Komplex fehérjeanalitikai módszerek alkalmazása a Proteomika Szolgáltató Laboratóriumban - a
teljes proteomikai munkafolyamat kivitelezése Dr. Csősz Éva Proteomika Szolgáltató Laboratórium Biokémiai és Molekuláris Biológiai Intézet
Műszerpark
MALDI-TOF
PSZL
LC-MS/MS ESI-QTRAP
Kétdimenziós elektroforézis
Bio-Plex
Munkatársak
Prof. Dr. Tőzsér József Dr. Csősz Éva
Kulcsár Andrea
Hallgatók Lábiscsák Péter – II. Mol. Biol. MSc Emri Zsófia – II. Vegyész BSc Kallós Gergő – I. Mol. Biol. MSc
Műszerpark
MALDI-TOF
PSZL
LC-MS/MS ESI-QTRAP
Kétdimenziós elektroforézis
Bio-Plex
Voyager DE PRO (ABSciex) MALDI-TOF tömegspektrométer
Tömegspektrométerek felépítése
Minta bemenet
Elektronika
Ion forrás
Tömeg analizátor
Detektor
Adatfeldolgozó rendszer
Vákuum rendszer Tömeg spektrum
MALDI – Mátrix által segített lézer deszorpció ionizáció (Matrix Assisted Laser Desorption Ionization) Mintatartó lemez Lézer Minta
+ MH+
+ +
+
+
Analizátor Mátrix
+20-30 kV
• mintát mátrixal együtt kristályosítják • a minta ionizációját a mátrix ionok segítik • egyszeres vagy kétszeres töltésű ionok keletkeznek
Detektor
MALDI – Mátrix által segített lézer deszorpció ionizáció (Matrix Assisted Laser Desorption Ionization)
Mintatartó lemez hn 1.
Minta (M) a feleslegben lévő mátrixxal (X)összekeverve és szárítva a mintatartólemezen.
Minta és mátrix keveréke Grid
MALDI – Mátrix által segített lézer deszorpció ionizáció (Matrix Assisted Laser Desorption Ionization)
hn
Lézer 2.
Lézer hatására semleges mátrix (X) és minta molekulák(M), valamint mátrix ionok keletkeznek (XH)+, (X-
H)- . 3.
Minta molekulákat ionizálják a mátrix ionok:
XH+ + M X + MH+. X-H- + M X + M-H-
MALDI – Mátrix által segített lézer deszorpció ionizáció (Matrix Assisted Laser Desorption Ionization)
hn 4.
Ion Extrakció:
Nagy
feszültség hatására az ionok felgyorsulnak és kirepülnek MH+
a forrásból az analizátor felé.
+20 kV
Az ionok útja a repülési idő (Time-Of-Flight) TOF analizátorban
• A TOF analizátorban az ionok a kinetikus energiájuk és nagyságuk alapján
vándorolnak • A kisebb ionok gyorsabban, a nagyobb ionok lassabban mozognak az analizátorban • Minél hosszabb az ionok útja, annál szebb elválást eredményez
Ionforrás
Analizátor
Detektor
Felhasználási területek, mintaigény
• Pontos móltömeg-meghatározás
Voyager Spec #1[BP = 3658.0, 24125] 3657.65
100
• fehérje azonosítás
2.4E+4
ACTH (1-17) (1 pmól)
90
80
ACTH (7-39) (1,5 pmól)
2093.49
• fehérje tisztulásának ellenőrzése
70
• fehérje intaktságának vizsgálata
% Intensity
60
40
• fehérje módosítások kimutatása
ACTH (18-39) (0,75 pmól)
50
Insulin (bovine) (1,75 pmól)
2465.39
30 5729.39 20
4083.30 3640.98
10
3614.68
• Mintamennyiség:
0 1999.0
2799.4
3599.8
4400.2 Mass (m /z)
0,5-1 l minta (pmól tartomány) • Mérési tartomány: 100 Da – pár száz kDa (több is lehet!) • Interferáló anyagok: Sók nagyon zavarják a mérést – ZipTip/Stage Tip tisztítás
5200.6
0 6001.0
AnTx problémája – miért nem megfelelő a rekombináns fehérje hatása?
