Proteomika és metabolomika Miskei György és Pongrácz Judit Erzsébet
A Human Genome Project nyomán kialakult „genomika” mintájára többféle „-omika” született, melyek célja a sejt különböző molekula szub-populációinak tanulmányozása.
Proteomika A proteomika tudománya a sejtben található összes protein expresszióját, lokalizációját, funkcióját, valamint e proteinek interakcióit - azaz a proteomot - tanulmányozza. Hogyan válhat ez a „bélyeggyűjtés” az orvostudomány hasznára? Egy orvosi proteomikai kutatás rendszerint azzal kezdődik, hogy összehasonlítjuk a kóros sejt vagy szövet és egészséges megfelelője proteomjait, azaz a bennük expresszált proteinek összességét. Az expresszált proteinek természetében – pl. mennyiségében vagy foszforiláltsági szintjében – bekövetkezett változások detektálhatók. Az így nyert adatok bepillantást engednek a kórfolyamat természetébe, valamint új biomarkereket eredményezhetnek, melyek a diagnosztikában vagy új terápiás eljárások kifejlesztésében lehetnek hasznosak.
A proteom tanulmányozása Egy sor különböző módszer alkalmazható a sejtekben és szövetekben expresszált proteinek vizsgálatára. Például a következők:
2D gél elektroforézis mikroszekvenálással kombinálva Western blotting, mely során antitestekkel azonosítjuk az elektroforézissel szeparált proteineket immunhisztokémia és immuncitokémia, melyben antitesteket alkalmazunk az egyes proteinek sejten vagy szöveten belüli in situ azonosítására enzim-kapcsolt immunoszorbens módszer (enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA), mely leginkább a szekretált proteinek, pl. gyulladásos citokinek mérésére szolgál kifinomultabb eljárások, pl. protein microarray-ek és SELDI-TOF Ezeket a módszereket részletesebben tárgyaljuk az alábbiakban.
1
2D gélelektroforézis Ez voltaképpen egy régi módszer, mely során a sejtekből-szövetekből kivont proteineket először izoelektromos fókuszálással szeparáljuk izoelektromos pontjaik szerint. Ez az első dimenzió. Az így szeparált proteineket tartalmazó „sávot” kimetsszük és egy másik gél tetejére fektetjük. A második gélben - denaturáló környezetben - szeparáljuk a proteineket molekulasúlyuk szerint. A módszer tehát 2 dimenzió szerint választja el a proteineket: izoelektromos pontjuk és molekulasúlyuk szerint. Így sokkal jobb szeparáció érhető el, mint az egydimenziós módszerekkel. A megfestett 2D géleken protein „foltok” sokasága látható, a probléma az egyes „foltok” azonosításában rejlik. Ez a régóta használatban lévő módszer ma reneszánszát éli, a belőle nyert adatok feldolgozására képes módszerek fejlődése miatt. A mintafelismerő (pattern recognition) szoftverek (pl. a Delta2D és a PDQuest) képesek a protein foltok elhelyezkedésének és erősségének összehasonlítására, például a beteg és egészséges minták között, és a közöttük lévő különbségek kimutatására. A protein szekvenáló módszerek fejlődése azt eredményezte, hogy lehetségessé vált a gélből kimetszett protein foltok azonosítása a protein szekvenciák sokaságát tartalmazó online adatbázisok segítségével.
Antitestek Antitesteket proteinek kimutatására először 1948-ban használtak. A kutatásban és a diagnosztikában az 1970-es évek óta számítanak standard reagensnek. Az antitestek sokoldalúan és specifikusan használhatók az egyes proteinek kimutatására. Sokféle módszer részeként alkalmazhatók proteinek azonosítására, mennyiségi analízisére és tisztítására. A viszonylag olcsó antitestek megjelenése a kereskedelemben (jellemzően egér vagy nyúl IgG) feleslegessé tette az antitestek „házi” előállítását.
