Proteomika Peptid szekvenálás. Dr. Csősz Éva Debreceni Egyetem ÁOK Biokémiai és Molekuláris Biológiai Intézet Proteomika Szolgáltató Laboratórium

Proteomika

Peptid szekvenálás

Dr. Csősz Éva Debreceni Egyetem ÁOK Biokémiai és Molekuláris Biológiai Intézet Proteomika Szolgáltató Laboratórium

Fókuszterületek Omikák, rendszerbiológia – hipotézis vezérelt és hipotézismentes megközelítések Miért van szükség a proteomikára? Milyen jellegű információt tud adni a proteomika? A proteomika módszertana A proteomika eszköztára A proteomika szerepe a diagnosztikában

Környezeti változás/ Stimulus

Sejt

Válasz

Patológiás reakció


Környezeti hatások mesterséges módosítása ( pl. gyógyszer adása)

Válasz

Válasz karakterizálása ( metabolitok szintjének vizsgálata szérumban)

Hipotézis-vezérelt és hipotézis nélküli megközelítések


Válasz

Válasz karakterizálása

Környezeti hatások mesterséges módosítása Hipotézis-vezérelt megközelítés Egy jól körülhatárolt kérdés

Egy jól értelmezhető válasz

A vak ember és az elefánt ...



Válasz


Környezeti hatások mesterséges módosítása Hipotézis-vezérelt megközelítés Egy jól körülhatárolt kérdés

Egy jól értelmezhető válasz

Előnye: Pontos információt nyújt Hátránya: Lassú „nem látjuk a fától az erdőt” – nehézkes lehet az egész megértése



Válasz


Környezeti hatások mesterséges módosítása Hipotézismentes megközelítés Egy kérdés

Nagy információ halmaz

Omikák ... – a cél az egész megértése...

?

?



Válasz


Környezeti hatások mesterséges módosítása Hipotézismentes megközelítés

Nagy információ halmaz

Egy kérdés Erősség:

Omikák – nagy mennyiségű adattal dolgoznak – speciális adatgyűjtési és adatfeldolgozási módszerek szükségesek, rendszerszintű információkat kaphatunk Probléma lehet: A kapott adatok megbízhatóságának biztosítása, az adatok értelmezése

Omikák ... – a cél az egész megértése...

?

Genomika/transzkriptomika Proteomika Lipidomika Glikomika Metabolomika Foszfoproteomika


Modell nélkül? „All models are wrong, but some are useful." George Box statistician

„All models are wrong, and increasingly you can succeed without them." Peter Norvig, Google

Együtt-változások vizsgálata ok-okozati összefüggések vizsgálata nélkül

Rendszerbiológiai megközelítés Különböző módon nyert információk közös rendszerben történő kezelése Probléma lehet a vizualizáció

• Milyen gének aktívak adott időpillanatban?

• Rétegekben

• Milyen fehérjék vannak jelen adott időpillanatban?

ábrázoljuk

• Melyek a foszforilált fehérjék adott időpillanatban?

• Interakciós

• Melyek a glikozilált fehérjék adott időpillanatban?

hálózatokban

• Milyen lipidek vannak jelen adott időpillanatban?

ábrázoljuk

• Milyen metabolitok/kismolekulák vannak jelen

adott időpillanatban? • Milyen a citokinek mennyisége az adott időpillanatban?

• …


Proteomika bevezető Genom DNS

RNS

Fehérje

Transzkriptom

Proteom

PROTEOM: Meghatározott sejtben, szövetben, vagy organizmusban adott körülmények között, egy adott időpillanatban kifejeződő fehérjék összessége. PROTEOMIKA: egy adott sejt, szövet, vagy organizmus proteomjának szisztematikus vizsgálata

*

Miért van szükség proteomikára? Azonos a genom, de különböző a proteom

vörös vértestek

izomsejtek

A különböző fehérjék változatos megjelenést eredményeznek azonos genom mellett

Miért van szükség proteomikára? A fehérjék szerepe:

Struktúrfehérjék – pl. aktin, miozin

Enzimek Receptorok Szabályozó funkció – pl. DNS kötő fehérjék Információ hordozók – citokinek, hormonok, lokális mediátorok Stb. A sejt effektorai a fehérjék

Miért van szükség proteomikára?

