Precancerosus állapota proteomika tükrében - diabetesben szenvedő betegek nyálmintáinak vizsgálata
Doktori (PhD) értekezés
Dr. Jancsik Veronika Ágnes
Iskolavezető: Dr. Kovács L. Gábor, egyetemi tanár Programvezető: Dr. Olasz Lajos, egyetemi tanár Témavezető: Dr. Olasz Lajos, MTA doktora Dr. Márk László, egyetemi docens
Pécsi Tudományegyetem Általános Orvostudományi Kar Fogászati és Szájsebészeti Klinika Arc-, Állcsont- és Szájsebészeti Tanszék
Pécs 2014.
TARTALOMJEGYZÉK
1. BEVEZETÉS .......................................................................................................... 5 1.1. PRECANCEROSUS ÁLLAPOTOK DEFINÍCIÓJA ........................................................... 8 1.2. A DIABETES MELLITUS ÉS A SZÁJÜREGI LAPHÁMCARCINOMA KÖZÖTTI KAPCSOLAT ..... 8 1.3. NYÁLDIAGNOSZTIKA, PROTEOMIKAI VIZSGÁLATOK NYÁLBÓL .................................. 12 2. VIZSGÁLATAINK CÉLJA .................................................................................... 16 3. ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK .............................................................................. 17 3.1. A VIZSGÁLATBA BEVONT DIABETES MELLITUSBAN SZENVEDŐ PÁCIENSEK ................ 17 3.2. MINTAVÉTEL ..................................................................................................... 19 3.3. A MINTÁK FELDOLGOZÁSÁHOZ HASZNÁLT MÓDSZEREK ......................................... 20 3.3.1. Elektroforézis ........................................................................................... 20 3.3.2. Tömegspekrometriás vizsgálat ................................................................ 24 3.3.2.1. A tömegspektrométer felépítése és működése ................................. 24 3.3.2.2. Mintaelőkészítés ............................................................................... 25 3.3.2.3. Ionforrások ........................................................................................ 26 3.3.2.4. Analizátor .......................................................................................... 29 3.3.2.5. Triptikus emésztés és MALDI TOF/TOF MS ..................................... 30 3.3.2.6. A spektrogram értékelése ................................................................. 33 3.3.2.7. Célzott peptid analízis ....................................................................... 33 3.4. STATISZTIKAI ELEMZŐ MÓDSZEREK ..................................................................... 34 4. EREDMÉNYEK .................................................................................................... 35 4.1. ELEKTROFORÉZIS VIZSGÁLAT EREDMÉNYE .......................................................... 35 4.2. TÖMEGSPEKTROMETRIÁS VIZSGÁLAT EREDMÉNYE ............................................... 37 4.2.1. Cukorbeteg páciensek nyálmintájának képe ........................................... 40 4.2.2. Egészséges kontroll minták képe ............................................................ 46 4.2.3. Tömegspektrometriás kép összehasonlítása .......................................... 49 4.3. STATISZTIKAI EREDMÉNYEK BEMUTATÁSA ........................................................... 50 2
5. MEGBESZÉLÉS ................................................................................................. 56 5.1 AZ IDENTIFIKÁLT FEHÉRJÉK BEMUTATÁSA ............................................................ 58 5.1.1. Annexin A8: ............................................................................................ 58 5.1.2. Peroxiredoxin-2: ...................................................................................... 59 5.1.3. Tirozin-protein kináz: ............................................................................... 61 5.2. KONKLÚZIÓ ...................................................................................................... 62 5.3. EREDMÉNYEK ÖSSZEFOGLALÁSA ........................................................................ 64 6. IRODALOMJEGYZÉK ......................................................................................... 65 7. TUDOMÁNYOS KÖZLEMÉNYEK ....................................................................... 73 7.1. TÉMÁVAL KAPCSOLATOS PUBLIKÁCIÓK JEGYZÉKE ................................................ 73 7.2 TÉMÁBAN MEGJELENT ABSZTRAKTOK JEGYZÉKE ................................................... 73 7.3. TÉMÁHOZ KAPCSOLÓDÓ ELŐADÁSOK .................................................................. 74 7.4. EGYÉB TUDOMÁNYOS ELŐADÁSOK ...................................................................... 75 8. KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS .................................................................................. 78 9. MELLÉKLET ........................................................................................................ 79 9.1. A VIZSGÁLAT SORÁN HASZNÁLT KÉRDŐÍV ÉS BELEEGYEZŐ NYILATKOZAT ................ 79 9.2. DIABÉTESZES PÁCIENSEK ADATAIT ÖSSZEFOGLALÓ TÁBLÁZAT ............................... 81 9.3. CLINPROTOOLS STATISZTIKAI ELEMZÉSSEL VALIDÁLT PEPTIDEK LISTÁJA ................ 82
3
RÖVIDÍTÉSEK
CPITN: Community periodontal index of treatment needs Da: Dalton DM: diabetes mellitus DNS: Dezoxiribonukleinsav Gl: glandula, mirigy MALDI TOF/TOF: Matrix segítette lézerdeszorpció, repülési idő MAPK: mitogén aktivált protein kináz kaszkád mM: millimol ml: milliliter mtsai: munkatársai m/z: tömeg és a töltéssel rendelkező ionok számának aránya pH: pondus Hidrogenii RAF: rapidan gyorsuló fibrosarcoma oncogén RAS: rat sarcoma oncogén, G-protein RNS: ribonukleinsav Rpm: revolutions per minute/ percre eső fordulatok száma SDS: Sodium-dodecyl-sulfate ún: úgy nevezett WHO: World Health Organization/ Világ egészségügyi szervezet µl: mikroliter
4
1. Bevezetés A cukorbetegség a XXI. század elejére népbetegséggé vált. 2000-ben 171 millió cukorbeteget tartottak nyilván a világon. Bár a betegség diagnózisa egy egyszerű és kötelező szűrővizsgálattal felállítható, ennek ellenére a cukorbetegségben érintettek száma folyamatosan emelkedik (1. ábra). Becslések szerint 2030-ra 366 millióra fog növekedni. Friss adatok szerint a cukorbetegség Magyarországon is egyre több embert érint. A nyugat-dunántúli régióban a betegség előfordulása néhol eléri a 10%ot is [19,27].Magyarországon a becslések szerint kb. 1-1.5 millió ember szenved diagnosztizált vagy nem diagnosztizált cukorbetegségben, illetve károsodott szénhidrát anyagcsere valamilyen formájában [27].
1. ábra: WHO adatok, Diabetes "becsült" prevalenciája világszerte (2007). Az ábra a világ országaira lebontva demonstrálja az egyes és a kettes típusú diabetes százalékos előfordulását jelzi a teljes populációban. Sötétbordó színnel jelölt: 14-20% előfordulási gyakoriságot mutatja, míg a sárga színnel 4%-os gyakoriságot jelzi. 5
A diabetes mellitus a pancreas Langerhans-szigetek béta-sejtjeinek csökkent inzulintermelése, vagy a sejtek inzulinrezisztenciája miatt alakul ki. A betegséget 3 fő csoportra osztjuk. Megkülönböztetünk 1-es típusú DM-t, 2-es típusú DM-t, gesztációs diabetest, és egyéb okból eredő diabetest [19]. Táblázatba foglaltam az 1-es és a 2-es típusú diabétesz fő tüneteit, diagnosztikus kritériumait (1. táblázat).
1. táblázat: 1-es és 2-es típusú DM összehasonlítása [Williams textbook of endocrinology (12th ed.). Philadelphia: Elsevier/Saunders. pp. 1371–1435. ISBN 978-1-4377-0324-5.]
1-es típus
2-es típus
Életkor
Főleg gyermekek
Főleg felnőtt
Testalkat
Vékony/ normál
Gyakran elhízott
Ketoacidosis
gyakori
ritka
Autoantitestek
Ált. jelen vannak
nincsenek
Endogen insulin
Alacsony/ hiányzik
Normál,/ csökkent/ megnövekedett szint
Prevalencia
~10%
~90%
6
A diabetes következményeként kialakuló szövődmények között találhatóak szív- és érrendszeri megbetegedések, vesebetegség, retinopathia [24,7]. Az első szájüregi szövődményt említő tudományos értekezést már a 19. században publikálták [18].
Irodalmi adatok szerint a cukorbetegekben észlelt rosszabb szájhygiéné, a nyálsecretiós
ráta
csökkenése
és
a
pH-csökkenés
kedvező
körülmény
a
szájnyálkahártya megbetegedéseinek (leukoplakia, lichen oris, illetve a nyelvhát nyálkahártyájának elváltozásai) kialakulásában [21,29]. Újpál és mtsai 2003-as vizsgálatai
alapján
elmondható,
hogy
a
precancerosus
léziók
gyakorisága
cukorbetegek körében elérte a 11%-ot, míg a nem cukorbetegek körébenez az érték 3,2% volt [3,39,63-65].
A Pécsi Tudományegyetemen Dr. Szántó Ildikó 2011-ben végzett a szájüregi daganatok
korai
felismerésére
vonatkozó
vizsgálatokat
[58].
A
kutatások
folytatásaként, azok eredményeinek továbbgondolásával, a cukorbetegségben szenvedő páciensek lehetséges szájüregi precancerosus állapotára utaló korai biomarkerek detektálását céloztam meg.
7
1.1. Precancerosus állapotok definíciója Ma az Egészségügyi Világszervezet definíciója alapján precancerosus (rákmegelőző) elváltozásokat és állapotokat különböztetünk meg. E meghatározás szerint precancerosus elváltozásnak tekintjük az olyan, klinikailag és szövettanilag kóros elváltozásokat (leukoplakia, erythroplakia), melyekből a carcinoma gyakrabban alakul ki, mint a hasonló területre jellemző egészséges nyálkahártyán [6, 23,26,50,52,53].
A szájüregi carcinomát megelőzhetik olyan nyálkahártya-elváltozások, amelyek rosszindulatú átalakulásra hajlamosak. Az elváltozások már hónapokkal vagy évekkel a rák kialakulása előtt jelentkezhetnek, vagy a már kifejlett rákos elváltozások mellett találhatók [37,43,47,66,67].
A precancerosus elváltozások kialakulását elősegítik bizonyos precancerosus állapotok: ezek olyan szisztémás állapotokat jelölnek, amelyek a carcinoma kialakulásához kedvező feltételeket, és így jelentősen megnövekedett rizikót teremtenek (lichen, vashiányos vérszegénység, diabetes mellitus, submucosus fibrosis)[11,42,61].
1.2. A diabetes mellitus és a szájüregi laphámcarcinoma közötti kapcsolat
A megnövekedett vércukor szint az egész emberi szervezetet működését befolyásolja [24,41,17,14,35,7]. A nem kontrollált, és nem jól beállított diabetes szájüregi tünetei igen változatosak. A perioralis régió bőre szárazzá válik, így hajlamosabb különböző bakterialis 8
betegségekre (furunculus, carbunculus). Gyakori tünet a xerostomia, glossodynia és az ízérzés zavara is. Gyakori szájnyálkahártya szájnyálkahártya tünet még a chronicus candidiasis candidia (2. ábra),, lichen oris, lichenoid reakció és a cheilitis angularis. A fogíny gíny és a fogágy állapotára is befolyással vannak a diabetes mellitus szisztémás hatásai. Gyakori kísérő tünet ünet a gingivitis és a parodontitis [29,3,39].
2. ábra- Chronicus Candidiasis [http://depts.washington.edu/hivaids/oral/case1/discussion.html http://depts.washington.edu/hivaids/oral/case1/discussion.html]
A diabetes mellitus és a szájüregi gyulladásos lesiok lesio közötti ti kapcsolat leírását, már a 19. században publikálták. Ujpál és munkatársai 2004-ben ben publikálták azt az 9
epidemiológiai vizsgálat eredményét, mely kimutatta, hogy a vizsgált 2-es típusú diabeteses betegcsoportban a leukoplakiak aránya több mint háromszoros, 11% a kontroll
csoportéhoz
képest.
Vizsgálták
továbbá
a
jóindulatú
elváltozások
előfordulását (6,4% a kontrollcsoportban és 16,9% a beteg csoportban). Érdekes eredményt hozott a cancer állapotok elhelyezkedésének összehasonlítása is. Míg a nem diabeteses csoportban inkább a sublingualis régióban, addig a diabetes csoportban a gingivatumorokat regisztráltak [1,63,64] (3. ábra).
