CHROMATOGRAFIE ZNAČENÝCH SLOUČENIN 1.1 ÚVOD Příprava a využití značených sloučenin nutně vyžaduje techniku, která umožňuje možnost separace, identifikace a kvantifikace sloučenin. Pro tyto účely se jako nejvhodnější ukázaly chromatografické techniky, které pracují na principu separace jednotlivých komponent i složitých směsí a lze je přímo kombinovat s dalšími měřeními, které dovolují identifikaci a kvantifikaci sloučenin. Chromatografické techniky patří tedy mezi separační metody, podobně jako krystalizace destilace, extrakce apod. Jejich historie není příliš dlouhá. První pokusy provedl ruský chemik Cvet na začátku dvacátého století, kdy objevil, že vodné či alkoholické roztoky rostlinných barviv kápnuté na filtrační papír se rozpíjí a během tohoto děje dochází k oddělení jednotlivých barviv, které jsou v uvedeném uspořádání viditelné jako soustředné kruhy. Přestože Cvet objev záhy publikoval, k vlastnímu využití došlo až bezmála o čtyřicet let později. Jak už vyplývá z původního pokusu, chromatografický proces je dělením látek mezi dvěma fázemi – v případě Cvetova pokusu mezi celulosou (sorbent) a rozpouštědlem (mobilní fáze) do něhož bylo extrahována směs rostlinných barviv. Postupem času byl jednoduchý experiment teoreticky propracován a byla zavedena řada chromatografických technik, které se v principu liší a) typem chromatografického sorbentu a elučního činidla(mobilní fáze) a b) vlastním uspořádáním (tenkovrstvá chromatografie, kolonová chromatografie). V dalším popisu se budeme zabývat pouze procesem takzvané kapalinové chromatografie, která se vyznačuje tím, že jako sorbent je použita pevná fáze, jako mobilní fáze kapalina. Z hlediska separačních procesů lze rozlišit několik základních principů“ a) adsorpční chromatografie: Separační proces je řízen absorpční izothermou a typickým sorbentem je silikagel (SiO2). Typickou mobilní fází jsou málo polární organická rozpouštědla nebo jejich směs. Látky se dělí podle afinity k polárnímu sorbentu, složeniny s vyšší polaritou jsou sorbovány větší silou a tedy pomaleji se z něj vymývají mobilní fází. b) rozdělovací chromatografie: Separační proces je řízen rozdělovací konstantou mezi sorbentem a mobilní fází. Hlavním procesem břehem chromatografie je vlastně extrakce a rozpouštění. Jako sorbent se používá nepolární fáze, v klasickém provedení silikagel s kovalentně vázanými dlouhými uhlíkatými řetězci (C8, C18), typickou mobilní fázi jsou vodné roztoky organických rozpouštědel (acetonitril, methanol), případně v kombinaci se slabými pufry. Chromatografované sloučeniny se dělí podle schopnosti rozpouštět se v nepolární vrstvě sorbentu a míra jejich rozpustnosti v lipofilní fázi určuje hodnotu zpoždění při vymývání z chromatografického systému ve srovnání s látkou, která by se sorbentem neinteragovala. Polární látky proto odcházejí ze systému dříve než látky nepolární a proto se uvedené uspořádání někdy nazývá chromatografie na obrácené fázi, reversní chromatografie apod. c) iontově výměnná chromatografie: Separační proces je založen na elektrostatické interakci a difúzi, zádrž látek je ovlivněna velikostí náboje, disociační konstantou a efektivním průměrem iontu. Jako sorbenty mohou být použity jak měniče aniontů, tak i měniče kationtů, ve funkci mobilní fáze se používají roztoky solí nebo pufry. Metoda je použitelná k separaci iontových nebo disociovatelných sloučenin. d) gelová chromatografie Separační proces je založen na principu difuze. Gel, nebo v některých případech mikroporézní skleněné kuličky mají póry o definovaném průměru. Látky, které mají menší efektivní molekulový objem než je průměr póru difundují do sorbentu a jsou tak zadržovány oproti větším molekulám, které se do póru nevejdou. Výsledkem je
