Vysokoúčinná kapalinová chromatografie

MC230P14 Vysokoúčinná kapalinová chromatografie, 2010/2011

Vysokoúčinná y kapalinová p chromatografie J Josef f Cvačka, C čk 3.11.2011 3 11 2011

1


Základy chromatografického procesu

K dělení dochází v separační koloně, která obsahuje stacionární fázi ( b t) a mobilní (sorbent) bil í fázi fá i (eluent). ( l t) Rozdílné analyty (dělené látky) mají rozdílnou afinitu ke stacionární fázi. fázi Různé analyty podléhají různé distribuci (rozdělování) mezi mobilní a stacionární fází. Rozdílné analyty jsou rozdílně zadržovány a rozdílně zpožďovány (retardovány). (retardovány) 2


Retenční veličiny

t R ,i = t M + t ' R ,i

Retenční čas tR je celkový čas od nástřiku vzorku do zaznamenání píku detektorem detektorem. Mrtvý čas tM je retenční čas analytu, který není v koloně zadržován, tj. analytu, který se pohybuje kolonou stejnou rychlostí jako mobilní fáze fáze. Všechny analyty stráví v mobilní fázi stejný čas - mrtvý čas kolony. Redukovaný ý retenční č í čas č t’R je čas, který příslušný analyt stráví ve stacionární fázi. f 3


Retenční veličiny

VR ,i = VM + V 'R ,i

Retenční objem VR je celkový objem mobilní fáze fáze, která proteče systémem od nástřiku vzorku do zaznamenání píku detektorem. Mrtvý objem VM je retenční objem analytu analytu, který není v koloně zadržován, zadržován tjtj. analytu, který se pohybuje kolonou stejnou rychlostí jako mobilní fáze. Je to objem kolonové trubice mínus objem náplně. 4 Redukovaný retenční objem V’R je dán rozdílem retenčního a mrtvého objemu.


Průtok mobilní fáze

Lineární rychlost y mobilní fáze u [[cm/min]]

u=

L tM

L – délka kolony

Objemová průtoková rychlost mobilní fáze Fm [ml/min]

VM = Fm ⋅ t M = Vm Vm – objem mobilní fá v koloně fáze k l ě

VR ,i = Fm ⋅ t R ,i

V 'R ,i = Fm ⋅ t 'R ,i 5


Distribuční konstanta Distribuční konstanta KD jje p poměr rovnovážné koncentrace analytu y ve stacionární a mobilní fázi

KD =

(ci ) s (ni ) s ⋅Vm = (ci ) m (ni ) m ⋅ Vs

(ci)s – koncentrace analytu ve stacionární fázi (ci)m – koncentrace analytu v mobilní fázi Vm – objem mobilní fáze Vs – objem stacionární fáze 6


Retenční poměr

t R ,i − t M

k=

t ' R ,i

k=

(ni ) s V = K D ,i ⋅ s (ni ) m Vm

tM

=

tM

VR ,i = VM + K D ,i ⋅ Vs

Retenční poměr k – jedna z nejužívanějších retenčních veličin. Udává kolikrát více času stráví analyt ve stacionární fázi než ve fázi mobilní, tj. v kolikanásobku mrtvého času (objemu) analyt eluuje eluuje. Je to i poměr látkových množství analytu ve stacionární a mobilní fázi za rovnovážných podmínek. 7 MC230P14 Vysokoúčinná kapalinová chromatografie, 2010/2011

Separační faktor

α=

k2 K D,2 = k1 K D ,1

Separační faktor (selektivita) α – parametr charakterizující vzájemnou retenci dvou analytů.

8


Teorie chromatografického patra Kolonu lze hypoteticky yp y rozdělit na množství tzv. pater, p na kterém dochází k okamžitému ustavení rovnováhy. Tvar eluční křivky – z teorie chromatografického patra vyplývá, že eluční křivka má tvar Poissonova rozdělení, které lze pro vysoký počet pater lze nahradit Gaussovou křivkou.

c = cmax ⋅ exp

− (t − t R ,i ) 2 2σ t2

wb – šířka píku při základně w0,5 píku v p polovině výšky ý y 0 5 – šířka p 9


Teorie chromatografického patra Počet teoretických pater n – bezrozměrná veličina pro vyjádření účinnosti chromatografické kolony. Vypočítá se z šířky píku v chromatogramu

⎛ t R ,i ⎞ ⎛ t R ,i ⎞ ⎟ ⎟⎟ = 5,54 ⋅ ⎜ n = 16 ⋅ ⎜⎜ ⎜ ⎟ ⎝ wb ⎠ ⎝ w0,5 ⎠ 2

2

Výškový ekvivalent teoretického patra H – délka kolony připadající na jedno teoretické patro