3. ábra – Gingivatumor diabeteses páciensben [http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1368837510000989]
Ennek hátterében a szájban levő chronicus gyulladás carcinogén hatása is állhat. Jól ismert tény, hogy a gastrointestinalis rendszer gyulladásos megbetegedésében szenvedőkben (ulcerativ colitis, Crohn betegség) gyakrabban alakul ki bélrendszeri malignus tumor [31]. Az epidemiológiai összefüggésen túl, ennek konkrét molekuláris biológiai magyarázata is van.
10
2004-ben Vaiktaris és munkatársai vizsgálatukban a diabetes oncogeneticus hatását vizsgálták állatkísérletes modell segítségével. A kísérlet során azt tapasztalták, hogy diabetesben az erbB2 és erbB3 receptorok indukciója által, aktiválódik a Ras/Raf/MAPK szignáltranszdukciós útvonal. Ennek következtében megnő a sejtek proliferációs rátája [59]. Ezzel párhuzamosan azt tapasztalták, hogy az apoptosis mértéke nem változott [65]. Ez eddig nem végeztek humán, laphámrákra utaló nyálban található molekuláris biomarker vizsgálatokat diabeteses betegekben.
11
1.3. Nyáldiagnosztika, Proteomikai vizsgálatok nyálból A nyálból nyerhető diagnosztikus értékű biomarkerek vizsgálata kis túlzással az XXI. század legígéretesebb vizsgálati módszere [69,71,49,57,58,25,16,62]. Az emberi nyálat a szervezetben három pár nagy nyálmirigy termeli: a gl. Parotis, gl. Submandibularis és a gl. Sublingualis (4. ábra). Ezen felül több száz kis nyálmirigy található a palatumon, az ajkak belső felszínén, ill. a buccán is.
4. ábra: A 3 pár nagy nyálmirigy elhelyezkedése a fej-nyak régióban [http://www.nlm.nih.gov/medlineplus/salivaryglanddisorders.html ]
Egészséges emberek esetén a nyálmirigyek kb. 1-1,5 liter nyálat termelnek naponta. Ennek összetétele 99,3% vízből és 0,7% szárazanyagból áll. A szárazanyag tartalom nagyrészt fehérjékből, anorganikus sókból, továbbá zsírból, de akár ún. testidegen anyagokból áll, mint például gyógyszermaradványok. A nyál mikrobiológiai flórája a születést követően alakul ki, és alakul át a élet során. Normál esetben előfordulnak Streptococcus fajok, stb. Egyes betegségekben akár vírusokat is detektálhatunk a nyálban ilyenek pl. EBV, HIV, Hepatitis [49].
12
A nyál egy dinamikusan változó rendszer, melynek összetétele nem konstans. Az összetevőket és azok arányát sok tényező befolyásolja. Vizsgálatok szerint az összetétel függ a páciensek korától, nemétől, gyógyszereitől. A kiválasztott anyagokat és azok mennyiségét befolyásolhatja, hogy milyen napszakban történt a mintavétel, vagy éppen a páciens emocionális állapota [36].
Ezek a tényezők az emberi szervezet egészére hatással vannak. Így lehetséges az, hogy ezeket a változásokat kísérő, a szervezetben lezajló biokémiai folyamatok termékei, fehérjék, ionok véráram útján keresztül a nyálba kiválasztódjanak. A kiválasztódás módja 4 úton történhet (5. ábra): a, aktív transzporttal b, passzív diffúzióval c, filtrációval d, ioncsatornákon keresztül 5. ábra: Nyálba szekretálódó bioaktív molekulák transzport mechanizmusai
13
A humán nyál, mint diagnosztikus rendszer, 1990-es évek óta vált intenzív kutatások célpontjává.
Ezen
vizsgálatok
kezdetben
a
szájüregi
megbetegedésekre
korlátozódtak, periodontium betegségei, caries, de a modern biokémiai módszerek segítségével ma már képesek vagyunk DNS, apasági-tesztek, HIV-teszt, de egyéb más szisztémás betegségek vizsgálatára is és akár különböző drogok, alkohol szint monitorozásában is bevált módszer [49,69]. Az „új” diagnosztikus értékű folyadék használata számos pozitív és előnyös tulajdonsággal rendelkezik. Majdnem minden vérben mérhető az egészségi állapotot reprezentáló molekula, ion, vegyület megtalálható a nyálban is. A vérrel ellentétben a nyálminták gyűjtése nem jár invazív beavatkozással, mely nem okoz szorongást, diszkomfort érzést, így a mintavétel megismétlése kevésbé komplikált a betegek compliancét tekintve. Klinikai gyakorlati használat szempontjából is sokkal előnyösebb tulajdonságokkal rendelkezik, mint a vér, vagy a serum. Az egyszerű gyűjtésen, tároláson kívül, nem kell számoljunk az alvadással, így csökken az elemző módszerek során használt szükséges manipulációk száma is.
Hátránya közé sorolandó, hogy az informatív biomolekulák aránya a nyálban sokkal alacsonyabb, mint a serumban előfordulóké. De az új és nagy érzékenységű technológiák számára ez ma már nem jelent akadályt.
Ezen technológiák kifejlesztésével megszülettek az ún. „OMICS”, proteomics, genomics tudományágak. A proteomikai vizsgálatok célja, hogy a szervezetben
14
található fehérjék összetételét elemezze. Ma már képesek vagyunk arra is, hogy a vizsgált fehérjéket ne csak összetételükben, de szerkezetbeli változásaik során is nyomon kövessük [49,57,58]. A proteomika két fő eszköze az elektroforézis és a tömegspektrometria. Az elektroforézis módszerrel a fehérjéket molekulasúlyuk szerint választjuk szét, majd a tömegspektrométer segítségével elemeire bontjuk. Az így kapott fragmenteket internetes adatbázisok segítségével azonosítva, következtetünk a vizsgált fehérjére, peptidekre [60].
15
2. Vizsgálataink célja
1. Kutatásunk során arra kerestük a választ, hogy a precancerosus állapotnak számító diabetes mellitusban szenvedő páciensek körében előfordulnak-e korai szájüregi laphámrákra utaló biomolekulák?
2. Van-e különbség a 10 éve vagy annál hosszabb ideje diabetesben szenvedő páciensek nyál biomarker mintázatában?
3. Célunk volt továbbá, hogy egy megbízható és egyszerű vizsgálati protokollt dolgozzunk ki, melyek a későbbiekben egy nagy betegszámú, multicentrikus tanulmány alapjául szolgálhatnak.
16
3. Anyagok és módszerek
3.1. A vizsgálatba bevont diabetes mellitusban szenvedő páciensek 2012. január 4-e és 2012. november 30-a között 45 nyálmintát vettünk az önkéntesektől. A DM csoportba soroltuk a 2-es típusú diabetesben szenvedő pácienseket (n=25), míg a H csoportba a velük kor / nem relációban hasonló, egészséges egyedek kerültek (n=20). A férfiak-nők aránya: 55-45% volt, az átlag életkor 62 év. A kontrollcsoportban 10 férfit és 10 nőt involváltunk vizsgálatainkba, az ő átlag életkoruk 62,1 év volt. A DM csoportban levő betegek mind a Pécsi Tudományegyetem II. sz. Belgyógyászati Klinika és Nephrológia Klinika fekvőbeteg osztályának páciensei voltak.
A vizsgálatban való részvétel kizárási kritériumait a következő táblázat
foglalja össze (2. táblázat).
2. táblázat- Részvételt kizáró kritériumok
1.
Nem jól kontrollált diabetes
2.
Diagnosztizált tumoros megbetegedés, precancer lézió
3.
Rossz szájhygiéné
4.
Mentális problémák
5.
Szájüregi aktív fertőzés vagy gyulladás, CPITN index >3
6.
Kontroll vizsgálatokon való részvétel elutasítása
17
3. táblázat- Diabetesben szenvedő betegek főbb adatai Adatok
Fő/n (%)
HbA1c szint <7%
10 (41%)
>7%
15 (59%)
DM2 diagnosztizálásának ideje <10 év
8 (32%)
>10 év
17 (68%)
Gyógyszerelés Inzulin
24 (96%)
A mintavétel előtt az önkéntes résztvevők egy saját szerkesztésű, nem validált kérdőívet töltöttek ki, melyben az egészségük állapotáról (3. táblázat), az általuk szedett gyógyszerekről, továbbá az alkoholfogyasztási szokásról és a dohányzási szokásról is kérdeztük őket. Ezt követően minden résztvevő egy stomatooncologiai szűrővizsgálaton esett át (anamnézislap, belegyező nyilatkozat "Függelék" részben található).
18
3.2. Mintavétel Mivel a nyál összetétele jelentős változásokat mutat a napi életciklus folyamán, ezért a projektünk megvalósításában fontos szerepe volt a mintavétel standardizálásának. Saját előzetes tapasztalataink és a szakirodalomban fellelhető ajánlások alapján mi a reggeli mintavétel mellett döntöttünk [38]. A páciensek nyálmintáit ugyanazon, délelőtti időben gyűjtsük, lehetőleg étkezés előtt. A mintavétel előtt nem történt invazív beavatkozás. Egy rövid tájékozató, a beleegyező nyilatkozat kitöltése után, a beteg anamnesztikus adatainak rögzítése történt. Ezt követően megkértük a pácienst, hogy a szájüreget kétszer hideg csapvízzel öblítse át. Szántó és munkatársai által használt taktilis mintavételi eljárással, steril, 5ml-es fecskendőbe gyűjtöttünk 1-1,5ml nyálat, ami a fecskendő érintésére – mint taktilis ingerre képződött (6. ábra).
6. ábra: Mintavétel a sublingualis régióból
19
A mintákat tartalmazó fecskendőt rögtön jégen tároltuk, majd a mintavétel után, laboratóriumi körülmények között 12 perc 2500 rpm centrifugálást követően a minták felülúszóját
Eppendorf csövekbe helyeztük és azonnal -80°C h őmérsékletre
hűtöttük. A mintákat a további biokémiai vizsgálatokig itt tároltuk. A kontroll csoport nyálmintáinak gyűjtéséhez szintén a taktilis mintavételt alkalmaztuk. A mintavétel során használt anyagok: öblítőpohár, 5ml-es egyszer használatos fecskendő,Eppendorf cső.
3.3. A minták feldolgozásához használt módszerek
3.3.1. Elektroforézis Az elektroforézis működése a töltéssel rendelkező partikulumok elektromos térben létrehozott migrációján alapul. Mivel a különböző részecskék eltérő méretűek és töltésűek, ezért a vándorlás is eltérő sebességgel zajlik, így a különböző részecskék egymástól
elválasztódnak.
Az
elektroforézis
jelenleg
az
egyik
legnagyobb
hatékonyságú szeparáló módszer. A géles közegben végzett elektroforézis a biológiai
makromolekulák
(fehérjék,
DNS,
RNS)
meghatározásának
egyik
legfontosabb eszköze.
20
A proteomikában proteinek és peptid molekulák analizálása során használják, de a módszer alkalmas sejt organellumok és natív fehérje komplexek szeparálására is. A proteinek és peptidek amfoterikus anyagok. Ez azt jelenti, hogy a fehérje környezeti pH értéktől függően, pozitív vagy negatív töltéssel rendelkezhetek. Az elektroforetikus szeparálás során pontosan beállított pH és konstans ionos erő mellett a partikulomok a műszer katód vagy az anód részének irányába vándorolnak. Az elektromos mezőben a vándorlás sebessége függ a molekula töltésétől, tömegétől és alakjától függő súrlódási együtthatótól, továbbá az elektromos tértől.
A legtöbb elektroforézis szeparációt géleken végezzük. A géleknek két fő típusát különbözethetjük meg: a granulált, vagy az ún. kompakt géleket. Granulátumból készíthető gélek általában dextrán alapúak és főleg a kromatográfiás vizsgálatokban terjedtek el. A nyálminták elemzése során SDS-PAGE (nátrium-dodecyl-szulfát, poliakrilamid) géleket használtunk.