Western blotting A sejt- vagy szövetkivonatban levő proteinekről a Western blotting módszer segítségével mind kvalitatív, mind kvantitatív információhoz juthatunk. A módszer roppant egyszerű. Első lépésben méretük alapján szétválasztjuk a proteineket egy poli-akrilamid gélben, majd egy membránra visszük át őket. Ezt követően antitestek segítségével azonosítjuk a minket érdeklő proteineket. A módszernek az az előnye, hogy könnyen megkülönböztethető a specifikus jelölés a háttértől a molekulasúly alapján. A módszer könnyen kvantitatívvá tehető, bár e tekintetben nem árt némi körültekintés. Némely poszt-transzlációs modifikáció – pl. glikoziláció és foszforiláció – is detektálható a Western blotting segítségével.
2
A módszer legsúlyosabb hátránya, hogy érzékeny a sejtek, szövetek proteinjeinek post mortem proteolitikus fragmentációjára, ezenkívül viszonylag nagy mennyiségű proteint tartalmazó mintákat igényel, és egy futtatás során csak egyféle protein azonosítható.
Immunhisztokémia és immuncitokémia A módszert kiterjedten alkalmazzák mind a diagnosztikában, mind az alapkutatásban. A módszer alkalmazása szöveti metszetek vagy sejtpreparátumok készítésével kezdődik, pl. klinikai mintákból. A következő lépés az úgynevezett „antigen retrieval”, melynek célja, hogy megkönnyítse az antitest hozzáférését a detektálandó protein antigénhez. Ez a lépés különféle technikákat involválhat, pl. melegítés mikrohullámokkal, enzimatikus emésztés vagy kémiai kezelés. Hogy melyik technikát választjuk, az a minta természetétől, a fixálás időtartamától és a vizsgálandó antigén minőségétől függ. A detektálás módját leggyakrabban az antigén szövetbeli mennyisége határozza meg. Manapság sokféle amplifikációs rendszer van kereskedelmi forgalomban, melyek használata igen kis mennyiségű antigén detektálását is lehetővé teszi. A legtöbb – színes vagy fluoreszcens jelölést alkalmazó – módszer csak kvalitatív kimutatást tesz lehetővé. Radioaktívan jelölt antitestek és autoradiográfia alkalmazása azonban lehetővé teszi az antigének kvantitatív analízisét a sejt- vagy szövetpreparátumokban.
ELISA Az ELISA módszer során az antigént vagy az azt felismerni képes antitestet műanyag edény aljára kötjük. Az ELISA a Western blotting-nál kevésbé érzékeny a proteolitikus degradációra, és képes az egyes proteinek igen pontos kvantitatív analízisére. Mivel a módszer sejt- és szövetkivonatok analízisére képes, pontos kontrollok alkalmazására van szükség, hogy elkerülhessük a mintában levő sejtek számának és a különféle sejttípusok arányának ingadozásából eredő artefactumokat. Az ELISA nem ad információt a proteinek poszt-transzlációs módosulásairól vagy a különböző izoformák jelenlétéről, kivéve, ha izoforma-specifikus antitesteket használunk. Proteinek szubcelluláris lokalizációjának meghatározása ELISA-val csak akkor lehetséges, ha a módszer alkalmazása előtt gondosan frakcionáljuk a különböző sejtalkotókat. A módszer nagy előnye, hogy automatizálható, ami lehetővé teszi a szövetkivonatok vagy testfolyadékok protein komponenseinek rutinszerű kvantitatív analízisét. Nagy áteresztőképességű (high throughput) 96-well plate-ek kaphatók a kereskedelemben klinikai diagnosztikai laboratóriumok számára. Példaként említhető, hogy régóta használják az ELISA módszert a citomegalovírus, rubeola és Toxoplasma ellenes antitestek kimutatására terhes nők szérumából. Az említett patogének igen veszélyesek a fejlődő magzatra, ezért nagyon fontos az anya immunállapotának megállapítása.
