívána
v konzervárenství ke snížení pH, působí jako antioxidant, je stabilizátorem barvy ve výrobcích z ovoce, umožňuje tvorbu některých pektinových gelů, srážení mléka chymosinem a zabraňuje tvorbě krystalů v cukrovinkách. [15] V organismu je kyselina citrónová biochemicky velmi významná, protože je součástí Krebsova cyklu, který se podílí na odbourávání bílkovin, tuků a sacharidů až na konečné produkty – oxid uhličitý a vodu. Tento cyklus reakcí je též označován jako cyklus kyseliny citrónové neboli citrátový cyklus. Citrát však hraje roli i v procesech glukoneogeneze, transaminace, deaminace a syntézy mastných kyselin. [5,15] 2.3.2. Kyselina fumarová
Obr. č. 2: Kyselina fumarová [14]
Kyselina fumarová (Fum) je organická nenasycená dikarboxylová kyselina. Přidává se do potravin jako regulátor kyselosti. Účastní se citrátového cyklu, kdy vzniká
16
ze sukcinátu pomocí sukcinátdehydrogenázy a na malát se mění pomocí fumarázy. Fumarát je zároveň produktem katabolismu některých aminokyselin a také vzniká u savců při detoxikaci amoniaku v močovinovém cyklu. [5,14]
2.3.3. Kyselina jablečná
Obr. č. 3: Kyselina jablečná [14]
Kyselina jablečná (Mal) je významná dikarboxylová kyselina. Může se vyskytovat ve dvou opticky aktivních formách. V přírodě byla zjištěna pouze v levotočivé L-formě, která je meziproduktem v cyklu citrónové kyseliny. Ve větším množství je obsažena v ovoci a zelenině, byla však dokázána i v mase, sýrech aj. [12] Je meziproduktem citrátového cyklu a procesu fiaxace oxidu uhličitého u C4 a CAM rostlin. Oxidací kyseliny jablečné vzniká kyselina oxaloctová. [5]
2.3.4. Kyselina jantarová
Obr. č. 4: Kyselina jantarová [14]
Kyselina jantarová (Suc) je běžnou složkou téměř všech rostlinných i živočišných tkání. Je metabolicky velmi významná (vzniká v citrátovém cyklu), jako anion sukcinát nebo jako acyl sukcinát (např. sukcinylkoenzym A). Její oxidací (dehydrogenací) vzniká kyselina fumarová. [14] Vyskytuje se jako přirozená složka v ovoci a v zelenině a také v nealkoholických nápojích. Nachází se v řepě, rebarboře, sýrech, masu, melase, medu, vejcích a v ovoci. Také je přítomna ve vínu a v pivu. V dozrávajícím ovoci jí ubývá shodně s poklesem intenzity dýchání. [12,13] V potravinářském průmyslu se používá jako jedna se složek zesilující chuťové vlastnosti masných výrobků. [12]
17
2.3.5. Kyselina malonová
Obr. č. 5: Kyselina malonová [14]
Kyselina malonová (Malon), neboli propandiová je významným metabolickým meziproduktem. Malonová kyselina se tvoří z acetylkoenzymu A přes karboxylaci závislou na biotinu a acetylkarboxyláze. [4]
2.3.6. Kyselina mléčná
Obr. č. 6: Kyselina mléčná [14]
Kyselina mléčná (Lac) patří k nejvýznamnějším hydroxykyselinám. Má jeden asymetrický uhlíkový atom, a může se tedy vyskytovat ve dvou opticky aktivních formách. L-mléčná kyselina je pravotočivá a bývá přítomna v mase a vnitřnostech, kde vzniká při tělesné námaze z glykogenu. Tvoří se také při mléčném kvašení cukrů. [12,14] Levotočivá D-forma kyseliny mléčné vzniká také při kvašení cukrů. Opticky inaktivní D, L-mléčná kyselina (racemická) se rovněž tvoří během kvašení za určitých podmínek. [12] Vápenaté soli mléčné kyseliny slouží jako potravinářská aditiva. Kyselina mléčná se používá jako okyselující a ochucující látka, zvýrazňuje chuť, zesiluje účinnosti antioxidantů a kontroluje pH. Účinkuje také jako antimikrobiální látka, rozpouštědlo a nosič. [16] Laktát cirkulující v krvi je produktem anaerobního metabolismu glukózy, a proto je významný markerem oxygenace tkání. [5]
18
2.3.7. Kyselina octová
Obr. č. 7: Kyselina octová [14]
Kyselina octová (Oct) je bezbarvá kapalina štiplavého zápachu. V těle se vyskytuje ve svalech, potu a moči. Je velmi rozšířená, jak volná, tak i ve formě derivátů. Její soli (octany, acetáty) i deriváty jsou významné v medicíně a biochemii. Důležitá je v metabolismu např. jako thioester s koenzymem A (acetylkoenzym A). [14] Používá se k výrobě acetátového hedvábí, v konzervárenství, pří výrobě léčiv (acylpyrin), její 5 – 8 % vodný roztok se běžně prodává jako ocet. Kvašením lihových roztoků vzniká kyselina octová také v přírodě. Jde o tzv. octové kvašení, způsobené některými druhy bakterií, které oxidují alkohol na kyselinu octovou. [17,18] Základem výroby kyseliny octové je oxidativní fermentace ethanolu. Proces katalyzuje systém octových bakterií. Koncentrovaná kyselina octová, tzv. ledová, tuhne již při 17°C. [17,19] 2.3.8. Kyselina oxaloctová
Obr. č. 8: Kyselina oxaloctová [14]
Kyselina oxaloctová (Oxal) je dikarobxylová kyselina vyskytující se převážně v ketoformě. V cyklu kyseliny citrónové je důležitým substrátem pro tvorbu citrátu (pomocí acetylkoenzymu A). Je také konečným produktem při odbourávání některých aminokyselin. [5,14] 2.3.9. Kyselina vinná
Obr. č. 9: Kyselina vinná [14]
19
Kyselina vinná (Tar) je dikarboxylová dihydroxy kyselina. Má dva asymetrické uhlíkové atomy, takže existuje pravotočivá D-forma, levotočivá L-forma, opticky inaktivní mesovinná a racemická kyselina. [12,14] V přírodě se nejčastěji vyskytuje D-vinná kyselina, zatímco L-forma se vyskytuje jen ojediněle a mesovinná kyselina nebyla vůbec v přírodě dokázána. Vinná kyselina neboli kyselina hroznová byla obvykle jako dihydrát dokázána ve šťávě hroznů, po nichž je pojmenována. [12] Nepatrné množství kyseliny vinné se nalézá i v některých jiných bobulích, jako je červený rybíz, angrešt a brusinky. V černém rybízu, v jablkách, borůvkách a v mnoha jiných druzích úplně schází. Soli kyseliny vinné jsou méně rozpustné než volná kyselina a vylučují se z hroznových šťáv a vín jako usazenina (vinný kámen). [13] Používá se v potravinářském (výroba prášku do pečiva) a chemickém průmyslu. [4]
20
3. Metody stanovení karboxylových kyselin Karboxylové kyseliny mohou být stanoveny použitím různých separačních technik. Tyto metody jsou zvláště vhodné pro identifikaci směsí organických kyselin. Nejčastěji používané jsou kapalinová chromatografie (LC), vysokoúčinné kapalinové chromatografie (HPLC), tenkovrstvá chromatografie (TLC), plynová chromatografie (GC) a kapilární elektroforéza (CE). [20,21] Nejrozšířenější metodou pro stanovení karboxylových kyselin je plynová chromatografie. Její výhodou je vysoká rozlišovací schopnost. Mezi nevýhody patří nutnost derivatizace analyzované látky a stejně jako u HPLC dlouhá doba analýzy. Nižší monokarboxylové a nižší dikarboxylové kyseliny lze analyzovat iontovou chromatografií. [8,20,21] Sledování obsahu karboxylových kyselin v potravinách je součástí kontroly kvality potravin, často k této kontrole se využívají chromatografické metody. Další možností je využití enzymových metod a elektromigračních technik. Velkou výhodou elektromigračních technik oproti chromatografickým je jednoduchá příprava vzorku, což je zvláště důležité pro rutinní analýzy velkých souborů vzorků. Také doba analýzy je obvykle kratší při stejné separační účinnosti. [12,22,23]
3.1. Plynová chromatografie Plynová chromatografie je fyzikální separační a analytická metoda, která má významnou úlohu v analýze těkavých látek. Používá se v mnoha průmyslových odvětvích, např. v chemickém, petrochemickém nebo farmaceutickém průmyslu. Významné uplatnění má v průmyslu organických syntéz. Převedení analytů na těkavé produkty pomocí derivatizace umožnilo širší aplikaci GC v lékařských, biologických a biochemických oborech. Standardně se využívá pro stanovení zbytků rozpouštědel v léčivech nebo pro stanovení stopových množství pesticidů v půdě, ve vodách a v potravinách. Má také velké využití při sledování kvality životního prostředí (aromatické polutanty v ovzduší a ve vodě, detekce pesticidů atd.). Mezi hlavní výhody této techniky patří jednoduché a rychlé provedení analýzy, účinná separace látek, vysoká citlivost a malé množství vzorku potřebné k analýze. [8,15,22] GC je separační metoda, která neposkytuje informace o struktuře látek ve vzorku. Při kvalitativní analýze v chromatografii se identifikace analytu provádí na základě srovnání retenčních dat analytu a standardu. Retenční data analytu odrážejí 21
specifické interakce analytu se stacionární a mobilní fází. Identifikace neznámých složek se provádí pomocí hmotnostní spektrometrie (MS). V současné době se často používá kombinace plynového chromatografu s plamenově ionizačním detektorem (GC-FID) nebo hmotnostním spektrometrem (GC-MS). [15] Tuto metodu lze použít k analýze dostatečně těkavých a teplotně stabilních organických látek. Některé nižší alifatické karboxylové kyseliny lze analyzovat přímo, vhodnější je však polární karboxylové kyseliny převést na těkavé estery. Plynovou chromatografií lze rovněž určit množství oxidu uhličitého vzniklé při kvantitativní dekarboxylaci [8].
