A proteomikai módszerek fejlõdési irányai
Janáky Tamás Orvosi Vegytani Intézet, Szegedi Tudományegyetem
360 Degree CEO Perspective Of The Global Healthcare Industry
© 2008 Frost & Sullivan. All rights reserved. This document contains highly confidential information and is the sole property of Frost & Sullivan. No part of it may be circulated, quoted, copied or otherwise reproduced without the written approval of Frost & Sullivan
Top 10 Global Healthcare Trends 2007 – 2020 High Impact
Projected Impact on the Healthcare Industry
Low Impact Low
Certainty
High
Information based medicine A betegségek molekuláris szintû pathomechanizmusának és az egyéni fehérjeprofilnak ismeretében
• molekuláris szintû diagnózis • racionális terápia tervezése • „personalized medicine”
right drug at the right dose for the right disease to the right patient
U.S. Balanced National Biomedical Research Portfolio, FY2008
Clinical Research
Translational Research
Basic Research
NIH – $29 B
Clinical Research
Translational Research Basic Research
Private Sector – $59 B
Gyógyszermolekulák célpontjai túlnyomó többségükben fehérjék
Quelle: Hopkins & Groom, Nat.Rev.Drug.Disc. 1 (2002) 727
Biológiai információ-áramlás Bioinformatika Adat
Adat
Adat
Genomika
Transcriptomika
Proteomika
Gének
mRNS
Fehérjék
Adat
Metabolomika Metabolitok
Rendszerbiológia A genomika, proteomika és metabolomika eredményeinek átfogó értelmezése.
Miért lenne jó ismerni a fehérjéket?
• biológiai útvonalak, hálózatok, jelátviteli mechanizmusok felderítése, megértése
• betegségek pathomechanizmusának jobb megértése
• fehérje biomarkerek felfedezése • új gyógyszer-célpontok felfedezése • fehérjealapú terápiás szerek felfedezése és elõállítása
Proteomika Strukturális proteomika: a proteom fehérjéinek kvalitatív analízise (3D szerkezetének meghatározása) Expressziós proteomika: (különbségi) Külsõ, v. belsõ tényezõk hatására bekövetkezõ fehérjeexpresszió változásainak minõségi és mennyiségi meghatározása Funkcionális proteomika: a fehérjék sejtbeni lokalizációjának, poszt-transzlációs módosításainak, fehérje-fehérje kölcsönhatásoknak és funkcióinak meghatározása
Az expressziós proteomikában alkalmazott technológiák
Elválasztástechnika
Tömegspektrometria
Bioinformatika
Milyen nehézségekkel találkozunk a proteomikai vizsgálatoknál? Fehérjék nagy száma: 100-500.000 sejtekben: 10-30.000 plazmában: 50-100.000
Óriási kihívás az Fehérjék nagysága: 50 – 100,000 aminósav elválasztástechnika 5,000-1,000,000 Da ésszéles a határok Relatív elõfordulás: ~ 10-1,000,000 molekula / sejt mennyiségi meghatározás elõtt Fehérjék koncentrációtartománya: sejtekben: 10 –2 – 10 –6 M testfolyadékokban : 10 –2 –10 –12 M
Sample preparation
• Sample collection (i.e. Laser capture microdissection) • Homogenation and protein isolation • Contaminant removal/ cleanup • Fractionation
Humán plazma fehérjeösszetétele Fibronectin 0.42%
a1-Antitrypsin 3.83% a2-Macroglobulin 3.64%
Immunoglobulin G 16.61%
Prealbumin (thyroxine-binding) 0.32%
Immunoglobulin A Complement C4 3.45% 0.45% Transferrin Ceruloplasmin 3.32% 0.48% Haploglobin Gc-Globulin 2.94% 0.48% Immunoglobulin M 1.98% a-trypsin inhibitor 0.58%
10%
Other a1-Antichymotrypsin 0.58% 9.91%
C1 Esterase inhibitor 0.32% a1B0.29% Glycoprotein b2-Glycoprotein I 0.29% b2-Glycoprotein II 0.27% Complement C1 0.22%
1%
maradék
a2HS-Glycoprotein 0.80% a1-Acid glycoprotein 1.25%
Albumin 54.31%
Hemopexin 1.05%
Complement C3 1.12%
Fehérjék koncentrációtartománya: 1 to –10-12M Klinikailag informatív fehérjék mennyisége 10 nagyságrendben változhat!
Multiple Affinity Removal Column
Absorbance (mAU)
High-Abundant Proteins Low-Abundant Proteins
2500 2000
Elution Buffer
1500
Equilibration Buffer
1000
Inj
500 0
0
2
4
6
8
10 12 Retention Time (min)
14
16
18
20
ProteoMiner (Bio-Rad)
IMAC (Immobilized Metal ion Affinity Chromatography)
O
O N
O Fe3+
O
P O
O OH2
His tartalmú fehérjék
OH
Foszfopeptidek
OR
Preparatív izoelektromos fókuszálás pH gradiens vízoldható amfolitokkal
3 g fehérjéig
OFFGEL elektroforézis
Fehérjék azonosítási lehetõségei
Elválasztástechnikai módszerek • Elektroforézis
izoelektromos fókuszálás poliakrilamid elektroforézis 2D elektroforézis kromatofókuszálás
• Kromatográfia 1D 2D Multi D
Applications for Gel-based Proteomics Establishing
reference maps
• Organellar fractions • Total soluble fraction Qualitative
differences
• Comparison of genotypes
Total soluble Protein
• Comparison of different organelles • Biomarker discovery Quantitative
differences
• Response to drugs • Changes during development • Response to stimulation
Secreted Protein
A 2D ELEKTROFORÉZIS KORLÁTAI PROBLÉMA
MEGOLDÁS
• felbontás nem elég jó
•IEF szûkebb pH tartományban
•„low-abundant” fehérjék
•szelektív dúsítás, v.
