ÚVOD .................................................................................................................................................................................... 3 TEORETICKÁ ČÁST........................................................................................................................................................ 4 PROTEOMIKA ............................................................................................................................................................... 5 Proteom......................................................................................................................................................................5
Strategie analýzy v proteomice................................................................................................................................. 6 Stavba proteomu........................................................................................................................................................ 7 Aminokyseliny........................................................................................................................................................................ 7 Peptidy .................................................................................................................................................................................... 8
Proteiny ................................................................................................................................................................................... 8
Identifikace proteinů ................................................................................................................................................. 9
Kvantitativní analýza ..............................................................................................................................................10
NÁSTROJE ANALÝZY V PROTEOMICE .................................................................................................................. 11 Chromatografické separační metody.....................................................................................................................11
Elektromigrační separační metody ........................................................................................................................11 Elektroforéza......................................................................................................................................................................... 12
Kapilární elektroforéza ........................................................................................................................................................ 12
Kapilární elektrochromatografie ......................................................................................................................................... 14
Izotachoforéza ...................................................................................................................................................................... 14
Hmotnostní spektrometrie....................................................................................................................................... 15 Laserová desorpce a ionizace za účasti matrice ................................................................................................................. 16 Laserová desorpce a ionizace s modifikací nosiče vzorku ................................................................................................ 18
Ionizace elektrosprejem ....................................................................................................................................................... 18 Průletový analyzátor............................................................................................................................................................. 19
MS/MS (MSn)....................................................................................................................................................................... 20
Fragmentace v MALDI-TOF............................................................................................................................................... 20
Rentgenová strukturní analýza............................................................................................................................... 21
Nukleární magnetická rezonance........................................................................................................................... 22
ENZYMATICKÉ ŠTĚPENÍ.................................................................................................................................................. 23 Enzymatické štěpení v gelu a v roztoku.............................................................................................................................. 23 Trypsin .................................................................................................................................................................................. 24
Peptidové mapování ............................................................................................................................................................. 24
Enzymatické štěpení proteinů na MALDI terčíku ............................................................................................................. 25
CÍLE DIPLOMOVÉ PRÁCE.......................................................................................................................................... 27 EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST............................................................................................................................................ 28 PŘÍSTROJE A VYBAVENÍ .................................................................................................................................................29
POUŽITÉ CHEMIKÁLIE ....................................................................................................................................................30
REAKČNÍ PODMÍNKY ENZYMATICKÉHO ŠTĚPENÍ..........................................................................................................31
1
PROVEDENÍ MECHANICKÉ MODIFIKACE MALDI TERČÍKU .......................................................................................... 33
PROVEDENÍ MECHANICKÉ MODIFIKACE MALDI TERČÍKU .......................................................................................... 34 Uzavřený mikroreaktor........................................................................................................................................... 35
Uzavřený mikroreaktor s omezením velikosti kapky.............................................................................................36 Nepájivá maska..................................................................................................................................................................... 38
Modifikace terčíku pomocí PTFE ....................................................................................................................................... 39
Použití vysokovroucího rozpouštědla ....................................................................................................................42 Enzymatické štěpení po přídavku vysokovroucího rozpouštědla ..................................................................................... 43
L IMIT DETEKCE V MALDI-TOF MS.............................................................................................................................46 LOD přístroje a příspěvek rušení........................................................................................................................... 46
Příspěvek enzymatického štěpení ........................................................................................................................... 49
Příspěvek kinetiky štěpení....................................................................................................................................... 51
Závěr ........................................................................................................................................................................ 54
SPOJENÍ CE A MALDI-TOF MS S LIF DETEKCÍ PRO ANALÝZU PROTEINŮ ................................................................55 ZÁVĚR................................................................................................................................................................................ 57 SEZNAM POUŽITÝCH ZKRATEK ............................................................................................................................ 58 POUŽITÁ LITERATURA............................................................................................................................................... 60
2
ÚVOD Tato diplomová práce je součástí projektu vývoje nové instrumentace pro komplexní
analýzu proteomu. Příkladem možného uplatnění je analýza proteomu bakteriofága 812, který je
označován za vhodného kandidáta pro fágovou terapii zejména pro rod Staphylococus Aureus.
Instrumentace je založená na platformě off-line spojení kapilární elektroforézy s MALDI-TOF hmotnostní spektrometrií, kde se zpracování a detekce frakcí vzorku odehrávají na MALDI
terčíku. Separace z CE je za subatmosférického tlaku nanášena na MALDI terčík, zóny proteinů jsou detekovány pomocí laserem indukovaná nativní fluorescence a následně jsou identifikovány metodou peptidového mapování pomocí enzymatického štěpení na terčíku.
Teoretická část je proto zaměřená především na vybrané kolonové separační techniky
používané pro analýzu biomolekul, se zaměřením na CE. V oblasti hmotnostní spektrometrie je
kladen důraz zejména na MALDI-TOF MS. Zmíněny jsou i další metody využívané pro analýzu biomolekul.
Mým úkolem v projektu vývoje nové instrumentace je studium enzymatického štěpení na
terčíku a identifikace proteinů pomocí MALDI-TOF MS a peptidového mapování.
3
TEORETICKÁ ČÁST
4
P RO TE OM I K A
Proteom Termín „proteom” byl zaveden v roce 1995 Marcem R. Wilkinsem pro označení
veškerého proteinového komplementu kódovaného genomem. Název vznikl z anglické definice „PROTEin complement able to be encoded by a given genOME“ nebo „PROTEin equivalent of a genOME“1.
Komplexní výzkum proteomu zahrnuje tři základní aktivity; identifikaci veškerých
proteinů produkovaných určitou buňkou, tkání nebo organismem, definici vzájemných interakcí
těchto proteinů nezbytných pro určitou biologickou funkci, a stanovení přesné trojrozměrné
struktury proteinů klíčové pro identifikaci nízkomolekulárních ligandů, například látek, které mohou sloužit jako potencionální léčiva. Později v roce 2001 byly cíle proteomiky stanoveny
poněkud přesněji jako identifikace všech proteinů kódovaných lidským genomem (popřípadě genomy dalších, zejména tzv. modelových organismů) s následným stanovením jejich a) exprese v různých buňkách daného organismu, b) subcelulární lokalizace v různých organelách, c) post-translačních modifikací, d) vzájemných interakcí a
e) vztahu mezi strukturou a funkcí (strukturní proteomika).
V závislosti na individuálních požadavcích se proteomikou rozumí i intenzivní studium
skupiny proteinů, případně jediného proteinu se zaměřením na specifickou vlastnost.
Přestože DNA je nositelem informací o struktuře proteinu, nelze často na základě pouhé
znalosti genomu objasnit mnohé buněčné procesy. Informace uložená v genech je definována
v podstatě lineární sekvencí čtyř znaků (A, C, T, G) a je tedy jednorozměrná. Informace uložená v proteinech je mnohorozměrná, závislá na faktorech jako „alternativní splicing“ (jedna mRNA
produkuje různé proteiny), posttranslační modifikace, a konečně, správné sbalení proteinu 5
vedoucí k jednoznačné trojrozměrné struktuře definující biologii každého proteinu. Navíc je
informace uložená v genech poměrně stabilní, zatímco proteom je časově proměnný.
Koncentrace jednotlivých druhů proteinů se (na rozdíl od jejich genů) mění podle aktuálních potřeb organismu.
Zatímco lidský genom byl sekvenován během jednoho roku v několika sekvenačních
továrních halách na robotických zařízeních a DNA sekvenátorech2, je pro řešení komplexního
zadání lidské proteomiky nezbytná kombinace širokého spektra metodických přístupů od klasické chemie a biochemie proteinů až po nejnovější techniky automatického zpracování vzorků a identifikace proteinů hmotnostní spektrometrií.
Strategie analýzy v proteomice Základní metodický arsenál proteomiky představují jednak techniky pro separaci proteinů
a jejich detekci ve velmi komplexních směsích, dále techniky pro identifikaci jednotlivých proteinů a jejich přiřazení ke kódujícím DNA sekvencím. V neposlední řadě je to i bioinformatika umožňující zpracování obrovského množství takto získaných dat, jejich analýzu a
modelování biologických procesů, které reprezentují. Technika dvourozměrné gelové
elektroforézy (2D GE) stále zůstává vzhledem ke své unikátní separační účinnosti základem
mnoha proteomických projektů. Použití imobilizovaných pH gradientů do velké míry vyřešilo
problém reprodukovatelnosti prvního rozměru (IEF), i když stále přetrvávají problémy s analýzou
hydrofobních, nerozpustných proteinů, příliš malých nebo příliš velkých proteinů, příliš kyselých nebo příliš bazických proteinů, apod. U některých látek, jako jsou například malé proteiny a
peptidy, se dává přednost kolonovým technikám separace, jako je afinitní nebo iontoměničová (IEC) chromatografie, kapilární elektroforéza (CE), příp. využití několikarozměrného uspořádání (například kombinace IEC a RP-HPLC). Následuje napojení na hmotnostní spektrometrii především s měkkými ionizačními technikami (MALDI, ESI), a to jak on-line (CE-ESI, RP-
HPLC-ESI), tak off-line (nanášení na MALDI terčík), příp. jako sběr frakcí. Při použití
speciálních hmotnostních detektorů poskytující spektra s vysokým rozlišením (FT-ICR, Orbitrap)
se objevuje reálná možnost získání detailních informací pro množství proteinů a peptidů odpovídající několika tisícům molekul.
6
V zásadě existují dva základní přístupy ke komplexní analýze proteinů. První tzv. „top-
down“ metoda zahrnuje MS, příp. MS/MS analýzu celých proteinů, druhá tzv. „bottom-up“ někdy také „shotgun“ metoda využívá specifického enzymatického nebo chemického naštěpení
proteinů s následnou MS, příp. MS/MS analýzou produktů. Pro dělení je určující typ analytu v hmotnostním spektrometru, nikoliv použití separační techniky.
Stavba proteomu A minokyseliny Přestože je v přírodě známo více jak tři sta různých aminokyselin, v proteomu savců se
jich běžně vyskytuje „jen“ dvacet. Každá aminokyselina obsahuje dvě funkční skupiny, karboxylovou skupinu a aminoskupinu (kromě prolinu, který obsahuje iminovou skupinu) a
alifatický nebo aromatický zbytek, navázaný na alfa uhlíku, který dělí aminokyseliny do několika skupin (polární, nepolární, kyselé, zásadité), a také určuje funkci dané aminokyseliny
v polypeptidovém řetězci. Protože se na každém alfa uhlíku (vyjma glycinu) nacházejí čtyři různé
substituenty, vykazují aminokyseliny optickou aktivitu. Aminokyseliny přítomné v bílkovinách se vyskytují zásadně v L-formě, u některých druhů antibiotik a u mikroorganismů je možná i D-
forma. Každá aminokyselina je charakterizována nejméně dvěmi disociačními konstantami, které odpovídají disociaci karboxylové skupiny a protonaci aminoskupiny. Jejich volný náboj nabývá různých hodnot v závislosti na pH prostředí a při určitém pH (tzv. isoelektrický bod, pI) je
celkový náboj molekuly roven nule.
Kondenzační reakcí karboxylové skupiny jedné aminokyseliny a aminoskupiny druhé
aminokyseliny za odštěpení molekuly vody vzniká peptidová vazba (Obr. 1).
H 3N
O
+
-
R1
O
+
H 3N
O
+
O
-
R2
O
Obr. 1: Schéma vzniku peptidové vazby
H3N
+
C
-
R2
O
NH
O
R1
7
Peptidová vazba má částečný charakter dvojné vazby (je kratší než jednoduchá vazba, a je
rigidní a planární), čímž je znemožněna rotace na vazbě C-N, avšak vazby mezi alfa uhlíky a alfa
karboxylovou skupinou nebo alfa aminoskupinou umožňují volné otáčení postranních řetězců, ovšem jsou limitovány charakterem a velikostí postranních řetězců. Kvůli stérickému bránění převažuje antigonální konformace.
P e p t id y Peptidy jsou nízkomolekulární látky, které jsou tvořeny dvěma a více aminokyselinami
spojenými peptidovou vazbou (viz výše). Dělí se podle počtu spojených aminokyselin (oligopeptidy, polypeptidy), podle struktury (lineární, cyklické), případně podle způsobu výroby
(přírodní, syntetické). Při biosyntéze peptidů je možno jít typickou cestou (např. syntéza
glutathionu), ale nejčastěji vznikají peptidy jako produkt specifického štěpení proteinů a tato směs peptidů je označována jako proteinová mapa a je využívána k identifikaci proteinu.
Důležitým atributem každého peptidu je sekvence, čili druh a pořadí aminokyselin v jakém jsou na sebe napojeny. Při molekulové hmotnosti větší než cca deset tisíc hmotnostních jednotek se již hovoří o proteinech.
P r o te i n y Proteiny, neboli bílkoviny, jsou přírodní vysokomolekulární látky složené z aminokyselin
vzájemně spojených peptidovou vazbou a jsou součástí všech živých organismů. Molekuly
proteinů mohou vytvářet protáhlé, vláknité, ve vodě nerozpustné struktury, tzv. fibrilární
proteiny, neboli skleroproteiny (chrupavka, vlasy, rohovina,…), a kulovité, příp. elipsoidní, ve vodě rozpustné globulární proteiny, neboli sféroproteiny (enzymy, proteiny ze svalové tkáně,…).