? AnTx
rAnTx
MALDI-TOF analízis
MALDI-TOF analízis
Hatás √
Hatás ~
0.4 mM tisztított AnTx spektruma Voyager Spec #1[BP = 4099.2, 430] 4099.1953
100
430.0
AnTx (Q forma) 90
17 Da 4098.1826
80
4100.1870 70
% Intensity
60
50
40
4096.1890
AnTx (Z forma)
4101.2075
30 4081.9626
20
10
0 4059.0
4071.6
4084.2
4096.8
4109.4
4122.0
Mass (m/z)
rAnTx2_0.4mM_32_2000_Cal_minta_0006.dat
Rekomináns AnTx – „refolded” forma spektruma Voyager Spec #1[BP = 4108.9, 97] 4108.8530
100
97.0
90
AnTx (Q forma)
80
4099.4575 70
% Intensity
60
50
4096.5713 4101.7319
40
AnTx (Z forma)
4107.2295 4113.7876
30 4086.3477 4117.8872 4094.2693
20 4080.7878
4084.2424 4098.4673
10
0 4077.0
4112.8081
4085.8
4094.6
4103.4
4112.2
4121.0
Mass (m/z)
rAnTx2refolded_22_2200_Cal_minta_0012.dat
Rekombináns AnTx - 20 mM DTT-vel redukált forma spektruma Voyager Spec #1[BP = 1065.9, 481] 4106.7534
100
4135.7666 92.0
AnTx (Z forma)
Redukált AnTx (Z forma)
90
Redukált AnTx (Q forma)
4070.7195 4064.6677
80
4081.6702 4124.4067 4107.9399
70
4128.9106
4056.9749
4121.0649
4136.2822
4117.0547 4087.5303
4125.3916
4103.2729
% Intensity
60
50
40
30
20
10
0 4056
4073
4090
4107
4124
4141
Mass (m/z)
rAnTx2DTT20mM_42_2200_Cal_minta_0004.dat
Rekomináns AnTx – „refolded” forma spektruma Voyager Spec #1[BP = 2464.0, 105] 4101.4673
100
105.0 4102.7441
AnTx (Q forma)
90
80
70 4099.2661
Redukált AnTx (Q forma)
% Intensity
60 4100.3853 50
4110.3877 40 4099.8174
30
4093.2793
4107.9180 4104.0952
4105.9033 4106.9141
20
4096.8965
4098.4761
10
0 4093.0
4096.8
4100.6
4104.4
4108.2
4112.0
Mass (m/z)
rAnTx2refolded_22_2200_Cal_minta_0007.dat
Tisztított rekombináns ANTX és kalibráló elegy együttes analízise
Voyager Spec #1[BP = 3658.0, 24125] 3657.65
100
2.4E+4
ACTH (1-17)
90
ACTH (7-39)
80 2093.49 70
% Intensity
60
ACTH (18-39)
50
Insulin (bovine) 40
2465.39
ANTX Z forma
30
5729.39 20
4083.30
3528 Da
3640.98
10
3614.68 0 1999.0
2799.4
3599.8
4400.2 Mass (m /z)
5200.6
0 6001.0
Baktériumok gyors, tenyésztés nélküli azonosítása • Bakteriológia – kenet levétele – baktériumok tenyésztése – baktériumok azonosítása • Egy/több nap Minden baktériumnak van egy csak rá jellemző, ún. spektrum-lábnyoma BioTyper (Bruker Daltonix) – baktériumok és bizonyos gombák gyors analízise
Minta
Azonosított baktérium
Szoftver Adatbázis – baktérium spektrumok MALDI-TOF
Baktériumok gyors, tenyésztés nélküli azonosítása
Dr. Szabó Judit DE OEC Mikrobiológiai Intézet
Minta MALDI-TOF Dr. Csősz Éva Lábiscsák Péter Kulcsár Andrea DE OEC PSZL
Szoftver készítése Dr. Emri Miklós DE OEC PET CENTRUM
Baktériumok gyors, tenyésztés nélküli azonosítása - munkamódszer
Standard baktérium törzsek
Dr. Szabó Judit DE OEC Mikrobiológiai Intézet
Baktérium szuszpenzió készítése
Mintafelvitel: 1 µl baktérium + 1 µl CHCA mátrix
MALDI – TOF analízis Spektrumok felvétele
Staphylococcus aureus baktérium MALDI-TOF spektruma Voyager Spec #1[B P = 3004.6, 9996] 3005.57
100
1.0E +4
90
80
70
% Intensity
60
50
