Mendelova univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav technologie potravin
Plynová chromatografie mastných kyselin ve vzorcích vepřového masa Diplomová práce
Vedoucí práce:
Vypracovala:
Ing. Tomáš Gregor, Ph.D.
Bc. Petra Maděrová
Brno 2011
2
PROHLÁŠENÍ Prohlašuji, že jsem diplomovou práci na téma: Plynová chromatografie mastných kyselin ve vzorcích vepřového masa vypracovala samostatně a použila jen pramenů, které cituji a uvádím v přiloženém seznamu literatury. Diplomová práce je školním dílem a může být použita ke komerčním účelům jen se souhlasem vedoucího diplomové práce a děkana Agronomické fakulty Mendelovy univerzity v Brně.
dne …………………………………… podpis diplomanta ……………………
3
PODĚKOVÁNÍ Děkuji Ing. Tomáši Gregorovi, PhD. za odborné vedení při psaní této diplomové práce, cenné rady a komentáře při zpracování a vyhodnocení výsledků a za vstřícný přístup.
ABSTRAKT Diplomová práce se zabývá problematikou měření mastných kyselin pomocí plynové chromatografie ve vzorcích vepřového masa. V literární části jsou zpracovány mastné kyseliny z pohledu jejich chemických vlastností, fyziologických funkcí a významu v organismu člověka. Je zde zmínka o esenciálních mastných kyselinách, jejich vyváženém poměru v potravě a projevy při jejich nedostatku. Je zde také uvedeno chemické a biochemické složení vepřového masa, se zaměřením na podrobnou skladbu jednotlivých mastných kyselin. V teorii plynové chromatografie je uvedeno rozdělení a popis chromatografických metod, kolon a detektorů používaných v plynové chromatografii. Práce popisuje metodiku měření mastných kyselin na chromatografu GC Fisons 8000 series ve vzorcích vepřového masa. Dále uvádí ověření správnosti zvolené metodiky pomocí standardů, kvalitativní a kvantitativní vyhodnocení naměřených výsledků ve vzorcích vepřového masa plemen Landrace a Bílé ušlechtilé.
Klíčová slova: plynová chromatografie, mastné kyseliny, vzorky vepřového masa
ABSTRACT This thesis deals with the measurement of fatty acids by gas chromatography in samples of pork meat. In the theoretical part, the fatty acids are processed in terms of their chemical properties, physiological functions and relevance in the human organism. The essential fatty acids, their balanced proportion and the effects of their absence are mentioned there. It also states the chemical and biochemical composition of pork meat, with a focus on the detailed composition of individual fatty acids. The chapter about gas chromatography refers to the division and description of chronic chromatography methods, columns and detectors used in gas chromatography. The practical part describes the methodology for measuring fatty acids on GC Fisons 8000 Series in the samples of pork meat. It also states the verification of the choice of methodology, by using the standards, qualitative and quantitative evaluation of the results gained in samples of pork meat, Landrace and Lange White breed.
Key words: gas chromatography, fatty acids, samples of pork meat
OBSAH PROHLÁŠENÍ ........................................................................................................................................... 3 PODĚKOVÁNÍ.......................................................................................................................................... 4 ABSTRAKT ............................................................................................................................................... 5 ABSTRACT................................................................................................................................................ 5 OBSAH ....................................................................................................................................................... 6 1 ÚVOD ...................................................................................................................................................... 8 2 LITERÁRNÍ PŘEHLED ....................................................................................................................... 9 2.1 MASTNÉ KYSELINY ............................................................................................................................ 9 2.1.1 Struktura a dělení mastných kyselin .......................................................................................... 9 2.1.2 Syntéza mastných kyselin......................................................................................................... 11 2.2 POLYNENASYCENÉ MASTNÉ KYSELINY ............................................................................................ 12 2.2.1 Esenciální mastné kyseliny...................................................................................................... 12 2.2.1.1 Úloha esenciálních mastných kyselin v organismu .......................................................................... 13
2.2.2 Dělení polynenasycených mastných kyselin ............................................................................ 13 2.2.3 Polynenasycené mastné kyseliny řady n-3............................................................................... 14 2.2.3.1 Přehled některých účinků EPA a DHA ............................................................................................ 14 2.2.3.2 Projevy nedostatku polynenasycených mastných kyselin řady n-3 .................................................. 15
2.2.4 Polynenasycené mastné kyseliny řady n-6............................................................................... 16 2.2.5 Rovnovážný poměr polynenasycených mastných kyselin řady n-3 : n-6 ................................. 17 2.2.6 Doporučená spotřeba polynenasycených mastných kyselin .................................................... 17 2.2.7 Metabolická řada n-6 a n-3 mastných kyselin......................................................................... 18 2.2.7.1 Transformace esenciálních mastných kyselin na eikosanoidy.......................................................... 19 2.2.7.2 Nejvýznamnější eikosanoidy............................................................................................................ 21
2.3 VEPŘOVÉ MASO ............................................................................................................................... 21 2.3.1 Definice masa.......................................................................................................................... 22 2.3.2 Chemické a biochemické složení vepřového masa .................................................................. 22 2.3.2.1 Skladba mastných kyselin n-3 PUFA ve svalovině prasat a obohacování krmiva o lněné semínko. 25
2.3.3 Produkce a spotřeba vepřového masa..................................................................................... 26 2.4 PLYNOVÁ CHROMATOGRAFIE........................................................................................................... 29 2.4.1 Rozdělení chromatografických metod ..................................................................................... 30 2.4.2 Vývoj kolon v plynové chromatografii..................................................................................... 32 2.4.3 Kolony v plynové chromatografii ............................................................................................ 34 2.4.4 Detektory v plynové chromatografii........................................................................................ 36 2.4.4.1 Ionizační detektory........................................................................................................................... 36
2.4.5 Teoretické základy chromatografického procesu .................................................................... 38 2.4.6 Popis chromatogramu ............................................................................................................. 39 2.4.7 Kvalitativní a kvantitativní vyhodnocení ................................................................................. 40 2.4.8 Mez stanovitelnosti a mez detekce........................................................................................... 41 3 CÍL PRÁCE .......................................................................................................................................... 42 4 MATERIÁL A METODIKA ............................................................................................................... 43 4.1 POUŽITÉ CHEMIKÁLIE A LABORATORNÍ POMŮCKY ........................................................................... 43 4.1.1 Použité chemikálie................................................................................................................... 43 4.1.2 Použité laboratorní pomůcky .................................................................................................. 43 4.2 PŘÍPRAVA PRACOVNÍCH ROZTOKŮ ................................................................................................... 44 4.2.1 Příprava methanolátu sodného ............................................................................................... 44 4.2.2 Příprava roztoku isooktanu s vnitřním standardem ................................................................ 45 4.2.3 Příprava nasyceného roztoku NaCl......................................................................................... 45 4.3 LYOFILIZACE A EXTRAKCE VZORKU ................................................................................................. 45 4.4 DERIVATIZACE VZORKU ................................................................................................................... 46 4.5 PARAMETRY CHROMATOGRAFU ....................................................................................................... 47 4.5.1 Podmínky měření na GC ......................................................................................................... 47
5 VÝSLEDKY A DISKUZE ................................................................................................................... 49 5.1 OVĚŘENÍ SPRÁVNOSTI ZVOLENÉ METODIKY..................................................................................... 49 5.2 MĚŘENÍ VZORKŮ VEPŘOVÉHO MASA ................................................................................................ 53 5.2.1 Porovnání obsahu MK dle data odběru vzorků vepřového masa ............................................ 53 5.2.2 Porovnání obsahu MK ve všech vzorcích vepřového masa mezi sebou .................................. 60 5.3 STATISTICKÉ VYHODNOCENÍ ............................................................................................................ 65 5.3.1 Bodové grafy pro dané mastné kyseliny .................................................................................. 65 5.3.2 T-test pro jednotlivá data odběrů vzorků ................................................................................ 69 5.3.3 Jednofaktorová analýza variance............................................................................................ 74 5.4 POROVNÁNÍ METODIKY .................................................................................................................... 75 6 ZÁVĚR .................................................................................................................................................. 79 7 POUŽITÁ LITERATURA................................................................................................................... 81 8 SEZNAM OBRÁZKŮ .......................................................................................................................... 85 9 SEZNAM TABULEK........................................................................................................................... 87 10 SEZNAM ZKRATEK ........................................................................................................................ 88 PŘÍLOHY................................................................................................................................................. 90
1 ÚVOD Mastné kyseliny jsou nejdůležitější a z hlediska výživy nejvýznamnější složkou lipidů. Ve stravě přijímá člověk jen málo volných mastných kyselin. Ostatní lipidy konzumované ve stravě se v malé míře již v žaludku, ale převážně teprve v tenkém střevě, enzymově štěpí na mastné kyseliny a nejčastěji teprve jako takové se vstřebávají střevní stěnou. Kromě mastných kyselin přijímaných v potravě je člověk schopen syntetizovat také nasycené a některé nenasycené mastné kyseliny podobně jako jiní živočichové a rostliny (Velíšek, 2002). Pánek a kol. (2002) doporučuje, aby spotřeba mastných kyselin byla nejméně 1 % z veškeré přijaté energie, v opačném případě by mohlo docházet k některým z příznaků jejich nedostatku. Pro člověka jsou esenciální polynenasycené mastné kyseliny linolová a kyselina α-linolenová. Přičemž kyselina linolová patří do řady n-6 a naopak kyselina α-linolenová do řady n-3. Poměr přijatých kyselin řad n-3 a n-6 hraje důležitou roli z hlediska správné výživy člověka. Obecně se doporučuje poměr polynenasycených mastných kyselin, které patří do těchto řad n-3 a n-6 1:1 nebo, aby se alespoň poměr těchto mastných kyselin blížil co nejvíce 1. V případě zvýšeného příjmu potravin s vyšším obsahem kyselin řady n-6 může docházet k řadě zdravotních komplikací, jako je např. rozvoj aterosklerózy, hypercholesterolémie, zvýšená náchylnost k infekcím, dochází též k tvorbě ekzémů atd. Tato diplomová práce je zaměřena na měření mastných kyselin vyskytujících se ve vepřovém mase. Spotřeba vepřového masa v České republice dosahuje více než 40 kg/osoba/rok. Z roční spotřeby masa celkem (kolem 80 kg/osoba/rok) plyne, že druh masa vepřového je nejvíce konzumovaným druhem masa u nás. V práci se soustřeďuji jak na spektrum jednotlivých mastných kyselin, tak na procentuální množství těchto mastných kyselin obsažených v tuku vepřového masa, s ohledem na jednotlivá plemena Landrace a Bílé ušlechtilé.
8
2 LITERÁRNÍ PŘEHLED
2.1 Mastné kyseliny Mastné kyseliny se řadí mezi významnou skupinu přírodních látek zvanou lipidy. Lipidy se obvykle definují jako přírodní sloučeniny obsahující vázané mastné kyseliny o více než 3 atomech uhlíku v molekule. Lipidy tedy patří k významným složkám potravin a ve výživě člověka tvoří jednu z hlavních živin nezbytnou pro zdraví a vývoj organismu (Velíšek, 2002).
2.1.1 Struktura a dělení mastných kyselin Mastné kyseliny jsou uhlovodíkové řetězce, obsahující na koncích metylové
(CH 3 − )
a karboxylové (− COOH ) skupiny. Liší se v délce řetězců a stupni nasycení
(Svačina, 2008). Mastné kyseliny se vyskytují jako volné (neesterifikované) nebo estericky vázané (triacylglyceroly, fosfolipidy, estery cholesterolu). Většina přirozených mastných kyselin má přímý řetězec o sudém počtu (12-30) atomů uhlíků a amfipatickou strukturu - to znamená, že mají hydrofobní (uhlíkový) řetězec i hydrofilní (karboxylová skupina) část. Čím je mastná kyselina delší, tím více se projevují její hydrofobní vlastnosti a tím méně je rozpustná ve vodě. Mastné kyseliny s řetězcem delším než 12 atomů uhlíku musí být přenášeny v plazmě ve vazbě na polární sloučeniny (Holeček, 2006). Z hlediska fyziologie výživy je důležité dělení mastných kyselin na: •
nasycené (v jejich molekule není žádná dvojná vazba; mezinárodně používaná zkratka SFA - saturated fatty acid)
•
mononenasycené (s jednou dvojnou vazbou; MUFA - monounsaturated fatty acid)
•
polynenasycené (dvě až šest dvojných vazeb; PUFA - polyunsaturated fatty acid)
Kromě toho existují i méně běžné mastné kyseliny (MK) s trojnými vazbami, větvenými vazbami, resp. MK cyklické (Komprda, 2003). Uhlíkové atomy mastných kyselin se číslují od karboxylového uhlíku. Pro označení polohy dvojné vazby však číslování počíná od koncového metylového uhlíku, který se 9
označuje jako ω- (nebo n-) uhlík. Stručný zápis struktury mastné kyseliny je například: 18:1, n-9 (kyselina o 18 uhlících s jednou dvojnou vazbou na 9. uhlíku od metylového konce- kyselina olejová). Příklady funkce nejvýznamnějších mastných kyselin jsou uvedeny v následující tabulce (Tab. 1).
Tab. 1 Výskyt a funkce fyziologicky významných vyšších mastných kyselin Skupina
Mastná kyselina
Výskyt
nasycené
palmitová (16:0)
běžně
stearová (18:0)
v živočišných
součást triacylglycerolů,
palmitoolejová (16:1, n-7)
a rostlinných
energický substrát
olejová (18:1, n-9)
tucích
linolenová (18:3, n-3)
rybí tuk,
eikosapentaenová (20:5, n-3)
vejce, rostlin-
dokosahexaenová (22:6, n-3)
né oleje
linolová (18:2, n-6)
rostlinné
arachidonová (20:4, n-6)
oleje
mononenasycené
polynenasycené n-3
polynenasycené n-6
Funkce
součást fosfolipidů, prekurzor eikosanoidů s antiagregačním a vazodilatačním účinkem součást fosfolipidů, prekurzor eikosanoidů s proagregačním a vazokonstrikčním účinkem
Prvé číslo v závorce (Tab. 1) značí počet uhlíků v řetězci, druhé počet dvojných vazeb a poslední polohu první dvojné vazby (počítáno od metylového uhlíku značeného jako ω nebo n), (Holeček, 2006). Důsledkem široké palety mastných kyselin, které se liší délkou a počtem dvojných vazeb, je rozmanitost struktury a funkce lipidů.
10
2.1.2 Syntéza mastných kyselin Nasycené mastné kyseliny se syntetizují z acetyl-CoA. Při každém cyklu se prodlouží řetězec mastné kyseliny vždy o dva atomy uhlíku, proto se mastné kyseliny se sudým počtem atomů uhlíku vyskytují v lipidech daleko častěji než mastné kyseliny s lichým počtem atomů uhlíku. Syntéza se většinou zastaví po dosažení 16-18 atomů uhlíku (Velíšek, 2002). Biosyntéza nasycených a většiny nenasycených mastných kyselin probíhá v cytoplazmě buněk postupným spojováním a redukcí dvojuhlíkatých zbytků kyseliny octové (acetyl-CoA), které pochází ze sacharidů, aminokyselin nebo z jiných mastných kyselin. Tvorba mastných kyselin probíhá na multienzymovém komplexu skládajícího se ze šesti enzymů uspořádaných radiálně okolo centrální bílkoviny. Syntézou „de novo“ vznikají v cytoplazmě nasycené mastné kyseliny až po kyselinu palmitovou (C16:0). Další prodloužení řetězce palmitové kyseliny se uskutečňuje v mitochondriích nebo v endoplazmatickém retikulu. V mitochondriích se také tvoří nenasycené mastné kyseliny pomocí enzymů dehydrogenáz, které odebírají atomy vodíku z nasycené mastné kyseliny za vzniku dvojné vazby v konfiguraci cis. Dehydrogenázy mitochondrií nejsou schopné vytvářet u savců dvojné vazby v polohách přesahujících devátý uhlík, počítáno od karboxylové skupiny. Z tohoto důvodu se pro savce stávají polynenasycené mastné kyseliny esenciální (Musil, 2002). Zde se v literatuře nachází rozpory. Savci mají enzymy ∆6- a ∆5-desaturázu, které vnáší dvojnou vazbu od karboxylového konce kyseliny (např. u kyseliny arachidonové to odpovídá 12. resp. 15. uhlíku počítaného od methylového konce).
2.1.3 Odbourávání mastných kyselin Rozklad mastných kyselin se uskutečňuje nejčastěji tzv. β-oxidací. β-oxidace je nejvýznamnějším procesem v katabolismu mastných kyselin, při kterém se řetězec mastné kyseliny rozpadne zpět na acetyl-CoA, ze kterých vznikl. Odbourávání probíhá v mitochondriích, do nichž jsou mastné kyseliny aktivně přeneseny. Před přenosem do matrix mitochondrie se musí molekula mastné kyseliny aktivovat koenzymem A (HS-CoA), za vzniku acyl-CoA. Vlastní přenos tohoto aktivovaného acylu z cytoplazmy do mitochondrie potom zajišťuje karnitin (Musil, 2002).
11
Z mastné kyseliny vázané na koenzym A vzniká nejprve trans-nenasycená (alk-2enová) kyselina, z ní vzniká 3-hydroxykyselina a 3-ketokyselina. Ta se štěpí na kyselinu o dva atomy uhlíku kratší a acetyl-CoA. Štěpení nenasycených mastných kyselin probíhá podle obdobných mechanismů. Méně běžná je α-oxidace, kdy se odštěpuje karboxyl a řetězec se zkrátí o jeden atom uhlíku, přičemž vznikají mastné kyseliny s lichým počtem atomů uhlíku. Některé MK, např. kyseliny s dlouhým uhlíkatým řetězcem, trans-nenasycené kyseliny a hydroxykyseliny, se odbourávají nesnadno a jsou určitou zátěží pro organismus, zejména pokud jsou ve stravě přítomny ve větším množství (Velíšek, 2002).
2.2 Polynenasycené mastné kyseliny 2.2.1 Esenciální mastné kyseliny Esenciální mastné kyseliny (EFAs) jsou důležitým článkem všech buněčných membrán, mají vliv na pružnost membrány a tím určují a ovlivňují chování enzymů vázaných na receptory membrány. EFAs jsou nezbytné pro život lidí, v těle se nesyntetizují, a proto musí být obsaženy v naší výživě. Zde se nachází rozpor v literatuře (viz syntéza mastných kyselin), enzymy ∆6- a ∆5-desaturáza syntézu umožňují. Tyto mastné kyseliny jsou pro organismus člověka nezbytné a v případě nedostatečného příjmu může dojít k poškození zdraví. V našem těle se vyskytují dva druhy esenciálních mastných kyselin. Jsou to n-6 řetězce, deriváty cis-linolové kyseliny (LA, 18:2) a řetězce n-3, deriváty α-linolenové kyseliny (ALA, 18:3). Existuje také jiný řetězec mastných kyselin odvozených z olejové kyseliny (OA, 18:1) n-9, ovšem kyselina olejová nepatří mezi esenciální mastné kyseliny. Das (2006) dále uvádí, že řady mastných kyselin n-9, n-6, n-3 jsou metabolizovány stejnou skupinou enzymů na vlastní metabolit s dlouhým řetězcem, což je ovšem v rozporu s tvrzením, že se v těle tyto kyseliny nesyntetizují. Je nutné poznamenat, že zatímco některé reakce a funkce EFAs vyžadují jejich konverzi na eikosanoidy a jiné produkty, ve většině případů jsou aktivní samy MK.
12
2.2.1.1 Úloha esenciálních mastných kyselin v organismu Pro člověka jsou esenciální polynenasycené mastné kyseliny (PUFAs), lidský organizmus je potřebuje pro tvorbu několika důležitých regulačních sloučenin. Největší množství esenciálních mastných kyselin (hlavně kyseliny linolové) se spotřebuje na tvorbu buněčných a intracelulárních membrán, včetně membrán pokožky. Dále mají esenciální mastné kyseliny úlohu při rozmnožování, při výstavbě nervových tkání a asi 1 % slouží k syntéze eikosanoidů. Esenciální mastné kyseliny také zvyšují polaritu a tím i rozpustnost lipoproteinů krevní plasmy (Pánek a kol., 2002). EFAs se prostřednictvím transkripčních faktorů- jaderných regulačních proteinů (například SREBP - Sterol Regulatory Element Binding Proteins a PPAR - Peroxisome proliferator activated receptor) účastní regulace exprese genů, které řídí metabolismus lipidů a sacharidů (Holeček, 2006). EFAs/PUFAs hrají důležitou roli v srdečně-cévních (kardiovaskulárních) a jiných chronických degenerativních nemocech (hypertenze, diabetes mellitus, metabolický syndrom, lupénka, ekzém, atopický ekzém, tepenné srdeční choroby, aterosklerosa a rakovina). Z EPA a DHA vznikají molekuly, které potlačují zánět. Naopak z kyseliny arachidonové vznikají látky, které riziko zánětů zvyšují (Das, 2006).