3
ELISA alapú módszerek használatosak auto-antitestek kimutatására autoimmun betegségek diagnosztikájában, valamint betegség biomarkerek felmérésére (pl. gyulladásos kórképekben, kardiomiopátiákban és tumoros megbetegedésekben). Ezeknek a teszteknek az érzékenysége és specificitása jó, és klinikai vizsgálatok szerint mindennapos klinikai alkalmazásuk nagyban hozzájárul a pontos diagnózis felállításához. Mint minden antitest alapú módszernek, az ELISA-nak is hátránya, hogy egyszerre csak egy, vagy legfeljebb néhány biomarkert tud vizsgálni.
Protein microarray-ek A protein microarray-ek a gén alapú microarray-ekhez hasonló elven működnek. Különféle protein microarray-ek léteznek az egyes proteinek detektálására és kvantitálására. Antitest microarray-ek Egy antitest microarray akár 1000 különböző antitestet (legtöbbször monoklonálist) tartalmazhat hordozó lemezhez kötve. Az array-t a proteineket tartalmazó mintával inkubáljuk, majd a protein-antitest interakciókat detektáljuk:
direkt módon fluoreszcencia segítségével (jelölés-alapú mérés) szekunder antitest használatával detektáljuk a megkötött proteineket (szendvics módszer) Az antitest array-ek segítségével sok marker detektálható egyszerre, így kifejlesztésük megoldotta az ELISA módszerrel kapcsolatos problémákat. A protein microarray-eket a klinikum következő területein használják:
citokin expresszió szintjének mérése számos vírus vagy baktérium egyidejű azonosítása allergia diagnosztikája protein-protein kölcsönhatások vizsgálata protein modifikációk detektálása A módszer további előnye, hogy a különböző mért protein-mintázatok segíthetik az optimális terápia megválasztását. Jelenleg a kereskedelmi forgalomban lévő antitest-microarray-ek választéka igen limitált, ezért a legtöbb array-t „házilag” kell elkészíteni, ami költséges és időigényes folyamat. Még a néhány forgalomban lévő (Novagen, Whatman Schleicher & Schuel) antitest microarray sem elfogadott hivatalosan klinikai diagnosztikai célokra. Azonban az elfogadott betegség-biomarkerek száma egyre nő, ezért csak idő kérdése a viszonylag olcsó antitestmicroarray-ek elterjedése.
4
Szöveti microarray A szöveti microarray kifejlesztésének az volt a célja, hogy az immunhisztokémiai tesztek és az in situ hibridizáziós vizsgálatok hatékonysága javuljon. Apró (0,6 mm átmérőjű) szövetmintákat vesznek injekciós tű segítségével, és precíz minta szerint (array) paraffin tömbbe ágyazzák őket. Az egyes tömbök különböző betegekből és/vagy szövetekből származó minták százait tartalmazhatják. Az egyes paraffin tömbökből mikrotom segítségével 100-150 metszetet készítünk, ezek mindegyikét tárgylemezre kötjük, és különböző antitestekkel vagy oligonukleotidokkal reagáltatjuk. Így egy időben sok minta tesztelhető sok antitesttel. Ez a módszer különösen hasznosnak bizonyult tumor minták vizsgálata esetében. Kémiai vegyület microarray A kémiai vegyület microarray esetében különböző kémiai vegyületek sokaságát kötjük üveg vagy műanyag felületre. Ezek a vegyületek a módszer használata során „csapdába ejtik” a velük kölcsönhatásra képes proteineket vagy egyéb molekulákat. Ez a fajta array hatalmas lehetőségeket rejt a gyógyszerfelfedezésben. A CD20 antigén detektálása - immuncitokémia vagy áramlási citometria segítségével Mabthera (hatóanyag: rituximab nevű monoklonális antitest) kezelést kapott limfómás betegekben nagyban segíti a kezelés hatékonyságának követését.