Sekvence aminokyselin určuje tzv. primární strukturu proteinu. Různé vlastnosti
aminokyselin a jejich kombinace udávají jak prostorové záhyby aminokyselinového řetězce, z nichž je "stvořena" konečná podoba proteinu, tak i konečné vlastnosti proteinů.
8
Sekundární struktura je určena typy interakcí v jednotlivých úsecích polypeptidového
řetězce (disulfidové a vodíkové můstky, hydrofobní a iontové interakce) a je tvořena dvěma základními tvary; alfa-šroubovicí a beta-skládaným listem.
Terciární struktura udává trojrozměrný tvar polypeptidového řetězce a kvartérní struktura
určuje prostorové uspořádání dvou a více polypeptidů v jednom proteinu.
Všechna tato strukturní uspořádání pomáhají stabilizovat přirozenou konformaci proteinu,
která však snadno podléhá fyzikálním a chemickým vlivům, jako jsou změna teploty, pH, zvýšení
iontové síly a přítomnost tenzidů, solí, organických rozpouštědel, iontů těžkých kovů a dalších chemických látek. Dochází k tzv. denaturaci proteinu, což je rozložení resp. porušení sekundární a terciární struktury, přičemž primární struktura zůstává zachována. Denaturace může být
reverzibilní nebo ireverzibilní; pokud při odstranění denaturačního činidla dojde k navrácení proteinu do původního stavu (strukturou i funkcí), jedná se o renaturaci.
Identifikace proteinů Postup při identifikaci proteinů zahrnuje získání podrobnější informace o zkoumaném
proteinu (molekulová hmotnost, isoelektrický bod, apod.), což ale ke spolehlivé identifikaci zdaleka nestačí. K jednoznačné identifikaci je třeba znát buď (alespoň částečnou) sekvenci proteinu, nebo jeho otisk, tzv. fingerprint.
Dříve bylo nejpoužívanější metodou ke zjišťování sekvence peptidů a proteinů Edmanovo
odbourávání, které spočívá v postupném odštěpování aminokyselin z polypeptidového řetězce a
pomocí následné HPLC analýzy vznikajících fenylthiohydantoinových derivátů aminokyselin se stanoví N-terminální sekvence proteinu. Dnes se využívá specifického štěpení polypeptidového
řetězce enzymem, bakteriální endopeptidázou nebo chemicky s analýzou vzniklých štěpů pomocí MS, příp. MS/MS.
V zásadě existují tři různé přístupy k identifikaci proteinů, v závislosti na typu získaných
dat pomocí hmotnostní spektrometrie. Ta mohou obsahovat molekulové hmotnosti peptidů, kombinace hmotností a částečné sekvence proteinu nebo MS/MS data. Poté lze identifikovat
protein na základě databázového hledání při porovnávání hmotnostních fragmentů nebo části sekvence. Buď lze analyzovat skupinu vzniklých peptidů, nebo podrobně analyzovat alespoň jeden peptid.
9
Metoda peptidového mapování (PMF – Peptide Mass Fingerprinting) je založena na
porušení specifických peptidových vazeb v proteinu, v závislosti na použitém činidle a následné MS analýze. Produktem je směs peptidů (digest), jejíž hmotnostní spektrum vykazuje charakteristický otisk (fingerprint) daného proteinu. Porovnáním naměřených hodnot m/z
s teoretickými hodnotami m/z získanými z mezinárodních databází je možné protein identifikovat.
Při metodě sequence tag (SQT), příp. MS-tag se po specifickém štěpení pomocí MS/MS
stanoví část sekvence (alespoň tři aminokyseliny) vybraného peptidu a na základě znalosti této sekvence je možné určit původní protein.
Identifikace proteinu metodou accurate mass tag (AMT) probíhá na základě znalosti
velmi přesné hmotnosti jednoho fragmentu po specifickém štěpení proteinu. Hmotnostní spektrometr musí mít vysokou rozlišovací schopnost (např.: FT-ICR MS, Orbitrap) a pokud je přesnost stanovení hodnoty m/z ≤ 1 ppm, existuje vysoká pravděpodobnost, že této hmotnosti odpovídá právě jedna kombinace aminokyselin, a tím i jeden protein.
Kvantitativní analýza Kvantifikaci proteinů lze provádět několika způsoby v závislosti na použité metodě. Např.
při analýze gelovou elektroforézou je možné proteiny barvit stříbrem, Coomassie blue, aj., při kvantifikaci po MS detekci jsou přidávány standardy značené stabilními izotopy 2H,
18
O, nebo využity kombinované metody (ICAT, IMAC, iTRAQ™, SILAC, aj.).
13
C,
15
N,
Při obarvování proteinů pomocí Coomassie blue (CB) lze využít jak klasickou, tak
koloidní nebo horkou CB. Volba činidla pro obarvování závisí na požadované citlivosti, době odbarvování a ceny. Kvantifikace pomocí redukce dusičnanu stříbrného na kovové stříbro
poskytuje sice vysokou citlivost, ale nevýhodou je vícekrokový postup, nízký dynamický rozsah a možný výskyt komplikací při MS analýze.
Další možností je využití fluorescenčního značení (Sypro Ruby3, Sypro Orange,…), které
poskytují dobrou kvantifikaci, dynamický rozsah a také minimum kroků.
10
N ÁSTR OJE ANALÝ ZY V PROTEOM I CE
Chromatografické separační metody Chromatografické metody využívají k dělení složek směsi mnohonásobného opakovaného
vytváření rovnovážných stavů složek mezi dvěma fyzikálně odlišnými fázemi, fází stacionární (nepohyblivou), a fází mobilní (pohyblivou). Proces separace je charakterizován rovnovážnými
stavy vytvářenými na základě různých (kvantitativně i kvalitativně) fyzikálně – chemických
interakcí mezi složkou a mobilní fází, složkou a stacionární fází a také mezi mobilní a stacionární fází.
Metoda vysoce účinné kapalinové chromatografie (HPLC – High Performance Liquid
Chromatography) je standardní kolonová technika pro separaci proteinů a peptidů s vysokým
rozlišením zón. Podstatou separace je rozdílná distribuce analytů ve vzorku mezi stacionární (sorbent) a mobilní fází (eluent).
Gelová permeační chromatografie (GPC – Gel Permeation Chromatography, SEC – Size
Exclusion Chromatography) využívá mechanického dělení molekul analytů v pórech gelu na
základě jejich rozdílné velikosti (molekulové hmotnosti) a tvaru. Využívá se k preparativním separacím, ke stanovení molekulových hmotností, resp. při odstraňování nízkomolekulárních sloučenin (odsolování).
Iontově výměnná chromatografie (IEC – Ion Exchange Chromatography ) využívá
rozdílné výměnné adsorpce analytů (iontů) na povrchu iontového měniče, neboli ionexu.
Elektromigrační separační metody Elektromigrační separační metody využívají dvou elektrokinetických jevů – elektroforézy
a elektroosmózy. V prostředí obsahujícím roztok s nabitými částicemi a pevné povrchy stýkající se s roztokem, které mohou nést elektrické náboje (stěny kapiláry, povrchy přítomných částic), se vytvářejí elektrické dvojvrstvy a mezi nimi vzniká určité rovnovážné rozdělení nábojů.
11
V elektromigračních separačních metodách je na toto prostředí připojeno stejnosměrné elektrické
pole, které poruší rovnováhu v rozložení nábojů a vyvolá jejich pohyb. Principem separace složek vzorku je rozdílná rychlost jejich migrace, neboť nabité částice různých složek se v určitém prostředí liší svou elektroforetickou pohyblivostí.
E l e k tr o f o r é z a Elektroforéza spočívá v migraci elektricky nabitých částic v elektrickém poli, které je
obvykle vytvořeno vložením konstantního stejnosměrného napětí mezi dvě elektrody. V zónové
elektroforéze je prostředí mezi elektrodami tvořeno základním elektrolytem, který zajišťuje
dostatečnou elektrickou vodivost v celém systému. Vzorek je dávkován do určitého místa tohoto systému. Separace probíhá na základě rozdílných elektroforetických pohyblivostí analytů v závislosti na tom, zda se jedná o kation, anion, nebo elektroneutrální látku. Velikost částic může být různá, od jednoduchých iontů až po makromolekuly.
Vliv difuse, která se snaží vyrovnávat v celém objemu roztoku koncentrace složek, je
nutné eliminovat, např. fixací složek během separace a elektroforézu provádět ve vhodném separačním loži. Jeho uspořádání může být plošné nebo kapilární. Dvourozměrná
plošná
gelová
elektroforéza
(2D
GE)
kombinuje
dva
druhy
elektromigračních separací. Vzorek proteinů se nejdříve rozdělí isoelektrickou fokusací podle isoelektrických bodů (pI) jeho složek. V kolmém směru se pak plošnou elektroforézou
v polyakrylamidovém gelu v přítomnosti dodecylsíranu sodného (SDS-PAGE) jednotlivé bílkoviny rozdělí pouze podle molekulových hmotností, protože přídavkem tenzidu získaly všechny složky směsi stejný náboj. Tímto způsobem lze separovat velmi komplexní směsi, obsahující tisíce proteinů a porovnávat dva a více vzorků při určování proteinové exprese.
K a p i lá r n í e le k tr o f o r é z a V kapilární elektroforéze (CE – Capillary Electrophoresis) je nosičem kapilára, která je
naplněna základním elektrolytem vedoucím proud. Její konce jsou ponořeny do zásobníků
12
s elektrolytem, společně s elektrodami z inertního materiálu. Mezi elektrody se aplikuje vysoké napětí (10 – 30 kV). Doba analýzy se oproti plošnému uspořádání zkracuje zejména z těchto důvodů: •
Jouleovo teplo tvořené uvnitř kapiláry je účinně odváděno jejími stěnami, proto lze použít
•
Kapilára prochází detektorem a je prováděna on-line detekce.
•
vyšších intenzit elektrického pole.
Elektroforézu doplňuje elektroosmóza. Elektroosmotický tok má za následek pohyb
roztoku kapilárou k detektoru. Snižuje analytické časy a k detektoru unáší i částice migrující opačným směrem.
Elektroosmotický tok Stěny kapiláry z taveného křemene obsahují silanolové skupiny, které v kontaktu
s roztoky o vyšším pH disociují, čímž se vytváří záporný náboj stěny. Ke stěně je přitažena vrstva
kationtů základního elektrolytu a vzniká stabilní elektrická dvojvrstva, tzv. Sternova vrstva.
Kationty blíže středu kapiláry tvoří tzv. difusní vrstvu. Po aplikaci napětí tyto kationty migrují ke
katodě. Kationty H+ bývají silně hydratovány a jejich pohyb společně s asociovanými
molekulami vody vyvolá tok celého roztoku ke katodě. Tento jev se nazývá elektroosmóza a tok se označuje jako elektroosmotický tok (EOF – ElectroOsmotic Flow). Hodnota rychlosti může
být i taková, že unáší ke katodě i anionty. Neutrální částice se pohybují rychlostí EOF, kationty rychleji, anionty pomaleji, v závislosti na jejich elektroforetické pohyblivosti. Rychlost EOF lze přídavky vhodných činidel upravovat, příp. jej úplně obrátit.
Nejvíce využívané techniky v kapilární elektroforéze jsou CZE (Capillary Zone
Electrophoresis – kapilární zónová elektroforéza), MECC (Micellar Electrokinetic Capillary
Chromatography – micelární elektrokinetická kapilární chromatografie), CGE (Capillary Gel Electrophoresis – kapilární gelová elektroforéza), CIEF (Capillary IsoElectric Focusing –
kapilární isoelektrická fokusace). Poslední dvě jsou významnými technikami na poli separace biomolekul a v rozvoji biotechnologií léčiv.
13
K a p i lá r n í e le k tr o c h r o m a t o g r a f ie Kapilární elektrochromatografie (CEC – Capillary ElectroChromatography) kombinuje
principy kapilární elektroforézy a HPLC. Jako kolony jsou používány kapiláry plněné
mikročásticemi stacionární fáze o rozměrech 1,5 – 5 µm. K plnění kolon se používá např.
tlakového plnění suspenzí mikročástic v organickém rozpouštědle nebo v oxidu uhličitém v nadkritickém stavu, aplikace EOF, atd. Jsou používány náplňové kolony i kapilární kolony, u
nichž je stacionární fáze na vnitřním povrchu kapiláry. Pro posun mobilní fáze je využívána
aplikace stejnosměrného napětí a vyvolání elektroosmotického toku. V koloně nastává separace
na stejných principech jako v HPLC. Velkou výhodou je pístový profil EOF, který podstatně
zvyšuje účinnost separace. CEC je metoda využitelná jak pro neutrální, tak i nabité látky, od jednoduchých molekul až po makromolekuly.