2.2.2 Dělení polynenasycených mastných kyselin Stěžejní význam má z hlediska fyziologie výživy dělení nenasycených mastných kyselin do dvou řad, označených n-3 a n-6, resp. ω − 3 a ω − 6 . Tyto symboly určují polohu dvojné vazby nejbližší methylovému (CH 3 − ) konci molekuly (Kalač, 2006). K esenciálním mastným kyselinám patří kyseliny s 20-24 atomy uhlíku a se systémem dvojných vazeb v pentadienovém uspořádání, které musí být v cis konfiguraci a první dvojná vazba musí být na šestém (n-6) nebo třetím (n-3) uhlíku od koncového metylu. Typickým zástupcem je kyselina arachidonová, která se však vyskytuje v potravinách jen v malém množství. V organismu se však může syntetizovat z kyseliny linolové (Pánek a kol., 2002). Zde je opět rozpor v tvrzení, že je kyselina esenciální, ale přitom syntéza v organismu možná je. Pro člověka jsou základní esenciální polynenasycené mastné kyseliny: •
kyselina linolová (n-6)
•
kyselina α-linolenová (n-3), (Musil, 2002).
13
V současné době se používá termín PUFAs (polyunsaturated fatty acids) pro pojmenování všech nenasycených mastných kyselin: LA (kyselina linolová), GLA (kyselina gama-linolenová), DGLA (kyselina dihomo-gama-linolová), AA (kyselina arachidonová), ALA (kyselina alfa-linolenová), EPA (kyselina eikosapentaenová), DHA (kyselina dokosahexaenová). A termín EFAs (essential fatty acids) odkazuje na LA a ALA. Přestože se termín EFAs a PUFAs běžně zaměňují, musí být jasné, že všechny esenciální mastné kyseliny patří mezi polynenasycené mastné kyseliny, ale ne všechny polynenasycené mastné kyseliny lze řadit mezi esenciální mastné kyseliny. Nedostatek esenciálních mastných kyselin může být alternován polynenasycenými mastnými kyselinami, např.: při zabudování mastných kyselin do fosfolipidové membrány buněk, proto se také PUFAs označují jako „funkční esenciální mastné kyseliny“ (Das, 2006). Mastné kyseliny řady n-3 se nacházejí v rostlinné stravě (α-linolenová kyselina) a také v mořské stravě (EPA, DHA). Téměř každý měsíc se objevuje nová studie přinášející důkazy o zdravotních účincích n-3 kyselin (Pratt, 2005).
2.2.3 Polynenasycené mastné kyseliny řady n-3 Prekursorem kyselin řady n-3 je esenciální mastná kyselina α-linolenová (cis, cis, cis- 9,12,15- oktadekatrienová). Vlastní mastné kyseliny této řady jsou kyseliny přítomné v rybích tucích, z nich nejznámější je kyselina eikosapentaenová (tzv. EPA; all- cis- 5,8,11,14,17- eikosapentaenová) a kyselina dokosahexaenová (zvaná zkráceně DHA; all- cis 4,7,10,13,16,19- dokosahexaenová (Pánek a kol., 2002). Kyseliny řady n-3 jsou znázorněny spolu s některými kyselinami řady n-6 na obrázku 1.
2.2.3.1 Přehled některých účinků EPA a DHA Kyselina eikosapentaenová je důležitá v prevenci srdečního infarktu především díky svému antitrombotickému efektu. Také se ukázalo, že zvyšuje čas krvácení a snižuje koncentraci sérového cholesterolu. Studie na primátech a na novorozeňatech ukázaly, že DHA je nutná pro normální funkci mozku hlavně u nedonošených dětí. Jiné studie ukazují, že tyto n-3 mastné kyseliny mohou snížit počet a velikost nádorů a prodloužit čas než se nádor objeví (Akoh, 14
Min, 2002). DHA také redukuje krevní cholesterol a zvyšuje citlivost buněk na inzulin (Das, 2006). Mozek se skládá převážně z lipidů, včetně cholesterolu a mononenasycených tuků. Zatímco si naše tělo dokáže vytvořit cholesterol a většinu lipidů obsažených v mozku, vznik polynenasycených mastných kyselin záleží na množství n-6 a n-3 mastných kyselin, které jsou obsaženy ve stravě. V mozku jsou nejvíce zastoupeny kyseliny AA z řady n-6 a DHA z řady n-3. Tyto mastné kyseliny jsou inkorporovány do plazmatických membrán nervových elementů, přičemž DHA převažuje (Felix, 2005). Kyselina DHA představuje v mozku savců 30-50 % mastných kyselin, především je přítomná v membráně fosfolipidů. Dostupnost vhodného množství n-3 a n-6 mastných kyselin a různé růstové faktory jsou proto základem pro růst mozku a vývoj během perinatálního období a v adolescenci. Nedostatek EPA, DHA a AA během kritického období oslabuje růst mozku a vývoj vhodných synaptických spojů, což může vést k vývojovým vadám mozku a neuropsychologickým změnám- demenci, depresi, schizofrenii, Alzheimerově chorobě a neurodegenerativním chorobám jako Huntingtonova nemoc, Parkinsonova nemoc atd. a může poškozovat formování a upevňování paměti (Das, 2006). U savců se na počátku vývoje (tzv. rané etapě ontogeneze) uskutečňuje vlastní inkorporace DHA, ale i AA do centrální nervové soustavy přibližně 10× rychleji než u dospělých. Tato selektivita je velmi zřetelná a netýká se dalších zástupců řady n-3 včetně např. základní vstupní MK, tj. kyseliny linolenové. Zvyšující se gradient kyseliny DHA od matky krví k novorozenci je nepřímým důkazem toho, že tato kyselina má pro vývoj jedince zcela mimořádný význam (Mourek a kol., 2007).
2.2.3.2 Projevy nedostatku polynenasycených mastných kyselin řady n-3 Nedostatek polynenasycených mastných kyselin řady n-3, resp. esenciálních se projevuje na pokožce (zvýšení propustnosti pro vodu, tvorba ekzémů a šupinatá kůže), dále v poruchách rozmnožování (v extrémních případech nastává sterilita), ve větší náchylnosti k infekcím, ve snadnější srážlivosti plazmatických lipoproteinů a v poruchách souvisejících s nedostatečnou tvorbou eikosanoidů (Pánek a kol., 2002). Deficit EFAs ve výživě je také dáván do souvislosti s hypercholesterolemií, rozvojem aterosklerózy, poruchami funkce nervového systému a hemokoagulace (Holeček, 2006). Tyto poruchy jsou zčásti vratné a je možno je odstranit podáváním potravy bohaté
15
na esenciální polynenasycené mastné kyseliny, zejména rostlinných olejů a různých semen. Nejlepším zdrojem polynenasycených mastných kyselin jsou obiloviny, luštěniny, olejnatá semena a vejce (Stratil, 1993).
2.2.4 Polynenasycené mastné kyseliny řady n-6 Prekursorem je kyselina linolová (cis, cis-9,12- oktadekadienová). Z kyseliny linolové lze metabolickou řadou pomocí enzymů desaturas a elongas zvýšit počet uhlíků a dvojných
vazeb
za
vzniku
kyseliny
arachidonové
(cis,cis,cis,cis-5,8,11,14-
eikosatetraenová). Kyselina arachidonová je prekurzorem kyseliny dokosapentaenové. Jiným prekurzorem je kyselina γ-linolenová (cis,cis,cis-6,9,12-oktadekatrienová), která se však ve stravě vyskytuje jen v nepatrném množství (Pánek a kol.,2002).
Obr. 1 Strukturální podoba zvolených mastných kyselin (Simopoulos, 2005)
16
2.2.5 Rovnovážný poměr polynenasycených mastných kyselin řady n-3 : n-6 U esenciálních mastných kyselin, jako i u jiných věcí týkajících se zdraví, je klíčová rovnováha. Činnost organismu neprobíhá optimálně bez rovnováhy EMK. Optimální rovnováhou mastných kyselin se rozumí rovnovážný poměr n-6 : n-3 mastným kyselinám v hodnotách 1 : 1 až 4 : 1 (Pratt, 2005). Přičemž hodnota 4 : 1 je spíše kompromisem mezi hodnotou v populaci běžnou v rámci současné stravy tzv. západního typu a hodnotou skutečně optimální, která by se měla co nejvíce blížit 1. Felix (2005) udává, že konzumace MK řady n-6 : n-3 se u některých osob pohybuje v poměru 20 : 1 nebo 10 : 1.
2.2.6 Doporučená spotřeba polynenasycených mastných kyselin Spotřeba mastných kyselin se obvykle vyjadřuje v % veškeré přijímané energie. Doporučuje se, aby nejméně 1 % energie tvořila tato skupina mastných kyselin, jinak by mohly nastat některé příznaky jejich nedostatku. Podle různých autorů se doporučují různé dávky, a to až do 3-4 % přijaté energie, což by bylo výhodnější z hlediska složení lipidů krevní plasmy, ale mohly by vznikat v nadměrném množství volné radikály. Z uvedeného příjmu by asi 70-90 % měly činit mastné kyseliny řady n-6 a 10-30 % mastné kyseliny řady n-3. Při dostatečném příjmu
řepkového a sójového oleje je tento poměr dodržován (Pánek a kol., 2002). Podle Mourka a kol. (2007) by se měl příjem trans nenasycených mastných kyselin omezit co nejvíce, protože jsou aterogení, a to více než nasycené mastné kyseliny. Příjem cholesterolu max. 300 mg za den (s optimem 100 mg na 1000 kcal). Dle Musila (2002) by měl tvořit tuk ve vyvážené, racionální dietě zdravého, dospělého člověka maximálně 30 % celkového denního energetického příjmu. Potřeba esenciálních mastných kyselin je ovlivněna věkem a fyzickým stavem člověka. Denní příjem kyseliny linolové nemá být větší než 10 g a denní příjem kyseliny α-linolenové nemá přesahovat 4 g. Dále doporučuje, aby denní příjem kyselin EPA a DHA z rybích zdrojů byl nejvíce 1 g. K úhradě denní potřeby kyseliny linolové a α-linolenové stačí přijmout potravou 1,5-2 lžíce řepkového oleje. Větší množství rostlinných olejů, případně rybího oleje se používat nedoporučuje. Vícenenasycené MK přijaté nad doporu-
čený limit, mohou totiž v těle podléhat oxidačním reakcím, přičemž vzniklé oxidační produkty mají nepříznivý zdravotní efekt.
17
2.2.7 Metabolická řada n-6 a n-3 mastných kyselin V lidském organismu se kyseliny linolová a α-linolenová prodlouží o 2 až 6 atomů uhlíku (tzv. elongací) a vytvářejí se další dvojné vazby (tzv. desaturce), takže vznikají mastné kyseliny s 20-24 atomy uhlíku a se 3-6 dvojnými vazbami v molekule. Tyto vyšší esenciální mastné kyseliny mají v organismu živočichů nezastupitelnou úlohu jako prekurzory biologicky aktivních látek nazývaných eikosanoidy a jako modulační složky biologických membrán, neboť ovlivňují jejich fluiditu a flexibilitu. Pro člověka je nejdůležitější látkou arachidonová kyselina, která se ukládá v biologických membránách jako C-2 ester fosfatidylinositolu a jiných fosfolipidů. Enzymy katalyzující denaturaci a elongaci n-6 a n-3 mastných kyselin jsou stejné, snadněji však probíhá desaturace a elongace u n-3 mastných kyselin. Někteří lidé mají málo aktivní ∆6-desaturasu, takže jsou pro ně tyto přeměny znesnadněny. Hlavními faktory, které aktivitu ∆6-desaturasy negativně ovlivňují, jsou věk (u starších jedinců je aktivita enzymu nižší), výživa (inhibiční účinek na enzym má příjem ethanolu, negativní vliv má deficience vitaminu B6, biotinu, Zn, Mg a Ca, vyšší příjem transnenasycených mastných kyselin a polohových izomerů přirozených nenasycených kyselin potravou), stres a virové infekce. Dostupné jsou proto přípravky s γ- a dihomo
γ-linolenovou kyselinou (Velíšek, 2002). Na obrázku 2 je zobrazeno schéma metabolismu esenciálních mastných kyselin v lidském organismu. Z esenciální linolové kyseliny (n-6) se metabolickou řadou syntetizuje kyselina arachidonová. Z esenciální kyseliny α-linolenové (n-3) vznikají její nejvýznamnější metabolity- kyseliny eikosapentaenová a dokosahexaenová. Významnými konečnými metabolity obou řad PUFA jsou tzv. eikosanoidy (cyklické struktury s dvaceti uhlíky). Eikosanoidy pocházející z arachidonové kyseliny na jedné straně a z kyselin EPA a DHA na straně druhé, mají velice rozdílné fyziologické účinky (Komprda, 2003). Vznik posledních metabolitů obou řad (n-6 i n-3) probíhá podle odlišného schématu „∆ 4–desaturace“: nejprve na mastnou kyselinu působí elongasa, poté ∆6–desaturasa, následuje β-oxidace.
18
Obr. 2 Schéma metabolismu esenciálních mastných kyselin v lidském organismu (Simopoulos, 2005)
2.2.7.1 Transformace esenciálních mastných kyselin na eikosanoidy Kromě erytrocytů produkují eikosanoidy všechny savčí buňky. K eikosanoidům se řadí: •
prostaglandiny
•
leukotrieny
•
prostacykliny
•
thromboxany
•
lipoxiny
Tyto sloučeniny se např. uplatňují jako vasokonstriktory a vasodilatační látky při regulaci krevního tlaku, regulují srážení krve jako agregační a antiagregační látky krevních destiček (trombocytů), regulují funkci leukocytů, cykly spánku a bdění aj. (Velíšek, 2002).
19
Kyselina linolová se dehydrogenuje enzymově na kyselinu γ-linolenovou, která přechází prodloužením uhlíkového řetězce (syntéza mastných kyselin) na kyselinu dihomo-γ-linolenovou, která se dále dehydrogenuje na kyselinu arachidonovou. Ta se dále oxiduje na eikosanoidy, např. prostaglandin (Pánek a kol., 2002). Z arachidonové kyseliny vznikají v lidském organismu působením cyklooxigenasy a dalších enzymů přes cyklický endoperoxid prostaglandiny, prostacykliny a thromboxany řady 2 (s indexem 2, jako prostaglandin E2, thromboxan A2 aj). Jinou cestou oxidace kyseliny arachidonové je katalytické působení 5-, 12-, či 15- lipoxygenasy, při-
čemž vznikají odpovídající hydroperoxidy a ty přecházejí dalšími reakcemi na leukotrieny a lipoxiny (5-lipoxygenasy např. poskytují z arachidonové kyseliny leukotrieny s indexem 4, 12/15-lipoxygenasy poskytují lipoxiny s indexem 4). Z EPA vznikají analogicky prostaglandiny, prostacykliny a thromboxany s indexem 3 a leukotrieny s indexem 5. Z dihomo-γ-linolenové kyseliny (eikosatrienové) vznikají prostaglandiny s indexem 1 a leukotrieny s indexem 3 (Velíšek, 2002). Tento oxidační metabolismus kyseliny arachidonové a eikosapentaenové je znázorněn na obrázku 3.
Obr. 3 Oxidační metabolismus kyseliny arachidonové a eikosapentaenové cyklooxigenasou a 5-lypoxygenasou (Simopoulos, 2005)
20
2.2.7.2 Nejvýznamnější eikosanoidy Z eikosanoidů jsou nejdůležitější leukotrieny, thromboxany a prostacykliny. Leukotrieny způsobují kontrakci hladkého svalstva a mají vliv na aktivní pohyb leukocytů. Thromboxany jsou přítomny v krevních destičkách a usnadňují srážení krve (vznik trombů). Prostacykliny jsou přítomny v endoteliálních buňkách cév. K prostacyklinům patří např. prostaglandiny, které způsobují kontrakci dělohy (mají např. velký význam při porodu). Mohou být ovšem nebezpečné tím, že podporují také stahy cév a mohou vést i k infarktu. Tento účinek mají prostaglandiny odvozené od kyseliny arachidonové, kdežto obdobné deriváty odvozené od kyseliny EPA působí jako jejich antagonisté. Antagonismus prostanoidů odvozených od kyseliny arachidonové a kyseliny eikosapentaenové je významný, jde o vyšší nebo nižší účinek látek stejného charakteru. Rozhodující je podíl vzniklých thromboxanů ve vztahu ke zvýšení rizika infarktu myokardu. Pánek a kol. (2002) uvádí, že se má z tohoto důvodu poměr obou typů mastných kyselin udržovat v dietě zhruba na hodnotě 1 : 5 až 1: 10. Což je ovšem hodnota dosti vysoká a zcela přesahuje optimální poměr 1 : 1, který je těžko dosažitelný, a proto se udává kompromis 1 : 4.
2.3 Vepřové maso V České republice, obdobně jako v Evropské Unii (EU) a ve světě, patří vepřové maso z pohledu celkového objemu produkce tak i spotřeby stále k nejvíce zastoupenému druhu masa (Abrahamová, 2009). Maso je oblíbenou složkou naší stravy, lidé ho konzumují nejen pro senzorické, ale i pro nutriční vlastnosti. Je to bohatý a univerzální zdroj živin a energie. Výživa je jedním z nejvýznamnějších faktorů lidského zdraví a maso patří k nejvýznamnějším potravinám. Primární význam masa spočívá v obsahu proteinů. Aminokyseliny jsou využívány pro růst a obnovu buněk a poskytují velké množství metabolizovatelné energie. Mastné kyseliny, vitaminy, minerální složky a voda jsou zahrnuty v syntéze proteinů, lipidů, buněčných membrán a dalších složek masa. Obsah plnohodnotných bílkovin v mase, které jsou nezbytnou složkou potravin a hlavním zdrojem dusíku, tím pádem i nejvýznamnější živinou pro člověka, se v mase se pohybuje kolem 20 %. Plnohodnotnost
21
bílkovin je dána tím, že obsahují všechny esenciální aminokyseliny ve vyváženém vzájemném poměru z hlediska jejich využití pro stavbu tělních bílkovin člověka. Maso je zdrojem téměř všech vitaminů s výjimkou kyseliny askorbové. Nejvyšší podíl na krytí fyziologických potřeb lidského organismu zabezpečuje vitamin B12 a další vitaminy skupiny B, B2, niacin, B6 (Ingr, 2008). Dále je maso z nutričního hlediska velmi cenným zdrojem nenasycených mastných kyselin a minerálních látek (mimo jiné obsahuje železo, vápník a zinek). Právem je považováno za nezastupitelnou složku výživy, i když je možné (obtížně) zajistit plnohodnotnou výživu i bez masa (Kadlec, Melzoch, Voldřich a kol., 2009).
2.3.1 Definice masa Jako maso jsou definovány všechny části těl živočichů v čerstvém nebo upraveném stavu, které se hodí k lidské výživě. V užším slova smyslu je maso definováno jako příčně pruhovaná svalovina z těl teplokrevných jatečných zvířat a to včetně nedílných součástí
svalových
partií
jako
jsou
vazivové
součásti
svalů,
povrchový
a intramuskulární tuk, nervy, mízní uzliny, cévy, kosti a opeřené kůže. Jatečně opracovaným tělem se rozumí celá řada částí těl zvířat, které se získali jejich poražením a které jsou připravené k veterinárnímu vyšetření na jatkách. Termín výsekové maso se chápe jako maso jatečných zvířat rozbouraných na části, které jsou určeny k prodeji (Steinhauser, 2000).
2.3.2 Chemické a biochemické složení vepřového masa Významnou jakostní charakteristikou masa je jeho chemické složení. Od této charakteristiky jsou dovozeny mnohé důležité vlastnosti masa, jako je např. nutriční hodnota, senzorické, technologické a kulinární vlastnosti (Ingr, 2003). Maso má složitou a velmi různorodou histologickou strukturu, proměnlivé chemické složení, technologické a senzorické vlastnosti. Struktura i složení závisí na způsobu života, funkci jednotlivých částí těla a na řadě intravitálních vlivů (druh zvířat, plemeno, pohlaví, věk, způsob výživy, zdravotní stav aj.), průběhu postmortálních změn i způsobu zpracování (Kadlec, Melzoch, Voldřich a kol., 2009). Chemické složení je třeba vázat na celé jatečně opracované tělo, na jeho jednotlivé
části nebo na jednotlivé tkáně, ale i to je velmi obtížné vzhledem k vysoké heterogenitě 22
jednotlivých celků. Jatečně opracovaná těla zvířat obsahují variabilní podíly svaloviny, tukových tkání a kostí. Z těchto důvodů je nejčastěji hodnoceno a uváděno chemické složení libové svaloviny, ale i v tomto případě je vhodné uvádět např. svalovou partii. Libová svalovina se skládá z vody, bílkovin, tuků, minerálních látek, vitaminů a extraktivních látek. Největší podíl v základním složení čisté libové kosterní svaloviny jatečných zvířat zaujímá voda 70 až 75 %, dále jsou to bílkoviny 18 až 22 %, tuk 2 až 3 %, minerální látky 1 až 1,5 %, extraktivní dusíkaté látky 1,7 % a extraktivní látky bezdusíkaté 0,9 až 1,0 %. Tyto uvedené rozsahy hodnot je možné chápat jako pásma nejčastěji zjištěných hodnot a nikoli jako mezní hodnoty (Ingr, 2003). V následující tabulce č. 2 je uvedeno orientační procentické složení vepřového masa podle bourárenského dělení.
