PROTEOMIKA 2006
PTM Nativní elektroforézy Chromatografické Separace Vícerozměrné separace Membránové proteiny Proteinové čipy Klinická proteomika …..
A CO POSTTRANSLAČNÍ MODIFIKACE ?
RADIOAKTIVNÍ ZNAČENÍ FOSFÁTOVÝCH SKUPIN
BIOTINYLACE A AFINITNÍ IZOLACE FOSFOPEPTIDŮ
IMOBILIZOVANÁ METAL-AFINITNÍ CHROMATOGRAFIE
Detekce fosfoproteinů na gelech Kolorimetricky (metylzeleň)
Fluorescenčně Pro-Q Diamond
Citlivost 40-80 ng PP
1–16 ng PP
Detekce glykoproteinů v gelech fluorescenčně: (Pro-Q Emerald 300)
Glykoproteiny Játra
Karcinom jater
Proteiny
kolorimetricky: (GelCode)
ANALÝZA PROTEINOVÝCH KOMPLEXŮ A INTERAKCÍ PROTEIN-PROTEIN
Komplexozom Interaktozom
•Nativní vícerozměrné separace •Blue native - 2D • Afinitní purifikace komplexů • Tandemová afinitní purifikace (TAP) •Dvojhybridní systém (Two-hybrid systém) • QUICK
NATIVNÍ CHROMATOGRAFIE - NATIVNÍ ELEKTROFORÉZA- LC/MS-MS
the native way…...
Methods For separation and identification of heme binding protein complexes, we used:
• Metabolic labeling of MEL cells by
59Fe-hemin
• Anion exchange liquid chromatography • Native electrophoresis in presence of Triton X100 • Mass spectrometry analysis (Ion trap - LC-MS/MS)
Results Native electrophoretic separation of radioactive fractions 18-25. A total 13 protein complexes (bands A-M) were analyzed 33 individual proteins were identified.
Results Hb – hemoglobin (α, β1, β2, δ chains) Prx I – peroxiredoxin I Prx II – peroxiredoxin II ROS – reactive oxygen species. PPI - peptidylprolyl isomerase B IAP – integtrin-associated protein
Complex 1
Results Ft – ferritin Prx I – peroxiredoxin I Prx II – peroxiredoxin II Hox – heme-oxygenase ROS – reactive oxygen species. ATPs – ATP synthase
Comple x2
Results Hb – hemoglobin (α, β1, β2, δ chains) Prx I – peroxiredoxin I Prx II – peroxiredoxin II ROS – reactive oxygen species. CA II – carbonic anhydrase II MD – cyt. malate dehydrogenase AAT – aspartate amino transferase NDK – nucleoside diphosphate kinase
Complex 3
Results Prx II – peroxiredoxin II Prx IV – peroxiredoxin IV NAC – Nascent associated complex
polypeptide-
HSP 2 – heat shock protein 2 HSP 110 – heat shock protein 110 PDI – protein disulfide isomerase ALAD – delta aminolevulinic acid dehydratase ATPs – ATP synthase
Complex 4
BLUE NATIVE ELECTROPHORESIS
Coomassie G250 • serves as substitute for detergents • binds on the surface of all membrane and most soluble proteins • negative charge shift. • precipitation of very hydrophobicproteins is minimized due to charge repulsion effects.
Schägger, H. & von Jagow, G. (1991). Blue native electrophoresis for isolation of membrane protein complexes in enzymatically active form. Anal Biochem 199, 223-231.
BLUE NATIVE ELECTROPHORESIS AND BN-2D PAGE
sample : added Coomassie brilliant blue G-250 in aminocaproic acid (0.5 M). cathode buffer: Tricine (50 mM), BisTris (15 mM), and Coomassie brilliant blue G-250 (0.02% w/v). anode buffer : BisTris (50 mM).
Arabidopsis thaliana mitochondrial proteome by Bluenative /SDS (Eubel et al. 2003, Plant Physiol. 133, 274286).
