Proteomika v mikrobiologii Ing. Lenka Hernychová, Ph.D. Ústav molekulární patologie Fakulta vojenského zdravotnictví, Universita obrany Hradec Králové
Obsah přednášky 1) Detekce a identifikace bakteriálních patogenů 2) SELDI analýza, proteinové čipy 3) Komparativní proteomové analýzy bakterie
Co je to proteom a proteomika? Proteom - pojem byl poprvé použit v roce 1994 Marcem Wilkinsem - označil veškerý proteinový komplement kódovaný genomem
Proteomika – metody použité ke studiu proteomu - separační techniky - hmotnostní spektrometrie - bioinformatické přístupy
1) Detekce a identifikace bakteriálních patogenů Kultivační techniky zdlouhavé a nejasný průkaz Bakterie v rybniční vodě
(2.1 x 101 živých bakterii na ml)
Bakterie v písku
(2.1 x 103 živých bakterii na ml)
Nebezpečí teroristických útoků
1. Teroristický útok v Londýně (2005) 2. Bombový útok – Sinai, Hotel Sharm el Sheik (2005) 3. Dopisy s bílým práškem (Bacillus anthracis) Je vyžadována rychlá detekce a identifikace biologického agens
Metodologie přípravy acetonitrilových extraktů Bakterie
Promytí
2x v PBS, 4 °C
Kultivace
• na pevné plotně • v kultivačním médiu
Sbírání bakterií
Extrakce proteinů roztokem
Acetonitril (70%), voda, TFA (0.5%)
Acetonitrilový extrakt
Elektronová mikroskopie
zvětšení 16 000x.
Francisella tularensis LVS
bakterie narostlé na kultivační plotně
zvětšení16 000x.
zvětšení 15 000x.
Francisella tularensis LVS po acetonitrilové
extrakci
Metodologie proteomové analýzy acetonitrilových extraktů mikrobů
ACN extrakt
2-DE
MALDI-TOF Lineární mód (MS spektra)
A
MALDI-TOF reflektronový mód (MS spektra)
B
Trypsinové štěpení
HPLC, CapLC
MALDI TOF/TOF ESI Q-TOF ESI Q-TRAP (MS/MS spektra)
C
Výsledky
A
MALDI-TOF lineární mód (MS spektra) 5816
1.0E+4
100 90 80 % Intensity
70
Coxiella burnetii phase I
60 50 40 30
12270
10508
5606 7969
1569 2214
20
10240
6902
1828 2086
9514
11166 10940
4475 8194
10 999.0
16389
13120
5799.4
10599.8
15273
22470
15400.2
20200.6
25001.0
Voyager Spec #1=>AdvBC(32,0.5,0.1)=>NF0.7[BP = 3213.3, 16705] 3215
100
1.7E+4
90 80
% Intensity
70
2609
Francisella tularensis subsp. tularensis (type A)
60 50 2882 40
2511
30 2248 20 2296 10
2864 2765 3007 2735 3107
8132
3517 3405 3422
5482 3847
4178 4306
3464 3449
0 2200.0
6053
4549
5200
3961.8
7435
5771
6166 5995
4688 4971 5284
7142
5723.6
10245
8166
7485.4
0 11009.0
9247.2
Mass (m/z)
Voyager Spec #1=>AdvBC(32,0.5,0.1)=>NF0.7[BP = 10276.9, 5281] 10277
100
5281.3
90 80 70
Francisella tularensis subsp. holarctica (type B)
% Intensity
7467 60
8136
9479
50
12722
40 10245 30 7144 5140 20 4686 6361 8047 5701 4442 6586 8333 10 7666 4643 5286 5958 6718 0 4354.0
8412.6
17233
10085 9112 9227 9921
10870
12073 12930 13057 11893
15994 14358
12471.2
15753
16734
16529.8 Mass (m/z)
17810
20785 19876 20588.4
23394 0 24647.0
Výsledky Hledání bakteriálních biomarkerů
A
5816
1.0E+4
100 90
Coxiella burnetii phase I
80 % Intensity
70 60 50 40 30
12270
10508
5606 7969
1569 2214
20
10240
6902
1828 2086
9514
11166 10940
4475 8194
10 999.0
16389
13120
5799.4
10599.8
15273
22470
15400.2
20200.6
25001.0
Voyager Spec #1=>AdvBC(32,0.5,0.1)=>NF0.7[BP = 3213.3, 16705] 3215