vlastně separace podle molekulové hmotnosti, která se také často využívá ke stanovení molekulové hmotnosti polymerních molekul, včetně biopolymerů, jako jsou proteiny či polysacharidy. Měření se provádí na základě kalibrace sadou odpovídajícího typu látek se známou molekulovou hmotností. Kalibrace však mezi jednotlivými typy molekul (proteiny, sacharidy, různý typy syntetických polymerů) nejsou převoditelné, protože se během procesu částečně projevují polární či afinitní interakce se sorbentem. Mobilní fází bývají často pufry. Metodu lze použít i k tzv. odsolení, což je odstranění solí ze vzorků především biomolekul, které se izolují v pufrech. Zvolíme-li sorbent s vhodnou velikostí pórů, anorganické ionty difundují do sorbentu a požadovaná biomolekula je zadržována jen minimálně. V uvedeném případě se jako mobilní fáze používá destilovaná voda, či roztok soli, kterou lze odstranit lyofilizací (uhličitan amonný apod.). V radiochemických syntézách se gelová filtrace používá např. k odstranění nízkomolekulárních sloučenin po radiojodaci proteinů (radiojodid, zbytky a produkty z oxidačního činidla). e) afinitní chromatografie: Separace využívá specifických rozpoznávacích systémů typu enzym-substrát, antigen-protilátka, inhibitor-enzym, receptor-látka apod. Molekuly v separované směsi se vymývají ze systému v závislosti na afinitě k modifikovanému sorbentu. Kromě uvedených principů se využívají mnohdy i kombinované procesy, navíc, žádný z těchto procesů neprobíhá zcela izolovaně a každá reálná chromatografie je kombinací uvedených principů, přičemž pro popis dějů se používá ten z nich, který je v dané separaci dominantní. Tenkovrstvá chromatografie (TLC, thin layer chromatography) TLC uspořádání je založeno na vrstvě sorbentu, nejčastěji silikagelu, která je fixována na povrch skleněné desky, nebo hliníkové či umělohmotné folie. Po nanesení vzorku na desku se tato ponoří okrajem do mobilní fáze, která vzlíná a postupně vymývá jednotlivé komponenty nanesené směsi. Po dosažení dostatečné dráhy mobilní fáze, se deska vyjme z vyvíjecí komory vysuší a látky se vhodným způsobem detegují. Pro snadnější detekci látek obsahujících aromatický systém, nebo konjugovaný systém dvojných vazeb je silikagel impregnován barvivem fluoreskujícím při dopadu UV záření o vlnové délce 254 nm. Přítomnost aromatického systému se potom projeví jako zhášení fluorescence uvedeného barviva. Pro některé typy látek existují i specifická činidla, která s daným typem sloučenin nebo funkční skupinou poskytují barevné produkty, které opět zviditelní nebarevné látky na chromatogramu. Obecnou detekcí je postřik kyselinou sírovou a následné zahřátí chromatogramu – organické látky zuhelnatí a objeví s jako tmavé skvrny, častou detekcí je rovněž použití par jodu. V případě radiochromatogramů lze detegovat aktivitu buďto TLC skenerem, autoradiograficky, nebo rozstříháním chromatogramu na příčné proužky (či vystřihnutím pouze sledovaných skvrn) a následným měřením LSC (či jinou vhodnou metodou). V praxi se nejčastěji používají desky s naneseným silikagelem, nicméně lze použít i komerční desky s reversní fází, celulosou (náhrada papírové chromatografie), oxidem hlinitým apod. Při vlastním provedením si připravíme destičku o vhodné velikosti (pro jednu skvrnu postačuje šířka dráhy 1 cm a délka mezi 50 – 100 mm je dostatečná pro většinu separací), ca. 1 cm od spodního okraje vyznačíme měkkou tužkou čáru start a na tuto čáru naneseme kapilárou, mikrostříkačkou nebo automatickou pipetou potřebné množství vzorku. Vzniklá skvrna by měla být co nejmenší, v případě malé koncentrace látky nanášíme několikrát, vždy po předchozím odpaření rozpouštědla. Před vložením do vyvíjecí nádoby s mobilní fází necháme rozpouštědlo z naneseného vzorku vždy odpařit. Mobilní fáze musí být ve vyvíjecí komoře jen tolik, aby sahala pod spodní okraj nanesené skvrny, v opačném případě by e látka vymývala do mobilní fáze. Po ponoření spodního okraje chromatogramu do
