3. Měření a optimalizace analytické metody... 4

1.

Úvod ................................................................................................................................... 2

2.

Charakteristika analytického systému ........................................................................... 2

3. Měření a optimalizace analytické metody .......................................................... 4 2.1. Atomová absorpční spektrometrie ................................................................................... 6 2.1.1. Zdroj primárního záření ........................................................................................... 8 2.1.2. Atomizátor ................................................................................................................ 8 2.1.3. Generování těkavých hydridů .................................................................................. 9 2.1.4. Monochromátor a detektor ..................................................................................... 12 2.2. Optická emisní spektrometrie ........................................................................................ 13 4.

Odběr, skladování a příprava vzorku k analýze ......................................................... 16 4.1. Metody rozkladu vzorku pro stanovení celkových obsahů prvků v půdách a v rostlinách .............................................................................................................................................. 17 4.1.1. Suchý rozklad ......................................................................................................... 17 4.1.1.1. Klasický suchý rozklad ................................................................................... 17 4.1.1.2 Příklad aplikace klasického suchého rozkladu pro rozklad biologického materiálu ....................................................................................................................... 20 4.1.1.4. Příklad aplikace mineralizátoru APION pro rozklad rostlinného materiálu ... 23 4.1.1.5. Jednoúčelový analyzátor stopových mnoţství rtuti AMA-254 ....................... 24 4.1.2. Mokrý rozklad ........................................................................................................ 26 4.1.2.1. Mokrý rozklad za atmosférického tlaku .......................................................... 26 4.1.2.2. Mokrý rozklad za zvýšeného tlaku.................................................................. 27 4.1.2.3. Příklad vlivu nedokonalého rozkladu vzorku na správnost stanovení arsenu . 29 4.2. Metody extrakce a frakcionace chemických prvků v půdě ............................................ 33 4.2.1. Metody jednoduché extrakce půdy ........................................................................ 34 4.2.2. Příklady a porovnání extrakčních metod pro stanovení podílů As, Cd, Cu, Pb a Zn v půdách ........................................................................................................................... 35 4.2.2.1. Kyseliny a cheláty ........................................................................................... 35 4.2.2.2. Roztoky solí a voda ......................................................................................... 36 4.2.2. Metody postupné extrakce půdy ............................................................................ 39 4.2.2.1. Vývoj metod postupné extrakce ...................................................................... 40 4.2.2.2. Příklady praktického vyuţití metod postupné extrakce .................................. 41 4.2.2.3. Vzájemný vztah mezi jednoduchou a postupnou extrakcí půdy ..................... 42

5. Vyhodnocení a interpretace výsledků .............................................................................. 45

1. Úvod Diskutujeme-li problematiku kontaminace jednotlivých sloţek ţivotního prostředí rizikovými prvky, musíme vycházet z přesných a správných analytických výsledků stanovení těchto prvků v konkrétních materiálech. V agrochemickém výzkumu, kde se zajímáme o chování chemických prvků v půdě, jejich přestup do rostlin a jejich následnou kumulaci v těchto rostlinách, je zájmovým materiálem zejména půda. Škála instrumentálních analytických technik, které jsou pro tento účel k dispozici, je velmi široká. Tato skripta nedávají vyčerpávající přehled dostupných analytických technik, ale upozorňují na ty metody, které jsou v oblasti stanovení rizikových prvků nejpouţívanější a v analytické praxi nejrozšířenější. Kromě takzvaných rizikových prvků (jejich vymezení bude uvedeno v další kapitole) jsou zde zmíněny i některé další prvky, pro jejichţ stanovení jsou popisované metody vhodné. Skripta jsou doporučena pro studenty předmětů „Agronomické vyuţití odpadů, Speciální metody analytické, Ekotoxikologie a Kontaminace prostředí a remediace“. Kromě uvedených předmětů lze tato skripta doporučit pro cvičení zaměřená na speciální analytické metody a to pro studenty bakalářského, magisterského i doktorského studia. Skripta mohou být uţitečným vodítkem při vypracování metodických částí bakalářských a diplomových prací studujících různá hlediska chování rizikových prvků v půdě a rostlinách.

2. Charakteristika analytického systému V biologických, chemických, agrochemických, pedologických a dalších vědách, které se zabývají studiem ţivotního prostředí a jeho jednotlivých sloţek, mají nezastupitelný význam chemické prvky a jejich sloučeniny. Hodnotíme-li však jednotlivé prvky z hlediska jejich esenciality pro vybrané sloţky biosféry nebo z hlediska jejich potenciální toxicity pro organismy, v tomto případě zejména v souvislosti s kontaminací ţivotního prostředí a moţným vstupem těchto prvků do potravního řetězce, pak musíme zajistit jejich analyticky přesné a správné stanovení v konkrétních materiálech. Příklady obsahů jednotlivých prvků v rostlinných tkáních uvádí tabulka 1. Všechny tyto prvky označujeme jako esenciální pro jejich nezastupitelný podíl na procesech přeměny látkové. Analýza rostlinných tkání na obsah uvedených prvků pak můţe slouţit pro zhodnocení naměřených hladin z hlediska fyziologické potřeby rostlin, pro odvození optimální potřeby daných prvků pro dosaţení maximální úrody zemědělsky vyuţívaných rostlin a pro stanovení nutriční hodnoty potravin rostlinného původu. Výsledky analýz je moţno rovněţ pouţít pro testování schopnosti půdy zásobovat rostliny těmito prvky a sledování pohybu, transformace a vzájemných vztahů prvků v systému půda-rostlina. Podle vlivu na organismus člověka pak rozdělujeme chemické prvky na jasně esenciální (Fe, I, Cu, Zn, Mn, Co, Mo, Se, Cr, F, B, Si, Mg, Ca), na prvky jejichţ esencialita nebyla ještě plně potvrzena ale je pravděpodobná (Bi, Ni, Sn, V, Br, Li, Sr, Rb, Zr), dále na prvky, které se sice vyskytují v různých koncentracích v biologických materiálech včetně tělesných tkání člověka, ovšem současné znalosti nám nedovolují posoudit jejich zařazení (Al, Sb, Au, W, Ag, Ba, Cs, Sc), a nakonec prvky vyloženě toxické. Tyto prvky jsou charakterizovány tím, ţe jejich biologický význam je omezen pouze jejich toxickými vlastnostmi pro organismus a to jiţ při relativně velmi nízkých koncentracích. Do této skupiny patří hlavně As, Cd, Pb, Hg.

2

Tabulka 1. Příklady obsahů esenciálních prvků v rostlinných tkáních Prvek oves ve stadiu zrno ovsa sláma ovsa odnoţování g.kg-1 sušiny N 39 17 4,5 P 4,4 4,3 1,2 S 3,2 2,8 3,3 Cl 15 2,7 14 K 43 6,4 14 Na 5,3 0,2 3 Ca 9,4 2,2 9,0 Mg 2,1 1,2 1,0 Si 3,5 1,8 3,3 -1 mg.kg sušiny Fe 74 53 85 Mn 130 80 50 Cu 7 3 2,3 B 6 1,1 7 Mo 2 1,6 1,0

zelená biomasa řepky 56 4,9 9,3 12 46 1,3 29 2,0 3,4 550 250 7 35 nestanoveno

Půda představuje velmi sloţitý komplex organických a anorganických sloučenin tvořících jedinečný vzájemně provázaný celek, který je významnou a nenahraditelnou součástí biosféry a stanovení chemických prvků v půdě je důleţitým krokem k poznání jednotlivých součástí tohoto celku. Dynamika prvků a jejich distribuce v půdách je ovlivňována celou řadou faktorů, které mají dopad na obsahy, rozpustnost a přístupnost prvků. Hlavními faktory v této souvislosti jsou mateční hornina, klimatické podmínky, roční období, geomorfologie terénu a nadmořská výška, dále obsah humusu, půdní reakce, zrnitost, vlhkost, teplota, propustnost, sorpční kapacita, mikrobiální aktivita, redoxpotenciál a agrotechnika. Pro určení mobility a pro odhad příjmu daného prvku rostlinami pak je třeba znát nejen celkové obsahy prvků v půdě, ale i jejich zastoupení v jednotlivých sloţkách půdy. Pro stanovení obsahu prvků a jejich sloučenin v biologických materiálech a dalších materiálech ţivotního prostředí jsou dnes pouţívány moderní instrumentální analytické metody, jako je atomová spektrometrie ve všech známých modifikacích, metody molekulové spektrofotometrie, elektrochemické metody, hmotnostní spektrometrie, nukleární analytické metody a mnoho dalších. Pro stanovení jednotlivých sloučenin či typů vazeb analyzovaných prvků pak vystupují do popředí metody plynové či kapalinové chromatografie často v kombinaci s některou z výše uvedených metod. Měřící přístroje, které jsou pro tyto analýzy k dispozici, jsou schopny stanovovat obsahy prvků v širokém rozmezí, na velmi nízkých koncentračních hladinách, s vysokou přesností a na vysokém stupni automatizace. Vlastní měření obsahu prvků je však jen součástí analytického systému, který zahrnuje: 1) odběr a skladování vzorku, 2) přípravu vzorku k analýze, 3) vlastní měření a konečně 4) vyhodnocení a interpretaci naměřených dat. Kaţdá z výše uvedených sloţek analytického systému můţe do tohoto systému vnášet řadu problémů, které jsou zdrojem chyb významně ovlivňujících konečný výsledek. Důsledkem

3

chybou zatíţené analýzy pak mohou být zkreslená rozhodnutí na základě nesprávného výsledku. V dalších kapitolách budou zmíněny základní charakteristiky jednotlivých částí analytického systému, přičemţ jako první budou zmíněny vybrané měřící techniky, protoţe příprava vzorku k analýze je do značné míry závislá na instrumentaci, kterou máme k dispozici. Literatura: Beneš S.: Obsahy a bilance prvků ve sférách ţivotního prostředí. I. část., MZe ČR, Praha 1993. Beneš S.: Obsahy a bilance prvků ve sférách ţivotního prostředí. II. část., MZe ČR, Praha 1994. Mengel K., Kirkby E. A.: Principles of Plant Nutrition, 4th edition. International Potash Institute, Worblaufen – Bern, 1987. Vaněk V., Balík J., Pavlíková D., Tlustoš P.: Výţiva a hnojení polních a zahradních plodin. ČZU Praha, 2002. Welz B., Sperling M.: Atomic Absorption Spectrometry. Wiley-VCH Verlag GmbH, Weinheim, 1999

3. Měření a optimalizace analytické metody Jak jiţ bylo řečeno, v analytické praxi můţeme pro stanovení obsahů chemických prvků vyuţít širokou škálu instrumentálních analytických metod, z nichţ jsou v analytické praxi nejběţnější metody spektrální, které budeme v této kapitole ve stručnosti charakterizovat. Jedná se o metody vyuţívající jako analytický signál vhodně zvolené vlastnosti elektromagnetického záření. Elektromagnetické záření lze mimo jiné popsat jako proud částic nazývaných fotony. Kvantová teorie definuje model atomu s jednotlivými energetickými hladinami elektronů, jak naznačuje obrázek 1. Interakce volných atomů prvků s fotony elektromagnetického záření jsou pak základem měření optických veličin v rámci metod atomové spektrometrie. Nejpouţívanějšími technikami jsou atomová absorpční spektrometrie a optická emisní spektrometrie, vyuţívající změny energie valenčních, tzv. optických elektronů. Vzájemné působení volných atomů a fotonů znázorňuje schematicky obrázek 2. Kvantitativní hodnocení spontánní emise a vynucené absorpce záření lze pak popsat takto: v objemové jednotce je Nn atomů ve stavu n, za jednotku času jich část Pnm přejde do m: Pnm = Anm.Nn, kde

Anm = Einsteinův koeficient spontánní emise;

opačný přechod závisí na počtu přítomných fotonů o frekvenci υnm v objemové jednotce, tj. na hustotě záření u: Pmn = Bmn.Nm.u, kde Bmn = Einsteinův koeficient absorpčního procesu. Koeficienty Anm a Bmn vyjadřují pravděpodobnost přechodu.

4

Obrázek 1. Absorpce energie atomem

E

E

E

n

n

n

m

m

m

0

0

0

a) spontánní emise Ef = ΔEnm = h.υnm Ef = energie fotonu

b) absorpce proces vynucený přítomností záření o vyhovující frekvenci υnm

c) stimulovaná emise vyzáření dalšího fotonu o téţe υ, stejného směru a stejné fáze kmitu

Obrázek 2. Vzájemné působení volných atomů a fotonů

5

2.1. Atomová absorpční spektrometrie Atomová absorpční spektrometrie (AAS) vyuţívá jako analytickou vlastnost sledovaných elementů absorpci záření jejich volnými atomy v základním stavu. Úbytek tohoto tzv. primárního záření je mírou koncentrace volných atomů prvku, který záření absorboval. Rozdíly energií mezi jednotlivými elektronovými stavy atomu jsou pro kaţdý prvek zcela specifické, neboť jsou funkcí vzájemného působení elektricky kladně nabitého jádra a pro daný prvek charakteristické konfigurace elektronového obalu. Zdrojem primárního záření je výbojka, v jejíţ katodě, musí být vţdy obsaţen ten prvek, který stanovujeme. (Kaţdý prvek má svou výbojku.) Přechod atomu z niţší energetické hladiny m na vyšší hladinu n není spontánní, ale je vynucen přítomností záření o vhodném kmitočtu nm [s-1] a energii fotonu h nm. Absorpcí fotonu vzniká excitovaný atom. Excitovaný atom můţe samovolně (spontánně) přejít na niţší energetický stav, přičemţ se rozdíl energií Enm můţe vyzářit v podobě fotonu o stejném kmitočtu nm a energii h nm : hc Enm = h

nm

=

,

(1)

kde energie E je uváděna obvykle v elektronvoltech [eV] a vlnová délka v nanometrech [nm], h je Planckova konstanta ( 6,626.10-34Js ) a c je rychlost světla ve vakuu ( 2,9979.108 m s-1 ). Rozdíl energií, odpovídající přechodu mezi energetickými stavy m a n při pohlcení nebo vyzáření fotonu, je co do absolutní hodnoty stejný a liší se jen znaménkem. Tuto vlastnost hmoty emitovat a absorbovat elektromagnetické záření téţe vlnové délky vyjadřuje Kirchhoffův zákon, který je téţ základem pro analytické vyuţití atomové absorpce. Při teplotách vhodných pro měření atomové absorpce (2000 - 3000 K) se převáţná část volných atomů většiny prvků nachází v základním energetickém stavu Eo a pohlcením fotonu se dostává na některou z vyšších energetických hladin (viz obrázek 3, přechody a, b). Elektronové přechody ze základního stavu, stejně jako emisní procesy na tomto energetickém stavu končící, se nazývají rezonanční. V AAS mají největší pravděpodobnost přechody mezi základním a nejbliţším excitovaným stavem o energii E1 . Těmto přechodům odpovídají tzv. základní rezonanční čáry, které jsou pro atomy jednotlivých prvků nejcitlivější. Obecný dvouhladinový systém n-m lze potom nahradit systémem 1-0, ve kterém pro poměrné zastoupení počtu atomů ve vyšším a niţším energetickém stavu podle Boltzmannova rozdělovacího zákona platí N1 = No

g1 E1 - Eo exp - ( ). go kT

(2)

Zde No resp. N1 je koncentrace atomů [m-3] v základním resp. excitovaném stavu, vyjádřená jejich počtem v objemové jednotce, go a g1 jsou statistické váhy těchto stavů, k je Boltzmannova konstanta [J K-1 ] a T je absolutní teplota [K]. K přeměně stanovovaného prvku na volné atomy slouţí atomizátor, který je v AAS nejen generátorem, ale i rezervoárem volných atomů. Pro atomizaci se nejčastěji vyuţívá tepelná a chemická energie plamenů, případně odporově vyhřívané, tzv. elektrotermické atomizátory (ETA). Hlavním poţadavkem je získání co nejvyšší koncentrace volných atomů sledovaného prvku - analytu- a dosaţení definované závislosti mezi koncentrací analytu ve vzorku a v plynné fázi, ve které probíhá měření.