A fehérjék vizsgálata összetettebb képet ad a sejt működéséről

Miért van szükség proteomikára? Hogyan tudunk változást elérni, szabályozást végrehajtani? 1. Fehérjék mennyiségét változtatjuk Gén szinten mRNS szinten Transzláció szinten Fehérje degradáció szinten 2. Meglévő fehérjék aktivitását változtatjuk Kovalens módosítás nélkül Allosztérikus módosítás Fehérje-fehérje interakció révén Kovalens módosítással Reverzibilis Foszforiláció Acetiláció Metiláció Irreverzibilis Limitált proteolízis

*

Miért van szükség proteomikára? Microarray vs. proteomikai elemzés

Microarray adat

Proteomikai adat

• A microarray adatok jelentős mennyiségű és minőségű információt szolgáltatnak a

biológiai folyamatok megértéséhez • Az adott időpillanatban éppen bekapcsolt gének vizsgálatát teszi lehetővé • Jól használható az egyes gének expresszió változásának vizsgálatára • De a transzkriptom és a proteom nem azonos

Miért van szükség proteomikára? Miért vizsgáljunk fehérjéket?

kb. 42000 mRNA tranzkript/osztódó sejt 2,4 mRNS kópia/sejt

kb. 95 millió

fehérje/osztódó sejt 3919 fehérje kópia/sejt

Marguerat, 2012, Cell

A fehérje változások nagyobb dinamikus tartományban történnek, mint az mRNS változások A transzkriptóm zsugorodik a nyugalmi időszakban A fehérjék globális mennyisége nem változik, de a proteóm átalakul

Miért van szükség proteomikára?

•

A különböző fehérjék változatos megjelenést eredményeznek azonos genom mellett • • •

A sejt effektorai a fehérjék

A transzkriptom és a proteom nem azonos

A fehérje változások nagyobb dinamikus tartományban történnek, mint az mRNS

változások •

Míg a transzkriptóm zsugorodik a nyugalmi időszakban, a fehérjék globális mennyisége nem változik, hanem a proteóm átalakul •

A fehérjék vizsgálata összetettebb képet ad a sejt működéséről


Fehérjék azonosítása Komplexben levő fehérjék és interakciós partnerek azonosítása

Fehérjék poszt-transzlációs módosításainak azonosítása, lokalizálása Sokszor maga a fehérje jelenléte/hiánya nem ad elegendő információt a tényleges működésre vonatkozóan

Glikogén

Glikogén foszforiláz Glükóz-1P

Fehérjék poszt-transzlációs módosításainak azonosítása, lokalizálása Fruktóz-6-foszfát

Foszfofrukto-2 kináz

Fruktóz-6-foszfát

ATP Pi

ADP

F2,6Páz

PF2K P Fruktóz-2,6-biszfoszfát

Fruktóz-2,6-biszfoszfát

Csak a fehérje jelenléte/hiánya nem ad elegendő információt a tényleges működésre vonatkozóan

Fehérjék bizonyos térszerkezet-változásainak azonosítása

Sup35 – transzlációs terminációs faktor

Riboszóma komplexhez kapcsolódik, leállítja a transzlációt

Prion forma – a riboszóma nem érzékeli a stop kodont, a fehérjék hossza megnő és a funkciója is megváltozik

A fehérjék térszerkezet-változása gyökeresen megváltoztathatja a fehérje funkcióját

Natív, endogén PrPc PrPsc interakciója endogén PrPc-vel Spontán PrPsc keletkezik PrPsc interakciója endogén PrPc-vel

Fehérje interakciós hálózatok felépítése

Az egyes fehérjék tulajdonságai, funkciói, a szervezetben betöltött szerepei jobban értelmezhetők és megérthetők a fehérje hálózatok szintjén

Fehérjék relatív vagy abszolút mennyiségének meghatározása

Dr. Crhistina Ludwig jóvoltából

Milyen jellegű információt tud adni a proteomika?