100
1.7E+4
90 80
% Intensity
70
Francisella tularensis subsp. tularensis (type A)
2609
60
DATABÁZE
50 2882 40
2511
30 2248 20 2296 10
2864 2765 3007 2735 3107
8132
3517
5482
3405 3422 3847
4178 4306
3464 3449
0 2200.0
6053
4549
5200
3961.8
7435
5771
6166 5995
4688 4971 5284
7142
5723.6
10245
8166
7485.4
0 11009.0
9247.2
Mass (m/z)
Voyager Spec #1=>AdvBC(32,0.5,0.1)=>NF0.7[BP = 10276.9, 5281] 10277
100
5281.3
90 80
Francisella tularensis subsp. holarctica (type B)
70
% Intensity
7467 60
8136
9479
50
12722
40 10245 30 7144 5140 20 4686 6361 8047 5701 4442 6586 8333 10 7666 4643 5286 5958 6718 0 4354.0
8412.6
17233
10085 9112 9227 9921
10870
12073 12930 13057 11893
15994 14358
12471.2
15753
16734
16529.8 Mass (m/z)
17810
20785 19876 20588.4
23394 0 24647.0
MicrobeLynx – Waters Saramis – Applera BioProfiler - Bruker
Výsledky
B
Stříbřená 2-DE referenční mapa acetonitrilového extraktu Francisella tularensis LVS kDa 76 66.2
DnaK GroEL
30S ribosomal protein S1 Proteiny acetonitrilového extraktu byly separovány IEF v oblasti pH 3-10 následovanou tricinovou SDS-PAGE (16.5% T, 6% C). Skvrny s identifikovanými proteiny jsou označeny jménem.
30
ABC transporter ATP-binding protein Conserved hypothetical protein 20 16
Bacterioferritin GroES 10
pI
4.5
5.1
5.5
5.9
7.0
C
Proteomické přístupy nevyužívající gelovou elektroforézu
LC MS experiment
9 Acetonitrilový extrakt naštěpený trypsinem 9 Analýza všech peptidů pomocí MS/MS 1-D LC ESI Q-TOF 1-D LC MALDI TOF/TOF 1-D LC ESI Q-TRAP 2-D LC ESI Q-TOF 1-D LC – reverzní fáze 2-D LC –kombinace kation výměnné chromatografie a reverzní fáze
2) SELDI, proteinové čipy Surface Enhanced Laser Desorption/Ionization ¾ ¾ ¾ ¾ ¾
byla definována na počátku devadesátých let je rozšířením MALDI-TOF-MS metoda desorpce a ionizace netěkavých látek měření proteinů v lineárním módu aktivní účast povrchu čipu při extrakci, prezentaci a strukturní modifikaci daného vzorku
Rozdíly mezi metodami MALDI a SELDI ¾ v prvotním zpracování samotného vzorku (inertní versus aktivní povrchy) ¾ softwarové vyhodnocení získaných dat (hledání biomárkerů)
Ciphergen ProteinChip technologie Proces je rozdělen do čtyř kroků
1) Selekce proteinového čipu 2) Aplikace vzorku 3) Odstranění nenavázaných komponent 4) Analýza čipu SELDI MS Patentovaná technologie
(přísně evidované čipy – může je zakoupit jen vlastník SELDI přístroje) Odkaz na Internet: http://www.ciphergen.com
1) Proteinový čip Hliníková destička 8 nebo 16 terčíků Typy povrchů – chemické, biochemické
1) Proteinový čip – chemické povrchy Iontoměničové povrchy
Funkční skupinou slabého kationtoměniče je karboxylát, u silných aniontoměničů je derivatizovaná kvarterní amonná báze
Čipy s povrchem IMAC („Immobilized Metal Affinity
Capture“)
Nesou na svém povrchu imobilizovanou kyselinu nitrilotrioctovou (NTA) umožňující chelataci dvojmocných (Zn, Co, Ni, Cu, Ca, Mg) i trojmocných (Al, Fe, Ga) iontů kovů ¾ IMAC 30 aplikací je detekce pozice fosforylací proteinů
Hydrofilní povrchy - oxid křemičitý Hydrofobní povrchy - C6 a C18 (liší se délkou alkylových řetězců)