mobilní fáze můžeme zcela zřetelně pozorovat postup vzlínání kapaliny vrstvou sorbentu. V okamžiku, kdy vzlínání dostoupilo několik mm před konec chromatografické desky, chromatogram vyjmeme usušíme a látky ve vrstvě sorbentu detegujeme vhodným způsobem. Polohu skvrny na chromatogramu lze charakterizovat hodnotou retenčního faktoru Rf, který je poměrem vzdálenosti středu skvrny od startu k celkové dráze mobilní fáze na chromatogramu. K hodnotě Rf se uvádí typ sorbentu a mobilní fáze. Volba mobilní fáze na silikagelu vychází z předpokladu, že čím je mobilní fáze polárnější, tím jsou polární látky více vymývány od startu. Lze použít celou škálu organických rozpouštědel od polárního methanolu až po nepolární hexan, či jejich směsi. Lze použít i vodně-organické fáze, mechanismus však potom není čistě adsorpční a postup mobilní fáze vrstvou je velice pomalý, navíc predikce a interpretace výsledků bývá u bohatých směsí komplikovaná. Nutno ještě podotknout, že hodnoty Rf se v publikacích běžně neuvádějí, pokud jsou uvedeny je nutné je přijímat s určitou rezervou a menší odchylky od zveřejněných hodnot nejsou chybou experimentátora. Hodnota Rf závisí nejen na látce a mobilní fázi a typu sorbentu, ale může se poněkud lišit i na jednou typu sorbentu vlivem různé zrnitosti, sféricity, aktuální vlhkosti přítomné v silikagelu apod. Stejně tak i čistota či obsah vody v použitých rozpouštědel mohou hodnotu Rf poměrně významně ovlivnit. Vysokoúčiná kapalinová chromatografie (HPLC, High Performance Liquid Chromatography) HPLC je instrumentální technikou, která umožňuje natolik reprodukovatelný proces, že jeho výsledky lze použít k identifikaci a kvantifikaci sloučeniny, samozřejmě, že ve většině případů srovnáním se standardem. HPLC systém sestává z vysokotlakého čerpadla mobilní fáze, nástřikového zařízení a detektoru spojeného s osobním počítačem. Výsledkem procesu je chromatogram, který je vlastně grafickou závislosti odezvy detektoru na čase. Jednotlivé separované látky se na chromatoramu projeví tzv. píky, jejichž charakteristickou vlastností je především vzdálenost maxima od nástřiku (retenční čas) a plocha, která je úměrná množství látky prošlé detektorem. Retenční čas se využívá k zjištění identity se standardem, plocha píku pro stanovení koncentrace. Z hlediska instrumentální techniky jsou čerpadla konstruována převážně jako dvoj či trojcestná čerpadla, která mohou pracovat v režimu konstantního složení mobilní fáze (izoktratická eluce) či v režimu naporogramované změny složení mobilní během jedné chromatografické separace (gradientový režim). I když pro většinu separací vystačíme s izokratickým režimem, tak v případech, kdy se ve směsi objevují látky s velkým rozdílem polarit (biologické vzorky) je výhodnější gradientový režim, který zaručí lepší dělení a zajišťuje kompletní vymytí vzorku z kolony. Nástřikové zařízení je zpravidla tvořeno několikacestným kohoutem, který umožňuje dávkovat vzorek z nástřikové smyčky o definovaném objemu pouhým otočením za minimální tlakové změny. Kolona je vlastním jádrem chromatografického procesu a je tvořena nerezovou trubkou, která je naplněna chromatografickým sorbentem. Nejčastější sorbenty jsou silikagel, a reversní fáze (C-18). V posledních letech převažuje použití reversní fáze, která je