40
30
2545.07
20 3873.01 10 2810.01
0 1999.0
5599.4
9199.8
12800.2
16400.6
0 20001.0
Mass (m /z)
Voyager Spec #1[B P = 3004.6, 9996] 3005.57
100
1.0E +4
90
80
70
% Intensity
60
50
40
2545.07
30
20 3873.01 10 2683.06
2305.30 0 2160.0
2642.6
2810.01
3079.55
3125.2
3607.8 Mass (m /z)
4090.4
0 4573.0
S. aureus és H. influenzae keverék (0,75+0,25 ul arányban) MALDI-TOF spektruma
Voyager Spec #1=>BC=>SM5[BP = 3012.4, 1229] 3012.99
100
1229.5
90
80
70
% Intensity
60
50
40 2312.49
3050.84 3033.32
30
2332.69 2293.53 20 2243.88 2985.18 2096.90 2132.72 2712.03 10
2370.42 2438.52
2972.80 3191.86
0 1999.0
5387.56
3881.09 3776.17
4365.34
5344.29
5599.4
6259.54
7282.90 7168.77
8375.10
15075.96
9539.35 9199.8
12800.2 Mass (m /z)
16400.6
0 20001.0
Baktériumok gyors, tenyésztés nélküli azonosítása - munkafolyamat
Baktérium spektrumok
Spektrumok reprodukálhatóságvizsgálata
Nem
Igen
Igen
Spektrumazonosítás Matematikai módszerek kidolgozása
Új mintafelviteli módszerek fejlesztése
Baktérium spektrum könyvtárak létrehozása
Dr. Emri Miklós DE OEC PET CENTRUM
Baktériumok gyors, tenyésztés nélküli azonosítása
Baktérium spektrumok
Biológiai minta
Matematikai algoritmus alkalmazása
Baktérium spektrum könyvtár
1 óra
Baktériumok azonosítása
Acanthamoeba vizsgálata könny mintákban
• Kontaktlencse viselők körében előforduló fertőzés • Szemek kivörösödését okozza, kellemetlen érzéssel, könnyezéssel, homályos látással és fényérzékenységgel jár • Maradandó látáskárosodást okoz • Ritka, Debrecenben évente kb. 2 eset
Acanthamoeba azonosítása könnymintákban - munkafolyamat
Egészséges önkéntesekből származó könny
Spektrumok
Acanthamoeba-ra jellemző csúcsok azonosítása Acanthamoeba-val fertőzött betegekből származó könny
Spektrumok
Acanthamoeba tenyészet vizsgálata
Acanthamoeba azonosítása könnymintákban
Emri Zsófia DE OEC PSZL
Dr. Csutak Adrienn Dr. Kettesy Beáta Dr. Goran Petrovski DE OEC Szemklinika
Egészséges könnyminták
Acanthamoeba-val fertőzött könnyminták
MALDI-TOF Dr. Csősz Éva Emri Zsófia DE OEC PSZL Dr. Szabó Judit DE OEC Mikrobiológiai Intézet Acanthamoeba referencia
Szoftver készítése Dr. Emri Miklós DE OEC PET CENTRUM
Műszerpark
MALDI-TOF
PSZL
LC-MS/MS ESI-QTRAP
Kétdimenziós elektroforézis
Bio-Plex
ESI – LC-MS/MS analízis Proxeon Easy nLC-vel kapcsolt 4000 QTRAP LC-MS/MS rendszer
4000 QTRAP (ABSciex) hibrid tripla kvadrupol/ioncsapda tandem tömegspektrométer
• Fehérje azonosítás • Poszt-transzlációs módosítás azonosítása
• Biomarker keresés/validálás • Specifikus módosulatok/fehérjék célzott kimutatása (MRM) • Relatív és abszolút kvantitálás
Ionforrás
Detektor
Elektrospray ionizáció (ESI) szárító gáz (N2) légköri nyomás
minta oldat
MS analizátor
elektrospray kapilláris
• többszörösen töltött nagy feszültség (+)
ionokat eredményez
nagy vákuum
• nagy térfogattartományban (nl-ml) használható • szükség van szárító
nyomás, feszültség és hőmérséklet gradiens
+ + +
+++ ++ + + + + + ++
+++++ ++ + + ++ ++ ++