Tab. 2 Orientační analytické parametry masa podle bourárenského dělení na části (Steinhauser, 2000)
Vepřové maso
Voda %
Bílkoviny %
Tuky %
bůček
34
7,1
56
kýta
53
15,2
31
pečeně
58
16,4
25
plec
49
13,5
37
V mase jsou lipidy zastoupeny z největší části jako tuky (triacylglyceroly), v malé míře jsou zastoupeny fosfolipidy (heterolipidy) a doprovodné látky tuků (cholesterol). Tuk má v mase význam z hlediska senzorického, je nosičem aromatických látek (Kadlec, Melzoch, Voldřich a kol., 2009). Tuky se vyskytují ve formě tuku svalového (intra a intermuskulární) a tuku depotního. Z hlediska senzorického je významný zejména intramuskulární tuk, který pozitivně ovlivňuje křehkost a chutnost masa. Intercelulární podíl intramuskulárního tuku, který je rozložen mezi svalovými vlákny ve formě žilek, je důležitý pro chuť a křehkost masa a tvoří tzv. mramorování masa (Steinhauser, 2000). Obsah tuku v samotné svalovině tvoří jen několik procent, vyšších hodnot se dosahuje, pokud jde o samotnou tukovou tkáň. Lipidy v mase obsahují cenné nenasycené mastné kyseliny. Na druhé straně je vyšší podíl tuku v mase hodnocen negativně jak pro jeho vyšší energetický obsah, tak pro převahu nasycených mastných kyselin, zejména palmitové a stearové. Z nenasycených MK převládá kyselina olejová, zatímco nutričně 23
významných polynenasycených mastných kyselin (linolová, linoleová, arachidonová) je v mase obsaženo méně. V následující tabulce č. 3 je uveden přehled obsahu mastných kyselin ve vepřovém tuku.
Tab. 3 Obsah mastných kyselin v tuku vepřového masa (v % mastných kyselin z celkové sumy mastných kyselin), (Ingr, 2003)
Mastné kyseliny
Vepřový tuk
palmitová (16:0)
25-35
palmitoolejová (16:1, n-7)
1,7-5,0
stearová (18:0)
12-18
olejová (18:1, n-9)
41-51
linolová (18:2, n-6)
2,5-7,8
linolenová (18:3, n-3)
1,0-1,5
arachidonová (20:4, n-6)
0,5-1,0
myristová (14:0)
0,5-2,5
Voda je nejvíce zastoupenou složkou masa. Má velký význam pro senzorickou, kulinární a především pro technologickou jakost masa. Voda je v libové svalovině vázána několika způsoby a různě pevně. Nejpevněji je v mase vázána tzv. hydratační voda. Hydratační voda je vázána v mono- i multimolekulární vrstvě na hydrofilní skupiny bílkovin. Další podíl vody je imobilizován mezi jednotlivými strukturálními částmi svaloviny a zbytek vody je volně pohyblivý v mezibuněčných prostorech. Technologie masa rozeznává v podstatě dvě formy existence vody v mase, vodu volnou a vodu vázanou. Rozhodující podíl vody v mase (cca 70 %) je obsažen v myofibrilách, proto jsou za vaznost masa odpovědné především myofibrilární bílkoviny. Voda ve svalovině je roztokem bílkovin, solí, sacharidů a dalších rozpustných látek, je označována jako masová šťáva. Vytváří prostředí pro průběh enzymových reakcí ve svalové tkáni živých zvířat i v postmortálních biochemických procesech v mase (Ingr, 2003). Bílkoviny jsou významnou složkou masa, především z hlediska nutričního a technologického. Z hlediska nutričního se jedná většinou o tzv. plnohodnotné bílkoviny, které obsahují všechny esenciální aminokyseliny. Technologické rozdělení bílkovin v mase vychází z jejich rozpustnosti ve vodě a v solných roztocích. Sarkoplasmatické bílkoviny jsou rozpustné ve vodě a slabých solných roztocích, myofibrilární proteiny nejsou roz24
pustné ve vodě, pouze v solných roztocích a vazivové, stromatické bílkoviny nejsou při nízkých teplotách rozpustné v žádném z uvedených roztoků (Steinhauser, 2000).
2.3.2.1 Skladba mastných kyselin n-3 PUFA ve svalovině prasat a obohacování krmiva o lněné semínko Tuk je důležitou složkou lidské stavy, ale momentální úroveň tukové skladby je buď vysoká, nebo nevyrovnaná. Velmi častý je nadměrný příjem nasycených mastných kyselin a konzumace nízkého množství kyselin polynenasycených. Je možné pozměnit obsah těchto mastných kyselin stravou zvířat u všech druhů masa. Enser a kol. (2000) provedl sérii výzkumů na osmdesáti prasatech samčího i samičího pohlaví. Tato prasata byla krmena buď krmivem kontrolním, které obsahovalo větší poměr kyselin řady n-6 (kyselina linolová), nebo testovací dietou. Testovací dieta byla obohacena o lněné semínko, které je bohaté na mastné kyseliny řady n-3 (kyselina αlinolenová) a měla nižší obsah kyselin n-6. Tato zdánlivě malá změna vedla k navýšení kyseliny α-linolenové (18:3) ve svalech a hlavně zvýšení obsahu prospěšných PUFAs s dlouhým řetězcem. V případě kyseliny EPA byl obsah zvýšen o 100 %, v případě kyseliny α-linolenové 55 %, u kyseliny DHA o 35 % a u kyseliny dokosapentaenové (DPA) 29 % a to u obou pohlaví. Nejvíce zastoupenou mastnou kyselinou v celém profilu byla kyselina olejová (u samčího pohlaví 414 mg/100 g svaloviny, u samičího pohlaví 330 mg/100 g svaloviny). U testovaných zvířat nebyly zjištěny žádné významné účinky na kvantitu nasycených a mononenasycených mastných kyselin. Obsah intramuskulárního tuku se nezměnil, ani vlivem pohlaví, ani vlivem diety. Změnila se pouze kompozice ve složení mastných kyselin. Okrouhlá a kol. (2009) stanovovali obsah mastných kyselin ve vepřovém mase také ve vztahu k pohlaví. Krmení se provádělo kompletní krmnou směsí, která se skládala ze tří komponentů (pšenice, ječmen a sojový extrahovaný šrot) a krmný doplněk. Po dosažení průměrné živé hmotnosti 111,8 kg byla prasata poražena a zatříděna na jatkách dle systému SEUROP metodou ZP (ČSN 466160). Z pravé jatečné půlky byly odebrány reprezentativní vzorky pečeně. Stanovení mastných kyselin bylo provedeno izolací lipidové frakce a následné methanolýze za katalytického působení hydroxidu draselného a extrakci kyselin ve formě methylesterů do heptanu. Z výsledků měření vyplynulo, že dominantní nasycenou mastnou kyselinou u vepříčků i prasniček byla kyselina pal-
25
mitová (231,35 a 167,29 mg/100 g svaloviny), dále kyselina stearová (116,97 a 78,81 mg/100 g svaloviny) a myristová (13,77 a 10,42 mg/100 g svaloviny). Z mononenasycených mastných kyselin byla nejvýše zastoupena kyselina olejová a to v množství 280,72 mg/100 g svaloviny u vepříčků a 210,21 mg/100 g svaloviny u prasniček, která byla zároveň nejvíce zastoupena z celkového profilu mastných kyselin. Z výsledků plyne, že mezipohlavní rozdíly nebyly statisticky významné. U obou výzkumů byla z celkového profilu mastných kyselin zastoupena v nejvyšším množství právě kyselina olejová.
2.3.3 Produkce a spotřeba vepřového masa Chov prasat spojený s produkcí vepřového masa je sektor zemědělské výroby, který po začlenění ČR do EU nejhůře odolává konkurenčnímu tlaku ostatních členských zemí. Od roku 2004 klesla domácí produkce o 21 %, stavy prasat se snížily o 22 %, naopak dovozy vepřového masa vzrostly více než dvojnásobně. Hlavními důvody zhoršení vývoje v tomto odvětví a utlumení chovu prasat v ČR má zejména dynamický vzestup cen obilí a tím pádem i zvýšené náklady na produkci vepřového masa (Abrahamová, 2009). Přitom spotřeba masa ve světě stále stoupá, ovšem velmi rozdílně v závislosti na koupěschopnosti obyvatel a na mnoha dalších faktorech. V ČR je průměrná roční spotřeba masa na jednoho obyvatele cca 80-85 kg v hodnotě „na kosti“, přičemž se mění poměrné zastoupení druhů masa (Ingr, 2003). Např. v roce 2008 byla celková spotřeba masa v České republice na 1 obyvatele 80,4 kg/rok (Situační a výhledová zpráva, 2010). Ve spotřebě masa v ČR má tradičně nejvyšší podíl maso vepřové. Český statistický úřad uvádí, že celková spotřeba vepřového masa v letech 2000-2006 činila 41,1 kg/obyvatele/rok (což je 48,3 % z celkové spotřeby masa). Vepřové maso je od roku 1965 světově nejvíce produkovaným druhem masa (Steinhauser, 2000). Nejvyšší spotřeba vepřového masa byla zaznamenána v České republice v roce 1990, a to 50,0 kg na obyvatele a kalendářní rok, od té doby se spotřeba postupně snižovala. Ke kolísání spotřeby dochází dlouhodobě v důsledku změn spotřebitelských zvyklostí. V devadesátých letech se postupně snižovala spotřeba masa, především hovězího i vepřového a naopak se prudce zvýšila obliba masa drůbežího.
26
Při posuzování spotřeby je nutno vnímat i skutečnost, že vepřové maso je konkurentem i ostatním druhům mas, především masu drůbežímu a hovězímu. Ale i případné zvýšení spotřeby masa rybího by pravděpodobně vedlo ke snížení spotřeby ostatních druhů mas, tedy i vepřového. Úroveň spotřeby je ovlivňována mnoha faktory, mezi něž patří demografické vlivy včetně věkové struktury obyvatel, spotřební zvyklosti, kupní síla spotřebitelů a jiné pří-
činy. Trend výživy v ekonomicky vyspělých státech je spojen v posledních dvou desetiletí s odklonem od konzumace vepřového masa k jiným, druhům mas s nižším obsahem tuku. Naopak v méně vyspělých státech se v souvislosti s akcelerací ekonomiky a vyšším nárůstem mezd předpokládá, že se spotřeba vepřového masa bude zvyšovat. Celosvětová produkce vepřového masa se v posledních letech postupně zvyšuje. Za deset let došlo k zvýšení produkce o 10 tis. tun. V roce 2009 činilo toto zvýšení meziročně 2,2 %. Produkce se logicky zvyšuje s možností se uplatnit, tj. se zvýšenou poptávkou, především v lidnatých asijských a latinskoamerických zemích, především Číně a Brazílii. Očekávaný je vzrůst spotřeby i produkce vepřového masa také v Rusku (Situační a výhledová zpráva, 2010). Celkem se ve světě chová asi 800 milionů kusů prasat, přičemž se i nadále předpokládá meziroční růst okolo 2 %. Celková produkce vepřového masa v roce 2005 se odhaduje na úrovni 101 milionů tun. Nejvyšší nárůst se předpokládá v Číně, Kanadě a USA. V zemích EU brzdí další rozvoj chovu prasat vysoká investiční náročnost především z hlediska ochrany životního prostředí a klesající zájem o maso v jejich zemích (Steinhauser, 2000). Spotřeba vepřového masa na obyvatele v ČR se trvale drží nad 40 kg za rok. Soběstačnost v komoditě vepřové maso se v ČR každoročně snižuje, protože klesá produkce, zatímco spotřeba je stabilní (Abrahamová, 2009). Na území České republiky, v průběhu historie československého a českého státu, je současný stav prasnic dosud nejnižší. Celkový stav prasat v roce 2010 odpovídá, s výjimkou válečných let, stavu na přelomu dvacátých a třicátých let minulého století (Situační a výhledová zpráva, 2010). Následující obrázek č. 4 znázorňuje průměrné ceny a výrobu vepřového masa za 3.
čtvrtletí roku 2010.
27
Vepřové maso - výroba a průměrné ceny zemědělských výrobců 85
43,0
41,0 75 Kč/kg
tisíc tun
39,0
37,0 65 35,0
55
33,0 III
IV
I 2009
výroba
II
III
IV
I 2010
II
III
cena (prasata, JUT, tř. j. S,E,U)
Obr. 4 Výroba a průměrné ceny vepřového masa (Český statistický úřad)
V roce 2008 nebyla ČR ve výrobě vepřového masa soběstačná, neboť celková produkce byla o 148,9 tis. t živé hmotnosti nižší, než činila domácí spotřeba. Z jednotlivých druhů masa, které se produkují v České republice, je soběstačnost trvale nejnižší. Vzhledem ke značnému úbytku prasnic a nízké rentabilitě produkce v předchozích letech se odhaduje, že bude v roce 2010 další meziroční snížení výroby vepřového masa o necelé dvě procenta na 416 tis. t živé hmotnosti. Spotřeba bude patrně stagnovat na úrovni 42 kg/obyvatele/rok. Očekává se, že poroste opět dovoz vepřového masa a živých prasat. Cena jatečných prasat se patrně výrazně nezvýší, neboť EU se jako významný světový vývozce vepřového masa dostává vlivem globální světové krize pod silný tlak ostatních konkurentů (např. Brazílie, USA), (Abrahamová, 2009). Ceny zemědělských výrobců jatečných prasat meziročně poklesly o 8,6 %. Jateční prasata zařazená do jakostních tříd S, E a U byla nakupována za průměrnou cenu 37,26 Kč/kg jatečně upraveného těla (JUT) a 28,87 Kč/kg živé hmotnosti (Český statistický úřad, 2010).
28
2.4 Plynová chromatografie Chromatografické metody představují nejdůležitější část separačních metod. Chromatografie využívá dělení látek mezi dvě fáze:
1. fázi pohyblivou, tzv. mobilní 2. fázi nepohyblivou, tzv. stacionární Fází mobilní může být kapalina nebo plyn. Fáze stacionární může mít v chromatografii velmi rozdílnou formu. Mohou jí být např.: částečky tuhé látky (velikost částic- jednotky až stovky µm), tenká vrstva kapaliny nanesená na pevných částicích, tenký film kapaliny na vnitřní stěně kapiláry (Jančářová, Jančář, 2003). Chromatografie je separační metoda, při které se oddělují složky obsažené ve vzorku. Svým určením je to především metoda kvalitativní a kvantitativní analýzy složek vzorku. V chromatografii se vzorek vnáší mezi dvě fáze. Jedna je nepohyblivá, stacionární fáze. Přes stacionární fázi se pohybuje fáze mobilní. Pohybem mobilní fáze je vzorek touto soustavou unášen. Složky vzorku, které lnou ochotněji ke stacionární fázi, se při pohybu zadržují více než jiné složky, které se ke stacionární fázi poutají hůře. Tím se postupně složky od sebe separují (Klouda, 1996). Dávkování vzorku na kapilární kolonu plynového chromatografu je jednou z kritických operací, která má velký význam pro výsledek stanovení (kvantitativní analýzu) analytu. Ideální dávkovač vzorků musí zabezpečit promíchání vzorku s nosným plynem ještě před začátkem separace na GC koloně, nemá snižovat účinnost separace a analyty se nesmí adsorbovat na stěny dávkovače anebo se nesmí změnit vzájemný poměr analytů. Dávkovač také nesmí diskriminovat analyty v závislosti od jejich teploty varu, molekulové hmotnosti, polarity a musí zabezpečit vysokou výtěžnost pro majoritní a minoritní (stopové) složky analyzované směsi (Tekeľ, Mikuš, 2005). Vzorek se dávkuje do proudu plynu, který jej dále unáší kolonou, proto se mobilní fáze nazývá nosný plyn. Aby vzorek mohl být transportován, musí se ihned přeměnit na plyn. V koloně se složky separují na základě různé schopnosti poutat se na stacionární fázi. Složky opouštějící kolonu indikuje detektor. Signál z detektoru se vyhodnocuje a z časového průběhu intenzity signálu se určí druh a kvantitativní zastoupení složek. Pro nutnost přeměny analytů v plyny můžeme separovat takové látky, které mají dostatečný tlak syté páry, jsou tepelně stálé a mají relativní molekulovou hmotnost menší než 1000. Obecně může být plynová chromatografie použita k separaci plynů, většiny nedisociovatelných kapalin a pevných organických molekul a mnoha organoko-
29
vových látek. Není použitelná pro separaci makromolekul, organických a anorganických solí. Častým postupem je chemická změna analytů nevyhovujících vlastností na deriváty, které mohou bát v analýze plynovou chromatografií použitelné (Klouda, 2003). V kapilární GC se rozlišuje dávkování vzorku: •
Dávkování s dělením vzorku
•
Dávkování bez dělení vzorku
•
Přímé dávkování do kolony
•
Dávkování s programovým odpařováním vzorku, (Tekeľ, Mikuš, 2005).
2.4.1 Rozdělení chromatografických metod Chromatografických metod je velké množství. Proto je účelné jejich rozdělení do určitých skupin. Vzhledem ke značné různorodosti se dělí podle několika hledisek: •
Podle skupenství mobilní fáze •
Kapalinová chromatografie (Liquid Chromatography - LC)- mobilní fází je kapalina.
• •
Plynová chromatografie (Gas Chromatography - GC)- mobilní fází je plyn.
Podle uspořádání stacionární fáze •
Kolonová chromatografie- stacionární fáze je umístěna v trubici (koloně).
•
Plošné techniky: o Papírová chromatografie (Paper Chromatography - PC)- stacionární fáze je součástí chromatografického papíru.
o Tenkovrstevná chromatografie (Thin Layer Chromatography - TLC)stacionární fáze je umístěna na pevném plochém podkladu (např. skleněné desce nebo hliníkové fólii). •
Podle povahy děje, který převládá při separaci
Obvykle se při separaci uplatňuje několik fyzikálně-chemických dějů současně, ale jeden z nich převládá. •
Rozdělovací chromatografie- o separaci rozhoduje odlišná rozpustnost složek vzorku ve stacionární fázi (kapalina) a mobilní fázi (kapalina nebo plyn). 30
•
Adsorpční chromatografie- o separaci rozhoduje různá schopnost složek poutat se (adsorbovat se) na povrch stacionární fáze (tuhá látka).
•
Iontově-výměnná chromatografie- o separaci rozhodují různě velké elektrostatické přitažlivé síly mezi funkčními skupinami stacionární fáze (iontoměnič) a ionty vzorku.
•
Gelová chromatografie- složky se separují podle velikosti na pórovité stacionární fázi (gelu); menší molekuly vzorku se v pórech gelu zdržují déle (molekulově síťový efekt).
•
Afinitní chromatografie- stacionární fáze je schopná vázat ze vzorku právě určité složky, ke kterým má úzce selektivní vztah (afinitu), (Klouda, 2003).
Tab. 4 Rozdělení plynové chromatografie dle použité stacionární fáze (Holzbecher, Churáček a kol, 1987)
Mobilní
Stacionární
fáze
fáze
kapalina
plyn
Separační
mecha-
nismus
Chromatografická technika
a funkce rozdělování, rozdělo-
plynová rozdělovací chromato-
vací rovnováha
grafie (GLC)
adsorpce, adsorpční
plynová adsorpční chromatogra-
izoterma
fie (GSC)
síťový efekt
plynová chromatografie na mo-
tuhá látka
lekulových sítech
U metody GSC je řídícím procesem adsorpce složky z plynné fáze na povrch pevného sorbentu a u GLC probíhá distribuce mezi plynnou mobilní fází a kapalnou stacionární fází. GLC má větší praktické uplatnění než metoda GSC. Plynová chromatografie se používá k dělení a následnému stanovení plynů, kapalin a látek s bodem varu zhruba do 400 °C. Protože složky jsou vždy separovány v plynné fázi, musí být definovaným způsobem vypařovány. Při vypařování se látky nesmí rozkládat a teplota 400 °C představuje horní teplotní limit většiny běžných plynových chromatografů (Jančářová,
Jančář, 2003).
31
2.4.2 Vývoj kolon v plynové chromatografii Plynové chromatografy a kolony, které se používají v dnešní době v plynové chromatografii, se postupně vyvíjeli v průběhu pěti desetiletí. V porovnání s dnešní moderní verzí lze první plynové chromatografy považovat za poměrně velké přístroje, ale byly takto vyrobeny především pro uschování kolon. Také podle hesla „čím větší, tím lepší“ bylo dříve umístěno v termostatu chromatografu větší množství kolon, což není v dnešní době bezpodmínečně nutné. Všeobecně je známo, že velké kolony v prostoru termostatu s sebou nesou potencionální problémy (např. teplotní gradienty, teplé a studené body) v případě instalace kolony z taveného křemene v prostorném termostatu. Kolony, které se využívaly v počátcích plynové chromatografie, byly vyrobeny z kovového potrubí, jako je měď, hliník a nerezová ocel viz obr. č. 5. Dodnes v provozu zůstávají pouze nerezové náplňové kolony. Kolony vyrobené z reaktivnějších kovů, jako měď a hliník se v dnešní době již nepoužívají. Použití měděných potrubí bylo v plynové chromatografii omezeno v podstatě jen na vedení nosného plynu a pomocná spojení k detektoru.
Obr. 5 Varianty náplňových kolon a jejich materiálů používaných při GC (Barry, Grob, 2007)
Na obrázku č. 5 jsou znázorněny možnosti materiálů, ze kterých byly vyrobeny náplňové kolony používané v plynové chromatografii. Zleva doprava: měděné potrubí kolony, hliníková kolona, kolona z hliníku pro preparativní GC, kolona z nerezové oceli, kolona z nerezové oceli stočená do konfigurace „svitku“, skleněné chromatografické kolony.