I z o ta c h o f o r é z a Separace iontů v isotachoforéze (ITP – IsoTachoPhoresis) probíhá také na základě
rozdílných elektroforetických mobilit, ale je řízena vloženým proudem (narozdíl od
elektroforézy, která je řízena vloženým napětím). Roztok dělených iontů je dávkován jako rozhraní dvou rozdílných elektrolytů. První elektrolyt nacházející se před vzorkem se nazývá
vedoucí (leading) a obsahuje ionty mající náboj stejného znaménka, ale vyšší hodnotu
elektroforetické pohyblivosti než všechny separované ionty. Druhý elektrolyt nacházející se za vzorkem se nazývá uzavírající (terminating) a obsahuje ionty stejného znaménka jako dělené
ionty, ale s nižší hodnotou elektroforetické pohyblivosti než všechny dělené ionty. Každý
separovaný ion vytváří během analýzy svoji vlastní zónu. Zóny všech dělených iontů jsou uzavřeny mezi vedoucí a uzavírající elektrolyt a jsou seřazeny bezprostředně za sebou podle klesající elektroforetické pohyblivosti dělených iontů.
14
Hmotnostní spektrometrie Hmotnostní spektrometrie (MS – Mass Spectrometry) patří v širším slova smyslu mezi
separační techniky, které převádí vzorek na ionizovanou plynnou fázi a vzniklé ionty separuje podle hodnoty podílu jejich hmotnosti a náboje (m/z).
Jednotlivé kroky MS analýzy probíhají podle obecného schématu:
• • • • •
převedení vzorku do plynné fáze ionizace
extrakce, příp. urychlení iontů do hmotnostního analyzátoru
separace iontů detekce iontů
Hmotnostní spektrometrie se dělí do několika skupin, podle způsobu ionizace, separace,
atd. Při převádění vzorku do plynné fáze rozhoduje počáteční skupenství vzorku. Pro plynný vzorek je potřeba pouze odstranit nosný plyn, u kapalných vzorků se využívá sprejových technik
a pro pevné vzorky je většinou využívána laserová desorpce. Při ionizaci vzorku se rozlišuje „tvrdá“ a „měkká“ ionizace, kdy u měkké ionizace nedochází k významné fragmentaci analytu, a
proto může být vhodná pro analýzu velkých molekul, jako jsou proteiny, polysacharidy, nukleové kyseliny, apod.
Mezi tvrdé ionizační techniky patří elektronová ionizace (EI – Electron Impact), ionizace
elektrickým polem (FI – Field Ionization), laserová ionizace (LDI – Laser Desorption\Ionization)
a další.
Z měkkých ionizačních technik lze zmínit chemickou ionizaci (CI – Chemical Ionization),
sprejové techniky jako termosprej (TSI – ThermoSpray Ionization), elektrosprej (ESI – ElectroSpray Ionization)), bombardování urychlenými atomy nebo ionty (FAB – Fast Atom Bombardment, FIB – Fast Ion Bombardment), ionizaci sekundárními ionty (SIMS – Secondary
Ion Mass Spectrometry) aj.
Dnes spolu s ESI pravděpodobně nejvyužívanější technika měkké ionizace je laserová
desorpce a ionizace za účasti matrice (MALDI – Matrix-Assisted Laser Desorption\Ionization),
15
která k ionizaci využívá nízkomolekulárních organických látek k přednostní absorpci laserového záření a následnému přenosu převážně jednotkového náboje na analyt.
Před vstupem do hmotnostního analyzátoru jsou ionty elektrickým polem urychleny a
zaostřeny pomocí iontové optiky.
Hmotnostní analyzátory, neboli separátory slouží k disperzi nebo filtraci iontů podle
hodnot m/z, případně podle kinetické energie a mohou obecně pracovat ve dvojím módu. Buďto
snímají hmotnostní spektra periodicky v čase, nebo sledují intenzitu jednoho nebo několika vhodně zvolených iontových druhů v čase, tedy jako selektivní detektor. Podle způsobu separace iontů se hmotnostní analyzátory dělí na:
• • • • •
magnetický analyzátor (B)
kvadrupólový filtr (Q)
iontovou past (IT)
průletový analyzátor (TOF)
analyzátor využívající iontovou cyklotronovou rezonanci (ICR)
L a s e r o v á d e s o r p c e a i o n iz a c e z a ú č a s t i m a t r i c e Technika laserové desorpce a ionizace za účasti matrice (MALDI – Matrix-Assisted Laser
Desorption\Ionization) byla poprvé popsána v roce 1987 Michaelem Karasem a Franzem Hillenkampem.4 Japonský vědec Koichi Tanaka následně poprvé využil této ionizační techniky
ke stanovení bioorganických molekul s hmotností vyšší než 10 kDa,5 za což mu byla spolu
s Johnem Fennem udělena v roce 2002 Nobelova cena za vývoj měkké ionizační techniky pro analýzu biologickým makromolekul pomocí hmotnostní spektrometrie. Proces MALDI zahrnuje tři kroky:
•
Vytvoření směsných krystalů analytu a matrice – v důsledku vysokého přebytku matrice
•
Excitaci matrice – jakmile je laserový puls zaostřen na místo s krystaly analytu a matrice,
jsou molekuly analytu od sebe izolovány, což vede k vytvoření „pevného roztoku“.
většinu laserového záření absorbují chromofory matrice, čímž dochází k její rychlé
desorpci. Ta s sebou strhává i molekuly analytu, který se odpaří a ochladí dříve, než se rozloží.
16
•
Ionizaci analytu – vzhledem ke kyselé povaze matrice je analyt ionizován především přenosem protonu: MH+ + ABCD → ABCDH+ + M +
+
(M je MALDI matrice)
Je možný i přenos kationtu (např. Na , K ), obvykle v případech nedostatečně
odsolených vzorků.
Ionty jsou poté pomocí elektrického pole extrahovány do hmotnostního separátoru,
kterým je nejčastěji průletový analyzátor (TOF – Time-Of-Flight). Jako matrice se používají zejména organické kyseliny (Obr. 2), které vyhovují podmínce absorpce při vlnové délce použitého laseru (obvykle 337 nm).
Obr. 2: Běžně využívané matrice v MALDI
a) α-kyano-4-hydroxyskořicová kyselina (CHC) b) 2,5-dihydroxybenzoová kyselina (DHB)
c) 3,4-dimethoxy-4-hydroxyskořicová kyselina (DHC) d) 4-hydroxy-3-methoxyskořicová kyselina (MHC)
17
L a s e r o v á d e s o r p c e a i o n iz a c e s m o d i f i k a c í n o s i č e v z o r k u Pro analýzu komplexních směsí proteinů je využitelná i modifikace MALDI techniky, tzv.
SELDI (Surface-Enhanced Laser Desorption\Ionization). Ta je založena na principu úpravy
povrchu nosiče vzorku, a to ve smyslu tvorby chemicky aktivní (hydrofilní, hydrofobní, normální fáze, kationtové, aniontové) nebo biologicky aktivní (protilátka, antigen, DNA, enzym, receptor) vrstvy o průměru 1 – 2 mm. Různorodost těchto povrchů dovoluje selektivně zachytit proteiny
s nejvyšší afinitou k dané struktuře povrchu. Rozpuštěné směsi jsou nanášeny v malých dávkách a proteiny s dostatečnou afinitou jsou selektivně vázány. Následuje série několika promytí, kdy
nespecificky nebo slabě vázané proteiny jsou odstraněny a specificky vázané proteiny jsou desorbovány laserem a analyzovány. Vzhledem k tomu, že pro analýzu jedné směsi se využívá více specifických interakcí, výsledkem SELDI analýzy pro každou interakci je specifický vzor,
neboli otisk, který neumožňuje přímou identifikaci proteinů, ale poskytuje porovnání mezi
jednotlivými vzorky. Analýza se uplatňuje při klinických studiích normálních a patogenních proteomů při léčbě leukémie6 či rakoviny7.
I o n iz a c e e le k t r o s p r e j e m Ionizace
elektrosprejem
(ESI
–
ElectroSpray
Ionization)
je
spolu
s MALDI
nejpoužívanější technikou měkké ionizace v hmotnostní spektrometrii. Objev ESI se připisuje Malcomovi Dole, který v 60. letech 20. století poprvé demonstroval využití elektrospreje
k ionizaci bez poškození molekuly. O dvacet let později byla publikována práce Johna Fenna, který se svými spolupracovníky v laboratoři úspěšně využil ESI k měkké ionizaci netěkavých,
termálně labilních, vysokomolekulárních biologických látek a jejich následné analýze pomocí MS.8 Tato práce později vedla k udělení Nobelovy ceny za chemii v roce 2002.
Základní uspořádání elektrospreje lze popsat následovně. Vzorek je zaváděn ve formě
roztoku, ať prostou infúzí, anebo častěji jako tok eluentu z kapalinové chromatografie. Roztok
vzorku protéká kapilárou, na jejíž konec je pomocí kapalinového spojení, přídavné kapaliny nebo pokoveného hrotu kapiláry přiváděno elektrické napětí (typicky 2,5 až 5 kV). Opačný pól se
18
nachází na elektrodě s otvorem, která slouží jako vstup do hmotnostního spektrometru. Působením elektrického pole dochází ke zvýšení koncentrace kladného náboje a tvorbě tzv. Taylorova kužele. Emitované kapky analytu a rozpouštědla z kapiláry získají povrchový náboj se
stejnou polaritou jako je náboj na hrotu kapiláry a pohybují se ke vstupnímu otvoru protější elektrody. V průběhu letu dochází v protiproudu sušícího plynu k postupnému vypařování rozpouštědla, čímž se objem kapky postupně snižuje a zároveň se zvyšuje hustota povrchového
náboje až do tzv. Rayleighovy limitní fáze, kdy se kapka vlivem odpuzování souhlasných nábojů asymetricky rozpadá na menší kapky. Tento proces se opakuje, dokud se v kapce nenachází (převážně vícenásobně) nabitá molekula analytu, která prochází vstupním otvorem štěrbiny diferenciálně pumpovaných komor do hmotnostního analyzátoru.
P r ů le t o v ý a n a l y z á t o r Průletový analyzátor (TOF – Time-Of-Flight) využívá k separaci rozdílné rychlosti iontů
v závislosti na poměru m/z. Jedná se o pulsní hmotnostní analyzátor; nejdříve jsou pulsem
extrakčního napětí ionty urychleny na vstupu do analyzátorové trubice, získaná kinetická energie
je dána rozdílem elektrického napětí ve zdroji. Hlavní výhodou je schopnost detekce molekul bez teoretického limitu m/z (prakticky cca 106 Da) a krátká doba záznamu spektra. Vysoká citlivost je
dána extrakcí výrazné většiny iontů nacházejících se v iontovém zdroji a jejich transmisí k detektoru.
Pro zvýšení rozlišení se využívá dvou konstrukčních prvků, které přispívají k zúžení
disperze kinetické energie iontů. Použití tzv. iontového zrcadla, neboli reflektoru, slouží ke kompenzaci různých kinetických energií pro ionty se stejnou hodnotou m/z. Ionty s větší
kinetickou energií proniknou hlouběji do odrazového elektrického pole reflektoru, čímž dojde
k jejich opoždění oproti iontům s nižší kinetickou energií a tím i k vyrovnání celkové doby
strávené v letové trubici, protože hloubka průniku iontů do elektrického pole reflektoru je přímo
úměrná pouze jejich kinetické energii a nezávisí na hodnotě m/z. Druhým prvkem pro zvýšení
rozlišení je pulsní (zpožděná) extrakce, která koriguje nerovnoměrnou disperzi počátečních kinetických energií iontů. Po laserovém pulsu je aplikováno nulové extrakční napětí po dobu cca
100 až 1000 ns. Během tohoto zpoždění se distribuce iontů v iontovém zdroji změní tak, že ionty 19
o stejném m/z, ale s vyšší kinetickou energií se budou nacházet dále od nosiče vzorku než ionty
s nižší kinetickou energií. Následnou aplikací extrakčního napětí dojde k vyrovnání distribuce počátečních kinetických energií pro ionty o stejné m/z. Nevýhodou zpožděné extrakce je
funkčnost pouze ve vymezeném, předem zvoleném, intervalu m/z.
MS/MS ( MSn) Tandemová spojení dvou nebo více hmotnostních analyzátorů jsou určena ke studiu
fragmentace iontů. Podstatou je selekce prekursoru (ion určený k fragmentaci) v iontovém zdroji,
následuje extrakce studovaného iontu do fragmentační cely, kde dochází ke kolizím s molekulami
plynu, a analýza dceřiných iontů (produktů) pomocí druhého hmotnostního analyzátoru. MS/MS lze provádět buď v prostoru, kdy je potřebná fyzická přítomnost dalšího hmotnostního analyzátoru (QqQ, Q-TOF, TOF-TOF, EBE-Q, EBE-TOF), nebo v čase pomocí iontové pasti (LIT – Linear Ion Trap), FT-ICR (Fourier Transform – Ion Cyclotron Resonance). MS/MS, příp.
MSn u iontové pasti funguje na principu vypuzování všech nepotřebných iontů vyjma prekursoru,
který se podrobí aktivačním kolizím s plynem a dalším vypuzováním iontů jsou proměřeny produkty, příp. provedena selekce dalšího prekursoru. Bylo demonstrováno až MS10, ale v praxi se uplatňuje MS2 – MS3 z důvodu klesajícího výtěžku iontů.