vhodnější pro biologické extrakty Nejsou u ní problémy se sorbovanými zbytky polárních látek, které jsou z silikagelové kolony mnohdy nevymytelné a při nahromadění způsobují změnu jejich parametrů. C-18 fáze využívá nějčastěji jako mobilní fáze směs acetonitrilu nebo methanolu s vodou. Co se týče rozměrů kolon, analytické kolony se používají o vnitřním průměru 1 - 4 mm a délce 150 – 250 mm, preparativní kolony mají příslušně větší rozměry. Nutno poznamenat, ze i k preparativní separaci značených sloučenin lze vzhledem k velmi malým hmotnostním množstvím využít i kolony analytické resp. semipreparativní (např. 8x250 mm). Problematiky detektorů v HPLC je poměrně složitá, mezi univerzální detektory se uvádí refraktometrický (změna indexu lomu) a UV/VIS detektor (změna absorpce při zvolené
vlnové délce). Speciálním detektorem je např. připojení k hmotovému spektrometru, jehož výsledky umožňují nejen konstrukci chromatogramu a kvantifikaci, ale rovněž dávají informaci o struktuře měřené molekuly. On-line detekce radioaktivity ve značených sloučeninách může být provedena pomocí detektoru radioaktivity založeném obvykle na scintilačním principu, přičemž detektor může využívat jako scintilační substanci buď scintilační sklo nebo mixovat mobilní fázi se scintilačním koktejlem. Zmínku ještě zaslouží UV/VIS detektor, který je snadno použitelný ke stanovení koncentrace látky ve vzorku na základě absorpce při vhodné vlnové délce. Jak vhodná vlnová délka se jeví absorpční maximum v UV/VIS spektru, vlastní stanovení probíhá na základě Lambert-Beerova zákona a kalibrace řadou chemicky identických standardů o různé koncentraci. V praxi to znamená, že na základě naměřených ploch píků při chromatografii různě koncentrovaných standardů se zkonstruuje kalibrační přímka ze které lze následně odečíst koncentrace a aktuálních vzorcích. Nutno poznamenat, že kalibrační přímka musí být konstruována v takovém rozsahu koncentrací, aby naměřené hodnoty ležely uvnitř koncentračního intervalu. V současné době je tento způsob analýzy již značně ulehčen, neboť většina chromagtografických programů umožňuje kromě vyhodnocení píků a jejich ploch i načíst chromatogramy pro kalibraci, automaticky proložit kalibrační závislost a neznámé koncentrace z chromatogramů automaticky vyhodnocovat. Kolonová nízkotlaká chromatografie (Column low-pressure chromatography) Zařízení pro tento typ chromatografie je tvořeno skleněnou či umělohmotné trubicí – kolonou naplněné zčásti sloupcem sorbentu, obvykle silikagelu. Na horní okraj sloupce silikagelu se nanese separovaná směs rozpuštěná v mobilní fázi nebo jiném vhodném rozpouštědle. Po vsáknutí vzorku se do kolony napustí mobilní fáze, která samovolně protéká sloupcem sorbentu přičemž probíhá vlastní chromatopgrafický proces. Na výstupu z kolony se postupně jímají malé frakce, které se analyzují – obvykle TLC. Frakce obsahující stejnou látku se nakonec spojí a mobilní fáze se odpaří čímž získáme jednotlivé čisté komponenty z původní směsi.
Varianta A TLC chromatografie z reakční směsi po izotopové výměně 1.2 ÚLOHA 1. Ověřte závislost Rf N-(4-jodfenyl)acetamidu na složení mobilní fáze 2. Vyhodnoťte radiochemický výtěžek reakce po izotopové výměně chromatografických systémech.
v různých
1.3 POTŘEBY A POMŮCKY TLC desky – silikagel UV254, N-(4-jodfenyl)acetamid, reakční směs z úlohy izotopová výměna v organické sloučenině, sada rozpouštědel, UV-lampa, InstantImager
1.4 PRACOVNÍ POSTUP 1. Připravte si 10 chromatografických desek o rozměrech 2x8 cm, 1 cm od kratšího okraje desky vyznačte čáru startu. 2. Připravte roztok neaktivního N-(4-jodfenyl)acetamidu v acetonitrilu o koncentraci ca 5 mg/ml.
