PROTEOMIKA

PROTEOMIKA 6 - 8. 12. 2006 Středa:

Čtvrtek:

Co je proteomika ? Nástroje

Pátek: Alternativní přístupy

Zpracování Obrazu, Analýza 2D gelů

2D elektroforéza

Nativní techniky Membránové proteiny

(Dr. J. Pánek, AVČR) IEF

Chromatografické Separace

SDS PAGE Klinická proteomika Barvení

Hmotnostní spektrometrie

Sérové profilování

(Dr. P. Halada, AVČR)

Literatura a publikace

Digesce Čištění peptidů Organizace Omezení 2D

PROTEIN J. J. Berzelius 1838 Proteios PROTEOMIKA Marc Wilkins 1994 PROTEOM Kompletní sada bílkovin přítomných v daném okamžiku v buňce, nebo tkáni, zahrnující veškeré jejich modifikace, vzájemné interakce, lokalizaci a metabolický obrat. PROTEOMIKA • kvantitativní a kvalitativní charakterizace úplné sady bílkovin organely, buněčné linie, tkáně nebo organismu • kvantitativní a kvalitativní porovnání proteomů za různých podmínek

CÍL PROTEOMIKY

Získat globální a integrovaný pohled na biologii studiem kompletní bílkovinné sítě buňky, spíše než studiem jednotlivých proteinů. Cílem je nejen identifikovat všechny bílkoviny, ale zároveň pochopit jejich funkci a strukturu a vytvořit 3D mapu buňky (určit lokalizaci jednotlivých bílkovin).

PROČ PROTEOMIKA KDYŽ MÁME GENOMIKU ? • nelze určit funkci proteinu na základě sekvence DNA nebo mRNA • nelze popsat molekulární mechanismy fyziologických dějů pomocí studia genomu • 200 typů posttranslačních modifikací • informace o lokalizaci bílkoviny • !!!! špatná korelace hladin mRNA a skutečných hladin bílkovin !!!! PROTOŽE PROTEINY A NIKOLIV GENY VYTVÁŘEJÍ FENOTYP !

JEDEN GENOM DVA PROTEOMY

JEDEN GEN, MNOHO BĹKOVIN

Cca 25-30 000 genů

Několik set tisíc bílkovin

STRUKTURNÍ PROTEOMIKA – vytváření buněčných nebo subcelulárních map, kompletní informace o bílkovinách a jejich interakcích v dané organele nebo víceproteinovém komplexu.

STRUKTURNÍ FUNKČNÍ PROTEOMIKA cílená sub-proteomická izolace a charakterizace funkčních celků nebo souborů bílkovin na základě společné funkce.( identifikace sub-proteomů na základě interakce s nějakým ligandem.)

PROTEOMIKA

EXPRESNÍ FUNKČNÍ

EXPRESNÍ PROTEOMIKA kvantitativní studium porovnávající expresi mezi různými proteomy

Počet publikací s proteomickou tématikou (Medline) 3028 2581

1656 1231 747 374 3

8

36

62

154

1995 1996 1997 1998 1999 2000 2001 2002 2003 2004 2005

NOBELOVA CENA ZA CHEMII 2002

Desorpce laserem za přítomnosti matrice (MALDI) K. Tanaka

Elektrosprejová ionizace John Fenn

KAM AŽ SAHÁ PROTEOMIKA ?

Graves and Haystead,(2002) MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY REVIEWS, Vol. 66, No. 1

OBECNÉ SCHEMA PROTEOMICKÉHO EXPERIMENTU Separace směsi bílkovin

Elektroforéza, chromatografie a jejich kombinace

Barvení gelů a výběr spotů, výběr píků

Výběr bílkovin k identifikaci

Štěpení vybraných bílkovin a čištění peptidů

Měření přesné hmotnosti peptidů a případně jejich Dalších fragmentů

Enzymatické či chemické štěpení spotů Nebo chromatografických frakcí, čištění

Získání hmotnostních spekter

Porovnání hmotností sady peptidů s údaji o všech dostupných ORFs v databázích. Případně přímé porovnání sekvencí.