Az SDS egy erős anionos detergens, szolubizálja a fehérjéket. A fehérjék hidrogénkötéseinek disszolvációja által, a másodlagos és harmadlagos szerkezetet bontja. Az SDS-PAGE segítségével a polipeptidek a molekulasúlyuk szerint szeparálódnak. A poliakrilamid géleket általában két üveglap között, géllemez formájában polimerizálják,az elektroforézis függőleges helyzetben történik. A futtatás során a proteinek az anód irányába vándorolnak. A minták fehérjesúlyának meghatározásához, ismert mólsúlyú kalibráló fehérjét is futtatunk. A futtatást követően
a
fehérje
spot-okat
különböző
eljárásokkal
(festés,
labeling,
autoradiográfia, Western blot) tehetők láthatóvá [12,69,28].
21
Munkacsoportunk a fehérjék szeparálását a következő elektroforézis módszerrel végezte (7. ábra).
A
biomarker
fehérjék
azonosításához
100
µL
nyálmintát
Ultra
Turrax
homogenizátorral 20 mM Tris/HCl pufferrel (pH: 7,4) homogenizáltuk. A puffer 3 mM EDTA-t, 5 mM betamercaptoethanol-t és 1% SDS-t tartalmazott.Ezt követően 1%-os bromphenolkék adtunk a mintákhoz, majd az elegyet 2 percig forraltuk, ezután centrifugáltuk (8000 g, 2 min). SDS-PAGE elektroforézist végeztünk, melyhez 12%os
gélt
készítettünk,
Laemmli
módszere
szerint
[50].
A
molekulatömeg
meghatározásához Pharmacia alacsony móltömeg kalibrációs kitet használtunk. A géleket 30 Coomassie brillant blue R-250-nel festettük, a festékkivonó oldat 5% (v/v) ecetsavat és 16% (v/v) metanolt tartalmazott.
Az
elektroforetikus
futtatás
után
a
géleket
szkenneltük,
majd
a
vizuális
összehasonlító elemzés után, az extra sávokat, amelyek a betegek mintáiban keletkeztek, szikével kimetszettük. A kimetszett sávokat Eppendorf csőbe helyeztük, festékmentesítettük 3x10 perces, 200µL 50%-os (v/v) acetonitril, és 50 mM NH4HCO3 oldatban.
22
7. ábra: Minták felvitele gélre, fehérjék futtatása
23
3.3.2. Tömegspekrometriás vizsgálat A tömegspektrometria (mass spectrometry, MS) egy analitikai technika, mellyel szerves és szervetlenkomponensekből képződött ionok tömeg/töltés (m/z) arányának mérésén alapuló, nagyhatékonyságú szerkezetvizsgáló és analitikai módszer. A módszer azon alapul,hogy az elemzett anyag részecskéiből a gép ionokat állít elő, majd ezeket elektromos és mágneses térbe helyezve, mozgásuk alapján relatívtömegük és töltésük hányadosa szerint szétválaszthatók.
3.3.2.1. A tömegspektrométer felépítése és működése
8.ábra: A TOF spektrométer működési elvének sematikus rajza 24
A tömegspektrométer főbb részei a következőek: 1, mintaelőkészítő- bevivőrendszer, 2, ionforrás, 3, analizátor 4,detektor 5,
valamint
az
ezekhez
kapcsolódó
számítógépes
adatfeldolgozó
és
irányítórendszer. Az analizátor, a detektor és az ionforrások viszonylag jelentős vákuum(10-4−107
mbar) mellett üzemeltethetők. A nagyvákuum az ionizáció hatékonyságának
növelését, másrészt az ion-molekula ütközések minimalizálását szolgálja. Ezek a nem kívánt kölcsönhatások módosíthatnák az ionok repülési pályáit, részben vagy teljesen
kiolthatnák
töltésüket,
így
reprodukálhatatlanná
tehetnék
a
tömegspektrumot. A nagyvákuum alkalmazása nagyban növeli az érzékenységet és a felbontást is (8. ábra).
3.3.2.2. Mintaelőkészítés Tömegspektrometriával elméletileg bármilyen halmazállapotú sok komponensű rendszer vizsgálható, azonban ezt nagyban befolyásolja az alkalmazott mintabeviteli és
ionizációs
technika.
Illékony
vegyületeket
(például:
gázok,
könnyen
párolgóanyagok) közvetlenül be lehet vezetni a forrásba, ahol az ionizáció megtörténik. Ha a vegyület nem ilyen, akkor először fel kell oldani, oldat formájában cseppenteni a targetlemezre (9. ábra), majd valamilyen alkalmas megoldással gázfázisba juttatni; ez történhet elektromos erőtér vagy porlasztás és szárítógáz 25
segítségével.
Az
oldószerhelyes
megválasztása
alapvetően
befolyásolja
a
tömegspektrum minőségét. Általánosságban kerülendő a pufferek és a nem illékony sók alkalmazása.
9. ábra: Minták felcseppentése a target lemezre
3.3.2.3. Ionforrások Ionforrásnak nevezzük a tömegspektrométer azon részét, melynek segítségével a minta molekuláiból gázfázisok képződnek. A méréshez szükség van a vizsgált részecskék ionizálására, mivel a készülékben valómozgatásuk az elektromos töltésükre gyakorolt hatás alapján történik. Optimális ionizálási feltételek kellenek a megfelelő érzékenység eléréséhez, a maximális szerkezeti információ kinyeréséhez.
26
Az ionizációs technika megválasztását főként a vizsgálandó molekula és az azt körülvevő mátrix határozza meg. Mivel univerzálisan alkalmazható ionizációs technika nincs, így a készülékek fejlődésénél meghatározó szerepű a különböző ionforrások cseréjének gyorsasága és egyszerűsége. A legrégibb és igen gyakran alkalmazott eljárás az elektron-ionizáció vagy a kémiai ionizáció. Az 1980-as években mutatták be a mátrix asszociált lézer deszorpciós ionizációt. Ez a módszer képes volt nagyméretű biomolekulák ionizálására. Ennek a módszernek a lényege, hogy az előzetesen előkészített mintát kicsi, organikus molekulával keverjük össze, amely képes abszorbálni a lézerfény hullámhosszát. A lézer deszorpciót és ionizációt okoz mind a mátrixon mind pedig az analítikumon. Majd a keletkezett ionok egy gyorsítón keresztül az MS analizátorba jutnak (10. ábra). Tripszinnel emésztett biomolekulák vizsgálatához általában α-ciano-4-hidroxifahéjsavat (CHCA) használunk matrixként. Alkalmazásával igen magas szenzitivitású vizsgálatokat végezhetők, kb. 10 kDa méréshatárig [60,69].
27
10.ábra: MALDI ionizáció sematikus rajza, [A fehérjekutatás modern módszertana, Medicina kiadó, 2011.]
A részecske ütközéses technikák, párolgáson-porlasztáson alapuló módszerek és lézerdeszorpciós módszerek. A részecske ütközésen alapuló technikák közé tartozik a kémiai ionizáció (CI), a szekunder ion tömegspektrometria (SIMS), a gyors atom és ionütköztetés (FAB, FIB) és a plazma deszorpció (PD). A párolgáson-porlasztáson alapuló eljárások a térdeszorpció (FD) és térionizáció (FI), termospray (TS) atmoszférikus nyomáson lejátszódó kémiai ionizáció és fotoionizáció (APCI, APPI) és elektrospray (ESI). A lézer deszorpciós (LDI) technikák közül a jelentősebbek a mátrix-segítette lézer deszorpció (MALDI) (10. ábra) és a felület-segítette lézer deszorpciós ionizáció (SELDI).
28
3.3.2.4. Analizátor Az analizátorban a képződött ionok szétválasztása történik a tömegük és a töltésük hányadosa szerint. Minél kisebb az ion tömege és minél nagyobb a töltése, annál nagyobb sebességre képes szert tenni egy adott gyorsító feszültség hatására. Tulajdonképpen ezt használják ki az ionok transzportján alapuló módszerek. Az újabb, modernebb készülékek inkább az ionok szelektív tárolása révén választják szét a részecskéket. Az analizátor jellemző paraméterei a maximális vizsgálható tömeg, az áteresztőképesség (a detektált és a képződött ionok számának hányadosa),
illetve
a
maximális
felbontóképesség.
A
legfejlettebb
tömegspektrométerek esetében az utóbbi érték elérheti az egymilliót is. Az egyik legelterjedtebb analizátor típus az ún. quadrupol tömegszűrő elven működik. Itt az ionok négy párhuzamos hengeres rúd között haladnak, amelyekre egyenáramot és nagyfrekvenciás váltóáramot kapcsoltak. A szemben lévő rudak azonos, a szomszédosak ellentétes polaritásúak, így közöttük oszcilláló elektromos tér alakul ki. Az ide bejutó ionok különböző amplitúdójú kitéréseket végezve haladnak, a rudak közti ideális pályát csak meghatározott m/z értékű ionok képesek tartani. A quadrupol készülékek viszonylag egyszerűbben működtethetők, gyorsak, jól kombinálhatók különféle ionforrásokkal. Hátrányuk, hogy tömegpontosságuk és felbontóképességük viszonylag alacsony. Hasonló elven működik az ioncsapda is. Az elektrotechnika fejlődésével lehetővé vált igen kicsiny időkülönbségek pontos észlelése, amely a repülési időn (time-of-flight, TOF) alapuló elválasztás alapját képezi. A TOF készülékekkel ma már igen jó felbontóképesség, széles mérési tartomány érhető el, viszonylag egyszerűek és olcsók; megfelelő ionforrással 29
(MALDI) kombinálva a nagyobb biomolekulák vizsgálatában nélkülözhetetlenek [73].Vizsgálatainkban MALDI TOF (Matrix Assisted Laser Desorption Ionisation Timeof-Flight) típusú eszközt használtunk a mérések elvégzésére. Ez a technika a nem illékony
biopolimerek,
szerkezetének
peptidek,
komplex
tömegspektrométerek
fehérjék,
valamint
tanulmányozására
rendkívül
kis
szintetikus
kitűnően
anyagmennyiségű
rendszerek
alkalmas.
minták
A
(femtomolnyi
mennyiségben) gyors, pontos, megbízható analízisére alkalmasak, az elválasztás technikában használatos módszerekkel jól kombinálható készülékek. Minőségi analízist
végezhetünk,
a
gép
alkalmas
a
nagy
áteresztőképességet
igénylőmérésekre (high through put típus), hiszen akár napi 6500 mérést is képes elvégezni automatizált üzemmódban. Használatával szekvencia információkhoz juthatunk, és kémiai módosítások pontos kimutatására valamint verifikációra is alkalmas. Mennyiségi mérésre nem használható, erre inkább kromatográfiás méréseket alkalmazhatunk. A vizsgált minták áttekintő felmérése (screening) egyszerűen és gyorsan elvégezhető. Az eszköz fenntartása relatíve olcsó, működési elvéből fakadóan nem jellemző a meghibásodása [22,57].
3.3.2.5. Triptikus emésztés és MALDI TOF/TOF MS A gél darabokat szobahőmérsékleten dehidráltuk, majd 10 µL tripszin (0,04 mg × mL1)Tris
puffer (2,5 mM, pH 8,5) oldattal 37°C-on 1 éj szakán át inkubáltuk. A kivont
peptideket 15 perces ultrahangos fürdőben 15 µL acetonitril és hangyasav (49/50/1v/v/v) vizes oldatban tartottuk. Az oldatból való kivonás után a peptideket liofilizáltuk,és újra feloldottuk vízben. A liofilizált fehérje triptikus emésztményének vizes oldatát a mintatartó lemezre (MTP 384 massive target plate, Bruker Daltonics,
30
Bremen,Germany) vittük fel. A mintatartó tálcán minden egyes 1 µL térfogatú mintaoldathoz 1µL telített mátrix oldatot kevertünk. A mátrix oldatot minden felhasználás előtt frissen készítettük: α-ciano-4-hidroxi-fahéjsavat (CHCA) acetonitril /0,1% TFA (1/2 v/v)-benoldva.