F r a g m e n ta c e v M A L D I - T O F Fragmentace v MALDI-TOF slouží k získávání informací o struktuře analytu a k analýze
směsí jako v případě tandemové hmotnostní spektrometrie (selekce prekursoru, fragmentace,
analýza produktů). Jedná se však o tzv. pseudo MS/MS, protože k fragmentaci nedochází
v kolizní cele v důsledku srážek s molekulami kolizního plynu, ale v důsledku vyšší počáteční excitace laserem.
20
Fragmentace za iontovým zdrojem Při fragmentaci za iontovým zdrojem (PSD – Post-Source Decay) v MALDI-TOF je
energie laseru zvýšena tak, aby došlo k rozpadu molekuly v průběhu letu. Prekursor je vybrán pomocí iontového selektoru (IG – Ion Gate), což je zařízení vhodně umístěné za iontový zdroj, na které je přiváděno napětí vychylující všechny ionty směrem od detektoru. Pouze v okamžiku, kdy
iontovým selektorem prolétá rodičovský ion, je napětí vypnuto a zvolený ion pokračuje k detektoru. Během letu se rozpadá a jeho kinetická energie se rozdělí mezi dceřiné ionty
v poměru k jejich hmotnosti. K separaci dochází v reflektoru na základě různých kinetických energií a ionty dopadají na detektor v čase, který je funkcí jejich hodnoty m/z.
V důsledku omezené rozlišovací schopnosti iontového selektoru je metoda vhodná jen
v případě prekursorů s relativně velkými rozdíly molekulových hmotností. Fragmentace v iontovém zdroji
Na rozdíl od fragmentace za iontovým zdrojem, které vyžaduje reflektor, vyžaduje
fragmentace v iontovém zdroji (ISD – In-Source Decay) pouze zpožděnou extrakci pro
prodloužení pobytu vznikajících iontů v iontovém zdroji a k dosažení dostatečné intenzity
spekter. Z praktického hlediska je ISD metoda zřídka použitelná, protože vyžaduje dokonalou separaci analytu před vlastní ionizací.
Rentgenová strukturní analýza Rentgenové záření se rozptyluje na atomech a iontech prvků a interferuje na možných
myšlených rovinách krystalu. Vzniklý difraktogram, který je charakteristický pro každou krystalickou sloučeninu slouží k objasnění struktury, případně k identifikaci látek. Znalost struktury nesmírně složitých komplexů má pro pochopení procesů odehrávajících se
v biologických systémech základní význam a proto se proteinová krystalografie stala nezbytnou součástí molekulární biologie a biotechnologických aplikací. Proteinová krystalografie dovede
v současné době popsat nejen molekulární strukturu a dynamiku, ale umožňuje i velmi přesný 21
odhad slabých mezimolekulárních interakcí v makromolekulárních systémech (hydrofobní síly, hydratace, vodíkové můstky), které rozhodují o jejich struktuře a funkci. V návaznosti na
zlepšující se dostupnost zdrojů synchrotronového záření, propojení s metodami molekulárního modelování a s technikami využívajícími nukleární magnetické rezonance, představuje
rentgenová strukturní analýza v současné době efektivní nástroj pro studium struktury a funkce biologických systémů na molekulární úrovni.
Nukleární magnetická rezonance Spektrometrie pomocí nukleární magnetické rezonance (NMR – Nuclear Magnetic
Resonance) může být považována za metodu komplementární k rentgenové difrakci. Jejím cílem
je především doplnit chybějící údaje k úplnému popisu struktury a dynamiky krystalických a
vysoce organizovaných systémů. Díky tomu je možné popsat strukturu a trojrozměrné uspořádání i u takových látek, které jen velmi neochotně poskytují krystaly vhodné k rentgenové difrakci,
které jsou nerozpustné anebo poskytují pouze velmi zředěné roztoky. Existuje řada fyzikálních
veličin sledovaných metodou NMR citlivých na rychlost a amplitudu vnitřních pohybů sloučenin, a právě NMR spektroskopie podává komplexní informace o vnitřní struktuře a uspořádání hmoty.
Zatímco difrakční techniky neposkytují dostatečnou citlivost k atomům vodíku, protože má kolem sebe jen malou elektronovou hustotu, NMR experimenty jsou k přítomnosti vodíku 1H
velmi citlivé.
22
E N ZY M A T IC KÉ Š T ĚPEN Í Enzymatické štěpení neboli trávení (digestion, enzymatic cleavage) je druhem
specifického štěpení využívaného při analýze proteinů. Jedná se o specifické porušení peptidové vazby, v závislosti na použitém enzymu. Produktem je směs peptidů (digest), která vykazuje charakteristický
peptidový
„otisk“ (fingerprint) daného proteinu. Obliba
enzymatického štěpení u analýz proteinů tkví v přesunu hmotností z oblasti vysokých hodnot m/z do oblasti nízkých hodnot m/z. Zde jsou parametry hmotnostních spektrometrů výrazně lepší (rozlišení, citlivost, přesnost a správnost stanovení m/z) a izotopová obálka píků je užší.
Užití proteolytických enzymů pro peptidové mapování je velmi časté, nicméně
optimální podmínky štěpení jsou obvykle stanoveny individuálně. Existuje celá řada využívaných enzymů (lysin, chymotrypsin, papain, aj.), ale nejčastěji používaným enzymem
je trypsin. Jeho specifita spočívá ve štěpení na C-konci lysinu nebo argininu, pokud nesousedí
s prolinem (toto omezení nemá obecnou platnost, někdy lze pozorovat velmi pomalé štěpení této vazby) v alkalickém prostředí o pH ≈ 7-9.
V ideálním případě je enzymatické štěpení specifické a úplné. V praxi však dochází i
ke vzniku peptidů s nerozštěpenými místy (tzv. „missed cleavage“). Dále se ve spektru se
mohou objevit nadbytečné píky v důsledku autolýzy trypsinu, neselektivního štěpení, přítomností nečistot, post-translační modifikace (PTM – Post-Translation Modification), aj.
nebo naopak některé píky chybějí (adsorpce peptidů, vzájemné rušení peptidů, nedostatečné rozštěpení proteinu, PTM, atd.).
E n z y m a t i c ké š t ě p e n í v g e l u a v r o z t o k u Enzymatické štěpení v gelu je většinou využíváno po separaci z 2D GE. Ukotvení
proteinu v gelu má své výhody, při modifikacích proteinu, při promývání, ale je zároveň
hlavní nevýhodou. Póry gelu znesnadňují přístup enzymu k proteinu, štěpení probíhá většinou po delší dobu a v přebytku enzymu a po naštěpení je nutné vzniklé fragmenty z gelu
extrahovat, většinou opakovanými přídavky acetonitrilu. Tyto faktory mohou negativně
ovlivnit celkovou výtěžnost, a proto je obecný zájem optimalizovat standardní postup při štěpení v gelu.9
Při štěpení v roztoku není protein nikde ukotven, a proto je volně přístupný pro enzym.
Enzym nemusí být v nadbytku, produkty není nutné extrahovat, autolýza trypsinu je výrazně
nižší. Mohou se však objevit komplikace při snaze modifikovat protein, kdy přidaná činidla zůstávají s analytem v roztoku.
Trypsin Trypsin se řadí mezi skupinu proteolytických enzymů označovaných jako serinové
proteasy. Charakterizuje je přítomnost extrémně reaktivního serinového zbytku, který je zodpovědný za jejich enzymovou aktivitu. Struktura trypsinu byla objasněna v roce 1967 rentgenovou krystalografií. Spolu s chymotrypsinem a elastasou patří do skupiny trávicích
enzymů, označovaných jako endopeptidasy. Jsou syntetizovány pankreatickými buňkami jako
proenzymy, které je potřeba aktivovat prostřednictvím enteropeptidasy za specifického odštěpení N-terminálního hexapeptidu (H3N-Val-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys). Tím se změní
konformace molekuly, obnaží se aktivní centrum a trypsin, schopný další aktivace sám sebe, tzv. autokatalýzy, se stává aktivním.
Tři výše uvedené endopeptidasy při štěpení proteinů katalyzují hydrolýzu peptidových
vazeb s různou specifitou závislou na postraních řetězcích.
Přestože trypsin a chymotrypsin obsahují shodné sekvence, jejich substrátová specifita
se liší v důsledku rozdílných vazebných míst. V chymotrypsinu je vazebné místo pokryté hydrofobními skupinami, u trypsinu se nachází záporně nabitý řetězec kyseliny asparagové.
Peptidové mapován í Analýzou na MALDI-TOF MS je získáno hmotnostní spektrum fragmentů
enzymatického štěpení. V případě trávení pomocí trypsinu je získáno spektrum s fragmenty peptidů s hodnotou m/z převážně v rozmezí 800 – 3500 Da, které jsou specifické pro daný
protein. V mezinárodních databázích se nacházejí sekvence proteinů, které lze pomocí
různých komerčních nebo volně dostupných programů teoreticky rozštěpit a porovnat s naměřenými hodnotami, což může vést k identifikaci proteinů. Pro všechny je společný
24
způsob hledání na základě několika parametrů. V každém případě musí být zadány hmotnosti
jednotlivých peptidových fragmentů nalezených v hmotnostním spektru a typ použitého enzymu. Dále je potřeba určit toleranci m/z, která určuje možnou odchylku hodnoty m/z od
teoretické hodnoty a výrazně ovlivňuje výsledek hledání. Pokud jsou známy podrobnější informace o štěpeném proteinu, lze zúžit počet kandidátů, např. zadáním rozmezí molekulových hmotností proteinu a/nebo pI proteinu, možných modifikacích proteinu, typ
použitého hmotnostního spektrometru. Dále je možno zadat počet míst, která nebyla
rozštěpena; obvykle se udává jedno, maximálně dvě, protože výrazně vzroste počet hmotností, které by mohli odpovídat specifickému štěpu proteinu a tím snížit relevanci
výsledku. Výsledkem databázového hledání je seznam kandidátů proteinů, které by mohly odpovídat původnímu proteinu. Každý výsledek je charakterizován nejméně třemi číselnými parametry, MOWSE skóre, poměr nalezených m/z ku zadaným m/z peptidů a procento pokrytí
sekvence (SQ – Sequence coverage). Platí, že čím jsou tato čísla vyšší, tím vyšší je
pravděpodobnost správné identifikace proteinu. Procentuální pokrytí sekvence proteinu
zahrnuje sekvenci nalezených peptidových fragmentů do celkové sekvence proteinu. Jinak řečeno, určuje procento pokrytí všech aminokyselin v proteinu na základě znalostí hmotností jednotlivých specifických peptidů. Příklady
volně
dostupných
databází
a programů
využitelných
pro
PMF:
MS-Fit-ProteinProspector10, MASCOT11, PeptideSearch12, MassSearch13, Pep-Ident14, Pro-
Found15, pepMAPPER16, aj.
E n z y m a t i c ké š t ě p e n í p r o t e i n ů n a M A L D I t e r č í k u Spojení separační techniky (CE) s detekční technikou MALDI MS je běžně
realizováno jako sběr frakcí CE eluátu do vialek. Eluát je také možno nanést přímo na
MALDI terčík, buď ve formě kontinuální stopy, nebo jako diskrétní, oddělené frakce.17, 18, 19 Při off-line spojení pak běžný postup detekce zahrnuje buď nanesení eluátu na terčík s předem
nanesenou matricí, nebo nanesení matrice přes jednotlivé frakce vzorku, a analýzu pomocí MS, příp. MS/MS. V důsledku přidání matrice ke vzorku je znesnadněno enzymatické štěpení pomocí trypsinu, který vyžaduje alkalické pH. Navrhli jsme proto detekci proteinů ve frakcích
pomocí laserem indukované nativní fluorescence (LIF – Laser-Induced Fluorescence) a proteinů. V nepřítomnosti fluoreskující MALDI matrice je možné provést enzymatické štěpení přímo na terčíku, kdy na základě předchozí detekce pomocí LIF jsou vybrané proteiny
25
rozštěpeny. Štěpení probíhá ve vodném roztoku s přídavkem slabě alkalického pufru (typicky
NH4HCO3); vzhledem k malým objemům je třeba zajistit nevysychání roztoku. Z literatury
jsou známy různé postupy při zajišťování vhodných podmínek, např. průběžné přidávání kapky pufru,20 doba štěpení odpovídající době odpaření rozpouštědla,21 použití trypsinem
pokrytých „nanovialek“ přímo na MALDI terčíku s dobou štěpení řádově v minutách,22 nebo
štěpení prováděné v boxu, ve kterém je přítomna voda a její nasycená pára, čímž dochází ke snižování rychlosti vypařování vzorku.23
Pro jednoduché postupy však nejsou uvedeny detailní reakční podmínky, složitější
postupy (nanovialky) nejsou kompatibilní s naším rozhraním CE-MALDI-TOF MS a k jeho provedení též chybí potřebná instrumentace.