SELDI-TOF A protein expresszió analízise és proteinek kvantitálása ugyan kivitelezhető elektroforézisen alapuló módszerekkel is, a tömegspektrometria alkalmazása nagyban megnövelte e vizsgálatok érzékenységét és specificitását, és lehetővé tette proteintartalmú minták nagy áteresztőképességű (high throughput) analízisét. A SELDI-TOF elnevezés a „felület által erősített lézer deszorpció/ionizáció repülési idő mérő tömegspektrometriával” elnevezés angol megfelelőjének kezdőbetűiből alkotott betűszó (surface-enhanced laser desorption/ionisation with time of flight mass spectrometry). A módszer azt használja ki, hogy a különböző proteinek differenciáltan kötődnek a különféle felülettípusokhoz. A „chip” - kihasználva felületének tulajdonságait megköti a különböző típusú (savas, bázikus, antigén stb.) proteineket; ez a lépés a minta proteinjeinek bizonyos fokú „előtisztítását” eredményezi, mely növeli a tömeg-spetrometria felbontóképességét. A chip-ekre ezután lézersugarakat irányítanak úgy, hogy ennek következtében a protein molekulák ionizálódnak és leválnak a felületről. A szabaddá vált protein molekulákat egy repülési időt (time of flight) mérő tömegspektrométer detektálja, mely – speciális szoftver segítségével - megméri tömegüket és relatív abundanciájukat a mintákban. Ezzel a technológiával 300-800 féle protein analízise 20 µl térfogatú mintákból rutin feladatnak számít. 5
A SELDI-TOF sokoldalúan használható proteomikai módszer, de csak a proteinek molekulasúlyáról, relatív abundanciájáról és biofizikai jellemtőiről nyújt felvilágosítást. A proteinek azonosságát (aminosav-sorrendjét) további módszerrel (szekvenálás) kell meghatározni.
Betegségek proteomikai markerei A legtöbb betegség multifaktoriális . A faktorok genetikailag meghatározottak vagy környezetiek lehetnek. Mindegyik faktor képes megváltoztatni egy adott protein expresszióját, ezért talán nem meglepő, hogy a legtöbb betegségre sokféle protein expressziójának megváltozása jellemző (protein térképek). Kiterjedt protein térkép vizsgálatok jelzik, hogy gyakran nem lehet egyetlen protein markerre hagyatkozni a diagnosztikában vagy a terápiára adott reakció monitorozásában. Egyre több kutatás jelzi, hogy a cerebrospinális folyadék (CSF) protein térképének analízise hasznos lehet a központi idegrendszer betegségeinek diagnózisában és a kórfolyamat monitorozásában. Hasonló vizsgálatok során tumor biomarkereket azonosítottak vérplazmában, míg reumatoid artritisz biomarkerek az szinoviális folyadékból kerültek elő.
Fejlődés a terápia terén
Új diagnosztikai biomarkerek azonosítása mellett a proteomikai kutatás a terápiában is fejlődést hozott. Ez a fejlődés többek között az alább felsorolt ágensek terápiás hasznosítása terén jelentkezik: monoklonális antitestek specifikus tirozin kináz inhibitorok vakcinák Monoklonális antitestek a terápiában A felfedezés, hogy specifikus proteinek expressziója növekszik (up-regulated) bizonyos fajta tumoros megbetegedésekben, e proteineket felismerő, humanizált monoklonális antitestek kifejlesztéséhez vezetett. Léteznek olyan antitestek (pl. Herceptin), amelyek receptor fehérjékhez kötődnek, ezáltal blokkolják a sejt-proliferációért, metasztázisért és szöveti invázióért felelős jelátviteli utakat; továbbá a tumorsejtekhez kötődve mozgósítják a beteg saját immunrendszerét. Radioaktív izotóppal vagy toxinnal konjugált antitestek képesek az általuk felismert tumorsejtek közvetlen elpusztítására.