A
tömegspektrometriás
méréshez
Autoflex
II
TOF/TOF
típusú
(Bruker
Daltonics,Bremen, Germany) készüléket használtuk. A MALDI TOF “peptid mass fingerprint (PMF)” elkészítésére a LIFT mode for PSD (post source decay) és CID (collisioninduceddecay)
fragmentációt
alkalmaztuk
automatizált
üzemmódban,
FlexControl 2.4 számítógépes program vezérlésével. A PMF-hez 20 kV gyorsító feszültséget használtunk. A műszer 337 nm-en emittáló pulzáló nitrogén lézert alkalmaz a minta és a mátrix elpárologtatásához és ionizációjához (model MNL205MC, LTB Lasertechnik Berlin GmbH, Berlin, Germany). Minden egyes mérés előtt külső tömegkalibrációt végeztünk a Bruker Peptide Calibration Standard szet segítségével (#206195 Peptide Calibration Standard, Bruker Daltonics, Bremen, Germany).
A
mérések
során
m/z
800és
5000
között
detektáltuk
a
tömegspektrumokat, és minden egyes mérési eredményt 500 egymást követő lézer lövés egyesített adataiból számoltunk ki.
31
10. ábra: Bruker Daltonics, Autoflex II tömegspekrometriás készülék [http://www.medwow.com/med/mass-spectrometer/bruker/autoflex-ii-lineartof/60250.model-spec]
A
fehérjék
PMF
azonosítása
MSDB
(Swiss-Prot)
és
NCBInr
adatbázisok
alkalmazásával, majd MASCOT adatbázis (MASCOT Server 2.2 search engine, MatrixScience Ltd., London, UK) keresőmotor és Bruker BioTools 3.0 software (BrukerDaltonics, Bremen, Germany) segítségével történt. A keresés során az egyszeresen pozitív töltésű monoizotópos peptidcsúcsokat vettük figyelembe, keresési hibahatárnak 100 ppm-et, illetve 1 kihagyott triptikus hasítási helyet adtunk meg. Az adatok további feldolgozását a Bruker FlexControl 2.4 (Bruker Daltonics, Bremen, Germany) és a Bruker FlexAnalysis 2.4 (Bruker Daltonics, Bremen, Germany)
programok
segítségével
végeztük
el.
A
MALDI-TOF/TOF
tömegspektrometria felhasználásával azonosítottuk azokat a fehérjéket, melyek jelenléte kimutatható a betegségek manifesztációja során, illetve amik diagnosztikai értékűek
lehetnek.
A
meghatározás
során
rögzítettük
az
elsődleges
tömegspektrumot, majd ezt követően a nagyobb intenzitású, vagy diagnosztikailag
32
jelentős peptideket PSD,- vagy CID fragmentációval tovább bontottuk. Így tudtuk meghatározni a peptidek pontos elsődleges szerkezetét és annak módosulásait [58,25].
3.3.2.6. A spektrogram értékelése
Minden minta analízise során egy grafikont készít a számítógép, aminek az értékelésével határozhatjuk meg magát a keresett fehérjét. A grafikon y tengelyén a jelintenzitása (egyenes arányban az adott peptid mennyiségével), az x tengelyen a móltömeg/töltés
látható.
Ennek
megfelelően
minden
mintából
készült
ábrasegítségével leolvasható, hogy milyen móltömegű peptid milyen arányban volt jelen. Az ábrán csúcsok láthatóak, amelyek 1-1 azonos móltömegű peptid mennyiségét jelzik. Ennek a grafikonnak, és az adatbázisban hozzáférhető fehérjék spektrogramjának összehasonlításával azonosíthatjuk a mintában lévő fehérjéket [57].
3.3.2.7. Célzott peptid analízis
Ezt az analitikai módszert azért választottuk, hogy a fent leírt módszer helyett egy időben rövidebb, ráfordításban olcsóbb eljárást keressünk, a nagy áteresztő képesség érdekében. Nem szükséges hozzá az elektroforetikus futtatás és peptid kivonás a gélből, direkt nyálminta felhasználással végeztük a méréseket, és az előzőleg kimutatott fehérjékre fókuszáltunk.
33
A célzott peptid analízishez 50 µl mennyiségű nyálat higítottunk 100 µl 50 mM koncentrációjú NH4HCO3 oldattal, ezt követően végeztük a tripszines emésztést, illetve a MALDI TOF/TOF MS analízist a korábbiakban leírtaknak megfelelően.
3.4. Statisztikai elemző módszerek Vizsgálataink statisztikai elemzését a ClinProTools 3.0 nevű szoftverrel végeztük el (Bruker Daltonics, Bremen, Germany). A rekalibrációra, a csúcsok normalizációjára, a csúcsok detektálására, a csúcsok kalkulációjára a szoftver automatikus beállításainak megfelelően került sor. The ClinProTools segítségével számos statisztikai próba végezhető el (t-próba, Wilcoxon- teszt, stb), mely prediktálja a jelentős diszkriminatív erővel bíró m/z értékeket.
34
4. Eredmények 4.1. Elektroforézis vizsgálat eredménye A gélen futtatott fehérjék mintázatát a gél beszkennelését követően szabad szemmel hasonlítottuk össze. 12. ábra: Kontroll csoport gélje (H csoport) kDa
Kalibráció
H1 H2
H3 H4 H5
H6
H7
170 130 100 70 55 40 35
25 15
kDa 170 130 100 70 55 40 35
Kalibráció D1 D2
D3 D4
D5 D6
D7 D8
25 15
13. ábra: Diabeteses páciensek gélje (D csoport) 35
A kész géleket átvilágító asztalra helyeztük, majd szkenner segítségével és digitális kamerával is rögzítettük a vizsgált gélek képét. Szabad szemmel is jól látható különbségeket találtunk a két csoport fehérje mintázatában. (12, 13. ábra) Jól látható eltéréseket figyeltünk meg a 7, 21, 37 és 86 kDa tartományban. Ezek a fehérjék jellemzően a diabeteses betegek nyálmintáiban fordult elő. Az elméleti tömegértékek megfeleltek a korábban leírt laphámcarcinomával összefüggésbe hozható nyál biomarkerek elméleti tömegével, ezért ezeket a spotokat kimetszettük a gélekből
és
további
elemzés
céljából
előkészítettük
tömegspektrometriás
vizsgálathoz.
36
4.2. Tömegspektrometriás vizsgálat eredménye
Vizsgálataink során több mint 900 peptidet sikerült azonosítani. A következő táblázat foglalja össze a DM csoportban leggyakrabban előforduló laphámcarcinomára utaló peptideket.
4. táblázat: Az identifikált peptidek paraméterei Elméleti Szám
Név
Azonosító kód
móltömeg (kDa)
Szekvencia fedettség%
1.
Annexin A8-like 2 [Homo sapiens]
gi|55666310
36,84
47,63
2.
Annexin A8-like Homo sapiens
Q5T2P8_HUMAN
36,86
32,72
3.
Tyrosine kinase
gi|473882
7,36
46,88
4.
AX969656 NID Homo sapiens
CAF14764
14,82
26,61
5.
Protein kinase [Homo sapiens]
gi|9886711
86,35
31,59
6.
Peroxiredoxin-2
gi|2507169
21,7
64
7.
Annexin A2
gi|113950
38,44
30
A vizsgálatba bevont személyek nyálmintáiban előforduló laphámcarcinomára utaló fehérjék előfordulását az 5. táblázat mutatja be.
37
5. táblázat:A szájüregi laphámrákra jellemző biomarkerek előfordulását a diabeteses és a kontroll mintákban. A kontroll csoportban nem detektálható egyik jellemző biomarker sem. Diabetes n=25
Biomarker
Kontroll n=20
Biomarker
D001
1,2,3
H001
neg
D002
1,2,3
H002
neg
D003
1,3
H003
neg
D004
1,2,3
H004
neg
D005
1,2
H005
neg
D006
1,2,3
H006
neg
D007
1,2,3
H007
neg
D008
1,2,3
H008
neg
D009
1,2,3
H009
neg
D010
1,2,3
H010
neg
D011
1,3
H011
neg
D012
1,2,3
H012
neg
D013
1,2,3
H013
neg
D014
1,2,3
H014
neg
D015
1,3
H015
neg
D016
1,2,3
H016
neg
D017
1,2
H017
neg
D018
1,2
H018
neg
D019
1,2,3
H019
neg
D020
1,2,3
H020
neg
D021
1,2,3
D022
1,2,3
D023
1,2
D024
1,2,3
D025
1,3
1: Annexin A8 2: Peroxiredoxin-2 3: Tirozin- kináz 38
A 6. táblázatban foglaltam össze a peroxiredoxin-2 előfordulását a DM csoportban. A táblázatból leolvasható, hogy jellemzően a 5 éve vagy annál régebb óta diabetesben szenvedő betegben detektálható a peroxiredoxin-2. 6. táblázat: A peroxiredoxin 2 előfordulása a diabeteses csoportban
DM Diagnosis
Bevonási szám
Nem
D001
nő
13
D002
nő
9
D004
férfi
15
D005
férfi
13
D006
nő
12
D007
nő
6
D008
férfi
25
D009
nő
11
D010
férfi
19
D012
nő
13
D013
nő
18
D014
nő
25
D016
nő
8
D017
nő
10
D018
férfi
6
D019
nő
14
D020
férfi
7
D021
nő
15
D022
férfi
16
D023
férfi
12
D024
férfi
5
felállítása (éve)
39
A vizsgálatokba bevont nyálminták tömegspektrográfiás képét az alábbi ábrákon mutatom be. A teljesség igénye nélkül csak a reprezentatív képet mutató nyálminták eredményeit demonstrálom. DM megjelöléssel a diabetes páciensek mintáját jelöltem, míg H jelöléssel az egészséges kontrollokét.
Intens. [a.u.]
4.2.1. Cukorbeteg páciensek nyálmintájának képe 1224.5 4000
3000
990.4
1471.6
2000
1731.7
1000
845.4
1866.8 2066.8
0 500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
4000
4500
m/z
Intens. [a.u.]
DM1- 13 éve diabetesben szenvedő, nő páciens. Mintájában megtalálható az m/z 991, m/z 1472-vel és m/z 1731-gyel jellemzett annexin A8, tirozin-protein kináz és peroxiredoxin-2.
990.4 6000
1471.5 4000
857.0
1238.4 1315.5
797.3 2000
1866.7 1680.7 2066.8
4371.2
2917.1
0 500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
4000
4500
m/z
DM2 – 9 éve diabetesben szenvedő nő páciens. Mintájában megtalálható az m/z 991, m/z 1472-vel és az 1731-gyel jellemzett annexin A8, tirozin-protein kináz és peroxiredoxin-2.
40
Intens. [a.u.]
1224.6 6000 5000
4000
990.5 3000
1471.8 1732.0
2000
1867.2
1000
0 500
2917.6
1000
1500
2000
2500
3000
3500
4000
4500
m/z
Intens. [a.u.]
DM3 – 6 éve diabeteses férfi nyálmintájában azonosított annaexin A8 és tirozinprotein kináz csúcsai. x104
1224.5
1.50
1.25 1.00
1471.6 990.4
0.75 0.50
1731.7 0.25
0.00 500
843.3
1866.8
1000
1500
2000
2377.6
2500
2917.2 3000
3500
4000
4500
m/z
Intens. [a.u.]
DM4- 14 éve diabetesben szenvedő férfi betegben detektált mindhárom biomarker.
x104 1.50
1287.5
1.25
1.00
1434.5
0.75
1471.5
0.50
4373.7
925.5 0.25
0.00 500
1150.5
1000
1491.6
1500
1766.8 3036.6 2000
2500
3000
3500
4000
4500
m/z
DM5- 13 éve diabetesben szenvedő férfi betegben kimutatott annexin A8 és peroxiredoxin-2.
41
Intens. [a.u.]
1287.4 1500
4372.3
1250 1000 750
990.5
1471.7
1000
1500
500 250 0 500
2000
2500
3000
3500
4000
4500
m/z
Intens. [a.u.]
DM6 – 12 éve diabeteses női betegben megtalálható mindhárom biomarker.
x104
1224.4
1.5
1471.5 1.0
893.3
0.5
1731.7 2067.0 2521.8
0.0 500
1000
1500
2000
2500
2917.4
3000
3500
4000
4500
m/z
Intens. [a.u.]
DM7- 6 éve diabetesben szenvedő nő beteg nyálmintájában található annexin A8, tirozin-protein kináz és peroxiredoxin-2 csúcsainak képe.