Milyen jellegű információt tud adni a proteomika?

• Fehérje azonosítása • Fehérje lokalizációja • Fehérje PTM meghatározása • Fehérje szerkezeti adatok • Fehérje-fehérje interakciók • Mennyiségi információk


Fehérje elemzés vs. proteomika Fehérje elemzés – egyetlen fehérje tanulmányozása: azonosítás, szerkezet és funkció meghatározás ... – top-down proteomika Proteomika – a proteom vizsgálata – bottom-up proteomika

Top-down proteomika

MS/MS analízis Bottom-up proteomika

Fehérjék kinyerése

Tripszines emésztés MS/MS analízis

Fehérje elemzés vs. proteomika

A proteomika módszertana Gél alapú módszerek

Kétdimenziós gélelektroforézis

Tömegspektrometriás módszerek

Fehérjék emésztése Peptidek elválasztása és dúsítása – kromatográfiás lépés

Fehérjék emésztése

Fehérje mintázat vizsgálata

Tömegspektrometriás analízis

Fókuszterületek Omikák, rendszerbiológia – hipotézis vezérelt és hipotézismentes megközelítések Miért van szükség a proteomikára? Milyen jellegű információt tud adni a proteomika? A proteomika módszertana A proteomika eszköztára Kétdimenziós elektroforézis Tömegspektrometriás módszerek A proteomika szerepe a diagnosztikában

Kétdimenziós gélelektroforézis – 2DE

• Hatékony módszer fehérjék elválasztására • Nagyon érzékeny, nagy technikai tudást igénylő módszer • Csak a legtisztább anyagokat lehet használni • Az első dimenzió az izoelektromos fókuszálás – a fehérjék elválasztása a pI alapján • A második dimenzió az SDS-PAGE – a fehérjék elválasztása a méret alapján • Alkalmas teljes proteómok vizsgálatára

• Legjobban sejtkultúrák vizsgálatára használható

Izoelektromos fókuszálás

pH 3

pH 10

• A fehérjék amfoterek, emiatt a töltésük változik a környezetük pH-jától függően • Izoelektromos pont: az a pH értek, amelyen a fehérje nettó töltése nulla • A fehérjék elválasztása a pI alapján történik

Izoelektromos fókuszáló készülék

• A fehérjék vándorolnak az elektromos térben és amint elérik az izoelektromos pontjuknak megfelelő pH értéket elveszítik töltésüket és vándorlásuk megszűnik

méret pI

Kétdimenziós elektroforézis A Minta

B Minta

2DE

2DE

gélanalízis kvalitatív és kvantitatív különbségek • Alkalmas a teljes proteóm vizsgálatára • Minőségi és mennyiségi adatot egyaránt szolgáltat Hátrány • A technikai variációk kiküszöbölésére legalább három párhuzamossal kell dolgozni • Munkaigényes és vegyszerigényes

Nagyhatékonyságú gélanalízis – a különbségek kimutatása

A kétdimenziós elektroforézis eredményeinek kiértékelése

• Progenesis (NonLinear Dynamics) • Delta2D (Decodon)

• PDQuest (BioRad) • DeCyder (GE Healthcare) • Melanie ...