6

Excitace

Emise Ion v excit. stavu

e Ion v zákl. stavu

Energie

}

Excit. stavy

h

{ f

a

b

c

g

d Základní stav

Obrázek 3. Znázornění energetických hladin atomů

Atomová absorpční spektra vyuţíváme v rozpětí vlnových délek 190-900 nm. Prochází-li monochromatické záření vhodným absorpčním prostředím o tloušťce b a počtu volných atomů v základním stavu No , dochází k zeslabení toku záření z původní hodnoty o na hodnotu [J s-1]. Za konstantní teploty a počtu elektronů je počet atomů na základní energetické hladině úměrný koncentraci ca analytu v roztoku, který do plamene zmlţujeme. Matematickým vyjádřením uvedených skutečností je spojený zákon Bouguerův-Lambertův a Beerův ve tvaru: o

A = log

=

b ca ,

(3)

kde absorbance A, definovaná jako logaritmus poměru původního a prošlého zářivého toku, je úměrná tloušťce absorbující vrstvy b [cm] a koncentraci analytu ca . Konstanta úměrnosti je při dané vlnové délce charakteristická pro absorbující prvek a nazývá se absorpční koeficient. Kromě absorbance je důleţitou veličinou propustnost (transmitance) , která je definovaná jako poměr toku záření prošlého absorpčním prostředím ku zářivému toku do prostředí vstupujícího =

. o

Transmitanci vyuţíváme při nastavení maxima vlnové délky rezonanční čáry ve spektrálním intervalu vymezeném monochromátorem. Mezi absorbancí a transmitancí platí jednoduchý převodní vztah A = - log . (4) 7

Základní konstrukční prvky kaţdého AA-spektrometru tak, jak jsou za sebou zařazeny v optické ose, jsou: zdroj monochromatického záření sledovaného prvku - absorpční prostředí s volnými atomy (atomizátor) - monochromátor k izolaci rezonanční čáry primárního záření detektor tohoto záření, kterým se mění proud fotonů (zářivý tok) na proud elektronů (elektrický proud) a konečné počítačové zpracování signálu (Obrázek 4). 2.1.1. Zdroj primárního záření Zdrojem primárního záření je nízkotlaká, neonem plněná výbojka s dutou katodou. Emituje čarové spektrum prvku, z něhoţ je zhotovena dutá katoda, nebo který je v materiálu duté katody obsaţen. Kaţdý prvek má obvykle svou výbojku nebo můţe být výbojka konstruována pro několik prvků s velmi podobnými fyzikálními vlastnostmi. Tím je dána vysoká selektivita této metody, kterou je moţné stanovit koncentrace jednotlivých prvků ve vzorku obvykle bez nutnosti dělení. Výbojka pracuje v doutnavém reţimu při minimálním proudu několika miliampér a tlaku řádově 10-1 kPa. K napájení výbojky slouţí stabilizovaný proudový zdroj o napětí asi 400V. 2.1.2. Atomizátor Nejjednodušeji realizovatelným prostředím k atomizaci je laminární předmíchaný plamen, který se získává laminárním hořením předmíchané směsi acetylénu se vzduchem popř. oxidem dusným ve speciálním hořáku. Jeho ústí má tvar úzké štěrbiny, pro plamen acetylén-vzduch dlouhé 10 cm a pro plamen acetylén-oxid dusný s vyšší rychlostí hoření pouze 5 cm. Délkou štěrbiny je dána i maximálně dosaţitelná tloušťka vrstvy absorpčního prostředí, kterým prochází záření z výbojky. Plamen acetylén-vzduch s teplotou hoření ca 2300 C se uţívá pro snadno atomizovatelné prvky, plamen acetylén-oxid dusný s teplotou hoření ca 3100 C pro prvky obtíţně atomizovatelné.

8

Obrázek 4. Funkční schema atomového absorpčního spektrometru Analyzovaný vzorek s určovaným prvkem se přivádí do plamene ve formě aerosolu, tj. nepatrných kapiček analyzovaného roztoku. Zmlţování roztoku se provádí pneumatickým zmlţovačem pomocí tlaku oxidujícího plynu, kterým je vzduch, popř. oxid dusný. Do zmlţovače se můţe vzorek zavádět pomocí peristaltické pumpy (na obrázku 4 označena jako SIPS Sample Introduction Pump System). Potřebné plyny se odebírají z tlakových lahví, vzduch většinou z kompresoru. Kaţdý AA-spektrometr musí být vybaven regulací a měřením průtoku paliva i oxidovadla. Poměrem obou plynů ve směsi se získává buď oxidační nebo redukční typ plamene. Redukční plamen je vhodný k atomizaci prvků, které tvoří termostabilní oxidy (např. Cr, Al). Sloţení a teplota plamene se mění s jeho výškou. Pro kaţdý prvek existuje proto optimální zóna v plameni daná výškou nad ústím hořáku, kde koncentrace volných atomů je největší. Tuto výšku je třeba zjistit pokusně. Poloha hořáku musí být proto nastavitelná, a to jak ve vertikálním, tak i horizontálním směru. Elektrotermický atomizátor se pouţívá pro měření velmi nízkých koncentrací analytu, které jiţ nelze měřit v plameni, neboť tam dochází ke značnému zředění zmlţovaného vzorku spalnými plyny. Tvoří jej kyveta, tj.malá trubička nejčastěji z grafitu, někdy téţ z kovu s vysokým bodem tání (W, Ta, Mo), odporově vyhřívaná a umístěná v inertní atmosféře (Ar, Ar+H2 aj.), do které se dávkuje 1 - 70 l roztoku vzorku. Počítačem řízený časový a teplotní program umoţňuje jeho vysušení, pyrolýzu a atomizaci. Pro sníţení rušivých vlivů matrice vzorku se při stanovení snadno atomizovatelných prvků do atomizátoru vkládá další podloţka, tzv. platforma. Kromě toho je téţ moţné moţné pouţít chemické modifikátory matrice. 2.1.3. Generování těkavých hydridů Generování těkavých sloučenin analytů pomocí vhodných chemických reakcí a jejich zavádění do atomizátoru je významnou součástí celé palety analytických technik pouţívaných v AAS. Při atomové absorpční spektrometrii můţe být vzorek do atomizátoru zaváděn nejen v kapalné, ale i v plynné fázi. Převedení analytu chemickou reakcí na těkavou sloučeninu a její separace od matrice vzorku, případně další nakoncentrování, vede k významnému zvýšení citlivosti stanovení a k omezení interferencí. V analytické praxi je nejrozšířenější generování plynných hydridů, které je zaloţeno na redukci analytu na hydrid v kapalné fázi, na jeho převedení do plynné fáze a na následné atomizaci v optické cestě. Základním rysem této techniky je tedy separace analytu od matrice a jeho vyšší koncentrace v absorpčním prostředí ve srovnání s klasickými metodami AAS. To vede ke zvýšení citlivosti a k výraznému omezení interferencí. Pouţívá se ke stanovení všech hydridotvorných prvků: As, Sb, Bi, Ge, Sn, Pb, Se, Te. Bylo popsáno i generování těkavých organických sloučenin olova či niklu, nebo chloridů jako AsCl3. V dalších kapitolách bude tato metoda několikrát zmíněna v souvislosti s některými konkrétními příklady pouţití jednotlivých metod pro stanovení arsenu, proto je zde tato technika popsána podrobněji. Pro generaci hydridů byly navrţeny různé reduktanty, např. směsi HCl, KI, SnCl 2 a granule Zn, nebo kovový Mg, HCl a TiCl3. Od roku 1973 se pouţívá tetrahydridoboritan sodný, NaBH4, který postupně nahradil ostatní redukční činidla. Stabilitu vodných roztoků NaBH4 studoval podrobně Bye (1982). Zjistil, ţe 3 % roztok NaBH4 ve 2 % NaOH je pouţitelný nejméně po dobu tří týdnů a je třeba jen dbát, pokud je roztok uloţen v chladničce, aby byl před pouţitím nejprve vytemperován na teplotu místnosti. Reakci analytu (v kyselém prostředí vzorku) s hydridoboritanem a uvolnění vznikajícího hydridu lze schematicky znázornit takto: H+

9

analyt(l) + BH4- → hydrid(g) Za těchto podmínek se hydridoboritan, který je přidáván v mnohořádovém přebytku, rozkládá za vzniku vodíku: BH4- + 3H2O + H+ → BO3- + 4H2 Optimální podmínky pro uvolnění jednotlivých hydridů a jejich fyzikální a spektroskopické charakteristiky jsou shrnuty v publikaci AAS II – kurz pro pokročilé, proto zde zmíníme jen několik praktických aspektů. Analyt by měl být v roztoku přítomen v optimální valenci, avšak výsledkem tepelného rozkladu vzorku v oxidačním prostředí jsou zpravidla vyšší oxidační stavy prvků. Existují signifikantní rozdíly v účinnosti redukce mezi As(III) a As(V) při koncentraci NaBH4 niţší neţ 1 %. To naznačuje, ţe za těchto podmínek As(III) reaguje rychleji neţ As(V) a je přeměněn na hydrid účinněji neţ As(V). Kompletní přeměny As(III) i As(V) můţe být dosaţeno pouze při koncentraci NaBH 4 1 % a vyšší. Jako optimální kyselost roztoku se uvádí 0,1 – 6 mol.l-1 HCl pro As(III) a 1 – 6 mol.l-1 HCl pro As(V). V praxi se v případě As, ale i Sb, provádí předredukce jodidem draselným, kyselinou askorbovou nebo L-cysteinem. Na rozdíl od As a Sb, selen a telur ve vyšší valenci nelze vůbec redukovat aţ na hydridy a i způsob předredukce je v tomto případě odlišný. Pouţívá se cca 30 min. ohřev roztoku v prostředí 6 mol.l-1 HCl, přičemţ vlastní stanovení analytu následuje bezprostředně po zchladnutí roztoku na laboratorní teplotu. Přítomnost jodidu draselného či kyseliny askorbové je při generování selenovodíku a telurovodíku zcela neţádoucí, protoţe vede k jejich redukci na elementární formy. Proto se doporučuje v laboratořích, které se zabývají stanovením současně jak As tak Se, zdvojení instrumentace pro generování hydridů obou prvků odděleně. Při vlastním generování hydridů lze pouţít instrumentace v dávkovém nebo průtokovém uspořádání. V dávkovém generátoru je omezený objem vzorku redukován najednou, k dávce vzorku v reakční nádobě je přidáno definované mnoţství tetrahydridoboritanu. Pracnost a rychlost analýzy jsou pro rutinní analytickou praxi nezanedbatelné parametry a z tohoto hlediska jsou dávkové generátory hydridů méně výhodné ve srovnání s průtokovými systémy a jsou vhodné spíše pro výzkumné účely nebo pro speciální aplikace. Průtokové generátory hydridů jsou konstrukčně řešeny jako kontinuální, nebo na principu dávkování do proudu. V kontinuálním uspořádání (Obrázek 5) je konstantní tok kyselého vzorku smícháván s konstantním tokem alkalického roztoku tetrahydridoboritanu a pak s proudem nosného plynu (dusíku nebo argonu). Při dávkování do proudu jsou malé objemy vzorku vstřikovány do proudu nosného média, kterým je zpravidla zředěná kyselina, a poté je reakční směs smíchána s konstantním proudem tetrahydridoboritanu sodného. Volba techniky bude tedy mimo jiné záviset na objemu vzorku, který máme k dispozici. Reakční směs je dále vedena do separátoru fází, kde se rozděluje na plynnou fázi (nosný plyn s hydridem), která postupuje dále do atomizátoru, a kapalnou fázi, která jde do odpadu. Průtokové metody generování hydridů jsou snadno automatizovatelné s vysokou rychlostí analýzy (zejména v případě dávkování do proudu) a s dostatečnou citlivostí pro analýzy běţných typů organických i anorganických materiálů. Jsou tedy vhodné zejména pro rutinní aplikace. Správnost stanovení jednotlivých analytů můţe být stejně jako u jiných analytických technik ovlivněna řadou rušivých vlivů, které se u generování hydridů projevují sníţením účinnosti redukční reakce. U biologických materiálů, které je nutno některou z metod rozkladu nejprve převést do roztoku, mohou být významným interferentem organické látky jako důsledek nedostatečného rozkladu. Z toho vyplývá nutnost dokonalé mineralizace biologických materiálů, popřípadě separace analytu od osnovy vzorku. Jako příklad můţeme

10

uvést široké spektrum organometalických sloučenin arsenu, z nichţ jen některé tvoří těkavé hydridy.

Obrázek 5. Blokové schéma kontinuálního generátoru hydridů s přímým přenosem hydridu do atomizátoru Přehled redukčních reakcí některých sloučenin arsenu shrnuje tabulka 2. Zejména v případě dimetylarseničných sloučenin je naprosto nezbytný krok digesce vzorku před vlastním stanovením, zatímco v případě As(III), As(V) a metylarseničných sloučenin je redukce borohydridem při pH <1 v podstatě kompletní a přístrojová odezva odpovídá koncentraci As bez ohledu na jeho formu. Většina způsobů mokrého rozkladu při rozkladu organických sloučenin As selhává a jako vhodný se osvědčil pouze rozklad ve směsi HNO3 + H2SO4 + H2O2. Pro rozklad arsenobetainu, sloučeniny, která představuje dominantní podíl z celkového obsahu arsenu ve tkáních mořských ţivočichů, je nutno pouţít teploty přesahující 300°C. Z anorganických sloučenin pak nejčastěji interferují především ionty přechodových a vzácných kovů. Interference mohou být vyvolány i nevhodnou kombinací reagencií pouţitých pro generování hydridů. Jodid draselný se pouţívá pro předredukci vyšších oxidačních stupňů As a Sb (viz výše). Je-li tato reakce prováděna za přítomnosti HNO3, pak je hlavním interferentem NO2 vznikající reakcí HNO3 s KI (tato reakce byla snadno demonstrována přídavkem roztoku KI do HNO3). Rychlá oxidace jodidu (I-) na jod (I2) se projeví vznikem lesklých tmavých krystalů jodu a vznikem hojného mnoţství červenohnědých dýmů NO2. Interference můţe být odstraněna pouţitím přídavku močoviny před krokem redukce s KI. KI lze v této reakci také nahradit L-cysteinem. V tomto případě je moţno významně sníţit

11

koncentraci HCl ve vzorcích aţ na 0,2 mol.l-1, ale je nutno pouţít zvýšené teploty. Dalším způsobem eliminace tohoto typu interference je generace As(V), které musí předcházet zahřátí vzorku s HNO3 pro převedení veškerého As(III) na As(V). Nevýhodou této metody je však větší výskyt interelementárních interferencí a niţší citlivost stanovení. Přítomnost HClO4 v mineralizátech aţ do koncentrace 15% nemá vliv na stanovení As. Váţné problémy však mohou nastat při přítomnosti HF v mineralizátech. Při koncentraci HF ve vzorku >1 % vzniká ion [AsF5OH], který nereaguje s NaBH4. Tento typ interference můţe být účinně eliminován tvorbou komplexu s kyselinou boritou. Lze konstatovat, ţe eliminace interferencí při generování hydridů vyţaduje individuální přístup vzhledem k stanovovanému analytu, analyzovanému materiálu a pouţité technice generování hydridů. Tabulka 2. Redukční reakce anorganických a organických sloučenin arsenu sloučenina

pH

produkt

bod varu

7

AsH3

-55 °C

4,0 1,5

nereaguje AsH3

-55 °C

metylester k. arseničné (kys. metylarsonová) (CH3AsO(OH)2)

5,0 1,5

slabá reakce CH3AsH2

2 °C

dimetylester k. arseničné (kys. kakodylová) ((CH3)2AsO(OH))

1,5

(CH3)2AsH

36 °C

trimetylester k. arseničné (trimetylarsinoxid) (CH3)3AsO

1,5

(CH3)3As

70 °C

fenylester k. arseničné (kys. benzenarsonová) (C6H5AsO(OH)2)

1,5

C6H5AsH2

148 °C

p-aminofenylester k. arseničné. (kys. arsanilová) p-H2NC6H4AsO(OH)2

1,5

H3+N C6H4 AsH2

-

kys. arsenitá (meta) (HAsO2) kys. arseničná (orto) (H3AsO4)

arsenobetain

nereaguje

2.1.4. Monochromátor a detektor K vedení záření primárního zdroje absorpčním prostředím, k izolaci zvolené analytické linie a k soustředění záření na detektor slouţí optický systém, jehoţ nejdůleţitější částí je mříţkový monochromátor. Natáčením mříţky se nastavuje vlnová délka rezonanční čáry na maximum propustnosti a pomocí vstupní a výstupní štěrbiny se reguluje šířka spektrálního intervalu (od 0,1 nm do 2,0 nm) tak, aby spolu s rezonančním zářením nedopadalo na detektor neabsorbující čili balastní záření čar blízkých vlnových délek. To by způsobilo zakřivení koncentrační závislosti absorbance (neplatnost Bouguerova-Lambertova-Beerova zákona).

12

K detekci toků záření o a (viz rovnici (3)) se zařazuje těsně za výstupní štěrbinu monochromátoru fotonásobič obvykle s oxidickou fotokatodou, jejíţ citlivost je dostačující aţ do vlnové délky 1000 nm. Do ultrafialové oblasti je pouţitelnost násobiče dána materiálem vstupního okénka, které je pro univerzální násobiče křemenné. Získaný fotoproud, nesoucí veškerou analytickou informaci, se zesiluje jednak vkládáním napětí na dynody násobiče elektronů, jednak dalším zesilovačem. V AAS se pouţívají fázově citlivé zesilovače (lock-in) laděné na frekvenci modulačního záření primárního zdroje. Zpracování výstupního signálu je nutné provést bez výrazné deformace a zvýšení šumu. Proto se u moderních přístrojů zařazuje analogově-digitální převodník přímo za synchronní zesilovač a veškeré další operace (logaritmování, přiřazení kalibrační funkce, korekce pozadí, vyhodnocování výsledků, statistika, tisk a j.) se provádějí v digitální formě.