1471.5 8000
1224.4 6000
1090.4 4000
1009.4 990.4
2000
1866.8
4371.9
1718.7
2917.3
2066.9 0 500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
4000
4500
m/z
DM8- 25 éve diagnosztizált diabetes férfi beteg nyálmintájában található annexin A8, tirozin-protein kináz és peroxiredoxin-2 csúcsainak képe.
42
Intens. [a.u.]
1471.5 8000
1224.4 6000
1090.4 4000
1009.4 990.4
2000
1866.8
4371.9
1718.7
2917.3
2066.9 0 500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
4000
4500
m/z
Intens. [a.u.]
DM9- 11 éve diabeteses nő beteg képe. Nyálmintájában megtalálhatóak az annexin A8, tirozin-protein kináz és peroxiredoxin-2 csúcsai.
4372.202 1000
800
990.549
1471.754
1224.625
600
400
1731.822 200
0 500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
4000
4500
m/z
Intens. [a.u.]
DM10- 19 éve diagnosztizált diabetes férfi betegben mindhárom keresett biomarker csúcsa detektálható.
8000
1224.5 1471.6
6000
1009.4 990.4
4000
2000
1731.7 797.4
4371.2
2066.8
0 500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
4000
4500
m/z
DM11- 8 éve diabetesben szenvedő nő páciensben az annexin A8 és tirozin-protein kináz csúcsai. 43
Intens. [a.u.]
1044.4 6000
893.3
4000
1471.5 1335.5
2000
1866.7 1691.6 0 500
1000
1500
2066.8
2000
2521.3 2500
4370.9 3000
3500
4000
4500
m/z
Intens. [a.u.]
DM12- 13 éve diabetesben szenvedő nő betegben előforduló annexin A8, tirozinprotein kináz és peroxiredoxin 2 csúcsai.
893.4 4000
3000
1471.6 1106.5 2000
1044.4 4371.9
1000
1866.8
0 500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
4000
4500
m/z
Intens. [a.u.]
DM13- 18 éve diabeteses nő betegben előforduló annexin A8, tirozin-protein kináz és peroxiredoxin 2 csúcsai.
1335.5 1600.5
3000
797.4
1106.4
4371.2
2000
1000
3036.4 1866.7
0 500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
4000
4500
m/z
DM14- 25 éve diabetesben szenvedő nő betegben előforduló annexin A8, tirozinprotein kináz és peroxiredoxin 2 csúcsai. 44
Intens. [a.u.]
1246.5 1106.4 3000
797.4
1044.4
1388.5
2000
1485.6
2067.1
1590.7 1000
1805.8 2759.3
0 500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
4000
4500
m/z
DM15- 10 éve regisztrált diabetes férfi betegben található annexin A8 és tirozinprotein kináz képe.
45
Intens. [a.u.]
4.2.2. Egészséges kontroll minták képe 2769.624 1200
922.034 1000 800
2385.888
600
1639.605 400
2026.746 3315.630
200 0 500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
4000
4500
m/z
Intens. [a.u.]
H1- 62 éves nő nyálmintájának tömegspektrográfiás képe: nem található egyik keresett biomarker sem. 2000
1107.402
1500
1357.697
1000
1822.164
896.201 500
0 500
2769.134
2211.715
1000
1500
2000
2500
3000
3500
4000
4500
m/z
Intens. [a.u.]
H2 - 67 éves nő önkéntes mintájának képe: a keresett biomarkerek nem jelennek meg. 2769.245 1250
1000
750
500
922.056
2211.584 1639.631
2503.233
250
0 500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
4000
4500
m/z
H3 - 57 éves férfi nyálmintáját tömegspektrogáfiás képe. A keresett biomarkerek nem jelennek meg.
46
Intens. [a.u.]
1200
2770.208
876.965 1320.655
1000
1107.501
800
1639.093 600
707.010
400
200
0 500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
4000
4500
m/z
Intens. [a.u.]
H4 - 72 éves nő nyálmintájának tömegspektrográfiás képe. A 3 fő biomarker nem mutatható ki.
4388.260
8000
6000
4000
1606.462
2000
0 500
2186.700
1197.808
723.126
1000
2770.365 3495.021
1500
2000
2500
3000
3500
4000
4500
m/z
Intens. [a.u.]
H5 - 55 éves férfi nyálmintájának tömegspektrogáfiás képe. A keresett biomarkerek spektrumjai hiányoznak.
2000
2769.258
1500
1947.232
2211.873 1000
877.028 500
0 500
1125.470
1000
1707.965
1500
2000
2500
3000
3500
4000
4500
m/z
H6 - 65 éves férfi, egyikkeresett biomarker sem található a mintában.
47
Intens. [a.u.]
2000
1254.640
1500
1995.157 2769.091 842.343
1000
2211.292
1639.933
500
0 500
2501.861
1000
1500
2000
2500
3000
3500
4000
4500
m/z
Intens. [a.u.]
H7 - 48 éves nő. A keresett biomarkerek nem találhatóak a mintában.
2047.895 4000
3000
1213.713
2000
2604.360 1836.378
1037.560 1000
0 500
896.444
1000
2360.271
1408.763 3039.566
1500
2000
2500
3000
3500
4000
4500
m/z
H8 - 70 éves nő nyálmintájának tömegspektrumos képe. Hiányoznak a jellegzetes biomarkerek.
48
4.2.3. Tömegspektrometriás kép összehasonlítása
1.kép: DM13- 18 éve diabetesben szenvedő, 61 éves női páciens mintájának képe,
Intens. [a.u.]
mindhárom jellegzetes laphámcarcinoma biomarkert tartalmazza.
893.4 4000
3000
1471.6 1106.5 2000
1044.4 4371.9
1000
1866.8
0 500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
4000
4500
Intens. [a.u.]
m/z
2769.245 1250
1000
750
500
922.056
2211.584 1639.631
2503.233
250
0 500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
4000
4500
m/z
2. kép: H3- Egészséges, 58 éves női kontroll egyed képe. A minta nem tartalmazza egyik keresett biomarkert sem.
49
4.3. Statisztikai eredmények bemutatása A minták normalizált tömegspektrumjain megfigyelhető csúcsok területeinek statisztikai elemzését egy speciálisan erre a célra készített ClinProTools 3.0TM szoftver segítségével végeztük el. A program első lépésben újrakalibrálja, normalizálja majd intergálja a spektrumokat, ezt követően különböző statisztikai próbák segítségével (t-próba, Wilcoxon- teszt) prediktálja a jelentős diszkriminatív erővel bíró m/z értékeket. Ezekkel a tömegekkel (pontosabban m/z értékekkel) jellemezhető ionok, olyan potenciális biomarkerek, amelyek az adott mintacsoportok közötti molekuláris különbségek kimutatására alkalmasak. a rb . u . 380
S p .#
360
24
340 22 320 300
20
280 18 260 16
240 220
14 200 12
180 160
10 140 8
120 100
6
80 4 60 40
2
20 0 0 500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
4000
4500
5000
Da
14. ábra: A statisztikailag elemzett minták úgynevezett „Gelview” képe.
50
A 14. ábrán látható a statisztikailag vizsgált egészséges kontroll és diabéteszes mintacsoportba tartozó minták „gelview” képe. Az X-tengelyen a peptidek tömegeit jelzik Dalton mértékegységben. A bal oldali Y-tengely a minták számát jelzi, míg a jobb Y-tengely a normalizált abszolút intenzitást jelöli. Az ábra jól reprezentálja a mintacsoportok közötti jelentős eltéréseket, ill. a mintacsoporton belüli viszonylag jó reprodukálhatóságot a teljes tömegtartományon (m/z 500-5000).
Az 15. ábrától a 20. statisztikai ábráig mutatom be a főkomponens analízisének eredményeit. Az ábrákon jól látható az erős prediktív jelleggel bíró m/z értékek. Kiválóan alkalmasak a csoportok elkülönítésére. Az egészséges kontroll és diabéteszes nyálminták proteomikai vizsgálata során három olyan biomarkert mutattunk ki (annexin A8, tirozin-protein kináz, peroxiredoxin 2), amelyek alkalmasak lehetnek a két mintacsoport elkülönítésére. Az 15-os statisztikai ábrán látható m/z 991 jellemzett tömeg az annexin A8-ra, míg az m/z 1472 a tirozin-protein kinázra jellemző. Ez is jól reprezentálja hogy a proteomikai eszközökkel kimutatott, de statisztikailag nem validált biomarkerek statisztikailag is predikcióval bírnak. Az ábrán jól megfigyelhető, hogy a
zöld színnel ábrázolt diabéteszes mintacsoport
szignifikánsan elkülönül a piros színnel jelölt egészséges mintacsoporttól. Ez a tény azt mutatja, hogy az annexin A8 és tirozin protein kináz triptikus peptidjei és így a két fehérje is patológiás biomarker.
23mm biomarker a táblázat elején van, ennél prediktívabb értékkel bír, de ennek az azonosítása további vizsgálatok tárgyát képezi.
51
P k 7 6 , 1 4 7 2 Da 200
180
160
140
120
100
80
60
40
20
0 0
20
40
60
80 100 P k 3 9 , 9 9 1 Da
120
140
160
15. ábra: Az m/z 991 és m/z 1472 –vel jellemzett csúcsok főkomponens analízisének kétdimenziós reprezentációja. Zöld a diabeteses, míg a piros egészséges csoportot jelöli.
P k 1 0 6 , 2 4 8 2 Da 3 .2
3 .0
2 .8
2 .6
2 .4
2 .2
2 .0
1 .8
1 .6
1 .4
1 .2
1 .0
0 .8
0 .6
0 .4
0 .2
0 .0 0 .0
2 .5
5 .0
7 .5
1 0 .0
1 2 .5
1 5 .0
1 7 .5
2 0 .0 2 2 .5 P k 3 0 , 9 1 2 Da
2 5 .0
2 7 .5
3 0 .0
3 2 .5
3 5 .0
3 7 .5
4 0 .0
16. ábra: A m/z 2482 és m/z 912-vel jelzett tömegspektrum csúcsok főkomponens analízésnek eredménye. Zölddel a diabetes csoport, míg a pirossal az egészséges csoportot jelöltük.
52
P k 4610, 1 0 1 0 Da
55
50
45
40
35
30
25
20
15
10
5
0 0
5
10
15
20
25 30 P k 4 2 , 1 0 2 9 Da
35
40
45
50
17. ábra: Az m/z 1010 és m/z 1029-vel jellemzett tömegspektrum csúcsok főkomponens analízisének eredménye. Zöld a diabeteses, míg a piros egészséges csoportot jelöli.
P k 4 6 , 1 0 6 9 Da 28
26
24
22
20
18
16
14
12
10
8
6
4
2
0 0 .0
0 .5
1 .0
1 .5
2 .0
2 .5
3 .0
3 .5
4 .0 4 .5 P k 3 8 , 9 7 3 Da
5 .0
5 .5
6 .0
6 .5
7 .0
7 .5
8 .0
18. ábra: Az m/z 1069 és m/z 973 tömegspektrum csúcsok összevetése. Zöld a diabeteses, míg a piros egészséges csoportot jelöli.
53
P k 3 0 , 9 1 2 Da 4 0 .0
3 7 .5
3 5 .0
3 2 .5
3 0 .0
2 7 .5
2 5 .0
2 2 .5
2 0 .0
1 7 .5
1 5 .0
1 2 .5
1 0 .0
7 .5
5 .0
2 .5
0 .0 0
20
40
60
80
100 120 P k 7 6 , 1 4 7 2 Da
140
160
180
200
19. ábra: Az m/z 912 és m/z 1472 csúcsok főkomponens analízisének eredménye. Zöld a diabeteses, míg a piros egészséges csoportot jelöli.
P k 6830, 1 2 6 3 Da
75
70
65
60
55
50
45
40
35
30
25
20
15
10
5
0 0
20
40
60
80
100 120 Pk 7 6 , 1 4 7 2 Da
140
160
180
200
20. ábra: Az m/z 1263 és m/z 1473 jelölt tömegspektrum csúcsok összevetése. Zöld a diabeteses, míg a piros egészséges csoportot jelöli.
