Plynová chromatografie

Plynová chromatografie Základní přednáška Doc.RNDr. Pavel Coufal, Ph.D. RNDr. Radomír Čabala, Dr. Univerzita Karlova v Praze Přírodovědecká fakulta Katedra analytické chemie

GC - Definice

Plynová chromatografie fyzikálně-chemická

metoda separace směsi látek na základě jejich rozdělování mezi dvě fáze, z nichž jedna je plynná a pohybuje se a druhá je pevná nebo kapalná a je nepohyblivá

lze

ji použít na separaci plynných látek nebo látek, které lze definovaným způsobem převést do plynného stavu

Separační metody

Plynová chromatografie

Výhody GC

nízké nároky na provedení konstantní

průtok/tlak mobilní fáze stlačený nosný plyn tlakové regulátory ventily

vysoká robustnost a citlivost

první komerčně vyvinutá přístrojová chromatografická technika

Separační metody


Plynová chromatografie: podíl na trhu Chemie, petrochemie, plyn, ropa 18%

Zemědělské, potravinářské 14%

Univerzity, státní instituce 19%

Nezávislé testovací 7%

Ostatní 9%

Farmaceutické 33% Zdroj: The Column, February 2008, www.thecolumn.com Separační metody


Chromatografie Rozdělení chromatografických metod podle fází a technik Mobilní fáze

Stacionární fáze Tuhá látka

Technika

Zkratka

Plynová adsorpční chromatografie

GSC

Plyn

Kapalina

Plynová rozdělovací chromatografie

GLC

Superkritická kapalina

Tuhá látka

Superkritická fluidní chromatografie

SFC

Adsorpční kapalinová chromatografie

LSC

Vylučovací chromatografie

SEC

Iontově výměnná chromatografie

IEC

Afinitní chromatografie

AC

Kapalina

Tuhá látka

Kapalina

Separační metody

Reverzní chromatografie

RPC

Kapilární elektrochromatografie

CEC

Chromatografie kapalina-kapalina

LLC

Micelární elektrokinetická chromatografie

MEKC


Blokové schéma plynového chromatografu Zdroj nosného plynu

Vzorek Dávkovač dělič toku

Regulace průtoku nosného plynu

Kolona

Regulace teploty

signál

Detektor

Vyhodnocovací a řídící zařízení

řídící signály

Termostaty

tok nosného plynu

Separační metody

analytická informace Plynová chromatografie

Plynová chromatografie GC

Plynový chromatograf

CHROMATOGRAM signál detektoru, mV

0,8

N2

0,6 0,4 0,2 0,0 0

O2 CH4 2

CO 4 6 retenční čas, min

8

10

TERMOSTAT Separační metody


Separace - definice

Separace operace,

při které se vzorek rozdělí alespoň na dva podíly odlišného složení

dochází

ke zvyšování molárního zlomku alespoň jedné složky původního vzorku oproti ostatním

odlišují

se

selektivitou rozsahem použitelnosti frakcionační kapacitou

Separační metody


Separace v GC probíhá v kapilární nebo náplňové separační koloně, která obsahuje nepohyblivou fázi (sorbent) a pohyblivou fázi (nosný plyn, inertní plyn či eluent).

vzorek nosný sorbent plyn

eluát analyt Separační metody

Rozdílné analyty mají rozdílnou afinitu k sorbentu. Různé analyty vykazují různou distribuci mezi sorbentem a eluentem. Rozdílné analyty jsou rozdílně zadržovány a rozdílně zpožďovány (retardovány). Plynová chromatografie

Struktura chromatografické kolony Termodynamické fáze

Sektory

Kinetické zóny

Proudící mf

Pohyblivá

(v prostoru mezi zrny)

Mobilní (mf)

Stagnantní (uvnitř pórů částic náplně)

Stacionární

Stacionární

Statická

(na povrchu nosiče)

Nosič - stěna kolony

Separační metody


Lineární rychlost nosného plynu 6

p i = 5 atm po = 1 atm

5 4

px

1,0 0,8

ux 0,6 uo 0,4

3 2 1

0,2

0 0,0

0,0 0,0

0,2

0,4

x/L

pi ui Separační metody

0,6

0,8

1,0

pi po =5

0,2

L px ux

0,4

0,6

x/L

0,8

1,0

po uo Plynová chromatografie

Regulace a měření průtoku nosného plynu Pi

Fi

Dávkovač (Injektor)

Fi = Fc + Fspl Dělič (Splitter)

Fspl

Fc

Kolona

Množství vzorku na koloně, mc

mc = ma

Fc Fc + Fspl

= ma

Fc Fi

ma - dávkované množství analytu

Separační metody

Fi - průtok injektorem Fspl - průtok děličem Fc - průtok kolonou Fd - průtok detektorem Fmg - průtok pomocného plynu Pi - tlak na vstupu P0 - tlak na výstupu