6
Tirozin kináz inhibitorok mint terápiás ágensek Sokféle tumorsejt proliferációs, inváziós és metasztatikus képessége növekedési faktoroktól függ. Ezt támasztja alá, hogy növekedési faktor receptorok mutációja vagy növekedési faktorok túlexpressziója (over-expression) serkenti a tumorsejtek proliferációját. Mutáns növekedési faktor receptorok tumor-specifikus expressziója lehetővé tette ezek szelektív gátlásán alapuló terápiás eljárások kifejlesztését. Vakcinák és gyógyszerek A vakcinák hagyományos szerepe a betegségek megelőzésében van. Az újabban kifejlesztett vakcinák közül néhányat gyógyításra terveztek, pl. rák és Alzheimer kór gyógyítására.
7
METABOLOMIKA A legújabb „-omika” tudomány a metabolomika. A genomika, transzkriptomika és a proteomika sok ígéretes felfedezést hozott az orvostudományban. Hasonlóképpen, a metabolomikától a komplex biológiai rendszerek megértésének új szintje várható.
Mi a metabolomika? A metabolomika általánosan véve a sejtek, szövetek, szervezetek, biológiai folyadékok teljes metabolit-profiljával foglalkozik. Vizsgálja a metabolit-profil különféle stimulusokra adott válaszait. E stimulusok lehetnek pl. toxinok, betegségek, genetikai változások, öregedés, gyógyszerhasználat. Különös érdeklődésre tarthatnak számot azok a kis molekulasúlyú (<1000 Da) metabolitok, amelyek szubsztrátként vagy termékként vesznek rész azokban az anyagcsere folyamatokban, amelyek funkciója a tápanyagok energiájának kinyerése és az élet fenntartásáért felelős kémiai és fiziológiai folyamatok fenntartása. Bizonyára mindannyiunk számára ismerősek az anyagcsere folyamatokat ábrázoló hatalmas poszterek. Úgy is tekinthető, hogy a fennálló metabolit-profil jellemzi igazán a sejt állapotát és funkcióját a mintavétel időpontjában, és a DNS, a transzkriptumok, a proteinek erre nézve prediktívek. Más szóval, hogy Bill Lasley-t, a Kaliforniai Egyetem kutatóját idézzük: „a genomika és a proteomika megmondja, mi történhet, a metabolomika pedig, hogy mi történt valójában”.
Hányféle metabolit létezik? A Humán Genom Projekt kiderítette, hogy kb. 30 000 génünk van, melyek kb. 100 000 különböző protein előállítására képesek. Az emberben az ismert metabolitok száma azonban jóval kisebb, kb. 3-4000, bár a pontos számuk nem ismert. Ennek a magyarázatát az alábbiakban látni fogjuk. Metabolomnak nevezzük ezeknek a metabolitoknak az összességét, melyek lehetnek szénhidrátok, aminosavak, lipidek, purin és pirimidin bázisok, antioxidánsok, enzim kofaktorok, hormonok, tápanyagok, neurotranszmitterek és vitaminok. Ezeken túl bizonyos klinikai minták tartalmazhatnak még drogokat és ezek metabolitjait, táplálékkal felvett kis molekulákat és bélbaktériumokból származó metabolitokat.
Nem mértünk már eddig is metabolitokat? Specifikus metabolitok szintjének mérése sokféle klinikai diagnosztikai teszt alapja, ilyen például a cukorbetegek vércukorszintjének mérése. Ezekben az esetekben azonban tudjuk, hogy a mért metabolitok relevánsak az adott betegségben. 8
Ezzel ellentétben a metabolomika sok anyagcsere utat vizsgál egyszerre, egységesen és prekoncepciók nélkül. Egy orvosilag releváns példa: a beteg és az egészséges rendszer metabolit profiljai közötti különbség bepillantást nyújthat a kórfolyamatba. Ezeknek a profiloknak, valamint az esetleges újonnan felfedezett biomarkereknek a genetikai eredete aztán visszakövethető. Az ilyen módon elvégzett metabolomikai kísérletek új hipotéziseket generálnak, melyek klasszikus módszerekkel tesztelhetők.