2.2. Optická emisní spektrometrie Při zahřívání přecházejí látky ze skupenství pevného přes kapalné aţ do plynného stavu. Dalším zvyšováním teploty přecházejí sloţitější sloučeniny přes jednodušší aţ na volné atomy. Ty potom dalším zvyšováním teploty přecházejí ze základního stavu, který je vyuţíván pro měření atomové absorpce, na vyšší vzbuzené energetické stavy aţ po ionizaci a buzení vyšších iontových stavů. Charakteristické elektromagnetické záření emitované při samovolné deexcitaci vzbuzených atomů nebo ionů se vyuţívá jak pro jejich identifikaci, tak pro kvantitativní stanovení různými metodami optické emisní spektrometrie (OES). Objevitelé emisní spektrální analýzy Bunsen a Kirchhoff vyuţili jako zdroj pro buzení spekter plamen svítiplyn-vzduch, který však vzhledem k nízké teplotě (ca 2000 K) stačil pouze pro sledování spekter atomů s nízkými budicími energiemi (alkalické kovy, alkalické zeminy). Velmi brzy se jako zdroje buzení začaly pouţívat i elektrické výboje, dosahující podstatně vyšších teplot. V oblouku lze dosáhnout 10 000 K a v jiskrovém výboji aţ 15 000 K. Spektra pokrývají celou viditelnou i ultrafialovou oblast elektromagnetického záření včetně její krátkovlnné vakuové části (pod 200 nm). Počet čar, odpovídající energetickým přechodům, se pro jednotlivé prvky velmi liší, a to od několika desítek (alkalické kovy) aţ po několik tisíc (vzácné zeminy). Výhodou emisních metod je možnost simultánního stanovení mnoha prvků a linearita kalibračních křivek přes 5 aţ 6 řádů koncentrace. Je tedy moţné vyhodnocením jednoho spektrálního záznamu sledovat analyty o koncentracích od 101 aţ po 10-5 %. Snaha po dosaţení výboje o teplotě oblouku a stabilitě plamene vyústila v polovině šedesátých let ve vyuţití plazmatu stejnosměrného proudu a vysokofrekvenčních výbojů. Metoda ICP-OES optická emisní spektrometrie s indukčně vázaným plazmatem (Inductively Coupled Plasma) znamenala úplný převrat ve vývoji spektrochemické analýzy. Jako plazma se označuje ionizovaný plyn obsahující dostatečně velký počet elektricky nabitých částic, přičemţ je stejný počet částic kladně a záporně nabitých. Celá soustava je vysoce vodivá, avšak navenek nevykazuje ţádný náboj - projevuje se jako quasi neutrální. Pro přechod plynu na plazma je nutné dodat energii vyšší, neţ je ionizační energie přítomných atomů. Kvalitativní změna vlastností plynu nastává při zahřívání na teplotu několika 1000 K, kdy se v důsledku ionizace objevují nabité částice, které se mohou volně pohybovat. Velmi důleţitá je přítomnost elektronů s vysokou kinetickou energií, kterou při sráţkách předávají těţším částicím (atomům, molekulám). Sráţkovými procesy se dosahuje vysoká teplota soustavy potřebná pro další atomizaci a ionizaci. Indukčně vázané plazma vzniká za atmosférického tlaku v proudu plynu. Nejčastěji se jako plazmový plyn pouţívá poměrně lehce ionizovatelný argon, který proudí soustavou tří

13

koncentricky uspořádaných ţárupevných trubic. Trubice tvoří tzv. plazmovou hlavici, která je obtočena 2-5 vodou chlazenými závity cívky vysokofrekvenčního (vf) generátoru.

1. 2. 3. 4. 5. 6. 7.

přívod vf proudu z generátoru indukční cívka s vodou chlazenými závity plazmový plyn chladicí plyn injektor pro přívod aerosolu vzorku plazmový (analytický) kanál (~3500K) plazmový prstenec uvnitř vf cívky (~10 000K)

Obrázek 6. Schema plazmové hlavice optického emisního spektrometru s indukčně vázaným plazmatem

První ionizační impuls je třeba dodat např. výbojem Teslova transformátoru. Vzniklé elektrony jsou urychleny vysokofrekvenčním polem o výkonu několika kilowatů (obvykle ~2,5 kW) a ionizují další atomy Ar. Lavinovitá ionizace udrţuje nepřetrţitý výboj, kterému je dodávána energie vf proudy indukovanými v povrchové vrstvě plazmatu. Přestoţe ICP umoţňuje vnášení všech skupenství, nejjednodušší a proto nejčastěji pouţívané je pouţívání roztoku vzorku, který se v mlţné komoře míchá s argonem na jemný aerosol. Ten je křemenným nebo korundovým injektorem veden do osy plazmové hlavice.

14

Vnášení kapalných vzorků je vlastně podobné jako u plamenové techniky atomové spektrometrie (AAS), stejným způsobem se u obou metod vnášejí i plynné vzorky v případě vyuţití generace plynných hydridů. Pouţití peristaltických čerpadel umoţňuje vnášení suspenzí (nejčastěji při stanovení otěrových kovů v olejích). Pro dávkování pevných vzorků jsou nutná další pomocná zařízení, např. laserové či elektrotermické vypařování. Indukčně vázaného plasmatu můţeme vyuţít i ve spojení s jinými měřícími technikami. Nejčastější je spojení ICP s hmotnostní detekcí (ICP-MS), které dociluje velmi nízké meze detekce a dovoluje i stanovení jednotlivých izotopů. Svou citlivostí předčí pro některé elementy metodu AAS s elektrotermickou atomizací a výhodou je i moţnost současného stanovení celé řady prvků. Nevýhodou je nutnost uţití roztoků s velmi malou solností, takţe je třeba mineralizovat malé naváţky vzorků (problémy s homogenitou) nebo výsledné mineralizáty dodatečně ředit. Vysoká cena tohoto zařízení se samozřejmě promítá i do ceny analýz. Tabulka 3 srovnává detekční limity, tedy nejniţší koncentrace analytu stanovitelné danou metodou, pro ty techniky, se kterými se v laboratořích nejčastěji setkáváme. Je zřejmé, ţe konkrétní poţadavky na analýzu určitého vzorku, tedy poţadované spektrum prvků a jejich koncentrační hladiny musíme modifikovat podle konkrétního vybavení laboratoře, která bude analýzu provádět. Cena analýzy a počet vzorků měřitelný za časovou jednotku tak budou dalšími faktory, které budou ovlivňovat volbu měřící techniky pro konkrétní účel.

Tabulka 3. Detekční limity vybraných instrumentálních analytických metod (μg.l-1); F-AAS – plamenová atomová absorpční spektrometrie, HG-AAS - atomová absorpční spektrometrie s generováním těkavých sloučenin, ET-AAS - atomová absorpční spektrometrie s elektrotermickou atomizací, ICP-OES – optická emisní spektrometrie s indukčně vázaným plazmatem, ICP-MS – hmotnostní spektrometrie s indukčně vázaným plazmatem

Prvek Ag Al As Au B Be Bi Ca Cd Cl Co Cr Cu Fe Ge K Mg Mn

F-AAS 1,5 45 150 9 1000 1,5 30 1,5 0,8 9 3 1,5 5 300 3 0,15 1,5

HG-AAS

0,03

0,03

ET- AAS 0,005 0,1 0,05 0,15 20 0,008 0,05 0,01 0,002

ICP-OES 0,6 1 2 1 1 0,09 1 0,05 0,1

0,15 0,004 0,014 0,06

0,2 0,2 0,4 0,1 1 1 0,1 0,1

0,005 0,005 0,005

ICP-MS 0,002 0,005 0,0006 0,0009 0,003 0,003 0,0006 0,0002 0,00009 12 0,0002 0,0002 0,0002 0,0003 0,001 0,001 0,00007 0,00007

15

Mo Na Ni P Pb S Sb Se Si Te Ti U Zn

45 0,3 6 75000 15 45 100 90 30 75 15000 1,5

0,03 0,005 0,07 130 0,05 0,15 0,03 0,03

0,05 0,05 1 0,1 0,35 0,02

0,5 0,5 0,5 4 1 10 2 4 10 2 0,4 10 0,2

0,001 0,0003 0,0004 0,1 0,00004 28 0,0009 0,0007 0,03 0,0008 0,003 0,0001 0,0003

Po výběru analytické metody pak následuje optimalizace podmínek měření (volba způsobu kalibrace – technika kalibrační křivky, technika přídavku standardu apod, modifikátorů matrice, ionizačních či uvolňovacích pufrů a další). Pro optimalizaci metody je vhodné vyuţít referenčního materiálu (tj. komerčně dostupného materiálu se známým obsahem sledovaných prvků), který by měl svým sloţením pokud moţno co nejlépe odpovídat analyzovanému vzorku. Jedině tak je moţno zajistit objektivní posouzení moţných interferencí při stanovení prvků či dalších nepříznivých vlivů způsobených matricí analyzovaného vzorku, které mohou významně ovlivnit výsledek analýzy.

Literatura Kolektiv autorů: Arsenic. Environmental Health Criteria 18. World Health Organisation, Geneva 1981. Bye, R.: Talanta 29, 797 (1982). Chen, H., Brindle, I.D., Le,X.: Anal.Chem. 64, 667 (1992). Kolektiv autorů: Vybrané metody analytické atomové spektrometrie. Československá spektroskopická společnost, Praha, 1987. Kolektiv autorů: Atomová absorpční spektrometrie II. Kurz pro pokročilé. Spektroskopická společnost Jana Marka Marci, Praha, 2000. Kolektiv autorů: Atomová absorpční spektrometrie I. Základní kurz. Spektroskopická společnost Jana Marka Marci, Praha, 2003. Krenţelok, M., Rychlovský, P.: Coll. Czech. Chem. Comm. 63, 164 (1998). Narsito-Agterdenbos, J.: Anal.Chim.Acta 197, 315 (1987). Petrick, K., Krivan,V.: Anal.Chem. 59, 2476 (1987). Schmidt, F.J., Royer, J.L.: Anal.Lett. 6, 17 (1973). Tesfalidet, S., Irgum, K.: Anal.Chem. 60, 2031 (1988). Thompson, K.C., Thomerson, D.R.: Analyst (London) 99, 595 (1974).

4. Odběr, skladování a příprava vzorku k analýze Je známo, ţe případné chyby, ke kterým dochází při odběru vzorku jsou mnohem závaţnější a obtíţněji odstranitelné, neţ je tomu u vlastního měření. Špatně provedený odběr vzorku můţe představovat aţ 30% celkové chyby analýzy. V tomto případě je třeba vzít

16

v úvahu reprezentativnost a homogenitu odebíraného vzorku, je třeba se vyvarovat sekundární kontaminace vzorku (odběrová a homogenizační zařízení nesmějí obsahovat stanovovaný prvek, nebo jeho koncentrace musí být o několik řádů niţší neţ v odebíraném materiálu) a analyzovaného vzorku musí být dostatečné mnoţství. Je nutno zabezpečit vhodné podmínky skladování vzorku tak, aby byla zachována stabilita analyzovaného prvku či sloučeniny a nedocházelo k nežádoucím chemickým změnám. Například při odběru vzorků rostlin je třeba vzít v úvahu druh rostliny, věk, odebíranou část rostliny, dobu odběru, pouţité hnojení a podobně. Velmi důleţité je i další zpracování vzorku, jako je odstranění nečistot z povrchu rostlin (významné zejména v případě Fe), sušení a homogenizace pokusného materiálu. Ve všech případech můţe dojít jak k sekundární kontaminaci vzorku, tak i ke ztrátám prvků, kdy např. příliš dlouhé omývání rostlin můţe vést ke ztrátám B a K. Většina z výše uvedených instrumentálních analytických metod vyţaduje pro vlastní měření přítomnost analytu v roztoku. Analyzujeme-li tedy nejrůznější biologické, zemědělské či geologické materiály, musíme analyzovaný prvek nebo jeho sloučeninu převést do roztoku takovým způsobem, aby byl daný analyt převeden kvantitativně, bez případných strukturálních změn a ve formě, která je vhodná pro pouţitou měřící techniku. Pro stanovení celkových obsahů prvků ve vzorcích volíme destrukci matrice vzorku a převedení analytů do roztoku, tedy rozklad nebo mineralizaci vzorku. Problematika rozkladů byla jak po teoretické, tak i po praktické stránce mnohokrát souborně zpracována. Nejnovější přehled metod rozkladu počínaje jejich teoretickým základem a konče vybranými praktickými aplikacemi podávají Krakovská a Kuss (2001). Z technik uvedených v této práci jsme se pak zaměřili na ty v praxi nejfrekventovanější, tedy mokrý a suchý rozklad. Další techniky, které je moţno nalézt v souborných pracích (Krakovská a Kuss, 2001, Bock, 1979), jako je alkalické tavení, fotolytický rozklad či rozklad pomocí enzymů, jsou pouţitelné zejména pro speciální aplikace a nedočkaly se širokého uplatnění. Při klasické verzi suchého rozkladu se vzorek zahřívá v reakční nádobě z křemenného skla, platiny nebo porcelánu při teplotě 450 – 500°C. Vzniklý popel se potom rozpustí v louţícím médiu, kterým je zpravidla zředěná minerální kyselina. Mokrý rozklad představuje destrukci matrice vzorku ve směsi silných minerálních kyselin za zvýšené teploty, případně i tlaku.

4.1. Metody rozkladu vzorku pro stanovení celkových obsahů prvků v půdách a v rostlinách 4.1.1. Suchý rozklad 4.1.1.1. Klasický suchý rozklad Klasický suchý rozklad je charakterizován jako rozklad v otevřeném systému, na vzduchu a za atmosférického tlaku. Při zahřívání vzorku v reakční nádobě z křemenného skla, platiny nebo porcelánu (za nejvhodnější se povaţuje křemenné sklo) nejprve dochází k úniku vody přítomných a vzniklých těkavých zplodin. Se zvyšováním teploty pak dochází k postupné destrukci organické hmoty. V tomto stadiu se mohou ve vzorku vytvářet centra lokálního záhřevu s podstatně vyšší teplotou, neţ je zvolená mineralizační teplota. Aby suchý rozklad probíhal plynule a bez exotermních reakcí, je nutno zvyšovat teplotu mineralizace velmi zvolna, nebo zuhelnaťovat vzorky nejprve mimo pec při teplotě 200 300 °C na horké desce s definovaným nárůstem teploty. Systematické chyby způsobené nedefinovatelným průběhem teploty zejména v první fázi rozkladu lze do značné míry redukovat precizně propracovaným teplotně - časovým reţimem rozkladu. Takové pracovní

17

postupy, obvykle upravené dle typu analyzovaného materiálu, vedou ke správným hodnotám obsahu sledovaných prvků a nedochází ke ztrátám analytů vytěkáním v místech okamţitého zvýšení teploty vzorku. Teplota rozkladu obvykle není niţší neţ 450 °C; tato teplota vede u většiny biologických materiálů k úplné destrukci organické matrice vzorku. Maximální teplota rozkladu pak zpravidla nepřekračuje 550 °C. Význam dokonalého rozkladu organické matrice vzorku vystupuje do popředí zejména při pouţití elektrochemických metod stanovení prvků, kde zbytky organické hmoty závaţným způsobem interferují. Byly popsány retence analytů na uhlíkaté zbytky po rozkladu biologického materiálu za niţší teploty, zejména v případě mědi. Při vyšších teplotách se zvyšuje nebezpečí ztráty analytů vytěkáním, retencí na pevný zbytek po rozkladu rostlinného materiálu nebo půdy, popřípadě retencí na stěny reakční nádoby. Nejvýznamnějším problémem se při rozkladu rostlinného materiálu jeví retence prvků na nerozpustný zbytek po rozkladu, který je v tomto případě tvořen zejména silikáty, jejichţ koncentrace je v některých rostlinných tkáních a zejména v půdách velmi vysoká. Příklad retence kadmia, olova a chromu na pevný zbytek po suchém rozkladu je znázorněn na obrázcích 7, 8 a 9. V tomto případě byly rozkládány vzorky komponentů pro výrobu kompostu metodou klasického suchého rozkladu, přičemţ popel byl rozpuštěn v 1,5 % HNO3. Popel se nerozpustil kvantitativně, ve všech případech zůstal na dně zkumavky pevný zbytek. Po stanovení obsahu prvků v roztoku byl pevný zbytek ze zkumavek odebrán, vysušen a rozpuštěn ve směsi HF + HNO3 při 150°C. Tento postup vede k úplnému odstranění silikátů ze vzorku a k uvolnění prvků, které byly na tento silikát pevně nasorbovány. Z obrázků je zřejmé, ţe míra retence prvků na pevný zbytek po suchém rozkladu závisí nejen na typu analyzovaného vzorku, ale i na analytu, přičemţ zejména u chromu je problém retence velmi závaţný. 120 100

%

80 60 40 20

materiál

hnůj

zbytky siláže

sediment 2

sediment 1

kapucín 4

kapucín 3

kapucín 2

kapucín 1

0

ve zbytku v roztoku

Obrázek 7: Retence kadmia na pevný zbytek po suchém rozkladu surovin pro výrobu kompostu

18

120 100 80

%

60 40 20

hnůj

zbytek sláže

sediment 2

sediment 1

kapucín 4

kapucín 3

kapucín 2

kapucín 1

0

ve zbytku v roztoku

materiál

Obrázek 8: Retence olova na pevný zbytek po suchém rozkladu surovin pro výrobu kompostu 120 100

%

80 60 40 20

materiál

hnůj

zbytky siláže

sediment 2

sediment 1

kapucín 4

kapucín 3

kapucín 2

kapucín 1

0

ve zbytku v roztoku

Obrázek 9: Retence chromu na pevný zbytek po suchém rozkladu surovin pro výrobu kompostu Velmi často se také pouţívá tzv. pomocné činidlo, nejčastěji minerální kyselina, dusičnan nebo síran, které zvyšuje účinnost rozkladu, sniţuje moţnost ztrát analytu vytěkáním a omezuje jeho kontakt s povrchem reakční nádoby. Při pouţití suchého rozkladu je také nutno zvolit optimální poměr naváţky vzorku a roztoku pouţitého pro převedení mineralizátu do roztoku (zpravidla zředěná HNO3 nebo HCl). Při pouţití příliš malého objemu roztoku nedochází k úplnému rozpuštění resp. vylouţení popela, coţ vede k nesprávným výsledkům.