32
Plnění takovýchto kolon bylo událostí, která vyžadovala přítomnost dvou i více lidí a schodiště, v závislosti na délce kolony, kterou bylo nutno naplnit. Po rozvinutí kovové kolony na požadovanou délku se vkládali svazky skelné vaty do jednoho konce kolony a připojila se nálevka na druhý konec. Plnící materiál musel být přidáván postupně, zatímco druhá osoba postupovala po schodech a navíjela nebo vibrovala kolonou. Po ukončení plnění byla nálevka oddělena a konec kolony byl izolován chomáčem skelné vaty, poté se kolona svinula manuálně do žádoucího průměru. Tyto procesy vibrování a čepování při plnění kolony nakonec přispěly k neefektivnosti chromatografie. Skleněné kolony byly brzy uznány jako výhodnější alternativa kolon kovových. Sklo nabízí inertnější strukturu povrchu, i když jsou tyto sloupce křehčí a vyžadují opatrnější zacházení. Skleněné kolony musí být nakonfigurovány na geometrické rozměry přístroje, ve kterých mají být instalovány. Silanolové skupiny, které se vyskytují na vnitřní stěně skleněné kolony, mohou v kontaktu s roztoky o vyšším pH disociovat. Další vlastností skleněných kolon je, že si lze snadno představit, jestli je kolona správně naplněna. Přítomnost jakýchkoliv prázdných prostorů a možných zabarvení v náplni závisí na akumulaci par a částic, což naznačuje, že je třeba náplň kolony vyměnit. Většina laboratoří v dnešní době upouští od přípravy a plnění kolon, volí spíše kolony od dodavatelů. Vývoj kapilárních kolon se považuje za paralelní s kolonami nápl-
ňovými. První kapilární kolony prokázaly vyšší účinnost než jejich protějšky kolony náplňové, které byly primárně z nerezové oceli. Skleněné kapilární kolony posupně nahrazují kapilární kolony z nerezové oceli, ukázaly se inertnější a vysoce účinné, ale na druhou stranu i jako méně povrchově aktivní. Problémem byla jejich křehkost, vyžadující vyrovnání konce sloupce přidáním malého množství alikvotního nátěru. Nejspíš nejvýznamnějším pokrokem v technologii kolon bylo v roce 1979 zavedení taveného křemene společností Hewlett-Packard (nyní Agilent Technologies). Dnes mají kapilární křemenné kolony široké uplatnění a funkci, podobně jako vyšší inertnost a flexibilitu. Tyto vlastnosti přispěli k současnému zlepšení přítoku a detektorové modifikace a vyvinuly se s pokroky stacionární-fázové technologie (Barry, Grob, 2007).
33
2.4.3 Kolony v plynové chromatografii Rozeznáváme pouze dva typy kolon, tj. náplňové kolony, plněné adsorbentem nebo nosičem smočeným zakotvenou fází, a kapilární kolony, jejichž vnitřní povrch je potažen tenkým filmem zakotvené fáze (Holzbecher, Churáček a kol., 1987). Náplňové kolony jsou tedy trubice naplněné sorbenty nebo nosiči pokrytými kapalnou fází. Jsou vyrobeny z oceli nebo skla, vnitřní průměr kolony je 2 až 3 mm, délka 1 až 3 m. Mají vyšší kapacitu, než kapilární kolony (Klouda, 2003). Adsorbenty pro adsorpční chromatografii zahrnují např. tyto náplně: silikagel, alumina (oxid hlinitý), anorganické soli, molekulová síta (hlinitokřemičitany) a později porézní polymery a grafitizované uhlíky (saze), (Barry, Grob, 2007). Nosiče kapalné fáze pro rozdělovací chromatografii bývají např. na bázi křemeliny (oxid křemičitý). Upravují se tak, aby se při separaci neuplat-
ňovaly adsorpční schopnosti, protože separace složek mezi nosným plynem a zakotvenou kapalnou stacionární fází má probíhat pouze na principu rozdělování. Mikronápl-
ňové kolony jsou moderní účinné náplňové kolony, které mají malý průměr a obsahují velmi malé částice (např. průměru 10 µm i méně). Proto je při stejné délce jako u běžné náplňové kolony dosahováno vyšší účinnosti separace. Kapilární kolony využívají jako nosiče stacionární fáze své vnitřní stěny. Vyrábějí se obvykle z taveného křemene, vnitřní průměr kolon je v intervalu 0,1-0,6 mm, tloušťka filmu stacionární fáze 0,25-5 µm, délka 15-60 m, kapacita 50 ng až 15 µg a účinnost 1000-3000 teoretických pater na 1 m. Použití menších průměrů kolon vede k vyšší účinnosti, ale nižší kapacitě. Užší kolony nemohou být tak dlouhé, protože by byl prodloužen čas separace. Obecně platí, pokud roste vnitřní průměr a tloušťka stacionární fáze, účinnost separace se snižuje. Kapilára je obalena polyimidovou vrstvou, která dává křehkému materiálu kolony pružnost a brání ho před zlomením. Kolonu chrání do teplot 350 °C, termicky stabilnější hliníková vrstva může být použita do 425 °C (maximální stabilitu ale určuje stabilita zakotvené stacionární fáze a analytů). Podle uložení mobilní fáze rozlišujeme tři typy kapilárních kolon: •
Kolony WCOT (Wall Coated Open Tubular) kapalná stacionární fáze tvoří tenký film na vnitřní straně kapiláry. Kolony musí být velmi úzké, aby byl zajištěn dostatečný styk mobilní fáze se stacionární fází.
•
Kolony SCOT (Support Coated Open Tubular) mají na vnitřní stěně vrstvu nosiče se zakotvenou kapalinou.
34
•
Kolony PLOT (Porous Layer Coated Open Tubular) mají na vnitřní stěně tenkou vrstvičku pórovitého materiálu (např. aluminy), která slouží jako adsorbent.
Podobné typy kolon SCOT a PLOT jsou svými charakteristikami střední cestou mezi kapilárními a náplňovými kolonami. Oba typy mají vyšší kapacitu než WCOT. V současné době se ale obecně dává přednost WCOT kolonám. Je-li nutno pracovat s vyšší kapacitou, volí se WCOT kolona s větším průměrem. PLOT kolony s molekulovými síty nebo aluminou jsou ještě používány pro separaci velmi těkavých analytů a permanentních plynů (Klouda, 2003). Hlavní podmínkou úspěšného využití rozdělovací plynové chromatografie je kromě spolehlivého přístroje i správná volba zakotvené stacionární fáze. Chromatografie v systému plyn-kapalina využívá dělení látek v podobě plynů a par mezi kapalnou zakotvenou stacionární fází a plynnou mobilní fází. Stacionární fáze smáčí buď stěny kolony, nebo je nanesena na povrch nosiče (Holzbecher, Churáček a kol., 1987). Stacionární fáze se fyzikálně nebo chemicky zakotví na vnitřní stěnu kapilární kolony typu WCOT. Chemicky vázané stacionární fáze zaručují: vysokou tepelnou stabilitu stacionární fáze, stabilní film stacionární fáze, možnost přípravy kolony s hrubým filmem stacionární fáze, minimální únik stacionární fáze a také zaručují stacionární fázi, kterou nelze vymýt z kolony běžnými rozpouštědly. K přípravě chemicky vázané fáze na stěnu kapiláry se často používají polymerační reakce. Vazby křemík-uhlík vznikají při polymeraci a je možné je iniciovat radikály, které vznikají tepelným rozkladem organických peroxidů nebo účinkem γ-záření. Stacionární fáze pro GC se konvenčně rozdělují na nepolární, semipolární a polární fáze. Parametry, které charakterizují kapilární kolony: •
Délka kolony (m)
•
Vnitřní průměr (I.D.) kolony (mm)
•
Typ chemicky imobilizované stacionární fáze
•
Polarita stacionární fáze
•
Hrubost filmu (df) stacionární fáze (µm), (Tekeľ, Mikuš, 2005).
Stacionární kapaliny by měly dobře rozpouštět separované látky a samy být teplotně stálé a málo těkavé. Měli by pevně ulpívat na nosiči, aby nedocházelo k jejich vymývání z kolony. Hojně využívaným řešením je chemické zesíťování stacionární kapaliny a případné navázání kovalentní vazbou na nosič (Klouda, 2003).
35
Stacionární zakotvenou fázi volíme podle charakteru dělených složek. Polární látky rozdělíme na polárních fázích, nepolární látky na nepolárních fázích. Čím je zakotvená fáze polárnější, tím je její působení selektivnější. Na nepolární zakotvené fázi se látky dělí podle svých teplot varu. Použitím polární fáze můžeme jejich sorpci ovlivnit tak, že dochází-li k silnějším interakcím (vytváření vodíkových vazeb), může se měnit pořadí eluce (Holzbecher, Churáček a kol., 1987). Volba stacionární fáze je obvykle rozhodující pro výběr vhodné kolony pro vzorek, který chceme analyzovat (Klouda, 2003).
2.4.4 Detektory v plynové chromatografii Detektory jsou citlivé snímače, které zaznamenávají v mobilní fázi přítomnost složky, která opouští kolonu chromatografu. Citlivost, selektivita a lineární dynamický rozsah (LDR) detektoru patří mezi základní kritéria hodnocení vlastností GC detektoru. Hodnota LDR udává rozsah, ve kterém závislost odezvy detektoru od koncentrace nebo hmotnosti je lineární (Tekeľ, Mikuš, 2005). Nosný plyn z kolony protéká detektorem, který reaguje na přítomnost analytu a vysílá signál, jenž je zaznamenáván v závislosti na čase. Detektor sleduje takovou vlastnost plynu z kolony, která závisí na druhu a koncentraci složek (analytická vlastnost). Musí mít dostatečnou citlivost (nízký detekční limit) a jeho odezva by měla být lineární funkce obsahu analytu. Citlivější detektor změní signál při určité změně obsahu složky více než detektor méně citlivý a je schopen detekovat nižší nejmenší postřehnutelný obsah složky. Důležitým požadavkem je vysoká selektivita pro stanovované analyty. Nejpoužívanější jsou tepelně-vodivostní detektor (Thermal Conuctivity Detector TCD), plamenový ionizační detektor a detektor elektronového záchytu.
2.4.4.1 Ionizační detektory Funkce ionizačních detektorů je založena na vedení elektřiny v plynech. Základem aparatury je izolovaná nádoba, kterou proudí plyn přes dvě kovové desky (elektrody), mezi nimiž je elektrické pole (Klouda, 2003). Zdroj ionizovaných částic je dvojí: plamen (plamenový ionizační detektor, FID), nebo radioaktivní záření (podle druhu záření a podle konstrukce detektoru jde o argonový nebo heliový detektor a o detektor elektronového záchytu, ECD), (Holzbecher, Churáček a kol., 1987).
36
•
Plamenový ionizační detektor (Flame Ionisation Detector - FID)
FID je nejrozšířenějším detektorem v plynové chromatografii. Princip spočívá v ionizaci molekul eluovaných látek v kyslíko-vodíkovém plameni (Smolková, Feltl, 1991). Nosný plyn se před vstupem do hořáku mísí s vodíkem, vzduch je přiváděn z vnějšku. Přítomnost složky zvýší ionizaci a elektrický proud se zvětší. Detektor je velmi citlivý. Detekční limity jsou v piktogramech analytu. Jako nosný plyn se hodí nejlépe dusík, ale použitelné jsou i ostatní nosné plyny. Detekuje prakticky vše, s výjimkou anorganických par a plynů (necitlivost na vodu sice nabízí možnost jejího použití jako rozpouštědla, ale voda snižuje odezvu detektoru a může až zhasnout hořák). Organické látky se teplem plamene štěpí na radikály, které s vodíkem v redukční
části plamene dávají radikály ⋅ CH . Ty se oxidují za vzniku iontů CHO + a elektronů, což je rozhodující pro odezvu detektoru. Ionty zanikají rekombinačními reakcemi, např. s vodou (vznik iontu H 3O + , který posléze zachytí elektron za vzniku vody a radikálu
⋅ H ) a s heteroatomy molekul organických sloučenin (Klouda, 2003). Odezva plamenového ionizačního detektoru vztažená na 1 mol vstupující látky závisí na počtu aktivních uhlíkových atomů v molekule chromatografované látky, na charakteru vazeb mezi uhlíky a na počtu neuhlíkových atomů. Efektivní uhlíkový atom je schopen v plamenu poskytnout ion, jenž se projeví při detekci. Odezva je při optimálním nastavení poměru průtoku nosného plynu a vodíku lineárně závislá na koncentraci ve velkém rozsahu koncentrací. FID je detektor s velkou citlivostí, použitelný i pro stopovou analýzu (Holzbecher, Churáček a kol., 1987).
Obr. 6 Flame ionisation detector (Braithwaite, Smith, 1999)
37
Kromě výše uvedeného plamenově ionizačního detektoru, který jsme při svých analýzách výhradně využívali my, patří do skupiny ionizačních detektorů také:
•
Plamenový ionizační detektor s alkalickým kovem (AFID)
•
Detektor elektronového záchytu (Electron Capture Detector - ECD)
•
Fotoionizační detektor (Photoionisation Detector - PID)
2.4.5 Teoretické základy chromatografického procesu Podle způsobu zavádění vzorku na kolonu a podle eluční síly použité mobilní fáze rozlišujeme tři techniky vyvíjení: eleuční vyvíjení, vytěsňovací vyvíjení a frontální vyvíjení, z nichž však pouze eluční technika našla širší uplatnění v praxi. Při elučním vyvíjení se vzorek zavádí na kolonu diskontinuálně a jeho složky jsou na koloně silněji sorbovány než složky mobilní fáze. Jednotlivé komponenty vzorku jsou eluovány z kolony v pořadí podle velikosti sorpce na stacionární fázi a jsou vzájemně odděleny čistou mobilní fází (Holzbecher, Churáček a kol., 1987). Z kolony vychází nejdříve ta složka, která se nejméně zachycuje na stacionární fázi. Čas, za který složka vyjde z kolony je pro ni za daných experimentálních podmínek charakteristický. Proto se tento časový údaj využívá k její identifikaci. Vzniklý chromatogram je tvořen sérií elučních píků, křivek. Zaznamenává se signál z detektoru v závislosti na čase nebo proteklém objemu nosného plynu (Klouda, 2003). Tohoto způsobu se v praxi používá téměř výlučně, neboť jím je možné dosáhnout nejlepšího rozdělení složek vzorku. Mění-li se polarita mobilní fáze s časem, mluvíme o gradientové eluci. Získávání výsledků ve všech kolonových chromatografických technikách je shodné. Při nástřiku vzorku do chromatografické kolony se nejdříve utvoří eluční zóna (pás), která obsahuje směs složek. Ty jsou potom unášeny mobilní fází a na koloně naplněné sorbentem dochází k jejich separaci. Po výstupu první látky z kolony indikuje detektor její přítomnost v eluátu a zaznamená eluční pík (křivku). Když všechny rozdělené látky vyjdou, jsou na záznamu zapisovače patrny eluční píky. Při průchodu separované složky kolonou přejde každá její molekula mnohokrát z mobilní fáze do sorbentu a zpět. Doba, po níž separovaná látka setrvá v koloně, závisí na velikosti interakcí a určuje pořadí, v němž složka vychází z kolony ven. Čím větší
38
jsou tyto interakce ve stacionární fázi, tím větší je hodnota elučního času či objemu (Holzbecher, Churáček a kol., 1987). Chromatografický proces lze interpretovat jako děje související s distribucí látek mezi různé fáze a vlivy způsobující rozšíření zón v důsledku transportu látek kolonou. Základní podmínky pro dělení látek jsou dány jednak jejich rozdílnou migrační rychlostí, jednak rozšiřováním zón během chromatografického procesu. Migrační rychlost závisí na podmínkách rovnováhy, tj. na distribuční konstantě a průtoku nosného plynu, zatímco rozšiřování zóny je důsledkem základních procesů toku, difúze a přenosu hmoty (Smolková, Feltl, 1991).
2.4.6 Popis chromatogramu Složky vzorku vycházející z kolony detekuje detektor a výsledek chromatografické separace je eluční křivka neboli pík. Eluční křivka vyjadřuje závislost odezvy detektoru na čase nebo objemu proteklé mobilní fáze. Základní veličinou každé analyzované látky v daném chromatografickém systému je eluční (retenční) čas t R a eluční (retenční) objem VR . Eluční čas t R je doba od nástřiku vzorku na kolonu po maximum eluční křivky. Eluční objem VR je celkový objem mobilní fáze, který proteče od nástřiku vzorku na kolonu až po maximum eluční křivky. Vztah mezi elučním časem a elučním objemem lze popsat rovnicí:
V R = t R ⋅ Fm kde Fm je objem mobilní fáze proteklý kolonou za 1 sekundu (objemový průtok v cm3.s-1), (Jančářová, Jančář, 2003). Eluční objem VR je dán součtem dvou objemových veličin:
V R = V R´ + VM kde V R´ je redukovaný eluční objem (označovaný též jako skutečný eluční objem), VM je mrtvý objem, tj. celkový objem, jenž zaujímá mobilní fáze od místa nástřiku přes kolonu až po detektor. Mrtvý objem VM se zjistí experimentálně jako eluční objem nesorbujícího se inertu. Start označuje okamžik, kdy je vzorek vpraven do chromatografické kolony. Na záznamu se na osu x vynáší čas či objem, na osu y odezva detektoru, která bývá z pravidla funkcí koncentrace složky v mobilní fázi vytékající z kolony (Holzbecher, Churáček a kol., 1987). 39
Hlavním cílem chromatografické analýzy je co nejlépe rozdělit analyzovaný vzorek a to v přijatelném čase. Při separaci vzorku může dojít k úplnému, částečnému nebo nedokonalému rozdělení složek (Jančářová, Jančář, 2003). Základní linie je odezva detektoru při průchodu mobilní fáze neobsahující dělené složky, tj. v případě, kdy kolonou prochází pouze nosný plyn. Základna píku je linie získaná interpolací základní linie mezi počátkem a koncem píku. Plocha píku A je plocha vymezená eluční křivkou a základnou píku. Výška píku h je vzdálenost mezi vrcholem eluční křivky a průsečíkem kolmice spuštěné z vrcholu se základnou píku. Šířka píku Y je část základní linie mezi průsečíky tečen k inflexním bodům eluční křivky. Šířka píku v poloviční výšce Y1/2 je úsečka vedená v polovině výšky rovnoběžně se základnou (Smolková, Feltl, 1991).
2.4.7 Kvalitativní a kvantitativní vyhodnocení Nositelem kvalitativní informace jsou eluční parametry t R a VR . Je však nemožné opírat se o absolutní hodnoty, neboť jsou závislé na všech experimentálních podmínkách chromatografické analýzy. Kvalitativní analýza je proto založena na porovnání elučního času nebo objemu neznámé složky s elučním časem nebo objemem standardu za stejných podmínek. Kvantitativní analýza vychází z toho, že plocha vymezená píkem nad základní linií je úměrná množství (koncentraci) látky. Kvantitativní analýze musí předcházet měření plochy píků, které se v současnosti provádí výhradně digitálními integrátory (Jančářová, Jančář, 2003). Podle klasického pojetí kvantitativní chemické analýzy je GC metoda submikrogramová. Stanovení je často prováděno s nanogramovými, ale i pikogramovými množstvími. Práce s malými množstvími je pro plynovou chromatografii důležitá především z hlediska účinné separace látek na koloně, ale na straně druhé se stává zdrojem chyb ovlivňujících přesnost i správnost kvantitativní analýzy. Problematika kvantitativní analýzy GC souvisí jak přímo s chromatografickým systémem, tak se způsoby provedení a zpracování chromatogramu. Kvantitativní interpretace chromatogramu závisí jednak na použité pracovní technice, jednak na typu detektoru. Skutečný chromatogram je ovlivněn řadou chyb způsobených při přípravě vzorku, jeho dávkování, vlastním separačním dějem, vlastnostmi detektoru, dalšími pracovními podmínkami i zapisovačem
40
a v poslední fázi i technikou a metodou kvantitativního vyhodnocení chromatogramu. Úkolem analytika je omezit zdroje chyb na minimum, při správném rozboru úkolu a provedení plynově chromatografické analýzy se relativní chyba stanovení pohybuje v rozmezí jednotek až desetin procenta. Nejpoužívanějšími pracovními technikami kvantitativní analýzy jsou vnitřní normalizace, absolutní kalibrace a vnitřní standardizace (Smolková, Feltl, 1991). Metoda vnitřní standardizace spočívá v přidání známého množství standardní látky ke vzorku. Výsledek zjistíme nástřikem vzniklé směsi a vyhodnocením příslušných ploch. Přidávaný standard nesmí být přítomen v původním vzorku, nesmí reagovat s žádnou složkou směsi a musí být dobře oddělen od všech ostatních složek. Standard má být zvolen tak, aby byl eluován blízko složky, jejíž koncentraci chceme stanovit. Výhodou této metody je, že stanovované látky i standard jsou chromatografovány během jediného experimentu a že není nutné znát přesné množství dávkované směsi. Proto tuto techniku používáme zejména tehdy, když se dávkovaný objem obtížně definuje, jako např. při použití děliče v kapilární chromatografii, nebo předchází-li analýze úprava vzorku např. derivatizací (Smolková, Feltl, 1991).