H=

L n 10


Van Deemterova rovnice

H = HF + HL + HM + HS K celkovému výškovému ekvivalentu teoretického patra přispívá: – výřivá (turbulntní) difúze v mobilní fázi HF – axiální difúze v mobilní fázi HL – odpor proti převodu hmoty v mobilní fázi HM – odpor protí převodu hmoty ve stacionární fázi HS Vířivá difúze – nepravidelnosti ve stacionární fázi způsobují, že některými kanálky proudí mobilní fáze s analytem rychleji než jinými

H F = 2λd p λ – geometrický faktor dp – velikost částic

11


Van Deemterova rovnice Axiální difúze – koncentrační g gradienty yp po stranách zóny y způsobují p j p pohyb y analytu y do oblasti s nižší koncentrací

HL =

2 Dm u

Dm – difúzní koeficient analytu v mobilní fázi u – lineární rychlost mobilní fáze

Odpor proti přenosu hmoty ve stacionární fázi – některé molekuly analytu proniknou hlouběji do stacionární fáze než jiné

HS =

d p2 ⋅ u 30 Dm

⋅

k (k + 1)2 12


Van Deemterova rovnice Odpor p proti p přenosu p hmoty y v mobilní fázi – p při průchodu p mobilní fáze kanálkem mají částice uprostřed mnohem větší rychlost než u stěny

HM =

ω ⋅ d p2 ⋅ u Dm

ω – faktor závislý na typu náplně

H = HF + HL + HM + HS V praxi se používá zkrácený zápis Van Deemterovy rovnice – závislost výškového ekvivalentu teoretického patra na lineární rychlosti mobilní fáze

H = A+

B + C ⋅u u

A,B,C , , – konstanty yp pro daný ý chromatografický systém

13


Van Deemterova rovnice

Účinnost separace roste se snižující se velkostí částic náplně (H~2,5dp). Minimum křivky udává průtokové rychlosti, při které kolona vykazuje největší účinnost. Minimum je pro malé částice ploché, tj. je možno pracovat v širším rozsahu h průtoků ůt ků bez b ztráty t át účinnosti. úči ti 14


HPLC a UHPLC (UPLC)

UHPLC = Ultra High Performance Li id Chromatography Liquid Ch t h Vysokoúčinná kapalinová chromatografie s částicemi menšími než 2 μm a velmi vysokým provozním tlakem ((do ~ 1000 bar). p ) Dosahuje se vyšších účinností separace a velmi krátkých retenčních časů.

15


Velikost částic a tlak v systému Tlak v HPLC systému je přímo úměrný průtoku, viskozitě mobilní fáze a délce kolony a nepřímo úměrný druhé mocnině velikosti částic a průměru kolony. kolony

ΔP ~

Fm ⋅η ⋅ L d p2 ⋅ d c2

16


Teplota a její vliv na účinnost Temperature gradients have negative impact on the column efficiency due to heterogeneous distribution of the mobile phase linear velocity, viscosity and density throughout the column, which affect the equilibrium constant of a compound distribution between mobile and stationary phases (decreases with increasing temperature), and retention factors of the analytes. The difference between the temperatures at the inlet and the outlet of the column can be as much as 20K 20K, and the difference between the temperatures of the center and the column wall can reach up to t 6K, 6K if th the column l iis operated t d under d regular convection conditions. The radial temperature gradient increases slowly along the column [17]. 17


Mimokolonové příspěvky k rozšiřování zón K celkové šířce píku přispívá nejen kolona, ale i ostatní části HPLC systému: 2 2 2 2 2 σ celkový = σ inj + σ kolona + σ spoj + σ det + σ el2

σ2inj – příspěvek injektoru. Objem vzorku by měl být co nejmenší ((< 1 teor. patro), nastříknutá zóna by měla být pravoúhlá.

σ

2 injj

=

Vinj2 K2

K – faktor závislý na konstrukci injektoru

σ2spoj – příspěvek spojovacích trubic. Spojovací trubice musí mít malý vnitřní průměr a musí být co nejkratší

σ

2 spoj

=

π ⋅ R 4 ⋅ l ⋅ Fm 24 Dm

R,l – vnitřní poloměr a délka trubice 18


Mimokolonové příspěvky k rozšiřování zón Profily rychlostí v trubici:

Laminární p proudění – vzniká p při běžných ý rychlostech mobilní fáze v HPLC. Kapalinu lze považovat za soubor vrstev, mezi nimiž působí viskózní síly síly. Turbulentní proudění – vzniká při velmi vysokých rychlostech (~100ml/min.), uspořádaná distribuce rychlostí je narušena, pohyb mobilní fáze je chaotický, dochází k intenzivnímu promíchávání.