19

4.1.1.2 Příklad aplikace klasického suchého rozkladu pro rozklad biologického materiálu 1. Určeno pro: Široké spektrum ţivočišných tkání a orgánů a rostlinných materiálů s nízkým obsahem silikátů (Mader et al. 1998). 2. Naváţka vzorku: 1 - 2 g, přípustná je i naváţka menší neţ 1 g (ale ne méně neţ 100 mg sušiny). 3. Zuhelnatění: Vzorek o známé hmotnosti se umístí do reakční nádoby (kádinka z křemenného nebo borosilikátového skla o objemu 50 ml), kádinka se postaví na studenou topnou desku umístěnou v digestoři, zakryje se hodinovým sklem a zapne se na teplotu 160°C. Po 1 hodině se teplota zvýší na 220°C, po další hodině na 280°C a po další hodině na 350°C. Na této teplotě jsou vzorky zahřívány po dobu 1 hodiny, poté se kádinky sejmou z horké desky a hodinová skla se odstraní. Přibliţně 10-15 % celkového počtu kádinek je vyhrazeno pro slepé vzorky, které monitorují případnou sekundární kontaminaci vzorku během mineralizace. 4. Zpopelnění: Kádinky (bez hodinových skel) se přemístí do studené muflové pece, pec se uzavře a zapne na 350°C. Po 1 hodině se regulátor teploty přepne na 450°C, po další hodině se teplota zvýší na 500°C a při této teplotě jsou vzorky spalovány cca 16 hodin (přes noc). Po uplynutí této doby se pec vypne a po cca 30 minutách se kádinky se vzorky přemístí do digestoře. 5. Přídavek pomocného činidla: Po ochlazení na laboratorní teplotu se do kaţdé kádinky přidá 1 ml HNO3 (67 %) vysoké třídy čistoty. Kádinky se poté přemístí na topnou desku, která se zapne na teplotu 130°C a zahřívají se, dokud není veškerá kapalina v kádince odpařena do sucha. 6. Opakované zpopelnění s přídavkem pomocného činidla: Kádinky se opět vrátí do muflové pece, která se zapne na teplotu 500°C. Na této teplotě jsou vzorky ponechány po dobu 1 hodiny, poté se pec vypne a po 30 minutách se vzorky vyjmou do digestoře. 7. Rozpouštění popela: Do kaţdé kádinky se přidá cca 5 ml zředěné HNO3 (1,5 %) a ponořením dolní třetiny kádinky do ultrazvukové lázně se popel kvantitativně uvolní od stěny kádinky. Poté se obsah kádinky kvantitativně přemístí do kalibrované zkumavky objemu 10, 20 nebo 25 ml. Pro vypláchnutí kádinek a pro doplnění zkumavek na poţadovaný objem se opět pouţije zředěná (1,5 %) HNO3. Kalibrované zkumavky se poté uzavřou parafilmem, dobře promíchají a uloţí při laboratorní teplotě po dobu nejméně 24 h v bezprašném prostředí. Tento mineralizát je vhodný pro stanovení Cd, Cu, Cr, Mn, Ni, Pb, Zn, Ca Mg, K, P a dalších prvků metodami elektrochemickými, AAS nebo ICP-OES. Není vhodný pro stanovení těkavých prvků, jako As, Se, nebo Hg, kdy dochází během mineralizace k významným ztrátám těchto prvků. 4.1.1.3. Moderní verze suchého rozkladu Pro zvýšení účinnosti suchého rozkladu byla vyvinuta řada zařízení, v nichţ mineralizace probíhá namísto na vzduchu v prostředí kyslíku či jiného oxidačního plynu (resp. směsi

20

plynů), někdy i za zvýšeného tlaku. Tyto metody pak umoţňují sníţení maximální teploty rozkladu, coţ sniţuje nebezpečí ztrát analytu vytěkáním či retencí. Některá zařízení pouţívají k rozkladu vzorku v uzavřeném systému v prostředí zvýšeného tlaku kyslíku či proudu kyslíku, nízkoteplotního kyslíkového plazmatu nebo NO2 s pouţitím finální teploty rozkladu 300 - 350 °C. V České republice a na Slovensku je na trhu mineralizátor APION (Tessek, Ltd.). Jedná se o elektricky vyhřívaný duralový horký blok a rozklad probíhá v prostředí superoxidační směsi plynů O2 + O3 + NOx. Teplotu zpopelnění je moţno zvolit v rozmezí 300 - 400 °C, dobu zpopelnění v rozmezí 0 - 14 hodin. Pro rozklad biologických materiálů je nutno pouţít maximální teploty (tj. 400 °C) a doby zpopelnění mezi 10 a 14 hodinami (Obrázek 10). Na rozdíl od klasického suchého rozkladu lze tento postup vyuţít pro rozklad vzorků pro stanovení arsenu bez nebezpečí ztrát tohoto analytu. I při pouţití tohoto mineralizátoru přichází v úvahu retence prvků na silikátový zbytek a nutnost jeho odstranění přídavkem kyseliny fluorovodíkové; ztráty retencí jsou však v tomto případě niţší ve srovnání s klasickým suchým rozkladem z důvodu niţší teploty rozkladu. Při analýzách rostlinných materiálů s vysokým obsahem manganu byl při pouţití superoxidační směsi zaznamenán vznik obtíţně rozpustného MnO2, takţe pro kvantitativní převedení manganu do roztoku bylo nutno popel nejprve zahřívat s malým mnoţstvím koncentrované HCl.

21

Obrázek 10. Mineralizátor APION. V levé části obrázku je vidět spalovací pec s kapilárami na přívod oxidačních plynů, v pravé části pak spalovací zkumavky s naváženým vzorkem a ovládací jednotka, která řídí teplotně-časový režim přístroje a zároveň produkuje směs oxidačních plynů v požadovaném složení.

Významnou nevýhodou klasického suchého rozkladu je poměrně dlouhá doba potřebná pro úplné rozloţení vzorku. Jako minimální doba rozkladu se uvádí 3 hodiny, ale velmi často je zapotřebí doby mnohem delší. Dlouhodobá expozice analyzovaného materiálu na vzduchu v otevřeném systému rovněţ můţe vést k sekundární kontaminaci vzorku z prostředí laboratoře. Proto se v poslední době objevují i metody, které pro destrukci organické matrice vzorku pouţívají jiné způsoby ohřevu, neţ je klasická muflová pec a horká deska. Pro spálení

22

organické matrice vzorku (zatím pouze pro stanovení obsahu popelovin v daném vzorku) je moţno pouţít i mikrovlnné pece s keramickou vloţkou absorbující mikrovlnné záření (CEM, USA). Relativní novinkou je vysokoteplotní mikrovlnná muflová pec (Milestone, Itálie) s programovatelným teplotně-časovým reţimem a teplotou spalování v rozmezí 450 - 900 °C, vhodná i pro rozklady předcházející stanovení stopových prvků. Tato technika rovněţ vede k významnému zkrácení doby rozkladu. 4.1.1.4. Příklad aplikace mineralizátoru APION pro rozklad rostlinného materiálu 1. Určeno pro: vegetativní části vyšších zelených rostlin, zelené řasy a buněčné kultury rostlinného původu (Miholová et al. 1993). 2. Do reakčních nádob, které byly předem vylouţeny po dobu 3 dnů v 5% HNO 3, vymyty redestilovanou vodou a vysušeny, naváţíme vzorek rostlinného materiálu o hmotnosti odpovídající 1 - 2 g sušiny. Vzorky vysušíme přímo v reakčních nádobách lyofilizací či v laboratorní sušárně. 3. Reakční nádoby vloţíme do studené mineralizační pece, pec uzavřeme a parametry na ovládacím panelu přístroje nastavíme takto: o o o o

mineralizační teplota 400 °C doba mineralizace 12 h doba sušení 0 min. vstup plynů od fáze A

4. Zapneme hlavní vypínač přístroje a tlačítkem START zahájíme fázi A. Otevřeme přívod kyslíku. Po otevření vstupních plynových ventilů přístroje počkáme 2 minuty a otevřeme přívod amoniaku. Rozklad můţe probíhat přes noc. Chlazení separátoru nuceným oběhem vody není nezbytné. 5. Po ukončení nastaveného programu vypneme hlavní vypínač a přívod plynů, mineralizační pec necháme zchladnout na 200 °C či méně. 6. Reakční nádoby vyjmeme a necháme v exsikátoru vytemperovat na teplotu místnosti. Do kaţdé nádoby přidáme cca 5 ml 1,5%-ní HNO3 a popel louţíme s pomocí ultrazvukové lázně. Vzniklý roztok resp. suspenzi kvantitativně převedeme do kalibrovaných zkumavek, doplníme 1,5%-ní HNO3 na 18-20 ml, uzavřeme parafilmem a promícháme. 7. Roztok resp. suspenzi ponecháme 24 h v klidu při pokojové teplotě. Tento mineralizát je vhodný pro stanovení As, Cd, Cu, Cr, Mn, Pb, Zn metodami elektrochemickými, AAS nebo ICP-OES. Pro rozklad vzorků s vysokým obsahem silikátů, jako jsou půdy, komposty, některé druhy rostlin apod. je třeba pevný zbytek po suchém rozkladu kvantitativně rozpustit. Vyuţít můţeme následujícího postupu: 1. 0,5 g vzorku půdy se spálí na suché cestě ve směsi superoxidačních plynů v přístroji APION při teplotě 400 C po dobu 10 hodin, nebo klasického suchého rozkladu dle postupu 4.1.1.2. nebo 4.1.1.4.

23

2. Pevný zbytek po suchém rozkladu se rozloţí ve směsi HF konc. + HNO3 konc. (1 + 2) na teflonové horké desce v teflonových kádinkách při 150 °C. 3. Odparek se rozpustí v 5 ml lučavky královské (tj. směsi 1 dílu HNO3 a 3 dílů HCl), převede se kvantitativně do kalibrovaných zkumavek objemu 25 ml, doplní se demineralizovanou vodou do 25 ml a uloţí se při teplotě místnosti aţ do doby měření, nejméně však po dobu 72 hodin. 4.1.1.5. Jednoúčelový analyzátor stopových množství rtuti AMA-254 Ve specifických případech lze s úspěchem propojit rozklad vzorku přímo se stanovením daného analytu bez nutnosti převádět tento analyt před stanovením do roztoku. U rizikových prvků je typickým příkladem takového přístroje jednoúčelový analyzátor stopových množství rtuti české výroby, který se distribuuje pod označením AMA-254. Rtuť má mezi všemi prvky zcela specifické postavení, protoţe se uvolňuje z roztoku vzorku ve formě monoatomové páry jiţ za laboratorní teploty. Tato vlastnost byla vyuţita při tzv. technice generování studených par rtuti, která byla popsána koncem 60. let 20. století a v současné době je dominantní metodou stanovení stopových koncentrací tohoto prvku. Při této technice se HgII v roztoku redukuje roztokem chloridu cínatého nebo tetrahydridoboritanu sodného na elementární rtuť, která je vedena proudem nosného plynu (argon, dusík) ve formě monoatomové páry přes sušící vrstvu (CaCl2, Mg(ClO4)2, silikagel) do křemenného atomizátoru. Technicky lze pro tuto metodu vyuţít běţný generátor hydridů (viz výše). Rtuť patří mezi nejsledovanější prvky ve všech sloţkách ţivotního prostředí, její koncentrace v biologických materiálech jsou však velmi nízké. Pro zvýšení citlivosti metody se proto vyuţívá schopnosti rtuti tvořit stabilní amalgámy se zlatem či stříbrem. Na tenké vrstvě kovu umístěné na keramickém nosiči (amalgamátoru) umístěném mezi generátorem rtuťových par a atomizátorem dojde k významnému zakoncentrování rtuti z velkého objemu vzorku do malého objemu amalgamátoru. Kritickým krokem při stanovení stopových koncentrací rtuti je rozklad vzorku, který musí ve většině případů vlastnímu stanovení předcházet. Nedostatečně rozloţené organické sloučeniny rtuti, které nejsou redukovatelné chloridem cínatým, ztráty rtuti během tepelného rozkladu, paměťové efekty plastových nádob často pouţívaných zejména při rozkladu za zvýšeného tlaku nebo moţnost sekundární kontaminace vzorku během rozkladu jsou častými důvody nesprávných výsledků. Jako velmi výhodná se v této souvislosti jeví moţnost pouţití termooxidačního rozkladu vzorku v proudu kyslíku následované amalgamací rtuti a on-line stanovením rtuti metodou AAS v absorpční kyvetě v uzavřeném systému. Tuto moţnost nabízí právě jiţ zmíněný jednoúčelový analyzátor stopových mnoţství rtuti AMA-254, který je schematicky znázorněn na obrázku 11. Přístroj je určen pro přímé stanovení obsahu rtuti v pevných vzorcích a v kapalinách bez potřeby předcházejícího rozkladu vzorku. Vlastní stanovení pak probíhá následovně: Vzorek o známé naváţce (podle povahy analyzovaného vzorku 50 – 300 mg) či objemu (do 500 μl) se vloţí do spalovací lodičky a je zaveden do spalovací trubice, kde je vysušen a spálen v proudu kyslíku. Rozkladné produkty pak postupují přes katalyzátor, kde se dokončí oxidace a zachytí se některé produkty spalování, a dále přes amalgamátor, kde se selektivně zachytí rtuť. Rtuť z amalgamátoru je uvolněna krátkodobým ohřevem cca na 1200 °C a je nosným plynem vedena nejprve do delší měřící kyvety a poté přes zpoţďovací nádobku do kratší měřící kyvety. Stejné mnoţství rtuti

24

se tedy měří dvakrát s odlišnou citlivostí (celkový dynamický rozsah se udává v rozmezí 0,05 – 600 ng Hg).