IMUNOAFINITNÍ IZOLACE PROTEINOVÝCH KOMPLEXŮ 1) matrix s protilátkou proti jedné složce komplexu 2) matrix s rekombinantním proteinem (složkou komplexu)
Navázání rekombinantního proteinu s „tagem“ na matrix
Eluce specifickou endopeptidázou (trombin) štěpící v „tagu“
„Tag“ (lalůček, přívěšek, značka) - AA sekvence vložená do rekombinantního proteinu sloužící k detekci, zakotvení apod...
TANDEMOVÁ AFFINITNÍ PURIFIKACE (TAP)
Anne-Claude Gavin et. al., (2002) Functional organization of the yeast proteome by systematic analysis of protein complexes. Nature 415, 142-147
1739 ORF
TANDEMOVÁ AFFINITNÍ PURIFIKACE (TAP)
TANDEMOVÁ AFFINITNÍ PURIFIKACE (TAP)
Komplexy (v průměru 7 komponent)
TANDEMOVÁ AFFINITNÍ PURIFIKACE (TAP)
QUICK SILAC+RNAi knock-down 4 classes of proteins are present in an immunoprecipitate: The target proteins specific interaction partners nonspecific binders cross-reactive proteins After knocking down expression of the protein of interest, only contaminants remain. Matthias Selbach & Matthias Mann Nature Methods, 2006
METODY SEPRACE BIOMOLEKUL
Liquid Chromatography (LC) Sample containing proteins or peptides
Liquid flow
Liquid flow
Separation according to: -molecular weight/ size -charge -hydrophobicity -affinity
Time
1
2
3
4
5
•Vzorek se rozděluje mezi mobilní a stacionární (pevnou) fázi
4:37 990909
KAPALINOVÁ CHROMATOGRAFIE (LC)
•Atmosférická •Nízkotlaká (FPLC, MPLC) •Vysokotlaká (HPLC)
Klesá : objem vzorku, průtok a průměr kolony Roste: rychlost separace
MATRIX : • kroslinkovaný dextran (Sephadex) • kroslinkovaná celulóza (Sephacel) • kroslinkovaná agarosa (Sepharose) • polyakrylamid (Sepahacryl) • silica - kyselina ortokřemičitá
SIZE-EXCLUSION CHROMATOGRAPHY GEL-PERMEATION, GEL-FILTRATION
Částice se v porézní matrix rozdělují na základě velikosti Lze provádět za nativních podmínek !
Separační rozmezí až do 1-2 000 000 Da
ION EXCHANGE CHROMATOGRAPHY IONTOMĚNIČOVÁ CHROMATOGRAFIE
• Dělí na základě aktuálního celkového náboje
Cation exchange column carries negatively charged groups Anion exchange column carries positively charged groups
Eluce: Gradient soli (gradient pH)
Funkční skupiny iontoměničů
REVERZNÍ FÁZE (REVERSE PHASE CHROMATOGRAPHY)
Dělení na základě odlišné hydrofobicity peptidů/proteinů •Matrix: vysoce hydrofobní (C4-C18 alifatické řetězce ( -CH2-CH2-CH2-CH3 ) •Vzorek je v hydrofilním rozpouštědle •Eluce: gradientem organického rozpouštědla
AFINITNÍ CHROMATOGRAFIE
Interakce proteinu s jeho specifickým ligandem metabolit, kov, DNA, protilátka…..
Eluce : pH, iontová síla, ligand….
AFINITNÍ MATRIX
Aktivované matrix: AH Sepharose …… lze vázat protein za karboxyl CH Sepharose……..laze vázat za aminoskupinu Matrix s afinitou pro IgG Protein G Sepharose Protein A sepharose Protein A, G magnetic beads Velké ligandy (DNA, protein) lze vázat přímo na matrix. Malé ligandy (nukleotid, NADP, hormon…) se váží přes inertní „spacer arm“.
Celková účinnost a počet kroků
Yield (%) 100 80
95% / step
60
90% / step
40
85% / step
20
80% / step 75% / step
0 1
2
3
4
5
6
Number of steps
7
8
20% overall yield!