26
CÍLE DIPLOMOVÉ PRÁCE Jak bylo výše uvedeno, enzymatické štěpení se spolu s MALDI-TOF hmotnostní
spektrometrií a peptidovým mapováním řadí k významným nástrojům využívaným při
identifikaci proteinů. Tato diplomová práce je součástí komplexního projektu analýzy
proteomu bakteriofága 812 pomocí off-line spojení CE a MALDI-TOF MS. Práce je
zaměřena na studium enzymatického (tryptického) štěpení proteinů v malých objemech
roztoku. Enzymatické štěpení je třeba prozkoumat z hlediska využití při analýze proteinů na MALDI destičce, což obnáší zajištění vhodných reakčních podmínek a porovnání s reakcí provedenou v makroměřítku (> 100 µl). Práce navazuje na diplomovou práci Jaromíry
Novákové, která ověřila proveditelnost enzymatického štěpení v mikroměřítku na MALDI terčíku a za přítomnosti MALDI matrice.
Vzhledem k tomu, že trávení pomocí trypsinu probíhá za zvýšené teploty, je důležité
zajistit, aby po celou dobu štěpení roztok vzorku na terčíku nevyschnul. Díky lokalizaci zón
proteinů na MALDI terčíku pomocí laserem indukované nativní fluorescenční detekce
z pevné fáze není nutný přídavek MALDI matrice, který může komplikovat proveditelnost štěpení probíhajícího pouze za zvýšeného pH.
Jedním z předmětů studia je vyzkoušení upraveného terčíku s pevně vymezeným
místem pro kapku roztoku pomocí hydrofilně-hydrofobního rozhraní. Součástí práce je proto i výroba upravené destičky.
Další zkoumanou alternativou je štěpení v roztoku se sníženou těkavostí, v práci tedy
bude ověřena možnost enzymatického štěpení ve vodných roztocích s přídavkem vysokovroucího rozpouštědla.
Pro úspěšné využití celkového konceptu zahrnujícího separaci CE, lokalizaci zón
proteinu, enzymatické štěpení na terčíku a následující identifikaci peptidovým mapováním
MALDI-TOF MS při analýze reálných vzorků je třeba zjistit nejnižší množství proteinu, které lze spolehlivě identifikovat.
27
EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST
28
PŘÍS T R OJ E A VY BA VE N Í Hmotnostní spektrometr MALDI-TOF, Axima CFR, Kratos Analytical Shimadzu Corporation
(Velká Británie). Dusíkový laser 337 nm, relativní jednotky výkonu (0 až 180), maximu
odpovídá výkon 6 mW při frekvenci 10 Hz. Software: Kratos Analytical Launchpad ver. 2. 2. 1.
Termostat KEVA, Ing. Pavel Krásenský, Katedra analytické chemie PřF MU (Česká Republika), rozsah teplot 30 – 75 °C, umožňuje zahřívání vialek nebo MALDI terčíku. pH-metr Orion 720A (USA). Ke zpracování výsledků byl použit software MS Excel 2000, Microsoft (USA).
29
PO UŽ IT É CH EM IK Á L IE Acetonitril, C2H3N, ACN, 99.99% (Scharlau, Německo).
Adrenokortikotropní hormon fragment 18 – 39, ACTH, 99 %, MR = 2464,1 g.mol -1 (SigmaAldrich, Německo).
Amoniak, NH3, 25% (POCh, Polsko).
Angiotensin lidský, 97 %, MR = 1295,6 g.mol -1 (Sigma-Aldrich, Německo).
Bradykinin, 99 %, MR = 1059,5 g.mol -1 (Sigma-Aldrich, Německo).
Hovězí sérový albumin, BSA, MR ~ 66 430 g.mol -1 (Sigma-Aldrich, Německo). Hydrogenuhličitan amonný, NH4HCO3, 99% (Sigma-Aldrich, Německo). Kyselina trifluorooctová, CF3COOH, 99 % (Sigma-Aldrich, Německo).
Kyselina α-kyano-4-hydroxyskořicová, CHC, MR = 189,2 g.mol -1 (Sigma-Aldrich, Německo). Redestilovaná voda z křemenné aparatury (Heraeus, Německo).
Renin substrát tetradekapeptid, 96 %, MR = 1758,9 g.mol -1 (Sigma-Aldrich, Německo).
Trypsin hovězí, specifická aktivita 10 100 jednotek.mg-1 (Sigma-Aldrich, Německo).
Trypsin vepřový, specifická aktivita >5000 jednotek.mg-1 (Promega, USA).
30
R EA K ČN Í PO DMÍ NK Y ENZY M A T IC KÉ HO Š T ĚPE NÍ
V literatuře existuje řada návodů pro enzymatické štěpení proteinů. Jednotlivé postupy
se liší zejména poměrem enzymu k substrátu a výběrem vhodných reakčních podmínek.24 Přestože se tyto práce věnují převážně problematice štěpení v gelu, je možno aplikovat některé podmínky i pro štěpení v roztoku. Mezi hlavní parametry ovlivňující štěpení patří
teplota a doba enzymatického štěpení. Současným trendem je co nejkratší doba analýzy, proto se objevily postupy s poměrně krátkou dobou štěpení za zvýšené teploty.25 Nevýhodou
štěpení za vysoké teploty je možná denaturace enzymu, kdy vlivem porušení sekundární a terciární struktury dochází ke ztrátě jeho funkce. Trávení může probíhat v roztocích s obsahem organického rozpouštědla i nad 50 %, jde převážně o acetonitril (ACN), který
napomáhá kratším časům při štěpení a přispívá ke zlepšení kokrystalizace analytu s matricí.26 Před samotným štěpením je vhodné substrát denaturovat (většinou 6 M roztokem močoviny) a
modifikovat „rozbalením“ jeho terciární struktury redukcí disulfidických můstků (-S-S-) na –
SH skupiny pomocí redukčního činidla (nejčastěji DTT) s následnou alkylací –SH skupin, což zajišťuje lepší přístup enzymu k substrátu. Důležitým faktem je pH, optimální rozmezí pH při
štěpení trypsinem je 7 – 9. Jsou popsány i přídavky surfaktantů, které podstatně ovlivňují
celkovou dobu štěpení, a přitom nesnižují enzymovou aktivitu a neruší při MS analýze.27 V současnosti je enzymatické štěpení jedním z nejvýznamnějších faktorů omezujících meze detekce proteinů pomocí MS, a tím i identifikaci proteinů. Se snižující se koncentrací proteinu se při zachování poměru enzym-substrát doba štěpení neúnosně prodlužuje. Do jisté míry je možné zvýšit koncentraci enzymu, ale vysoký poměr enzym-protein může vést k dominanci
produktů autolýzy enzymu ve spektru a jiným komplikacím (nespecifické štěpení, výměnné interakce mezi disulfidickými můstky). Tyto enzymové fragmenty mohou potom rušit i
původní signál analytu. Alternativní řešení může být použití imobilizovaného trypsinu přichyceného na vnitřním povrchu kapiláry.28,29 Ale i zde dochází k problémům zejména u vzorků s vysokým obsahem solí.
Na základě těchto informací a předchozí práce30 jsme se rozhodli pro následující návrh
experimentu. Jako modelový protein byl použit hovězí albumin (BSA – Bovine Serum Albumin), díky jeho vysoké relativní hmotnosti cca 66 000 a tím i počtu specifických
fragmentů, které poskytuje po štěpení. Teplota byla zvolena 40 °C a doba štěpení 2 hodiny. 31
Štěpení bylo prováděno na terčíku pomocí uzavřeného mikroreaktoru a hmotnostní poměr protein : enzym byl 10:1. Modifikace proteinu (denaturace, redukce a alkylace) nebyly prováděny, protože by analýzy byly komplikovanější a v závěru půjde o vzájemné srovnání
experimentů. Lze předpokládat, že modifikace budou zahrnuty v konečné fázi experimentu. Při trávení byl použit amonný pufr zajišťující alkalické prostředí (pH ~ 9). Pro MALDI-TOF MS analýzu byl vždy připraven čerstvý roztok 60 mM matrice CHC v jednom dílu ACN a
v jednom dílu 0,1 % TFA. Pokud není uvedeno jinak, přídavek kyselého roztoku matrice do reakční směsi sloužil také k zastavení reakce.
Trypsin byl vybrán na základě výsledku MALDI-TOF MS digestu BSA, porovnávající
trávení trypsinem zakoupeným od firmy Sigma a Promega (Obr. 3).
Na dva spoty na MALDI terčíku byl nanesen 1 µl BSA o koncentraci 0,1 mg.ml -1.
Následně byl k jednomu přidán 1 µl trypsinu od firmy Sigma a k druhému 1 µl trypsinu od
firmy Promega, o koncentraci 0,01 mg.ml -1. Směs byla uzavřená pomocí mikroreaktoru a ponechána při teplotě 40 °C po dobu dvou hodin. Reakce byla zastavena přídavkem 1 µl 60
mM roztoku MALDI matrice. Po odpaření rozpouštědel byly vzorky analyzovány MALDITOF MS v reflektronovém módu. Pulsní extrakce byla nastavena pro 1500 Da a počet pulsů laseru byl 200.
Obvykle je trypsin přidáván k proteinu v určitém poměru protein : trypsin pohybujícím
se 50:1 až 10:1. Zvolený hmotnostní poměr protein : enzym (10:1) odpovídal za daných
podmínek reakční kinetice, pokud množství přítomného proteinu nekleslo pod určitou mez. V takovém případě byl použit trypsin o konstantní koncentraci 0,01 mg.ml -1 (Obr. 4), což odpovídá nižšímu poměru protein : trypsin (1:1).
Z obrázku je patrné, pokud se sníží koncentrace proteinu pod ~ 0,01 mg.ml -1, je
vhodné použít enzym v konstantní koncentraci. Jinak řečeno, koncentrace enzymu by neměla klesnout pod 0,01 mg.ml -1.
Pro další experimenty byl použit pouze trypsin od firmy Promega, u kterého nedochází
za daných podmínek při štěpení ke vzniku specifických produktů autolýzy, které by mohly znesnadnit identifikaci proteinu.
32
Obr. 3: MALDI-TOF MS spektra digestů BSA o původní koncentraci 0,1 mg.ml -1. Štěpeno trypsinem od firmy Sigma (červené), trypsinem od firmy Promega (modré) a nejčastější
autolytické fragmenty trypsinu od firmy Promega (zelené). Specifické fragmenty pocházející z BSA jsou označeny písmenem B, z trypsinu označeny písmenem T a nespecifické fragmenty jsou označeny písmenem N.
Obr. 4: MALDI-TOF MS spektrum digestů BSA o původní koncentraci 0,01 mg.ml -1 v hmotnostním poměru k trypsinu 10:1 (červené) a 1:1 (modré).
33
PRO VE DE NÍ ME CH A N ICK É M O D IF IK A CE M A L D I T E RČ ÍK U
Pro úspěšné enzymatické štěpení v roztoku je nezbytné, aby se po celou dobu štěpení
nacházel protein i enzym v roztoku. Vypařování probíhá na volném povrchu roztoku za laboratorní teploty. Rychlost, kterou se rozpouštědlo vypařuje, závisí na jeho typu, teplotě, na ploše volného povrchu, na vlastnostech rozpuštěných látek a na množství par nad volným povrchem kapaliny.
Naším cílem je provádět enzymatické štěpení v objemech nepřevyšující 5 µl.
K odpaření vodných roztoků o těchto objemech dochází za atmosférického tlaku při teplotě 40 °C v průběhu několika minut, což nestačí k zvýraznění průběhu enzymatického štěpení.
Proto musí být zvoleny vhodné experimentální podmínky, které by rychlost
vypařování co nejvíce snížily.
Rozhodli jsme se vyzkoušet tyto přístupy k omezení vypařování rozpouštědla: 1. Uzavřený mikroreaktor.
2. Uzavřený mikroreaktor s omezením velikosti kapky. 3. Použití vysokovroucího rozpouštědla.
34
Uzavřený mikroreaktor Při tomto přístupu je kapka obklopena silikonovou gumou a přikryta laboratorním
sklíčkem (Obr. 5), aby nedocházelo k vysychání roztoku na MALDI terčíku.
Obr. 5: Detail uzavřeného mikroreaktoru. Jedná se o uzavřený systém, kdy nedochází k výměně hmoty, ale pouze energie.
Terčík není možné zahřívat zespodu, neboť takto by se přednostně zahřívala ocel, která by
vlivem přímého kontaktu přenášela kapalině více tepla, a laboratorní sklíčko, jímž je kapka
seshora uzavřena, by bylo chladnější, což by podporovalo nežádoucí kondenzaci par na
sklíčku a vyschnutí kapky na terčíku. Při zahřívání seshora je teplotní gradient opačný, dochází k přenosu tepla vzduchem, sklíčko je zahříváno na vyšší teplotu než terčík, protože je blíže zdroji tepla. Teplota roztoku je v rovnováze s teplotou par roztoku a nedochází ke kondenzaci par na sklíčku.
Zahřívání bylo realizováno pomocí termostatu KEVA, který byl zkonstruován pro
zahřívání vialek o objemech 1,2 ml, 0,8 ml a 0,3 ml a také umožňuje zahřívání MALDI terčíku. Při zahřívání seshora byl MALDI terčík umístěn na filtračním papíře na ploše stolu a byl přiklopen předehřátým termostatem (Obr. 6). V momentě přiklopení bylo zahájeno měření času. Vzdálenost mezi topným tělesem termostatu a laboratorním sklíčkem byla ~ 5 mm.
