Hiv-1 virale-loadbepalingen: problemen en ontwikkelingen

O v e r z i c h t s a r t i k e l e n

Hiv-1 virale-loadbepalingen: problemen en ontwikkelingen HIV-1 viral load measurement: problems and developments Auteurs

A.M. Pettersson en W. Kortmann

Trefwoorden

hiv, real-time PCR, testontwikkeling, virale ‘load’

Key words

HIV, real-time PCR, test development, viral load

Samenvatting

Voor het monitoren van hiv-patiënten worden naast het meten van de concentratie CD4+ positieve T-lymfocyten routinematig virale-loadbepalingen uitgevoerd in plasma. Virale-loadbepalingen zijn belangrijk om het effect van behandeling te meten. Bij een toename van de virale load moet resistentievorming tegen antivirale middelen worden overwogen. Daarom is het ook essentieel dat de tests alle hiv-varianten goed kunnen kwantificeren. Omdat het virus snel muteert, is het van belang dat zowel artsen-microbiologen als behandelende artsen alert zijn bij een onverwacht lage ‘load’ (bij een nieuwe patiënt) en zich realiseren dat dit aan de test zou kunnen liggen. Dit wordt hieronder geïllustreerd aan de hand van een typische casus uit de praktijk. Verder worden de recente testontwikkelingen besproken.

Summary

Viral load measurement in plasma is an important tool in the follow-up of HIV patients, in addition to measurement of the concentration of CD4 + T lymphocytes. Viral load quantification is important to monitor the effect of treatment, and a rise in load can suggest resistance against antiviral agents. Therefore, the tests should be able to quantify all HIV variants. Because the virus is able to mutate with a high rate, it is important that both medical microbiologists and treating physicians are alert when an unexpected low viral load is seen (in a new patient). They should realize that this could be due to the type of test used. This fact will be illustrated with a patient case. Furthermore, recent test developments are discussed.

(Tijdschr Infect 2010;5:167-71)

Inleiding

Na het ontdekken van hiv-1 als veroorzaker van aids in 1983 werd het wenselijk om diagnostiek uit te kunnen voeren bij patiënten.1 Behalve serologische assays om antistoffen aan te tonen en besmetting vast te stellen, was er snel behoefte aan tests die het ziekteproces konden monitoren. De eerste tests die het virus direct aantoonden, waren antigeentests die het matrixeiwit p24 detecteerden.2 Deze tests gaven een indruk van het ziekteproces, maar hadden een relatief lage sensitiviteit.3 Intussen was de PCR als moleculaire techniek gemeengoed geworden en kon ook hier toegepast worden. De allereerste PCR-test was een test die proviraal DNA uit mononucleaire

t i j d s c h r i f t

v o o r

i n f e c t i e z i e k t e n

perifere bloedcellen kon amplificeren.4 Dit was een kwalitatieve test, waarbij het mogelijk was om binnen 3 dagen resultaten te krijgen, terwijl een routinekweek van het virus 3-4 weken in beslag nam. Al snel werd er een ‘reverse transcriptase’ (RT)-stap toegevoegd, waardoor het mogelijk was om hivRNA te detecteren met RT-PCR.5 Toen bekend werd dat het virus ook aanwezig was in plasma en hieruit gekweekt kon worden, hebben Holodniy et al. de eerste kwantitatieve hiv-1-RNA virale-loadtest ontwikkeld, gebaseerd op RT-PCR.6,7 Deze test meet de hoeveelheid virale RNA-kopieën in plasma van patiënten. Zij concludeerden dat de ‘load’ afhankelijk was van de fase van de ziekte. De hoog-

vol.

5

nr.

5 - 2010

167


ste ‘loads’ werden immers gevonden bij patiënten met aids en de laagste bij asymptomatische patiënten. Hiermee werd de virale ‘load’, samen met de concentratie CD4+ T-lymfocyten in het bloed, een belangrijke prognostische factor voor het risico van het ontwikkelen van aids en het risico om hieraan te overlijden.8 Verschillende onderzoeken lieten ook het effect van de therapie zien op de hoeveelheid virus in plasma of serum.9,10 De mogelijkheid om het effect van de therapie en therapiefalen te monitoren was een feit. Hierdoor werd het ook mogelijk om de kinetiek van de hiv-replicatie te schatten en werd het duidelijk dat de replicatiesnelheid zeer hoog is.11 Tevens werd het mogelijk om het effect van resistentieontwikkeling te volgen, omdat resistentie gepaard gaat met een stijging van de virale load.12 Vandaag de dag zijn virale load- en resistentiemetingen routinematig in gebruik om de behandeling van hiv-patiënten te monitoren. In Nederland wordt bij patiënten die nog niet met combinatie antiretrovirale therapie (cART) gestart zijn het absolute aantal CD4+ T-lymfocyten en de virale ‘load’ gecontroleerd. In het algemeen wordt therapie gestart als het absolute aantal CD4+ T-lymfocyten 350-500/µl bedraagt. Vervolgens wordt het effect van de therapie regelmatig gecontroleerd. Een stijging van de virale ‘load’ kan wijzen op therapieontrouw, resistentieontwikkeling of suboptimale therapie door andere oorzaken. Het is van belang dat dit snel wordt gesignaleerd in verband met het wel of niet switchen van therapie. Daarom is het essentieel dat er wordt gekozen voor een goede en betrouwbare virale-loadtest. In dit artikel worden de problemen van de huidige tests geïllustreerd aan de hand van een casus. Ten slotte worden de nieuwe ontwikkelingen op de markt besproken.