+
++ + ++ +
++ + ++
+
++ + ++
gázra (nitrogén)
[M + nH]n+
oldószer cseppek további robbanások párolgás szétrobbanása és deszolvatált ionok keletkezése
Az ionok útja a kvadrupólban A kvadrupól elektródáira kapcsolt feszültség segítségével szabályozható, hogy mely ionokat enged át a kvadrupól
Kvadrupól
A kvadrupól szelektíven stabilizál
Detektor
Az ionok útja az ioncsapdában Az ioncsapda stabilizálja minden bejutott ion mozgását és az elektródákra kapcsolt feszültség segítségével szabályozható, hogy mely ionokat destabilizál és enged ki
Detektor
Az ioncsapda szelektíven destabilizál
Bruker/Proxeon Easy nLC II nano HPLC
A top-down és bottom-up proteomikai megközelítések Top-down proteomika
A fehérjéből származó MS/MS spektrumok MS/MS analízis
Bottom-up proteomika
Fehérjék kinyerése
Tripszines emésztés MS/MS analízis
Peptidekből származó MS/MS spektrumok
LC-MS/MS analízis sajátosságai, mintaigény • 300 nl/min áramlási sebesség • Víz/acetonitril gradiens • Oldatban vagy gélben emésztés tripszinnel vagy más enzimmel
• Minták gélben vagy oldatban (acetonos kicsapás) (50 fmól citokróm C – 0,6 ng)
50 fmól (3,3 ng) BSA 1 51 101 151 201 251 301 351 401 451 501 551 601
MKWVTFISLL FSQYLQQCPF VASLRETYGD KADEKKFWGK LLPKIETMRE FVEVTKLVTD CCDKPLLEKS GSFLYEYSRR KHLVDEPQNL RSLGKVGTRC TESLVNRRPC ALVELLKHKP STQTALA
LLFSSAYSRG DEHVKLVNEL MADCCEKQEP YLYEIARRHP KVLASSARQR LTKVHKECCH HCIAEVEKDA HPEYAVSVLL IKQNCDQFEK CTKPESERMP FSALTPDETY KATEEQLKTV
VFRRDTHKSE TEFAKTCVAD ERNECFLSHK YFYAPELLYY LRCASIQKFG GDLLECADDR IPENLPPLTA RLAKEYEATL LGEYGFQNAL CTEDYLSLIL VPKAFDEKLF MENFVAFVDK
IAHRFKDLGE ESHAGCEKSL DDSPDLPKLK ANKYNGVFQE ERALKAWSVA ADLAKYICDN DFAEDKDVCK EECCAKDDPH IVRYTRKVPQ NRLCVLHEKT TFHADICTLP CCAADDKEAC
EHFKGLVLIA HTLFGDELCK PDPNTLCDEF CCQAEDKGAC RLSQKFPKAE QDTISSKLKE NYQEAKDAFL ACYSTVFDKL VSTPTLVEVS PVSEKVTKCC DTEKQIKKQT FAVEGPKLVV
43% lefedettség
• Acetonos kicsapás, emésztés, gélből történő extrakció – veszteség • Keratin probléma !!!
Működési protokoll
Minta
LC-MS/MS analízis
Emésztés
1 nap
2 nap
Adatbázis keresés 1 nap
Minimum 4 nap
Minta + mintalap
Eredmények és értékelés Jelentés
Teljesítési igazolás
Kollaborációs és szolgáltatási kapcsolatok
Biosystem International Kft. Kardiológiai Intézet Orvosi Vegytani Intézet Biofizikai és Sejtbiológiai Intézet Biokémiai és Molekuláris Biológiai Intézet
Műszerpark
MALDI-TOF
PSZL
LC-MS/MS ESI-QTRAP
Kétdimenziós elektroforézis elektroforézis
Bio-Plex
Kétdimenziós elektroforézis Bio-Rad kétdimenziós elektroforézis rendszer
IEF cella 7 cm strip
17 cm strip
Mini-PROTEAN Tetra Cell
PROTEAN II xi XL Cells
24 cm strips
PROTEAN Plus Multi-Casting Chamber
PROTEAN Plus Dodeca Cell
Pharos FX Plus szkenner
Kétdimenziós gélelektroforézis – 2DE
• Hatékony módszer fehérjék elválasztására •Az első dimenzió az izoelektromos fókuszálás – a fehérjék elválasztása a pI alapján • A második dimenzió az SDS-PAGE – a fehérjék elválasztása a méret alapján • Alkalmas teljes proteómok vizsgálatára