Identifikace bílkovin

DVOJROZMĚRNÁ ELEKTROFORÉZA

HISTORICKÉ MINIMUM 2D ELEKTROFORÉZY 1930 Tiselius - papírová a škrobová elektroforéza (1948 Nobelova cena) 1956 Smithies a Poulík – první 2D 1970 Laemli – Akrylamidové gely 1971 Rigetti – Izoelektrická fokusace (IEF) 1975 O´Farrell : Kombinace IEF a SDS elektroforézy 1982 Bjellqvist: Immobilizované pH gradienty (IPG) Edmanovo sekvenování proteinů Hmotnostní spektrometrie a jemné způsoby ionizace (Tanaka a Fenn Nobelova cena) Genové databáze Nové detergenty a redukční činidla Metody detekce

TYPICKÉ USPOŘÁDÁNÍ 2D EXPERIMENTU

Pandey & Mann Proteomics to study genes and genomes NATURE | VOL 405 | 15 JUNE 2000 |

•Příprava vzorků •Izoelektrická fokusace •Ekvilibrace •SDS-PAGE •Detekce bílkovin •Zpracování dat a vyhodnocení

PŘÍPRAVA VZORKŮ Kontaminace, ztráty, degradace, modifikace versus reproducibilita Proteiny mají nejnižší rozpustnost v oblasti pH kolem jejich izoelektrického bodu !!! Tělní tekutiny, tkáňové nebo buněčné homogenáty či homogenizované subcelulární frakce • • •

Homogenizace buněk, nebo tkáně ( buněčná frakcionace) . Mechanické rozbití (krystalizace vody, homogenizéry, sonikace, french-press) Lyzační pufr s detergentem

LYZAČNÍ PUFR PRO IEF: Močovina, thiomočovina – chaotropní činidlo, zvýšení rozpustnosti, denaturace bílkovin Detergent (CHAPS) – čistý zwitteriontový detergent – zvýšení rozpustnosti snížení agregace bílkovin Redukční činidlo (DTT) – redukce disulfidický můstků (ionizují se nad pH 8) DTT, tributylfosfin Nosičové amfolyty -- (carrier ampholytes, IPG buffers) – jsou náhražkou pufrů, je to směs ionizovatelných látek vytvářejí potřebný pH gardient Pigment (BFB) – pro snazší manipulaci

KON

PROTEÁZY A NEČISTOTY VE VZORKU

PROTEÁZY stále aktivní i ve vysoké koncentraci močoviny !!!

DNA a RNA

Zhoršená separace Barví se v kyselé oblasti gelu

LIPIDY

Zhoršená separace

SOLI

Špatná separace

PROTEÁZY

Degradace bílkovin

Sonikace,

DNázy, RNázy,

Precipitace, komplexování s amfolyty Detergent nebo precipitace

Ultrafiltrace, mikrodialýza, precipitace

Inhibitory proteáz – PMSF, koktejly Precipitace

UNIVERZÁLNÍ ŘEŠENÍ : Precipitace acetonem, TCA nebo kombinací, ALE…

•Stanovení koncentrace bílkovin •Analytická versus preparativní nanáška (10-2000 mikrogramů)

•Příprava vzorků •Izoelektrická fokusace •Ekvilibrace •SDS-PAGE •Detekce bílkovin •Zpracování dat a vyhodnocení

B A A

B

B

ZÁPORNĚ NABITÉ AMINOKYSELINY

pH 7

pH > 9

KLADNĚ NABITÉ AMINOKYSELINY (pH 7)

TEORIE IZOELEKTRICKÉ FOKUSACE •Celkový náboj proteinu (net charge) je součtem všech jeho negativních i pozitivních nábojů. • Kyselé a zásadité skupiny polypeptidu jsou v protonovány a deptrotonovány • v závislosti na pH okolí. •Amfoterní molekula (bílkovina) v elektrickém poli v gradientu pH migruje do bodu , • kde je její celkový náboj rovný nule. • pH tohoto bodu odpovídá izoelektrickému bodu (pI) dané bílkoviny.