σ2det – příspěvek detektoru. Závisí na objemu a geometrii detekční cely

σ2el – příspěvek příspě ek elektronik elektroniky. Závisí Zá isí na časových časo ých konstantách elektronických obvodů (zesilovačů).

σ

2 det

Vdet2 ≈ 2 K

σ el2 = konst ⋅ Fm2 19


Symetrie píku

AS =

Tf =

B A

w0, 05 2f

Faktor asymetrie as metrie As – míra souměrnosti so měrnosti chromatografického píku, pík určuje rč je se v 10% výšky. Tailing faktor Tf – obdobná veličina jako faktor asymetrie používaná ve farmaceutické analýze. Určuje se v 5% výšky píku. Tf>1 pro píky asymetrické v sestupné části (“tailing” píky) Tf<1 pro píky asymetrické ve vzestupné části (“fronting” píky)

20


Rozlišení

Rozlišení – veličina kvantifikující schopnost chromatografického systému vzájemně oddělit dva analyty.

R1, 2 =

t R , 2 − t R ,1 0,5 ⋅ ( wb , 2 + wb ,1 ) 21


Rozlišení

Dva píky jsou rozděleny “na základní linii” pokud je R>1.5

22


Rozlišení PŮVODNÍ

⎛ k1 ⎞ n ⎟⎟ R1, 2 = ⋅ (α 2,1 − 1) ⋅ ⎜⎜ 4 ⎝ 1 + k1 ⎠ ZMĚNA k

účinnost

selektivita

retence ZVÝŠENÍ

Ovlivnění selektivity a retence

α

Volba V lb mobilní bil í fá fáze, volba lb stacionární t i á í fáze, teplota. ZVÝŠENÍ

Ovlivnění účinnosti

n

Délka él a kolony, olo y, vel velikost ost část částic, c, p průtok. ůto . 23


Rozlišení R1, 2 =

⎛ k ⎞ n ⋅ (α 2,1 − 1) ⋅ ⎜⎜ 1 ⎟⎟ 4 ⎝ 1 + k1 ⎠

α Největší vliv na rozlišení – zvýšení lze dosáhnout optimalizací stacionární i mobilní fáze. n Má význam, ale rozlišení roste “ ” s druhou odmocninou n. “jen” k Pro vyšší retenční časy se poslední člen blíží k 1 a nemá tedy smysl dále retenci zvyšovat.

24


Isokratická a gradientová eluce Izokratická eluce: Složení mobilní fáze (její eluční síla) se během analýzy nemění. nemění Gradientová eluce: Eluční síla mobilní fáze vzrůstá během analýzy.

Výhody gradientové eluce: Vhodnější pro komplexní vzorky s velkým počtem analytů Lepší rozlišení pro píky na začátku a konci chromatogramu Vyšší citivost pro píky na konci chromatogramu Větší kapacita píků (víc se jich vejde do chromatogramu)

Nevýhody ý yg gradientové eluce: Náročnější instrumentace (čerpadla) Náročnější vývoj metody Delší doby analýzy vyplývající z nutnosti ekvilibrace kolon

25


Účinnost v gradientové eluci – kapacita píku Při gradientové eluci se ( é ěř) nemění (téměř) ě í šířka šířk píku ík s časem a nelze tedy pro hodnocení účinnosti 2 použít rovnici: ⎛t ⎞ n = 16 ⋅ ⎜⎜ R ,i ⎟⎟ ⎝ wb ⎠

Kapacita píku P: Veličina pro srovnávání účinnosti různých gradientů di tů – podíl díl celkové lk é d doby b gradientu a průměrné šířky píku v chromatogramu

P = 1+

tg n

(1 / n)∑ wb 1

P: 100-200 (gradient) tg – doba trvání gradientu

26


Ovlivnění separačního procesu v HPLC Separaci p lze ovlivnit: - změnou velikosti interakce mezi analytem, stacionární a mobilní fází – termodynamický aspekt ovlivněním šířky zón eluujících složek – kinetický -ovlivněním aspekt Termodynamický aspekt:

VR ,i = VM + K D ,i ⋅ Vs Ovlivňujeme distribuční konstanty analytů změnami mobilní nebo stacionární fáze. KD je závislá na teplotě, teplota ovlivňuje separaci. Kinetický aspekt: píků lze ovlivnit všemi parametry p y vyskytující y y j se Šířku p v plné verzi Van Deemterovy rovnice, tj. lineární rychlostí mobilní fáze, velikostí částic sorbentu, difůzními koeficienty (lze ovlivnit teplotou!) teplotou!), délkou kolony. 27

Vysokoúčinná kapalinová chromatografie

Recommend Documents