3. Připravte sadu mobilních fázi: 1. Methanol; 2. dichlormethan; 3. chloroform; 4. toluen; 5. ethyl-acetát; 6. hexan; 7. ethyl-acetát-hexan (3:1); 8. chloroform-methanol (2:1); 9. toluenmethanol (9:1); 10. hexan-diethylether (8:2). 4. Na připravenou chromatografickou desku naneste vzorek připraveného standardu N-(4jodfenyl)acetamidu a reakční směsi (do jedné skvrny) a proveďte chromatografii v mobilní fázi 1. Před vyjmutím chromatogramu z vyvíjecí nádoby označte polohu čela mobilní fáze a po uschnutí chromatogramu označte tužkou skvrnu testované látky, změřte její polohu a stanovte Rf. Aktivitu proměřte elektronickou autoradiografií, nebo rozstříháním chromatogramu příčně na stejné proužky do scintilačních lahviček a po převrstvení scintilačním koktejlem měřte na LSC. V obou případech získáte poměr radioaktivity přítomné ve skvrně produktu vůči radioaktivitě naměřené na celém chromatogramu. (výstupem je Rf, profil aktivity a procentuální zastoupení aktivity v produktu). 5. Uvedený proces zopakujte pro řadu dalších 9 mobilních fází a pozorujte změny v Rf, tak i v získaných výsledcích radiochemického výtěžku reakce z předchozí úlohy.
Varianta B Separace z reakční směsi po izotopové výměně, stanovení radiochemické čistoty 1.5 ÚLOHA 1. Separujte [125I]N-(4-jodfenyl)acetamid z reakční směsi v izolovaném produktu stanovte radiochemickou čistotu.
po
izotopové
výměně,
1.6 POTŘEBY A POMŮCKY Injekční stříkačka 10 ml (2x), delší injekční jehla, vata, TLC desky, silikagel, filtrační papír, zatavená hadička k zaslepení stříkačky, sada lékovek pro sbírání frakcí, automatická pipeta (10 µl, 1 ml), Instant Imager, LSC Spektrometr, hexan, ethyl-acetát, acetonitril, methanol, odměrné válce (10 a 20 ml)
1.7 PRACOVNÍ POSTUP Separaci produktu proveďte metodou kolonové chromatografie na silikagelu, mobilní fázi použijte hexan-ethyl-acetát (1:1). 1. Připravte 20 ml mobilní fáze hexan/ethyl-acetát (1:1, v/v) 2. Připravte chromatografickou kolonu z umělohmotné injekční stříkačky. Ze stříkačky odstraňte píst, nástavec pro nasazení jehly lehce ucpěte malým množstvím vaty a stříkačku upevněte do klemy na laboratorní stojan. Pod takto připravenou kolonu umístěte větší sběrnou nádobu. Rovněž si připravte sadu nádobek pro sbírání frakcí a kousek umělohmotné hadičky na jednom konci zatavený(k uzavření kolony nasunutím na nástavec pro upevnění injekční jehly). Ve zvláštní nádobě rozmíchejte 3 ml silikagelu v 10 ml mobilní fáze a vzniklou suspenzi vlijte do stříkačky. mobilní fázi nechte vykapávat do sběrné nádoby tak dlouho až se její hladina dotkne povrchu silikagelového sloupce. Poté kolonu uzavřete nasunutím zaslepené hadičky na výtok. 3. Reakční směs z izotopové výměny zřeďte 300 µl mobilní fáze a vzniklou směs opatrně naneste na povrch silikagelového sloupce. Kapalinu nechte pomalu vsáknout (průtok se reguluje nasazováním či odstraňováním hadička na výpusti z kolony). Poté vložte na
povrch silikagelu kolečko z filtračního papíru (zabrání zvíření silikagelu při přidávání mobilní fáze) a stříkačkou s delší jehlou přidejte mobilní fázi po okraj stříkačky-kolony. Odstraňte zaslepovací trubičku na výpusti z kolony a sbírejte frakce po cca. 1 ml. mobilní fázi průběžně doplňujte, tak abyste použili celkem 10 ml mobilní fáze. 4. Jednotlivé frakce analyzujte TLC (2 desky 4,5x8, na každou 5 frakcí + standard, postačují vzorky o objemu ca 10 µl, silikagel, ethyl-acetát/hexan 3:1), vyhodnoťte pomocí elektronické autoradiografie. Vzorky obsahující produkt spojte a na rotační vakuové odparce odpařte do sucha a rozpusťte v definovaném množství acetonitrilu(methanolu) – 1 - 5 ml. 5. Vzorek z připraveného roztoku znovu analyzujte TLC a vypočtěte radiochemickou čistotu. Alikvot roztoku proměřte na LSC (vzorek 10 µl, měřte 3 nezávisle odebrané vzorky, aby se zabránilo náhodné chybě vzniklé pipetováním, vzorek vždy vnášejte do scintilační lahvičky naplněné scintilačním koktejlem a pod jeho hladinu). Měře v modu DPM a vypočtěte objemovou aktivitu připraveného roztoku značené sloučeniny.
