Gelová permeační chromatografie
•separace molekul na základě molekulové hmotnosti, velikosti a tvaru molekuly •stacionární fáze – gel (obvykle prokřížený cukr) •velké molekuly se eluují dříve, malé molekuly se eluují později •možnost stanovení molekulových hmotností •odstraňování nízkomolekulárních sloučenin (odsolování)
Typický eluční diagram
V0
Vt
Vt
V0
Vt – V0
mobilní fáze
Kd =
Ve − V0 Ve − V0 = Vs Vt − V0 − Vgelu
K av =
stacionární fáze
Ve − V0 Vt − V0
R=
V0 Ve
Vliv tvaru molekuly
Kalibrace •eluční čas (eluční objem) standardů je vynesen v závislosti na molekulové hmotnosti •kolona by měla být pravidelně kalibrována •stálý průtok •kolona separuje podle velikosti ne molekulové hmotnosti, proto je získaná molekulová hmotnost jen relativní
Kalibrační křivka
A280nm
Vztah mezi velikostí částic a rozlišením VELIKOST ČÁSTIC [µ µm] Coarse 100–300 Medium 50–150 Fine 20–80 Superfine 10–40
Ve/Vt
Vztah mezi velikostí částic a průtokem
Vztah mezi rozlišením a objemem vzorku Rozlišení R=
∆Ve w1 + w2 2
∆Ve
ideální objem nanášeného vzorku ~ 1 - 2 % w1
w2
objem nanášeného vzorku [% Vt]
Vztah mezi rozlišením, průtokem a délkou kolony výška kolony [cm] průtok koncentrace
[ml/min]
zvyšování průtoku
snižování délky
čas
Tvar kolony
krátká a silná kolona
dlouhá a tenká kolona
silná kolona nemá dostačující rozlišení ale má lepší průtok a kapacitu
Stacionární fáze Pharmacia Sephadex Sepharose Sephacryl Sephacel
glukosa (dextrosa) agarosa glukosa + akryamid cellulosa
FPLC Superose Superdex Bio-Rad BioGel P BioGel A
akrylamid agarosa
Sephadex
pó r
glukosová jednotka
Vlastnosti Sephadexu
malé proteiny
Sephacryl HR
cross- link N, N´-methylen bis-aktŕylamid
Ve [ml]
Sepharose
Sepharose CL Sepharose + 2,3 − dibromopropanol NaOH → SepharoseCL •lepší teplotní a chemická stabilita •extrémě malé množství ionizovatelných skupin rozsah ~ 10000 - 10000000
Sephadex
velké proteiny
Sephacryl
Superose prokřížená poresní agarosa
Bio-Gel P Bio-Gel P gely – poresní polyakrylamidové částice vzniklé kopolymerací akrylamidu a N,N'-methylene-bis-akrylamidu. •extremě hydrofilní •nenabité
Bio-Gel A Bio-Gel A gely – agarosa •minimalní nespecifické interakce •výborné průtokové vlastnosti
Použití gelové permeační chromatografie vysoké rozlišení
skupinová separace
separace molekul na základě velikosti (tvaru)
odsolení
vhodná jako závěrečný krok purifikace
výměna pufru
separace polymerů od monomerů
odstranění vysokomolekulárních a nízkomolekulárních látek
separace denaturovaných forem proteinů od nativních
Experiment vysoké rozlišení
skupinová separace
stacionární fáze
výběr podle frakcionačního rozsahu lepší strmá selektivita pro úzké píky malé částice
Sephadex G-25
kolona
dlouhá a tenká kolona 30-100 cm
nezáleží na délce kolony
mobilní fáze
kompatibilní, střední iontová síla
kompatibilní
průtok
nižší průtok
i střední průtok
objem vzorku
0,5 - 5% objemu kolony
až ¼ objemu kolony
Před purifikací: •zkontrolujte viskozitu vzorku •zfiltrujte nebo odstřeďte vzorek
Pro zvýšení rozlišení: 1. optimální frakcionační rozsah 2. co nejmenší objem vzorku 3. co nejmenší částice gelu (x průtok) 4. dvě kolony do série 5. snížit průtok
Nespecifická adsorbce vzácně na agarosu a dextran pokud Kav > 1 iontové nebo hydrofobní interakce •pufr > 0.05M NaCl •Hydrofobní interakce - 25% acetonitrile, EtOH nebo isopropopanol, 10% etyleneglycol
Ionexová chromatografie
• Určena pro separaci látek nesoucích kladný nebo záporný náboj • Afinita iontů k ionexu závisí na velikosti náboje • V případě proteinů hraje zásadní roli pH !