3.2. Kapalinová chromatografie Nedostatky kapalinové chromatografie byly z počátku dány nízkým rozlišením. Spojení LC s MS, však rozšířilo její analytické možnosti, zejména pak v profilování metabolitů. Využití LC-MS je zaměřeno na diagnostiku v oblasti medicíny, ideální je pro profilování některých tělních tekutin. Ve farmaceutickém průmyslu je LC-MS hojně využívána pro analýzu rostlinných extraktů. [20] HPLC je metodou často používanou pro stanovení karboxylových kyselin. Organické kyseliny je možné stanovit iontově výměnnou chromatografií, iontově párovou chromatografií a chromatografií na reverzní fázi použitím vodných mobilních fází. [22,24,25] Iontově výměnnou chromatografií (IEC) se separace provádí pomocí silně kyselého iontoměniče a jako mobilní fáze se používají zředěné roztoky anorganických kyselin. Při separaci na reverzní fázi (RP) se používají kolony s nepolární stacionární fází. [22]
3.3. Enzymové metody Stanovení některých karboxylových kyselin (kyselina mléčná a jantarová) se nejčastěji provádí enzymově, s pomocí komerčních souprav. [7,26] Princip stanovení L-mléčné kyseliny: L-laktát + NAD+ pyruvát + L-glutamát
pyruvát + NADH+ + H+ L-alanin + 2-oxoglutarát
22
Množství NADH vznikajícího v první reakci je ekvivalentní množství L-mléčné kyseliny. Vznikající množství NADH je stanoveno měřením absorbance při 340 nm. Princip stanovení jantarové kyseliny: sukcinát + ITP + CoA IDP + PEP
IDP + sukcinyl-CoA + P
ITP + pyruvát
pyruvát + NADH + H+
L-laktát + NAD+
Množství oxidovaného NADH je ekvivalentní množství jantarové kyseliny a stanoveno měřením absorbance při 340 nm.
3.4. Elektromigrační metody Elektromigrační metody jsou jednoduché a nevyžadují složité úpravy vzorku. Kapilární elektroforéza (CE) se vyznačuje vysokou účinností, kratšími časy analýz a nižší provozní cenou spojenou s malou spotřebou vzorku a základních elektrolytů. CE ve spojení s MS má velký potenciál v metabolomických studiích. V oblasti farmakologie se CE-MS využívá pro analýzu rostlinných sekundárních metabolitů. [20] Pro stanovení kapilární zónovou elektroforézou je nutné zvolit nosný elektrolyt s takovou hodnotou pH, která co nejblíže odpovídá hodnotám pKa stanovovaných kyselin, aby byly ve vzorku přítomny ve formě iontů, které jsou disociovány a které lze následně separovat. [27] Kapilární izotachoforéza je vhodnou metodou pro identifikaci a stanovení karboxylových kyselin v potravinách. Její výhodou je jednoduchá úprava vzorku a krátký čas analýzy. [28]
23
4. Použití GC pro stanovení karboxylových kyselin Plynová chromatografie je velmi rozšířenou technikou pro stanovení karboxylových
kyselin.
V současnosti
se
nejvíce
kombinuje
s hmotnostním
spektrometrem, tedy s nejlepší analytickou technikou pro identifikaci a kvantifikaci stopových množství organických látek. K detekci karboxylových kyselin lze použít i plamenově ionizační detektor (FID). Karboxylové kyseliny mají relativně vysokou teplotu varu a malou tepelnou stabilitu. Proto jsou před analýzou převedeny (derivatizovány) na stabilnější deriváty (estery). Nicméně nutnost derivatizačních postupů a dlouhá doba analýzy na kapilární koloně patří mezi nevýhody GC metod. [8]
4.1. Princip metody GC Při analýze je vzorek vnesen mezi systém dvou vzájemně nemísitelných fází – stacionární a mobilní. Vzorek je umístěn na začátek stacionární fáze a pohybem mobilní fáze je unášen mezerami mezi částicemi porézní náplně stacionární fáze. Jednotlivé složky vzorku mohou být stacionární fází zachyceny a při pohybu se zdržují. Tím dochází k postupné separaci složek. [22,29] Prvním krokem při použití metody GC je odpaření vzorku v temperovaném dávkovacím zařízení (injektoru), následné oddělení jednotlivých složek směsi v chromatografické koloně, detekce každé složky a její vyhodnocení. [30] Vzorek z injektoru je zaveden do proudu nosného plynu, který protéká kolonou se stacionární fází umístěnou v termostatu. Při průtoku plynu kolonou se jednotlivé složky směsi pohybují různými rychlostmi ovlivněnými mírou interakce se stacionární fází. V důsledku toho se jednotlivé složky směsi oddělují a při výstupu z kolony mohou být kvantifikovány vhodným detektorem. [30] Separace probíhá v plynné fázi obvykle za teplotního gradientu (ohřev z počáteční teploty na konečnou dostatečně vysokou teplotu) v proudu nosného plynu. Mezi povrchem stacionární fáze a dělenými analyty v plynné fázi dochází k periodickému ustanovení rovnováhy, která je závislá na povaze analytu (bod varu, polarita, tvar molekuly) a použité stacionární fázi – následkem toho dochází k separaci (rozdílné eluci látek v závislosti na čase). [31] Metoda plynové chromatografie může být využívána jak ke kvantitativnímu stanovení analytu ve vzorku, tak ke kvalitativní analýze směsi neznámých vzorků.
24
Množství analytu je detekováno měřícím systémem. Jeho signál je funkcí obsahu analytu ve vzorku a citlivosti detekčního zařízení. [31]
Obr. č. 10: Zjednodušené schéma plynového chromatografu – FID [30]
4.2. Instrumentace 4.2.1. Nosný plyn – mobilní fáze Mobilní fáze je v plynové chromatografii představována nosným plynem. Jako zásobník tohoto plynu slouží tlaková lahev. Nosný plyn transportuje vzorek přes kolonu do detektoru. Musí být inertní nebo alespoň nereaktivní vzhledem ke stacionární fázi. Nejčastěji používaný je vodík, dusík nebo helium. Při volně nosného plynu se berou v úvahu následující faktory: viskozita, účinnost, čistota, reaktivita, separační schopnost, rychlost průtoku, typ používaného detektoru a kolony a cena plynu. [15,22,30]
4.2.2. Injektor Injektor je vstupním zařízením, kterým analyzovaná látka proniká do plynového chromatografu (kolony) společně s inertním plynem. Nástřik látky se nejčastěji provádí pomocí speciální injekční stříkačky přes septum, které odděluje vnitřek injektoru od vnějšího prostoru. Součástí injektoru je skleněná vložka (liner), ve které dochází při vysoké teplotě k rychlému odpaření vzorku a ke správnému promíchání par vzorku s nosným plynem. Mezi injektorem a kolonou je umístěn dělič toku (splitter), který umožňuje vést jen část odpařeného vzorku na kolonu (splitovací poměr, split ratio).