Fmg

Fd = Fc + Fmg

Detektor Fd P0 Plynová chromatografie

Kompresibilitní faktor, j 2

⎛ pi ⎞ ⎜⎜ ⎟⎟ − 1 3 ⎝ po ⎠ j= ⋅ 2 ⎛ p ⎞3 ⎜⎜ i ⎟⎟ − 1 ⎝ po ⎠

pi tlak na vstupu do kolny po tlak na výstupu z kolony

průměrná lineární rychlost mobilní fáze

Bo ⋅ Δp Bo ⋅ (pi − p o ) u= = η⋅ ε ⋅ L η⋅ ε ⋅ L u = j⋅ uo

Separační metody

Bo specifická permeabilita kolony [m2] Δp tlakový spád [Pa] η dynamická viskozita [Pa s] ε vnitřní porozita sorbentu L délka kolony [m] Plynová chromatografie

Retenční objemy v GC VM = t M ⋅ Fm mrtvý retenční objem VR,i = t R,i ⋅ Fm retenční objem redukovaný retenční objem

′ i = t ′R,i ⋅ Fm = VR,i − VM VR,

čistý retenční objem je redukovaný retenční objem korigovaný na stlačitelnost nosného plynu ′ i⋅j VN = t ′R,i ⋅ Fm ⋅ j = VR, specifický retenční objem je čistý retenční objem vztažený na 1 g nebo 1 m2 stacionární fáze a vztažený na 0 °C (tj. 273,15 K) 273,15 ⋅ VN Vg = w L ⋅ Tc Separační metody

273,15 ⋅ VN VS = S ⋅ Tc Plynová chromatografie

Adsorpce Langmuirova adsorpční izoterma A(g) + S ⇔ AS K D,A

(c A ) AS = (c A ) max ⋅

(a A ) AS (c A ) AS ⋅ ( γ A ) AS = = (a A ) g (c A ) g ⋅ ( γ A ) g

(c A ) AS =

K D,A R ⋅T

1 + K D,A ⋅ p A

10 8

⋅ pA

(c A ) AS = konst ⋅ p A

6

(cA)AS

Henryho adsorpční izoterma

4

(cA )max = 10 mmol/m2 KD,A = 1

2 0

Separační metody

K D,A ⋅ p A

0

2

4

pA

6

8

10


Rozpouštění (absorpce)

γ B = γ B (x B ) pokud xB << 1, pak γB je konstantní a platí Henryho zákon

pB = HB ⋅ x B Separační metody

parciální tlak

p B = p oB ⋅ γ B ⋅ x B

áko n γ> 1

p B = p oB ⋅ x B

pB parciální tlak složky B nad směsí kapalin poB tlak (tenze) nasycených par složky B xB molární zlomek složky B v kapalné směsi

Hen ryho z

Raoultův zákon

Ra

n o k á z v ů t l ou

h Henry

o

<1 γ , n záko

molární zlomek Plynová chromatografie

Vliv teploty na separaci teplota nástřikové hlavy, Tinj teplota termostatu kolony, Tc teplota detektoru, Td Tc > Tvar , Tinj ≥ Tc , Td > Tc Vyšší teplota kolony vede k rychlejší analýze. Vyšší teplota kolony vyžaduje vyšší tlak nosného plynu na vstupu do kolony pro zachování jeho lineární rychlosti kolonou. izotermická analýza, Tc = konst. analýza s teplotním gradientem, Tc,1 → Tc,2

Separační metody


Derivatizace analytu vede ke snížení jeho bodu varu (Tvar) kyselina benzoová (249 °C), anilin (184 °C), benzanilid (117 °C) derivatizace aminokyselin aminokyselina + isopropylalkohol → isopropylester + trifluoracetanhydrid → trifluoracetamid

Separační metody


Nosný plyn N2 , H2 , He , Ar

tlaková láhev s nosným plynem opatřená regulátorem tlaku či regulátorem průtoku

bublinkový průtokoměr Separační metody


Zdroj nosného plynu 3

3 2

1

1

Tlakové láhve Redukční ventily

vstupní tlak: 5 - 220 atm výstupní tlak: 0,5 - 15 atm

Rozvod plynů

Nosný plyn

Mobilní fáze v GC - nosný plyn (účastní se přenosu látek kolonou)

Kritéria volby nosného plynu

typ detektoru inertnost čistota (min. 99,99% až 99,9999%) hustota Plyn Hustota viskozita g.cm-3 bezpečnost

Viskozita

Tepená vodivost

μPa.s

J.m-1.s-1.K-1

Používané plyny

dusík helium vodík argon

Vodík

0,0899

8,44

175,0

Helium

0,178

18,6

143,6

Dusík

1,250

16,58

23,86

Argon

1,784

21,2

16,75

Dávkování vzorků

Úkoly reprodukovatelně a rychle převést kapalný či tuhý vzorek do plynné fáze beze změny jeho relativního složení zavedení malého definovaného objemu plynné fáze vzorku do kolony