2.4.8 Mez stanovitelnosti a mez detekce Výsledkem analytického postupu při stanovení složek vzorku je analytický signál, který má v případě GC charakter kontinuální (chromatogram). Z naměřeného analytického signálu se získává požadovaná hodnota obsahu složek vzorku pomocí nejrůznějších vyhodnocovacích technik. Mez detekce (limit of detection, LOD) je nejnižší koncentrace analytu, která může být stanovena s přijatelnou přesností za uvedených podmínek zkoušky. Obvykle je definována jako trojnásobek poměru signál/šum (LOD = 3 ⋅ Signal / Noise ) nebo trojnásobek směrodatné odchylky slepého pokusu (3 ⋅ SDbl ) . Mez stanovitelnosti (limit of quantification, LOQ) je nejnižší koncentrace analytu, která může být kvantifikována v daném vzorku s přijatelnou přesností (opakovatelností) a správností za uvedených podmínek zkoušky. Obvykle je definována jako desetinásobek poměru signál/šum
(LOQ = 10 ⋅ Signal / Noise )
nebo desetinásobek směrodatné
odchylky slepého pokusu (10 ⋅ SDbl ) , (Kubáň, Kubáň, 2007).
41
3 CÍL PRÁCE Cílem diplomové práce bylo vypracovat literární rešerši na téma Plynová chromatografie mastných kyselin ve vzorcích vepřového masa. V rešerši bylo úkolem zaměřit se na chemické vlastnosti mastných kyselin a jejich chování při různých podmínkách. Dále se zaměřit na možnosti měření mastných kyselin metodou plynové chromatografie v různém uspořádání. Navrhnout, popřípadě upravit metodiku pro stanovení mastných kyselin pomocí plynové chromatografie. Provést měření mastných kyselin na chromatografu GC Fisons 8000 series ve vzorcích vepřového masa. Statisticky zpracovat naměřené výsledky, rozvinout diskuzi a porovnat tyto výsledky s literárními zdroji.
42
4 MATERIÁL A METODIKA
4.1 Použité chemikálie a laboratorní pomůcky 4.1.1 Použité chemikálie Při derivatizaci vzorku mastných kyselin jsem používala Isooktan p.a. (C 8 H 18 ) Lach-Ner, s.r.o., objem 1000 ml a M= 114,23 g/mol, 99%. Methanol Chromasolov for high-performance liquid chromatography
(CH 4 O )
Sigma Aldrich Chemistry,
M= 32,04 g/mol, 99,90 % a Sodium 99 % od stejné společnosti. Bron trifluridemethanol solution (CH 4 BF3 O ) , Sigma Aldrich, 14 % in methanol, 1000 ml, s teplotou skladování 2-8 °C. Chlorid sodný ( NaCl ) Lach-Ner, s.r.o., 1000 g. Síran sodný bezvodý p.a. ( Na 2 SO4 ) od společnosti PENTA Ing. Petr Švec, M= 142,04 g/mol, 1000 g, 99 %. Pro ověření správnosti metody byly použity tyto mastné kyseliny: Pentadecanoic acid 10 g (CH 3 [CH 2 ]13 CO2 H ) , 99+ %, Sigma Aldrich Chemistry, Linolenic acid 10 ml
(C18 H 30 O2 ) , FLUKA-Chemika, M= 278,43 g/mol, teplota skladování +4 °C. Kyselina olejová čistá (C18 H 34 O2 ) Lach-Ner, s.r.o., 900 ml, M= 282,47 g/mol, skladování +1 až +5 °C a Linoleic acid 5 ml
(C18 H 32 O2 )
od firmy FLUKA-Chemika,
M= 280,46 g/mol, skladování při +4 °C.
4.1.2 Použité laboratorní pomůcky Z přístrojové techniky byl používán chromatograf GC Fisons 8000 series, vodní lázeň Kryostate K10 E1 medingen Stırk tronic (Fiemegruppe Preiss-Daimler), analytické váhy KERN & Sohn GmbH, type: ABJ 220-4M a zařízení pro přípravu ultračisté vody Watek DEMIWA 10 ros. K odebírání vzorku tuku MK přímo z varné baňky se zábrusem o objemu 250 ml byla použita mikropipeta FINNPIPETTE Thermo Scientific 10-100 µl, dále se používala k odměření reagencií mikropipeta BIOHIT Proline 100-1000 µl, špičky k mikropipetám JK 397 311 762 100 Chirana (1000 ks).
43
K vlastní derivatizaci se používaly varné baňky se zábrusem o objemu 100 ml a plastová svorka k upevnění varné baňky ke kuličkovému chladiči, laboratorní stojan a držák. K přípravě pracovních roztoků byly použity skleněné odměrné válce o objemech 50, 250 a 500 ml, odměrné baňky 100 a 200 ml, zátky pastové, porcelánová lodička na vážení, skleněná tyčinka, skleněná nálevka, nůžky, lihový popisovač, Parafilm “M“ Laboratory film Greenwich a nerezový kopist se lžící. Petriho miska a skalpel byli použity k odběru sodíku a přípravě methanolátu sodného. K manipulaci se vzorkem po derivatizaci se používali vialky šroubovací ND 18 o objemu 16 ml, k nim se používal uzávěr PP černý pro šroubovací vialky ND 13, otvor 8,5 mm, silikon. K uchování vzorku po derivatizaci se používaly vialky šroubovací ND 13 o objemu 4 ml a k nim uzávěr magnetický pro vialky ND 18 otvor 8 mm, butyl
červ./PTFE šedý. Vše od společnosti Fisher Scientific. Injekční stříkačka Chirana T. Injecta, a.s. 5 ml s jehlou TERUMO 1.2 x 40 mm LUER. K nástřiku vlastního vzorku na GC kolonu byl používán injektor hp 9301-0246 o objemu 10 µl.
4.2 Příprava pracovních roztoků 4.2.1 Příprava methanolátu sodného Sodík je velmi měkký, vysoce reaktivní, stříbrobílý a lesklý kov. Na vzduchu je sodík nestálý a rychle se pokrývá vrstvičkou hydroxidu sodného (NaOH), s kyslíkem hoří za vzniku peroxidu Na2O2. Elementární kovový sodík se dlouhodobě uchovává v petroleji, s nímž nereaguje. Před vlastním vážením je třeba nožíkem odstranit vrchní zoxidovanou vrstvu. Navažuje se 1,15 g/100 ml methanolu. Před vlastním rozpouštěním sodíku v methanolu je lepší nechat vrchní vrstvu zreagovat v menším
množství methanolu, který
se k vlastnímu stanovení již nepoužívá. Do methanolu se takto navážený a připravený sodík přidává po menších kouscích, směs se poměrně dost zahřívá, je lépe pracovat v digestoři.
44
4.2.2 Příprava roztoku isooktanu s vnitřním standardem Navážka vzorku tuku se při derivatizaci rozpouští ve 3 ml roztoku vnitřního standardu, jenž tvoří isooktan a kyselina pentadekanová. Koncentrace kyseliny pentadekanové je 1 g/200 ml isooktanu. Na analytických vahách jsem na porcelánovou váženku navážila požadované množství kyseliny pentadekanové, poté jsem vše kvantitativně převedla do odměrné baňky o objemu 200 ml. Nejprve jsem přidala menší množství isooktanu, ve kterém se kyselina pentadekanová dokonale rozpustila, poté jsem baňku doplnila po rysku isooktanem. Takto připravený roztok izooktanu s vnitřním standardem kyseliny pentadekanové se uchovával v lednici.
4.2.3 Příprava nasyceného roztoku NaCl Do kádinky s destilovanou vodou se přidával za stálého míchání chlorid sodný (NaCl) do té doby, než se vytvořil přesycený roztok. Poté se roztok převedl do odměrné baňky pro lepší uchovávání a manipulaci.
4.3 Lyofilizace a extrakce vzorku Vlastní derivatizaci mastných kyselin, kterou pro mě zpracování jednotlivých vzorků začínalo, předchází příprava vzorku vepřového masa lyofilizací a extrakcí, při kterých je ze vzorku vepřového masa odstraněna veškerá voda v mase obsažená a zároveň je získán veškerý možný tuk. Lyofilizace neboli sušení vymrazováním je nejšetrnější metodou přípravy suchých látek. Při sušení vymrazováním se využívá fyzikálního jevu sublimace ledu, tj. bezprostředního přímého přechodu z pevné fáze do fáze plynné. Vybraný vzorek masa byl zvážen a nakrájen na 0,5 cm velké kousky. V hliníkových miskách je vložen do přístroje ALPHA 1-2 LO plus (Christ, LABIKOM), ve kterém je nastaven 48 hodinový program. Dochází k vysušování zmražených vzorků při teplotě -40 °C po dobu 40 hod a následně se vzorek dovysušuje při teplotě -50 °C 8 hod za podtlaku 35 mPa. Tato metoda se využívá pro šetrné odstranění veškeré vody v potravině a zachování ostatních látek v co nejméně porušeném stavu.
45
Po skončení lyofilizace je vysušený vzorek zvážen a pomocí pinzety vložen do extrakční patrony, jejíž vrchní část je přeložena. Patrona je vložena do střední části Soxhletova extraktoru. Extraktor se nasadí na čistou, vysušenou a zváženou varnou baňku se zábrusem o objemu 250 ml, do níž se nalije petrolether. Po zapojení chladící vody se extrahuje 4 hodiny na elektrickém vodním hnízdě VL-32 KAVALIER o teplotě lázně 65 °C. Po skončení extrakce byla baňka vyjmuta a přebytečné rozpouštědlo bylo odstraněno na vakuové rotační odparce HB4 basic (KIKA Labortechnik) při 40 °C. Na závěr byl zvážen veškerý získaný tuk (Rozíková, 2010). Takto je vzorek vepřového tuku připraven k vlastní derivatizaci a poté k samostatné analýze spektra jednotlivých mastných kyselin a také jejich procentuálního zastoupení v tuku pomocí plynového chromatografu.
4.4 Derivatizace vzorku Před vlastním měřením vzorku pomocí GC je nutné nejprve provést methylaci (derivatizaci) mastných kyselin. Účelem derivatizace je převedení málo těkavých mastných kyselin ve vzorku na jejich těkavé estery. Pro toto konkrétní stanovení mastných kyselin se využívá methylesterů FAME (fatty acids methyl esters). K derivatizaci FAME, která probíhá v roztoku methanolu, se většinou využívá reesterifikace katalyzovaná bazicky. U kysele katalyzované reesterifikace dochází, na rozdíl od té bazické, k esterifikaci volných mastných kyselin, také může docházet k posunu dvojných vazeb mastných kyselin. Navážka čistého vzorku 0,05 g <0,04-0,06> byla rozpuštěna ve 3 ml isooktanu p.a. (M=114,23 g/mol) s vnitřním standardem kyselinou pentadekanovou. Poté se přidalo mikropipetou 3 ml methanolátu sodného (11,5 g/l Na v CH3OH), methanolát sodný zde vytváří alkalické prostředí a dochází k tvorbě solí mastných kyselin. V kombinaci s alkoholem vznikají estery mastných kyselin. Směs byla poté zahřívána ve vodní lázni Kryostate K10 E1 medingen Stırk tronic při teplotě 60 °C (± 1,5 °C) po dobu 5 minut. Po této době bylo přidáno 3 ml 14 % BF3 v CH3OH přes zpětný chladič a směs byla zahřívána dalších 5 minut. V tomto alkalickém prostředí dochází k esterifikaci zbylé organické části. Po uplynutí dané doby byla směs odstavena a přidalo se mikropipetou 2 ml isooktanu. Vzorek se promíchal, poté se přidalo 5 ml nasyceného roztoku NaCl a celá směs se opět důkladně promíchala. Na dně baňky se vysrážela sůl, která vznikla
46
procesem vysolování glycerinu s NaCl. Organický podíl i s částí sraženiny se slil do vialky (kvůli navrstvení směsi do vyššího sloupce), ze které byla potom injekční stříkačkou s jehlou odsána pouze organická část vzorku. Na každý vzorek se použila nová sada injekční stříkačky s jehlou. Takto potřebná část vzorku byla převedena do
čisté skleněné vialky, ve které bylo již naváženo 0,5 g bezvodého síranu sodného. Vzorek se opět důkladně protřepal, popřípadě se přidal další bezvodý síran sodný do úplného vyčeření. Z takto připraveného vzorku se odebral 1 µl, který byl ručně nastříknut pomocí injektoru na chromatografickou kolonu. Vzorky, které nebyly změřeny hned po derivatizaci, se uchovávali v mrazícím zařízení (Rozíková, 2010).
4.5 Parametry chromatografu Stanovení methylesterů mastných kyselin ve vzorcích tuku vepřového masa bylo provedeno po předchozí derivatizaci na plynovém chromatografu Fisons GC 8000 series. Součástí tohoto chromatografu je GC kolona s názvem: Capital Analytical RH1ms+. S teplotními limity 60-360/370 °C, s průměrem 0,25 mm, délkou 30 m a tloušťkou filmu 0,25 µm. Tato kapilární kolona je vyrobena ze 100 % dimethylpolysiloxanu. Kolona je vhodná k analýze zjištění užívání drog, pesticidů, aminů, FAME, fenolů, PCB, uhlovodíků, methylterciálních butyletherů (MTBE), glykolů. Plynový chromatograf Fisons GC 8000 series je dále vybaven plamenovým ionizačním detektorem. Veškeré vyhodnocení bylo prováděno pomocí počítače v programu Clarity.
4.5.1 Podmínky měření na GC K vlastnímu měření bylo použito již odzkoušené nastavení tohoto chromatografu v budově N Ústavu technologie potravin dle Rozíkové (2010). Analýza plynového chromatografu Fisions Instrument MFC 800 začíná při 140 °C po dobu 5 minut, teplotní gradient je 4 °C/min. až na teplotu 240 °C, při které rovněž setrvává 5 minut. Ponechali jsme teplotní gradient 30 °C/min. až na 300 °C, doba setrvání 2 min. pro vyčištění kolony. Teplota detektoru a injektoru byla nastavena na 260 °C.
47
Použité plyny (SIAD): nosný plyn N2 o čistotě 5.0 a pracovním tlaku 100 kPa, H2 o čistotě 4.5 a pracovním tlaku 80 kPa a AIR o čistotě 4.5 a pracovním tlaku 150 kPa. Další nastavení GC bylo Split 1:100, zádrž Top: 0 min., zádrž Bottom: 0 min.
48
5 VÝSLEDKY A DISKUZE
5.1 Ověření správnosti zvolené metodiky Vhodnost nastavených parametrů na GC jsme si ověřili reprodukovatelností kyseliny pentadekanové (Sigma-Aldrich s.r.o., koncentrace 99+ %), navážka této kyseliny byla 0,01 g a při derivatizaci se rozpouštěla v čistém isooktanu. Ověřoval se také nástřik stejné navážky kyseliny pentadekanové rozpuštěné při derivatizaci v roztoku isooktanu s vnitřním standardem kyseliny pentadekanové. Jako vnitřní standard jsme zvolili mastnou kyselinu, která by se v daných vzorcích vepřového masa normálně vyskytovat neměla. Použitím tohoto vnitřního standardu (kyselina pentadekanová) o předem známé koncentraci, který je smíchán s rozpouštědlem (isooktan) a používá se při derivatizaci vzorku, nám pomohlo optimalizovat výsledky. Po analýze lze z chromatografu, díky tomuto vnitřnímu standardu, určit z plochy píků množství a výtěžnost MK pro jednotlivé vzorky vepřového masa. Samostatně byly proměřeny také kyseliny linolová, linolenová a olejová, o kterých se předpokládalo, že se v reálných vzorcích budou vyskytovat v největším zastoupení. Tyto kyseliny se poté změřily i ve směsích s rozdílnou koncentrací, abychom zjistili případné kvalitativní změny při jejich vyhodnocení v chromatogramu. Koncentrace jednotlivých mastných kyselin jsou uvedeny v následující tabulce č. 5. Tyto tři varianty směsi MK se navážili dle uvedeného množství v tabulce č. 5 a provedla se derivatizace, jejíž postup je uveden v oddílu č. 4.4.
Tab. 5 Navážky jednotlivých mastných kyselin ve směsích různých koncentrací
Mastná
1. směs (g)
2. směs (g)
3. směs (g)
18:1
0,01
0,05
0,01
18:2
0,05
0,01
0,01
18:3
0,01
0,01
0,05
kyselina
Byly provedeny také kalibrace vybraných mastných kyselin. Na následujícím obrázku č. 7 je znázorněna kalibrační křivka kyseliny linolové. Osa x znázorňuje množství
49
kyseliny linolové v [µl ] a osa y její odezvu v [mV ⋅ s ] . Kalibrační křivky, které jsou zde uvedeny, byly pořízeny v programu Clarity. Kyselina linolová vykazovala odezvu signálu při stanovení pomocí GC v 23,950 minutě analýzy, kyselina olejová byla detekována v 24,160 minutě, kyselina palmitová v 19,900 minutě a kyselina stearová v 24,960 minutě analýzy.
Obr. 7 Kalibrační křivka kys. linolové
Obr. 9 Kalibrační křivka kys. palmitové
Obr. 8 Kalibrační křivka kys. olejové
Obr. 10 Kalibrační křivka kys. stearové
50
Pro kvalitativní analýzu bylo využíváno srovnání retenčních časů vzorků s retenčními časy standardů použitých při stejných podmínkách analýzy. Hlavním standardem byl mix 37 složek FAME od společnosti Supleco. Pro správné určení dané mastné kyseliny ve vzorku vepřového masa byly jednotlivé retenční časy MK změřeny, jak směsí 37 mastných kyselin Supleco, tak byly také odzkoušeny standardy jednotlivých MK (např. kyselina olejová, linolová, linolenová, pentadekanová) a tyto retenční časy byly mezi sebou porovnány. V příloze č. 1 je znázorněn přehled jednotlivých mastných kyselin, jejich čistota a množství, které jsou obsaženy ve směsném standardu Supleco. Na obrázku č. 11 jsou uvedeny parametry pro analýzu tohoto směsného standardu a jejich chromatogram.
51
Obr. 11 Podmínky pro analýzu standardu Supleco a jeho chromatogram
52
5.2 Měření vzorků vepřového masa Celkem bylo změřeno 107 vzorků tuku vepřového masa plemen Landrace a Bílé ušlechtilé. Obecně vykazovali větší procentuální obsah tuku z celkové hmotnosti masa vzorky od plemene Landrace. Následuje ukázka záznamu chromatogramu reálného vzorku tuku vepřového masa v programu Clarity (viz obr. č. 12). První pík znázorňuje kyselinu palmitovou s retenčním časem ve 20,30 min., po ní následuje s retenčním časem 24,24 min. kyselina linolová, s časem 24,60 min. kyselina olejová, po ní kyselina linolová a v 25,23 minutě je detekována kyselina stearová. V rámci jednotlivých měření pomocí GC se můžou retenční časy MK mírně lišit (asi do 1 min.).
Obr. 12 Chromatogram vzorku vepřového masa
5.2.1 Porovnání obsahu MK dle data odběru vzorků vepřového masa Dle naměřených výsledků procentuálního obsahu mastných kyselin v jednotlivých vzorcích vepřového masa byly sestaveny grafy se zaměřením se na datum odběru vzorku a na rozdíl v obsahu jednotlivých MK. Následující tabulka č. 6 udává označení vzorků vepřového tuku uspořádaných dle dat odběrů jednotlivých skupin vzorků, je zde vyznačeno také množství mastných kyselin v %.