54
a rb . u . 380
S p .#
360
24
340 22 320 300
20
280 18 260 16
240 220
14 200 12
180 160
10 140 8
120 100
6
80 4 60 40
2
20 0 0 9 0 5 .0
9 0 7 .5
9 1 0 .0
9 1 2 .5
9 1 5 .0
9 1 7 .5
9 2 0 .0
9 2 2 .5 Da
9 2 5 .0
9 2 7 .5
9 3 0 .0
9 3 2 .5
9 3 5 .0
9 3 7 .5
9 4 0 .0
9 4 2 .5
21. ábra: Annexin A8 előfordulása a felső (diabetes csoportban) sávban, vele szemben az egészséges csoportban nem található.
a rb . u . 380
S p .#
360
24
340 22 320 300
20
280 18 260 16
240 220
14 200 12
180 160
10 140 8
120 100
6
80 4 60 40
2
20 0 0 1462
1464
1466
1468
1470
1472
1474 Da
1476
1478
1480
1482
1484
1486
22. ábra: Tirozin-protein kináz előfordulása a diabetes csoportban (felső sáv), míg vele szemben az egészséges csoportban nem jelenik meg.
55
5. Megbeszélés Érdekes párhuzamot vélhetünk fel a diabetes és szájüregi laphámcarcinoma gyakoriságában.
Az
elmúlt
négy
évtizedben
az
intenzív
kutatások,
és
gyógyszerfejlesztések és a szűrőprogramok kihangsúlyozása ellenére, több mint négyszeresére nőtt a szájüregi laphámcarcinomával diagnosztizált páciensek száma. A helyzet több, mint aggasztó: Magyarország Európában első helyet foglal el a rák statisztikai adatok között. [51,48,44] Ezen belül is a szájüregi laphámcarcinoma rendszerint az első háromban található [5,55]. Ennek hátterében sok tényező állhat. Az etiológiai faktorok közül kiemelkedő a magyar társadalom dohányzási szokása és a tömény szeszes italok fogyasztásának túlzott mennyisége [1,2,4,8-10,13,30,33,40]. Nem elhanyagolható faktor a súlyos szisztémás betegségek következtében kialakuló szövődmény sem [14,15,17,24,35,41]. Korábbi epidemiológiai vizsgálatok, már felvették annak lehetőségét, hogy a kettes típusú diabetes mellitus egyik súlyos szövődménye akár a szájüregi rák is lehet. A statisztikák szerint ezekben a páciensekben háromszor, de akár négyszer gyakrabban fordulnak elő gyulladásos szájüregi betegségek, precancerosisok, ill. tumorok, mint a velük kor- és nem eloszlásában megegyező kontroll csoportokban.
Az egészséges szájüreg epithelium borítása képes védekezni a carcinogén behatás ellen. Diabetesben az oralis mucosa progresszív atrófiája következtében az epithel barrier védelmi funkciója csökken. Tovább súlyosbítja a helyzetet, hogy diabetesben a szájüregben gyakrabban fordulnak elő gyulladásos betegségek. A megnövekedett vércukorszint hatására a reaktív oxigén szabadgyökök aránya is megnő a szervezetben, ami szintén promotálhat carcinogenesist [68].
56
Emellett megfigyelték, hogy a diabetes páciensekben mind a cellularis immunválasz, mind
a
T-sejtek
funkciója
csökkent,
ami
kedvez
a
carcinogen
anyagok,
vegyületeknek [39].
A microanginopathiák, mind szövődmények régóta ismertek. Így logikussá válik az a statisztikai eredmény is, mely szerint a nem diabeteses populációban a szájüregi laphámcarcinoma a nyelven, oropharynxon és szájfenéken fordul elő, addig a diabeteses betegekben, az microerekkel dúsan ellátott területeken (ajkak mucosája, ginigiván) találtak nagyobb arányban tumoros elváltozásokat [3,56].
Vizsgálataink során arra kerestük a válasz, hogy az epidemiológiai és állatkísérletes vizsgálatok
eredményeit,
sejtéseit
felhasználva,
diabeteses
betegekben
kimutathatók-e korai laphámrákkal megegyező biomarkerek. A diabeteses és egészséges egyedek géljeit összehasonlítva sok különbséget találtunk. A két csoportban eltérő spotokat tömegspektrometria segítségével azonosítottuk. Több mint 900 peptidet találtunk. A 4. táblázatban csak a diabeteses betegre jellemző laphámrákra utaló fehérjéket összegeztük. Az 5. táblázat foglalja össze a fehérjék előfordulását a mintákban.
57
5.1 Az identifikált fehérjék bemutatása
5.1.1. Annexin A8:
Az annexinek fontos cellularis és fiziológiás folyamatokban vesznek részt. Szerepük van a membránok scaffolding-jában* ami jelentősen összefügg a sejtek alakjával, formájával. Részt vesznek a vesiculák formálásában, továbbá megtalálhatók az endocytosis és exocytosis folyamatában is. Nem csak intracelluláris folyamatokban, de sejten kívül is megtalálhatóak. Annexinokat találhatunk a fibrinolysis, coagulatio, gyulladások és az apoptotikus folyamatokban. Az annexin szupercsalád csoportnak több tagja is ismert. A vizsgálataink során identifikált A8 forma specifikusan kötődik a calcyclinhoz, ami egy calcium-csatorna függő anyag. A calcyclin részt vesz az ún. "midbody" formatioban és cytokinesis terminális fázisában, így a sejt növekedésre is hatással van. Annexineket különböző súlyos szisztémás kórképekben sikerült már azonosítani. Gyulladásos megbetegedésekben, neoplasiakban is izolálták már. Az annexin expressziójának
változását
összefüggésbe
hozták
már
tumorgenetikus
folyamatokkal. Az annexin csoport tagjaira jellemző, hogy a túlprodukció, illetve a normális szinthez képest alulprodukció egyaránt malignus transzformáció jele lehet. Szántó és mtsai által vizsgált szájüregi laphám rákos páciensek nyál mintáiban emelkedett annexin A2 szintet találtak. Az annexin A11 és A8 "overexpresszióját" leírták már colorectalis daganatokban, de vizsgálataink során arra következtethetünk, hogy ezek a biomarkerek esetlegesen egy korai oralis laphám carcinoma jelenlétére utalhatnak [16,45,46,62].
*membrán scaffolding: membrán "feltekeredés" 58
23.ábra: Annexin A8 struktúrája [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/mmdb/mmdbsrv.cgi?uid=31354]
5.1.2. Peroxiredoxin-2:
Az oxidativ szabad gyökök, szervezetünkre igen sokfélék lehetnek. Ezek a reaktív részecskék részt vesznek a lipidperoxidációban, a DNS-lánc hasadásában. Az oxidatív stressz következménye irreverzibilis sejtkárosodás, a sejtek öregedése, de akár sejthalált is indukálhatnak. A thioredoxin peroxidáz család, vagy peroxiredoxinok elsődleges feladata az intracelluláris szabadgyökök, mint a H2O2 redukálása. Nagy érzékenységű és gyorsan reagáló molekulák. Hat izoformája ismert, valamennyi szerepet kap a különböző lokalizációjú tumorok kialakulásában [32,72].
59
Vizsgálatainkban azt figyeltük meg, hogy a 10 vagy annál több éve diabetesben szenvedők esetében észleltük. A vizsgált betegek 87,5%-ban (n=21) jelent meg, akiknél átlagosan 12,9 éve diagnosztizálták a betegséget. Továbbá, a vizsgálatba bevont nőkre volt inkább jellemző, n=12/25. Ennek az összefüggésnek az eredményeit a 6. táblázat foglalja össze.
24. ábra: Peroxiredoxin 3D-struktúrája [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/mmdb/mmdbsrv.cgi?Dopt=s&uid=13774]
60
5.1.3. Tirozin-protein kináz:
Tirozin- protein kinázok, olyan enzimek, melyek katalizálják a foszfátcsoportok addícióját a tirozin specifikus aminosavakban. Ezek az enzimek kulcsfontosságú szerepet játszanak a szignáltranszdukcióban, a sejtek differenciálódásában és morfogenezisben.
Aktivizált
formáját
korábban
összefüggésbe
hozták
már
mesenchyma eredetű tumorokkal, chronicus myeloid leukaemiával. Pontos szerepük az orális laphám carcinómában kialakulásában, progressziójában még nem ismert. Ezért későbbi vizsgálatainkban tervezzük ennek a molekulának további elemzését [20].
25.ábra: Tirozin-protein kináz 3D-képe [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/mmdb/mmdbsrv.cgi?uid=93770]
61
5.2. Konklúzió A kettes típusú diabetes elterjedése a mai civilizált társadalomban egyre ijesztőbb méreteket ölt [70]. Az elmúlt két évtizedben rohamosan nőtt az újonnan diagnosztizált betegeket száma, és a statisztikai előrejelzések szerint ezek a számok nemhogy
csökkenni
fognak,
de
rohamosan
emelkednek
a
jövőben.
Ma
Magyarországon körülbelül egymillió fő szenved a cukorbetegség valamelyik formájában, ez a lakosság több mint egy tizedét érinti.
Ennek a betegségnek a súlyos, akár az egész egészségügyi és gazdasági rendszert érintő következményei lesznek. Nem elhanyagolható tény az sem, hogy a diabetesben szenvedőkben idővel súlyos az egész szervezetet érintő, másodlagos megbetegedések alakulnak ki [7,14,17,24,35,41].
A
szakirodalomban
a
szájüregi
laphámcarcinoma
és
a
diabetes
mellitus
összefüggésére irányuló vizsgálatok nagy számban előfordulnak, de nyálból izolált laphám
carcinomával
összefüggésbe
hozható
biomarkerek
először
a
mi
munkacsoportunknak sikerült azonosítani.
A megnövekedett annexin A8, peroxiredoxin-2 szint, és a tirozin-protein kináz jelenlétét nyálmintákban ez eddig tumoros betegekben azonosították. Precancerosus állapotokban ezt eddig nem sikerült igazolni. Eredményeink tükrében feltételezzük, hogy a diabetes mellitus nem csak precancerosus állapot, de valószínűsíthetően a rosszindulatú laphámcarcinoma kialakulását megelőző, premalignus állapotnak is tekinthető. Minden nyálmintában találtunk korábban már a szakirodalomban leírt, laphámcarcinóma daganatsejtek által expresszált fehérjét. Ez az eredmény különös 62
fontosságú,
hiszen
a
vizsgálatba
bevont
önkénteseknél
korábban
nem
diagnosztizáltak laphámrákot vagy precancerosus elváltozást.
A proteomikai módszerek fejlődésével, lehetőségünk nyílt arra, hogy a különböző vegyületeket, ne csak szerkezetükben, de funkciójuk során is elemezni tudjuk. Méréseink egyszerű kivitelezhetősége, mintagyűjtés non-invazivitása bebizonyította számunkra, hogy a kötelező stomatooncológiai szűrésen túl, lehetőségünk van már korai fázisban kimutatni laphámrákra utaló fehérjéket. Így bizonyítottuk, hogy a kettes típusú diabetest jogosan tartjuk precancerosus állapotnak.
Ennek fontossága egyáltalán nem elhanyagolható. A korai stádiumban kiszűrt rákos megbetegedések,
precancerosus
laesiok
sokkal
nagyobb
valószínűséggel
gyógyíthatók, jobb prognózissal rendelkeznek, mint az előrehaladott stádiumban levő tumoros elváltozások.
Munkacsoportunk jövőbeli céljai közé tartozik, hogy még nagyobb populáción validáljuk eredményeinket.
63
5.3. Eredmények összefoglalása
1. Sikerült 3 biomarkert azonosítsunk diabeteses páciensek nyálában, mely szoros összefüggésbe hozható a szájüregi laphám carcinomával. Bár ezek pontos szerepe jelenleg még nem tisztázott a rák kialakulásában, gyanítható, hogy a carcinogenesis korai szakaszának biomarkereinek tekinthetőek.
2. Megállapítottuk, hogy azokban a páciensek akik 5 vagy annál több éve szenvednek diabetesben magasabb százalékban fordul elő a peroxiredoxin-2 biomarker, mint azoknál a betegeknél, akik 5 évnél rövidebb ideje szenvedtek a betegségben.