VÍCEROZMĚRNÉ CHROMATOGRAFICKÉ SEPARACE
Ion exchange - RP Size exclusion - ion exchange - RP Nativní ion exchange - Nativní elektroforéza - RP
Vícerozměrná chromatografická analýza proteomu Jon M. Jacobs, Multidimensional Proteome Analysis of Human Mammary Epithelial Cells. Journal of Proteome Research 2004, 3, 68- 75
MudPIT (2002) Multidimensional protein identification technology
1484 proteinů identifikováno ! (kvasinka - cca 5000 ORF)
Jak na membránové proteiny ? ! Až 30 % všech bílkovin ! ! Nízké zastoupení a vysoká hydrofobicita !
Strukturní proteomika 1) 2) 3) 4) 5)
Prefrakcionace -1D SDS - digesce a LC-MS/MS Prefrakcionace - digesce - 2D LC-MS/MS „Oholení“ peptidů z povrchu – 2D LC/MS povrchové značení Cy3, Cy2, Cy5 a detekce na gelech povrchová biotinylace + affinitní izolace
Cysteiny
Lys
The N-hydroxysulfosuccinimide (NHS) ester group reacts with the e -amine of lysine. Although a -amine groups present on the N-termini of peptides react with NHS esters, a amines on proteins are seldom accessible for conjugation.
Cukry
Biotin Hydrazide and Biotin-LC-Hydrazide bind to oxidized carbohydrates through the hydrazide group (–NH-NH2), forming a hydrazone linkage. Oxidation of glycoproteins generates reactive aldehydes that react specifically with hydrazide groups.
COOH
Amine-PEO-Biotin The amine group can be reacted with carboxyl groups on aspartate or glutamate residues or carboxy termini. The reaction is mediated by the crosslinker EDC.
??? Semi-kvantitativní proteomika membránových proteinů ??? •SILAC • • •
povrchová biotinylace + affinitní chromatografie digesce LC-MS/MS
PROTEOMICKÁ ANALÝZA POSTTRANSLAČNÍCH MODIFIKACÍ
FOSFORYLACE
1) radioaktivní značení a 2D (různé izotopy) 2) biotinylace a afinitní izolace proteinů a peptidů 3) IMAC afinitní izolace izolace peptidů 4) Specifické pigmenty a protilátky
PROTEINOVÉ ČIPY (PROTEIN ARRAYS)
MATRICE PRO ZACHYCENÍ BÍLKOVIN
POROVNÁNÍ EXPRESE NA PROTEINOVÝCH ČIPECH
Global Analysis of Protein Activities Using Proteome Chips. Heng et. al., (2001) Science. 293, 2101-2105
6His-GST fusion yeast proteins : • expressed and purified • 6566 protein samples representing 5800 unique proteins were spotted in duplicate on a single nickelcoated microscope slide. The slide was probed with anti-GST (10).
Identifikace bílkovin interagujících s calmodulinem
S
S
LEGENDA Protein na čipu S Calmodulin - Ca++ protein-protein vazba PI - různé fosfolipidy, interakce lipid-protein
Biotynylovaný calmodulin Streptavidin -Cy3
Leukaemia-specific cell profiles (cells captured on CD antibody microarrays (Dot Scan) (A) Key; (B) T-ALL (C) AML (D) Precursor B-379 (E) B-CLL (F) FL
Belov et al. (í2006) British Journal of Haematology 135 (2), 184-197
Hledání diagnostických biomarkerů pomocí hmotnostní spektrometrie
Co je to biomarker ? Protein nebo peptid vykazující reprodukovatelné rozdíly v expresi či struktuře specifické pro dané onemocnění. Nejlépe ve snadno dostupné tkání či tělní tekutině.
Sérum
•Dodnes spolehlivě identifkováno přes 3020 bílkovin • extrémní rozdíly v koncentracích Albumin Interleukin 6
40 000 000 000 pg/ml 5 pg/ml
• 6 hlavních proteinů představuje cca 85% bílkoviny (Albumin, IgG, IgA, Tf, alpha-2 makroglobulin, haptoglobin)
• 22 hlavních představuje více než 99 % • složení séra se mění při chorobných stavech
α2-macroglobulin
IgA
albumin
α1-antitrypsin fibrinogen
Tf IgG HC
haptoglobin
IgG LC
Apo A1 haptoglobin
chromatografické přístupy !!!