• Legjobban sejtkultúrák vizsgálatára használható • Nagyon érzékeny, nagy technikai tudást igénylő módszer • Csak a legtisztább anyagokat lehet használni
Izoelektromos fókuszálás
pH 3
pH 10
• A fehérjék amfoterek, emiatt a töltésük változik a környezetük pH-jától függően • Izoelektromos pont: az a pH értek, amelyen a fehérje nettó töltése nulla • A fehérjék elválasztása a pI alapján történik
Izoelektromos fókuszáló készülék
• A fehérjék vándorolnak az elektromos térben és amint elérik az izoelektromos pontjuknak megfelelő pH értéket elveszítik töltésüket és vándorlásuk megszűnik
méret pI
A gélek festése – a gélben levő fehérjék láthatóvá tétele
SyproRuby festés (1 ng) Coomassie festés (50 ng – 1 g)
pH 3 4%
Fontos szempontok • Érzékenység • Linearitás • Reprodukálhatóság • MS kompatibilitás • Költséghatékonyság • Munkaigény
• Rendelkezésre álló szkenner
18%
pH 10
Ag festés (0,1 ng)
RuBPS – ruténium (II) tris (bathofenantrolin diszulfonát) festés
• Fluoreszcens festési eljárás
• Az érzékenység az SyproRuby festéshez hasonló • Viszonylag egyszerű kivitelezni,
olcsóbb • Teljes mértékben MS kompatibilis • Kiértékeléséhez speciális szkenner
szükséges
A SyproRuby, RuBPS és Coomassie érzékenységének összehasonlítása 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7.
M 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7.
SyproRuby
1,5 mól 0,75 mól 150 pmól 15 pmól 1,5 pmól 150 fmól 15 fmól
BSA
M 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7.
RuBPS
M 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7.
M
Coomassie PageBlue
A különböző proteómok kvalitatív és kvantitatív különbségeinek analízise A Minta
B Minta
2DE
2DE
• Alkalmas a teljes proteóm vizsgálatára • Minőségi és mennyiségi adatot egyaránt szolgáltat Hátrány • A technikai variációk kiküszöbölésére legalább három párhuzamossal kell dolgozni • Munkaigényes és vegyszerigényes
DIGE – differenciál gél elektroforézis H. Influenzae (Kontrol)
Jelölés DIGE festékkel
H. H. Influenzae Influenzae (aktinonin (aktinonin kezelt) kezelt)
Minták összekeverése 2DE
• A minták összekeverésével kiküszöbölhetők az analízisek közti technikai különbségek • Alkalmas a teljes proteóm vizsgálatára • Minőségi és mennyiségi adatot egyaránt szolgáltat Hátrány • Drága E. Csosz és H. Voshol
Nagyhatékonyságú gélanalízis – a különbségek kimutatása
• Progenesis (NonLinear
Dynamics) • Delta2D (Decodon) • PDQuest (BioRad) • DeCyder (GE Healthcare) • Melanie ... • Redfin (BioRad)
A 2D elektroforézis során nyert gélképek összehasonlítása Delta2D szoftverrel
Gélek behívása, csoportosítása
Gélképek egymásravetítése (warping)
Master gél készítés
Expressziós különbségek analízise
Poszt-transzlációs módosítások kimutatására szolgáló festési eljárások
Sypro Ruby Flamingo Minden fehérjét megfest ProQ Diamond Csak a foszfoproteineket festi ProQ Emerald Csak a glikoproteineket festi
Fehérjemennyiség … mihez mennyit?