pH < pI

pH=pI

pH > pI

TEORETICKÁ DISOCIAČNÍ KŘIVKA DVOU BÍLKOVIN Net charge

+3

pI 3

4

5

pI 6

7

8

9

10

11

pH

pH pufru se vzorkem -4

pI

+

+

pH 3

pI

-

+

-

pH 11

NOSIČOVÉ AMFOLYTY (CARRIER AMPHOLYTES) Zajišťují vytvoření stabilního a hladkého gradientu pH v elektrickém poli Vlastnosti: •Vysoká pufrační kapacita a rozpustnost při vlastním pI •Dostatečná a stálá elektrická vodivost •Absence biologických efektů •Nízká MW Původně: směsi různě dlouhých řetězců oligoamino-oligokarboxylových kyselin ALE ty MIGRUJÍ …….nestabilní gradient !!!

Zakotvené pH gradienty (Immobilized pH gradients – IPG)

ZAKOTVENÉ PH GRADIENTY (IMMOBILIZED PH GRADIENTS – IPG) Derivovaný akrylamid s disociovatelnými karboxy- a aminoskupinami

IPG STRIPY (IPG STRIPS) 3 mm široké, 0.5 mm silné, dehydrované - trvanlivost , reproducibilita, plastova podložka, stabilita, nemigrují, neinterferují s nimi redukční činidla.

ZOOMING pH 4-7

1071

pH 4-5 498

pH 5-6 896 Celkem 1754

pH 5,5-6,7 376

REHYDRATACE IPG STRIPŮ A NANÁŠKA VZORKU

Cup loading (různé pH)

V pufru bez vzorku Rehydratace

aktivní V pufru se vzorkem

pasivní

Typický rehydratační pufr (většinou použit již pro lyzaci vzorku) • 7 M Močovina • 2 M Thiomočovina • 2 - 4 % CHAPS • 0.2 % DTT (TCEP, tributylfosfin] • 0.5 – 1 % Nosičové amfolyty (IPG pufr) • 0.002 % BFB

REHYDRATAČNÍ NANÁŠKA versus „CUP LOADING“ PRO: Proteiny rovnoměrně rozložené, neprecipitují v místě nanášky Výhodné pro velké nanášky řidších vzorků

PRO: IEF ve vysoce kyselých a zásaditých gradientech probíhá lépe Vzorek jde přímo do gelu eliminují se proteinprotein interakce (např. proteázy)

Rehydratace a nanáška je spojena– méně manipulací se vzorkem Aktivní rehydratace zlepšuje vstup velkých bílkovin do gelu PROTI: Vzorek je dlouhodobě při pokojové teplotě U bazických gradientů dochází k velkým ztrátám proteinu (nevstoupí do gelu) Při rehydrataci stoupá koncentrace proteinu mimo gel a může docházet k precipitaci

PROTI: Proteiny s pI blízko bodu nanášky mají nízkou rozpustnost a mobilitu a mají tendenci precipitovat na povrchu gelu V první fázi se proteiny koncentrují na vstupu do gelu a mohou precipitovat

PODMÍNKY IZOELEKTRICKÉ FOKUSACE Optimalizace podmínek pro každý vzorek, typ stripu a nanášky. Platí zvlášť pro: větší nanášky, a větší a hydrofobnější proteiny. Teplota: kolem 20 oC ( KARBAMYLACE ! versus krystalizace močoviny za nízkých teplot) Aktivní chlazení !!! Dochází k přehřívání na tzv. HOT SPOTS

Elektrické podmínky : 50-70 microA na strip, E co nejvyšší, kroky nebo pozvolný vzestup V praxi až 10 kV. Celková fokusace pro 18-24 cm stripy 20-80 kVh Prevence oxidace a vysychání stripu : parafinový olej

PŘEHŘÍVÁNÍ IPG STRIPŮ NA TZV. HOT SPOTS

(HOT SPOTS jsou hrany iontových pásů - hranice oblasti s nízkou a vysokou vodivostí)

E

Soli a ionty pufrů

TYPICKÝ IEF BĚH BIO-RAD Protean IEF Cell 18 cm strip pH 3-10 Rehydratační nanáška 1mg 50 microA / strip Celkem 51 000 Vh + “hold”