• Redfin (BioRad)

A 2D elektroforézis során nyert gélképek összehasonlítása Delta2D szoftverrel

DIGE – differenciál gél elektroforézis H. Influenzae (Kontrol)

Jelölés DIGE festékkel

H. H. Influenzae Influenzae (aktinonin (aktinonin kezelt) kezelt)

Minták összekeverése

2DE

• A minták összekeverésével kiküszöbölhetők az analízisek közti technikai különbségek • Alkalmas a teljes proteóm vizsgálatára • Minőségi és mennyiségi adatot egyaránt szolgáltat Hátrány • Drága

Poszt-transzlációs módosítások kimutatására szolgáló festési eljárások

Sypro Ruby Flamingo Minden fehérjét megfest ProQ Diamond Csak a foszfoproteineket festi ProQ Emerald Csak a glikoproteineket festi

Fókuszterületek Omikák, rendszerbiológia – hipotézis vezérelt és hipotézismentes megközelítések Miért van szükség a proteomikára? Milyen jellegű információt tud adni a proteomika? A proteomika módszertana A proteomika eszköztára Kétdimenziós elektroforézis Tömegspektrometriás módszerek A proteomika szerepe a diagnosztikában

A fehérjék vizsgálata tömegspektrométer segítségével • Lehetővé válik a teljes proteóm analízise vagy az egyedi fehérjék azonosítása • Nagyon érzékeny, kis mintamennyiséget igénylő módszer • MS/MS vizsgálatokkal a fehérje nagy biztonsággal azonosítható

Fehérjét tartalmazó foltok kivágása

Enzime (tripszi emészt

A sejt lízise

2DE

Fehérjék azonosítása

Tömegspektrometriás analízis

A tömegspektrométer felépítése

Minta bemenet

Ion forrás

Elektronika

Tömeg analizátor

Detektor

Adatfeldolgozó rendszer

Vákuum rendszer Tömeg spektrum

Detektált jel

intenzitás

A tömegspektrum

Peptidek/fehérjék azonosítása

m/z

Adatbázisok (NCBInr, SwissProt), Speciális keresőprogramok (MASCOT), Kvantitálásra alkalmas szoftverek (ProteinPilot, MASCOT) használata

Az tömegspetrometriás adatok és a fehérje funkció összekapcsolása Detektált jelek – felvett spektrum – fehérje azonosítás/kvantitálás



intenzitás

Intakt fehérje MW alapján Túl sok variációs lehetőség – ritkán használható m/z

Tripszinnel emésztett fehérjéből származó peptidek m/z alapján – PMF: peptide mass fingerprint

intenzitás

Több variációs lehetőség – ha van előzetes információ, használható.

Közléshez nem elfogadott. m/z

Tripszinnel emésztett fehérjéből származó peptidek fragmentációja segítségével

intenzitás

Fehérje azonosítás

megállapított szekvencia alapján. Pontos információ, közléshez is elfogadott.

m/z

Fehérje azonosítás tömegspektrometriával •

A fehérjéket tripszinnel emésztik

•

Peptideket ionizálják és pontos tömegüket meghatározzák, hogy így azonosítsák a peptideket és fehérjéket (PMF), vagy ionokat választanak ki (anya ion/prekurzor ion) és fragmentálják őket (MS/MS spektrum)

•

A keletkezett egyszeres töltésű ionokat (leány ionok) analizálják hogy a

szekvenciát meghatározzák és azonosítják a peptidet, majd a peptidek segítségével a fehérjéket

Peptidek fragmentációja •

Az ütközési cellában történik, általában ütközés hatására

•

Több típusa létezik, leggyakrabban a CID – collision induced dissotiation – ütközés indukálta disszociációt alkalmazzák

•

Amikor a peptidek belépnek az ütközési cellába, akkor főként a peptid kötés mentén fragmentálódnak