53
Tab. 6 Číslování vzorků vepřového masa dle dat odběrů Laboratorní číslo vzorku 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58
Datum odběru 3.4.2010
13.4.2010
29.4.2010
7.5.2010
Číslo vzorku masa 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 6 7
Palmitic acid (16:0)
Steraric acid (18:0)
Oleic acid (18:1)
Linolic acid (18:2)
26,8 26,4 27,5 26,6 29,0 28,7 28,4 26,1 26,3 26,8 26,9 26,4 27,1 26,8 27,0 27,5 28,4 28,2 29,4 28,1 25,5 27,5 25,7 28,0 29,6 27,6 28,9 28,7 27,8 26,5 29,0 25,4 27,0 27,5 29,3 28,6 28,4 29,2 29,4 28,6 28,3 29,5 28,2 25,9 26,1 26,6 29,8 28,9 27,3 26,5 29,2 26,7 27,6 27,1 26,5 27,2 26,7 28,0
13,4 15,2 15,5 14,6 14,1 15,2 14,9 16,1 12,4 15,4 14,8 13,6 14,6 16,1 14,5 14,7 16,7 14,4 16,8 15,3 15,4 14,8 14,9 17,6 14 12,6 13,9 15,6 14,5 15,6 17,8 14,1 14,8 16,9 15,1 15,7 13,1 15,3 14,9 15,6 13,8 16,6 16,6 16,4 11,8 14,6 15,1 18,4 15,5 15,3 16,9 15,9 16,8 16,8 16,1 16,3 16,4 14,7
54,8 52,0 49,1 52,2 49,9 48,8 50,4 51,6 53,9 49,7 49,3 52,3 50,1 48,2 50,7 48,4 49,7 53,0 48,0 50,6 50,7 53,3 50,7 47,7 52,4 55,5 49,7 49,8 53,1 51,8 46 53,4 52,1 48,7 51,1 50,1 52,9 49,5 50,7 48,9 52,7 48,7 49,7 49,7 54,3 52,9 50,1 47,2 50,4 52,4 48,5 50,1 49,6 49,8 48,7 48,9 49,7 48,4
5,0 6,5 7,9 6,5 7,0 7,3 6,3 6,2 7,3 8,1 9,0 7,7 8,2 8,9 7,8 9,5 5,2 4,4 5,8 6,0 8,4 4,4 8,7 6,8 4 4,3 7,6 6 4,6 6 7,2 7,2 6,1 6,9 4,5 5,6 5,7 6,1 5,0 6,9 5,2 5,2 5,4 8,0 7,8 5,9 5,0 5,5 6,8 5,8 5,3 7,3 6,0 6,3 8,7 7,6 7,2 8,9
54
59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107
27.5.2010
16.6.2010
1.7.2010
8 9 10 11 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18
28,1 26,8 25,7 26,6 27,6 28,1 27,4 26,8 26,4 27,5 27,4 26,9 25,8 26,2 26,7 26,1 26,6 30,6 28,0 26,8 27,7 25,1 26,5 27,1 27,5 26,9 28,3 27,3 27,0 28,2 28,6 26,6 27,5 27,6 27,9 27,6 27,9 26,5 28,9 29,3 28,3 27,8 29,4 28,3 27,9 29,0 28,6 28,7 28,3
16,4 15,5 15,0 15,9 14,6 14,2 15,5 16,3 14,6 13,3 14,5 14,6 14,7 13,0 12,9 14,1 15,9 15,0 15,4 13,5 14,2 14,3 15,8 15,6 15,7 13,4 15,7 15,1 14,8 13,4 14,5 16,5 15,6 15,5 14,6 15,1 14,5 14,8 15,5 15,0 15,3 13,7 13,9 14,5 14,5 13,4 15,9 16,4 14,2
50,6 50,8 51,3 50,0 51,4 50,1 49,9 51,4 52,1 51,4 51,1 51,9 52,4 54,0 52,7 52,4 52,0 50,9 51,5 56,0 51,4 54,8 53,7 51,6 52,6 53,3 52,6 52,3 54,1 54,9 53,1 51,7 51,1 52,1 52,6 52,0 52,3 53,3 51,5 51,6 51,6 53,6 51,6 51,1 52,2 53,0 51,4 50,2 53,4
4,9 6,9 8,0 7,5 6,4 7,6 7,2 5,5 6,9 7,8 7,0 6,6 7,1 6,9 7,6 7,4 5,5 3,5 5,1 3,6 6,6 5,8 4,0 5,7 4,2 6,5 3,4 5,3 4,0 3,5 3,7 5,1 5,8 4,7 4,9 5,3 5,2 5,3 3,9 4,0 4,8 4,8 5,0 6,2 5,3 4,5 4,1 4,6 4,1
Následuje grafické vyjádření dat změřených vzorků vepřového masa plynovou chromatografií (obr. č. 13), které byly odebrány 3.4.2010. Vzorek číslo 8 zde vykazuje nejvyšší obsah kyseliny olejové a to 54,8 %, naopak vzorek č. 24 má obsah kyseliny olejové nejnižší 47,7 %. Kyselina palmitová byla v největším množství zaznamenána u vzorku s číslem 19 a to s obsahem 29,4 % a nejmenší obsah kyseliny palmitové
55
25,5 % byl zaznamenán u vzorku 21. Největší obsah kyseliny stearové byl 17,6 % u vzorku 24 a nejméně jí obsahoval vzorek č. 9 15,4 %. Kyselina linolová byla nejvíce zastoupena ve vzorku č. 16 a to 9,5 % a nejmenší obsah této MK byl 4,4 % ve vzorcích
č. 18 a 22. Vzorek č. 24 vykazoval nejvyšší obsah kyseliny stearové a zároveň nejnižší obsah kyseliny olejové ze všech vzorků, které byly odebrány v tomto datu.
Množství MK v %
60,0
Odběr vzorků vepřového masa 3.4.2010
50,0 40,0 30,0 20,0 10,0
Oleic acid Palmitic acid Stearic acid Linolic acid
23
21
19
15
13
11
vzork u
17
Číslo
9
5
7
1
3
0,0
Obr. 13 Odběr vzorků vepřového masa 3.4.2010
Odběr vzorků vepřového masa s datem 13.4.2010 zahrnoval celkem 12 vzorků, jejichž obsahy mastných kyselin jsou zpracovány ve sloupcovém grafu na obr. 14. Nejvyšší obsah kyseliny palmitové 29,6 % byl zaznamenán ve vzorku č. 1, ve vzorku č. 8 byl detekován nejnižší obsah této kyseliny 25,4 %. Kyselina stearová byla nejvíce zastoupena (17,8 %) ve vzorku s číslem 7, naopak nejnižší obsah kyseliny stearové (11,8 %) obsahoval vzorek č. 21. Ve vzorku číslo 2 byl obsah kyseliny olejové 55,5 %, nejnižší procento této MK (46,0 %) bylo detekováno ve vzorku č. 7. Obsah kyseliny linolové byl nejvyšší ve vzorku č. 20 a to 8,0 %, nejnižší obsah této kyseliny 4,0 % byl ve vzorku č. 1.
56
Odběr vzorků vepřového masa 13.4.2010
Obsah MK v %
60 50 40 30 20 10
21
Číslo vzorku
Oleic acid Palmitic acid St earic acid Linolic acid
19
17
15
13
11
9
7
5
3
1
0
Obr. 14 Odběr vzorků vepřového masa 13.4.2010
Sloupcový graf znázorněný na obrázku č. 15 uvádí obsahy MK ve vzorcích vepřového masa, které byly odebrány 29.4.2010. Tento odběr obsahoval pouze pět vzorků masa, přičemž nejvyšší obsah kyseliny palmitové byl 29,8 % ve vzorku číslo 1 a její nejnižší obsah 26,5 % byl zaznamenán ve vzorku číslo 4. Vzorek s číslem 2 vykazoval obsah kyseliny stearové 18,4 % a naopak ve vzorku číslo 1 byl obsah této kyseliny 15,1 %. Obsah kyseliny olejové byl v tomto datu odběru vzorů nejvyšší u čísla 4 s 52,4 %, nejnižší procento kyseliny olejové 47,2 bylo ve vzorku č. 2. Kyselina linolová byla nejvíce zastoupena ve vzorku č. 3 a to 6,8 %, její nejnižší obsah 5,0 % byl ve vzorku 1.
Odběr vzorků vepřového masa 29.4.2010
Množství MKv %
60,0 50,0 40,0 30,0 20,0 10,0 0,0 1
Čísl o
Oleic acid Palmitic acid
2
vzork u
Stearic acid
3
Linolic acid
4 5
Obr. 15 Odběr vzorků vepřového masa 29.4.2010
57
Další odběr vzorků vepřového masa byl proveden 7.5.2010, celkem 11 vzorků je i s jejich procentuálními obsahy MK zpracováno v grafu, který uvádí obr. č. 16. Z tohoto grafu plyne, že nejvyšší obsah kyseliny palmitové 28,1 % obsahoval vzorek 8, naopak nejnižší obsah této kyseliny 25,7 % byl ve vzorku s číslem 10. Nejvyšší obsah kyseliny stearové ve vzorcích odebraných 7.5.2010 byl zaznamenán ve vzorcích č. 2 a 3 a to se shodnou hodnotou 16,8 %, nejméně kyseliny stearové 14,7 % byl ve vzorku č. 7. Olejová kyselina vykazovala nejvyšší obsah 50,8 % ve vzorku s číslem 9, nejméně jí bylo ve vzorku č. 7 48,4 %. Nejvyšší obsah kyseliny linolové byl 8,9 % a obsahoval ho vzorek č. 7, nejnižší obsah této kyseliny byl ve vzorku s číslem 8 s hodnotou 4,9 % kyseliny linolové ve vzorku vepřového tuku.
Odběr vzorků vepřového masa 7.5.2010 Množství MK v %
60,0 50,0 40,0 30,0 20,0 10,0 0,0 1 2 3
4
5
Číslo vzorku
6
7
8
9 10 11
Oleic acid Palmitic acid Stearic acid Linolic acid
Obr. 16 Odběr vzorků vepřového masa 7.5.2010
Následuje 12 vzorků vepřového masa, které byly odebrány dne 27.5.2010, jsou zpracovány v grafu viz obr. 17. Kyselina palmitová je v tomto odběru zastoupena nejvíce 28,1 % ve vzorku č. 2, její nejnižší množství bylo zaznamenáno ve vzorku č. 9 s 25,8% obsahu kyseliny palmitové. Nejvíce kyseliny stearové obsahoval vzorek č. 4 v množství 16,3 % a naopak nejnižší obsah této kyseliny byl ve vzorku č. 11 s 12,9 %. Co se týká kyseliny olejové, tak ta byla nejvíce obsažena (54,0 %) ve vzorku s č. 10, nejméně jí potom bylo ve vzorku č. 3 (49,9 %). Nejvyšší zastoupení kyseliny linolové (7,8 %) měl vzorek č. 6, její nejnižší obsah byl 5,5 % ve vzorku č. 4.
58
Odběr vzorků vepřového masa 27.5.2010
Množství MK v %
60,0 50,0 40,0 30,0 20,0 10,0 0,0 1
2
3
4
5
6
7
8
Číslo vzorku
9
Oleic acid P almitic acid St earic acid Linolic acid
10 11 12
Obr. 17 Odběr vzorků vepřového masa 27.5.2010
Dne 16.6.2010 bylo odebráno a poté v budově N naší univerzity zpracováno celkem 15 vzorků vepřového masa. Tento odběr je znázorněn za pomocí sloupcového grafu na obr. č. 18. Ze všech vzorků obsažených v tomto datu odběru, bylo nejvíce kyseliny palmitové ve vzorku č. 2 (30,6 %) a naopak nejméně ve vzorku č. 6 (25,1 %). U kyseliny stearové bylo nejvíce jejího obsahu (15,9 %) zaznamenáno ve vzorku č. 1 a nejméně obsahoval tuto kyselinu vzorek č. 10 a 14 se shodným obsahem 13,4 %. Vzorek s číslem 4 byl na obsah kyseliny olejové nejbohatší (56,0 %), nejméně kyseliny olejové bylo zaznamenáno ve vzorku s číslem 2 (50,9 %). Linolová kyselina měla nejvyšší zastoupení 6,6 % ve vzorku č. 5 a její nejnižší obsah byl u vzorku č. 11 se 3,4 %.
Odběr vzorků vepřového masa 16.6.2010
Množství MK v %
60,0 50,0 40,0 30,0 20,0 10,0 0,0 1 2 3 4 5
6 7
Číslo vzorku
8
9 10 11 12 13 14 15
Oleic acid Palmitic acid Stearic acid Linolic acid
Obr. 18 Odběr vzorků vepřového masa 16.6.2010
59
Celkový počet vzorků odebraných 1.7.2010 byl 18 ks (viz obr. 19), přičemž nejvyšší procentuální obsah kyseliny palmitové byl 29,4 % ve vzorku č. 12 a nejnižší obsah této MK byl s hodnotou 26,5 % ve vzorku č. 7. Nejvíce kyseliny stearové vykazoval vzorek č. 1 s 16,5 %, naopak nejméně bylo kyseliny stearové (13,4 %) ve vzorku č. 15. Olejová kyselina byla v 53,6 % obsažena ve vzorku č. 11 a 50,2 % této kyseliny obsahoval vzorek č. 17. Další z detekovaných mastných kyselin byla kyselina linolová, která byla nejvíce zastoupena (6,2 %) ve vzorku č. 13 a nejméně jí obsahoval (3,9 %) vzorek
č. 8.
Odběr vzorků vepřového masa 1.7.2010
Množství MK v %
60,0 50,0 40,0 30,0 20,0 10,0
15
Oleic acid Palmitic acid Stearic acid Linolic acid
17
Číslo vzorku
13
11
9
7
5
3
1
0,0
Obr. 19 Odběr vzorků vepřového masa 1.7.2010
5.2.2 Porovnání obsahu MK ve všech vzorcích vepřového masa mezi sebou Pomocí sloupcového grafu byly porovnány všechny obsahy mastných kyselin a to u každé MK odděleně. Pro zvýraznění rozdílů mezi obsahy dané mastné kyseliny byly do grafu vloženy chybové úsečky. Typ chybové hodnoty- pevná byl zadán dle vypočítané směrodatné odchylky, kterou jsem získala z popisné statistiky, do které bylo vždy zahrnuto všech 107 hodnot vzorků pro danou mastnou kyselinu. U grafů vždy uvádím nejnižší a nejvyšší procentuální obsah té mastné kyseliny, kterou graf znázorňuje. Také zde uvádím, ke kterému plemeni (Landrace nebo Bílé ušlechtilé) daná hodnota patří. Následující dva grafy uvádějí rozdíly mezi množstvím kyseliny palmitové. Všech 107 odebraných a následně analyzovaných vzorků je vždy rozděleno do dvou grafů
60
z důvodu lepší názornosti. Nejvyšší množství kyseliny palmitové bylo zaznamenáno 30,6 % u vzorku číslo 76, tento vzorek se řadí k plemeni Bílé ušlechtilé. Naopak nejnižší obsah kyseliny palmitové 25,1 % byl u vzorku č. 80 a pocházel od stejného plemene.
Palmitic acid 35,0
Množství MK v %
30,0 25,0 20,0 15,0 10,0 5,0 0,0 1
3
5
7
9
11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 33 35 37 39 41 43 45 47 49 Číslo vzorku
Obr. 20 a) Kyselina palmitová
Palmitic acid 35,0
Množství MK v %
30,0 25,0 20,0 15,0 10,0 5,0
97 99 10 1 10 3 10 5 10 7
93 95
87 89 91
83 85
77 79 81
71 73 75
65 67 69
59 61 63
55 57
51 53
0,0
Číslo vzorku
Obr. 20 b) Kyselina palmitová
Další dva grafy znázorňují obsah kyseliny stearové ve všech 107 analyzovaných vzorcích. Nejvyšší množství kyseliny stearové bylo zaznamenáno u plemena Bílé ušlechtilé ve vzorku č. 48 a to 18,4 %. Naopak nejnižší obsah kyseliny stearové byl ve vzorku č. 45 v množství 11,8 % a jednalo se o plemeno Landrace.
61
Stearic acid
Množství MK v %
25,0 20,0 15,0 10,0 5,0 0,0 1
3
5
7
9
11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 33 35 37 39 41 43 45 47 49 Číslo vzorku
Obr. 21 a) Kyselina stearová
97 99 10 1 10 3 10 5 10 7
93 95
87 89 91
83 85
77 79 81
71 73 75
65 67 69
59 61 63
55 57
20,0 18,0 16,0 14,0 12,0 10,0 8,0 6,0 4,0 2,0 0,0
51 53
Množství MK v %
Stearic acid
Číslo vzorku
Obr. 21 b) Kyselina stearová
Následující dva obrázky znázorňují jednotlivá množství kyseliny olejové v % ve všech vzorcích tuku vepřového masa, které byly analyzovány. Nejnižší obsah kyseliny olejové 46 % byl zaznamenán ve vzorku č. 31, který se řadí k plemeni Bílé ušlechtilé. Nejvíce kyseliny olejové obsahoval vzorek č. 78 od plemene Bílé ušlechtilé a to 56 %.
62
Oleic acid 70,0
Množství MK v %
60,0 50,0 40,0 30,0 20,0 10,0 0,0 1
3
5
7
9
11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 33 35 37 39 41 43 45 47 49 Číslo vzorku
Obr. 22 a) Kyselina olejová
Oleic acid 70,0
Množství MK v %
60,0 50,0 40,0 30,0 20,0 10,0
97 99 10 1 10 3 10 5 10 7
91 93 95
85 87 89
79 81 83
75 77
69 71 73
63 65 67
59 61
55 57
51 53
0,0
Číslo vzorku
Obr. 22 b) Kyselina olejová
Další dva sloupcové grafy, které v textu následují, znázorňují množství kyseliny linolové v %. Nejnižší množství kyseliny linolové obsahoval vzorek č. 85 v množství 3,4 %. Vzorek patřil k plemeni Bílé ušlechtilé. Naopak nejvyšší obsah kyseliny linolové 9,5 % byl zaznamenán ve vzorku č. 16, který pocházel od stejného plemene. Rozdíly v obsahu kyseliny linolové, které jsou z grafu patrné, můžou být způsobeny citlivostí této kyseliny ke změnám v potravě.
63
Linolic acid 12,0
Množství MK v %
10,0 8,0 6,0 4,0 2,0 0,0 1
3
5
7
9
11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 33 35 37 39 41 43 45 47 49 Číslo vzorku
Obr. 23 a) Kyselina linolová
Linolic acid 12,0
Množství MK v %
10,0 8,0 6,0 4,0 2,0
97 99 10 1 10 3 10 5 10 7
93 95
87 89 91
83 85
77 79 81
71 73 75
65 67 69
59 61 63
55 57
51 53
0,0
Číslo vzorku
Obr. 23 b) Kyselina linolová
Přesto, že obsah tuku z celkové hmotnosti odebraného vzorku masa byl jednoznačně vyšší u plemene Landrace, není žádná spojitost mezi nejvyššími naměřenými hodnotami procentuálního obsahu daných mastných kyselin. Plemeno Landrace se vyskytlo pouze jednou, a to jako hodnota s nejnižším procentuálním obsahem kyseliny stearové. Důvodem tohoto mohl být malý počet vzorků. Mezi jednotlivými vzorky, které byly vyhodnoceny ke každé z obsažených mastných kyselin zvlášť (kyselina palmitová, stearová, olejová a linolová), byla nalezena chyba měření do 20 %, a to zejména z důvodu nehomogenity vzorků a jejich malého počtu.
64
5.3 Statistické vyhodnocení Statistické vyhodnocení bylo provedeno v programu Statistica 9.0 od firmy StatSoft. Pomocí tohoto programu bylo vytvořeno celkem šest bodových grafů, kde se porovnávají mastné kyseliny (olejová, palmitová, stearová a linolová kyselina), které byly nalezeny ve vzorcích vepřového masa v největším zastoupení. V grafu jsou vždy dvě vybrané mastné kyseliny a porovnává se tak jejich vzájemné působení na své procentuální obsahy v reálném vzorku. Také bylo provedeno statistické vyhodnocení pomocí metody T-test. Postupně byly porovnány všechny obsahy jednotlivých mastných kyselin samostatně, vždy se všemi daty odběrů mezi sebou. Toto porovnání bylo vytvořeno i mezi jednotlivými plemeny Landrace a Bílé ušlechtilé. V programu Microsoft Excel byla vytvořena jednofaktorová analýza variance. Tato analýza posuzuje, zda je rozdíl mezi obsahy daných mastných kyselin, které byly porovnávány mezi sebou v datech odběrů tak, jak následovaly časově po sobě.
5.3.1 Bodové grafy pro dané mastné kyseliny V řadě první bodový graf na obr. 24 uvádí vliv kyseliny stearové na kyselinu palmitovou. Z grafu plyne, že obsah kyseliny stearové nesouvisí s obsahem kyseliny palmitové, i když asi 2% z celkového vzorku má stoupající tendenci.
Obr. 24 Porovnání kyseliny stearové s kyselinou palmitovou
65
Obrázek č. 25 uvádí bodový graf pro kyselinu olejovou a palmitovou. Tyto dvě kyseliny na sebe ve vzorku vzájemně působí tak, že se vzrůstajícím obsahem kyseliny palmitové bude obsah kyseliny olejové klesat v 10 % případů.
Obr. 25 Porovnání kyseliny olejové s kyselinou palmitovou
Bodový graf uvedený na obr. 26 analyzuje závislost mezi množstvím kyseliny linolové a její vliv na kyselinu palmitovou. Ze statistiky patřící ke grafu plyne, že zhruba ve 23 % případů se zvyšujícím se obsahem kyseliny palmitové klesá i obsah kyseliny linolové.
Obr. 26 Porovnání kyseliny linolové s kyselinou palmitovou
66
Graf uvedený na obrázku č. 27 znázorňuje závislost mezi kyselinami olejovou a stearovou. Z tohoto bodového grafu plyne, že čím větší procentuální obsah kyseliny stearové bude ve vzorku obsažen, tím nižší podíl bude mít v daném vzorku kyselina olejová. Jedná se až o 50 % případů (r2= 0,5087), kdy se vzrůstající kyselinou palmitovou, bude klesat obsah kyseliny olejové.
Obr. 27 Porovnání kyseliny olejové s kyselinou stearovou
Při pohledu na bodový graf (obr. 28) s porovnáním kyseliny linolové spolu s kyselinou stearovou je jasné, že tyto dvě kyseliny na svůj obsah ve vzorku nenají žádný vliv, r2=0,0000.
67
Obr. 28 Porovnání kyseliny linolové s kyselinou stearovou
Následuje obr. 29, který znázorňuje závislost kyseliny linolové proti kyselině olejové. Z jejich obsahů ve vzorcích bylo zjištěno, že na sebe tyto dvě kyseliny vliv mají. Se vzrůstajícím obsahem kyseliny olejové, klesá obsah kyseliny linolové zhruba ve 23 % případů.
Obr. 29 Porovnání kyseliny linolové s kyselinou olejové
68
5.3.2 T-test pro jednotlivá data odběrů vzorků V rámci tohoto testu byla data odběrů vzorků očíslována (odběr 1 až 6). První odběr je ze 3.4.2010, odběr 2 byl vytvořen sloučením odběrů ze dne 13.4.2010 a 29.4.2010, odběr 3 je ze dne 7.5.2010, odběr 4 je z 27.5.2010, odběr 5 ze dne 16.6.2010 a odběr 6 ze dne 1.7.2010. Každá z nejvíce obsažených mastných kyselin (stearová, palmitová, olejová a linolová kyselina) v našich vzorcích vepřového masa, byla samostatně porovnána a zařazena v tabulce T-testu jako skupina 1 (skupina vzorků odebraných v 1. datu odběru) v porovnání k obsahům kyselin ve skupině 2 a tím byly postupně porovnány všechny data odběrů vzorků mezi sebou. Statisticky průkazný rozdíl je na 95% hladině pravděpodobnosti. Při porovnání obsahu kyseliny palmitové mezi jednotlivými odběry, z tabulky 7. plyne jasná odlišnost pouze mezi prvním a posledním odběrem. Mezi ostatními odběry není v obsahu kyseliny palmitové průkazný rozdíl na 95% hladině pravděpodobnosti.