V 5000

3000

1000

1

3

6

9

12

24 t [h]

INSTRUMENTACE IEF

•Příprava vzorků •Izoelektrická fokusace •Ekvilibrace •SDS-PAGE •Detekce bílkovin •Zpracování dat a vyhodnocení

EKVILIBRACE STRIPŮ PŘED “DRUHÝM ROZMĚREM“

• • • •

Cíle ekvilibrace: Převést bílkoviny do pufrů vhodných pro redukci, alkylaci a SDS separaci Maximalizovat přenos bílkovin ze stripu Redukovat disulfidické můstky Alkylovat cysteiny EKVILIBRAČNÍ PUFR (EQP):

50 mM Tris pH 8.8 2% SDS, 6 M močovina 30 % glycerol

15 min EQP + 1% DTT 15 min EQP + 2.5 % iodacetamid (!)

ELEKTROENDOOSMOTICKÝ EFEKT Nepohyblivé (zakotvené) nabité skupiny v elektrickém poli !!

katoda

Po ekvilibraci v neutrálním nebo zásaditém pufru: • COOH disociovaná na COO-, • aminoskupiny zůstávají nedisociované Disociovaný karboxyl je přitahována k anodě (+), ale nemůže……. To je kompenzováno migrací H3O+ ke katodě (-) COO-

H3O +

Voda nese rozpuštěné částice směrem ke katodě ! H3O +

Následky:

IEF :

bobtnání katodického (bazického) konce zhošená separace SDS-PAGE : ztráta bílkovin na vstupu do gelu zhoršená separace

+

anoda

•Příprava vzorků •Izoelektrická fokusace •Ekvilibrace •SDS-PAGE •Detekce bílkovin •Zpracování dat a vyhodnocení

SDS ELEKTROFORÉZA SDS-PAGE (Sodium dodecyl sulphate – polyacrylamide gel electrophoresis) •Bílkoviny se rozdělují na základě jejich MW •Záporně nabité SDS tvoří komplexy s bílkovinami a stíní náboje proteinu (1,4g SDS :1g proteinu) •Komplex má jednotkový náboj na hmotnostní jednotku. •Všechny komplexy jsou záporně nabité a migrují k anodě PUFR: Tris-chlorid/Tris-glycin pufrový systém s 0.1 % SDS Redukce disulfidických můstků (Dithiothreitol, Dithioerythrol, TCEP, beta-mercaptoethanol)

SDS

POLYAKRYLAMIDOVÉ GELY

Složení a příprava gelu: • akrylamid (monomerní) • bis-akrylamid (zesíťování polymeru) • APS (katalyzátor, produkuje radikál), • TEMED (tetramethylethylenediamine) odstraňuje kyslík bránící polymeraci) • (+pufr a SDS) Celková koncentrace akrylamidu a bis-akrylamidu určuje KONCENTRACI (T) gelu v procentech (2-20 %) Poměr bis-akrylamidu a akrylamidu POROZITU (C) gelu. APS v zásaditém prostředí může reagovat s Trisem, koncentrace co nejnižší ve prospěch TEMEDu.

SDS-PAGE

• Ekvilibrace stripu • Upevnění stripu : zalití agarózou • MW markery ?

Podmínky separace: (minimalizace elektroendoosmozy, difúze, modifikace bílkovin a času) Nízké (nízké pole) prvních 30-60 minut (redukce elektroendoosmozy) Teplota : 10-25 oC , termostating, prevence “smiling” gelů, reprodukovatelný odvod tepla Výhoda rychlých separací (difuze se týká hlavně LMW) Plastic backing vs. fluorescence Reprodukovatelnost: Výhoda přípravy více gelů najednou pomocí „multicasters“

NEPHGE, Non-equilibrium pH gradient gel Někdy lepší pro bazické, hydrofobní a velké bílkoviny

WITA Small (8x7 cm), large (24x32 cm) and giant gels (48x32 cm) ( mouse ovary total protein extract, 5000-8000 spots).