25
Technika nástřiku bez splitu (splitless injection) se používá při stopové analýze směsí látek, které se výrazně liší v bodu varu. [56]
Obr. č. 11: Schéma injektoru [32]
4.2.3. Kolona Kolona je část chromatografu, kde je uložena stacionární fáze. Dle skupenství stacionární fáze se plynová chromatografie dělí na chromatografii v systému plyn – pevná látka (plynová adsorbční chromatografie, GSC) a na chromatografii plyn – kapalina (plynová rozdělovací chromatografie, GLC). Podle charakteru analyzovaného vzorku se volí typ stacionární fáze. Při výběru platí, že stacionární fáze by měl mít podobný charakter jako analyzovaný vzorek. Stacionárních fází existuje mnoho druhů, ale v současné době se jejich výběr zúžil na několik typů, které jsou vyráběny na bázi polysiloxanů. [15,33] V koloně dochází ke zpomalení průchodu molekul zkoumané látky. Rychlost je závislá na délce kolony, na tlaku, pod kterým je směs vháněna dovnitř a na teplotě. Existují dva základní druhy kolon, které se používají v plynové chromatografii: náplňové a kapilární. Náplňové kolony se zhotovují ze skla nebo nerezové oceli. V dnešní době jsou nejpoužívanějším typem kolony kapilární pro jejich vyšší účinnost. Kapilární kolony jsou vyráběny z taveného křemene, jehož vnější povrch je potažen vrstvou polyimidu, což přispívá k větší pružnosti kolony. Vnitřní průměr kolon je 30 – 350 μm. Stacionární fáze je rozprostřena na vnitřních stěnách kapiláry. Podle specifikace můžeme kolony rozdělit na univezální a specifické, které se dále dělí podle efektu na nepolární a polární. Nepolární kolony jsou vhodné pro nepolární sloučeniny,
26
pořadí eluce odpovídá bodům varu dělených látek. Polární kolony se používají pro separaci polárních látek. [15,22,33] Kolona je umístěna v peci, která je temperována na určitou teplotu. Teplota je důležitá proměnná v plynové chromatografii. Pokud je teplota kolony během analýzy vzorku konstantní, jedná se o isotermální analýzu. Pro analýzu směsí látek s rozdílnými body varu je vhodné použít teplotního gradientu, kdy se teplota kolony během analýzy mění podle teplotního programu. Výhodou je zlepšení tvaru chromatografických píků (zúžení signálů, vyšší citlivost) a výrazné zkrácení doby analýzy. [15,22,33]
4.2.4. Detektor Zařízení, v němž dochází k převádění množství analytu, nejčastěji na elektrický signál. Je umístěn na výstupu z kolony a je spojen s hardwarovým zařízením zobrazujícím signály pro různé analyty. [22,34] V plynové chromatografii se využívá několik typů detektorů. Jsou děleny na univerzální a selektivní. Nejčastěji používaným univerzálním detektorem je plamenově ionizační detektor (FID). Mezi selektivní detektory patří detektor elektronového záchytu (ECD). V současnosti se často používá spojení GC s hmotnostním spektrometrem (MS). To umožňuje nejen detekci přítomnosti analytu, ale také jeho identifikaci na základě hmotnostního spektra. Mezi další detektory patří: tepelně vodivostní detektor (TCD), atomově emisní detektor (AED) nebo třeba fotoionizační detektor (PID). [15,22] Plamenově ionizační detektor (FID) V současné době je nejrozšířenějším detektorem v plynové chromatografii. Princip je založen na měření elektrického proudu procházejícího sběrnými metodami. Výstup z kolony ústí do hořáku, ve kterém je spalována směs vodíku, vzduchu a analytu vycházejícího z kolony. [15,22] Plyn z chromatografické kolony je zaváděn do kyslíko-vodíkového plamene, kde probíhají chemiionizační reakce vedoucí ke vzniku nabitých částic. Detektor se sestává z ocelové trysky, do které vstupuje směs nosného plynu, vodíku a doplňkového plynu. Na špičce mikrohořáku pak dochází v proudu vzduchu ke ionizaci této směsi na ionty, které se detekují na polarizovaných elektrodách. [15,22]
27
Obr. č. 12: Plamenově ionizační detektor (FID) [30]
FID poskytuje odezvu téměř na všechny organické látky. Výsledný signál je závislý na počtu C-H vazeb v molekule. Odezvu nedává většina anorganických plynů a par a některé organické látky (formaldehyd, tetrachlormethan). Nastavení průtoku vodíku a vzduchu je velmi důležité a musí být provedeno s ohledem na nosný plyn. Maximální linearity a citlivosti se dosahuje při optimálním poměru doplňkový plyn / vodík. Odchylky od optimálního poměru mají za následek nestabilní plamen a velký šum [15,22] Výhody: -
nižší pořizovací náklady, malý rozměr
-
vyšší dynamický rozsah
-
prakticky univerzální odezva pro uhlovodíky – využití při kvantitativní analýze
-
jako nosný plyn lze i N2
Nevýhody: -
více provozních plynů (nosný plyn, H2, vzduch)
-
detekce pouze sloučenin obsahujících C-H vazbu [31] 4.2.5. Pomocné plyny V detektorech se používají různé pomocné plyny podle způsobu detekce. FID
vyžaduje k vytvoření plamene směs syntetického vzduchu a vodíku, zatímco pro ECD se používá dusík a methan nebo jejich směs v argonu. V TCD je pomocný plyn shodný s nosným plynem. Stejně tak jako pro nosné plyny je i čistota pomocného plynu velmi důležitá pro výkon, údržbu a životnost detektoru. [30] 28
4.3. Záznam chromatogramu Chromatogram je grafický záznam závislosti napěťové odezvy detektoru na čase. Ze získaných chromatogramů lze vyhodnotit retenční parametry jednotlivých signálů, plochy a výšky píku. [15,22] 4.3.1. Kvalitativní vyhodnocování metody v GC Pro identifikaci látek je podstatné umístění maxima píku v chromatogramu. Toto umístění lze vyjádřit pomocí retenčních dat. Retenční čas Rt je pro látky za daných separačních podmínek (rozměry kolony, průtoková rychlost nosného plynu, teplota kolony, tlakový spád na koloně) charakteristikou vlastností. [22]
4.3.2. Kvantitativní vyhodnocování metody v GC Za předpokladu lineární odezvy detektoru je plocha úměrná množství látky. To umožňuje určovat množství či koncentraci dané látky v neznámém vzorku. Kvalita kvantitativní analýzy je především ovlivněna přípravou vzorků, správnou funkcí přístroje a kvalitou zpracování dat. [15,22] Metoda vnitřní normalizace Touto metodou se určuje obsah látek ve směsích, je-li počet komponent relativně nízký a všechny komponenty jsou známy. Množství určité komponenty se vyjadřuje jako relativní frakce z celku. Tedy, v určité směsi je x % látky A, y % látky B, z % látky C atd. Výsledky při použití této metody nezávisí na přesnosti objemu při nástřiku vzorku. [15,22] Metoda absolutní kalibrace Touto metodou se určuje absolutní koncentrace nebo absolutní množství látky na základě kalibrační závislosti. Protože u této metody je kritický objem nástřiku, závisí správnost metody na dobré reprodukovatelnosti dávkovaných objemů. Často se doporučuje pracovat s automatickým dávkovačem (autosampler). [15,22] Metoda vnitřního standardu Při této metodě se ke vzorku přidává určité množství známé látky, tzv. vnitřní standard. Tato látka nesmí být přítomna v původním vzorku, nesmí reagovat s žádnou 29
složkou vzorku, musí být dobře oddělena od všech složek v původním vzorku a musí eluovat v blízkosti stanovované složky. Výhodou této metody je, že není třeba znát přesný objem nástřiku vzorku. Navíc, s použitím vnitřního standardu se eliminuje vliv změn pracovních podmínek, protože jak stanovovaná složka, tak vnitřní standard jsou těmito změnami stejně ovlivněny. [15,22] Metoda standardního přídavku Při použití této metody se ke vzorku přidává známé množství stanovované látky. Z plochy píku látky obsažené ve vzorku a plochy píku po přidání definovaného množství látky ke vzorku lze vypočítat množství látky v původním vzorku. [15,22]
4.4. Příprava vzorku k analýze Plynová chromatografie se používá pro separaci a detekci těkavých látek. Sloučeniny obsahující funkční skupiny s aktivním vodíkem (-SH, -OH, -NH, -COOH) tvoří intermolekulární vodíkové vazby. Tyto vodíkové vazby působí na vlastní těkavost sloučenin, které tyto vazby obsahují, ovlivňuje jejich tendenci reagovat s materiály kolony, a dále má vliv na jejich tepelnou stabilitu. Modifikace funkční skupiny v molekule pomocí derivatizace umožňuje analýzu těchto látek. [35,36] Derivatizační proces by měl splňovat určitá kritéria. Se vzorkem by mělo být snadno manipulováno, a pokud je to možné, používat jedno činidlo. Důležité je, aby byla derivatizační reakce prováděna ve vodném prostředí. Reakce by měla být rychlá a probíhat za pokojové teploty. Požadováno je také malé množství levných činidel. Výsledný produkt by měl být více těkavý, méně polární, teplotně stabilní a analýza by měla dávat vysoký výtěžek. Mezi nejčastější derivatizační reakce patří silylace, alkylace a acylace. [35,36]