Tab. 7 T-test pro kyselinu palmitovou
Tabulka 8 uvádí T-test pro kyselinu stearovou. Průkazný rozdíl je zde mezi prvním a třetím odběrem. Na hranici průkaznosti je i rozdíl v obsahu kyseliny stearové mezi prvním a druhým, nebo prvním a čtvrtým odběrem. S vzrůstající dobou odběru průkaznost mezi rozdíly v obsahu kyseliny stearové rapidně klesá. Tento rozdíl v obsahu kyselin může být ovlivněn geneticky.
Tab. 8 T-test pro kyselinu stearovou
69
T- test pro kyselinu linolovou je zpracován v tab. 9. Odlišné jsou zde poslední dva odběry (odběr 5 a 6). Hodnota P je nejnižší ze všech zpracovaných T-testů, je zde největší odlišnost mezi procentuálními obsahy této mastné kyseliny. Je patné, že se obsah kyseliny linolové v mase s delší dobou růstu snižuje. Obsah kyseliny linolové je nejvyšší u mladých kusů, se vzrůstající dobou výkrmu je kyselina linolová nahrazována spíše nasycenými mastnými kyselinami (kyselinou palmitovou a stearovou).
Tab. 9 T-test pro kyselinu linolovou
Tabulka 10. uvádí T-test kyseliny olejové. Při tomto srovnání všech odběrů v rámci kyseliny olejové mezi plemeny, byla největší odlišnost v obsahu kyseliny v odběrech 5 a 6. Trend u kyseliny olejové je podobný jako u kyseliny linolové, s vyšším věkem její obsah klesá.
Tab. 10 T-test pro kyselinu olejovou
Následující tabulky patří také k analýze T-testu. Odběr 2. zde byl vytvořen sloučením odběrů ze dne 13.4.2010 a 29.4.2010 s tím rozdílem, že vzorky od plemene Landrace byly vyjmuty a vytvořila se z nich samostatná skupina, se kterou byly porovnány obsahy jednotlivých MK v různých datech odběrů plemene Bílé ušlechtilé. Z tabulky č. 11, která znázorňuje porovnání kyseliny palmitové je patrné, že se obsah této kyseliny průkazně lišil v porovnání mezi plemeny Bílé ušlechtilé a Landrace na 95% hladině pravděpodobnosti. 70
Tab. 11 T-test pro kyselinu palmitovou
Tabulka 12. porovnává obsah kyseliny linolové z naměřených vzorků vepřového masa. Podobně jako u kyseliny palmitové se i obsahy kyseliny linolové průkazně lišily mezi plemeny Landrace a Bílé ušlechtilé.
Tab. 12 T-test pro kyselinu linolovou
71
Z porovnání kyseliny olejové pomocí T-testu, který je znázorněn v tabulce s číslem 13, vyšlo najevo, že není ve většině odběrů průkazný rozdíl mezi dvěma uvedenými plemeny Tab. 13 T-test pro kyselinu olejovou
72
Tabulka č. 14 udává porovnání obsahů kyseliny stearové mezi jednotlivými daty odběrů vzorků vepřového masa dvou plemen Bílé ušlechtilé a Landrace. Bylo zjištěno, že pro kyselinu stearovou není mezi jednotlivými odběry průkazný rozdíl.
Tab. 14 T-test pro kyselinu stearovou
73
5.3.3 Jednofaktorová analýza variance Z naměřených procentuálních obsahů MK byla provedena jednofaktorová analýza variance. Statistická analýza byla provedena mezi obsahy stejných mastných kyselin, které byly naměřeny z různých dat odběrů vzorků vepřového masa. Vždy jsou porovnány mezi sebou dvě následující data odběrů vzorků masa. Z uvedených údajů má pro naše statistické vyhodnocení největší význam hodnota P, pokud je hodnota P mezi výběry pod 0,05, jedná se o výsledky statisticky významné. V příloze č. 2 uvádím vyhodnocení jednofaktorové analýzy variance pro kyselinu stearovou. Mezi sebou byly porovnány hodnoty jednotlivých vzorků kyseliny stearové s daty odběrů 3.4.2010 a 13.4.2010. Hodnota P je zde rovna 0,924435, což znamená, že tento případ porovnání není průkazný, hodnoty si jsou téměř rovny. Další vyhodnocení jednofaktorové analýzy variance patří ke vzorkům kyseliny stearové, které byly odebrány 7.5.2010 a 27.5.2010, jsou uvedeny v příloze č. 3. Zde je hodnota P nižší než 0,05 (P= 0,00034). Porovnání těchto dat odběrů vzorků je průkazně rozdílné pro jednofaktorovou analýzu variance. Následuje porovnání vzorků kyseliny stearové v datech odběrů 16.6.2010 a 1.7.2010, vyhodnocení jednofaktorové analýzy variance je uvedeno v příloze č. 4. Mezi těmito daty odběrů je hodnota P opět vyšší než 0,05 (P= 0,9831). Následující tři vyhodnocení jednofaktorové analýzy variance se vztahují na kyselinu palmitovou. První jednofaktorová analýza variance, která patří ke kyselině palmitové, porovnává odběry vzorků vepřového masa ze 3.4.2010 a 13.4.2010, je uvedena v příloze č. 5. Pro tuto jednofaktorovou analýzu variance jsem zjistila, že případy jsou neprůkazné. Další vyhodnocení jednofaktorové analýzy variance ke kyselině palmitové je znázorněno v příloze č. 6. K analýze jsou odběry vzorků z 7.5.2010 a 27.5.2010. Hodnota P je 0,951677, což znamená, že si jsou čísla obsažena v těchto odběrech téměř rovna. Poslední porovnaná data, která patří ke kyselině palmitové, byla mezi odběry vzorků 16.6.2010 a 1.7.2010. Vyhodnocení jednofaktorové analýzy variance uvádím v příloze č. 7. Hodnota P je zde opět vyšší než 0,05 (P= 0,164651). Další data patří ke kyselině linolové. U kyseliny linolové byla provedena jednofaktorová analýza variance také nejprve mezi vzorky odebranými 3.4.2010
74
a 14.4.2010, tuto analýzu uvádím v příloze č. 8. Zde je hodnota P nižší než 0,05 (P= 0,015373). V příloze č. 9 následuje jednofaktorová analýza variance pro data odběrů vzorků vepřového masa 7.5.2010 a 27.5.2010. Pro tuto jednofaktorovou analýzu variance jsem zjistila, že jsou případy neprůkazné (P= 0,54922). Data odběrů vzorků 16.6.2010 a 1.7.2010 patří ke kyselině linolové a je to poslední jednofaktorová analýza variance k této kyselině, kterou uvádím v příloze č. 10. Hodnota P je zde rovna 0,38568. V řadě poslední kyselina, ke které byla provedena jednofaktorová analýza variance, je kyselina olejová. Příloha č. 11 obsahuje tuto analýzu pro odběry vzorků vepřového masa z 3.4.2010 a 13.4.2010. Z hodnoty P (P= 0,614021), která je uvedena v této tabulce plyne, že hodnoty jsou si téměř rovny. V příloze č. 12 je uvedena jednofaktorová analýza variance pro data odběrů 7.5.2010 a 27.5.2010 s obsahy kyseliny olejové. V tomto případě je hodnota P menší než 0,05 (P= 0,00042). Tím pádem jsou tyto výběry statisticky významné. V poslední příloze č. 13, která patří do jednofaktorové analýzy variance pro kyselinu olejovou, jsou znázorněny výsledky analýzy z dat odběrů vzorků 16.6.2010 a 1.7.2010. Hodnota P je zde 0,045233, a proto jsou tyto výběry průkazné.
5.4 Porovnání metodiky Komprda a kol. (2005) měli ve své práci k dispozici čtrnáct souborů experimentálních zvířat vybraných druhů drůbeže a ryb. Zvířata byla krmena buď komerčními krmivy, do kterých byl do výše 5 % čerstvé hmoty přidáván lněný olej, rybí olej nebo olej slunečnicový nebo byla krmena směsí pšenice a kukuřice (v poměru 2:1). K vzorkům vepřového masa plemen Landrace a Bílé ušlechtilé jsem žádné údaje o způsobu výkrmu k dispozici neměla. Komprda a kol. (2005) dále uvádí, že bezprostředně po porážce byly odděleny tkáně prsní a stehenní svaloviny i s vnějším viditelným tukem. Tyto části byly poté homogenizovány v mixéru Moulinex (model D56, Moulinex, Francie). Extrakce lipidů probíhala tak, že se do baňky navážilo podle předpokládaného obsahu celkových lipidů: 70 g rybího filé a drůbežích prsíček, respektive 50 g filé z kapra a kuřecího, krůtího stehenního masa. Svalová tkáň byla smíchána s 5 ml vnitřního standardu pro stanovení MK
75
2,5 mg C15:0/ml v isooktanu (Supleco). Poté byl vzorek extrahován po dobu 1 minuty se 180 ml hexanu/2-propanol (HIP) 3:2 v/v objemové směsi (HIP 1) použitím homogenizátoru DIAX 900 (Heidolph, Německo), poté se směs zfiltrovala. Bylo přidáno 120 ml vodného roztoku Na2SO4 (1g bezvodé soli na 15 ml vody). Po protřepání a oddělení vrstev se vrstva n-hexanu přefiltrovala přes bezvodý Na2SO4 do 250 ml odměrné baňky. Vodní vrstva byla reextrahována 50 ml HIP (7:2 v/v; HIP 2). Po reextrakci a sušení bezvodým Na2SO4 byla 250 ml baňka doplněna po rysku n-hexanem. Extrakty byly převedeny do baňky a jejich obsah byl odpařován na rotační vakuové odparce (RV 05-ST 1P-B model; IKA Labortechnik, Německo) při 40 °C. Odpařování bylo dokončeno pod dusíkem a celkové lipidy byly stanoveny gravimetricky. V našem případě byly vzorky vepřového masa nejprve lyofilizovány, poté několik hodin extrahovány a až poté se těsně před vlastní derivatizací přidával vnitřní standard (roztok isooktanu s kyselinou pentadekanovou). Komprda a kol. (2005) prováděli stanovení mastných kyselin tak, že se poměrná
část 40-60 mg čistého HIP extraktu odpařila do sucha pod dusíkem, pevný zbytek byl zvážen v reakční baňce a poté se přidal 1 ml butylhydroxytoluen (BHT; 1% roztok v CH3OH; Sigma), aby se zabránilo oxidaci. Po ultrazvukové homogenizaci byly přidány 2 ml 0,5 N methanolového roztoku CH3ONa (1,15 g Na/100 ml CH3OH) a směs se zahřívala po dobu 5 minut pod zpětným chladičem. Přes kondenzátor bylo po uplynulé době přidáno 2 ml 14 % BF3 v CH3OH, směs byla zahřívána dalších 5 min. Po této době, se zahřívání přerušilo, přidaly se 2 ml isooktanu, směs se protřepala a nechala stát 1 min. Poté bylo přidáno 5 ml nasyceného roztoku NaCl a důkladně se po dobu 15sec. protřepávalo. Organická vrstva byla převedena do zkumavky, odebrali se 2 µl, které byli vstříknuty na kolonu GLC. Methylestery MK byly odděleny pomocí chromatografu HP 4890
(Hewlett-Pacard)
a
kapilární
kolony
Omegawax
TM250
30m × 0,25 mm × 0,25 µl s těmito následujícími teplotními programy: 205/240 °C s výdrží 9/16 min., rychlost ohřevu byla 5 °C/min., s teplotou nástřiku 280 °C a teplotou detektoru 300 °C. Jako nosný plyn byl použit dusík, při průtoku 0,9 ml/min. Srovnání celkového obsahu tuků a zejména obsahu mastných kyselin v živočišných tkáních bylo založeno na analýze zkušebního rozptylu. Vztahy mezi procenty kyselin AA, EPA + DHA, PUFA n-3 a n-6 v poměru ve tkáni na jedné straně a na straně druhé kyseliny LA, LNA a LA/LNA v poměru ve stravě, respektive obsah tuku v tkáních, živá hmotnost při porážce a věk, byly hodnoceny pomocí regresní analýzy.
76
Okrouhlá, Englmaierová a kol. (2009) ve své práci zahrnuli do pokusu celkem 40 kusů jatečných prasat finální hybridní kombinace (ČBUxČL) × (HxPN), 25 kusů krav holštýnského skotu a 40 kusů vajec bělovaječných slepic nosného hybrida Lohmann. Methylestery MK byly stanoveny v jatečné partii pečeně po extrakci celkových lipidů metodikou dle Folcha a kol. (1957). Následně proběhla methanolýza za katalytického účinku hydroxidu draselného a extrakce kyselin ve formě methylesterů do heptanu. Izolované methylestery byly stanoveny plynovým chromatogramem Master GC od firmy Dani (split režim, detektor FID) na koloně se stacionární fází polyethylen glykol (FameWax 30 m × 0,32 mm ×0,25 µl). Jako nosného plynu zde bylo použito helia o průtoku 5 ml/1 min. Teplotní režim byl následující: teplota nástřiku 50 °C (2 min.), po 10 °C/1 min. až na 230 °C (8 min.), teplota detektoru 220 °C. Výsledky pokusů byly vyhodnoceny statistickým programem SAS Propriety Software Repase 6,04 (2001). Hodnoty MK jsou zde vyjádřeny v miligramech na 100 gramů produktu. Z výsledků měření je na první pohled zřejmé, že celková suma MK byla několikanásobně vyšší ve vaječném žloutku (6798,60 mg/100 g produktu) oproti mléčnému tuku (1343,64 mg/100 g produktu) a vepřové pečeni (716,39 mg/100 g produktu). Což je dáno tím, že vaječný žloutek obsahuje v porovnání s ostatními produkty nejvíce tuku. V jatečné partii pečeně byl naměřen 2,29 % průměrný obsah tuku. V jednotlivém zastoupení nasycených mastných kyselin byla stanovena za dominantní u všech produktů kyselina palmitová a stearová. Třetí nejvyšší hodnota byla u jatečné partie pečeně registrována u kyseliny myristové. Z mononenasycených MK a zároveň z celé skladby mastných kyselin dosáhla nejvyššího zastoupení kyselina olejová (247,23 mg/100 g vepřové pečeně). V pořadí dalšími mononenasycenými MK byly kyselina palmitoolejová a eikosanová. Z polynenasycených mastných kyselin byla u pečeně za nejvyšší shledána kyselina linolová, dále arachidonová a DHA. V našem pokusu bylo analyzováno, že nejvyšší obsah MK ve vzorcích vepřového masa zaujímala kyselina olejová, palmitová, stearová a nejnižší množství bylo zaznamenáno u kyseliny linolové. Tento rozdíl mohl být způsoben tím, že naše vzorky vepřového masa byly získány po kratší době výkrmu, tedy od mladších kusů zvířat (viz kapitola 5.3.2) nebo také druhem podávaného krmiva.
77
Teye a kol. (2006) prováděli svůj experiment na 60 kusech prasat plemen Duroc, Bílé ušlechtilé a Landace. Zvířata byla krmena standardní granulovanou výživou až do dosažení 40 kg živé hmotnosti. Pak byla prasata rozdělena do šesti skupin a krmena odlišně. Do krmiva byl přidáván sojový a palmový olej v různých poměrech, všem skupinám byl do krmiva přidáván vitamin E. Vzorky vepřového masa byly před rozmělněním v kuchyňském robotu zbaveny pojivové a tukové tkáně. Poté se navážil 1 g vzorku a byl hydrolyzován po dobu 2 hodin při 60 °C s 6 ml 5 M KOH v 50 % vodném methanolu, který obsahoval hydrochinon (0,1 %) jako antioxidant a známé množství C 21:0 (1,5 mg/vzorek) jako vnitřní standard. Po vychladnutí vzorku byla přidána destilovaná voda a nezmýdelněné lipidy byly extrahovány do petroleteru. Hydrolyzáty byly okyseleny 3 ml 10 M H2SO4 a mastné kyseliny byly poté extrahovány do petroleteru. FAME byly připraveny pomocí diazomethanu v diethyl eteru a poté analyzovány pomocí plynové chromatografie. Analýza byla provedena na Fisions Mega Series 5160 GC vybaveném CP Sil88 WCOT kapilární kolonou a plamenovým ionizačním detektorem. Jako nosného plynu bylo použito helia a MK byly identifikovány v porovnání se standardy od Sigma UK. Kvantifikace bylo dosaženo použitím vnitřního standardu před hydrolýzou a linearita odezvy detektoru byla testována pomocí referenčního FAME mixu. V našem pokusu nebyly vzorky vepřového masa homogenizovány pomocí kuchyňského robotu, ale byla provedena již zmiňovaná lyofilizace z důvodu odstranění vody v mase a získání veškerého možného tuku a následně byly vzorky extrahovány. Vnitřní standard se přidával až těsně před derivatizací.
78
6 ZÁVĚR Cílem práce bylo analyzovat mastné kyseliny ve vzorcích vepřového masa. Vypracovat literární rešerši k tématu Plynová chromatografie mastných kyselin ve vzorcích vepřového masa. Ověřit, popřípadě upravit metodiku pro stanovení mastných kyselin pomocí plynové chromatografie, zvládnout metodiku v praxi. Výsledky zpracovat statisticky, rozvinout diskuzi a porovnat výsledky s literárními zdroji. Metodika převzatá z předchozí DP byla po kontrole nástřiku standardu kyseliny pentadekanové shledána jako vyhovující pro účely měření obsahu MK ve vzorcích vep-
řového masa. Metodiku jsme si ověřili také nástřikem kyselin olejové, linolové a linolenové, které byly proměřeny samostatně, tak i ve směsích těchto kyselin s různou koncentrací. Identifikace jednotlivých MK byla provedena porovnáním retenčních časů standardů a směsného standardu Supleco s reálnými vzorky vepřového masa. Bylo změřeno 107 vzorků vepřového masa plemen Bílé ušlechtilé a Landrace. Byly porovnány obsahy jednotlivých mastných kyselin v rámci jednotlivých odběrů s výsledkem, že nejvíce zastoupenou mastnou kyselinou byla kyselina olejová, po ní následovala kyselina palmitová, stearová a linolová. Při porovnání všech naměřených obsahů u každé z uvedených MK zvlášť, byly největší rozdíly v procentuálním zastoupení zjištěny u kyseliny linolové. Je možné, že tyto výkyvy v obsahu kyseliny linolové mohli být ovlivněny citlivostí této MK ke změnám v potravě. V bodových grafech byly porovnány každá z MK, které byly ve vzorcích vepřového masa zastoupeny v největším množství (kyselina linolová, olejová, palmitová a stearová), mezi sebou a bylo zjištěno, že procentuální obsah kyseliny stearové nesouvisí s obsahem kyseliny palmitové, se vzrůstajícím obsahem kyseliny palmitové bude obsah kyseliny olejové klesat, asi ve 23 % případů bude se zvyšujícím se obsahem kyseliny palmitové klesat kyselina linolová, s vyšším obsahem kyseliny stearové bude kyselina olejová klesat a to až v 50 % případů, při porovnání kyseliny linolové s kyselinou stearovou bylo zjištěno, že tyto dvě kyseliny na svůj obsah ve vzorku nemají žádný vliv a při posledním porovnání bylo zjištěno, že se vzrůstajícím obsahem kyseliny olejové bude mít kyselina linolová klesající tendenci.
79
Obsahy MK, které byly naměřeny ve vzorcích vepřového masa pomocí metody GC, byly také porovnány v T-testu. Každý obsah mastné kyseliny byl porovnán vždy postupně v datech, kdy byly vzorky masa odebrány. Statisticky průkazný rozdíl na 95% hladině pravděpodobnosti byl u většiny mastných kyselin nalezen mezi prvním a posledním nebo mezi prvním a dvěma posledními daty odběrů. Tento trend však neplatil pro kyselinu stearovou. Průkazný rozdíl zde byl mezi prvním a třetím odběrem, což znamená, že se vzrůstající dobou odběru průkaznost mezi rozdíly v obsahu kyseliny stearové rapidně klesá, což může být ovlivněno geneticky. Také byly porovnány jednotlivé MK mezi plemeny Landrace a Bílé ušlechtilé pomocí T-testu. Na 95% hladině pravděpodobnosti se mezi plemeny průkazně lišil obsah kyselin palmitové a linolové. Průkazný rozdíl v obsahu kyselin olejové a linolové mezi plemeny prokázán nebyl. Při vyhodnocení jednofaktorové analýzy variance bylo zjištěno, že při porovnání vzorků odebraných 7.5.2010 a 27.5.2010, které patřily ke kyselině stearové, byl nalezen průkazný rozdíl (hodnota P byla nižší než 0,05). Další průkazný rozdíl byl nalezen u kyseliny linolové, jednofaktorová analýza variance vyhodnotila průkazný rozdíl mezi vzorky odebranými 3.4.2010 a 14.4.2010. U kyseliny olejové byl nalezen průkazný rozdíl mezi vzorky s daty odběrů 7.5.2010 a 27.5.2010 a také 16.6.2010 a 1.7.2010. Pouze u kyseliny palmitové nebyl nalezen jednoznačně průkazný rozdíl mezi daty odběrů.
