Diagnostické metody v lékařské mikrobiologii Výuková prezentace z:
Lékařské mikrobiologie Jan Smíšek © ÚLM 3. LF UK 2009
Princip identifikace • Soubor znaků s rozdílnou diskriminační hodnotou • Základní problémy – Minimum morfologických znaků – Podobné antigeny – Genomová nestabilita – mutace, plasmidy
Principy diagnostiky • Přímá diagnostika – Přímý průkaz přítomnosti mikroba (kultivace) nebo jeho částí (antigen, DNA)
• Nepřímá diagnostika – Průkaz specifické imunitní reakce proti mikrobovi (specifické protilátky) • VÍCE VIZ. VÝUKOVÉ CD
Odběr materiálu • Přímé diagnostické metody – Odběr z postiženého orgánového systému – ideálně pouze málo invazivní (stěr z tonsil, sputum, krev, moč, mozkomíšní mok)
• Nepřímé diagnostické metody – Průkaz protilátek v séru, vzácněji např. v mozkomíšním moku • VÍCE VIZ. VÝUKOVÉ CD A PREZENTACE ODBĚR
Přímá diagnostika • Klasické metody přímé diagnostiky – Mikroskopické vyšetření – Kultivační vyšetření
• Pokročilé metody přímé diagnostiky – Specifické testy – Biochemické testy – Detekce antigenu – Citlivost k ATB
• Moderní metody přímé diagnostiky – Detekce DNA
Klasická přímá diagnostika • Světelná mikroskopie – Nativní (nefixované a nebarvené preparáty) pozorované fázovým kontrastem nebo v zástinu – slouží jen k popisu základní morfologie – Fixované a barvené preparáty • Rozdělení podle vlastností buněčné stěny – Gramovo barvení (Gram pozitivní a negativní) – Ziehl-Neelsenovo barvení (Acidorezistentní)
Klasická přímá diagnostika
VÍCE VIZ. VÝUKOVÉ CD A PREZENTACE BAKTERIE A MIKROSKOPIE
Klasická přímá diagnostika • Kultivace na kultivačních půdách – Obecné kultivační půdy – roste na nich většina mikrobů – Selektivní kultivační půdy – jsou vhodné pro růst konkrétního skupiny nebo druhu – Diagnostické kultivační půdy – lze jimi prokázat určitou vlastnost mikroba (zkvašování cukru) – Speciální kultivační půdy – vhodné k růstu náročných druhů, které nelze běžně kultivovat – Na pevných půdách (agarech) hodnotíme morfologii kolonií, na tekutých (bujónech) typ růstu
Klasická přímá diagnostika
VÍCE VIZ. VÝUKOVÉ CD A PREZENTACE KULTIVACE
Klasická přímá diagnostika • Mikroskopické a kultivační vyšetření – Výhody • Snadné • Levné • Není náročné na technické vybavení
– Nevýhody • Vyžaduje interpretaci zkušeným pracovníkem
Pokročilá přímá diagnostika • Specifické testy – Po interpretaci výsledků mikroskopického a kultivačního vyšetření – Odliší od sebe příbuzné a vzájemně podobné mikroby – Jsou založeny na specifických chemických vlastnostech či kultivačních podmínkách • Chemické vlastnosti – průkaz oxidázy, katalázy • Kultivační vlastnosti – CAMP, satelitismus, rozpustnost ve žlučových solích
Pokročilá přímá diagnostika
VÍCE VIZ. VÝUKOVÉ CD
Pokročilá přímá diagnostika • Biochemické testy – Jsou založeny na schopnosti bakterií metabolizovat různé substráty (cukry, aminokyseliny aj.) – Většina bakterií umí zpracovat pouze konkrétní substráty Æ kombinace substrátů typická pro bakterii Æ biochemický profil – Komerčně vyráběné testové sady s diagnostickými půdami pro určité skupiny bakterií • Enterobakterie – fermentující Gram neg. tyčky • Nefermentující Gram neg. Tyčky
– Pro snazší hodnocení Æ zpracování substrátu Æ změna barvy diagnostické půdy
Pokročilá přímá diagnostika
Biochemické vlastnosti bakterií čeledi Enterobacteriacae (tzv. „Krátká pestrá řada“) indol +
laktóza -
+
-
sacharóza