Casus

Een 38-jarige man, geboren in Suriname, werd in februari 2008 opgenomen met een pneumokokkenpneumonie. Hij reageerde goed op de ingestelde antibiotische therapie. Bij het lichamelijk onderzoek bij opname werd tevens een wit beslag in de mond gezien, wat zeer suspect is voor candidiasis. Aangezien de anamnese negatief was voor het gebruik van steroïden en/of antibiotica werd er gedacht aan een verlaagd absoluut aantal CD4+ T-lymfocyten als oorzaak van de orofaryngeale candidiasis. De hiv-1-test bleek positief te zijn. De gemeten virale ‘load’ eind februari was 430 kopieën/ml. Nadien werd er nog driemaal een absoluut aantal CD4+ Tlymfocyten gemeten; deze waren tussen de 150 en

168

vol.

5

nr.

5 - 2 0 10

210/µl. Aangezien bij deze lage CD4+ T-lymfocyten een veel hogere virale ‘load’ werd verwacht, is ook plasma opgestuurd naar een centrum waar een andere virale-loadtest werd gebruikt. Het vermoeden bestond dat de test die gebruikt was de virale ‘load’ niet goed kon meten. In het andere centrum bleek de uitslag van de virale ‘load’ 39.500 kopieën/ml, terwijl in hetzelfde monster met de eerder gebruikte test een virale ‘load’ van 155 kopieën/ml werd gemeten. De patiënt is inmiddels gestart met cART en heeft al meer dan een jaar een ondetecteerbare virale ‘load’ (voortaan gemeten in het andere centrum) en een absoluut aantal CD4+ T-lymfocyten >500/ µl.

Problemen met virale-loadtests

Virale-loadtests meten alle de hoeveelheid hiv1-RNA in het plasma, al dan niet via een amplificatiestap. De amplificatie gebeurt met hulp van kleine stukjes DNA die een specifieke sequentie herkennen, de ‘target’. De replicatie van het virus zelf in vivo gaat via een RT-stap, waarin het virus een DNA-kopie maakt van zijn RNA-genoom. Het enzym maakt veel transcriptiefouten. Dit resulteert in een hoge mutatiesnelheid; 3,4 x 10-5 mutaties per basepaar per replicatiecyclus, waardoor er verschillende varianten ontstaan.13 Op deze manier zijn er verschillende subtypes van hiv-1 ontstaan, en zijn deze subtypes ook constant aan veranderingen onderhevig. Verder kunnen patiënten besmet raken met 2 verschillende types, die met elkaar kunnen recombineren. Hierbij ontstaan recombinante vormen (‘circulating recombinant forms’ (CRF’s) en ‘unique recombinant forms’ (URF’s)).14 Men gaat ervan uit dat het hiv-1-virus is overgedragen op de mens vanuit chimpansees (groepen M en N) en gorilla’s (groep O).15,16 Groep M heeft zich overal in de wereld verspreid, en heeft zich verder ontwikkeld in subtypes A tot en met K en CRF’s. De genetische variatie binnen een subtype is 15-20%, en tussen subtypes 25-35%.17 Subtype B is het meest voorkomende subtype in Europa en Amerika, maar zorgt wereldwijd voor maar 10% van de besmettingen.18 Wereldwijd komt subtype C het meest voor, namelijk 50%. Virale-loadtests werden in eerste instantie ontwikkeld voor de Europese en Noord-Amerikaanse markt, met als doel om vooral subtype B te kunnen detecteren. Er zijn verschillende commerciële virale-loadassays op de markt, met een detectielimiet van 40-50 kopieën/ml. De Roche Cobas® TaqMan® HIV-1-test en de Abbott RealTime HIV-1-assay zijn allebei gebaseerd op RT real-time PCR. Real-time


v o o r


Tabel 1. Overzicht van virale-loadtests (laatste versies). Naam test

Principe test

Fabrikant

Target gen

Detectielimiet Bron

real-time PCR Cobas TaqMan® HIV-1 (v. 2.0)

Roche gag, LTR Molecular Diagnostics

20 kopieën/ml

RealTime HIV-1

real-time PCR

Abbott Molecular

40 kopieën/ml Productinformatie op website http://www.abbottmolecular.com

VERSANT® HIV-1 RNA 1.0 (kPCR)

real-time PCR

Siemens pol Healthcare Diagnostics

35 kopieën/ml

referentie 29

NucliSENS EasyQ® (v. 2.0)

NASBA gecom- BioMérieux gag bineerd met Clinical real-time PCR Diagnostics

10 kopieën/ml

Productinformatie op website http://www.biomerieux-diagnostics.com

®

pol

Productinformatie op website http://molecular.roche.com/diagnostics

NASBA=‘nucleic acid sequence-based amplification’, LTR=‘long terminal repeat’.

