A Proteomika Szolgáltató Laboratóriumban elérhető szolgáltatások

A Proteomika Szolgáltató Laboratóriumban elérhető szolgáltatások

Dr. Csősz Éva

Tudományos hétfő 2012. 06. 04.

Proteomika Szolgáltató Laboratórium műszerpark MALDI-TOF (ABSciex)

PSZL

ESI-4000 QTRAP (ABSciex)

Kétdimenziós elektroforézis rendszer (Bio-Rad) BioPlex (Bio-Rad) Tudományos hétfő 2012. 06. 04.

I. Szekvencia alapú fehérje azonosítás - MS/MS spektrumokon alapuló fehérjeazonosítás - A spektrumok segítségével fehérje szekvencia részlet azonosítása történik, majd a megfelelő fehérje hozzárendelése az egyre bővülő adatbázisokból - ProteinPilot 4.0 (ABSciex) illetve Mascot keresőprogramok segítségével, az eredmények manuális értékelésével nagy biztonsággal történik a fehérje azonosítás Tudományos hétfő 2012. 06. 04.

I. Szekvencia alapú fehérje azonosítás

Fehérjét tartalmazó foltok/sávok kivágása 2DE

Enzimes (tripszin) emésztés

A sejt lízise Fehérjék azonosítása Tömegspektrometriás analízis Tudományos hétfő 2012. 06. 04.

II. Fehérje kvantitálás metabolikus jelölést követően SILAC – Stable isotope labelling with amino acids in cell culture Tápfolyadék 13C tartalmú Arg-el (nehéz Arg)

Tápfolyadék normál Arg-el (könnyű Arg)

Sejtek lízise és homogenizálása

Sejtek lízise és homogenizálása

Minta összekeverése

intenzitás

MS/MS

6 Da

m/z


III. Fehérje kvantitálás kémiai jelölést követően

B

R

Kontroll

115

B

R

Kezelt sejt 60 min

116

B

R

Kezelt sejt 120 min

117

B

R

Kezelt sejt 240 min

Sejtek feltárása, összekeverése

MS

m/z

jelölés

MS/MS 115

Fehérje mennyiségi adat a görbe alatti területből számolva

intenzitás

114

intenzitás

iTRAQ (isobaric tag for relative and absolute quantitation)

116 114

117

m/z


Fehérje kvantitálás metabolikus (SILAC) vagy kémiai (iTRAQ) jelölést követően Metabolikus jelölés

Kémiai jelölés

Előny

Előny

• 100%-os jelölést biztosítanak

• Tetszőleges mintán

• Egyazon rendszerben

alkalmazható

vizsgálható a két minta

• Egyazon rendszerben

Hátrány

vizsgálható 2-8 minta

• Csak sejtkultúrákra

Hátrány

alkalmazható

• A jelölés hatékonysága soha

• Bizonyos sejtek kiemelt

sem 100%

figyelmet igényelnek (speciális

• Jelölés nem teljesen specifikus

tápfolyadék stb.) Tudományos hétfő 2012. 06. 04.

Könnyfehérjék kvantitálása iTRAQ jelölést követően

Csosz et. al. (2012) J. Proteomics


IV. Fehérjék kvantitálása MRM/SRM módszer segítségével Q1 analizátor

Peptid kiválasztása

Ütközési cella

Q3 analizátor

Peptid fragmentálása Fragmens kiválasztása

Detektálás


IV. Fehérjék kvantitálása MRM módszer segítségével MRM módszer kidolgozása szöveti fehérjékre AALVLAQAPAALADVLEGDSSEDRAFRVRIAG DAPLQGVLGGALTIPCHVHLRPPPSRRAVLG SPRVKWTFLSRGREAEVLVARGVRVKVNEAY RFRVALPAYPASLTDVSLARCEVQHGIDDSSD AVEVKVKGVVFLYREGSARYAFSFSGAQEAC TPEQLYAAYLGGYEQCDAGWLSDQTV

Elméleti tripszin hasítás

Fehérje szekvencia BLASTp

MRM spektrum

MRM átmenetek tervezése

Csak a fehérjére jellemző szekvenciák kiválogatása


V. Aminosav analízis un. „intelligens” reagensek segítségével


V. Aminosav analízis un. „intelligens” reagensek segítségével


VI. Proteomikai profil változás vizsgálata kétdimenziós gélelektroforézis segítségével Alkalmas a proteomikai profilban bekövetkezett változások kimutatására, nyomon követésére A Minta

B Minta

gélanalízis kvalitatív és kvantitatív különbségek Tudományos hétfő 2012. 06. 04.

VI. Proteomikai profil változás vizsgálata kétdimenziós gélelektroforézis segítségével A proliferatív vitreoretinopátiára (PVR) jellemző fehérje profil vizsgálata Dispase

TG2 KO egér

TG2 KO PVR egér


VII. Gélanalízis Kétdimenziós gélelemzés


VII. Gélanalízis Géldokumentáció

Gélanalízis

Master gél

Expressziós különbségek


VII. Gélanalízis Egydimenziós gélelemzés QuantityOne (BioRad) szoftverrel M 240 kDa 165 kDa 125 kDa 93 kDa 72 kDa 63 kDa

H1

AD1 AD2 AD3 1 2 3 4 5 6

42 kDa 7

H1 H2 AD2 AD3

35 kDa

25 kDa

8

20 kDa

9

17 kDa

H2

10 11

12


VIII. Szkennelés Quantity One 1-D PDQuest Delta2D szoftverek

PharosFX Plus System •gélek •blottok •microplate-ek •agar-agar lemezek szkennelése


VIII. Szkennelés Fluorescens szkennelés: • 488 nm • 532 nm • 635 nm lézerek

Telepszámlálás agar-agar lemezen


Összefoglalás Vállalt szolgáltatások: • Szekvencia alapú (MS/MS) fehérjeazonosítás • Fehérje kvantitálás (SILAC, iTRAQ) • MRM alapú fehérje azonosítás és kvantitálás

• Gyors aminosav analízis • 1D és 2D elektroforézisek kivitelezése • Géldokumentáció • Gélanalízis • Fluoreszcens szkennelés • Fehérje profilok változásának vizsgálata Tudományos hétfő 2012. 06. 04.

Elérhetőségek

Honlap: http://bmbi.med.unideb.hu/proteomics Cím: DE OEC Elméleti Tömb, 204.

Személyes kapcsolat: Dr. Tőzsér József [email protected] Dr. Csősz Éva [email protected]

Köszönöm a figyelmet! Tudományos hétfő 2012. 06. 04.

A Proteomika Szolgáltató Laboratóriumban elérhető szolgáltatások

Recommend Documents