Obrázek 11. Blokové schéma jednoúčelového analyzátoru AMA-254. 1 - dávkovací zařízení, 2 – spalovací trubice, 3 - katalytická pec, 4 - spalovací pec, 5 – amalgamátor, 6 – vypuzovací pec, 7 – blok měřících kyvet, 8 – rtuťová výbojka, 9 – clonka, 10 – detektor, 11 – interferenční filtr, 12 – chladící čerpadlo, 13 – topení bloku měřících kyvet, 14 – delší měřící kyveta, 15 – zpoţďovací nádobka, 16 – kratší měřící kyveta, 17 – výstup kyslíku, 18 – analogová elektronika, 19 – mikropočítač 8051, 20 – regulátor průtoku kyslíku, 21 – dávkovací lodička, 22 – vstup kyslíku, 23 – komunikace s PC. Moţnosti analyzátoru je moţno v krátkosti demonstrovat několika našimi vlastními výsledky stanovení obsahu rtuti v certifikovaných referenčních materiálech (tedy materiálech se známým obsahem rtuti) s různou matricí a zejména se širokým rozsahem certifikovaných obsahů tohoto prvku (Obrázek 12). Je zřejmé, ţe naměřené hodnoty se ve všech případech

25

log(mg/kg)

shodují s certifikovanými hodnotami a ţe přístroj je tedy schopen stanovovat správné obsahy rtuti v několikařádovém rozmezí. 10

1

0.1

0.01

0.001 BCR-184

SO-3

RM 12-2-3

NIST1572

BCR-62

RM 12-2-1

BCR-144

CRM certif. hodnota AMA-254

Obrázek 12. Výsledky stanovení obsahu rtuti v certifikovaných referenčních materiálech biologického původu pomocí analyzátoru AMA-254. (BCR-184 – hovězí svalovina, SO-3 – půda, RM 12-2-3 – zelená řasa, NIST 1572 citronové listí,BCR-62 – olivové listí, RM 12-2-1 – hovězí játra, BCR-144 – čistírenský kal)

4.1.2. Mokrý rozklad 4.1.2.1. Mokrý rozklad za atmosférického tlaku Pro rozklad biologických materiálů na mokré cestě při atmosférickém tlaku v otevřeném či polouzavřeném systému se pouţívají minerální kyseliny, jako H2SO4, HNO3, HClO4, HCl v nejrůznějších kombinacích, případně doplněné přídavky dalších oxidačních činidel (H2O2) či katalyzátoru (Se, Hg, Cu). Koncentrovaná HClO4 je při teplotách pouţívaných při rozkladu silným oxidačním a dehydratačním činidlem a z pouţívaných kyselin je povaţována za nejúčinnější. Její pouţití však vyţaduje dodrţení řady bezpečnostních opatření, která potlačí případné riziko exploze reakční směsi. Biologický materiál se obvykle rozkládá nejprve samotnou HNO3 a teprve po rozloţení větší části organické matrice vzorku se k ochlazenému roztoku přidává HClO4. V ţádném případě by se tato reakční směs neměla odpařit aţ do sucha. Kyselina dusičná se můţe pouţívat samostatně, ale její účinnost je omezena nízkým bodem varu. Některými autory je jednoznačně označována za nedostačující pro rozklad biologického materiálu za atmosférického tlaku. Nejčastěji se pouţívá jako součást reakčních směsí, jako například HNO3 + HClO4 a HNO3 + H2SO4. Doporučuje se i nahradit kyselinu

26

chloristou peroxidem vodíku, zejména z bezpečnostních důvodů, a obě směsi jsou povaţovány z hlediska účinnosti rozkladu za plně srovnatelné. Poměrně frekventované je pouţití kyseliny chlorovodíkové pro rozklad rostlinného materiálu, a to jak koncentrované, tak i zředěné vodou v poměru 1:1 nebo pouze na koncentraci 1 mol.l-1. Teplota rozkladu se v těchto případech pohybuje mezi 60 a 110 °C a je moţno stanovit obsahy všech běţných esenciálních prvků. Pouţití kyseliny fluorovodíkové se doporučuje podle typu analyzovaného vzorku, a to zejména u vzorků s vysokým obsahem křemíku, podobně jako u suchého rozkladu. Velký přebytek HF však můţe vést k tvorbě málo rozpustných fluoridů (MgF2, CaAlF5 apod.), pro jejichţ eliminaci se doporučuje přídavek kyseliny borité do reakční směsi. Pro zvýšení účinnosti rozkladu biologického materiálu na mokré cestě při atmosférickém tlaku je moţno pouţít i zařízení, kde je pro ohřev reakční směsi v křemenné nádobce pod zpětným chladičem vyuţíváno mikrovlnného ohřevu. Zařízení (ProLabo Microdigest A 301, Francie) je konstruováno tak, ţe mikrovlnné záření je fokusováno přímo na vzorek zalitý reakční směsí. Byla popsána i extrakce Mg, Mn a Zn z jemně homogenizovaných rostlinných tkání (velikost částic < 50 μm) pomocí ultrazvuku v prostředí 0,3 % HCl, přičemţ výsledky stanovení prvků korespondovaly s běţnými metodami rozkladu. 4.1.2.2. Mokrý rozklad za zvýšeného tlaku Zvýšení účinnosti samotné HNO3 je moţné i při vyuţití mokrého rozkladu za zvýšeného tlaku, kdy je reakční směs umístěna do hermeticky uzavřeného prostoru a vystavena účinkům teplot vyšších, než je bod varu azeotropu HNO 3 (122,4 °C) při atmosférickém tlaku. Současně dojde k výraznému vzestupu tlaku v reakčním prostoru (jednotky aţ desítky MPa). S výjimkou ojedinělých příkladů, kdy byl rostlinný materiál rozkládán ve směsi HClO4 a H2O2 v uzavřené silnostěnné křemenné nádobě při teplotě 80 °C, velká část aplikací mokrého rozkladu za zvýšeného tlaku vyuţívá teflonových či křemenných reakčních nádob uzavřených v silném kovovém plášti. Mokrý rozklad biologického materiálu v uzavřeném systému v prostředí koncentrované kyseliny dusičné má následující výhody ve srovnání s otevřeným systémem: o nedochází ke ztrátám prvků vytěkáním o kratší doba rozkladu a jeho vyšší účinnost o můţe být pouţita samotná kyselina dusičná, kterou je moţno relativně snadno připravit ve vysoké čistotě o pouţívá se niţší objem reagencií, coţ vede ke sníţení úrovně slepého pokusu o nepřichází v úvahu sekundární kontaminace vzorku během rozkladu z prostředí laboratoře o šetří pracovní prostředí v laboratoři a zlepšuje hygienu práce. Moţnost zvýšení teploty rozkladu je v tomto případě omezena materiálem, ze kterého jsou vyrobeny reakční nádoby. Silnostěnné tlakové reakční nádoby z PTFE jsou omezeny maximální teplotou 240 °C. Ukazuje-li se jako nezbytné pouţití vyšších teplot rozkladu, pak se doporučují reakční nádoby křemenné. Při pouţití teploty rozkladu niţší neţ 280 °C není biologický materiál kompletně rozloţen samotnou HNO3 a přítomné organické zbytky mohou komplikovat či dokonce znemoţnit stanovení prvků zejména elektrochemickými metodami. Při pouţití plamenové AAS můţe viskozita a zvýšené povrchové napětí roztoku se zbytky organické matrice vzorku

27

komplikovat nasávání vzorku do plamene. Naopak při stanovení obsahu prvků ve vzorcích zemědělských plodin metodou ICP - OES se při vysoké teplotě plazmatu (tisíce Kelvinů) zbytky neúplně rozloţené organické matrice vzorků úplně odstraní a k chemickým interferencím nedochází. Komerčně dostupné vysokoteplotní rozkladné zařízení High Pressure Asher - HPA (Anton Paar Company, Graz, Rakousko) je jednou z moţností řešení tohoto problému. Jedná se o rozklad vzorku (obvykle 0,1 - 0,5 g) v křemenných nádobách v prostředí koncentrované HNO3 při maximální teplotě 320°C v autoklávu, ve kterém je moţno dosáhnout tlaku aţ 14 MPa. V posledních několika letech jsou v analytických laboratořích velmi frekventována zařízení vyuţívající mikrovlnného záření jako zdroje energie pro ohřev kapalné reakční směsi v uzavřené nádobě bez ohřevu nádoby a vnějšího prostoru. Na trhu je moţno najít několik systémů speciálně vyvinutých pro aplikaci v analytické chemii, vyrobených z materiálů odolných proti působení korozivními parami silných kyselin a vybavených zařízením pro kontrolu teploty a tlaku uvnitř reakčních nádob (Obrázek 13). Materiál reakčních nádob, konstrukční uspořádání a s tím související maximální tlak uvnitř reakční nádoby jsou determinujícím faktorem účinnosti rozkladu organické matrice vzorku a tím i pouţitelnosti mineralizátu pro jednotlivé analytické měřící techniky, jak je diskutováno výše u mokrého rozkladu s konvenčním ohřevem reakčních nádob.

28

Obrázek 13. Laboratorní zařízení pro mokrý rozklad za zvýšeného tlaku s mikrovlnným ohřevem CEM 2000 (CEM Corporation, USA). Obrázek napravo ukazuje silnostěnné teflonové nádoby, do kterých se vkládá vzorek. 4.1.2.3. Příklad vlivu nedokonalého rozkladu vzorku na správnost stanovení arsenu Arsen v mořských rybách je přítomen z 80 % ve formě organické sloučeniny, kterou nazýváme arsenobetain. Jiţ zde bylo uvedeno, ţe arsenobetain se rozkládá při teplotě vyšší neţ 300°C, coţ je teplota, které v běţných zařízeních pro mokrý rozklad s mikrovlnným i konvenčním ohřevem nedosáhneme. Jednou z nejběţnějších metod stanovení arsenu v biologických materiálech je technika generování hydridů, která byla v předchozí kapitole detailně popsána. Tato technika vyţaduje, aby arsen byl přítomen v roztoku ve formě takových sloučenin, které jsou redukovatelné na hydrid. Arsenobetain mezi takové sloučeniny nepatří. Důsledkem pak je, ţe neredukovatelná sloučenina zůstává v roztoku, nedostane se do atomizátoru a podíl arsenu vázaný v této sloučenině není technikou generování hydridů stanoven. V našem případě jsme rozkládali vzorek svaloviny mořské ryby s označením DORM-1, coţ je certifikovaný referenční materiál se známým obsahem arsenu v mikrovlnném zařízení MLS - 1200 MEGA (Milestone, Německo) ve směsi HNO3 a H2O2.

29

Obrázek 14. Chromatografický záznam standardního roztoku vybraných sloučenin arsenu As(III) – kyselina arsenitá, As(V) – kyselina arseničná, MA – kyselina metylarseničná, DMA – kyselina dimetylarseničná, AB – arsenobetain Jak je zřejmé z obrázku 14, jednotlivé sloučeniny arsenu přítomné v roztoku lze identifikovat pomocí metody vysokoúčinné kapalinové chromatografie s detekcí na principu hmotnostní spektrometrie s indukčně vázaným plazmatem (HPLC-ICPMS). Touto technikou jsme stanovili zastoupení sloučenin arsenu v jiţ popsaném mineralizátu vzorku mořské ryby DORM-1. Z obrázku 14 je zřejmé, ţe arsenobetain se pouţitým postupem nerozloţil. Vliv na výsledek stanovení je pak následující: Certifikovaný obsah arsenu v tomto vzorku je 17,7 ± 2,1 mg As.kg-1. Metodou atomové absorpční spektrometrie s generováním hydridů bylo nalezeno pouze 0,61 mg As.kg-1, coţ odpovídá podílu kyseliny arseničné v daném vzorku (Obrázek 15). Naměřená hodnota je tedy zcela nesprávná a neodpovídá reálnému obsahu celkového As ve vzorku. Pokud byl obsah arsenu v tomto mineralizátu stanoven metodou hmotnostní spektrometrie s indukčně vázaným plazmatem (ICP-MS), kde při stanovení nezáleţí na formě arsenu v roztoku, pak bylo nalezeno 17,39 mg As.kg-1, coţ je v dobré shodě s certifikovanou hodnotou.

30

Obrázek 15. Chromatografický záznam mineralizátu mořské ryby DORM-1 získaného rozkladem na mokré cestě s mikrovlnným ohřevem Vyšší signál vlevo odpovídá arsenobetainu, nižší signál vpravo pak kyselině arseničné. Další podobný příklad dokumentuje tabulka 4. Vzorek svaloviny tuňáka byl rozloţen jak na mokré cestě s mikrovlnným ohřevem, tak i na suché cestě v prostředí oxidačních plynů v mineralizátoru APION. Obsah arsenu byl stanoven metodou hmotnostní spektrometrie s indukčně vázaným plazmatem (ICP-OES) a atomovou absorpční spektrometrií s elektrotermickou atomizací (ETAAS). U obou těchto metod nezáleţí na formě arsenu přítomného v roztoku a výsledek stanovení byl u obou mineralizačních postupů srovnatelný. Při stanovení obsahu arsenu atomovou absorpční spektrometrií s generováním hydridů (HGAAS) byl po mokrém rozkladu opět stanoven pouze podíl arsenu přítomný v roztoku ve formě redukovatelných sloučenin. Podíl arsenobetainu evidentně stanoven nebyl. Při pouţití suchého rozkladu, kde se pracuje při teplotě 400°C, byly organické sloučeniny arsenu rozloţeny a stanovení celkového obsahu arsenu v mineralizátu metodou HGAAS nepředstavovalo váţnější problém. Tabulka 4. Vliv metody rozkladu a měření na stanovení celkového obsahu arsenu ve vzorku svaloviny tuňáka rozklad mikrovlnný rozklad (CEM 2000) suchý rozklad (APION)

HGAAS 0,71 ± 0,09 6,83 ± 0,27

ETAAS 7,15 ± 1,30 6,52 ± 0,22

ICP-MS 7,16 6,86 ± 0,09

Závěrem lze říci, ţe pro rozklad rostlinných materiálů byla vyvinuta a ověřena nesmírně široká škála metod, kdy mezi jednotlivými metodickými postupy existují zdánlivě jen nepatrné rozdíly. Ve stejné míře se používají rozklady na suché i na mokré cestě. Dále je zřejmé, ţe jak u suchého, tak i u mokrého rozkladu směřuje vývojový trend směrem k moderním, často automatizovaným laboratorním zařízením pro rozklad vzorku, která zaručují vyšší rychlost rozkladu při stejné či vyšší účinnosti rozkladu. Při pouţívání vhodných standardních operačních postupů pro jednotlivé typy biologických materiálů lze dosáhnout dostatečně přesných a správných výsledků. Záleţí jen na personálních a finančních moţnostech jednotlivých laboratoří a částečně téţ na tradici a zvyklostech těchto laboratoří, pro který z moţných přístupů k rozkladu vzorků se rozhodnou. Dále pak záleţí na instrumentální analytické technice, kterou je příslušná laboratoř vybavena a pro kterou metoda rozkladu má za úkol vzorek připravit.

Literatura Allen S. E.: Chemical Analysis of Ecological Materials. Blackwell Sci. Publ., Oxford 1974. Anderson D. L., Henderson L. J.: Agron. J. 78, 937 (1986). Barbera R., Farre R., Lozano A.: J. Micronutr. An. 6, 47 (1989). Bartels V.: CLB Chem. Labor. Bet. 41, 640 (1990). Bauvalet A., Ferrau J., Casassas E.: Oleagineux 41, 141 (1986). Bock, R.: A Handbook of Decomposition Methods in Analytical Chemistry. International Textbook Company, London 1979.

31

Bowman R. A.: Commun. Soil. Sci. Plant Anal. 20, 539 (1989). Bradfield E. G.: Analyst 99, 403 (1974). Čurdová E., Száková J., Miholová D., Mestek O., Suchánek M.: Analusis 26, 116 (1998). de Boer J. L. M., Maessen F. J. M. J.: Spectrochim. Acta, 38B, 739 (1983). Filgueiras A. V., Capelo J. L., Lavilla I., Bendicho C.: Talanta 53, 433 (2000). Franko M., Kosta L.: Vestn. Slov. Kem. Drus. 33, 454 (1986). Greenberg R. R., Kingston H. M., Watters R. L., Jr., Pratt K. V.: Fresenius J. Anal. Chem. 338, 394 (1990). Halvin J. L., Soltanpour P. N.: Commun. Soil Sci. Plant Anal. 11, 969 (1980). Hilpert K., Waidmann E.: Fresenius Z. Anal. Chem. 325, 141 (1986). Hoenig M., Vanderstappen R.: Analusis 6, 312 (1978). Horwitz W. (ed.): Official Methods of Analysis of the Association of Official Analytical Chemists. Volume 13, section 51.028. Association of Official Analytical Chemists, Arlington 1980. Hu Y. F., Barker A. V.: Commun. Soil Sci. Plant Anal. 30, 677 (1999). Huang C. Y., Schulte E. E.: Commun. Soil Sci. Plant Anal. 16, 943 (1985). Jiránek V., Tlučhoř D.: Sborník z konference Mikroelementy '84, Praha 1984, str. 4. Jiránek V.: Sborník z konference Mikroelementy '83, Roţnov pod Radhoštěm 1983, str. 8. Jones J. B., Jr., Wolf B., Mills H. A.: Plant Analysis Handbook. Micro - Macro Publishing, Athens, 1991. Kingston H. M., Jassie L. B. (eds.): Introduction to Microwave Sample Preparation. Theory and practice. ACS, Washington 1988. Knapp G. v knize: Trace Element Analytical Chemistry in Medicine and Biology (Braetter P., Schramel P., eds.) Walter de Gruyter, Berlín 1988, str. 63. Knapp G.: Microchim. Acta [Wien] II, 445 (1991). Korpeľ L.: Sborník z konference Trendy vývoje AAS a analýza biologických materiálů, Olomouc 1996, str. 37. Krakovská E., Kuss H-M.: Rozklady v analytickej chémii. Vienala, Košice 2001. Labanausas C. K., Handy M.F.: Hort. Sci. 38, 596 (1975). Lindstrom R. M., Byrne A. R., Becker D. A., Smodiś B., Garrity K. M.: Fresenius J. Anal. Chem. 338, 569 (1990). Mader P., Čurdová E.: Chem. Listy 91, 227 (1997). Mader P., Haber V., Zelinka J., Analusis 25, 175 (1997). Mader P., Száková J., Čurdová E.: Talanta 43, 521 (1996). Mader P., Száková J., Miholová D.: Analusis 26, 121 (1998). Markert B.: Instrumentelle Multielementanalyse von Pflanzenproben. VCH Verlagses. Weinheim 1993. Metals. Determination by Atomic Absorption Spectrophotometry in Foodstuffs, Nordic Committee on Food Analysis, No. 139, Stockholm 1991. Microwave Ashing System - 300. New Product Bulletin, CEM Corporation, Matthews 1989. Miholová D., Mader P., Száková J., Slámová A., Svatoš, Z.: Fresenius J. Anal. Chem. 345, 256 (1993). Miholová D., Száková J., Kolihová D., Vyslouţilová M.: Sborník 11. spektroskopické konference, Spektroskopická společnost J. M. Marci, Praha 1999, str. 38. Miyzawa M., Parau M. A., Block M. F. M.: Commun. Soil Sci. Plant Anal. 15, 441 (1984). MLS-1200 PYRO vysokoteplotní mikrovlnná muflová pec. Firemní materiál firmy Milestone, Praha 1993. Munter R. C., Grande R. A. v knize: Barnes R. M. (ed.): Developments in Atomic Plasma Spectrochemical Analysis. Proc. Int. Conf. San Juan, Puerto Rico, Jan. 7-11, 1980, Heyden, London - Philadelphia - Rheine 1980, s. 653.