3. Vizsgálati protokollunk egy jól működő, standardizálható folyamat, mely bármikor reprodukálható. Így a protokoll a későbbiek során egy nagy multicentrikus tanulmány alapjául szolgálhat.
64
6. Irodalomjegyzék 1. Albrecht M, Bánóczy J, Dinya E, Tamás Jr G: Occurence of oral leukoplakia and lichen planus in diabetes mellitus. J Oral Path Med 1992;21:364-5. 2. Alvarez Gomez GJ, Alvarez Martinez E, Jimenez Gomez R, et al. Reverse smokers's and changes in oral mucosa. Department of Sucre, Colombia. Med Oral Patol Oral Cir Bucal. Jan 1 2008;13(1):E1-8. 3. American Academy of Periodontology. Position paper: diabetes and periodontal diseases [CD-ROM]. J Periodontol 1996;67: 166-76. 4. Andre K, Schraub S, Mercier M, et al. Role of alcohol and tobacco in the aetiology of head and neck cancer: a case-control study in the Doubs region of France. Eur J Cancer B Oral Oncol. Sep 1995;31B(5):301-9. 5. Argiris A, Karamouzis MV, Raben D et al: Head and neck cancer. Lancet, 2008;371:1695-1709. 6. Axell T, Holmstrup P, Kramer IRH, et al. International seminar on oral leukoplakia and associated lesions related to tobacco habits. Community DentOral Epidemiol. 1984;12:145-154. 7. Ben-Aryeh H, Serouya R, Kanter Y, Szargel R, Laufer D:Autonomic neuropathy and salivary composition in diabetic patients, Journal of Diabetes and its Complications, 1996, 10, 4, 226. 8. Blot WJ, McLaughlin JK, Winn DM, et al. Smoking and drinking in relation to oral and pharyngeal cancer. Cancer Res. Jun 1 1988;48(11):3282-7. 9. Campisi G, Giovannelli L, Arico P, et al. HPV DNA in clinically different variants of oral leukoplakia and lichen planus. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod. Dec 2004;98(6):705-11. 65
10. Carroll WR, Foushee HR Jr, Hardy CM, Floyd T, Sinclair CF, Scarinci I. Tobacco Use among Rural African American Young Adult Males. Otolaryngol Head Neck Surg. Aug 2011;145(2):259-63. 11. Cabay RJ, Morton TH Jr, Epstein JB. Proliferative verrucous leukoplakia and its progression to oral carcinoma: a review of the literature. J Oral Pathol Med. May 2007;36(5):255-61. 12. Cox M, Nelson DR.: Lehninger: Principles of Biochemistry (fifth ed.). W H Freeman & Co. 13. Decker J, Glodstein JC: Risk factors in head and neck cancer. N Engl J Med 1982; 306:1151-5. 14. Eastman R C: Neurpathy in diabetes. Diabetes in America. 2nd edition. 1995. 339-348. 15. Ernster JA, Sciotto CG, O'Brien MM, Finch JL, Robinson LJ, Willson T, et al. Rising incidence of oropharyngeal cancer and the role of oncogenic human papilloma virus. Laryngoscope. Dec 2007;117(12):2115-28. 16. Farnaes L, Ditzel HJ: Dissecting the cellular functions of annexin XI using recombinant human annexin XI-specific autoantibodies cloned by phage display. J. Biol. Chem. 2003;278 (35): 33120–6. 17. Fong D S, Aiello L, Gardner T, King G L, Blankenship G, Cavallerano J D, Ferris F L, Klein R: Retinopathy in diabetes. Diabetes Care.January 2004 vol. 27 no. suppl 1 s84-s87. 18. Glickman J: Clinical periodontolgy. Philadelphia, PA, Saunders, 1972. 19. Halmos T, Jermendy G.: Diabetes mellitus. Budapest, Medicina, 2002, 43-71, 163-188.
66
20. Hanks SK, Quinn AM, Hunter T.: The protein kinase family: conserved features and deduced phylogeny of the catalytic domains. Science. 1998;241 (4861): 42–52. 21. Hintao J, Teanpaisan R, Chongsuvivatwong V et al: The microbiological profiles of saliva, supragingival and subgingival plaque and dental caries in adults with and without type 2 diabetes mellitus. Oral Microbiol Immunol 2007;22:175-81. 22. de Hoffmann E, Stroobant V: Mass spectrometry. Principles and Applications. (third edition). Wiley 23. Hogewind WF, van der Kwast WA, van der Waal I. Oral leukoplakia, with emphasis on malignant transformation. A follow-up study of 46 patients. J Craniomaxillofac Surg. Apr 1989;17(3):128-33. 24. Howard B. V, Best L. G, Galloway J M, Howard W J, et al: Coronary heart disease risk equivalence in diabetes depends on concomitant risk factors. Diabetes Care.Febr 2006vol. 29,no. 2 391-397. 25. Jarai T, Maasz G, Burian A, Bona A, Jambor E, Gerlinger I, Mark L:Mass Spectrometry-Based Salivary Proteomics for the Discovery of Head and Neck Squamous Cell Carcinoma. Pathol Oncol Res 2012;18(3):623-8. 26. Kademani D. Oral cancer. Mayo Clin Proc. Jul 2007;82(7):878-87. 27. King H, Rewers M.: Global estimates for prevalence of diabetes mellitus and impaired glucose tolerance in adults. Diabetes Care, 1993, 16, 157-177. 28. Laemmli UK: Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 1970;227: 680-5. 29. Lamster IB, Lalla E, Borgnakke WS, Taylor GW: The relationship between oral health and diabetes mellitus. J Am Dent Ass 2008;139: 19S-24S.
67
30. Llewellyn CD, Johnson NW, Warnakulasuriya KA. Risk factors for squamous cell carcinoma of the oral cavity in young people--a comprehensive literature review. Oral Oncol. Jul 2001;37(5):401-18. 31. Lu H, Ouyang W, Huang C: Inflammation, a key event in cancer development. Mol Cancer Res 2006;4(4):221-33. 32. Lu Y, Liu J, Chengzhao L, Wang H, Jiang Y, Wang Y, Yang P, He F: Peroxiredoxin2: a potential biomarker for early diagnosis of Hepatitis B Virus related liver fibrosis identified by proteomic analysis of the plasma. BMC Gastroenterol. 2010;10: 115. 33. McDowell JD. An overview of epidemiology and common risk factors for oral squamous cell carcinoma. Otolaryngol Clin North Am. Apr 2006;39(2):277-94. 34. Modern fehérjekutatási módszerek. Medicina kiadó,1. kiadás, 2011. 35. Murrah V A: Diabetes mellitus and associated oral manifestations: a review. J of Oral Pathology & Medicine. 1985. 14: 271-281. 36. Dr. Nagy Ákos: Biológiailag aktív fehérjék a nyálban: az alfa amiláz és az epidermális növekedési faktor funkcionális vizsgálata.PhD értekezés, 2003. 37. Napier SS, Speight PM. Natural history of potentially malignant oral lesions and conditions: an overview of the literature. J Oral Pathol Med. Jan 2008;37(1):1-10. 38. Navazesh M: Methods for collecting saliva. Ann NY Acad Sci 1993;694:72-7. 39. Negrato CA, Tarzia O: Buccal alterations in diabetes mellitus. Diabetol Metab Syndr 2010; 15:2-3. 40. Negri E, La Vecchia C, Franceschi S, et al. Attributable risk for oral cancer in northern Italy. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. May-Jun 1993;2(3):189-93.
68
41. Nelson R G, Knowler W L, Pettitt D J, Bennett P H: Kidney diseases in diabetes. Diabetes in America. 2nd edition. 1995. 349- 387. 42. Neville BW, Damm DD, Allen CM, et al. Oral & maxillofacial pathology. 2nd ed. Philadelphia, PA: Saunders; 2002:337-369. 43. Neville BW, Day TA. Oral cancer and precancerous lesions. CA Cancer J Clin. Jul-Aug 2002;52(4):195-215. 44. Parkin DM, Bray F, Ferlay J, Pisani P: Global cancer statistics, 2002. CA Cancer J Clin 2005;55:74-108. 45. Paweletz CP, Ornstein DK, Roth MJ, Bichsel VE, Gillespie JW, Calvert VS, Vocke CD, Hewitt SM, Duray PH, Herring J, Wang QH, Hu N, Linehan WM, Taylor PR, Liotta LA, Emmert-Buck MR, Petricoin EF: Loss of annexin 1 correlates with early
onset of tumorigenesis in esophageal and prostate
carcinoma. Cancer Res. 2000;60:6293–6297. 46. Rand JH: The annexinopathies: a new category of diseases. Biochim Biophys Acta.2000;1498:169–173. 47. Report of a meeting of investigators on the histological definition of precancerous lesions. Geneva: World Health Organization; 1973. 48. Ries LAG, Melbert D, Krapcho M, Stinchcomb DG, Howlader N, Horner MJ, Mariotto A, Miller BA, Feuer EJ, Altekruse SF, Lewis DR, Clegg L, Eisner MP, Reichman M, Edwards BK (eds). SEER Cancer Statistics Review, 1975-2005, National
Cancer
Institute.
Bethesda,
MD,
http://seer.cancer.gov/csr/1975_2005/, based on November 2007 SEER data submission, posted to the SEER web site, 2008 [database online]. 2008. Updated 2008.
69
49. Segal A, Wong DT: Salivary diagnostics: enhancing disease detection and making medicine better. Eur J Dent Educ. 2008.12(suppl):22S-29S 50. Shafer WG, Waldron CA. Erythroplakia of the oral cavity. Cancer. Sep 1975;36(3):1021-8. 51. Silverman S Jr. Demographics and occurrence of oral and pharyngeal cancers. The outcomes, the trends, the challenge. J Am Dent Assoc. Nov 2001;132 Suppl:7S-11S. 52. Silverman S Jr, Gorsky M, Lozada F. Oral leukoplakia and malignant transformation.
A follow-up
study of
257
patients.
Cancer.
Feb
1
1984;53(3):563-8. 53. Silverman S Jr. Observations on the clinical characteristics and natural history of oral leukoplakia. J Am Dent Assoc. Apr 1968;76(4):772-7. 54. Sugerman PB, Shillitoe EJ. The high risk human papillomaviruses and oral cancer: evidence for and against a causal relationship. Oral Dis. Sep 1997;3(3):130-47. 55. Szabolcs O, Kásler M.: A hazai és nemzetközi daganatos halálozási és megbetegedési mutatók alakulása. Magyar Onkológia. 2005, 49, 99-107. 56. Szabó Gy, Németh Zs.: Szájsebészet, maxillofaciális sebészet. Nyálmirigy betegségek, Semmelweis kiadó, Budapest, 2004; 125-129. 57. Szántó
I:
Nagy átbocsátóképességű
diagnosztikai módszer szájüregi
daganatok korai felismerésére. PhD értekezés. 2011. 58. Szanto I, Mark L, Bona A, Maasz G, Sandor B, Gelencser G, Turi Z, Gallyas F Jr.: High-throughput screening of saliva for early detection of oral cancer: a pilot study. Technol Cancer Res Treat. 2012;11(2):181-8. 59. Szeberényi J. Molekuláris sejtbiológia. Dialóg Campus Kiadó 2004.
70
60. Talián M., Márk L, Melegh B: In: Kovács LG, Debreceni L (szerk.): Tömegspektrometria. Gyakorlati laboratóriumi medicina, Literatúra medicina 2008. 61. Tilakaratne WM, Klinikowski MF, Saku T, et al. Oral submucous fibrosis: review on aetiology and pathogenesis. Oral Oncol. Jul 2006;42(6):561-8. 62. Tomas A, Futter C, Moss SE: Annexin 11 is required for midbody formation and completion of the terminal phase of cytokinesis. J. Cell Biol. 2004;165 (6): 813– 22. 63. Ujpál M, Matos O, Bídok G, Somogyi A, Szabó G, Suba Z: Diabetes and oral tumors in Hungary. Diabetes Care 2004;27: 770-4. 64. Ujpál M.: A szájüregi daganatok és a diabetes mellitus összefüggései. PhD Értekezés. 2004 65. Vairaktaris E: Diabetes and Oral Oncogenesis, Anticancer Research 2004;27: 4185- 4194. 66. Warnakulasuriya S, Johnson NW, van der Waal I. Nomenclature and classification of potentially malignant disorders of the oral mucosa. J Oral Pathol Med. Nov 2007;36(10):575-80. 67. Waldron CA, Shafer WG. Leukoplakia revisited. A clinicopathologic study 3256 oral leukoplakias. Cancer. Oct 1975;36(4):1386-92. 68. Weinberg RA.: The Biology Of Cancer. New York: Garland Science,Taylor & Francis Group, LLC. pp. 757–759. 69. Westermeier R, Naven T, Höpker HR: Proteomics in Practice (second edition). Wiley-VCH Verlag. 70. Wild S, Roglic G, Green A, Sicree R, King H: Global prevalence of Diabetes. Diabetes Care. May 2004 vol. 27 no. 5 1047-1053.