Podmínky nesmí se měnit tlakové a teplotní podmínky v systému dle teorie je pro dosažení maximální účinnosti je nutno dávkovat objem vzorku odpovídající objemu jednoho HETP

Dávkovaná množství vzorku náplňové kolony: až 100 µg v 1 - 10 µl rozpouštědla kapilární kolony: max. 1 µg

Separační metody


Dávkování vzorku se provádí do nástřikové hlavy opatřené septem, která je vyhřívána na zvolenou teplotu a proplachována nosným plynem plynné vzorky injekční stříkačky o objemu 10 až 1000 μl kapalné vzorky injekční stříkačky o objemu 1 až 100 μl tuhé vzorky roztok ve vhodném rozpouštědle

kolona

nosný split/splitless dávkovač plyn odpad Separační metody


Separační kolony

Seaparační kolona srdce

celého GC systému místo průběhu separace parametry separace

účinnost selektivita doba analýzy

volba

kolony

druh SF rozměry

Špatná volba kolony zaručeně zkazí analýzu!

Separační metody


Kolony a) náplňové kolony: skleněné nebo z nerezové oceli o průměru 1 až 6 mm a délce 0,5 až 5 m s adsorbentem (GSC) nebo se stacionární fází na inertním nosiči (GLC) b) kapilární kolony: dříve skleněné nebo z nerezové oceli, dnes výhradně křemenné s polyimidem o průměru 0,1 až 0,5 mm o délce 10 až 100 m WCOT wall coated open tubular SCOT support coated open tubular PLOT porous layer open tubular s chemicky vázanou stacionární fází WCOT

SCOT stacionární fáze

Separační metody

PLOT nosič a stacionární fáze

sorbent


Adsorbenty v GC aktivní uhlí, grafitizované uhlí dělení plynů a lehkých uhlovodíků silikagel dělení anorganických plynů a nízkovroucích kapalin molekulová síta (krystalické hlinitokřemičitany) 5A dělení plynů a lehčích uhlovodíků 4A jako sušidla porézní polymery (vinylbenzenové kopolymery) komerčně tzv. Porapaky dělení nízkomolekulárních uhlovodíků, anorganických plynů, alkoholů, esterů a ketonů Separační metody


Kapalné stacionární fáze v GC Carbowaxy (polyethylenglykoly) Ucony (polypropylenglykoly) polární stacionární fáze, s rostoucí Mr klesá polarita Polyestery (např. polyethylenglykoladipáty, polypropylenglykoladipáty, polyethylenglykolsukcináty) polární stacionární fáze Silikonové stacionární fáze (polysiloxany) (např. methylpolysiloxan SE-30, fenylmethylpolysiloxan OV-17, fenylpolysiloxan SE-54, kyanopropylpolysiloxan SP-2340) často používané, široký rozsah polarity Separační metody


Detektory

Úkoly detegovat

v nosném plynu složky opouštějící kolonu

Požadavky rychlá

odezva velká citlivost stabilita základní linie velký lineární dynamický rozsah nulová odezva na MF zanedbatelný šum

Separační metody


Detektory - charakteristika Charakteristika měřícího zařízení

LOD, LOQ

Citlivost

Šum

Selektivita RMR

Linearita

Koeficient linearity Separační metody

Lineární dynamický rozsah

Chyba linearity Plynová chromatografie

Detektory Signál analytu 0

LOD

Analyt je detegován nelze ho stanovit 3 < S/N <10

Analyt není detegován S/N < 3

0

Sbc

LOQ

Sbc + 3σ

Analyt lze stanovit S/N > 10

Sbc + 10σ

Signál měřícího zařízení Separační metody


Tepelně vodivostní detektor, TCD univerzální, nedestruktivní, středně citlivý

odporové vlákno Separační metody


Plamenový ionizační detektor, FID selektivní, destruktivní, velmi citlivý

zapalování

+ elektrody

vzduch

vodík eluát

Separační metody


Detektor elektronového záchytu, ECD selektivní, nedestruktivní, středně citlivý

+ anoda

zářič katoda

63 28Ni

eluát Separační metody


Detektory pro GC Hmotnostní spektrometr, MS vysoce specifický, destruktivní, velmi citlivý TCD: všechny látky lišící se tepelnou vodivostí od nosného plynu FID: uhlovodíky ECD: halogenderiváty (pesticidy) a nitroderiváty MS: téměř všechny organické látky Separační metody


Charakterizace detektorů základní linie, šum a drift, pík odezva detektoru (signál detektoru), R diferenciální veličina (výška píku)