•Příprava vzorků •Izoelektrická fokusace •Ekvilibrace •SDS-PAGE •Detekce bílkovin •Zpracování dat a vyhodnocení

DETEKCE BÍLKOVIN V GELECH

• Citlivost • Možnost kvantifikace • Linearita signálu • Dynamický rozsah • Kompatibilita s MS • Cena • (nízká toxicita)

Kolorimetrické „viditelné“ barvení

Fluorescenční barvení DIGE

Radioaktivní detekce

DETEKCE BÍLKOVIN VIDITELNÝMI PIGMENTY • COOMASSIE BLUE • SOLI STŘÍBRA ! Různá účinnost na různé proteiny !

COOMASSIE BRILIANT BLUE

HORKÁ CBB (CBB-R350)

KLASICKÁ CBB (CBB-R250)

KOLOIDNÍ CBB (CBB-G250)

„BLUE SILVER“ (CBB-G250)

Citlivost 100-200 ng

Citlivost 50-100 ng

Citlivost 10-30 ng

Citlivost 1-10 ng

Alkohol-kyselina Pouze10 minut Vysoké pozadí Dlouhé odbarvování

Alkohol-kyselina Odbarvování proteinů Špatná kvantifikace Nízká cena

Alkohol - kyselina – síran amonný „Steady state“ (bez ztráty při odbarvení) Dobrá kvantifikace Středně vysoká cena

•Více pigmentu •Alkohol - kyselina – síran amonný „Steady state“ (bez ztráty při odbarvení) Dobrá kvantifikace Středně vysoká cena

!NEW! 2004, Candiano et al

Jaterní homogenát, preparativní nanáška 2 mg, barvení koloidní Coomassie Blue 1025 spotů

pH 4

pH 7

DETEKCE STŘÍBŘENÍM Redukce dusičnanu stříbrného na kovové stříbro, více než 100 variant

Citlivost 0.5 ng ! nízká cena Vícekrokový postup (až 20) Citlivý na přesnost Nízký dynamický rozsah Negativní barvení Komplikace s MS Problematická reproducibilita

FLUORESCENČNÍ DETEKCE • • • •

(4–8 ng/band) (4–8 ng/band) (1–2 ng/band; comparable to silver staining) (4–8 ng/band)

SYPRO RUBY (Molecular Probes) FLAMINGO (BIO-RAD) DEEP PURPLE (GE-Amersham)

Sypro Ruby

Dobrá kvantifikace Kompatibilní s dalším barvením Minimum kroků Dynamický rozsah Fluorescenční scanner (max. excitace daleko od UV) Sběr spotů je komplikovaný

Flamingo

Vysoká cena, ale …….

….ALE je tu ruthenium a bathophenantrolinsulfát

POROVNÁNÍ CITLIVOSTI SYPRO, STŘÍBŘENÍ A COOMASSIE

Sypro Orange

Silver

Sypro Ruby

Coomassie

2D-DIGE : 2D DIFFERENČNÍ GELOVÁ ELEKTROFORÉZA (Cy2, Cy3, Cy5 Difference gel electrophoresis)

Maleimid - Cys (-SH) Succimid - Lys (ε− aminoskupina) Hydrazid - karbonyl

EXPERIMENTÁLNÍ USPOŘÁDÁNÍ PRO DIGE

Minimální versus maximální značení Rozdíly v migraci FlaSH dyes (Fuji, Raytest)

RADIOAKTIVNÍ ZNAČENÍ

Inkorporace značených aminokyselin (35S methionin, beta zářič) nebo jiných prekurzorů ŽIVÝMI buňkami - metabolické značení Vysoká citlivost Nejvyšší dynamické rozsah ALE…. Gel je nutné usušit před detekcí Klasická radiografie je nepraktická Fosfoimager nezbytný Rizika práce s izotopy