35
Obr. 6: Princip zahřívání seshora.
Uzavřený mikroreaktor s omezením velikosti kapky Častým problémem vyskytujícím se při použití mikroreaktoru je, že kapka nemá
kontrolovanou velikost a tvar, a proto může dojít k jejímu kontaktu se stěnami mikroreaktoru
(Obr. 7a). Dále obecně platí, že vypařovaní probíhá tím rychleji, čím větší je plocha povrchu kapaliny ve styku s okolní atmosférou. Pokud je na ocelovém povrchu nanesen nízký objem vodného roztoku (1 – 3 µl), může dojít k adhezi vody na relativně hydrofilní ocel tak, aby
kapka zaujala co největší povrch. Potom dochází ke vzlínání kapaliny do štěrbin, nežádoucímu zvětšení plochy vzorku na MALDI terčíku, příp. ke kontaminaci vzorku. Pokud
se ale povrch modifikuje vytvořením pole hydrofilních a hydrofobních míst, kapka vodného roztoku je nucena zaujmout nižší povrch při stejném objemu a tvarem se více podobá kouli
(Obr. 7b). Tato možnost již byla dříve popsána v literatuře a dnes jsou již běžně dostupné MALDI terčíky využívající tohoto faktu k zakoncentrování analytu při krystalizaci s matricí.31
36
V případě využití upraveného terčíku, s připraveným polem hydrofilních míst
oddělených hydrofobní vrstvou probíhá enzymatické štěpení v objemu s minimálním
povrchem a kapky jsou od sebe definovaně odděleny. Při návaznosti enzymatického štěpení
na předcházející separaci proteinů pomocí kapilární elektroforézy s nanášením přímo na MALDI terčík musí být protein znovu převeden do roztoku malým objemem rozpouštědla. Přestože se jedná o nízký objem, vyschlé kapky proteinů jsou po separaci z CE tak blízko u
sebe, že bez vytvoření bariéry v podobě hydrofobního povrchu mezi kapkami by mohlo dojít k jejich smíšení. Úprava povrchu tedy rovněž zabraňuje vzájemné kontaminaci mezi sousedními frakcemi.
Materiál pro tenkovrstvé pokrytí terčíku musí být nejen hydrofobní, ale také chemicky
odolný vůči organickým rozpouštědlům, zejména pak ethanolu, acetonu, acetonitrilu, které mohou být využity jak během přípravy vzorku, tak během čištění terčíku. Pokud by se ověřila
schopnost použitého materiálu selektivně interagovat s některou z látek v reakční směsi, mohl
by být takto upravený terčík dále využit pro analýzy využívající modifikace nosiče vzorku, např. SELDI MS.
Obr. 7: Tvorba kapky na a) nemodifikovaném, b) modifikovaném terčíku.
37
Ne p á j i v á m a s ka První návrh počítal s využitím tzv. nepájivé masky, která se běžně používá při výrobě
desek plošných spojů, kde slouží k ochraně motivu plošného spoje před nežádoucím
zkratováním a vlivy okolního prostředí. Poskytuje dostatečnou chemickou i mechanickou odolnost a lze ji nanášet fotocestou, což umožňuje přesné dodržení vzdáleností a velikostí
podle navržené šablony. V profesionálním rýsovacím programu AutoCAD™ 32 byla navržena
maska (Obr. 8), podle které byla vyrobena šablona a následně maska na MALDI terčíku. Šablona vymezuje pole 1176 kruhů o průměru cca 1 mm a se vzdáleností mezi středy těchto kruhů 2.5 mm. Návrh byl stanoven s ohledem na parametry CE, která potřebuje cca 500 bodů k nanesení eluátu, i pro potřeby využití mikroreaktoru, předpokládaný nanášený objem je 1 – 3 µl.
Obr. 8: Maska pro vytvoření šablony k pokrytí terčíku.
38
Byl proveden test vhodnosti materiálu pomocí nanášení malých objemů v rozmezí 1 –
10 µl vody na místa na oceli, která byla obklopena vrstvou nepájivé masky. Nebyla však pozorována tvorba požadovaných kapek, která by potvrzovala dostatečnou hydrofobicitu
masky. Pravděpodobně se jedná o důsledek malého rozdílu mezi hydrofobicitou oceli a masky, který neumožňuje přesně definovat tvar kapky vody. Z toho vyplynulo, že je nutné
vybrat materiál, který bude zaručeně splňovat předpoklad vysoké hydrofobicity. Tímto materiálem může být silikonová guma nebo PTFE. Nevýhodou těchto materiálů však je velmi
obtížné nanášení podle připravené šablony. Pro nanášení fotocestou, resp. sítotiskem v
případě silikonové gumy, však nebyla nalezena firma, která by šablonu pro požadovaný terčík dokázala zhotovit.
Mo d i f i ka c e t e r č í ku p o m o c í P T F E PTFE (Teflon®33) je z hlediska využitelnosti pro modifikaci terčíku ideálním
materiálem, neboť je vysoce chemicky odolný (odolává všem chemikáliím, kromě roztavených alkalických kovů a reaktivních fluoračních činidel), nepřilnavý, nesmáčivý
(hydrofobní i oleofobní), odolává jak vysokým (250 °C), tak nízkým (-270 °C) teplotám a
jeho jedinou vadou je malá mechanická odolnost. Velmi však záleží na zrnitosti povrchu, na
který je nanášen, a v případě téměř hladkého ocelového povrchu MALDI terčíku je mechanická odolnost PTFE vrstvy značně snížena. K nanášení Teflonu® se využívají techniky stříkání a následného vytvrzení při cca 500 °C. Vytvoření šablony před nanášením
PTFE není možné z důvodu vysoké teploty tvrzení a podobě šablony. Proto bylo navrženo terčík nejprve pokrýt Teflonem® celý a tyto „otvory“ pak následně vytvořit pomocí CNC (Computer Numeric Control) stroje podle předchozí masky (Obr. 9). Kvůli vyšší přilnavosti
PTFE vrstvy byl hladký MALDI terčík upraven pomocí brusné pasty. PTFE nanášení
provedla firma TPT COATING34, práci na CNC stroji zajistila firma MCAE Systems35 (Obr. 10). Byl proveden test hydrofobicity pomocí nanášení nízkých objemů (1 – 10 µl) vody (Obr. 11).
39
Obr. 9: Detail uzavřeného mikroreaktoru s omezením velikosti kapky.
Obr. 10: Foto zhotoveného MALDI terčíku pokrytého PTFE vrstvou. 40
Obr. 11: Foto deseti kapek vody o objemu 2 – 3 µl nanesených na MALDI terčíku s otvory v PTFE vrstvě. Průměr kruhů je 1,1 mm, vzdálenost mezi středy je 2,5 mm.
Z obr. 11 je patrné, že tvorba kapek vody na PTFE upraveném MALDI terčíku
odpovídá vytvoření hydrofilně-hydrofobního rozhraní. Experimenty týkající se takto upraveného terčíku jsou rozpracovány, jedná se hlavně o využití při nanášení eluátu z CE na terčík a enzymatické štěpení na terčíku.
41
Použití vysokovroucího rozpouštědla Další možností, jak zajistit, aby proces enzymatického štěpení probíhal po celou dobu
v roztoku, je přídavek malého množství vysokovroucího rozpouštědla ke kapce vzorku. Tímto způsobem je možné vyhnout se použití mikroreaktorů, což je výhodné zvláště u potřeby analýzy více kapek. Toto rozpouštědlo však musí splňovat určité předpoklady: 1.
2. 3.
4.
Zanedbatelné vypařování během doby štěpení.
Dokonalé odpaření během přijatelné doby (méně než 12 hodin) za atmosférického nebo, lépe, subatmosférického tlaku. Mísitelnost s vodou.
Nesmí mít negativní dopad na samotný proces enzymatického štěpení. Pro potřebu odpaření rozpouštědla je možno využít komory, kde lze pomocí olejové
vývěvy dosáhnout tlaku cca 20 kPa. Na základě hodnot teplot varu při atmosférickém tlaku a tlaku 10 kPa36 (Tabulka 1) jsem zvolil organická rozpouštědla, která mohou při určité
koncentraci zajistit nevysychání kapky na MALDI terčíku po dobu dvou hodin při 40 °C za
atmosférického tlaku, a to bez uzavírání kapky pomocí silikonové gumy a laboratorního sklíčka. Pro porovnání jsou v tabulce uvedeny i fyzikální vlastnosti kapalin běžně využívaných při MALDI MS analýze a při enzymatickém štěpení.
Tabulka 1: Fyzikální vlastnosti vybraných kapalin. glykol 1-amino-2 propanol 1,4-butandiol voda acetonitril aceton
Teplota varu ve °C při tlaku 100 kPa 10 kPa 1 kPa 196,9 132,5 86 157,9 98,2 53 227,6 164,7 116 99,6 45,8 7 81,2 21,4 -20 55,7 1,3 -36
42
E n z y m a t i c ké š t ě p e n í p o p ř í d a v k u v y s o ko v r o u c í h o r o z p o u š t ě d l a Pro zjištění možného negativního dopadu na enzymatické štěpení byl navržen a
proveden experiment, kdy byl 1 µl 50 % roztoku těchto rozpouštědel přidán k 1 µl vzorků
obsahující modelový protein BSA o koncentraci 0,1 mg.ml -1 a poté byl přidán 1 µl trypsinu o
koncentraci 0,01 mg.ml -1. Konečná koncentrace vysokovroucího rozpouštědla v reakční směsi
byla tedy cca 16,7 %. Vzorky byly ponechány nepřikryté po dobu dvou hodin a teplotě 40 °C. Reakce byla zastavena přídavkem 1 µl 1 % roztoku TFA a vzorky byly ponechány přes noc v laboratoři za atmosférického tlaku, aby došlo k odpaření všech rozpouštědel. Poté byl
přidán 1 µl roztoku MALDI matrice a následovala MALDI-TOF MS analýza produktů
štěpení v reflektronovém módu přístroje (Obr. 12). Z obrázku je patrné, že v případě 1-amino2-propanolu
MS analýza produktů neprokázala přítomnost tryptických
fragmentů
potvrzujících průběh enzymatického štěpení za daných podmínek. Proto byla směs dále analyzována v lineárním módu MALDI-TOF MS za účelem porovnání obsahu jednotlivých reagentů, tj. proteinu a enzymu v reakční směsi (Obr. 13).
Obr. 12: MALDI-TOF MS digestů BSA o koncentraci 0,1 mg.ml -1. Štěpeno v přítomnosti cca 16,7 % glykolu (červená), 1,4-butandiolu (modrá) a 1-amino-2-propanolu (zelená). Písmenem B jsou označeny specifické fragmenty BSA.
43
Obr. 13 : MALDI-TOF MS směsi proteinu a enzymu v přítomnosti cca 16,7 % glykolu
(červená), 1,4-butandiolu (modrá) a 1-amino-2-propanolu (zelená). Písmenem T je označen trypsin.
Na
základě
opakovaných
výsledků
MALDI-TOF
MS
analýzy
produktů
enzymatického štěpení v přítomnosti 1-amino-2-propanolu lze říci, že toto rozpouštědlo není
vhodné z důvodu negativního ovlivnění reakce. Několikanásobně vyšší intenzita píku patřící BSA v přítomnosti 1-amino-2-propanolu oproti intenzitám píku BSA v přítomnosti dalších
dvou rozpouštědel potvrzuje domněnku, že enzymatické štěpení s největší pravděpodobností
v přítomnosti 1-amino-2-propanolu neprobíhá. K dalším analýzám byly proto využity pouze glykol a 1,4-butandiol.
Pro zjištění možného vlivu glykolu, příp. 1,4-butandiolu na enzymatické štěpení byla
spektra produktů porovnána se spektrem produktů enzymatického štěpení provedeného v uzavřeném mikroreaktoru (Obr. 14).
44
Obr. 14: MALDI-TOF MS spektra digestů BSA. Původní koncentrace BSA byla 0,1 mg.ml -1, štěpeno trypsinem o koncentraci 0,01 mg.ml -1 v přítomnosti cca 16,7 % glykolu (modrá),
resp. 1,4-butandiolu (zelená). Pro názornost je ukázáno spektrum digestu BSA při použití uzavřeného mikroreaktoru a stejných koncentrací reagentů (červená). Písmenem B jsou označeny specifické fragmenty BSA, písmenem N nespecifické fragmenty.
Závěrem lze prohlásit, že enzymatické štěpení v přítomnosti vhodného organického rozpouštědla probíhá, ale s jistým omezením. Porovnáním počtu specifických fragmentů u
digestů v přítomnosti organického rozpouštědla s referenčním digestem provedeným ve
vodném roztoku bylo zjištěno, že přítomnost organické fáze během štěpení snižuje počet specifických fragmentů, ale pro spolehlivou identifikaci je ještě dostačující. Proto je třeba prozkoumat enzymatické štěpení v přítomnosti organického rozpouštědla s ohledem na různé
koncentrace organické fáze a pro více modelových proteinů, možnou změnu pH, možný vliv sorpce, apod. Použití těchto rozpouštědel při štěpení se jeví jako vhodný doplněk k uzavřenému mikroreaktoru s omezením velikosti kapky.