(1-106 dinamikus tartomány
elõfrakcionálás
• membránfehérjék (oldhatóság!)
•új detergensek
• bázikus fehérjék
•új IPG gélek
• detektálás
•(izotóp), új festékek
2D Fluoreszcens Differenciál Gél Elektroforézis (2D-DIGE)
Kromatográfiás technikák peptidek, fehérjék analíziséhez
Gélszûrés
Hidrofób kölcsönhatás
Ioncserés
Fordított fázisú
Affinitási
Multidimenzionális elválasztások
ProteomeLab PF2D Chromatofocusing column Gradient pump Isocratic pump pH monitor
UV monitor
Column oven
UV monitor
96 well fxn collector/ autosampler
Reverse Phase Non Porous Silica column
Kromatográfia
nanoHPLC nanoUPLC Oszlop: 75 μm Áramlási sebesség: 200 nl/perc
HPLC-Chip/MS Fluid connections
Microfluidics
Top view
Stator
6 port rotary valve Rotor
Side View
Waste
Nanoelectrospray tip Sample in Sample enrichment column
Nano LC Pump
Top View
LC Column
Waters Trizaic nanoTile
Tömegspektrometriás ionizációs módszerek
• ESI (electrospray ionization) • MALDI (matrix assisted laser desorption/ionization)
Tandem tömegspektrométerek a proteomikában
• Kvadrupól-kvadrupól (QQQ) • Kvadrupól-ioncsapda (QIT) • Kvadrupól-TOF (QTOF) • TOF-TOF • Ioncsapda-TOF • Ioncsapda-Orbitrap • Ioncsapda-FTICR
Main demands for mass spectrometers
• • • • • • •
Accuracy (ppm-ppb) Sensitivity (fmol-amol) Speed (20 spectra/sec) Quantitative Wide-linearity Wide dynamic range ...
Tömegmérés pontossága (Mass Accuracy) •Növekedésével egyre javul a fehérjeazonosítás megbízhatósága •Lehetõség nyílik izobár peptidek azonosítása, polimorfizmus, poszttranszlációs módosítások, stb. pontos meghatározására
Kvantitatív fehérjeprofil meghatározása peptidek kvantitálása
Label-free quantitation
fehérjék kvantitálása
Targeted, Hypothesis-Driven Mass Spectrometry
Multiple Reaction Monitoring (MRM) on QQQ v. QTRAP tömegspektrométeren
Thermo Scientific LTQ Velos Dual-Pressure Linear Ion Trap
Thermo Scientific Orbitrap Velos
SYNAPT™ G2 from Waters •Over 40,000 FWHM resolution • Linear dynamic range of up to 105 • Exact mass (1 ppm RMS) • Class-leading sensitivity • 20 spectra/sec
Waters XevoTM QTof, QQQ MS
Agilent 6540 Ultra-High-Definition (UHD) Accurate Mass Q-TOF far the highest-performing benchtop Q-TOF on the market
Agilent 6430 Triple Quadrupole LC/MS
maXis™ QTOF MS Speed, accuracy and sensitivity
Fast chromatography applications Small molecule ID Trace analysis studies Metabolomics Quantitative proteomics
AB SCIEX QTRAP® 5500
4800 MALDI TOF/TOF™ Analyzer
Tömegspektrométerek kiválasztása
Megfelelõ tömegspektrométert a megfelelõ célra!
A bioinformatika jövõje
• A biológiai rendszerekrõl nyert adatok olyan rendszerezése, amely lehetõvé teszi a már meglévõ információk széleskörû elérését, ill. új információk beépítését.
• Olyan új eszközök (algoritmusok) kifejlesztését, amelyek segítik a biológiai adatok analízisét.
• A rendelkezésre álló adatok olyan globális analízise, mely lehetõvé teszi közös elvek érvényesülésének felderítését különbözõ rendszerekben, ill. új összefüggések megvilágítását.
Identification of Protein-Protein Interaction ¾ Yeast two-hybrid system ¾ Immunoassay ¾ Protein chip ¾ Biosensor system ¾ Molecular image ¾ Tandem affinity purification (TAP) and mass spectrometry (MS)
Adatbázisok a fehérje-fehérje kölcsönhatásokról Interactions
Databases
Protein Chip (microarray) • Antibody Chip Detect Ag-Ab interactions
• Protein Chip Protein:protein Protein:drug Enzyme:substrate
• Ligand Chip • And more….
Jövõ 10 -6 M 10 -9 M 10 -12 M 10 -15 M 10 -18 M 10 -21 M
Összefoglalás 1/ A proteomika eredményes mûveléséhez az elválasztástechnika, a tömegspektrometriás fehérjeazonosítás és a bioinformatika szoros együttmûködésére van szükség. 2/ Ideális az a megoldás, ha a proteomikai szakember már a kísérlet megtervezésétõl részt vesz a kutatási feladat megoldásában. 3/ Versenyképes csak olyan 6-10 tagú csoportok lehetnek a proteomika területén, amelyeknek rendelkezésére áll a teljes mûszeres háttér és a fenti 3 terület szaktudása. 4/ A proteomika egyre inkább egy adott szemléletmódot is jelent, az egymással komplex kapcsolatban (hálózatban) álló fehérjék mûködésének megértését. 5/ Van már Magyarországon egy olyan proteomikai centrum (DNT-Kromat Kft., MTA-SzBK, ELTE), amelyik sikeresen mûködik, elsõsorban a neuroproteomika területén.