Viditelné

Klasická CBB

nízká citlivost

Koloidní CBB

střední citlivost, dobrá kvantifikace

Hot CBB

nízká citlivost

Stříbření

vysoká citlivost

Fluorescenční

Sypro a Rb-BPS

vyšší citlivost, kvantifikace, dynamický rozsah, F-scanner

DIGE

Cy-2, 3, 5 a další

vysoká citlivost, cena !, scanner a software

35S a další

nejvyšší citivost,kvantifikace, dynamický rozsah, P-imager

Radioaktivní detekce

ZÍSKÁNÍ A ZPRACOVÁNÍ OBRAZU

Kritické parametry: • rozlišení • bitová hloubka (dpi, μm • dynamický rozsah

KRITICKÉ PARAMETRY

• rozlišení (počet pixelů na jednotku délky obrázku- dpi, μm, ) • bitová hloubka (počet bitů definující každý pixel, stupně šedi, 8 bitů – 256 stupňů šedi 16 bitů – 65536 stupňů šedi) •dynamický rozsah (pozor na saturaci)

Získání obrazu a hloubka a tak

100 dpi dpi.

300

Softwarové vyhodnocení 2D gelů Komerční: PDQuest Phoretix Melanie ProFinder Bio Numerics a další Volně dostupné: GelScape Open2Dprot

Co když to ale nevypadá tak hezky ?

KDYŽ TO NECHODÍ…..

LIMITY 2D ELEKTROFORÉZY 5-10 000 aktivních genů v buňce 20 000 - 50 000 proteinů Detekce 5000 – 8 000 (2 -30 %) 60-90 % proteinů zůstává mimo detekci

Hmotnostní a izoelektrický limit pro konvenční 2D

OMEZENÍ 2D TECHNOLOGIE

!

Bílkoviny s extrémním pI Bíloviny nad 150 kDa Membránové (hydrofobní) bílkoviny

!

Ztráty v průběhu 2D experimentu

ZTRÁTY: Rehydratace 20-55 % IEF 7-14 % Ekvilibrace 17-24 % SDS-PAGE Fixace a barvení

!

Až 80 % proteinů může být ztraceno v průběhu konvenčního 2D experimentu !!!!!!

•Příprava vzorků •Izoelektrická fokusace •Ekvilibrace •SDS-PAGE •Detekce bílkovin •Zpracování dat a vyhodnocení •Příprava vzorků pro identifikaci • Identifikace bílkovin pomocí MS

ŠTĚPENÍ BÍLKOVIN MS analýza - Intaktní protein je příliš velký navíc komplikace s PTM Cíl fragmentace: Definovaně fragmentovat protein, aby jednotlivé peptidy byly dostatečně malé na optimální MS analýzu, ale zároveň poskytly dostatečnou sekvenční informaci Optimum 6-20 AA, cca 800-2500 DaPoznámka Proteáza Místo štěpení

Trypsin

za Lys, Arg

Glu-C (Proteáza V8) za Glu a Asp

nenásleduje Pro nenásleduje Pro

Chymotrypsin

za Phe,Trp,Tyr, Leu, Ileu, Val, Met nenásleduje Pro

Lys-C

za Lys

nenásleduje Pro

Arg-C Chemická digesce CNBr BNPS-SKATOL Hydroxylamin

za Arg

nenásleduje Pro

Met Trp Asn-Gly vazba

organika, hydrofobní P.

Trypsin: • z kravského nebo prasečího pankreasu • Štěpí na C- konci za Arg, Lys • 50 kDa protein : cca 30 peptidů • Použití v roztoku, na blotu, v gelu

Trypsin štěpí za Lys, Arg pokud nenásleduje Pro

PŘÍPRAVA VZORKŮ Z GELU PRO IDENTIFIKACI MS

Výběr a vyříznutí spotu (spotpicking)

KERATIN !!!

Dehydratace gelu (redukce, alkylace) ACN, vakuum Rehydratace v pufru s Trypsinem

Digesce 37 oC

Extrakce (ACN)

Čištění a koncentrace peptidů

ČIŠTĚNÍ A KONCENTRACE PEPTIDŮ PO DIGESCI ZipTips Chromatografie v reverzní fázi (Reverse Phase) Hydrofobní vazba peptidu na alifatické uhlovodíkové řetězce (C18 nebo C4) Objem vzorku po extrakci obvykle > 40 mikrolitrů Po koncentraci a odsolení na ZipTips jen 1 – 10 mikrolitrů