Hogyan tanulmányozható a metabolom? A génekkel és proteinekkel ellentétben, a metabolom hatalmas szerkezeti diverzitása nem teszi lehetővé, hogy egyetlen analitikai platform segítségével tanulmányozzuk a klinikai mintákban jelenlevő összes metabolitot. Habár lehetséges biopsziával nyert szövetminták metabolit-profiljának vizsgálata is, az első orvosi metabolomikai kísérletekben plazma-, szérum- és vizeletmintákat használtak, mert ezek minimálisan invazív beavatkozással hozzáférhetőek. A legtöbb analitikai platform használata előtt a minták előkészítése szükséges, például protein precipitáció, sómentesítés vagy szilárd fázisú extrakció. A következőkben mérlegelni kell, hogy a klinikai minták közvetlenül analizálhatók-e, vagy először szét kell választani a metabolitokat kromatográfiával vagy más módszerrel. A legtöbb esetben a metabolom komplexitása szükségessé teszi az elválasztás-technikai lépés beiktatását.
Elválasztási módszerek Ha előzetes elválasztás szükséges, három módszer közül választhatunk az esetek többségében:
Gázkromatográfia (gas chromatography, GC). Ez a legfejlettebb elválasztás-technika, amely nagyon jó felbontást biztosít. Azonban gázkromatográfiával csak illékony anyagokat analizálhatunk, és nagyon sok fontos metabolit molekulafajta nem ilyen. A nem illékony metabolitok némely esetben illékony származékokká alakíthatók kémiai módszerekkel, de sajnos ez bonyolítja a metabolomikai adatok gyűjtését. Nagy teljesítményű folyadék kromatográfia (high-performance liquid chromatography, HPLC). Ez a módszer nagyban bővíti mind a közvetlenül, mind a kémiai módosítás után analizálható metabolitok körét, azonban felbontása a gázkromatográfiánál gyengébb. A felbontás azonban, mint arról az alábbiakban, az analitikai platformok diszkussziója során szó esik, gyakran javítható az átfedő kromatográfiai csúcsok különböző fizikai tulajdonságok alapján történő megkülönböztetésével. Kapilláris elektroforézis (capillary electrophoresis, CE). Ez a módszer ma még kevésbé széleskörűen használt, azonban népszerűsége várhatóan nőni fog. A leggyakoribb konfiguráció a kapilláris zóna elektroforézis (capillary zone electrophoresis, CZE), bár ez csak ionos molekulák esetében használható. 9
Elektromosan töltött és semleges molekulák egyaránt elválaszthatók micelláris elektrokinetikus kromatográfia (micellar electrokinetik chromatography, MEKC) segítségével, mely során felületaktív anyagok mintához adása szükséges. A kapilláris elektroforézis előnyei a nagyon jó felbontóképesség, széleskörű alkalmazhatóság, és a kis (szubmikroliter) anyagigény.
Analitikai technikák a metabolomikában A metabolomika tudományában két analitikai technika használata dominál. Ezek a magmágneses rezonancia spektroszkópia (nuclear magnetic resonance spectroscopy, NMR) és a tömegspekrometria (mass spectrometry, MS). Ez valószínűleg így is marad belátható ideig, bár a kutatók tudatában vannak, hogy további módszerek lesznek szükségesek a detektálható metabolitok számának növeléséhez. A szóban forgó módszerek ismertetése meghaladja kereteinket, csak vázlatos ismertetésükre szorítkozhatunk. Az analitikai kémiai tankönyvek segítenek az érdeklődők tudásának elmélyítésében.