32

Pratt K., Kingston H.M., MacCrehan W.A., Koch W.F.: Anal. Chem. 60, 2024 (1988). Püschel P.: Dry Mode Mineralizer APION. Firemní materiál firmy Tessek, Praha 1987. Rosopulo A., Hahn M., Staerk J., Riedler J.: Landw. Forsch. 32, 199 (1975). Runkel K. H., Baar I.: Z. Anal. Chem. 260, 284 (1974). Sharma R. C., Sud K. C.: Indian J. Exp. Biol. 18, 89 (1980). Society for Analytical Chemistry, Analytical Methods Committee, Analyst (London) 84, 214 (1959). Staňa J., Zbíral J.: Agrochémia 25, 123 (1985). Száková, J., Mader, P.: Chem. Listy 98, 388 (2004). Száková, J., Tlustoš, P., Balík, J., Pavlíková, D., Vaněk, V.: Fresenius J. Anal. Chem. 363, 594 (1999). Száková, J., Kolihová, D., Miholová, D., Mader, P.: Chem. Pap. 58, 311 (2004). Száková, J., Mader, P.: Chem. Listy 98, 388 (2004). Tinggi U., Reilly C., Petterson C.: Food Chem. 60, 123 (1997). Van Loon J. C.: Selected Methods of Trace Metal Analysis. Biological and Environmental Samples. Wiley - Interscience, New York 1985. Wieteska E., Ziolek A., Drzewinska A.: Chemia Analityczna 42, 837 (1997). Würfels M., Jackwerth E., Stoeppler M.: Fresenius Z. Anal. Chem. 330, 159 (1988). Würfels M., Jackwerth E.: Fresenius Z. Anal. Chem. 322, 354 (1985). Yokoyama T., Makishima A., Nakamura E.: Chem. Geology 157, 175 (1999).

4.2. Metody extrakce a frakcionace chemických prvků v půdě Hlavním cílem analytického stanovení chemických prvků je získání podkladů pro hodnocení vlivu kontaminace na lidskou populaci i další sloţky ţivotního prostředí, identifikaci možných zdrojů znečištění a definovat souvislosti mezi úrovní kontaminace a případným vlivem na zdraví člověka nebo na případné změny parametrů životního prostředí. Je tedy nutno zkoumat a pochopit transportní mechanismy chemických prvků, aby bylo moţno pochopit jejich chemický cyklus v biosféře. V biologických systémech jsou však mobilita a transport chemických prvků závislé zejména na chemické formě daného elementu. Stanovení celkového obsahu prvků ve vzorcích není tedy v tomto případě dostačující. Biologická aktivita prvků je dána mnoha různými faktory např. oxidačním stupněm, kdy třeba kovový chrom Cr0 je pro organismus, z hlediska biologické vyuţitelnosti, nedostupný a neaktivní, trojmocná forma CrIII je biologicky vysoce aktivní a forma šestimocná CrVI toxická. Velký vliv na biologickou aktivitu či dostupnost má také chemická forma jednotlivých prvků, tedy vstupují-li do organismu jako anorganické, organické nebo komplexní sloučeniny (v tomto případě má velký vliv i charakter jednotlivých ligandů komplexní sloučeniny a způsob vazby na centrální atom prvku). Biopřístupný podíl prvku charakterizuje ten podíl prvku, který je v daném systému biologicky aktivní. V případě suchozemských rostlin se například jedná o takové formy prvku v půdě, které mohou být přijímány kořeny rostlin během vegetačního cyklu a mohou ovlivnit ţivotní cyklus daných rostlin. Analytické metody, které namísto celkového obsahu prvku stanovují pouze některou z jeho chemických forem, nazýváme speciací. Speciace prvku je tedy: o distribuce prvku do přesně definovaných specií v daném systému, coţ představuje

33

izotopové sloţení, oxidační stupeň, anorganické sloučeniny a komplexy, organokovové sloučeniny, organické a makromolekulární sloučeniny, o distribuce prvku do rozličných chemických a fyzikálních forem, jako je stanovení podílu volných iontů, komplexů a chelátů daných prvků v roztoku nebo amorfní a krystalické formy těchto prvků v pevné fázi. V případě, ţe tedy máme v daném materiálu stanovit ne celkový obsah prvku, ale jeho sloučeniny, valenční stav nebo způsob vazby na jiné sloţky analyzovaného materiálu, musíme při převedení vzorku do roztoku zabezpečit, aby analyt přešel do roztoku kvantitativně a bez jakýchkoli chemických změn. Volíme tedy namísto metod rozkladu metody extrakce analytu do vhodného média. Mimo takto striktně vymezenou charakteristiku speciace prvků pak stojí metody jednoduché a postupné extrakce prvků, které neuvolňují přesně definované specie nebo chemické formy prvků, ale určují tyto frakce pouze daným operačním postupem. Metody postupné extrakce se v praxi pouţívají pro stanovení frakcí chemických prvků v půdách, sedimentech, čistírenských kalech a jiných biologických odpadech, kompostech, popílcích, pevných spadech, odpadech z těžby minerálů a rud. Speciální aplikací je pak frakcionace rostlinné biomasy, kdy jsou v jednotlivých frakcích stanoveny obsahy prvků a zároveň se stanoví základní skupiny organických látek v těchto frakcích. Tento postup napomáhá poznání distribuce a transformace prvků v rostlinných buňkách a můţe být s úspěchem vyuţit při studiu odezvy stressového metabolismu rostlin na různé stresory včetně rizikových prvků. Typickým příkladem vyuţití extrakčních metod u zemědělských materiálů jsou analýzy vzorků půd. Půda představuje velmi sloţitý komplex organických a anorganických sloučenin tvořících jedinečný vzájemně provázaný celek, který je významnou a nenahraditelnou součástí biosféry. Pro posouzení moţných interakcí prvků obsaţených v půdě s dalšími sloţkami ţivotního prostředí je informace o celkovém obsahu těchto prvků jen málo obsaţná. Pro získání podrobnějších informací o distribuci prvků v jednotlivých komponentech půdy a o způsobu a pevnosti vazeb prvků na tyto komponenty byla vyvinuta celá řada extrakčních činidel. Některá z těchto činidel mohou být specifická pro určitý prvek či studovanou plodinu. Volba chemické sloučeniny pouţité pro extrakci se pak řídí poţadavkem, která frakce prvku má být z dané půdy uvolněna. 4.2.1. Metody jednoduché extrakce půdy Velmi detailní přehled pouţívaných extraktantů a moţností jejich aplikace publikoval Beckett (1989). Tato práce zároveň dokumentuje nesmírnou pestrost škály extrakčních činidel, jeţ vyplynula ze specifických poţadavků analytických pracovišť na řešení konkrétních problémů. Jen v případě pouţití kyseliny etylendiamintetraoctové (EDTA) je v této práci citováno více neţ 20 extrakčních postupů lišících se koncentrací vyluhovadla, teplotou či pH extrakčního roztoku. Rozdílnost analytických postupů však velmi ztěţuje vzájemné porovnání výsledků jednotlivých pracovišť, k čemuţ přistupuje i omezená moţnost kontroly kvality analytických dat vzhledem k existenci jen omezeného počtu certifikovaných referenčních materiálů půd se známým obsahem extrahovatelných frakcí jednotlivých kovů. Nejběžněji používané extraktanty lze rozdělit následovně: o silné kyseliny: o slabé kyseliny:

lučavka královská, 0,43 - 2 mol.l-1 HNO3, 0,1 - 1 mol.l-1 HCl 0,43 mol.l-1 kyselina octová

34

o cheláty o pufrované soli o nepufrované soli

0,01 - 0,05 mol.l-1 kyselina etylendiamintetraoctová (EDTA), 0,005 mol.l-1 kyselina dietylentriaminpentaoctová (DTPA) 1 mol.l-1 octan amonný pH = 7 0,01 - 0,1 mol.l-1 CaCl2, 0,1 mol.l-1 NaNO3, 1 mol.l-1 NH4NO3

4.2.2. Příklady a porovnání extrakčních metod pro stanovení podílů As, Cd, Cu, Pb a Zn v půdách 4.2.2.1. Kyseliny a cheláty Nejúčinnějším extraktantem je podle očekávání lučavka královská, kde se extrahovatelné obsahy prvků pohybují mezi 80 - 90 % celkového obsahu a neliší se významně u jednotlivých prvků. Řada autorů povaţuje tento způsob extrakce ve svém výsledku ekvivalentní celkovému rozkladu silikátové matrice půdního vzorku kyselinou fluorovodíkovou. V některých vzorcích jsou ale prvky tak pevně vázány na minerální komponenty půdy, ţe například v případě arsenu je účinnost extrakce pouhých 40 %. Přestoţe byla publikována doporučení vedoucí ke zvýšení účinnosti tohoto způsobu rozkladu, jako je pouţití přídavku H2O2 do reakční směsi nebo nahrazení konvenčního ohřevu reakční směsi ohřevem mikrovlnným, pouţití HF pro rozloţení silikátové matrice vzorku se ukazuje jako nezbytné. Výsledky stanovení prvků v extraktu lučavkou královskou pak mohou poslouţit jako odhad celkového obsahu, zejména při hodnocení kontaminace daného vzorku potenciálně toxickými prvky. Větší rozdíly v extrahovatelnosti jednotlivých prvků byly nalezeny při pouţití 2 mol.l -1 HNO3. Zatímco v případě kadmia nebyl nalezen významný rozdíl ve srovnání s pouţitím lučavky královské, v případě zinku a arsenu bylo uvolněno pouze 40, resp. 25 % celkového obsahu prvku a v obou případech bylo rozpětí nalezených hodnot širší ve srovnání s lučavkou. Je tedy zřejmé, ţe pouţití tohoto činidla jako ekvivalentu stanovení celkového obsahu prvku je moţné s určitými výhradami akceptovat pouze u velmi mobilních prvků, jako je kadmium. Zvýšení koncentrace kyseliny aţ na 4 mol.l-1 společně se zvýšením teploty reakční směsi aţ na 80 C můţe vést ke zvýšení účinnosti extrakce Zn aţ na 80 %. Pro kvantitativní převedení prvků z půdy do roztoku jsou i tyto úpravy metodiky nedostatečné. Extrakci 2 mol.l -1 HNO3 lze však pro její metodickou jednoduchost a snadnou reprodukovatelnost s úspěchem pouţít (při respektování různé extrahovatelnosti jednotlivých prvků) pro odhad kontaminace půd potenciálně rizikovými prvky. Zředěná kyselina octová bývá charakterizována jako činidlo uvolňující frakce prvků specificky sorbované na jílovité minerály v půdě. Tato frakce představuje 45 % celkového Cd 7 % Zn a 5 % As. Širší rozpětí hodnot extrahovatelného mnoţství u As a Zn ve srovnání se silnými kyselinami naznačuje větší vliv komplexu půdních vlastností na uvolňování prvků tímto činidlem. V případě Cd a Zn lze podobně charakterizovat i pouţití DTPA, tvořící pevné komplexy s kationty kovů vázaných v povrchových vazbách oxidů a v organických vazbách. Průměrná extrahovatelnost je přibliţně o 25 - 30 % niţší ve srovnání s účinností kyseliny octové. Pro extrakci arsenu, který se v půdě vyskytuje především ve formě aniontů, toto vyluhovadlo vyvinuté pro uvolnění kationtových forem prvků pouţitelné není. Extrakce lučavkou královskou 3 g vzorku se naváţí do 250 ml reakční nádoby a po zvlhčení vzorku malým mnoţstvím vody se přidá 21 ml HCl konc. a 7 ml HNO3 konc. Po 16 hodinovém stání při pokojové teplotě se vzorky zahřívají po dobu 2 hodin pod zpětným chladičem. Po zchladnutí reakční směsi se zpětný chladič propláchne zředěnou HNO3, vzorek se zfiltruje do 100 ml odměrné baňky, doplní po rysku zředěnou HNO3, promíchá a uloţí aţ do doby měření.

35

Extrakce 2 mol.l-1 roztokem HNO3 Vzorek půdy je extrahován 2 mol.l-1 roztokem HNO3 v poměru 1 : 10 (w/v) při teplotě místnosti následovně: 3,0 g vzorku půdy se naváţí do plastikové lahvičky, zalije se 30 ml 2 mol.l-1 HNO3, uzavře a nechá stát po dobu 16 hodin. Po uplynutí této doby je vzorek mechanicky protřepáván po dobu 6 hodin, poté je zfiltrován přes jemný filtr a uloţen při laboratorní teplotě aţ do doby měření. Extrakce roztokem CH3COOH Vzorek půdy se extrahuje 0,43 mol.l-1 roztokem CH3COOH v poměru 1 : 40 (w/v) při teplotě místnosti následovně: 1,0 g vzorku půdy se naváţí do 100 ml polyetylenové lahvičky a zalije se 40 ml 0,43 mol.l-1 CH3COOH. Reakční směs je mechanicky protřepávána po dobu 5 hodin, poté je roztok centrifugován po dobu 10 minut při 3000 otáčkách. Supernatant je uloţen v chladničce ve zkumavkách při teplotě 6° C aţ do doby měření. Extrakce roztokem DTPA Vzorek půdy se extrahuje 0,005 mol.l-1 roztokem DTPA v poměru 1 : 2 (w/v) následovně: 10 g vzorku půdy se naváţí do 100 ml polyetylenové lahvičky a zalije 20 ml 0,005 mol.l -1 roztoku DTPA (+ 0,1 mol.l-1 trietanolamin + 0,01 mol.l-1 CaCl2). Reakční směs se mechanicky protřepává po dobu 2 hodin, poté se roztok zfiltruje a uloţí při teplotě 6° C aţ do doby měření. 4.2.2.2. Roztoky solí a voda Pouţití deionizované vody a neutrálních solí vede přes některé odlišnosti k vzájemně porovnatelným výsledkům jak ve vlastní extrahovatelnosti jednotlivých prvků, tak i v další interpretaci dat. Tato činidla jsou schopna uvolnit pouze slabě vázané, rostlinám snadno přístupné podíly půdních elementů. U arsenu a zinku nepřesahují vyluhovatelné obsahy prvků 0,5 % jejich celkového obsahu v půdě, ale byly pozorovány rozdíly v jejich účinnosti. U arsenu se účinnost extrakce zvyšuje v pořadí: 1 mol.l-1 NH4NO3

0,1 mol.l-1 NaNO3

0,01 mol.l-1 CaCl2

H2O.

Je tedy pravděpodobné, ţe vyšší iontová síla pouţitého vyluhovadla sniţuje rozpustnost slabě vázaných forem tohoto prvku. Je také třeba mít na zřeteli, ţe většina běţně pouţívaných činidel byla vyvinuta pro extrakci prvků vázaných v půdě ve formě dvojmocných kationtů a nemusí být vţdy aplikovatelná pro prvky tvořící jiné typy vazeb. Obsah zinku v extraktu se zvyšuje v pořadí: 0,1 mol.l-1 NaNO3

H2O

1 mol.l-1 NH4NO3

0,01 mol.l-1 CaCl2.

V případě kadmia kopíruje pořadí extraktantů řadu sestavenou pro zinek, ale extrahovatelnost tohoto prvku je ve srovnání se zinkem významně vyšší. Rovněţ rozpětí hodnot pro jednotlivé vzorky je významně širší, přičemţ v některých případech se obsahy Cd extrahovatelné chloridem vápenatým blíţily 50 % celkového obsahu prvku. Ze vzájemného srovnání extrahovatelných obsahů prvků s některými půdními charakteristikami vyplynul zřetelný vliv půdních vlastností na mobilitu sledovaných prvků. Obrázek 16 ukazuje podíly mědi extrahovatelné 0,01 mol.l-1 roztokem CaCl2 ze souboru půd rozdílných fyzikálně-chemických vlastností. Je zřejmé, ţe extrahovatelnost mědi se v různých typech půd významně liší. Lineární regresní analýza ukázala statisticky významný pokles

36

obsahů Cd a Zn v extraktech při zvyšujícím se pH půdy. Byl také zaznamenán trend ke sníţení mobility arsenu při zvyšujících se hodnotách dalších půdních parametrů, tedy kationtové výměnné kapacity, obsahu organických látek a obsahu jílnatých částic. Lze shrnout, ţe zmíněná činidla jsou vhodná pro studium transportu prvků z půdy do rostlin. Chlorid vápenatý, který se svým sloţením nejvíce podobá půdnímu roztoku a je schopen uvolnit relativně vysoké, tedy snadněji stanovitelné, obsahy sledovaných prvků, se pak jeví jako nejvhodnější. Extrakce H2O Vzorek půdy se extrahuje čerstvou deionizovanou vodou v poměru 1 : 5 (w/v) při teplotě místnosti následovně: 5,0 g vzorku půdy se naváţí do 100 ml plastové lahvičky a zalije 25 ml H2O. Reakční směs se mechanicky protřepává po dobu 30 minut, poté se směs ponechá 16 hodin v klidu při teplotě místnosti, následně se opět protřepává po dobu 5 minut a poté centrifuguje po dobu 15 minut při 3000 otáčkách. Supernatant se uloţí v chladničce ve zkumavkách při teplotě 6° C aţ do doby měření.