Javasolt rehidráló oldat- és fehérje mennyiségek
Strip hossza Rehidráló oldat térfogata Fehérje mennyiség ezüst festéshez Fehérje mennyiség Coomassie festéshez
7 cm
11 cm
17 cm
18 cm
24 cm
125 µl
200 µl
330 µl
350 µl
450 µl
5-20 µg
20-50 µg
50-80 µg
50-80 µg
80-150 µg
50-100 µg
100-200 µg
200-400 µg
200-400 µg
400-800 µg
A fehérjék vizsgálata tömegspektrométer segítségével
Fehérjét tartalmazó foltok kivágása
Enzimes (tripszin) emésztés
A sejt lízise 2DE
Fehérjék azonosítása
Tömegspektrometriás analízis
Nutriproteomika - funkcionális élelmiszerek előállítása Dr. Czeglédi Levente Gulyás Gabriella Állattenyésztési Intézet • Se gazdag tej, tojás, hús • Ideális zsírsav-összetételű sertéshús és zsír
Csirkemáj proteóm
Tej proteóm
előállítása
Longevity jelleg proteomikai vizsgálata • 1:1000-2000 „longevity” tehén jelenik meg – tőggyulladás, lábgyulladás stb. betegségek nagyon ritkán fordulnak elő • 100.000 L tej/tehén
• Magyarországon kb. 300 db. • Genetikailag nagyon összetett – Proteomikai megközelítés alkalmazása
Kontroll tehén szérum
Longevity tehén szérum
Proliferatív vitreoretinopátia és a transzglutamináz 2 kapcsolatának vizsgálata 6 éves proliferatív vitreo-retinopátiás gyerek - a PVR-t vitrektómiával eltávolították
Dr. Goran Petrovski Berényi Erika
Őssejtek (neurosphera)
TG2 KD
Kontroll sejtek tápfolyadék TG2 KD sejtek tápfolyadék
Membránfehérjék kétdimenziós gélelektroforézise 2DE or not 2DE …
Plazma membrán
Citoszól
Műszerpark
MALDI-TOF
PSZL
LC-MS/MS ESI-QTRAP
Kétdimenziós elektroforézis
Bio-Plex Bio-Plex
Biomolekulák szimultán analízisére alkalmas, mikrogyöngy alapú multiplex technológián alapuló Bio-Plex rendszer bemutatása
Evolúció, rendszerszemléletű biológia, „omikák”
kémcső
microplate
microarray
Egyszerű assay –
Multiplex assay -
egy paraméter/
Több paraméter
analit per teszt
per teszt
Luminex xMAP-, FMAP-technológia - mikrogyöngy-alapú multiplex tipizálás - „szuszpenziós array” - akár mintánként 100 biomarker kvantitatív meghatározása egyszerre sok mintán - berendezéshez kötött, robusztus platform - kismennyiségű mintaigény, nagy áteresztőképesség - kommersz bead szettek, custom bead fejlesztés
- gyors, költséghatékony, precíz platform
Alkalmazási területek
• Citokinek/kemokinek monitorozása • MMP-expresszió • Transzkripciós faktor analízis • SNP-genotipizálás • miRNS-mérés • Autoimmun diagnosztika • HLA-tipizálás • Allergológia
• Infektológia • Obesitas • Diabétesz
Luminex FMAP mérési elv 1. • A mérés során uniform méretű (5.6 um), polisztirol mikrogyöngyöket használunk szilárd fázisként.
• Minden gyöngypopuláció belsőleg rendelkezik kétféle fluoreszcens festék egyedülálló kombinációjával, azaz egy-egy spektrális régiókóddal (spectral address). Precíz koncentrációkkal 100-féle színű mikrogyöngy-szett teremthető. A kis gyöngyméret megenged: - gyors kinetika
- folyadékban Brown-mozgás
-„szuszpenziós array”
- óriási fajlagos felszín
Luminex FMAP mérési elv 2. • Minden bead felszíne egy a bioesszére specifikus befogó ágenssel van burkolva. Ezek a capture reagensek lehetnek: antigének, antitestek, oligonukleotid primerek, enzim szubsztrátok, receptorok, ligandok; lehetővé téve a rendszer számára unikális gyöngy-populációk azonosítását.
Luminex FMAP mérési elv 3.
• Ezek a különböző bevonatú mikrogyöngy-populációk egyfajta master-mixként vannak összemérve a microplate minden egyes microwell-jében a mintáinkkal, létrehozva ezáltal egy olyan mérőrendszert, mely egyetlen mintából egyszerre képes többféle, multiplex analitikum meghatározására.
Mintaigény: 50 ml
Luminex FMAP mérési elv 4.
•
Így, minden egyes mikrogyöngy-populáció felszínén mint szilárd fázison, végbemegy egy diszkrét bioreakció.
Luminex FMAP mérési elv 5. •
Miután egy-egy mikrogyöngy befogja a megfelelő target markerét, további felszíni rétegként egy fluoreszcens festékkel jelzett riporter rendszert építünk a mikrogyöngyre.
Luminex FMAP mérési elv 6.
•
Következő lépésként a gyorsan áramoltatott mikrogyöngyök átesnek egy kétlézeres gerjesztésen. Az első lézer gerjeszti az internális festékeket, azonosítva az adott mikroszféra-populációt. Egy második lézer gerjeszti a gyöngyfelszíni riporter rendszeren hordozott fluoreszcens festéket.