Mag-mágneses rezonancia spektroszkópia (nuclear magnetic resonance spectroscopy, NMR spectroscopy) Az NMR spektroszkópia az atommagok (pl. 1H és 13C) mágneses tulajdonságain alapszik, és fontos információkat szolgáltathat a biomolekulák azonosságáról és szerkezetéről. A klinikai minták közül a plazma- vagy vizeletminta kevés előkészítést igényel vizsgálat előtt, és nincs szükség az analit molekulák kromatográfiás szétválasztására. Emellett nagy áteresztőképességű (high throughput) mintafelviteli rendszerek alkalmazása lehetővé teszi a módszer használatát a metabolit-koncentrációk időfüggésének mérésére. Az NMR sok metabolit molekula-féleség egyidejű azonosítására képes, közel univerzális detektáló rendszer. Hátránya, hogy viszonylag inszenzitív, ezért csak a nagyobb mennyiségben jelen levő metabolitok – a metabolom kb. 10 %-a - analízisére képes.
Tömeg-spektrometria (mass spectrometry, MS) A tömeg-spektrométer a molekulákat ionizálja, melyek ennek következtében a „szülő”molekulára jellemző fragmentumokra disszociálnak. A készülék megméri az ionok (és fragmentumaik) tömeg/töltés arányát (m/z). Az egy bizonyos molekulaféleségre jellemző m/z értékek összességét tömegspektrumnak nevezzük. Az egyes tömegspektrumok - az ujjlenyomatokhoz hasonlóan – adatbázisokban megkereshetők, így a spektrumot eredményező molekula azonosítható. A tömeg-spektrométereknek több típusa létezik, a legkifinomultabb a Fourier-transzformált ion ciklotron rezonancia (Fourier Transform Ion Cyclotron Resonance, FT-ICR) analizátor. Ennek használatával elméletileg a molekulák empirikus képletei meghatározhatók, méghozzá előzetes kromatográfiás elválasztás nélkül. Ez ideálissá teszi a módszert biológiai folyadékok metabolomikai analízisére. A baj csak az, hogy ezek a készülékek nagyon költségesek. Szélesebb körben elterjedtek az elválasztástechnikai eszközökkel közvetlenül kapcsolt tömeg-spektrométerek. Ezek közül a GC-MS a 10
legfejlettebb, mert a szétválasztott metabolitok a gázkromatográfot gázfázisban hagyják el, így közvetlenül a tömeg-spektrométerre vihető. A HPLC-MS vagy a CE-MS használatánál probléma az elválasztás-technikai eszközök és az MS készülék közötti felület (interface) kialakítása. Az interface ionizációs hatékonysága magas kell hogy legyen, nem szabad, hogy tovább módosítsa a szeparált analitokat, nem szabad, hogy háttérzajt keltsen az elpárolgott mobil fázis, és nem szabad, hogy az interface rontsa az MS működését – pl. ion szuppresszió által. Ezek a feltételek komoly kihívást jelentenek a szakembereknek. Az NMR viszonylag alacsony érzékenységével szemben, az MS alapú módszerek nagyon érzékenyek és sokoldalúan alkalmazhatók, azonban az egy kísérlet során detektálható metabolitok száma limitált lehet olyan – a műszerre jellemző - paraméterek miatt, mint az ionizáció módja, az adatgyűjtési mód vagy a készülék típusa.