Sérové profilování (kombinace chromatografie a MS) profilování pomocí SELDI (Surface enhanced laser desorption ionization) profilování pomocí MALDI (Matrix assisted laser desorption ionization)
MALDI Magnetické kuličky (Bruker Daltonics)
SELDI (Ciphergen)
Sérum nebo plazma
Sérum nebo plazma
Odmytí nenavázaných
Odmytí nenavázaných
Eluce navázaných Překrytí matricí TOF MS analýza
SELDI
MALDI
Vyhledávání (nejen) nádorových markerů v séru
C8
Cu-IMAC
WCX
m/Z 2466
nemocní
zdraví
Problémy s identitou Tentýž vzorek?v reflexním modu
m/Z 1865
MS/MS spektrum, peak 1865,001
peptid m/Z 1865 je fragment lidského komplementu C3
Xixiong Kang et. al.
JCI, 116 (1) 2006
SELDI analýza (136 vzorků z toho 96 poztivních na BRC)
Klinika A Klinika B
Karsan et al. Clin Chem. 51(2005) 1525-8
Rýžování zlata nebo přebírání odpadků ? Dosud identifikované „biomarkery“ jsou fragmenty majoritních sérových bílkovin ! Fibrinopeptid A Transferin C3a, C3f,C4 fibrinogen haptoglobin alpha 1-antitrypsin transthyretin serum amyloid A Hb alpha, beta apolipoprotein A-I, A-II…apod. ….až na vzácné výjimky
Co vlastně nacházíme ?
•Fragmenty bílkovin pocházející přímo z nádoru nebo okolní tkáně (navázané na nosič ?) •Fragmenty vzniklé štěpením sérových proteinů nádorovými proteázami (navázané na nosič ? Nebo vzniklé ex-vivo ?)
Afinitní mechanismy deplece majoritních proteinů
•„Top6“ „MARS“ imunodeplece (albumin, transferrin, haptoglobin,antitrypsin, IgG, IgA)
• Cibacron Blue (albumin) • Protein A, protein G (IgG, IgA)
KOLIK STOJÍ PROTEOMICKÁ LABORATOŘ ?
Izoelektrická fokusace: 200 000 – 400 000 Kč Vertikální elektroforéza, zdroj a chlazení: 280 000 – 500 000 Kč Software pro 2D analýzu : 150 000 – 300 000 Kč Minimální investice: 700 000 – 1 000 000 Kč Hmotnostní spektrometr (TOF) 3-7 000 000 Kč Hmotnostní spektrometr (TOF-TOF) 12 000 000 Kč Laserový scanner/P-imager 1.5 - 5 000 000 Kč Stripy…………………………300-400 Kč/ks Akrylamid gel (pre-cast).…… 2500 Kč/ks Barveni CCBB………………..500-1000 Kč/gel Sypro Ruby……….. 500-1500 Kč/gel DIGE……………….2000 Kč/gel
PUBLISH OR PERISH….. Počet publikací s proteomickou tématikou (Medline) 3028 2581
1656 1231 747 374 3
8
36
62
154
1995 1996 1997 1998 1999 2000 2001 2002 2003 2004 2005
Molecular and Cellular Proteomics (IF 9,8) Journal of Proteome Research ( IF 6.9) Proteomics (IF 6.0 ) Electrophoresis (IF 3,7) BBA – Proteins and proteomics (IF 2,9) Expert Review of Proteomics (IF 1,5)
HUPO – HUman Proteome Organization (www.hupo.org) US HUPO (www.ushupo.org) Proteomická sekce ČSBMB (10. 10. 2007 - 3. česká proteomická konference !!!)
Prezentace z přednášek budou ke stažení na adrese: http://www.uhkt.cz/vyuka/proteomika včetne pdf souborů s doporučenou literaturou