4.4.1. Silylace Tato reakce zahrnuje nahrazení aktivního vodíku trialkylsilylovou skupinou. Jedná se o nukleofilní substituci. Deriváty jsou těkavější a stabilnější než výchozí látka. Reaktivita funkčních skupin v silylačních reakcích klesá v následujícím pořadí: alkoholy > fenoly > karboxylové kyseliny > aminy > amidy > amidová / hydroxylová skupina. Použitý vzorek i rozpouštědlo musí být suché. Použitá rozpouštědla by měla být v co nejvyšší čistotě. Mnoho činidel vyžaduje zahřívání na teplotu, která není vyšší
30
než 60 °C po dobu asi 10 – 60 minut, aby se zabránilo rozpadu derivátu. Silylové látky jsou kompatibilní s většinou detekčních systémů, ale v případě, že jsou použity v nadbytku, můžou způsobit potíže s FID (tvorba oxidu křemičitého). Po přidání katalyzátoru se zvyšuje reaktivita činidla. [35,36]
Obr. č. 13: Reakční schéma silylace
4.4.2. Acylace Principem této metody je zavádění acylové skupiny do organické sloučeniny. Sloučeniny, které obsahují aktivní vodíky (např. –OH, -SH, -NH) mohou být nejdříve převedeny na estery, thioestery a amidy. V případě karboxylových kyselin, reakce zahrnuje zavedení acylové skupiny a ztrátu hydroxylové skupiny. [35, 36]
Obr. č. 14: Reakční schéma acylace
Acylace zlepšuje stability sloučenin, které jsou tepelně nestabilní vložením chránící skupiny do molekuly. Může poskytovat těkavost látkám, které mají mnoho polárních skupin, jsou netěkavé a obvykle se při zahřátí rozkládají (např. sacharidy nebo aminokyseliny). Nevýhodou acylačních činidel je, že jsou citlivá na vlhkost, jsou nebezpečná a zapáchající. Může být obtížné připravit acylační deriváty, protože reagují s jinými reakčními produkty, které musí být odstraněny dříve, než dochází k separaci pomocí plynové chromatografie. [35,36]
31
4.4.3. Alkylace Proces nahrazení aktivního vodíku alifatickou nebo alifaticky-aromatickou skupinou se nazývá esterifikace. Alkylační reakce se používají pro přípravu esterů, etherů, thioetherů, thioesterů, N-alkyaminů, amidů a sulfonamidů. [35,36]
Obr. č. 15: Reakční schéma alkylace
Produkty alkylace jsou méně polární než výchozí látky v důsledku nahrazení aktivního atomu vodíku za alkylovou nebo arylovou skupinu. Alkylestery mají dobrou stabilitu, což umožňuje jejich dlouhodobé skladování. Mezi často používaná činidla alkylace patří dimethylsulfát (DMS) a diethylsulfát (DES). Tato reakce se používá jako první krok pro další derivatizaci. [35, 36]
4.4.4. Reakce s alkyl chloroformiáty
Obr. č. 16: Typické reakce s alkyl chloroformiáty
Metoda derivatizace za použití alkyl chloroformiátů (ACF) je často používána především pro její jednoduchost. Výhodou této reakce je, že trvá řádově pár minut a probíhá i při pokojové teplotě a ve vodném prostředí. Podmínkou pro dobrý průběh reakce je udržení zásaditého pH reakční směsi. Při reakci je zapotřebí použít katalyzátor (pyridin nebo 3-pikolin). Náklady na použitá činidla jsou zanedbatelná. Použitím ACF
32
se zvyšuje citlivost detektoru a zlepšuje se separace úzce souvisejících analytů. [35,36,37,38]
Obr. č. 17: Reakce alkyl formiátu s karboxylovou kyselinou
33
Cíle práce Náplní této bakalářské práce je charakterizace karboxylových kyselin pomocí metody plynové chromatografie. K přípravě vzorku byla vybrána specifická reakce s alkyl chloroformiáty, vzhledem k tomu, že reakce probíhá ve vodném prostředí. Cílem experimentální části bylo osvojit si metodu derivatizace karboxylových kyselin pomocí alkyl chloroformiátů a oddělení derivatizovaných karboxylových kyselin od zbylé reakční směsi pomocí extrakce kapalina – kapalina pro stanovení pomocí plynové chromatografie v kombinaci s plamenově ionizačním detektorem. Dále optimalizovat postup derivatizace vybraných karboxylových kyselin, separačních podmínek a detekci ionizačním detektorem. Poté v rámci chromatografické analýzy charakterizovat jednotlivé karboxylové kyseliny pomocí retenčních časů, stanovit limit detekce a vytvořit kalibrační křivky. Dalším cílem je ověřit možnost stanovení karboxylových kyselin a aminokyselin (AMK) v jednom vzorku.
34
II.
Experimentální část
5. Použité přístroje -
Plynový chromatograf Bruker GC-450 -
Výrobce: Bruker Corporation, Billerica, Massachusetts, USA
-
Automatický nástřikový systém PC 8400
-
Nástřikový prostor -
Septum: 9 mm Marathon Center Guide
-
Liner: Gooseneck splitless liner, 4 mm x 6,5 mm x 78,5 mm for Varian GC
-
Kolona: ZB-50
-
Plamenově ionizační detektor (FID)
-
Vyhodnocovací software: Compass CDS
-
Tlakové lahve: -
-
-
-
Dusík (čistota 5.0) -
Nosný plyn
-
Výrobce: SIAD Czech spol., s.r.o. Praha, ČR
Vodík (čistota 5.0) -
Pomocný plyn (spalovací palivo pro FID)
-
Výrobce: SIAD Czech spol., s.r.o. Praha, ČR
Vzduch (čistota 5.0) -
Pomocný plyn (spalovací palivo pro FID)
-
Výrobce: SIAD Czech spol., s.r.o. Praha, ČR
Vortex MS2 Minishaker od firmy IKA®-Werke GmbH & Co. KG, Staufen, Německo
-
Ultrazvuk SONODREX Digitec od firmy BANDELIN electronic GmbH & Co. KG, Berlín, Německo
35
6. Použité chemikálie a materiál K přípravě vzorků pro testované postupy byly použity standardy CA o čistotě ≥ 98 % od firmy Sigma-Aldrich, Co., St. Louis, USA. Pro vybrané CA (Citr, Citram, Fum, Lac, Mal, Malon, Oct, Oxal, Ph-But, Suc, Tar) byly pomocí deionizované vody připraveny zásobní roztoky CA standardů o koncentraci 10 mM, které byly skladovány v lednici při teplotě 5°C. Pro jednotlivé analýzy byly zásobní roztoky podle potřeby ředěny. Jako vnitřní standard byla použita fenylbutanová kyselina. Pro přípravu vzorků byla používána tato derivatizační činidla: ECF (čistota ≥ 98 %) a PrCF (čistota 98 %). Všechna tato činidla byla od firmy Sigma-Aldrich, Co., St. Louis, USA. Do reakčních směsí byly přidávány tyto alkoholy: EtOH (čistota 99,8 %) a PrOH (čistota ≥ 99,9 %) od firmy Sigma-Aldrich, Co., St. Louis, USA. Jako katalyzátor byl používán pyridin (čistota 99,8 %) nebo 3-pikolin (čistota ≥ 99,5 %) od firmy Sigma-Aldrich, Co., St. Louis, USA. Další používané chemikálie pro přípravu vzorků byly hydroxid sodný (čistota ≥ 99 %), isooktan (čistota ≥ 99,8 %), chloroform (čistota ≥ 99,9 %), hexan (čistota > 99 %), 37% kyselina chlorovodíková a uhličitan sodný (p.a.). Všechny tyto látky byly od firmy Sigma-Aldrich, Co., St. Louis, USA. Příprava i analýza vzorků byla prováděna ve vialkách o objemu 1,5 ml od firmy Labicom s.r.o, Olomouc, ČR, za použití plastových šroubovacích víček se silikon/teflonovým septem (9 mm).
36
7. Metody přípravy vzorku Na základě literární rešerše byly vybrány postupy přípravy vzorku pro analýzu CA pomocí GC. Jedná se o nepřímé metody za použití derivatizačních činidel alkyl chloroformiátů. Tyto metody byly vybrány na základě hlavní výhody ACF, a to možnosti derivatizace ve vodném prostředí. Na základě získaných výsledků, byla navržena a optimalizována nejvhodnější metoda, aby byly získány nejvyšší výtěžky. Pro prvotní testování byly vybrány kyselina citrónová a jablečná. Jako blank byla použita voda vždy ve stejném množství jako vzorek a následně byl proveden stejný postup jako v případě vzorku obsahujícího karboxylovou kyselinu. U některých postupů bylo v rámci jedné metody testováno několik separačních analýz.
7.1. Metoda I K 600 µl vzorku (590 µl H2O + 10 µl roztoku CA) bylo přidáno 240 µl EtOH a 160 µl pyridinu. Reakční směs byla následně protřepána. K této směsi bylo přidáno 10 µl ECF a vše bylo opět protřepáno. Poté bylo přidáno 500 µl isooktanu s 1 % ECF. Celá směs byla protřepána na vortexu po dobu 1 minuty. Po oddělení fází (1 – 2 hodiny) bylo odebráno 400 µl vrchní (isooktanové) fáze k analýze na GC-FID. [39] Takto připravený vzorek byl měřen na GC-FID pomocí analýzy I a VI (viz. příloha č. 1).
7.2. Metoda II Ke 200 µl vzorku (190 µl H2O + 10 µl roztoku CA) byla přidána směs 40 µl NaOH (5%), 240 µl alkoholu a 120 µl katalyzátoru. Celá směs byla následně protřepána a bylo k ní přidáno 10 µl alkyl chloroformiátu. Opět došlo k protřepání směsi. Následně bylo přidáno 500 µl isooktanu s 1 % alkyl chloroformiátu. Reakční směs byla protřepána na vortexu po dobu 1 min. Po oddělení fází (1 – 2 hodiny) bylo odebráno 400 µl vrchní (isooktanové) fáze k analýze na GC-FID. [39] Tato metoda byla provedena ve 2 modifikacích (viz. tabulka č. 1). Vždy za použití jiného alkoholu, alkyl chloroformiátu a katalyzátoru. Takto připravený vzorek byl měřen na GC-FID pomocí analýzy I v případě A, a VIII v případě B (viz příloha č. 1).