71
71. Wong DT: Salivary diagnostics powered by nanotechnologies, proteomics and genomics. J Am Dent Ass. 2006;137: 313-321. 72. Wood ZA, Poole LB, Karplus PA: Peroxiredoxin evolution and the regulation of hydrogen peroxide signaling. Science. 2003; (300) 650–653.
72
7. Tudományos közlemények
7.1. Témával kapcsolatos publikációk jegyzéke 1.Jancsik VA, Gelencser G,Maasz G, Schmidt J,Molnár GA, Wittmann I, Olasz L, Mark L: Salivary proteomic analysis of diabetic patients for possible oral squamous cell carcinoma biomarkers Pathology and Oncology Research, Vol. 19, Issue 4, Oct. 2013.DOI: 10.1007/s12253-013-9736-8, IF: 1,555 2.Jancsik VA, Márk L, Molnár GA, Wittmann I, Olasz L: Nyálból izolált szájüregi laphámkarcinóma biomarkerek vizsgálata 2-es típusú diabéteszes betegekben Fogorvosi Szemle, 106. évf. 3. sz. 2013.
3. Jancsik VA, Márk L, Molnár GA, Wittmann I, Olasz L: A szájüregi rák megelőzésének lehetőségei, új módszerek a diagnosztikában Magyar Epidemiológia, 2013.
7.2 Témában megjelent absztraktok jegyzéke 1.JancsikVÁ, MárkL, Wittmann I, OlaszL: Application Proteomic methods in early cancer-related biomarkers in diabetic patients J Dent Res 93(Spec Iss Abstract Book): a.id:182583, 2013. IF:3.826
2.Jancsik VA, Molnár GA, Wittmann I, Olasz L, Mark L: Is Type 2 Diabetes a Risk Factor for Oral Squamous Cell Carcinoma? Analyzing Alterations of Salivary Biomarkers 73rd Scientific Sessions Abstract Book, the July 2013 supplement to the Journal Diabetes®a.id:2718-PO, IF:8.3
IF.: 1,555 Kumulatív IF absztaktokkal.: 16,681 73
7.3. Témához kapcsolódó előadások
1.Jancsik VÁ, Márk L, Molnár GA, Wittmann I, Olasz L: Determing early oral cancer biomarkers in type-2 diabetes 10th European Symposioum on Saliva, Egmond aan Zee, 2014.
2. JancsikVÁ, MárkL, Wittmann I, OlaszL: Application Proteomic methods in early cancer-related biomarkers in diabetic patients 10th World Congress on Preventive Dentistry, poszterprezentáció, Budapest, 2013.
3. Jancsik VA, Olasz L: A szájüregi rák megelőzésének lehetőségei, új módszerek a diagnosztikában Magyar Epidemiológiai Társaság Kongresszusa,Pécs, 2013.
4. Jancsik VA, Márk L, Molnár GA, Wittmann I, Olasz L: A 2-es típusú diabétesz a szájüregi laphámrák Kórjelző biomarkerek klinikai proteomikai vizsgálata
rizikófaktora?
–
Magyar Arc-, Állcsont- és Szájsebészeti Társaság 16. Nemzeti Kongresszusa, Visegrád, 2012.
5. Jancsik VA, Márk L, Molnár GA, Wittmann I, Olasz L: A proteomika a tumordiagnosztikában- kórjelző biomarkerek előfordulása 2-es típusú diabéteszben Magyar Fogorvosok Egyesületének Árkövy Vándorgyűlése, Pécs, 2012.
74
6.Olasz L, Márk L, Molnár GA, Wittmann I, Jancsik VA: The characterisation of possible salivary OSCC biomarker expression in type 2 Diabetes 21. Congress of the European Association for Cranio-Maxillo-Facial Surgery, Dubrovnik, 2012.
7. Jancsik VA, Molnár GA, Wittmann I, Olasz L, Mark L: Salivary oral squamous cell carcinoma biomarkers – Exploring potetial indicators in type-2 diabetes European Proteomics Association Congress, Glasgow, YIP-díj jelölt, 2012.
8. Jancsik VA, Mark L, Molnár GA, Wittmann I, Olasz L: Potenciális szájüregi páciensekben
laphámrák
biomarkerek
vizsgálata
diabéteszes
Magyar Arc-, Állcsont- és Szájsebészeti Társaság, Pannon Szekció kongresszus, Veszprém, 2012. 9. Jancsik VA, Mark L, Molnar G, Olasz L: Biomarker discovery for oral squamous cell carcinoma– Searching for potential indicators in a high risk group Congress of the International College of Maxillofacial Surgery, Maspalomas, 2012.
7.4. Egyéb tudományos előadások 1.Jancsik V, Cseh G, Frank D, Börzsei L, Borsiczky B Pyogén csontfertőzések terápiája PMMA-szorbitol kapszulával Magyar Sebész Társaság konferencia, Budapest, szóbeli előadás, 2011. 2.Jávor Sz, Hocsák E, Balatonyi B, Kovács V, Jancsik V Á, Rőth E, Wéber Gy Transzvaginális pneumoperitoneum káros hatásának csökkentése antioxidáns kezelésse Magyar Sebész Társaság konferencia, Budapest, társszerző, 2011.
75
3.Cseh G, Jancsik V, Börzsei L, Frank D, Javor Sz, Borsiczky B PMMA sorbitol capsules for the treatment of pyogenic bone infection: experimental study in rabbits ESSR konferencia, Aachen, társszerző, 2011.
4.Jancsik V, Börzsei L, Frank D, Borsiczky B PMMA- sorbitol capsules for the treatment of pyogenic bone infection: an experimental study in rabbits Cross diákkonferencia, Zágráb, szóbeli előadás, 2011.
5.Jancsik V, Borsiczky B Pyogén csontfertőzések terápiája PMMA-szorbitol kapszulával Grastyán konferencia, Pécs, szóbeli előadás, 2011.
6.Nyúl tibiában létrehozott kísérletes osteomyelitis lokális therápiája antibiotikummal töltött PMMA - szorbitol kapszulák segítségével Dékáni pályamunka, díjazott pályamű, 2010.
7.Jancsik V, Börzsei L, Kereskai L, Kocsis B, Fülöp A, Borsiczky B New antibiotic filled capsules for the treatment of bone and intramedullary infections: an experimental study in rabbits YES Meeting, Porto, legjobb szóbeli előadás sebészet szekcióban, 2010.
8.Jancsik V, Börzsei L, Kereskai L, Kocsis B, Fülöp A, Borsiczky B Therapy with antibiotic filled PMMA-sorbitol capsule for experimental osteomyelitis due to Staphylococcus aureus in rabbits HMAA konferencia, Balatonfüred, szóbeli előadás, 2010.
9.Borsiczky B, Börzsei L, Jancsik V, Farnk D, Miseta A, Cseh G Nyúl tibiáján létrehozott kísérletes osteomyelitis lokális terápiája PMMA-szorbitol kapszulák közvetítésével Magyar Traumatológus Társaság konferencia, Pécs, társszerző, 2010.
76
10.Jancsik V, Borsiczky B Nyúl tibiáján létrehozott kísérletes osteomyelitis lokális terápiája antibiotikummal töltött PMMA-szorbitol kapszulák közvetítésével Korányi Frigyes Tudományos Fórum, Budapest, szóbeli előadás, különdíj, 2010.
11.Jancsik V, Börzsei L, Kereskai L, Kocsis B, Fülöp A, Wéber Gy, Borsiczky B Nyúl tibiában létrehozott kísérletes osteomyelitis lokális terápiája antibiotikummal töltött PMMA-szorbitol kapszulák közvetítésével TDK konferencia, Pécs, szóbeli előadás, 2010.
12.Jancsik V, Börzsei L, Kereskai L, Kocsis B, Fülöp A, Borsiczky B Therapy with antibiotic filled PMMA-sorbitol capsule for experimental osteomyelitis due to Staphylococcus aureus in rabbits Cross diákkonferencia, Zágráb, szóbeli előadás, 2010.
13.Jancsik V, Börzsei L, Kereskai L, Kocsis B, Fülöp A, Wéber Gy, Borsiczky B New antibiotic delivery system in the treatment of osteomyelitis YES Meeting, Porto, poszterprezentáció, 2009. 14.Jancsik V, Börzsei L, Kereskai L, Kocsis B, Fülöp A, Wéber Gy, Borsiczky B Új lehetőség az osteomyelitis kezelésében Korányi Frigyes Tudományos Fórum, Budapest, szóbeli előadás, különdíj, 2009.
77
8. Köszönetnyilvánítás
Hálásan köszönöm témavezetőimnek, Prof. Dr. Olasz Lajosnak és Dr. Márk Lászlónak a lehetőséget, hogy csatlakozhattam a doktori iskolához. Őszintén köszönöm önzetlen segítségüket, hasznos tanácsaikat és ösztönzésüket, mellyel támogattak dolgozatom megírásában.
Köszönetet mondok Prof. Dr. Wittmann Istvánnak és Dr. Molnár Gergő belgyógyász kollégáknak,
hogy
engedélyezték
és
támogatták
a
diabéteszes
páciensek
vizsgálatát. Külön köszönettel tartozom Dr. Nagy Ákos docens úrnak önzetlen segítségéért és támogatásáért.
Köszönet illeti meg az Orvosi Kémiai és Biokémiai Intézet munkatársainak segítségét a minták feldolgozásában, és elemzésében.
Nem utolsó sorban köszönöm a kollégáknak, az asszisztenseknek a fáradhatatlan munkáját, türelmét és segítőkészségét, amivel nagyban hozzájárultak e dolgozat megírásához. Külön hálával tartozom Wenczler Máriának a tanulmányaim során nyújtott segítségéért.
Végezetül köszönöm családom végtelen türelmét és bíztatásukat.
78
9. Melléklet 9.1. A vizsgálat során használt kérdőív és beleegyező nyilatkozat
79
80
9.2. Diabéteszes páciensek adatait összefoglaló táblázat
DM Diagnosis
Bevonási szám
Nem
Életkor
D001
nő
60
13
inzulin
D002
nő
61
9
inzulin
D003
férfi
70
16
inzulin
D004
férfi
74
15
inzulin
D005
férfi
58
13
inzulin
D006
nő
62
12
inzulin
D007
nő
70
6
inzulin
D008
férfi
67
25
inzulin
D009
nő
56
11
inzulin
D010
férfi
63
19
inzulin
D011
nő
62
12
inzulin
D012
nő
61
13
inzulin
D013
nő
68
18
inzulin
D014
nő
65
25
inzulin
D015
férfi
62
8
inzulin
D016
nő
60
8
inzulin
D017
nő
61
10
inzulin
D018
férfi
62
6
inzulin
D019
nő
62
14
inzulin
D020
férfi
52
7
inzulin
D021
nő
61
15
inzulin
D022
férfi
45
16
inzulin
D023
férfi
64
12
inzulin
D024
férfi
63
5
oralis antidiabetikum
D025
nő
61
16
inzulin
felállítása (éve)
Gyógyszerezés
81
9.3. ClinProTools statisztikai elemzéssel validált peptidek listája
82
S Index Mass DAve PTTA PKWK
PAD
Ave1Ave2 StdDev1 StdDev2 CV1 CV2
83
S Index Mass DAve PTTA PKWK
PAD
Ave1Ave2 StdDev1 StdDev2 CV1 CV2
84
S Index Mass DAve PTTA PKWK
PAD
Ave1Ave2 StdDev1 StdDev2 CV
CV2
85