Elektrokémia Az elektrokémiai oxidáción vagy redukción alapuló módszereket – HPLC-vel kapcsoltan redox-aktív biomolekulák nagy érzékenységű, szelektív detektálására használják. Habár az elektrokémiai áramlási cellák többféle típusa van forgalomban, a nagy felületű, porózus grafit elektródokkal rendelkező kolorimetriás cellák a legelterjedtebbek, mert közel 100%-os elektrolízisre képesek, így nagyon érzékenyek, valamint stabil és reprodukálható válaszjeleket adnak. A coulometriás elektrokémiai array detekció (CEAD) a módszer új keletű továbbfejlesztése, amelyben több (akár 16) kolorimetriás cella van sorba kapcsolva. Megfelelő HPLC rendszerrel kapcsolva a CEAD redox-aktív anyagok széles körének azonosítására képes, mind kromatográfiás viselkedésük, mind inherens elektrokémiai sajátságaik alapján, ezért ideális a metabolomikai vizsgálatokra. Kimutatták, hogy ischaemiás vagy neurodegeneratív kórképek fontos jellemzője, hogy a sejtek oxidatív és antioxidáns folyamatainak egyensúlya megbomlik. A keletkező oxidatív stressz - a makromolekulák (proteinek, lipidek, DNS) károsodása mellett – redox-aktív metabolitok abnormális mintázatának kialakulásához vezet, tehát a CEAD a klinikai kutatásokban igen fontos metabolit-csoport analízisére képes. Sajnos a módszernek – csakúgy, mint a többi analitikai platformnak – hátrányai is vannak. A kromatográfiás lépés miatt a CEAD nem alkalmas nagy áteresztőképességű (high throughput) vizsgálatokra, és - az NMR-rel és az MS-el ellentétben – csekély információt nyújt az analitok szerkezetéről.
Hogyan analizáljuk és interpretáljuk a metabolomikai adatokat? Bármelyik ismertetett analitikai platformot használjuk is a metabolomikai vizsgálatokban, a kapott adathalmaz nagy információ-sűrűséggel bír, hiszen mindegyik minta adatpontok százait, ha nem ezreit eredményezi. Tovább bonyolítja a helyzetet, hogy nem csak, vagy nem elsősorban az egyes metabolitok koncentrációjára vagyunk kíváncsiak, hanem interakcióikra és egymásba alakulásaik sebességére. Az ilyen információ kinyerésére a bonyolult adathalmazokból – együttesen kemometriának nevezett - sokváltozós statisztikai és
11
mintafelismerő módszereket használnak, melyek részletes ismertetése messze meghaladja ennek az írásnak a kereteit.
A metabolomika alkalmazása a klinikai kutatásban Tegyük fel, hogy a metabolomikát a „beteg” és a „kontrol” csoport közötti különbséget jelző biomarkerek felfedezésére kívánjuk felhasználni. A vizsgálatot négy fázisra bonthatjuk.
Az első fázisban kiválasztjuk a megfelelő minta-típust és az analitikai platformot. A mérés eredményeképpen kapott adathalmazt sokváltozós adatelemzési módszereknek vetjük alá, hogy megtaláljuk azokat a metabolitokat, melyek a „beteg” és a „kontroll” minták megkülönböztetésére szolgálhatnak. A következő lépés a biomarkerek azonosítása, rendszerint MS alapú módszerekkel. Ezután az azonosított biomarkerek hasznosságának tesztelésére kerül sor több központú vizsgálatokban. Végül, miután a diagnosztikus biomarker hasznossága bizonyítást nyert, hagyományos, hipotézis-vezérelt kutatásra kerül sor. Az a cél hogy megállapítsuk a marker genetikai eredetét, sejten belüli kompartmentalizációját, valamint annak okát, hogy abnormális mennyiségben van jelen a beteg szervezetben. Ezek az információk a betegség kórélettanába is bepillantást nyújthatnak.
Konklúzió A proteomika és a metabolomika nagyon különböző módszereket használ nagyon különböző molekulatípusok vizsgálatára. E két tudományterület mögött meghúzódó filozófiái hátterek azonban nagyon hasonlóak. Mindkét terület „modell-mentes” megközelítést alkalmaz a betegségért felelős celluláris funkció-változások felderítésére, remélve, hogy ezek a változások hasznos biomarkerek lesznek a betegségek etiológiájának tisztázásában és új terápiás eljárások kifejlesztésében.
12