Luminex FMAP mérési elv 7.
•
Végezetül a nagysebességű digitális jelfeldolgozók azonosítanak minden egyedi mikrogyöngyöt és kvantitálják az ezeken hordozott bioesszé eredményét, mindezt valósidőben megvalósítva
•
1 óra alatt 9600 mérési adat leolvasása
•
Kalibráló görbeillesztéssel kvantitált eredmények
ELISA vs. xMAP
IL-6 Correlation
y = 0.8827x + 0.0808 R2 = 0.9584
140 120
80 60 40 20 0 0
50
100
IL-4 Rec CQkit Correlation y = 1,16x + 12,389 Cell Culture R2 = 0,9827
150
FMAP 1400 1200 1000
QKit
QKIT
100
800 600 400 200 0 0
200
400
600 FMAP
800
1000
1200
Hagyományos ELISA és a Bio-Plex összehasonlítása
ELISA
Bio-Plex
Citokinek száma
18
18
Minták száma
80
80
Összes adat pont
1440
1440
96--lyukú lemezek száma 96
18
1
Adat pontok száma lemezenként
80
1440
Mérési idő (hr)
60
3
Minta térfogat (μ (μl)
900
12 (plazma) 50 (sejtkultúra)
Bio-Plex rendszer
Bio-Plex citokin assays • humán, egér, vagy patkány citokinek • sejt kultúra felülúszók, szérum, vagy plazma • single, vagy multiplex • gyári, vagy kívánság szerint öszeállított (x-Plex) panelek • jelenleg 27+21 humán, 21+9 egér, vagy 9 patkány citokin
Bio-Plex diagnosztikus panelek
Bio-Plex®Precision Pro™ Human Cytokine Assays Bio-Plex Pro™ Human Isotyping Assays New! Bio-Plex Pro™ Human Diabetes10-Plex Assays New! Bio-Plex Pro™ Mouse Diabetes 8-Plex Assays Bio-Plex Pro™ Human Acute Phase Assays Bio-Plex Pro™ Human Angiogenesis Assays
Bio-Plex humán citokin panel
RnD system * Human Cytokine Panel A * Human Cytokine Panel B * Mouse Cytokine Panel * Rat Cytokine Panel * Human MMP Panel
* Human Obesity Panel * Human Adhesion Molecule Panel * Human Angiogenesis Panel A * Human Inflammation 12-Plex Kit * Human TGF-beta 3-Plex Kit * Human TIMP 4-Plex Kit
* Primate 11-Plex Kit
R&D System humán citokin panel A
MILLIPLEX MAP
Millipore citokin és diagnosztikus panelek
* Cytokines/Chemokines
* Cell Signaling / EpiQuant * Neuroscience * Bone Metabolism * Specialty Panels
* Isotyping * Cancer Biomarker * Endocrine * Gut Hormone
* Cardiovascular Disease * Toxicity * Metabolic
MILLIPLEX MAG * Cytokines/Chemokines Magnetic Bead * Endocrine Magnetic Bead * Metabolic Magnetic Bead * Canine Gut Hormone Magnetic Bead * Toxicity Magnetic Bead
Általános proteomikai munkafolyamat
Minta előkészítés
Fehérje szeparálás
Fehérjék emésztése
MS mérés
Peptidek elválasztása
Peptid tömegtérkép
Peptid szekvencia Adatbázis keresés
Azonosított fehérje
Kollaborációk
COST Farm Animal Proteomics
DERMINOVA
FA Action FA1002
Állattenyésztéstudományi Intézet
PET Centrum
PSZL Orvosi Mikrobiológiai Intézet
Szemklinika Biofizikai és Sejtbiológiai Intézet
Biokémiai és Molekuláris Biológiai Intézet
Kardiológiai Intézet
Köszönetnyilvánítás
Dr. Szabó Judit – Orvosi Mikrobiológiai Intézet
Prof. Dr. Fésüs László
Dr. Emri Miklós – PET Centrum
Prof. Dr. Tőzsér József
Dr. Csutak Adrienn – Szemklinika
Kulcsár Andrea
Dr. Goran Petrovski – Szemklinika
Lábiscsák Péter
Dr. Czeglédi Levente –
Emri Zsófia
Állattenyésztéstudományi Intézet
Hevele Ildikó
Köszönöm a figyelmet!
Dr. Zahuczky Gábor Góczi Noémi