37
Tab. č. 1: Schematické znázornění modifikací metody II
A
B 200 µl vzorku 40 µl NaOH (5 %)
240 µl EtOH
240 µl PrOH
120 µl pyridinu
120 µl 3-pikolinu
10 µl ECF
10 µl PrCF
500 µl isooktanu s 1 % ECF 500 µl isooktanu s 1 % PrCF
7.3. Metoda III Na základě získaných poznatků z předešlých experimentů byl vytvořen postup III. K 100 µl vzorku (90 µl H2O + 10 µl roztoku CA) byla přidána směs 300 µl NaOH (5%), 200 µl alkoholu a 50 µl 3-pikolinu. Celá směs byla promíchána na vortexu po dobu 10 s. Poté bylo přidáno 50 µl alkyl chloroformiátu a směs byla opět protřepána vortexem 10 s. Následně bylo přidáno 300 µl NaOH (5%) a 5 s třepáno na vortexu. Poté bylo přidáno 500 µl isooktanu nebo hexanu a vše promícháno na vortexu 5s. Poté byl přidán znovu alkyl chloroformiát v množství 20 µl a celá reakční směs byla míchána na vortexu po dobu 10 s. Po ustálení fází bylo odebráno 400 µl vrchní (isooktanové nebo hexanové) fáze k analýze na GC-FID. Tato metoda byla provedena v 5-ti modifikacích (viz. tabulka č. 2). Testoval se vliv 2 přídavků NaOH, 2 typů alkoholů a alkyl chloroformiátů a také vliv sonikace. Takto připravený vzorek byl měřen na GC-FID pomocí analýzy I, VII (v případě A), II, VII, VIII, X (v případě B), VII, VIII (v případě C) a VIII (v případě D a E), (viz příloha č. 1).
38
Tab. č. 2: Schematické znázornění modifikací postupu III
A
B
C
D
E
100 µl vzorku 300 µl NaOH
-
200 µl EtOH
200 µl PrOH 50 µl 3-pikolinu
50 µl ECF
50 µl PrCF -
300 µl NaOH
300 µl NaOH
sonikace 1 min -
300 µl NaOH
300 µl NaOH
500 µl isooktanu nebo hexanu 20 µl ECF
20 µl PrCF -
sonikace 1 min
7.4. Metoda IV K 100 µl vzorku (80 µl H2O + 10 µl 1M HCl + 10 µl roztoku CA) byla přidána směs 100 µl PrOH, 10 µl PrCF a 20 µl 3-pikolinu. Cela směs byla jemně promíchána. Následně k ní bylo přidáno 300 µl chloroformu a 100 µl Na2CO3 (1M). Směs byla protřepána na vortexu po dobu 30 s. Poté došlo k ustálení fází a byla odsáta vrchní vrstva a ke spodní fázi bylo přidáno 150 µl chloroformu. Poté bylo odebráno 200 µl spodní (chloroformové) fáze k analýze na GC-FID. [40] Takto připravený vzorek byl měřen na GC-FID pomocí analýzy XI (viz. příloha č. 1).
7.5. Metoda V Ke 200 µl vzorku (180 µl H2O + 20 µl roztoku CA) bylo přidáno 20 µl NaOH (20 %), 200 µl směsi alkohol – katalyzátor (v poměru 7:1) a 50 µl směsi isooktan – alkyl chloroformiát (v poměru 5:1). Celá směs byla protřepána na vortexu. Dále bylo do reakční směsi přidáno 20 µl NaOH (20 %), 50 µl směsi isooktan – alkyl chloroformiát (v poměru 5:1) a 100 µl chloroformu s 2 % alkyl chloroformiátu. Směs byla protřepána a následně k ní bylo přidáno 100 µl Na2CO3 (5 %). Směs byla znovu protřepána a po ustálení fází byla odsáta vrchní vrstva. Ke spodní vrstvě bylo přidáno 150 µl HCl (3,7
39
%) a směs byla promíchána. Poté bylo odebráno 100 µl spodní fáze k analýze na GCFID. [41] Tato metoda byla provedena ve 3 modifikacích (viz. tabulka č. 3). Testoval se vliv dvou typů alkoholů a alkyl chloroformiátů a také vyšší přídavek chloroformu. Takto připravený vzorek byl měřen na GC-FID pomocí analýzy XII (viz. příloha č. 1). Tab. č. 3: Schematické znázornění modifikací metody V
A
B
C 200 µl vzorku 20 µl NaOH
200 µl směsi EtOH – 3-pikolin (7:1)
200 µl směsi PrOH – 3-pikolin (7:1)
50 µl směsi isooktan – ECF (5:1)
50 µl směsi isooktan – PrCF (5:1)
20 µl NaOH 50 µl směsi isooktan – ECF (5:1) 100 µl chloroformu se 2 % ECF
50 µl směsi isooktan – PrCF (5:1)
200 µl chloroformu se 2 % ECF
200 µl chloroformu se 2 % PrCF
100 µl Na2CO3 150 µl HCl
7.6. Metoda VI Na základě získaných poznatků z předešlých experimentů byl vytvořen postup VI. K 100 µl vzorku (90 µl H2O + 10 µl roztoku CA) bylo přidáno 300 µl NaOH (5 %), 200 µl PrOH a 50 µl 3-pikolinu. Tato směs byla protřepána na vortexu po dobu 10 s. Poté bylo přidáno 20 µl PrCF a následně opět protřepáno na vortexu po dobu 10 s. Následně bylo přidáno 100 µl chloroformu a směs byla míchána na vortexu 10 s. Ke směsi bylo přidáno 300 µl NaOH (5 %) a vše opět promícháno pomocí vortexu po dobu 5 s. Následně bylo přidáno 500 µl isooktanu a opět protřepáno na vortexu 5 s. K celé směsi bylo nakonec přidáno 20 µl PrCF a celá reakční směs byla míchána na vortexu po dobu 10 s. Po ustálení fází bylo odebráno 400 µl vrchní (isooktanové) fáze k analýze na GC-FID. Takto připravený vzorek byl měřen na GC-FID pomocí analýzy III, IV, V, IX, XIII (viz příloha č. 1). 40
7.7. Metoda VII K 100 µl vzorku (50 µl H2O + 50 µl roztoku CA) bylo přidáno 16 µl pyridinu, 84 µl PrOH a 50 µl směsi isooktan – PrCF (v poměru 5:1). Tato směs byla protřepána. Následně k ní bylo přidáno 20 µl NaOH (5 %) a vše bylo opět promícháno. Poté bylo přidáno 50 µl směsi isooktan – PrCF (v poměru 5:1) a směs byla protřepána. Následně bylo přidáno 100 µl chloroformu se 2 % PCF. Směs byla protřepána a v posledním kroku k ní bylo přidáno 100 µl Na2CO3 (5 %) a 150 µl HCl (5 %). Celá reakční směs byla promíchána na vortexu a po oddělení fází bylo odebráno 100 µl vrchní (isooktanové) fáze k analýze na GC-FID. [41] Takto připravený vzorek byl měřen na GC-FID pomocí analýzy XIII (viz. příloha č. 1).
41
8. Optimalizace metody Ze získaných výsledků poskytovala nejvyšší odezvu metoda VI. Proto byla vybrána pro následnou optimalizaci pro zvýšení výtěžku a citlivosti. Jako vzorek byla analyzována kyselina citrónová a fenylbutanová. Tato metoda byla provedena v 7 modifikacích (viz. tabulka č. 4). Testovaly se různé přídavky NaOH a PrCF. Dále se vyzkoušely dva typy katalyzátorů (3-pikolin a pyridin). Takto připravený vzorek byl měřen na GC-FID pomocí analýzy V (v případě A a C), V, XIII (v případě B), a XIII (v případě D –G), (viz. příloha č. 1). Tab. č. 4: Schematické znázornění modifikací metody VI
A
B
C
D
E
F
G
200 µl NaOH
400 µl NaOH
300 µl NaOH
20 µl PrCF
40 µl PrCF
20 µl PrCF
-
100 µl vzorku 300 µl NaOH 200 µl PrOH 50 µl 3pikolinu 10 µl PrCF
50 µl pyridinu 20 µl PrCF
10 µl PrCF
20 µl PrCF
20 µl PrCF
100 µl chloroformu 300 µl NaOH
500 µl isooktanu
10 µl PrCF
20 µl PrCF
10 µl PrCF
20 µl PrCF
42
20 µl PrCF
9. Výsledky V této kapitole jsou shrnuty výsledky všech testovaných postupů a modifikací, které jsou graficky vyhodnoceny. Dále jsou zde uvedeny experimentálně získané retenční časy, chromatogram průběhu stanovení CA, limity detekce a parametry kalibračních křivek jednotlivých testovaných karboxylových kyselin.
9.1. Výsledky měření testovaných postupů Kyselina citrónová a jablečná byly vybrány jako nejvhodnější zástupci karboxylových kyselin pro testování všech 7 metod přípravy vzorku. V rámci měření, nejlepší odezvu poskytovala metoda VI (viz graf č. 1). Následně byla tato metoda optimalizována pro dosažení co nejlepší citlivosti.
350
Citr Mal
300
A [V.min-1]
250 200 150 100 50 0
met I
met II met III met IV met V met VI met VII
metody Graf č. 1: Přehled ploch píků vybraných CA získaných různými metodami
Zbylé metody nevykazovaly žádnou odezvu na výše uvedené karboxylové kyseliny. V rámci testovaných metod byl sledován vliv parametrů vodné i organické fáze na výtěžek derivatizace citrónové a jablečné kyseliny. U metody III byl testován vliv isooktanu nebo hexanu. Za použití hexanu, analýza prakticky neprobíhala. V případě metody III byl také sledován vliv sonikace, který je v literatuře často doporučován pro zvýšení výtěžku. V našem případě však sonikace neměla na výsledek žádný vliv. 43
9.2. Výsledky optimalizace metody VI Optimalizace metody VI spočívala ve změně parametrů vodné fáze a to různých přídavků činidel a katalyzátorů. Výsledky výše uvedených modifikací metody VI jsou shrnuty v grafu č. 2.