Obrázek 16. Obsahy mědi extrahovatelné 0,01 mol.l-1 roztokem CaCl2 ze souboru půd rozdílných fyzikálně-chemických vlastností.

Extrakce roztokem CaCl2 Vzorek půdy se extrahuje 0,01 mol.l-1 roztokem CaCl2 v poměru 1 : 10 (w/v) při teplotě místnosti následovně: 3,0 g vzorku půdy se naváţí do 100 ml polyetylenové lahvičky a zalije se 30 ml 0,01 mol.l-1 CaCl2. Reakční směs je mechanicky protřepávána po dobu 6 hodin, poté je roztok centrifugován po dobu 10 minut při 3000 otáčkách. Supernatant je uloţen ve zkumavkách při teplotě 6° C aţ do doby měření. Extrakce roztokem NH4NO3

37

Vzorek půdy se extrahuje 1 mol.l-1 NH4NO3 v poměru 1 : 2,5 (w/v) při teplotě místnosti následovně: 10,0 g vzorku půdy se naváţí do 100 ml polyetylenové lahvičky a zalije se 25 ml 1 mol.l-1 NH4NO3 . Reakční směs je mechanicky protřepávána po dobu 2 hodin, poté je roztok centrifugován po dobu 10 minut při 3000 otáčkách. Supernatant je uloţen ve zkumavkách při teplotě 6° C aţ do doby měření. Extrakce roztokem NaNO3 Vzorek půdy se extrahuje 0,1 mol.l-1 NaNO3 v poměru 1 : 2,5 (w/v) při teplotě místnosti následovně: 10,0 g vzorku půdy se naváţí do 100 ml polyetylenové lahvičky a zalije se 25 ml 0,1 mol.l-1 NaNO3. Reakční směs je mechanicky protřepávána po dobu 6 hodin, poté je roztok centrifugován po dobu 10 minut při 3000 otáčkách. Supernatant je uloţen ve zkumavkách při teplotě 6° C aţ do doby měření. Extrakce roztokem NaHCO3 Vzorek půdy se extrahuje 0,5 mol.l-1 NaHCO3 v poměru 1 : 20 (w/v), pH = 8,5 při teplotě místnosti následovně: 2,0 g vzorku půdy se naváţí do 100 ml polyetylenové lahvičky a zalije se 40 ml 0,5 mol.l-1 NaHCO3. Reakční směs je mechanicky protřepávána po dobu 30 minut, poté je roztok centrifugován po dobu 10 minut při 3000 otáčkách. Supernatant je uloţen ve zkumavkách při teplotě 6° C aţ do doby měření. Literatura Beneš, S.: Obsahy a bilance prvků ve sférách ţivotního prostředí. I. část., str. 73, MZe ČR, Praha 1993. Agricultural Research Centre, Department of Soil Science: Methods of soil and plant analysis, Jokioinen, Finland, 1986. Baghdady, N. H., Sippola, J.: Acta Agric. Scand. 34, 339, 1984a. Baghdady, N. H., Sippola, J.: Acta Agric. Scand. 34, 345, 1984b. Beckett, P. H. T.: Adv. Soil Sci. 9, 143 (1989). Borůvka, L.: Doktorská disertační práce, ČZU Praha, 1997. Cao, H., Chang, A. C., Page, A. L.: J. Environ. Qual. 13, 632, 1984. Griepink, B.: J. Environ. Anal. Chem. 51, 123 (1993). Hickey, M. G., Kittrick, J. A.: J. Environ. Qual. 13, 372, 1984. ISO, International Standard Organisation: Soil quality extraction of trace metals soluble in Aqua Regia, ISO - standard of ISO/TC 190/SC 3/ WG. Kiekens, L., Cottenie, A. v knize: Chemical methods for assessing bio-available metals in sludges and soils (Leschber, R., Davis, R. D., Hermite, P. L. ed.), str. 42, Elsevier Applied Science, London, 1985. Kozák, J., Jehlička, J., Krištoufková, S., Haladová, H., Vachoušek, V.: Závěrečná zpráva, VŠZ Praha (1990). Lindsay, W. L., Norwell, W. A.: Soil Sci. Soc. Amer. J. 42, 421 (1978). Mader, P., Száková, J., Miholová, D.: Analusis 26, 121 (1998). Masscheleyn, P. H., Delaune, R. D., Patrick, W. H.: Environ. Sci. Technol. 25, 1414, 1991. Miller, W. P., Martens, D. C., Zelazny, L. W., Kornegay, E. T.: J. Environ. Qual. 15, 69, 1986. Miller, W. P., McFee, W. W.: J. Environ. Qual. 12, 29, 1983. Němeček, J., Podlešáková, E., Pastuszková, M.: Rostl. Výr. 41, 25, 1995. Nienwenhuize, J, Poley-Vos, C. H, Van Den Akker, A. H., Van Delft, W.: Analyst 116, 347, 1991.

38

Novozamsky, J., Lexmond, T. M., Houba, V. J. G.: Intern. J. Environ. Anal. Chem. 51, 47 (1993). O`Neill, P. v knize: Heavy metals in soils (Alloway, B. J. ed.), John Wiley & Sons, New York, 1990. Oake, R. J., Booker, C. S., Davis, R. D.: Wat. Sci. Tech. 17, 587 (1984): Page, A. L. (ed.): ASA Publication No. 9 (Part 2), series Agronomy, ASA, SSSA, Madison (WI) (1982). Quevauviller, P., Ure, A., Muntau, H., Griepink, B.: Intern. J. Environ. Anal. Chem.. 51, 129 (1993). Swiss Ordinance on Heavy Metal Contents in Soils Nr. SR 814.01 (1986). Symeonides, C., McRae, S.G.: J. Environ. Qual. 6, 120 (1977). Száková J., Tlustoš P., Pavlíková D., Balík J.: Chem. Listy 91, 580 (1997). Száková, J., Tlustoš, P., Balík J., Pavlíková, D., Balíková, M.: Sbor. Biogeochemistry of trace elements, Vídeň, 1999, 594. Száková, J., Tlustoš, P., Balík J., Pavlíkova, D., Vaněk, V.: Fresenius J. Anal. Chem 363, 594, 1999. Száková, J., Tlustoš, P., Balík, J., Pavlíková, D., Balíková, M.: Analusis 28, 808 (2000). Száková, J., Tlustoš, P., Balík, J., Pavlíková, D., Balíková, M.: Chem. Listy 95, 179 (2001). Tessier, A., Campbell, P. G. C., Bisson, M.: Anal. Chem. 51, 844 (1979). Tlustoš, P., van Dijk, D., Száková, J., Pavlíková, D.: Rostl. Výr. 40, 1107 (1994). Ure, A., Quevauviller, P., Muntau, H., Griepink, B.: BCR information EUR 14763 EN, Community Bureau of Science (1993). Ţemberyová, M., Smirnová, L.,Vačková, M.: Agrochémia 31, 282, 1991. 4.2.2. Metody postupné extrakce půdy Metody postupné extrakce byly vyvinuty s cílem přesněji definovat zastoupení prvků v jednotlivých frakcích půdy. Obvykle tyto metody zahrnují tři až sedm samostatných kroků a je tedy přirozené, ţe se jedná o metody časově náročné, vyţadující zkušený laboratorní personál a samozřejmě odpovídající instrumentální analytickou techniku. V rámci metody postupné extrakce se pouţívá řada extrakčních činidel, přičemţ kaţdé následující je buďto silnější, nebo chemicky zcela odlišné od předchozího. Selektivita jednotlivých činidel je pak ovlivněna zejména chemickými vlastnostmi zvoleného extraktantu, experimentálními parametry, sekvencí jednotlivých kroků, matričními vlivy, jako například readsorpcí prvků, a heterogenitou vzorku. Hlavay et al. (2004) shrnují nejčastější kroky metody postupné extrakce následovně: o mobilní frakce, která zahrnuje vodorozpustné a nespecificky vázané podíly prvků a rozpustné komplexy prvků s organickými látkami. Jako extraktanty se pouţívají: voda, neutrální roztoky anorganických solí (CaCl2, NaNO3), roztoky solí s upraveným pH (CH3COONH4) a slabé roztoky chelatačních činidel (DTPA, EDTA); o snadno mobilizovatelná frakce, která představuje specificky vázané podíly prvků a prvky okludované na povrchu půdních částic; o frakce vázaná na karbonáty se uvolňuje pomocí pufrů (např. acetátový pufr při pH = 4,75); o organicky vázaná frakce, kdy se podíl prvků vázaný na organickou hmotu uvolňuje oxidací, rozpuštěním nebo přídavkem kompetitivních ligandů; o frakce vázaná na oxidy manganu, která je snadno ovlivnitelná změnou fyzikálně

39

chemických podmínek půdy; o frakce vázaná na oxidy hliníku a železa, která se někdy dále rozděluje na frakci vázanou na amorfní a krystalické oxidy Al a Fe; o reziduální frakce, která reprezentuje podíly prvků pevně vázaných v krystalických mříţkách a pro její rozloţení je třeba pouţít některou z metod celkového rozkladu vzorků půdy. Extrakční postup musí být popsán následujícími parametry: pouţité extraktanty a posloupnost jednotlivých extrakčních kroků, koncentrace pouţitých chemikálií, pH extraktantu, poměr vzorku k extraktantu, doba a způsob extrakce (třepání, míchání), a nakonec teplota potřebná pro příslušnou extrakci. 4.2.2.1. Vývoj metod postupné extrakce V posledních dvaceti letech byla vyvinuta celá řada postupných extrakčních metod, protoţe mnohé laboratoře zabývající se výzkumem v této oblasti vyvíjely své vlastní metodické přístupy stanovení jednotlivých frakcí daných prvků v půdě. První metodu postupné extrakce popsali jiţ McLaren a Crawford (1973), ale nejčastěji vyuţívanou metodou je ta, kterou vyvinuli Tessier et al. (1979), kteří popsali frakcionaci vybraných kovů v sedimentech do pěti frakcí následovně: o o o o o

výměnná frakce, která představuje nejsnáze přístupné podíly prvků, frakci vázanou na karbonáty, frakci vázanou na oxidy Fe, Mn a Al, organicky vázanou frakci prvků reziduální frakci pevně vázanou na silikátovou matrici vzorku sedimentu.

Filgueiras et al. (2002) shrnuli v souborné práci několik stovek aplikací metod postupné extrakce pro frakcionaci prvků v nejrůznějších vzorcích z oblasti ţivotního prostředí, jako jsou sedimenty, půdy, čistírenské kaly, popílky, popel vzniklý spalováním pevných odpadů, městský prach apod. Tato práce ukazuje nesmírnou diverzitu postupných extrakčních postupů v případě pouţitých extrakčních činidel, konkrétních laboratorních postupů a počtu pouţitých extrakčních kroků. Některé z častěji pouţívaných metod postupné extrakce pak shrnuje tabulka 5. Autoři dále zdůrazňují, ţe jiţ malá změna experimentálních podmínek u postupných extrakčních postupů, jako je pH extrakčních činidel, doba kontaktu vzorku s činidlem, poměr vzorku k extraktantu, velikost částic analyzovaného vzorku či předchozí úprava tohoto vzorku má často za následek významné změny ve frakcionaci prvků. Tato skutečnost velmi ztěţuje srovnání výsledků z různých laboratoří, jak bylo potvrzeno mnoha výzkumníky u jednoduchých i postupných extrakcí. Vedle konvenčních extrakčních metod pak byly popsány i metody s vyšší mírou vyuţití moderních technik, jako je kontinuální průtoková extrakce, extrakce s vyuţitím mikrovlnného ohřevu či zvýšení účinnosti extrakce pouţitím ultrazvuku. Unifikací metod jednoduché a postupné extrakce a přípravou referenčních materiálů pro tyto postupy se v rámci Evropské unie dlouhá léta zabývá Ústav pro referenční materiály a měření (Institute for Reference Materials and Measurements, dříve Standards, Measurement and Testing). Postup, který je výsledkem tohoto výzkumu zahrnuje separaci extrahovatelných prvků do tří frakcí následovně: 1 g vzorku půdy se naváţí do centrifugačních zkumavek a extrahuje postupně následujícími médii:

40

1. výměnná frakce: 0,11 mol.l-1 CH3COOH v poměru 1 : 20 (w/v) po dobu 16 hodin; 2. frakce vázaná na oxidy: 0,1 mol.l-1 NH2OH.HCl v poměru 1 : 40 (w/v), pH = 2 po dobu 16 hodin; 3. frakce organicky vázaná: 8,8 mol.l-1 H2O2 v poměru 1 : 40 (w/v), po odpaření do vlhkého zbytku na teflonové horké desce při teplotě 85°C následuje extrakce 1 mol.l-1 roztokem CH3COONH4 v poměru 1 : 50 (w/v), pH = 5 po dobu 16 hodin; 4. reziduální frakce: vypočtena jako rozdíl celkového obsahu prvku a součtu předchozích frakcí. Reakční směs se po skončení kaţdého kroku centrifuguje při 3000 otáčkách po dobu 10 minut, supernatant se slije a uloţí při 6 C aţ do doby měření.

Tabulka 5. Vybrané příklady metod postupné extrakce (převzato z Filgueiras et al. 2002) Postup A B Tessier et al. MgCl2 NaOAc (1979) Elmednaoui BaCl2 NaOAcC et al. (1983) Shuman Mg(NO3)2 (1983) Salomons a NH4OAc NaOAc Förstner (1984) Miller et al. Ca(NO3)2/ HOAc/ (1985) Pb(NO3)2 Ca(NO3)2 Elliot et al. MgCl2 NaOAc (1990) Quevauviller HOAc (1993) Campanella NH4OAc et al. (1995) Sahuquillo et al. (1999)

-

HOAc

C NH2OH.HClc

Frakcea D E F NH2OH.HCl/ H2O2/ HOAc NH4OAc NH2OH.HCl/ H2O2/ HOAcD NH4OAcB NaOClB NH4Ox/HOx -

G -

NH2OH.HCl

-

NH4Ox/HOx

H2O2/ NH4OAc

-

NH2OH.HCl

K4P2O7

NH4Ox/HOx

-

NH4Ox/HOx

Na4P2O7D NH4Ox/HOxC

-

-

H2O2/ NH4OAc HClC/ NaOHD/ HNO3E H2O2/ NH4OAc

-

NH2OH.HCl

-

-

NH2OH.HCl/ HOAc

-

-

NH2OH.HCl

-

-

-

-

a

pokud se pořadí extraktantů lišilo od pořadí uvedeného v tabulce, je tento fakt vyznačen u příslušného činidla v horním indexu; Frakce: A...výměnná, B...rozpustná ve slabých kyselinách, C...snadno redukovatelná (vázaná na oxidy Mn), D...snadno oxidovatelná (vázaná na humínové kyseliny a fulvokyseliny, E...středně redukovatelná (amorfní oxidy Fe), F...oxidovatelné oxidy a hydroxidy, G...obtíţně redukovatelná (krystalické oxidy ţeleza). Reziduální frakce není v tabulce zahrnuta. HOAc…kyselina octová, HOx…kyselina šťavelová.