45
L IM IT DET EK CE V M A L D I- T OF MS Limit detekce (LOD – Limit Of Detection) metody určuje nejnižší množství látky,
které je možno pomocí dané metody detekovat. Při určování limitu detekce pro metodu MALDI-TOF MS byly navrženy a provedeny čtyři experimenty, s cílem odhadnout míru vlivu jednotlivých faktorů na LOD: 1. LOD přístroje.
2. Příspěvek rušení.
3. Příspěvek enzymatického štěpení. 4. Příspěvek kinetiky štěpení.
V prvním a druhém případě se jedná o zjištění LOD pro jeden peptid, ve třetím a
čtvrtém případě se jedná o stanovení minimální množství proteinu, které lze ještě spolehlivě identifikovat peptidovým mapováním. Pro zjednodušení je používán název LOD proteinu.
LOD přístroje a příspěvek rušení Limit detekce přístroje závisí na typu analytu, přípravě vzorku, ionizační a detekční
účinnosti. Pro zjištění detekčního limitu přístroje byly provedeny dvě MALDI-TOF MS analýzy modelového peptidu angiotensinu. V prvním případě se daný peptid nacházel ve
vzorku sám, ve druhém byla analyzována směs angiotensinu spolu s třemi dalšími peptidy, označovaná jako kalibrační směs Calmix (Tabulka 2).
Tabulka 2: Složení směsi Calmix Peptid
Koncentrace
Bradykinin
Relativní molekulová hmotnost M+H
+
monoizotopická
dominatní
1µM
1060,56
1060,56
Angiotensin
1µM
1296,68
1296,68
Renin
2µM
1759,93
1760,93
5µM
2465,19
2466,2
Adrenokortikotropní hormon
46
Na MALDI terčík bylo naneseno 0,5 µl peptidu angiotensinu o koncentraci 0,01
µg.ml -1 a poté bylo přidáno 0,5 µl CHC. Dále bylo na terčík naneseno 0,5 µl 100x zředěné
směsi Calmix, a opět přidáno 0,5 µl CHC. Byla provedena MALDI-TOF MS analýza v reflektronovém módu s manuálním hledáním a počtem pulsů 200.
Detekční limity byly počítány metodou trojnásobku standardní relativní odchylky
šumu pro deset hodnot v blízkém okolí píku peptidu, v prvním případě pro samotný
angiotensin (Tabulka 3, Obr. 15), ve druhém případě bylo sledováno ovlivnění LOD konkurujícími peptidy ve směsi Calmix (Tabulka 4, Obr. 16). LOD = n ⋅
3 ⋅ SD ( šumu ) I
n je počet molů nanesených na terčíku a I intenzita píku po odečtení intenzity základní linie.
Jednotky intenzity jsou udávány v a. u.
1) LOD přístroje – analýza standardu
Koncentrace angiotensinu byla 0,01 µg.ml -1, což odpovídá koncentraci ~ 7,7 nM. Při
objemu 0,5 µl bylo na MALDI terčíku naneseno asi 3,85 fmol peptidu. Tabulka 3: Limit detekce angiotensinu 1
2
3
SD (šumu)
14,19
23,92
8,78
intenzita píku
408,06
335,47
302,92
LOD
0,40
0,82
0,34
Ø 1,2,3
0,5
fmol
SD 1,2,3
0,3
fmol
47
Obr. 15: MALDI-TOF MS spektrum angiotensinu o koncentraci ~ 7,7 nmol.l -1 . Písmenem A jsou označeny píky patřící angiotensinu.
2) Příspěvek rušení
Směs Calmix obsahovala angiotensin o koncentraci 1 µM, což při ředění 100x (10
nM) a naneseném objemu 0,5 µl odpovídalo 5 fmol angiotensinu přítomném na MALDI terčíku.
Tabulka 4: Limit detekce angiotensinu ve směsi Calmix 1
2
3
SD (šumu)
8,36
24,56
29,19
intenzita píku
250,08
312,03
575,25
LOD
0,50
1,18
0,76
Ø 1, 2, 3
0,8
SD 1, 2, 3
fmol
0,3
fmol
48
Obr. 16: MALDI-TOF MS směsi Calmix. Koncentrace angiotensinu je 10 nmol.l -1. Písmenem A jsou označeny píky patřící angiotensinu.
Vypočtený limit detekce pro samotný angiotensin vypovídá o citlivosti přístroje a o
přípravě vzorku. Není ovlivněn rušením vyskytujícím se při analýzách směsí. LOD angiotensinu obsaženého ve směsi Calmix je navíc ovlivněn přítomností tří dalších peptidů ve vzorku, které si navzájem konkurují zvláště při ionizaci.
Příspěvek enzymatického štěpení Přestože limit detekce u jednoho peptidu, či směsi čtyř peptidů dosahuje řádově
jednotek femtomolů, u digestu proteinu je limit detekce ovlivněn zejména příspěvkem štěpení, sorpce, odlišné ionizační účinnosti a vysokým počtem navzájem si konkurujících fragmentů při ionizaci.
Do tří vialek bylo napipetováno 10 µl BSA (0,1 mg.ml -1 v 50 mM NH4HCO3) a do
každé z nich byl přidán 1 µl trypsinu (0,1 mg.ml -1). Po dvou hodinové inkubaci bylo štěpení
49
zastaveno přídavkem 1 µl 1% TFA. Digesty byly použity v této koncentraci a dále zředěny
10x a 100x. Ředění probíhalo bez MALDI matrice, 1 µl CHC byl přidán k 1 µl digestu až na MALDI terčíku. Pro 100x zředěný digest již nebyla odezva přístroje na signál analytu patrná.
Limit detekce byl proto počítán z roztoků naředěných 10x (Obr. 17). Jednak LOD pro
pík s nejvyšší intenzitou (majoritní pík), pro určení limitního množství proteinu, které by bylo možno detekovat, pokud by enzymatické štěpení bylo úplné a specifické (Tabulka 5), a dále
LOD pro pík s nejnižší intenzitou ve spektru (minoritní pík), který zároveň patří mezi pět zvolených specifických píků potřebných pro peptidové mapování (Tabulka 6). Při peptidovém
mapování je protein identifikován na základě znalosti hodnot m/z několika specifických
peptidových fragmentů. Jako dostačující počet specifických fragmentů se někdy uvádí již tři, ale z důvodů vyšší spolehlivosti identifikace a s ohledem na reálný vzorek jich bylo zvoleno pět.
V tomto případě se již nejedná o limit detekce jednoho peptidu, ale spíše o minimální
množství proteinu, které lze identifikovat, zjednodušeně LOD proteinu. LOD proteinu je tedy
dán limitem detekce peptidu s nejnižší intenzitou z pěti předem zvolených specifických fragmentů nacházejících se ve spektru.
Koncentrace BSA na začátku byla 0,1 mg.ml -1, pipetovaný objem 10 µl tak obsahoval
~ 1,5 nmol BSA. V průběhu štěpení došlo k přídavku 2 µl roztoků, koncentrace BSA byla
tedy zředěna ještě 1,2x. Po naředění digestu vodou 10x byla koncentrace celkového proteinu ~ 125 nM, což při nanášeném objemu 1 µl odpovídá 125 fmol celkového proteinu na terčíku. Tabulka 5: Limit detekce digestu BSA pro majoritní pík 1
2
3
SD (šumu)
53,58
20,35
22,57
intenzita píku
1948,33
1075,58
515,36
LOD
10,31
7,10
16,42
Ø 1, 2, 3
11
SD 1, 2, 3
fmol
5
fmol
Tabulka 6: Limit detekce digestu BSA pro minoritní pík 1
2
3
SD (šumu)
36,22
31,27
35,15
intenzita píku
1948,33
1075,58
515,36
LOD
6,97
10,90
25,58
Ø 1, 2, 3
15
SD 1, 2, 3
fmol
10
fmol
50
Obr. 17: MALDI-TOF MS spektrum 12x zředěných digestů BSA o původní koncentraci 0,1 mg.ml -1, písmenem B jsou označeny specifické fragmenty BSA.
Vypočítané LOD zpochybňuje fakt, že při 100x ředěném vzorku nebyla odezva
signálu na analyt patrná. Je známo, že limit detekce počítaný z hodnot naměřených při vyšší
koncentraci analytu může být nižší v důsledku omezené platnosti rovnice pro výpočet LOD. Z faktu, že při 100x ředěném vzorku nebyla patrná odezva přístroje, je patrné, že skutečný LOD bude vyšší než vypočtená hodnota, řádově v desítkách fmol.
Příspěvek kinetiky štěpení V předchozím případě bylo samotné štěpení proteinu BSA provedeno v relativně
velkém objemu za vysokých koncentrací a až samotný digest byl ředěn. Pro tento vzorek byl
pak vypočten limit detekce. V okamžiku, kdy je enzymatické štěpení prováděno přímo na terčíku je dalším omezením detekce nízká celková koncentrace proteinu, vedoucí
k pomalejšímu štěpení, a sorpce. Limit detekce je opět omezen požadavkem přítomnosti alespoň pěti specifických fragmentů, které se musí vyskytovat ve spektru.
51
Na MALDI terčík byl nanesen 1 µl BSA o koncentraci a) 0,1 mg.ml -1,
b) 0,01 mg.ml -1,
c) 0,001 mg.ml -1
a k nim byl přidán 1 µl trypsinu o koncentraci 0,01 mg.ml -1 v souladu se zjištěním z kapitoly
věnující se reakčním podmínkám. Hmotnostní poměr enzym substrát byl tedy a) 1:10 b) 1:1
c) 10:1 Tento hmotnostní poměr byl zvolen na základě obecné platnosti enzymové kinetiky,
kdy je vhodnější použít enzym v dostatečné koncentraci, aby reakce mohla probíhat s patřičnou rychlostí. Situace také více odpovídá reálné analýze, kdy není vždy známo přesné množství proteinu.
Směs byla pomocí špičky pipety promíchána a ponechána v uzavřeném mikroreaktoru
po dobu 2 hodin při teplotě 40 °C. Zastavení reakce bylo provedeno pomocí 1 µl 60 mM CHC.
Tabulka 7: Limit detekce digestu BSA na terčíku pro majoritní pík 1
2
3
SD (šumu)
17,19
16,70
18,31
intenzita píku
569,92
511,21
984,22
LOD
13,57
14,70
8,37
Ø 1, 2, 3
12
SD 1, 2, 3
fmol
3
fmol
Tabulka 8: Limit detekce digestu BSA na terčíku pro minoritní pík 1
2
3
SD (šumu)
17,69
18,02
18,52
intenzita píku
142,01
131,57
145,64
LOD
56,05
61,63
57,22
Ø 1, 2, 3
58
SD 1, 2, 3
fmol
3
fmol
52
Obr. 18: MALDI-TOF MS spektrum digestů BSA o původní koncentraci 0,01 mg.ml -1, písmenem B jsou označeny specifické fragmenty BSA.
Limit detekce byl stanoven ze spekter naměřených pro koncentraci BSA 0,01 mg.ml -1
(Obr. 18), což odpovídá koncentraci asi 150 nM (nižší koncentrace BSA (0,001 mg.ml -1) sice
také poskytovala odezvu signálu, ale ve spektru se nacházely 3 – 4 specifické fragmenty, což neodpovídalo požadavku zvolených pěti píků). Opět byl vyhodnocen LOD pro majoritní
(Tabulka 7) a minoritní (Tabulka 8) pík. Na terčík byl nanesen objem 1 ul, což odpovídá
teoreticky asi 150 fmol celkového množství BSA na terčíku. Prakticky je počet molů fragmentů BSA nižší v důsledku sorpce, nedostatečného štěpení, příp. výskytu jednoho peptidu ve více produktech. Vypočtený LOD je opět zpochybněn faktem, že pro koncentraci 0,001 mg.ml -1 nebylo přítomno alespoň pět specifických fragmentů.
Vypočtený LOD proteinu je v tomto případě srovnatelný s předchozím případem, tj.
enzymatické štěpení v mikroměřítku nepřináší výrazné zvýšení LOD.
53
Závěr Tabulka 9: Souhrnná tabulka LOD LOD (fmol)
ideální případ
0,5 ± 0,3
příspěvek rušení
příspěvek enzymatického štěpení příspěvek kinetiky štěpení
0,8 ± 0,3 majoritní 11 ± 5
12 ± 3
specifický pík
minoritní 15 ± 10 58 ± 3
Jak bylo naznačeno výše, citlivost přístroje je značně závislá na typu analytu, který je
stanovován. U jediného píku angiotensinu, příp. u stejného peptidu ve směsi Calmix se limit detekce pohybuje v řádu jednotek femtolů, při vysokém počtu fragmentů vzniklých
enzymatickým štěpením se limit detekce posouvá k desítkám v případě trávení na terčíku až
ke stovkám femtomolů. To je způsobeno zejména vlivem samotného štěpení, sorpce, výskytem jednoho fragmentu ve více produktech, konkurencí jednotlivých píků při ionizaci a
faktem, že byl zvolený nutný výskyt alespoň pěti specifických fragmentů. Závěrem je třeba zmínit, že MALDI-TOF MS je považována spíše za semikvantitativní metodu, pro kvantitativní analýzu je třeba použít interní standard.