Princip ionexové chromatografie
Ionexy • Katexy – záporný náboj vazba kationtů Anexy – kladný náboj vazba aniontů
silný anex Q Sepharosa
0,1 M NaOH
Nosiče •polystyren – Amberlit, Dowex •celulosa – X-Sephacel •dextran – X-Sephadex •prokřížená agarosa – X-Sepharosa •syntetické polymery – MonoBeads, MiniBeads (Q, S)
X-Sepharosa Sepharose High Performance (34 µm), Sepharose Fast Flow (90 µm), Sepharose Big Beads (100 – 300 µm), Sepharose CL-6B (90 µm, lepší chemická a fyzikální stabilita)
Vzorek:
0,8 mg cytochrom C (pI 10,3) 0,8 mg lysozym (pI>11) 3 mg ribonukleasa A (pI 9,3) Startovací pufr: 20mM fosfátový pufr pH 6,8 Eluční pufr: 20mM fosfátový pufr pH 6,8+0,5 M NaCl Průtok: 1 ml/min Kolona: 1ml Průběh separace: ekvilibrace – 20 ml startovacího pufru aplikace vzorku – 2 ml promytí - 5 ml startovacího pufru eluce – 40 ml, lineární gradient, 0-100 % elučního pufru
0,8 mg α-laktoglobulin (pI 5,8) 0,4 mg conalbumin (pI 6,3) 1,2 mg trypsin inhibitor (pI 4,5) Startovací pufr: 20mM Tris/HCl pH 7,4 Eluční pufr: 20mM Tris/HCl pH 7,4 + 0,5 M NaCl Průtok: 1 ml/min (150cm/h) Kolona: 1ml Průběh separace: ekvilibrace – 20 ml startovacího pufru aplikace vzorku – 2 ml promytí - 5 ml startovacího pufru eluce – 40 ml, lineární gradient, 0-80 % elučního pufru Vzorek:
Údaje od výrobce
MonoBeads, MiniBeads (Q, S) vysoké rozlišení MiniBeads – mikropurifikace, analysa vyšší pracovní tlak – FPLC/HPLC MonoBeads -FPLC
Vzorek: pankreatin Eluce: gradient iontové síly Rozlišení
Výběr vhodného pH pro ionexovou chromatografii
Eluční gradient
pH gradient
gradient iontové síly – lineární x skokový
Vliv strmosti gradientu
Vliv elučního objemu
Koncentrační efekt
Alfa-amylasová aktivita byla měřena s využitím rozpustného škrobu jako substrátu a produkty reakce byly detekovány reakcí s dinitrosalicylovou kyselinou. Reakční směs obsahovala 0,2 ml enzymu, 0,3 ml 1% škrobu a 0,5 ml 50 mM Tris pufru pH 8,2. Reakce probíhala 1 minutu při 37 °C a byla ukon čena přídavkem 4ml dinitrosalicylové kyseliny. Směs byla povařena 5 minut. Absorbance výsledných produktů při 530 nm byla 1,235 v 1cm kyvetě. Vypočítejte aktivitu amylasy.
1,4
Kalibrace
postup:
Byla připravena koncentrační řada glukosy (2, 4, 6, 8, 10mM glukosa) a 1 ml byl smíchán se 4 ml dinitrosalicylové kyseliny. Směs byla povařena 5 minut. Absorbance výsledných produktů byla měřena při 530 nm.
1,2
A 530nm
1 0,8
y = 0,1107x R² = 0,9672
0,6 0,4 0,2 0 0
2
4 6 8 koncentrace glukosy / mmol/l
10
12
Vypočítejte aktivitu malátdehydrogenasy. Reakční směs obsahovala 0,5 ml NAD+ (100mM), 0,5 ml malátu (200 mM), 1 ml enzymového preparátu (konc. bílkovin 1,5 mg/ml) a 2 ml pufru (100 mM Tris, pH 7,5). Reakce probíhala při teplotě 37 °C a byl sledován přírůstek absorbance při 340 nm. Po 5 minutách vzrostla absorbance z 0,2 na 1,45. Vypočítejte celkovou a specifickou aktivitu malátdehydrogenasy v enzymovém preparátu. (ε=6220 l/mol/ cm). Měření absorbance probíhalo v jednocentimetrové kyvetě a všechny substráty byly v reakční směsi v nadbytku.
Chromatofokusace • separace proteinů na základě jejich pI • vysoké rozlišení • není potřeba připravovat pH gradient • zaostřovací efekt • jednoduchost
Polypufry - amfolyty Polybuffer 96 Polybuffer 74
-
pH 9-6 pH 7-4
Pharmalyte
-
pH 8-10,5
Stacionární fáze PBE94
PBE118
Princip fokusace
MonoP Beads – směs kvartérních a terciálních aminů
Dvoudimensionální chromatografie Beckman Coulter – PF 2D
Dvoudimensionální chromatografie
hydrofobicita
pH
frakce