4.2.2.2. Příklady praktického využití metod postupné extrakce

41

Nejvyšší počet aplikací metod postupné extrakce můţeme zaznamenat v případě vzorků půd a sedimentů. Prvky vázané v sedimentech se mohou fyzikálními i chemickými reakcemi uvolňovat do vodního sloupce. V půdě jsou chemické prvky ukládány, přičemţ existuje mnoho moţností, jak tyto prvky v půdě mobilizovat. Změny některých půdních parametrů mohou významně ovlivnit chování prvků v půdě a vyvolat změny v zastoupení prvků v jednotlivých půdních frakcích. Mezi základní parametry v této souvislosti patří hodnota pH, teplota, redox potenciál, rozklad a syntéza organické hmoty v půdě, vyplavování prvků, iontová výměna a mikrobiální aktivita. Pomocí metod postupné extrakce pak získáme velmi přesné informace o frakcionaci prvků v půdě a transformacích těchto prvků mezi jednotlivými frakcemi, přičemţ můţeme hodnotit vliv fyzikálně chemických vlastností půdy, úroveň kontaminace půdy nebo dlouhodobý účinek některých agrotechnických opatření, jako je vápnění, nebo aplikace čistírenských kalů, popílku apod. Dále jsou metody postupné extrakce vhodné například pro posouzení distribuce prvků do jednotlivých půdních frakcí po experimentálním přídavku těchto prvků do půdy nebo pro hodnocení remediačního potenciálu pro jednotlivé prvky. V některých případech mohou být výsledky stanovení obsahů prvků v jednotlivých půdních frakcích rozhodujícími faktory při výběru fytoremediačního programu na konkrétní půdě. Zemědělské vyuţití kalu je nejlevnějším a současně nejsnadnějším způsobem likvidace tohoto typu odpadu. Je známo, ţe aplikace čistírenských kalů do zemědělské půdy vede ke zlepšení zásobenosti ţivin v půdě a zároveň ke zlepšení fyzikálně - chemických vlastností půdy. Je ale také známo, ţe tyto kaly se často vyznačují zvýšenými obsahy organických i anorganických polutantů včetně potenciálně toxických prvků, jako je As, Cd, Cu, Pb nebo Zn. Proto je před aplikací do půdy ověřována předúprava těchto kalů, která má imobilizovat či rozloţit přítomné toxické látky. Podobně jako je tomu v půdě, i v čistírenském kalu je stabilita vazeb toxických prvků ovlivněna řadou faktorů, mezi kterými je třeba zdůraznit původ kalu, pH, oxidačně - redukční podmínky, vlhkost a rozkladné procesy během předúpravy kalu. V nádobových vegetačních pokusech pak bylo prokázáno, ţe zvýšení celkového obsahu kadmia v půdě vlivem přídavku čistírenského kalu vede ke zvýšení obsahu rostlinou přijatelného podílu tohoto prvku. Zvláště v případech, kdy je celkový obsah rizikových prvků v půdě velmi nízký, můţe opakovaná aplikace kalu představovat riziko dlouhodobé kontaminace dané půdy. Úprava pH půdy vápněním pak můţe sníţit mobilitu sledovaných prvků a tedy i jejich přístupnost rostlinám. Je tedy zřejmé, ţe správně zvolená metoda postupné extrakce můţe být jedním z kritérií hodnocení podobných agrotechnických opatření. 4.2.2.3. Vzájemný vztah mezi jednoduchou a postupnou extrakcí půdy Na obrázku 17 byly vyneseny mediány relativních obsahů prvků uvolněných jednotlivými činidly a porovnány s mediány relativních obsahů prvků v půdních frakcích po odečtení frakce reziduální. Z obrázku je zřejmé, ţe pouze pouţití lučavky královské vedlo k uvolnění podstatné části reziduální frakce, tedy podílu prvku pevně vázaného v silikátové matrici vzorku. Kyselina dusičná pak s malým překryvem, který lze přičíst i heterogenitě půdních vzorků, uvolňuje podíly prvků odpovídající součtu mobilních frakcí. Rovněţ lineární regresní analýza prokázala zvyšující se extrahovatelnost prvků kyselinou dusičnou při sniţujícím se podílu reziduální frakce (rAs = 0,3, rCd = 0,4, rZn = 0,6). Kyselina octová jako jediný další extraktant přesahuje u všech tří prvků hranici součtu vodorozpustné a výměnné frakce a uvolňuje i podíly prvků vázané na oxidech. Je však zřejmé, ţe toto činidlo neuvolní prvky vázané na oxidech kvantitativně a bylo by proto uţitečné rozšířit metodiku postupné extrakce o rozlišení jednotlivých typů oxidů Mn a Fe.

42

V případě kadmia se rovněţ DTPA ukázala jako extraktant zasahující i do oxidové a organické frakce tohoto prvku, jak jiţ bylo zmíněno výše. Arsen Aqua Regia

81.3

HNO3

23.0

CH3 COOH

4.6

NaHCO3

0.78

H2 O

0.31

CaCl2

0.20

NaNO3

0.09

DTPA

0.08

NH4 NO3

0.05

BCR 0

%

10 vázaný na oxidy 8.2 %

výměnný 2.8 %

vodorozpustný 0.31 %

organicky vázaný 5.7 %

Kadmium HNO3

93.9

Aqua Regia

87.1

CH3 COOH

43.8

DTPA

30.9

NaHCO3

4.0

CaCl2

2.2

NH4 NO3

0.8

H2 O

0.55

NaNO3

0.34

BCR 0

20 vodorozpustné 0.54 %

40

60 vázané na oxidy 56.0 %

výměnné 16.2 %

%

80 organicky vázané 8.8 %

Zinek Agua Regia

79.8

HNO3

48.7

CH3 COOH

9.7

DTPA

4.6 0.72

CaCl2 NH4 NO3

0.60

NaHCO3

0.24

NaNO3

0.15

H2 O

0.07

BCR 0

10 vodorozpustný 0.067 %

20 výměnný 7.2 %

30 vázaný na oxidy 19.9 %

40 organicky vázaný 18.3 %

43

Obrázek 17. Mediány extrahovatelných obsahů As, Cd a Zn dle jednotlivých vyluhovadel ve srovnání s rozdělením sledovaných prvků do jednotlivých frakcí (% z celkového obsahu). Jak je zřejmé z obrázku 17, roztoky solí byly schopny uvolnit pouze malou část prvků uvolnitelných v rámci „výměnné frakce“. Lineární regresní analýzou nebyly prokázány statisticky významné korelace mezi obsahy Cd a Zn extrahovanými roztoky neutrálních solí a výměnnou frakcí těchto prvků. Uvolnitelnost Cd a Zn roztoky neutrálních solí závisí, jak jiţ bylo řečeno, zejména na půdní reakci. Při pouţití 0,11 mol.l-1 roztoku kyseliny octové k extrakci „výměnné frakce“ těchto prvků jsou rozdíly v pH půdy setřeny vysokou kyselostí extraktantu. U arsenu byly nalezeny významné korelační koeficienty u jednotlivých extraktantů ve vztahu k zastoupení As v jednotlivých frakcích v rozmezí r = 0,51 - 0,55. Extrahovatelnost arsenu je zřejmě obdobně ovlivněna komplexem fyzikálně - chemických vlastností půdy jak při pouţití jednoduchých extrakčních postupů (viz výše), tak i při postupné frakcionaci. Přesnější definování snadno rozpustných frakcí prvků pak můţe vést k lepšímu pochopení dynamiky změn zastoupení stopových prvků v jednotlivých půdních frakcích. Literatura Bordas F., Bourg A.C.M.: Water Air Soil Pollut. 103, 137 (1998). Campanella L., D´Oracio D., Petronio B.M., Pietrantonio E.: Anal. Chim. Acta 309, 387 (1995). Campos E., Barahona E., Lachica M., Mingorance M.D.: Anal. Chim. Acta 431, 209 (1998). Canet, R., Pomares, F., Tarazona, F.: Soil Use and Management 13, 117 (1997). Elliott H.A., Dempsey B.A., Maille M.J.: J. Environ. Qual. 19, 330 (1990). Elmednaoui H., Castetbon A., Astruc M.: Environ. Technol. Lett. 5, 529 (1984). Filgueiras A.V., Lavilla I., Bendicho C.: J. Environ. Monit. 4, 823 (2002). Filgueiras A.V., Lavilla I., Bendicho C.: Anal. Bioanal. Chem. 374, 103 (2002). Garcia G., Zanuzzi A., Faz A.: Biodegradation 16, 187 (2005). Gray C.W., McLaren R.G.: Commun. Soil Sci. Plant Anal. 34, 2327 (2003). Han F. X., Banin A., Kingerz W.L., Triplett G.B., Zhou L.X., Zheng S.J., Ding W.X.: Adv. Environ.Res. 8, 113 (2003). Hickey, M. G., Kittrick, J. A.: J. Environ. Qual. 13, 372 (1984). Hlavay J., Prohaska T., Weisz M., Wenzel W.W., Stingeder G.J.: Pure Appl. Chem. 76, 415 (2004) Chaudhuri D., Tripathy S., Veeresh H., Powell M.A., Hart B.R.: Environ. Geol. 44, 419 (2003). Chowdhury A.K., McLaren R.G., Cameron K.C., Swift R.S.: Commun. Soil Sci. Plant Anal. 28, 301 (1997). Chowdhury A.K., McLaren R.G., Swift R.S., Cameron K.C.: Commun. Soil Sci. Plant Anal. 23, 1451 (1992). Kaasalainen M., Yli-Halla M.: Environ. Pollut. 126, 225 (2003). Kennedy V.H., Sanchez A.L., Oughton D.H., Rowland A.P.: Analyst 122, 89R (1997). McLaren R. G., Clucas L. M. J. Environ. Qual. 30, 1968 (2001) Miller W.P., Martens D.C., Zelazny L.W., Kornegay E.T. (1986): J. Environ. Qual. 15, 69. Miller, W. P., McFee, W. W.: J. Environ. Qual. 12, 29 (1983). Nystrøm G.M., Ottosen L.M., Villumsen A.: J. Physique IV 107, 975 (2003). Pérez-Cid B., Fernández-Alborés A., Fernández-Gómez E., Falqué-López E.: Anal. Chim. Acta 431, 209 (2001)

44

Quevauviller P., Ure A., Muntau H., Griepink B.: Intern. J. Environ. Anal. Chem. 51, 129 (1993). Sahuquillo A., López-Sánchez J.F., Rubio R., Rauret G., Thomas R.P., Davidson C.M., Ure A.M.: Anal. Chim. Acta 382, 317 (1999). Salomons W., Förstner U.: Metals in the hydrocycle. Springer-Verlag, Berlin (1984). Shiowatana J., Tantidanai N., Nookabkaew S., Nacapricha D.: J. Environ. Qual. 30, 1195 (2001) Shuman L.M.: Soil Sci. Soc. Am. J. 47: 656 (1983). Száková J., Tlustoš P., Balík J., Pavlíková D., Balíková M.: Chem. Listy 95, 645 (2001). Száková J., Tlustoš P., Balík J., Pavlíková D., Vaněk V.: Fresenius J. Anal. Chem. 363, 594 (1999). Száková, J., Tlustoš, P., Balík J., Pavlíková, D., Balíková, M. Sbor. 4th International Conference on Environmental Impact Assessment, Praha, 2000, 163. Tessier A., Campbell P.G.C., Bisson M.: Anal. Chem. 51, 844 (1979). Tokalioğlu Ş., Kartal Ş., Birol G.: Turk. J. Chem. 27, 333 (2003). Zeien, H., Brümmer, G. W.: Mitteilungen Dt. Bodenkundl. Gesselsch. 66, 439, 1991.

5. Vyhodnocení a interpretace výsledků Při vyhodnocení výsledků měření je nutno definovat a vyhodnotit moţnosti analytické metody z hlediska dosahované přesnosti a správnosti. Je tedy nutná validace metody, v rámci které lze definovat a matematicky vyjádřit následující parametry: Správnost metody, která se ověřuje pouţitím vhodného referenčního materiálu a v případě, ţe vhodný materiál není k dispozici, pouţije se srovnání metody s referenční metodou nebo metoda standardního přídavku. Dalšími parametry pak jsou pracovní a lineární rozsah metody, tedy koncentrační rozsah, ve kterém dosahujeme přijatelné správnosti a přesnosti a rozsah, ve kterém pracujeme v lineární oblasti kalibrace, mez detekce, tedy nejniţší stanovitelná koncentrace prvku, mez stanovitelnosti, tedy nejniţší koncentrace stanovitelná s dostatečnou přesností a správností, přesnost, která popisuje shodu mezi vzájemně nezávislými výsledky stanovení (tedy provedenými jedním analytikem na jednom zařízení v krátkém časovém intervalu, tzv. opakovatelnost, nebo provedenými více analytiky na různých zařízeních v rozsáhlém časovém intervalu, tzv. mezilehlá přesnost).

0.050 mg.kg-1

+3 s +2 s 0,02 -2 s -3 s

0.025

0.000 1

6

11 16 21 26 31 36 41 46 51 56 pořadí analýz

45

Obrázek 18. Regulační diagram pro obsah rtuti v certifikovaném referenčním materiálu 12-02-03 Lucerne stanovený na jednoúčelovém atomovém absorpčním spektrometru AMA-254; hodnota 0,026 mg.kg-1 udává centrální linii, +2s a –2s horní a dolní varovnou mez, +3s a –3s horní a dolní regulační mez. Vhodnou metodou kontroly kvality práce laboratoře jsou pak Shewhartovy regulační diagramy, kdy analyzujeme v pravidelných intervalech vzorky se známým obsahem prvků a výsledky vyneseme do grafu v závislosti na čase. Závislost nám pak umoţní sledovat stabilitu analytického systému, kdy nás výsledky přesahující vypočtené horní a dolní varovné a regulační meze upozorňují na změny kvalitativních parametrů pouţité metody. Obrázek 18 znázorňuje příklad regulačního diagramu stanovení rtuti v referenčním materiálu s pouţitím jednoúčelového atomového absorpčního spektrometru AMA-254. Regulační diagram jasně ukazuje periodické zvyšování variability výsledků, které signalizuje v tomto konkrétním případě opotřebování a nutnost výměny katalytické trubice u tohoto přístroje. Je zřejmé, ţe analytická práce vyţaduje dobře propracovaný systém, který podmiňuje reprodukovatelnost celého pracovního postupu. Výsledky mohou být zatíţeny celou řadou chyb, které mohou vznikat v jednotlivých krocích analytického systému. Je také dokázáno, ţe chyba analýzy se zvyšuje se sniţující se koncentrační hladinou, jak dokumentuje obrázek 19.

46

Obrázek 19. Závislost relativní směrodatné odchylky (RSD) měření na koncentraci analytu (Horwitz 1982). Obrázky 20 a 21 ukazují výsledky mezilaboratorní analýzy vzorku listů pampelišky, která byla organizována v rámci programu Wageningen Evaluating Programmes for Analytical Laboratories organizovaném univerzitou ve Wageningen v Holandsku. Tohoto programu se účastní více neţ 260 laboratoří z celého světa, včetně našeho pracoviště. V případě stanovení hořčíku bylo shromáţděno od jednotlivých laboratoří 139 výsledků a většina dat se pohybovala v rámci intervalu spolehlivosti správné hodnoty, tj. 3160 mg.kg-1, nebo v jeho blízkosti. U arsenu, jehoţ celkový obsah v analyzovaném vzorku byl o čtyři řády niţší (0,287 mg.kg-1) , se podařilo shromáţdit pouze 27 výsledků, přičemţ jejich rozptyl je řádově vyšší ve srovnání s hořčíkem. Tyto výsledky dokazují, ţe chyby stanovení se zvyšují se sniţující se koncentrační hladinou analytu, přičemţ jsou nezávislé na typu analytu, matrici a metodě stanovení. I přes některé odlišnosti lze uvedené parametry analytického systému aplikovat nejen na stanovení chemických prvků a jejich sloučenin, ale i celé škály organických polutantů, se kterými se můţeme v našem ţivotním prostředí setkat. Způsobem, jak prokázat, ţe analytická laboratoř má pro daný analyt propracovaný a fungující analytický systém je její akreditace na základě poţadavků daných normou ISO/IEC 17025: 1999, v českém systému ČSN EN ISO/IEC 17025 „Všeobecné poţadavky na způsobilost zkušebních a kontrolních laboratoří”. Literatura Funk W., Dammann, B.V., Donnevert, G.: Quality Assurance in Analytical Chemistry. VCH 1995. Horwitz, W.: Anal. Chem. 54, 67A (1982). Kolektiv autorů: Atomová absorpční spektrometrie I. Základní kurz. Spektroskopická společnost Jana Marka Marci, Praha, 2003. Mestek, O., Pavlík, J., Suchánek, M.: Accred. Qual. Assur. 2, 238 (1997).

-1

600

2000

g.kg

Arsen (n=27)

400

8 12

1 14

96

0 18

57

87

68

7 15

6 17

1 26

9 16

2 10

7 24

18

2

200

Laboratoř

47

Obrázek 20. Výsledky mezilaboratorní analýzy stanovení arsenu v interním referenčním materiálu listů pampelišky IPE 142 analyzovaném v rámci programu Wageningen Evaluating Programmes for Analytical Laboratories organizovaném universitou ve Wageningen, Holandsko. Horizontální linie vytyčují intervaly spolehlivosti pro jednotlivé prvky. 4000

mg.kg-1

Hořčík (n=139)

3000

2000

59

166

187

234

4

19

64

200

14

76

43

68

112

61

51

18

261

139

32

183

1000 Laboratoř

(b) Obrázek 21. Výsledky mezilaboratorní analýzy stanovení hořčíku v interním referenčním materiálu listů pampelišky IPE 142 analyzovaném v rámci programu Wageningen Evaluating Programmes for Analytical Laboratories organizovaném universitou ve Wageningen, Holandsko. Horizontální linie vytyčují intervaly spolehlivosti pro jednotlivé prvky.

48