12000
Citr Ph-But
10000
-1 A [V.min ]
8000 150
100
50
G od if m
m
od if
F
E m
od if
D m
od if
C m
od if
B od if m
m
od if
A
0
Graf č. 2: Přehled ploch píků vybraných CA získaných různými modifikacemi metody VI
Z výsledků je patrné, že odezvu poskytovaly pouze 2 modifikace (modifikace C, G) Řádově vyšší výtěžky byly u modifikace G, která má zjednodušený postup a proto byl vybrána pro další analýzu. Touto metodou pak byly analyzovány všechny vybrané kyseliny společně s vnitřním standardem (IS), kyselinou fenylbutanovou.
44
9.3. Identifikace karboxylových kyselin Optimalizovanou metodou VI byly analyzovány všechny vybrané karboxylové kyseliny (Citr, Citram, Fum, Lac Mal, Malon, Oxal, Suc, Tar a Ph-But jako vnitřní standard IS). V rámci analýzy byly stanoveny retenční časy, limit detekce a vytvořeny kalibrační křivky. 9.3.1. Retenční časy Analýzou na GC-FID bylo zjištěno, že některé CA poskytují více charakteristických píků. Jejich retenční časy (Rt) jsou shrnuty v tabulce č. 5. Retenční časy byly určeny u všech stanovovaných kyselin vyjma kyseliny octové, jejíž modifikací vzniká propyl acetát, který má bod varu blízký bodu varu isooktanu. Propylacetát ko-eluoval s isooktanem, a tudíž nebyl detekován. Průběh analýzy kompletního vzorku CA je znázorněn na chromatogramu (obr. č. 18). Tab. č. 5: Retenční časy stanovovaných karboxylových kyselin
Retenční časy (Rt) [min]
CA
pík 1
pík 2
pík 3
Citr
14,832 ± 0,002
Citram
9,600 ± 0,000
14,234 ± 0,005
Fum
8,640 ± 0,009
9,053 ± 0,007
Lac
8,848 ± 0,004
13,060 ± 0,000
Mal
8,633 ± 0,007
9,049 ± 0,004
14,477 ± 0,006
Malon
7,490 ± 0,006
8,505 ± 0,006
12,523 ± 0,004
Oxal
7,830 ± 0,000
14,665 ± 0,005
16,557 ± 0,004
Ph-But *
11,397 ± 0,005
Suc
8,645 ± 0,000
8,842 ± 0,011
Tar
7,504 ± 0,016
13,640 ± 0,004
Oct
NI
14,866 ± 0,004
pík 4
pík 5
14,516 ± 0,004
15,658 ± 0,004
18,526 ± 0,004
* vnitřní standard (IS)
9.3.2. Limit detekce Dalším stanoveným parametrem měření je limit detekce (LOD), který odpovídá nejmenší koncentraci analytu ve vzorku, které může být detekováno. Mez detekce závisí na poměru signál/šum. V separačních metodách se limit detekce vyjadřuje jako trojnásobek šumu základní linie. U provedených měření činil LOD 20 μV.
45
46
Obr. č. 18: Chromatogram průběhu analýzy karboxylových kyselin a jejich identifikace
9.3.3. Kalibrační křivky Pro sestrojení kalibračních křivek, byly připraveny vzorky, které obsahovaly karboxylové kyseliny v rozmezí koncentrací 1 nM až 10 mM. Odezvu daného analytu převyšující LOD splňovaly až vzorky, obsahující karboxylové kyseliny o koncentraci 10 popřípadě 100 μM. Získané výsledky byly extrapolovány vůči internímu standardu (Ph-But). Lineární odezva byla pozorována pouze v rozmezí 10 μM až 10 mM a na základě těchto hodnot byly sestrojeny kalibrační křivky (viz. graf č. 4 a 5), jejichž parametry jsou uvedeny v tabulce č. 6. U kyseliny mléčné (pík 2), kyseliny malonové (pík 2), kyseliny oxaloctové (pík 1) a kyseliny jantarové (pík 2) nebyla u některých píků sestavena kalibrační křivka z důvodu nedostatku dat. V těchto případech byl pík detekován pouze u nejvyšší koncentrace vzorku (10 mM). Použitá metoda nebyla dostatečně citlivá pro vzorky obsahující karboxylové kyseliny o koncentraci 1nM až 1 μM.
7000 y= 0,6016x + 7,7506 2 R = 0,9999
6000
-1 A [V.min ]
5000 4000 3000 2000 1000 0 0
2000
4000
6000
8000
10000
cPh-But [M] Graf č. 3: Lineární regrese kalibrační křivky interního standardu (Ph-But) v rozmezí koncentrací 1 μM až 10 mM
V případě kyseliny citrónové byl zaznamenán pouze jeden charakteristický pík, zatímco u kyseliny jablečné byly identifikovány 3 píky. Pík kyseliny citrónové vykazoval linearitu u koncentrací 10 μM až 10 mM.
47
y = 0,1879x + 0,0955 2 R = 0,9994
2,5
A / A Ph-But
2,0
1,5
1,0
0,5
0,0 0
2
4
6
8
10
cCitr [mM]
Graf č. 4: Lineární regrese kalibrační křivky pro Citr o koncentracích 10 μM až 10 mM
U kyseliny jablečné byly sestrojeny kalibrační křivky pro všechny 3 píky. Lineární odezvu v rámci koncentračního rozsahu 10 μM až 10 mM vykazoval pouze 1 pík.
y = 1,5454x - 0,0569 2 R = 0,9996
Pík 1 (Rt = 8,63 min)
16
Pík 2 (Rt = 9,05 min)
14
Pík 3 (Rt = 14,48 min)
A / A Ph-But
12 10 8
y = 0,3693x - 0,0814 2 R = 0,9988
6 4
y = 0,2731 - 0,0293 2 R = 0,9994
2 0 0
2
4
6
8
10
cMal [mM]
Graf č. 5: Lineární regrese kalibrační křivky pro Mal o koncetracích 10 μM až 10 mM
48
Tab. č. 6: Parametry kalibračních křivek y = ax + b
CA Citr Citram Fum Lac
Mal
Malon
Oxal
Suc
Tar
pík 1 (Rt = 14,83 min) pík 1 (Rt = 9,60 min) pík 2 (Rt = 14,23 min) pík 1 (Rt = 8,64 min) pík 2 (Rt = 9,05 min) pík 1 (Rt = 8,85 min) pík 2 (Rt = 13,06 min) pík 1 (Rt = 8,63 min) pík 2 (Rt = 9,05 min) pík 3 (Rt = 14,48 min) pík 1 (Rt = 7,49 min) pík 2 (Rt = 8,51 min) pík 3 (Rt = 12,52 min) pík 4 (Rt = 14,52 min) pík 5 (Rt = 15,66 min) pík 1 (Rt = 7,83 min) pík 2 (Rt = 14,67 min) pík 3 (Rt = 16,56 min) pík 1 (Rt = 8,65 min) pík 2 (Rt = 8,84 min) pík 1 (Rt = 7,50 min) pík 2 (Rt = 13,64 min) pík 3 (Rt = 14,87 min) pík 4 (Rt = 18,53 min)
a
b
R2
0,1879 0,2603 0,1129 0,8247 0,4448 2,057 NI 1,5454 0,2731 0,3693 2,2203 NI 0,1447 0,0683 0,0467 NI 0,0214 0,0396 NI 0,8326 0,0955 0,0323 1,7520 0,2498
0,0955 -0,0332 0,0334 0,1279 0,0134 -0,0733
0,9994 0,9997 1 0,9986 0,9873 0,9998
-0,0569 -0,0293 -0,0814 -0,7174
0,9996 0,9994 0,9988 0,9638
-0,0494 0,0164 0,0029
0,9924 0,9747 0,9879
0,0589 0,1444
0,9596 0,9873
0,2911 -0,0235 0,0125 -0,6203 0,0453
0,9611 0,9813 0,9344 0,9950 0,9044
7,7506 0,9999 Ph-But (IS) * pík 1 (Rt = 11,40 min) 0,6016 * hodnoty IS fenylbutanové kyseliny nebyly vztaženy vůči dalšímu standardu NI – pík detekován pouze u nejvyšší koncetrace (10 mM) a tudíž nebyla vytvořena kalibrační závislost
49
Diskuze Cílem této bakalářské práce bylo najít a optimalizovat nejvhodnější metodu pro analýzu CA pomocí GC-FID. Práce se zaměřila na metodiku přípravy vzorku a následně na optimalizaci dostupných postupů separace pomocí plynové chromatografie. Na základě dostupné literatury byla vybrána metoda derivatizace karboxylových kyselin pomocí alkyl chloroformiátů. Výhodou této metody jsou nízké náklady na reakční činidla a možnost derivatizace ve vodném prostředí s následným přenosem modifikovaného analytu do organické fáze. Nevýhodou této metody byla tvorba mnoha vedlejších produktů, které nebyly identifikovány pomocí FID. Pro derivatizaci karboxylových kyselin za použití ACF bylo na základě literární rešerše vybráno několik postupů, které byly následně modifikovány. Ze získaných výsledků je patrné, že funkční byla pouze jedna metoda. Tato metoda byla následně optimalizována na základě získaných výsledků a zkušeností z předešlých postupů. Derivatizační reakce probíhá pouze za přítomnosti bazického katalyzátoru Nejčastěji v literatuře [37,41] doporučované jsou pyridin a 3-pikolin, které byly také v rámci optimalizace metody porovnávány. Vyšší odezvy CA byly pozorovány v případě použití pyridinu. Souběžně bylo nutné optimalizovat poměr přidávaného alkoholu vůči množství dalších činidel [37] a mimo jiné také správná volba kombinace ACF a alkoholu. V tomto případě je nutné podotknout nutnost použití analogických alkoholů a ACF, aby nedocházelo ke tvorbě dvou různých derivátů při derivatizaci na karboxylové skupině. Z důvodu nízké polarity derivátů je zapotřebí vyextrahovat tyto látky do organické fáze nemísitelné s vodou. V rámci optimalizace extrakce vytvořených esterů do nepolární fáze byla testována různá s vodou nemísitelná organická rozpouštědla. Jako nejúčinnější byla shledána směs chloroform-isooktan. Touto metodou byly až na kyselinu octovou identifikovány všechny stanovované karboxylové kyseliny. Jako interní standard byla použita fenylbutanová kyselina, která poskytuje výrazně vyšší signál v porovnání se zbývajícími CA. Vůči hodnotám tohoto interního standardu, byly vztaženy plochy píků stanovovaných karboxylových kyselin. Pomocí kalibračních křivek, které se podařilo sestrojit pro 10 z 11 identifikovaných karboxylových kyselin, byla sledována citlivost metody a byl stanoven limit detekce. V případě kyseliny mléčné, malonové, oxaloctové a jantarové nebylo možné sestavení kalibrační závislosti u jednoho píku kvůli vysokému limitu detekce. Analýzy byly