1) Proteinový čip – biochemické povrchy Povrch terčíku je pokryt derivatizovaným epoxidem nebo karbonyldiimidazolem (CDI)
obojí umožňuje vázat aminové skupiny a imobilizovat tak enzymy, specifické receptory, léčiva nebo vhodně značené oligonukleotidy Imobilizace enzymu (vazba substrátu)
Komerčně dodávaný epoxidový povrch s navázaným G-proteinem umožňuje imobilizaci protilátek Imobilizace protilátek (vazba antigenu)
1) Proteinový čip Pomocí navázaného peptidu, proteinu, DNA, protilátky či molekuly léčiva můžeme na povrch čipu imobilizovat odpovídající reakční partnery
Imobilizace proteinů (vazba protilátek) Protein-proteinová interakce
Čipy se zlatými terčíky umožňují využití SELDI systému pro standardní MALDI experiment
2) Aplikace vzorku
Aplikace vzorků na čip (manuálně nebo automaticky)
Typy vzorků používaných k SELDI analýzám: 9 biologické vzorky – sérum, buněčné nebo tkáňové lyzáty, moč, mozkomíšní tekutina 9 bakteriální lyzáty, proteinové homogenáty, oligonukleotidy
3) Odstranění nenavázaných komponent
9 Inkubace vzorku na čipu – tvorba vazby 9 Omytí nenavázaného materiálu (síla vazby závisí na pH promývacího roztoku) 9 Pouze proteiny navázané na povrchu čipu jsou analyzovány 9 Aplikace matrice (sinapová kyselina)
4) Analýza čipu SELDI MS
9 Zkoumaná látka je kokrystalyzována v pevné matrici, která je ozářena krátkým laserovým pulsem (3 ns) 9 Dojde ke vzniku iontů (neutrálních, kladně i záporně nabitých) 9 Jejich proud je usměrněn do průletového analyzátoru (TOF)
4) SELDI výsledky Zobrazení dat v podobě píků – SELDI spektrum na ose x: efektivní hmotnost iontu m/z na ose y: výška píku udává četnost výskytu iontu s daným poměrem m/z
4) SELDI výsledky „Gel view“ získaná data jsou vynesena do grafu s obdobnou orientací os jako při zobrazení píků, kdy intenzita píků je převedena do denzitometrické podoby, podobně jako u akrylamidové či agarosové elektroforézy
Porovnání profilů: zdravý-nemocný
Základní software umožňuje zpracování získaných spekter je doplněn dalšími nástroji umožňujícími statistické zpracování směřující k hledání biomarkerů
SELDI analýza virulentního (Schu) a méně virulentního (LVS) kmene F. tularensis
LVS
Schu
Data z MS spekter zpracovaná do formátu 1D gelu
5000
10000
15000
20000 LVS 5ul 10% acetonitril, 0.25% TFA LVS 20ul 10% acetonitril, 0.25% TFA LVS 5ul 20% acetonirtil, 0.5% TFA SCHU 5ul 10% acetonitril, 0.25% TFA SCHU 20ul 10% acetonitril, 0.25% TFA SCHU 20ul 20% acetonirtil, 0.5% TFA
5000
10000
15000
20000
CLINPROT systém (Bruker Daltonics) Použití magnetických kuliček se specifickým povrchem pro vazbu proteinů a peptidů (povrchy stejné jako u SELDI čipů)
Hydrofobní interakce
Iontově výměnné
Imunoafinitní
Příprava vzorků 1) Vazba vzorku na receptory
1)
magnetických mikrokuliček 2) Promytí 3) Eluce proteinů či peptidů z povrchu magnetických kuliček a přenos na speciální
2)
MALDI destičku AnchorChipTM 4) MALDI-TOF MS(MS) analýza 3)
Identifikace biomárkerů ¾ Měření MS spekter (zdravý x nemocný) ¾ Biomárkery jsou proteiny rozdílně exprimované v kontrolních a ovlivněných vzorcích (zdraví X nemocní) ¾ Výběr píku označeného softwarem jako biomárker ¾ Selekce prekurzorového píku ve spektru ¾ Fragmentace peptidu (aminokyselinová sekvence) ¾ Identifikace proteinu (MASCOT)