54
SPOJ E NÍ CE A MA L D I-T O F MS S L IF DE T E KC Í PRO A N A L Ý ZU PR OT E INŮ
Enzymatické štěpení na terčíku bylo využito v kombinaci off-line spojení CE a
MALDI-TOF MS, které bylo prezentováno na ASMS 200537. Po separaci CE byly proteiny
naneseny na MALDI terčík, jejichž zóny byly detekovány s využitím LIF (Obr. 19).38 Vybraný protein byl enzymaticky naštěpen na MALDI terčíku s využitím uzavřeného mikroreaktoru a po přídavku matrice identifikován metodou peptidového mapování.
Separace modelových proteinů cytochromu C (c = 0,20 mg.ml -1), lysozymu (c = 0,15
mg.ml -1) a myoglobinu (c = 0,30 mg.ml -1) byla nanesena na MALDI terčík Patrikem
Vrábelem za těchto podmínek. Křemenná kapilára (i.d. = 50 µm, o.d. = 375 µm), E = 250 V.cm -1, I = 11 µA, elektrolyt kyselina citronová v NH3 (pH = 2,3), elektrokinetické dávkování
vzorku, 5 s při 250 V.cm -1. Nanášení eluátu bylo prováděno za subatmosférického tlaku na
MALDI terčík v podobě diskrétně oddělených 2,5 s frakcí. Poté byla Patrikem Vrábelem provedena laserem indukovaná nativní fluorescenční detekce frakcí proteinů (Obr. 19, detaily viz cit. 37,38).
Vzhledem k faktu, že se zóna proteinu nacházela cca v šesti frakcích, bylo možné
provést MALDI-TOF MS analýzu jak celého proteinu, tak i MALDI-TOF MS analýzu po provedení enzymatického štěpení na MALDI terčíku. Enzymatické
štěpení
zvoleného
proteinu
lysozymu
probíhalo
v uzavřeném
mikroreaktoru za těchto podmínek. Ke frakci proteinu na terčíku byl přidán 1 µl 1 % roztoku
NH3, k převedení vzorku do roztoku a upravení pH. Pak byl přidán 1 µl trypsinu o koncentraci 0,01 mg.ml -1 a směs byla promíchána a ponechána v uzavřeném mikroreaktoru při teplotě 40 °C po dobu dvou hodin. Reakce byla zastavena přídavkem 1 µl 60 mM roztoku
MALDI matrice a po odpaření všech rozpouštědel byla provedena MALDI-TOF MS analýza produktů štěpení v reflektronovém módu (Obr. 20).
Protein byl identifikován na základě databázového hledání pomocí programu
MS-Fit-ProteinProspector10.
55
Obr. 20: Laserem indukovaná nativní fluorescenční detekce zón proteinů na MALDI terčíku.38
Obr. 20: MALDI-TOF MS digestu lysozymu ze zóny na MALDI terčíku. Štěpeno trypsinem o koncentraci 0,01 mg.ml -1 v přítomnosti elektrolytu a NH3 o pH ~ 9. MOWSE score: 7.104, pokrytí sekvence: 51%.
56
ZÁVĚR Studium enzymatického štěpení v mikroměřítku na MALDI terčíku s použitím
uzavřeného mikroreaktoru ověřilo závěrečný úspěšný experiment Jaromíry Novákové. Byla
provedena série pokusů, které prokázaly praktickou použitelnost této metody. Dále se
podařilo upravit některé reakční podmínky, zejména využití techniky zahřívání seshora a poměr enzymu a proteinu. V případě modelových vzorků proteinů o známé koncentraci je hmotnostní poměr enzym : protein (1:10) vhodný pro koncentrace proteinů vyšší než 0,01
mg.ml -1. V případě nižší nebo neznámé koncentrace proteinu by koncentrace enzymu neměla
klesnout pod 0,01 mg.ml -1.
Při experimentech v mikrolitrových objemech reakčních směsí prováděných v
mechanicky uzavřené kapce vzorku často docházelo ke znehodnocení vzorku, buď odpařením
rozpouštědla vlivem nedokonalosti uzavřeného systému, nebo kontaktem reakční směsi se stěnami mikroreaktoru. Proto byly navíc navrženy a vyzkoušeny další přístupy rozšiřující možnosti využití enzymatického štěpení na terčíku.
Uzavřený mikroreaktor s omezením velikosti kapky byl vytvořen pomocí modifikace
MALDI terčíku hydrofobní vrstvou PTFE. Jeho použití bude ověřeno pro kapky do objemu 3 µl.
Přístup zahrnující přídavek vysokovroucího rozpouštědla nevyžadoval žádné
mechanické uzavírání kapky vzorku, přítomnost asi 16,7 % organického rozpouštědla dokázala zabránit odpaření reakční směsi po dobu min. dvou hodin při teplotě 40°C. Změnou složení reakční směsi docházelo i k ovlivnění průběhu reakce. Ze tří vybraných rozpouštědel se dvě z nich ukázala využitelná pro další studium enzymatického štěpení v přítomnosti vysokovroucího rozpouštědla.
S využitím uzavřeného mikroreaktoru bylo zjištěno nejnižší množství proteinu, které
je možno pomocí enzymatického štěpení na terčíku s následnou MALDI-TOF MS analýzou
identifikovat. Obecně lze spolehlivě identifikovat protein enzymaticky rozštěpený na terčíku v množství stovek femtolů, koncentrační limit se pohybuje ve stovkách nmol.l -1. Největší vliv
na tento limit má příspěvek kinetiky štěpení a sorpce, vliv mikroměřítka není zásadní.
V závěru práce je uveden příklad využití enzymatického štěpení na terčíku při spojení
CE a MALDI-TOF MS s laserem indukovanou nativní fluorescenční detekcí proteinů.
57
SEZNAM POUŽITÝCH ZKRATEK 2D PAGE: dvourozměrná gelová elektroforéza v polyakrylamidovém gelu A: adenin
AMT: accurate mass tag a. u.: arbitrary units
B: magnetický analyzátor C: cytosin
CE: kapilární elektroforéza
CEC: kapilární elektrochromatografie CFR: curve-field reflectron
CGE: kapilární gelová elektroforéza CI: chemická ionizace
CIEF: kapilární isoelektrická fokusace CNC: computer numeric control
CZE: kapilární zónová elektroforéza DNA: kyselina deoxyribonukleová DTT: dithiothreitol
EI: elektronová ionizace
EOF: elektroosmotický tok
ESI: ionizace elektrosprejem
ESI: ionizace elektrosprejem
FAB: ionizace urychlenými atomy FI: ionizace polem
FIB: ionizace urychlenými ionty
FT-ICR: iontová cyklotronová rezonance s fourierovou transformací G: guanin
GPC, SEC: gelová permeační chromatografie
HPLC: vysoce účinná kapalinová chromatografie ICAT: isotope-coded affinity tag
IEC: iontoměničová chromatografie IG: iontový selektor
58
IMAC: immobilized metal ion affinity chromatography ISD: fragmentace v iontovém zdroji IT: iontová past
ITP: izotachoforéza
iTRAQ: amine-modifying labeling reagents for multiplexed relative and absolute protein quantitation
LDI: laserová desorpce a ionizace
LIF: laserem indukovaná fluorescence LIT: lineární iontová past LOD: limit detekce
m/z: hodnota poměru hmotnosti a náboje
MALDI: laserová desorpce a ionizace za účasti matrice
MECC: micelární elektrokinetická kapilární chromatografie MOWSE: molecular weight search
mRNA: mediátorová kyselina ribonukleová kyselina MS/MS: tandemová hmotnostní spektrometrie MS: hmotnostní spektrometrie
NMR: nukleární magnetická rezonance pI: isolektrický bod
PMF: metoda peptidového mapování
PSD: fragmentace za iontovým zdrojem PTFE: polytetrafluorethylen
PTM: post-translační modifikace Q: kvadrupólový analyzátor RP: reverzní fáze
SD: standardní relativní odchylka SDS: dodecylsíran sodný
SELDI: laserová desorpce a ionizace s využitím upraveného povrchu nosiče vzorku SILAC: stable isotopes labeling by amino acids in cell culture SIMS: ionizace sekundárními ionty SQT: sequence tag T: thymin
TOF: průletový analyzátor
TSI: ionizace termosprejem 59
POUŽITÁ LITERATURA 1
V. C. Wasinger, S. J. Cordwell, A. Cerpa-Poljak, J. X. Yan, A. A. Gooley, M. R. Wilkins,
M. W. Duncan, R. Harris, K. L. Williams, I. Humphery-Smith: Electrophoresis, 16; 1090
(1995). 2
3
J. C. Venter et al.: Science, 291; 1304 (2001).
K. Berggren, T. Steiberg, W. Lauber, J. Carroll, M. Lopez, E. Chernokalskaya, L. Zieske, Z.
Diwu, R. Haugland, W. Patton: Anal. Biochem. 276; 129 (1999).
4
M. Karas, D. Bachmann, U. Bahr, F. Hillenkamp: International Journal of Mass
Spectrometry and Ion Processes 78; 53 (1987). 5
K. Tanaka, H. Waki, Y. Ido, S. Akita, Y. Yoshida, T. Yoshida: Rapid Commun. Mass
Spectrom. 2; 151 (1988). 6
C. M. Hegedus, L. Gunn, C. F. Skibola, L. Zhang, R. Shiao, S. Fu, E. A. Dalmasso, C.
Metayer, G. V. Dahl, P. A. Buffler, M. T. Smith: Leukemia 19; 1713 (2005).
7
S. Y. Yang, X. Y. Xiao, W. G. Zhang, L. J. Zhang, W. Zhang, B. Zhou, G. Chen, D. C. He:
BMC Cancer 5; 83 (2005).
8
9
M. Yamashita, J. B. Fenn: Journal of Physical Chemistry 88; 4451 (1984).
J. Havliš, H. Thomas, M. Šebela, A. Shevchenko, Anal. Chem. 75; 1300 (2003).
10 11 12 13 14
15 16 17 18
http://prospector.ucsf.edu (4/2006)
http://www.matrixscience.com (4/2006)
http://www.narrador.embl-heidelberg.de (4/2006) http://www.cbrg.ethz.ch/services/index (4/2006)
http://www.unb.br/cbsp/paginiciais/pepident.htm (4/2006) W. Zhang, B. T. Chait: Anal. Chem. 72; 2482 (2000). http://wolf.bms.umist.ac.uk/mapper/ (4/2006)
J. Preisler, F. Foret, B. L. Karger: Anal. Chem. 70; 5278 (1998).
T. Rejtar, P. Hu, P. Juhasz, J. M. Campbell, M. L. Vestal, J. Preisler, B. L. Karger: J.
Proteome Res. 4; 171(2002) 19
20
J. Preisler, P. Hu, T. Rejtar, B. L. Karger: Anal. Chem. 72; 4785 (2000).
A. Zuberovic, S. Ullsten, U. Hellman, K. E. Markides, J. Bergquist: Rapid Commun. Mass
Spectrom. 18; 2946 (2004).
21
A. Zhukov, M Schürenberg, Ö. Jansson, D. Areskoug, J. Buijs: J. Biomolecular Techn. 15;
112 (2004).
60
22
D. Ericsson, S. Ekström, J. Nilsson, J. Bergquist, G. Marko-Varga, T. Laurell: Proteomics
1; 1072 (2001). 23
B. Ásgeirsson, S. Haebel, L. Thorsteinsson, E. Helgason, K. O. Gudmundsson, G.
Gudmundsson, P. Roepstorff: Biochem. J. 329; 497 (1998).
24 25
26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36
A. Shevchenko, M. Wilm, O. Vorm, M. Mann: Anal. Chem. 68; 850 (1996).
S. J. Bark, N. Muster, J. R. Yates, G. Siuzdak: J. Am. Chem. Soc. 123; 1774 (2001). W. K. Russell, Z. Y. Park, D. H. Russell: Anal. Chem. 73; 2682 (2001).
Y. Q. Yu, M. Gilar, P. J. Lee, E. S. P. Bouvier, J. C. Gebler: Anal. Chem. 75; 6023 (2003). L. Licklider, W. G. Kuhr: Anal. Chem. 66; 4400 (1994).
L. N. Amankwa, W. G. Kuhr: Anal. Chem. 64; 1610 (1992).
J. Nováková, Diplomová práce, PřF MU, Brno (2004). http://www.bruker.com (2/2006)
http://www.autodesk.com (2/2006) http://www.dupont.com (2/2006) http://tptcoating.com (2/2006) http://www.mcae.cz (2/2006)
D. R. Lide, Handbook of chemistry and physics, CRC Press Taylor & Francis Group, USA
(2005). 37
J. Preisler, P. Vrábel, O. Peš, H. Řehulková, J. Havel: In Proceedings of the 53rd ASMS
Conference on Mass Spectrometry and Allied topics. San Antonio, TX, ASMS, od s. MP32562 (2005). 38
P. Vrábel, Disertační práce, PřF MU, Brno (2006).
61