50
prováděny na sadách vzorků o koncentracích od 1 nM do 10 mM. Linearita však byla zaznamenána pouze v oblasti od 10 μM do 10 mM. Získané výsledky nedosahovali dostatečné citlivosti a limit detekce byl poměrně vysoký a splňovaly ho pouze vzorky s koncentrací CA 10 μM a vyšší. Důvodem je vznik více produktů CA. Pouze u kyseliny citrónové byl zaznamenán jeden pík. Ostatní kyseliny reakcí s ACF vytváří dimery, trimery, případně další adukty, snižující signál majoritního produktu. Z tohoto důvodu je jejich identifikace obtížnější. Derivatizací CA vznikají látky, které mají velmi blízký bod varu. Z tabulky č.6 je patrné, že vzniklé deriváty těchto CA na základě retenčních časů mohou koeluovat, a tudíž dané píky ve směsi nemohou být využity pro signifikantní určení množství dané CA, jak je patrné z obrázku č. 18. Aby bylo dosaženo dostatečné separace CA je nutné změnit rychlost nárůstu teploty při separaci v kapilární koloně. Tento krok je spojen s prodloužením doby analýzy daného vzorku. Mimo jiné, našim cílem bylo ověřit možnost stanovení CA a AMK ve směsi pomocí reakce s ACF. V tomto případě metoda VI představuje optimalizovanou metodu pro stanovení AMK. Pro CA tato metoda není zcela vhodná, její modifikací bylo dosaženo výrazného zvýšení signálu CA. Z výsledků je patrné, že vhodnějším katalyzátorem pro derivatizaci CA je pyridin než 3-pikolin, který je využíván při derivatizaci AMK. Princip derivatizace CA, který byl zde používán, poskytuje nižší výtěžky a citlivost ve srovnání s literaturou [42-46], a proto by bylo vhodné metodu dále zefektivnit například zakoncentrováním vzorku. Dalším krokem ke zlepšení by mohlo být použití čistějších katalyzátorů a dalších používaných chemikálií, aby byly eliminovány vznikající vedlejší produkty, jejichž přítomnost je dobře patrná z obrázku č. 18. Vedle optimalizace derivatizační metody je nutné také pozměnit postup analýzy na GC-FID. V tomto případě se jedná o snížení rychlosti teplotní eluce v oblastech, kdy retenční časy cílových analytů získané při jednotlivých měřeních jsou velmi blízké. Změnou tohoto parametru by mělo dojít k výraznějšímu rozdělení analytů, které mají velmi blízký bod varu.
51
Souhrn Tato bakalářská práce se zabývá možnostmi stanovení karboxylových kyselin. V teoretické části byly charakterizovány karboxylové kyseliny a na základě dostupné literatury shrnuty možnosti jejich stanovení. V experimentální části byly přímo testovány a optimalizovány vhodné metody pro jejich stanovení ve vzorku pomocí plynové chromatografie s plamenově ionizačním detektorem. Na základě testování několika metod byl vyvinut postup používající reakční směsi skládající se z propyl chloroformiátu, propanolu, chloroformu, isooktanu a pyridinu, který slouží jako katalyzátor. Zvolená separační metoda poskytovala i přes přítomnost mnoha vedlejších produktů dostatečné rozlišení signálu stanovovaných látek. Vytvořená a optimalizovaná metoda byla i přes nedostatky u většiny z analyzovaných karboxylových kyselin úspěšná, avšak bylo by vhodné tuto metodu dále modifikovat, aby bylo dosaženo vyššího výtěžku dané derivatizační reakce.
52
Summary This thesis deals with the possibilities of determination of carboxylic acids. In the theoretical part, the carboxylic acids were characterized and on the basis of the available literature summarized determination options. In the experimental part were directly tested and optimized methods for their determination in the sample by gas chromatography with a flame ionization detector. By testing several methods a procedure using a reaction mixture consisting of propyl chloroformate, propanol, chloroform, isooctane and pyridine as a catalyst has been developed. The chosen separation method despite the presence of many by-products provide sufficient signal of analytes. Created and optimized method was successful despite shortcomings in most of the analyzed carboxylic acids, but it would be desirable to further modify this method to achieve higher yield of the derivatization reactions.
53
Seznam použité literatury 1. ČELADNÍK M. Organická chemie. 1. vyd. Praha: Avicenum, zdravotnické nakladatelství, 1990, 596 s. ISBN 80-201-0093-8 2. McMURRY J. Organická chemie. 1. vyd. Praha: VŠCHT, 2007, 1270 s. ISBN 97880-7080-637-1 3. PACÁK J. Poznáváme organickou chemii. 1. vyd. Praha: SNTL, 1989, 384 s. ISBN 80-03-00185-4 4. Wikipedia. [online]. [cit. 2014-03-20]. Dostupné z: http://en.wikipedia.org 5. Organické (karboxylové) kyseliny a jejich deriváty. [online]. [cit. 2014-03-17]. Dostupné z: http://ciselniky.dasta.mzcr.cz/hypertext/200630/hypertext/_TRIDAK_ ORGA.htm 6. Multimediální učebnice chemie. [online]. [cit. 2014-03-17]. Dostupné z: http://www.e-chembook.eu/cz/organicka-chemie/karboxylove-kyseliny 7. Chemie potravin – praktická cvičení. [online]. [cit. 2014-03-17]. Dostupné z: http://cit.vfu.cz/ivbp/wp-content/uploads/2011/07/Chemie-potravin.pdf 8. KŘŮMAL K., MIKUŠKA P., VEČEŘA Z. Zdroje, výskyt a analýza karboxylových kyselin v ovzduší. Chemické Listy. 103 (2009) 277-283 9. MURRAY R. K. Harperova biochemie. 4. vyd. Praha: H & H, 2002, 872 s. ISBN 8073190133 10. VODRÁŽKA Z. Biochemie 2. 1.vyd. Praha: Academia, 1992, 136 s. ISBN 80-2000441-6 11. BALAŠTÍK J. Konzervování v domácnosti. 1. vyd. Kyjov: Ottobre 12, 2001, 234 s. ISBN 80-86528-07-3 12. DAVÍDEK J., JANÍČEK G., POKORNÝ J. Chemie potravin. 1. vyd. Praha: SNTL, 1983, 632 s. 13. KYZLINK V. Základy konzervace potravin. 1. vyd. Praha: SNTL, 1980, 516 s. 14. Wikipedia. [online]. [cit. 2014-03-17]. Dostupné z: cs.wikipedia.org 15. Plynová chromatografie. [online]. [cit. 2014-04-20]. Dostupné z: http://cheminfo.chemi.muni.cz/chem_sekce/predmety/C7300/GC/uvod.pdf 16. VRBOVÁ T. Víme, co jíme? aneb Průvodce „Éčky“ v potravinách. 1. vyd. Praha: EcoHouse, 2001, 276 s. ISBN 80-238-7504-3 17. BENEŠOVÁ M., SATRAPOVÁ H. Odmaturuj z chemie. 1. vyd. Brno: Didaktis, 2002, 208 s. ISBN 80-86285-56-1
54
18. Chemical of the Week: Acetic acid & Acetic anhydride [online]. [cit. 2014-05-06]. Dostupné z: http://scifun.chem.wisc.edu/chemweek/pdf/aceticacid.pdf 19. NEISER J., HAUZAR I., KRAITR M., JELÍNEK F. Obecná chemická technologie. 1. vyd. Praha: Státní pedagogické nakladatelství, 1981, 288 s. 20. MUSILOVÁ J., GLATZ Z. Metabolomika – základní pojmy, strategie a metodologie. Chemické Listy. 105 (2011) 745-751 21. WOJTOWICZ P., JANEČKOVÁ H., FRIEDECKÝ D., ADAM T., Techniky metabolimiky v biomedicíně. Chemické Listy. 107 (2013) 3-11 22. KLOUDA P. Moderní analytické metody. 2. upr. vyd. Ostrava: Pavel Klouda, 2003, 132 s. ISBN 80-86369-07-2 23. STRÁNSKÝ Z. Analýza organických sloučenin. 1. vyd. Olomouc: Univerzita Palackého, 1981, 235 s. 24. LODIN S., ROSSIN G. Determination of some organic acids in sugar factory products. Journal of Chromatography A. 706 (1995) 375-383 25. SCHWARZENBACHER R. High performace of liquid chromatography of carboxylic acid. Journal of Chromatography. 251 (1982) 339-358 26. MÍKOVÁ K., DAVÍDEK, J. Kritéria čerstvosti a kvality slepičích vajec. Czech Journal of Food Science. 18 (2000) 250-255 27. CHURÁČEK J. Analytická separace látek. 1. vyd. Praha: SNTL, 1990, 384 s. ISBN 80-03-00569-8 28. BOČEK P., PAVELKA S., GRÍGEROVÁ K., DEML M., JANÁK J. Determination of lactic and acetic acid in silage extraxts by analytical isotachophoresis. Journal of Chromatography. 154 (1978) 356-359 29. ŠVEC F. Co dnes hýbe kapalinovou chromatografií?. Chemické listy 103 (2009) 266-270 30. Linde Gas. [online]. [cit. 2014-04-20]. Dostupné z: http://www.lindegas.cz/cs/index.html 31. Plynová chromatografie. [online]. [cit. 2014-04-20]. Dostupné z: http://chemistry.ujep.cz/userfiles/files/prednaska%20MS%20v%202014-2.pdf 32. Gas Chromatography. [online]. [cit. 2014-03-20]. Dostupné z: http://teaching.shu.ac.uk/hwb/chemistry/tutorials/chrom/gaschrm.htm 33. VOLKA K. a kol. Analytická chemie II. Praha: VŠCHT, 1995, 236 s. ISBN 807080-227-8 34. ŠTULÍK K. a kol. Analytické separační metody. Univerzita Karlova v Praze: Karolinum, 2005, 264 s. ISBN 80-246-0852-9