Výhody SELDI analýzy ¾ Rychlá detekce biomárkerů ¾ Citlivá detekce z pouze několika µl vzorku ¾ Lze analyzovat biologické vzorky (sérum, moč, plasma ….) ¾ Možnost kvantitativní analýzy ¾ Detekce modifikovaných forem proteinů (fosforylace) ¾ Monitorování rozvoje onemocnění ¾ Sledování terapeutického efektu léků nebo léčebných postupů
Nevýhody SELDI analýzy ¾ Vysoká cena přístroje ¾ Drahé čipy – nutné odebírat jen od jednoho dodavatele ¾ Nutné dodržení přesného postupu odběru vzorku, přípravy a vazby vzorku na povrch čipu = reprodukovatelnost výsledků ⇒ statistika Nevýhody u ProteinChip technologie ¾ Sledování „jen“ změn v proteinovém složení analyzovaných vzorků (lineární mód) ¾ Není přímá identifikace biomárkerů ¾ Nutné použití kolonek se stejným povrchem jako u čipů, 1DE, MS/MS
3) Komparativní proteomové analýzy bakterie
Jaké je schéma proteomové analýzy? bakterie
Celobuněčný lyzát
Sekretované proteiny Membránové proteiny
Stříbřené a modřené 2DE proteinové mapy
Analytický gel
Preparativní gel
Statistická analýza (skenování, MELANIE)
Výběr skvrn
Vyříznutí skvrn
Bioinformatika
MS analýza
Štěpení trypsinem
S čím pracujeme? 9F. tularensis je Gram-negativní,
fakultativní intracelulární bakterie
9 Tvar: proměnlivý, nejčastěji tyčinkovitý
o rozměrech 0.5 x 1 µm
9 Množení: uvnitř hostitelských buněk
(makrofágy, monocyty, hepatocyty, dendritické buňky, B-buňky)
9 Způsobuje onemocnění, tularémii (vysoké teploty, bolesti hlavy, kloubů, svalů, vznik vředů, zduření uzlin), vznik epidemií
9 Přenos na člověka: přímý kontakt
s nemocným zvířetem, pobodání hmyzem, sáním klíšťat
9Potenciální biologická zbraň
Francisella tularensis
Klasifikace tularemických mikrobů podle epidemiologických a klinických výskytů
Subtypy
Typ
Francisella tularensis subtyp tularensis
A
Schu kmen
Francisella tularensis subtyp holarctica
B
LVS kmen
Francisella tularensis subtyp mediaasiatica
B
Francisella tularensis subtyp novicida
B
¾ Typ A: kmeny s vysokou virulencí ve vztahu k člověku ¾ Typ B: kmeny s redukovanou virulencí
2DE referenční proteinové mapy
F. tularensis
(celobuněčný lyzát bakterií)
SDS-PAGE (9-16%T), pH 3 - 10 SDS-PAGE (9-16%T), pH 6 - 11 16,5%T, 6%C Tricine-SDS-PAGE Hubalek M., Hernychova L. et al. Proteomics. 4(10):3048-60, 2004 Hubalek M., Hernychova L. et al. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 787(1):149-177, 2003
Nábojové varianty hypotetického 23 kDa proteinu (IglC) Rozdíly v kmenech F. tularensis typu B a typu A
5.56
5.78
5.97
holarctica
tularensis
Hernychova L. et al. Construction of a Francisella tularensis two-dimensional electrophoresis protein database. Proteomics. 1(4):508-515, 2001
Proč analyzujeme subproteomy? - Odkrytí proteinů, které se exprimují v nižších koncentracích - Při globální analýze jsou maskovány koncentrovanějšími proteiny - Cílené zaměření na vybranou skupinu proteinů – funkční proteomika
Jaké mohou být –omy? 9Membranom 9Imunoproteom 9Sekretom 9Stresom 9Intracelulom a další….