manitol
+
+
-
glukóza -
+
ureáza +
-
+
Simons -
+
SIM -
+
-
plyn
Pozn . 1
Test na produkci indolu - Kovácsovo činidlo (podobné Ehrlichovu činidlu); test je pozitivní při přítomnosti červené vrstvičky na hladině
2 4
Test štěpení (utilizace) laktózy, sacharózy a manitolu - indikátorem je bromthymolová modř
5
Test štěpení glukózy - ve Wassermanově zkumavce (je široká), v ní menší zkumavka - tzv. „plynovka“ - pokud je v ní bublina vzduchu, znamená to, že bakterie štěpí glukózu za vzniku plynu
6
Test na produkci ureázy (tzn. schopnost štěpit močovinu) - zkumavka s šikmo nalitým agarem obsahujícím močovinou, indikátorem změny pH je fenolová červeň
7
Amoniumcitrát (Simons)
8
SIM agar - pokud je zákal jen kolem vpichu, bakterie je nepohyblivá (nebo byla její pohyblivost nějakým způsobem ovlivněna); pokud je zákal v celém objemu agaru, bakterie je pohyblivá (např. Proteus mirabilis, Proteus vulgaris, etc.); dále se na tomto agaru testuje produkce sirovodíku - ten zde tvoří černé sraženiny
VÍCE VIZ. VÝUKOVÉ CD
HS
Pokročilá přímá diagnostika • Výsledky se hodnotí podle matice a zaznamenají např. do hodnotícího programu v PC
Pokročilá přímá diagnostika • Program vyhodnotí pravděpodobnost shody s typovými biochemickými profily konkrétních druhů
Pokročilá přímá diagnostika • Detekce antigenu – Přímý průkaz antigenu v biologickém materiálu – průkaz infekce konkrétním druhem • Aglutinací (latexová aglutinace) • Imunofluorescenčně • ELISA
– Průkaz antigenu v čisté kultuře – identifikace konkrétního kmene • Používají se diagnostická séra Æ sérotypizace (zpětná aglutinace)
Pokročilá přímá diagnostika
VÍCE VIZ. VÝUKOVÉ CD
Pokročilá přímá diagnostika • Určení citlivosti k antibiotikům – Velký terapeutický význam – Určení citlivosti / rezistence konkrétního kmene – Disková difúzní metoda – nejčastější, disky napuštěné ATB – měří se velikost inhibičních zón – E test – proužek s klesající koncentrací ATB, drahé !!! – MIC (Minimální Inhibiční Koncentrace) – bujón s klesající koncentrací ATB – nejnižší koncentrace při níž bakterie nevyroste = MIC
Pokročilá přímá diagnostika
VÍCE VIZ. VÝUKOVÉ CD A PREZENTACE ATB
Moderní přímá diagnostika • Detekce DNA mikroba – Hybridizační metody • Průkaz navázáním značených genových sond na specifické úseky DNA nebo RNA
– Amplifikační metody • Průkaz pomnožením specifických úseků DNA • Polymerázová řetězová reakce (PCR)
• VÍCE VIZ. VÝUKOVÉ CD
Nepřímá diagnostika • Založena na průkazu specifických protilátek hostitele proti mikrobovi • Klasické metody nepřímé diagnostiky – KFR, Přímá aglutinace, Hemaglutinace
• Moderní metody nepřímé diagnostiky – ELISA, Western blot
• VÍCE VIZ. VÝUKOVÉ CD A PREZENTACE SEROLOGIE
Diagnostický postup • Lokalizovaná infekce (pneumonie) – Odběr lokálního materiálu (sputum) – Mikroskopie (morfologie, Gram, ZiehlNeelsen) – Kultivace (krevní agar, McConkeyho agar, Sabouraudův agar) – Diagnostický test dle výsledků mikroskopie a kultivace • CAMP, satelitismus, enterotest atd.
– Určení citlivosti k ATB Æ terapeutické doporučení
Diagnostický postup • Závažná specifická infekce (meningitida) – Odběr lokálního materiálu (likvor) i krve – Rychlý průkaz antigenů v likvoru (latexová aglutinace) – Mikroskopie a kultivace likvoru – Hemokultura (kultivace krve) – Při průkazu bakteriálního původce vyšetření citlivosti k ATB – Jinak průkaz protilátek (spirochety a viry) a DNA (viry)