R = S⋅c

dm R = S⋅ dt

t2

S m A = ∫ R dt = ⋅ Mh Fm t1

citlivost detektoru, S

plocha pod eluční křivkou, A integrální veličina (plocha píku)

časová konstanta, τ (3τ → 95 %)

t2

A = ∫ R dt = S ⋅ m t1

R t = R ∞ ⋅ (1 − e − t/τ )

lineární dynamický rozsah A = b ⋅ c detekční limit, LOD

3σ

limit stanovení, LOQ 10σ Separační metody


Analytická informace z chromatogramu RESULTS Peak 1 2 3 4

RT(min) 5.723 12.561 15.887 22.975

Height 1.957 5.457 2.827 0.773

Area 8.872 96.121 73.266 6.001

W50% 0.023 0.048 0.073 0.102

kvalitativní informace : poloha píku – retenční čas → retenční faktor - druh látky (metoda standardů nebo MS detekce) kvantitativní informace : plocha píku → množství, koncentrace látky a) metoda vnitřní normalizace b) metoda absolutní kalibrace (kalibrační přímky) c) metoda vnitřního standardu d) metoda standardního přídavku Separační metody


GC plynů ze vzduchu

signál detektoru, mV

0.8

kolona: náplňová, z nerezové oceli 6' x 1/8'' (183 cm x 3,2 mm)

N2

0.6

stacionární fáze: molekulové síto 5A 0.4

nosný plyn: 30 ml/min He

O2 0.2

0.0

dávkování: 100 μl (35 °C) CH 4

teplota termostatu kolony: 35 °C

CO

detekce: TCD (140 °C) 0

Separační metody

2

4

6

8

retenční čas, min

10


GC isopropylesteru fenylalaninu (N-TFA)

signál detektoru, mV

80

1

kolona: křemenná kapilární, 25 m x 0,250 mm stacionární fáze:

2

60

PERMABOND® L-CHIRASIL-VAL 40

20

0 0

Separační metody

2

4

6

8


10

12

nosný plyn: 1,2 ml/min H2 (0,6 bar) dávkování: 0,5 μL (1% roztok v CH2Cl2) splitter (dělič): 1:50 teplota termostatu kolony: 150 °C detekce: FID (260 °C) 1. D-fenylalanin 2. L-fenylalanin Plynová chromatografie

GC polychlorovaných bifenylů (PCB) signál detektoru, mV

1.0

4

9 7

0.8

12 11

13 14 15 16

6

0.6

8 0.4

1

10

23

0.2

0.0

5

0

5

10

15

20

25


30

35

kolona: FS-SE-54-DF-0,35; 50 m x 0,25 mm ID stacionární fáze: SE-54 (fenylpolysiloxan) nosný plyn: N2 (1,2 bar) dávkování: 1 μL (200 - 800 pg/μL v CH2Cl2) splitter (dělič): 1:70 teplota kolony: 80 °C → 280 °C, 8 °C/min detekce: ECD (260 °C)

1. 2-chlorbifenyl, 2. 4-chlorbifenyl, 3. 2,2'-dichlorbifenyl, 4. 2,4-dichlorbifenyl, 5. 4,4'-dichlorbifenyl, 6. 3,5,3'-trichlorbifenyl, 7. 2,4,4'-trichlorbifenyl, 8. 2,5,2',5'-tetrachlorbifenyl, 9. 2,4,6,4'-tetrachlorbifenyl, 10. 3,4,4'-trichlorbifenyl, 11. 2,3,4,6,2'-pentachlorbifenyl, 12. 2,3,4,4'-tetrachlorbifenyl, 13. 2,3,4,5,2'-pentachlorbifenyl, 14. 2,4,5,2',4',5'-hexachlorbifenyl, 15. 2,3,4,2',4',5'- hexachlorbifenyl, 16. 2,3,4,5,2',3'- hexachlorbifenyl Separační metody


Superkritická fluidní chromatografie, SFC mobilní fáze je superkritická tekutina CO2: kritická teplota, Tc = 35 °C kritický tlak, Pc = 75 bar (7,5 MPa) fázový diagram oxidu uhličitého 120

tlak, bar

100 80 60 40

Pc tuhá látka

kritický bod kapalina

plyn

20 0

superkritická tekutina

Tc -80 -60 -40 -20

0

o

teplota, C

Separační metody

20

40

60

oxid uhličitý 40 °C: 72 bar → 0,22 g/ml 400 bar → 0,96 g/ml 80 °C: 72 bar → 0,14 g/ml 400 bar → 0,82 g/ml Hustota a rozpouštěcí schopnost superkritické tekutiny se blíží hustotě a rozpouštěcí schopnosti kapalin. Viskozita superkritické tekutiny se blíží viskozitě plynů. Superkritická fluidní chromatografie

Plynová chromatografie

Recommend Documents