Varianta C Stanovení měrné aktivity izolovaného N-(4-jodfenyl)acetamidu 1.8 ÚLOHA 1. Stanovte měrnou aktivitu izolovaného N-(4-jodfenyl)acetamidu.
1.9 POTŘEBY A POMŮCKY Kapalinový chromatograf (C-18, 4,5x250), parametry viz zadání), detektor UV a scintilační detektor, odměrné baňky (5 ml, 4x), váhy s přesností minimálně na 0,1 mg, acetonitril(methanol), úloha vyžaduje instruktáž a přítomnost operátora příslušné chromatografické stanice
1.10 PRACOVNÍ POSTUP 1. Vycházejte z izolovaného roztoku značené sloučeniny, který byl získán v části B a vypočtěte koncentraci N-(4-jodfenyl)acetamidu vzhledem k původní navážce v reakci izotopové výměny (1 mg). 2. Změřte aktivitu alikvotu (5 - 10 µl) výše uvedeného roztoku na LSC s použitím zhášecí křivky (DPM). Z výsledků vypočtěte aktivitu v celém objemu v Bq a µCi. 3. Na základě vypočtené hodnoty připravte 4 kalibrační roztoky neznačeného N-(4jodfenyl)acetamidu tak, aby 3 z nich byly o nižší koncentraci, jeden o koncentraci vyšší. (např. pro vypočtenou koncentraci 0,5 mg/ml zvolte koncentrace 0,1, 0,25, 0,4 a 0,6 mg/ml). Roztoky připravte ve stejném rozpouštědle, jako je již připravený roztok značené sloučeniny. 4. Vlastní stanovení se provede na kapalinovém chromatografu. Zvolte následující podmínky: kolona C-18, mobilní fáze methanol/voda (8:2, v/v), průtok 1 ml/min, detekce UV při 254 nm, detekce radioaktivity (není nutná) HPLC scintilační detektor s celou plněnou scintilačním sklem. Nejprve chromatografujte řadu kalibračních roztoků a na základě měnící se plochy píků při různých vstupních koncentracích sestrojte kalibrační přímku. Nástřikem zkoumaného roztoku potom získáte po integraci chromatogramu plochu píku, která odpovídá aktuální koncentraci ve zkoumaném roztoku. Integrací chromatogramu z detekce radioaktivity můžete ověřit přesnost stanovení radiochemické čistoty z předchozí části úlohy.
1.11 POZNÁMKA Vzhledem k tomu, že se v úloze pracuje s elektronickým zpracováním dat a příslušný chromatografický program se může v ovládání lišit, dostanete podrobné instrukce od operátora konkrétní chromatografické sestavy. Ke konstrukci a vyhodnocení kalibrační závislosti použijte přímo chromatografický software a výsledky prezentujete formou protokolu jako výstupu z chromatografické datastanice. Na základě získaných údajů (aktivita a hmotnost látky v roztoku) vypočtěte měrnou aktivitu získané značené sloučeniny.