Membranom
Příprava membránové frakce
Membrána prokaryotické buňky (G- bakterie E. coli)
Celobuněčný lyzát rozbíjení bakterií v parách dusíku nebo frenchpressem Nerozbité bakterie odděleny centrifugací Karbonátová extrakce integrálních membránových proteinů podle Molloy et al. (precipitace membránových proteinů 0,1M NaHCO3) Ultracentrifugace Rozpuštění sedimentu v rehydratačním pufru
Převzato z: Molecular Biology of the Cell. Eds.: Alberts, B. et al., N.Y., Garland Publ., 1994
Složení rehydratačního pufru: močovina, thiomočovina, ASB 14, Triton X-100, Tris, tributylphosphin
Analýza: 2D elektroforéza: IPG stripy s pH gradientem 3-10, 6-11 a 4-7 Detekce: amoniakální stříbření a modření Coomassie G-250
Referenční 2DE stříbřené mapy membránových proteinů rozdělených v pH gradientu 3 - 10 SCHU
LVS 0087
0087 1484
148 4
69
0077 1483
0918 1539 1103
1676
54
0077 0918/091 9 1103
1539
1483 0380
038 0 1676
1591 0726
35
1591 0245
0245
0209
0209 1666
0365
1357,1712
22
1747
1572 1441 1260
0373 1441 1749
1355,171 0
1572
14
kDa
1346,1701 3
0365 1357,17 12
0373
1747
kDa
0503
0726
0503
pI
10
3
pI
10
Výsledky membranomu Francisella tularensis
Komparativní analýza 6 proteinů unikátně exprimovaných pouze v kmeni Schu (subtyp tularensis) 4 proteiny (u kmene Schu) a 7 proteinů (u kmene LVS) bylo nalezeno v jiných nábojových variantách 4 proteiny byly signifikantně exprimovány ve vyšších koncentracích u kmene Schu
FTT 1103 Conserved hypothetical lipoprotein Obsahuje konzervativní doménu DsbA podrodiny thioredoxin rodiny Thiol-disulfide isomerasy se účastní při sbalování proteinů a shromažďování membránových, periplasmatických a sekretovaných proteinů DsbA proteiny jsou známé virulenční faktory v E. coli, P.
aeruginosa, Salmonella enterica, Shigella flexneri, Vibrio cholerae
Imunoproteom Analýza imunoreaktivních proteinů bakterie K detekci bylo použito sérum pacientů, kteří prodělali onemocnění tularémii a v séru jim byl stanoven signifikantní titr tularemických protilátek Detekce byla provedena na PVDF membráně, na kterou byl oblotován 2-DE gel. Primární protilátka – séra pacientů, sekundární protilátka antilidský imunoglobulin (anti-IgG, IgA, IgM) značený peroxidásou. Vizualizace reaktivních skvrn byla provedena chemiluminiscenčně
Identification of immunoreactive antigens in membrane proteins enriched fraction from Francisella tularensis LVS A. Silver-stained reference map
B. Immunoblot
kDa
kDa
90
1
34
1 2
2
5
90
34 5 9
10 11
60
14
678
14
12 13
12 13 17
18
678
60
15 16
19
18
19
10 11 20 21
24
25
20
28 29 27 26
22
40
23
22
40 28, 29, 27
32 31
30
25
31
33
20
20 35
42 35 37
34
34
36 37
36
38
43 39
39
40
40
38
41
10
10 41
pH 3
10
pH 3
10
Komparativní proteomová analýza 9Porovnání subtypů na úrovni globální analýzy nebo subproteomů (lze porovnávat bakterie kultivované za různých podmínek – stresom, intracelulom…)
Hledání rozdílů v proteinové expresi (kvalitativní i kvantitativní) 9 možný vztah proteinů k virulenci 9
konstrukce subjednotkových vakcín
9 využití k typizaci subtypů 9 rychlá diagnostika (ELISA testy) 9 rychlá detekce biologického agens
Schéma proteinové databáze STRAINS
PROTEINS
strain ID
PREDICTION
protein ID
protein ID
sequence
subspecies
spot ID
pI
membrane domains
etc.
gel ID
MW
signal peptide
protein ID
etc.
localization
species
SPOTS
etc.
RefGel spotID spot parameters gel ID
MS identification parameters
strain ID
etc.
GELS
SPOT PROPERTY REFERENCE GEL
RefGel spotID immunoreactivity
2-DE parameters
RefGel spotID
stress alteration
spot parameters
subspecies alter.
etc.
etc.
etc.