•

Minden egyes peptidre optimalizálni kell az ütközési energiát

•

Ütközéses fragmentációkor főleg “b” és “y” típusú leány ionok keletkeznek

A „b” és „y” fragmens ionok y2

y3

H2N

Aminosav1

Aminosav2

b1

Aminosav3

b2 +

H2N

Aminosav1

y1

Aminosav2

Aminosav4

b3 + Aminosav3

Aminosav4

y ion

b ion y4 y3 y2 y1

MINTAPEPTID b1 b2 b3 b4

COOH

COOH

Peptidek szekvenálása MS/MS segítségével Komplex minta

Ionforrás

Analizátor1

Ütközési cella

MS/MS spektrum

fragmentáció

intenzitás

intenzitás

MS spektrum

Analizátor2

m/z

m/z

„b” és „y” sorozatok azonosítása

Peptid szekvencia megállapítása

Fehérje azonosítása

Detektor


Ionforrás

1. Tömegspektrum (MS) felvétele

Analizátor1

Ütközési cella

Analizátor2

MS spektrum

Prekurzor ion kiválasztása

Detektor


Ionforrás

2. Töltöttségi fok meghatározása

Analizátor1

Ütközési cella

Analizátor2

Detektor

+2 - Töltöttségi fok megállapítása - Megfelelő ütközési energia kiszámolása

Peptidek szekvenálása MS/MS segítségével 3. MS/MS spektrum felvétele

Komplex minta

Ionforrás

Analizátor1

Ütközési cella

Analizátor2

Detektor

MS/MS spektrum

Peptid fragmens ionok analízise

Peptidek szekvenálása MS/MS segítségével Információ függő adatgyűjtés: IDA – information dependent aquisition/DDA – data dependent aquisition MS (EMS)

Kizárási listák

Töltöttségi fok megállapítása (ER)

MS/MS (EPI)

Peptidek szekvenálása MS/MS segítségével A szekvencia meghatározása a spektrumban látható csúcsok különbségéből Aminosavak monoizotópos tömege

Intenzitás

EPTID PEPTID PEPTI y6 b1 b2 y2

y4 3 y3 b101

y5

97 Pro(P) b5

113 Ile/Leu Thr(T) b4 129 97 101 113 Glu(E) Pro(P) Thr(T) Ile/Leu (I/L)

m/z

129 Glu(E)

y7

b6 115 Asp(D) 97 Pro(P)

Glicin Alanin Szerin Prolin Valin Treonin Cisztein Izoleucin Leucin Aszparagin Aszpartát Glutamin Lizin Glutamát Metionin Hisztidin Fenilalanin Arginin Tirozin Triptopfán

57.02147 71.03712 87.03203 97.05277 99.06842 101.04768 103.00919 113.08407 113.08407 114.04293 115.02695 128.05858 128.09497 129.04264 131.04049 137.05891 147.06842 156.10112 163.06333 186.07932

Peptidek szekvenálása MS/MS segítségével Fehérjék azonosítása tömegspektrometriás szekvenálás és adatbázisok segítségével intenzitás

MS/MS spektrum

Adatbázis (pl. NCBInr, UniProt)

m/z

Keresőprogram (pl. MASCOT)

Peptid szekvenciák

Fehérjék

Peptidek szekvenálása MS/MS segítségével Fehérjék azonosítása tömegspektrometriás szekvenálással - áttekintés

Fehérje

intenzitás

Tripszines emésztés

Triptikus fragmensek (peptidek) m/z

m/z

m/z

MS/MS spektrum

intenzitás

intenzitás intenzitás

m/z

intenzitás

Peptid szekvencia Peptid szekvencia Fehérje Peptid szekvencia Peptid szekvencia

LC-MS

m/z

MS spektrum

Peptidek szekvenálása MS/MS segítségével Fehérjék azonosítása tömegspektrometriás szekvenálás és adatbázisok segítségével intenzitás

MS/MS spektrum

Adatbázis (pl. NCBInr, UniProt)

m/z

Keresőprogram (pl. MASCOT)

De novo szekvenálás

Peptid szekvenciák

Fehérjék

Proteomika Peptid szekvenálás. Dr. Csősz Éva Debreceni Egyetem ÁOK Biokémiai és Molekuláris Biológiai Intézet Proteomika Szolgáltató Laboratórium

Recommend Documents