55
35. CASAS FERREIRA A. M., FERNANDEZ LAESPADA M. E., PEREZ PAVON J. L., MORENO CORDERO B. In situ aqueous derivatization as sample preparation technique for gas chromatographic determinations. Journal of Chromatography A. 1296 (2013) 70–83 36. ORATA F. Derivatization Reactions and Reagents for Gas Chromatography Analysis. Dostupné z: http://www.intechopen.com/download/get/type/pdfs/ id/32817 37. HUŠEK P. Chloroformates in gas chromatography as general purpose derivatizing agents. Journal of Chromatography B. 717 (1998) 57–91 38. HUŠEK P., ŠIMEK P. Alkylchloroformates in sample derivatization strategies for GC analysis. Current Pharmaceutical Analysis. 2 (2006) 23-43 39. EZ:faastTM – sample preparation kit, USER GUIDE, Phenomenex, Torrance, CA, USA 40. HUŠEK P., MATUCHA P. Simple approach for analysis of plasma oxo-, hydroxy and dicarboxylic acids. Journal of Chromatography B. 693 (1997) 499–502 41. HUŠEK P., ŠIMEK P., MATUCHA P. Smooth esterification of di- and tricarboxylic acids with methyl and ethyl chloroformates in gas chromatographic profiling of urinary acidic metabolites. Chromatographia. 58 (2003) 623-630 42. VILLAS-BÔAS S. G., SMART K. F., SIVAKUMARAN S., LANE G. Alkylation or silylation for analysis of amino and non-amino organic acids by GS-MS. Metabolites. 1 (2011) 3-207 43. HUŠEK P. Improved procedure for the derivatization and gas chromatographic determination of hydroxycarboxylic acids treated with chloroformates. Journal of Chromatography. 630 (1993) 429-437 44. HUŠEK P. Fast esterification of fatty acids with alkyl chloroformates. Journal of High Resolution Chromatography. 13 (1990) 633-638 45. HUŠEK P., ŠVAGERA Z., HANZLÍKOVÁ D., ŠIMEK P. Survey of several methods deproteinizing human plasma before and within the chloroformatemediated treatment of amino/carboxylic acids quantitated by gas chromatography. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 67-68 (2012) 159–162 46. HUŠEK P., ŠIMEK P., TVRZICKÁ E. Simple and rapid procedure for the determination of individual fress fatty acids in serum. Analytica Chimica Acta. 465 (2002) 433-439
56
Seznam grafů Graf č. 1: Přehled ploch píků vybraných CA získaných různými metodami .............................. 43 Graf č. 2: Přehled ploch píků vybraných CA získaných různými modifikacemi metody VI ..... 44 Graf č. 3: Lineární regrese kalibrační křivky interního standardu (Ph-But) v rozmezí koncentrací 1 μM až 10 mM ........................................................................................................................... 47 Graf č. 4: Lineární regrese kalibrační křivky pro Citr o koncentracích 10 μM až 10 mM ......... 48 Graf č. 5: Lineární regrese kalibrační křivky pro Mal o koncetracích 10 μM až 10 mM ........... 48
Seznam obrázků Obr. č. 1: Kyselina citrónová [14] ............................................................................................... 16 Obr. č. 2: Kyselina fumarová [14] .............................................................................................. 16 Obr. č. 3: Kyselina jablečná [14] ................................................................................................ 17 Obr. č. 4: Kyselina jantarová [14] ............................................................................................... 17 Obr. č. 5: Kyselina malonová [14] .............................................................................................. 18 Obr. č. 6: Kyselina mléčná [14] .................................................................................................. 18 Obr. č. 7: Kyselina octová [14] ................................................................................................... 19 Obr. č. 8: Kyselina oxaloctová [14] ............................................................................................ 19 Obr. č. 9: Kyselina vinná [14] ..................................................................................................... 19 Obr. č. 10: Zjednodušené schéma plynového chromatografu – FID [30] ................................... 25 Obr. č. 11: Schéma injektoru [32] ............................................................................................... 26 Obr. č. 12: Plamenově ionizační detektor (FID) [30] ................................................................. 28 Obr. č. 13: Reakční schéma silylace ........................................................................................... 31 Obr. č. 14: Reakční schéma acylace............................................................................................ 31 Obr. č. 15: Reakční schéma alkylace .......................................................................................... 32 Obr. č. 16: Typické reakce s alkyl chloroformiáty ...................................................................... 32 Obr. č. 17: Reakce alkyl formiátu s karboxylovou kyselinou ..................................................... 33 Obr. č. 18: Chromatogram průběhu analýzy karboxylových kyselin a jejich identifikace ......... 46
57
Seznam tabulek Tab. č. 1: Schematické znázornění modifikací metody II ........................................................... 38 Tab. č. 2: Schematické znázornění modifikací postupu III ......................................................... 39 Tab. č. 3: Schematické znázornění modifikací metody V........................................................... 40 Tab. č. 4: Schematické znázornění modifikací metody VI ......................................................... 42 Tab. č. 5: Retenční časy stanovovaných karboxylových kyselin ................................................ 45 Tab. č. 6: Parametry kalibračních křivek y = ax + b .................................................................. 49
Seznam příloh Příloha č. 1: Metody pro GC-FID ............................................................................................... 59
58
Příloha č. 1: Metody pro GC-FID
Metody
I
II
III
IV
V
VI
Nástřikový objem [μl]
1
1
1
1
1
1
Split
1/20
1/5
1/10
1/10
1/10
1/100
Teplota nástřikového prostoru [°C]
280
300
240
300
260
280
90°C (2 min) poté 20°C/min do 280°C (2 min)
90°C (1 min) poté 20°C/min do 300°C (2 min)
0,5
1,0
1,0
1,0
1,0
0,5
Dusík [ml.min-1]
29
29
29
29
29
29
Vodík [ml.min-1]
30
30
30
30
30
30
Vzduch [ml.min-1]
300
300
300
300
300
300
280
300
280
300
280
280
Teplotní program Průtok nosného plynu kolonou [ml.min-1]
60°C (1,5 min) 90°C (1 min) poté 10°C/min do poté 10°C/min do 280°C (2 min) 300°C (2 min)
90°C (1 min) 90°C (2 min) poté 10°C/min do poté 20°C/min do 280°C (2 min) 280°C (2 min)
Průtok plynu detektorem
Teplota detektoru
Pokračování přílohy č. 1
Metody
VII
VIII
IX
X
XI
XII
XIII
1
1
1
1
1
1
1
Split
1/10
1/10
1/10
1/10
1/10
1/10
1/10
Teplota nástřikového prostoru [°C]
300
240
240
300
300
240
300
60°C (1 min) poté 20°C/min do 300°C (2 min)
60°C (1 min) poté 10°C/min do 280°C (2 min)
60°C (1,5 min) poté 10°C/min do 280°C (2 min)
60°C (1 min) poté 10°C/min do 320°C (2 min)
60°C (1 min) poté 20°C/min do 300°C (2 min)
60°C (2 min) poté 10°C/min do 260°C (2 min)
90°C (1 min) poté 10°C/min do 300°C (2 min)
1,0
1,0
1,0
1,0
1,0
1,0
1,0
Dusík [ml.min-1]
29
29
29
29
29
29
29
Vodík [ml.min-1]
30
30
30
30
30
30
30
Vzduch [ml.min-1]
300
300
300
300
300
300
300
300
280
280
300
300
280
300
Nástřikový objem [μl]
Teplotní program Průtok nosného plynu kolonou [ml.min-1]
Průtok plynu detektorem
Teplota detektoru