80
7 POUŽITÁ LITERATURA
ABRAHAMOVÁ M. Produkce vepřového masa v ČR a jeho ekonomika Praha: ÚZEI, 2009.
Databáze
online
[cit.
2010-11-20].
Dostupné
na:
http://ksz.af.czu.cz/akce/p09/01_abrahamova.pdf.
AKOH CASIMIR C., MIN DAVID B. Food Lipids: Chemismy, Nutrition, and Bio-
technology, Second edtition, Revised and Expanded. CRC Press; 2 edition, (17 April 2002). 1040 s. ISBN 0-8247-0749-4.
Situační a výhledová zpráva: Vepřové maso Praha: Ministerstvo zemědělství, 2010. ISBN 97880708489882.
BARRY E., GROB R. Columns for gas chromatography: performance and selection New Jersey: John Wiley & Sons, 2007. ISBN 978-0-471-74043-8.
BRAITHWAITE A., SMITH F. J. Chromatographic Methods Fifth Edition. Kluwer Academic Publishers, 1999. ISBN 0-7514-0158-7.
ČESKÝ STATISTICKÝ ÚŘAD Pokles výroby masa, vyšší ceny mléka Rychlá informace,
29.
10.
2010.
Databáze
online
[cit.
2010-11-17].
Dostupné
na:
http://www.czso.cz/csu/csu.nsf/informace/czem102910.doc.
DAS U. N. Essential Fatty Acids- A Review. Current Pharmaceutical Biotechnology. Bentham Science Publishers: December 2006. Volume 7, Numer 6, 467-482(16) s. ISSN 1389-2010.
FELIX C. Vše o tucích typu omega- 3. Z anglického originálu All about Omega-3 Oils přeložila Lenka Sychrová. Praha: Pragma, 2005. 111 s. ISBN 80-7205-886-X.
HOLEČEK M. Regulace metabolismu cukrů, tuků, bílkovin a aminokyselin 1. vyd., Praha: Grada publishing a.s., 2006. 286 s. ISBN 80-247-1562-7.
81
HOLZBECHER Z., CHURÁČEK J. a kol. Analytická chemie 1. vyd. Praha: SNTLNakladatelství technické literatury, 1987. 664 s.
INGR I. Zrání masa a jeho praktický význam Český svaz zpracovatelů masa, 22.10.2003.
Databáze
online
[cit.
2010-10-16].
Dostupné
na:
http://www.cszm.cz/clanek.asp?typ=2&id=894.
INGR I. Máme jíst maso? Český svaz zpracovatelů masa, 26.3.2008. Databáze online [cit. 2010-10-15]. Dostupné na: http://www.cszm.cz/clanek.asp?typ=1&id=1075.
JANČÁŘOVÁ I., JANČÁŘ L. Analytická chemie 1. vyd. Brno: Mendelova zemědělská a lesnická univerzita v Brně, 2003. 195 s. ISBN 80-7157-647-6.
KADLEC P., MELZOCH K., VOLDŘICH M. a kol. Co byste měli vědět o výrobě po-
travin?: Technologie potravin 1 vyd. Ostrava: Key Publishing, 2009. 536 s. ISBN 97880-7418-051-4.
KALAČ P., ŠPIČKA J. Složení lipidů sladkovodních ryb a jejich význam v lidské výži-
vě: vědecká monografie 1. vyd. V Českých Budějovicích: Jihočeská univerzita, Zemědělská fakulta, 2006. 57 s. ISBN 80-7040-901-0.
KLOUDA P. Moderní analytické metody 2. upr. a dopl. vyd. Ostrava: Pavel Klouda, 2003. 132 s. ISBN 80-86369-07-2.
KOMPRDA T. Základy výživy člověka 1. vyd. Brno: Mendelova zemědělská a lesnická univerzita v Brně, 2003. 164 s. ISBN 80-7157-655-7.
KOMPRDA T., ZELENKA J., FAJMONOVÁ E., FIALOVÁ M., KLADROBA D.
Arachidonic Acid and Long-Chain n-3 Polyunsaturated Fatty Acid Contents in Meat of Selected Polutry and Fish Species in Ralation to Dietary Fat Sources. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 2005, 53, 6804-6812.
82
KUBÁŇ V., KUBÁŇ P. Analýza potravin 1. vyd. Brno: Mendelova zemědělská a lesnická univerzita v Brně, 2007. 203 s. ISBN 978-80-7375-036-7.
MOUREK J. a kol. Mastné kyseliny omega- 3 1. vyd. Praha/ Kroměříž: TRITON, 2007. 176 s. ISBN 978-80-7254-917-7.
MUSIL D. Klinická výživa a intenzivní metabolická péče 1. vyd. Univerzita Palackého v Olomouci, Lékařská fakulta. Olomouc: Univerzita Palackého, 2002. 109 s. ISBN 80244-0566-0.
OKROUHLÁ M., ČÍTEK J., STUPKA R., KRATOCHVÍLOVÁ H. Vliv pohlaví na
zastoupení mastných kyselin ve vepřovém mase Česká zemědělská univerzita v Praze, FAPPZ, Katedra speciální zootechniky, sborník 2009. ISBN 978-80-213-1974-5.
OKROUHLÁ M., ENGLMAIEROVÁ M., CHARVÁTOVÁ V., TOUŠOVÁ R. Za-
stoupení mastných kyselin ve vybraných živočišných produktech Česká zemědělská univerzita v Praze, FAPPZ, Katedra speciální zootechniky, 14.10.2009. Databáze online [cit. 2011-04-18]. Dostupné na: http://ksz.af.czu.cz/akce/p09/sbornik09.pdf.
PÁNEK J., POKORNÝ J., DOSTÁLOVÁ J. Základy výživy a výživová politika 1. vyd. Praha: Vysoká škola chemicko-technologická, 2002. 219 s. ISBN 80-7080-468-8.
PRATT STEVEN C., MATTHEWS K. Superpotraviny: 14 potravin, které změní váš
život 1. vyd. Praha: Ikar, 2005. 303 s. Z anglického originálu SuperFoods Rx přeložil David Frej. ISBN 80-249-0473-X.
ROZÍKOVÁ V. Plynová chromatografie esterů mastných kyselin ve vybraných druzích
potravin. Diplomová práce, Technologická fakulta. Brno: Mendelova univerzita v Brně, 2010. 83 s.
SIMOPOULOS A. P. Omega-3 Polyunsaturated [online]. Encyclopedia of Human Nu-
trition, Elsevier, 2005, p. 205-219. [cit. 29. listopadu 2010]. Dostupné z: http://www.sciencedirect.com/science/referenceworks/9780122266942
83
SMOLKOVÁ E., FELTL L. Analýza látek v plynném stavu 1. vyd. Praha: SNTL - Nakladatelství technické literatury, 1991. 480 s. ISBN 80-03-00604-X.
STRATIL, P. ABC zdravé výživy díl 1. A. Wolf, B. Turek, J. Potácel. 1. vyd. Brno: Tiskárny Havlíčkův Brod, a.s., 1993. 351 s. ISBN 80-900029-8-6.
SVAČINA Š., BRETŠNAJDROVÁ A. Dietologický slovník 1. vyd. Praha: Triton, 2008. 271 s. ISBN 978-80-7387-062-1.
TEKEĽ J., MIKUŠ P. Vybrané kapitoly z analytickej chémie: analýza látok
v biologických systémech 1. vyd. Bratislava: Vydavateľstvo UK, 2005. 194 s. ISBN 80223-1988-0.
TEYE G.A., SHEARD P.R., WHITTINGTON F.M., NUTE G.R. STEWART A., WOOD J.D. Influence of dietary oils and protein level on pork quality. 1. Effects on muscle
fatty acid composition, carcass, meat and eating quality. Meat Science. 2006, 73. 157165.
VELÍŠEK, J. Chemie potravin 1. 2. vyd. Tábor: OSSIS, 2002. 344 s. ISBN 80-8665900-3.
84
8 SEZNAM OBRÁZKŮ Obr. 1
Strukturální podoba zvolených mastných kyselin (Simopoulos, 2005)
Obr. 2
Schéma metabolismu esenciálních mastných kyselin v lidském organismu (Simopoulos, 2005)
Obr. 3
Oxidační metabolismus kyseliny arachidonové a eikosapentaenové cykloo xigenasou a 5-lypoxygenasou (Simopoulos, 2005)
Obr. 4
Výroba a průměrné ceny vepřového masa (Český statistický úřad)
Obr. 5
Varianty náplňových kolon a jejich materiálů používaných při GC (Barry, Grob, 2007)
Obr. 6
Flame ionisation detector (Braithwaite, Smith, 1999)
Obr. 7
Kalibrační křivka kys. linolové
Obr. 8
Kalibrační křivka kys. olejové
Obr. 9
Kalibrační křivka kys. palmitové
Obr. 10
Kalibrační křivka kys. stearové
Obr. 11
Podmínky pro analýzu standardu Supleco a jeho chromatogram
Obr. 12
Chromatogram vzorku vepřového masa
Obr. 13
Odběr vzorků vepřového masa 3.4.2010
Obr. 14
Odběr vzorků vepřového masa 13.4.2010
Obr. 15
Odběr vzorků vepřového masa 29.4.2010
Obr. 16
Odběr vzorků vepřového masa 7.5.2010
Obr. 17
Odběr vzorků vepřového masa 27.5.2010
Obr. 18
Odběr vzorků vepřového masa 16.6.2010
Obr. 19
Odběr vzorků vepřového masa 1.7.2010
Obr. 20 a) Kyselina palmitová Obr. 20 b) Kyselina palmitová Obr. 21 a) Kyselina stearová Obr. 21 b) Kyselina stearová Obr. 22 a) Kyselina olejová Obr. 22 b) Kyselina olejová Obr. 23 a) Kyselina linolová Obr. 23 b) Kyselina linolová Obr. 24
Porovnání kyseliny stearové s kyselinou palmitovou 85
Obr. 25
Porovnání kyseliny olejové s kyselinou palmitovou
Obr. 26
Porovnání kyseliny linolové s kyselinou palmitovou
Obr. 27
Porovnání kyseliny olejové s kyselinou stearovou
Obr. 28
Porovnání kyseliny linolové s kyselinou stearovou
Obr. 29
Porovnání kyseliny linolové s kyselinou olejovou
86
9 SEZNAM TABULEK Tab. 1
Výskyt a funkce fyziologicky významných vyšších mastných kyselin
Tab. 2
Orientační analytické parametry masa podle bourárenského dělení na části (Steinhauser, 2000)
Tab. 3
Obsah mastných kyselin v tuku vepřového masa (v % mastných kyselin z celkové sumy mastných kyselin), (Ingr, 2003)
Tab. 4
Rozdělení plynové chromatografie dle použité stacionární fáze (Holzbecher, Churáček a kol, 1987)
Tab. 5
Navážky jednotlivých mastných kyselin ve směsích různých koncentrací
Tab. 6
Číslování vzorků vepřového masa dle dat odběrů
Tab. 7
T-test pro kyselinu palmitovou
Tab. 8
T-test pro kyselinu stearovou
Tab. 9
T-test pro kyselinu linolovou
Tab. 10
T-test pro kyselinu olejovou
Tab. 11
T-test pro kyselinu palmitovou
Tab. 12
T-test pro kyselinu linolovou
Tab. 13
T-test pro kyselinu olejovou
Tab. 14
T-test pro kyselinu stearovou
87
10 SEZNAM ZKRATEK AA
kyselina arachidonová
AFID
plamenový ionizační detektor s alkalickým kovem
ALA
α-linolenová kyselina
DGLA
kyselina dihomo-gama-linolová
DHA
kyselina dokosahexaenová
ECD
electron capture detector
EFAs
esenciální mastné kyseliny
EPA
kyselina eikosapentaenová
EU
Evropská Unie
FAME
fatty acids methyl esters
FID
flame ionisation detector
GC
gas chromatography
GLA
kyselina gama-linolenová
GLC
plynová rozdělovací chromatografie
GSC
plynová adsorpční chromatografie
JUT
jatečně upravené tělo
LA
linolová kyselina
LC
liquid chromatography
LDR
dynamický rozsah
LOD
limit of detection
LOQ
limit of quantification
MK
mastné kyseliny
MS
hmotnostní spektrum
MUFA
monounsaturated fatty acid
PC
paper chromatography
PID
photoionisation detector
PLOT
porous layer coated open tubular
PUFA
polyunsaturated fatty acid
OA
olejová kyselina
SCOT
support coated open tubular
88
SFA
saturated fatty acid
TCD
thermal conuctivity detector
TLC
thin layer chromatography
WOCT
wall coated open tubular
89
PŘÍLOHY Příloha č. 1
Přehled jednotlivých MK obsažených ve standardu Supleco
Příloha č. 2
Jednofaktorová analýza variance pro kyselinu stearovou s daty odběrů 3.4.2010 a 13.4.2010
Příloha č. 3
Jednofaktorová analýza variance pro kyselinu stearovou s daty odběrů 7.5.2010 a 27.5.2010
Příloha č. 4
Jednofaktorová analýza variance pro kyselinu stearovou s daty odběrů 16.6.2010 a 1.7.2010
Příloha č. 5
Jednofaktorová analýza variance pro kyselinu palmitovou s daty odběrů 3.4.2010 a 13.4.2010
Příloha č. 6
Jednofaktorová analýza variance pro kyselinu palmitovou s daty odběrů 7.5.2010 a 27.5.2010
Příloha č. 7
Jednofaktorová analýza variance pro kyselinu palmitovou s daty odběrů 16.6.2010 a 1.7.2010
Příloha č. 8
Jednofaktorová analýza variance pro kyselinu linolovou s daty odběrů 3.4.2010 a 13.4.2010
Příloha č. 9
Jednofaktorová analýza variance pro kyselinu linolovou s daty odběrů 7.5.2010 a 27.5.2010
Příloha č. 10
Jednofaktorová analýza variance pro kyselinu linolovou s daty odběrů 16.6.2010 a 1.7.2010
Příloha č. 11
Jednofaktorová analýza variance pro kyselinu olejovou s daty odběrů 3.4.2010 a 13.4.2010
Příloha č. 12
Jednofaktorová analýza variance pro kyselinu olejovou s daty odběrů 7.5.2010 a 27.5.2010
Příloha č. 13
Jednofaktorová analýza variance pro kyselinu olejovou s daty odběrů 16.6.2010 a 1.7.2010
90
Příloha č. 1
Přehled jednotlivých MK obsažených ve standardu Supleco
91
Příloha č. 2
Jednofaktorová analýza variance pro kyselinu stearovou s daty odběrů 3.4.2010 a 13.4.2010
Faktor Výběr Sloupec 1 Sloupec 2
Počet 22 22
Součet Průměr Rozptyl 328,5 14,93182 1,066082 329,3 14,96818 2,128939
ANOVA Zdroj variability Mezi výběry Všechny výběry Celkem
Příloha č. 3
SS 0,014545 67,09545 67,11
Hodnota MS F P F krit 1 0,014545 0,009105 0,924435 7,279561 42 1,597511
Rozdíl
43
Jednofaktorová analýza variance pro kyselinu stearovou s daty odběrů 7.5.2010 a 27.5.2010
Faktor Výběr Sloupec 1 Sloupec 2
Počet 11 11
Součet Průměr Rozptyl 175,8 15,98182 0,465636 158,2 14,38182 1,049636
ANOVA Zdroj variability SS Mezi výběry 14,08 Všechny výběry 15,15273 Celkem
29,23273
Rozdíl
MS F 1 14,08 18,58411 20 0,757636 21
92
Hodnota P F krit 0,00034 8,095958
Příloha č. 4
Jednofaktorová analýza variance pro kyselinu stearovou s daty odběrů 16.6.2010 a 1.7.2010
Faktor Výběr Sloupec 1 Sloupec 2
Počet 15 15
Součet Průměr Rozptyl 222,3 14,82 0,804571 222,4 14,82667 0,654952
ANOVA Zdroj variability SS Mezi výběry 0,000333 Všechny výběry 20,43333 Celkem
Příloha č. 5
20,43367
Rozdíl
MS F 1 0,000333 0,000457 28 0,729762
Hodnota P F krit 0,9831 7,635619
29
Jednofaktorová analýza variance pro kyselinu palmitovou s daty odběrů 3.4.2010 a 13.4.2010
Faktor Výběr Sloupec 1 Sloupec 2
Počet 22 22
Součet Průměr Rozptyl 601,4 27,33636 1,050043 616,1 28,00455 1,602359
ANOVA Zdroj variability SS Mezi výběry 4,911136 Všechny výběry 55,70045 Celkem
60,61159
Hodnota MS F P F krit 1 4,911136 3,703161 0,061102 7,279561 42 1,326201
Rozdíl
43
93
Příloha č. 6
Jednofaktorová analýza variance pro kyselinu palmitovou s daty odběrů 7.5.2010 a 27.5.2010
Faktor Výběr Sloupec 1 Sloupec 2
Počet 11 11
Součet Průměr Rozptyl 297 27 0,494 296,8 26,98182 0,471636
ANOVA Zdroj variability Mezi výběry Všechny výběry
SS 0,001818 9,656364
Celkem
9,658182
Příloha č. 7
Hodnota P MS F F krit 1 0,001818 0,003766 0,951677 8,095958 20 0,482818
Rozdíl
21
Jednofaktorová analýza variance pro kyselinu palmitovou s daty odběrů 16.6.2010 a 1.7.2010
Faktor Výběr Sloupec 1 Sloupec 2
Počet 15 15
Součet Průměr Rozptyl 412,2 27,48 1,507429 420,5 28,03333 0,748095
ANOVA Zdroj variability Mezi výběry Všechny výběry
SS 2,296333 31,57733
Celkem
33,87367
Hodnota P MS F F krit 1 2,296333 2,036186 0,164651 7,635619 28 1,127762
Rozdíl
29
94
Příloha č. 8
Jednofaktorová analýza variance pro kyselinu linolovou s daty odběrů 3.4.2010 a 13.4.2010
Faktor Výběr Sloupec 1 Sloupec 2
Počet 22 22
Součet Průměr Rozptyl 153,4 6,972727 2,162078 131,2 5,963636 1,347186
ANOVA Zdroj variability Mezi výběry Všechny výběry
SS 11,20091 73,69455
Celkem
84,89545
Příloha č. 9
Hodnota P MS F F krit 1 11,20091 6,383623 0,015373 7,279561 42 1,754632
Rozdíl
43
Jednofaktorová analýza variance pro kyselinu linolovou s daty odběrů 7.5.2010 a 27.5.2010
Faktor Výběr Sloupec 1 Sloupec 2
Počet 11 11
Součet Průměr Rozptyl 79,3 7,209091 1,366909 76,6 6,963636 0,418545
ANOVA Zdroj variability Mezi výběry Všechny výběry
SS 0,331364 17,85455
Celkem
18,18591
Rozdíl
MS F 1 0,331364 0,371181 20 0,892727 21
95
Hodnota P F krit 0,54922 8,095958
Příloha č. 10
Jednofaktorová analýza variance pro kyselinu linolovou s daty odběrů 16.6.2010 a 1.7.2010
Faktor Výběr Sloupec 1 Sloupec 2
Počet 15 15
Součet Průměr Rozptyl 70,4 4,693333 1,302095 74,8 4,986667 0,35981
ANOVA Zdroj variability Mezi výběry Všechny výběry Celkem
Příloha č. 11
SS 0,645333 23,26667 23,912
Rozdíl
MS F 1 0,645333 0,776619 28 0,830952
Hodnota P F krit 0,38568 7,635619
29
Jednofaktorová analýza variance pro kyselinu olejovou s daty odběrů 3.4.2010 a 13.4.2010
Faktor Výběr Sloupec 1 Sloupec 2
Počet 22 22
Součet Průměr Rozptyl 1116,7 50,75909 3,637771 1123,7 51,07727 4,988506
ANOVA Zdroj variability Mezi výběry Všechny výběry
SS 1,113636 181,1518
Celkem
182,2655
Hodnota MS F P F krit 1 1,113636 0,258196 0,614021 7,279561 42 4,313139
Rozdíl
43
96
Příloha č. 12
Jednofaktorová analýza variance pro kyselinu olejovou s daty odběrů 7.5.2010 a 27.5.2010
Faktor Výběr Sloupec 1 Sloupec 2
Počet 11 11
Součet Průměr Rozptyl 547,9 49,80909 0,804909 568,4 51,67273 1,340182
ANOVA Zdroj variability Mezi výběry Všechny výběry
SS 19,10227 21,45091
Celkem
40,55318
Příloha č. 13
Rozdíl
MS F 1 19,10227 17,81022 20 1,072545
Hodnota P F krit 0,00042 8,095958
21
Jednofaktorová analýza variance pro kyselinu olejovou s daty odběrů 16.6.2010 a 1.7.2010
Faktor Výběr Sloupec 1 Sloupec 2
Počet 15 15
Součet Průměr Rozptyl 794,8 52,98667 2,188381 781,3 52,08667 0,576952
ANOVA Zdroj variability SS Mezi výběry 6,075 Všechny výběry 38,71467 Celkem
44,78967
Hodnota MS F P F krit 1 6,075 4,393684 0,045233 7,635619 28 1,382667
Rozdíl
29
97