PCR is meer geschikt voor kwantitatieve bepalingen dan de klassieke PCR van de eerste generatie tests. De bioMérieux NucliSENS EasyQ® HIV-1-test maakt gebruik van amplificatie met de ‘nucleic acid sequence-based amplification’ (NASBA)-techniek, in combinatie met real-timedetectie. De Siemens VERSANT® HIV-1 (bDNA)-test is een techniek die gebaseerd is op signaalamplificatie (voor de detectie van het RNA worden vertakte DNA-probes met meerdere labels gebruikt waardoor het detectiesignaal wordt geamplificeerd) in plaats van nucleïnezuuramplificatie. Deze 4 tests worden gebruikt in verschillende laboratoria in Nederland. De tests zijn uitgebreid gevalideerd met grote panels patiëntenmonsters uit verschillende landen en zijn goed bevonden.19,20-22 Toch verschijnen er regelmatig rapporten in de literatuur over onderkwantificatie van vooral niet-subtype B-stammen.23-25 Deze onderkwantificatie is een gevolg van mutaties in de targetsite van de test. Behandelende artsen moeten dus alert zijn als zij patiënten zien waarbij een discrepantie bestaat tussen het absolute aantal CD4+ Tlymfocyten (bijvoorbeeld dalend) en de virale ‘load’ (bijvoorbeeld persisterend laag). Dit geldt vooral voor patiënten die besmet zijn met stammen van een ander subtype dan B. Bij verdenking van onderkwantificatie moet het patiëntenmonster getest worden met een andere assay. De bovengenoemde casus van de patiënt die was besmet met subtype C, is een voorbeeld hiervan. De Cobas® TaqMan® HIV1-test kwantificeerde het monster als 155 kopieën/ ml, en de Abbott RealTime HIV-1-assay als 39.500 kopieën/ml. De reden van onderkwantificatie was de aanwezigheid van ‘mismatches’ in de target van de Cobas® TaqMan®-test (sequencing uitgevoerd door Roche Diagnostics, Almere, Nederland).


v o o r


Nieuwe ontwikkelingen

Bedrijven zijn zich bewust van de problemen door onderkwantificatie, en zijn ook bereid om monsters van klanten te sequencen om achter de oorzaak van de onderkwantificatie te komen. Zij gebruiken de data voor verbetering van hun tests. Bedrijven als Abbott en Roche hebben wereldwijde surveillanceprogramma’s voor het sequencen van grote aantallen stammen uit de gehele wereld. In de westerse wereld worden ook steeds meer verschillende subtypes gezien, onder andere wegens immigratie uit Afrika, Zuid-Amerika en Azië en wegens reizen naar verre landen.26 Dat betekent dat de testontwikkeling zich richt op alle subtypes. Er komen regelmatig updates van bestaande tests (zie Tabel 1). Zo heeft Roche in 2009 een update van de Cobas® TaqMan® HIV-1 (versie 2.0) op de Europese markt gebracht, die verschillende subtypes beter detecteert, ook de groepen N en O. Verder is de test gevoeliger dan versie 1.0.27 Onderzoek naar plasma van bovengenoemde casus liet zien dat de test het virus nu goed kan kwantificeren. De nieuwe Siemens VERSANT® HIV-1 RNA (kPCR)-assay is thans gebaseerd op RT real-time PCR en niet op signaalamplificatie.28,29 Hierdoor zijn nu bijna alle commerciële tests RT real-time PCR-assays geworden. Verder heeft BioMérieux recentelijk een nieuwe versie van de NucliSENS EasyQ®-test (versie 2.0) gelanceerd.30 Er zijn nog geen publicaties over de prestaties van deze test ten opzichte van andere tests. Bij het in gebruik nemen van een nieuwe test is het belangrijk dat het laboratorium een validatie uitvoert, waarbij de oude test met de nieuwe wordt vergeleken. Dit dient niet alleen te gebeuren op patiëntenmonsters met verschillende ‘loads’, maar ook op negatieve monsters. Omdat de commerciële tests steeds beter en gevoeliger worden, kunnen er discrepanties optreden.

vol.

5

nr.

5 - 2010

169


Aanwijzingen voor de praktijk 1. Wees alert bij onverwacht lage ‘loads’ bij patiënten met een laag absoluut aantal CD4 + T-lymfocyten, in het bijzonder bij patiënten die in niet-westerse landen geïnfecteerd zijn of bij personen uit niet-westerse landen. Dit kan duiden op een goede immunologische controle, maar ook op onderkwantificatie van de virale ‘load’. 2. Vraag om dit probleem te herkennen om een alternatieve virale-loadtest. 3. Fabrikanten van virale-loadtests zijn meestal bereid om de reden tot onderkwantificatie uit te zoeken. Dit helpt hen om hun tests up-to-date te brengen.

Dit is, onder andere, ontdekt tijdens het valideren van de nieuwe Roche Cobas® TaqMan® HIV-1-test (versie 2.0).31 Bij een aantal monsters werden er lage ‘loads’ gemeten met de nieuwe test, terwijl de monsters in de oude test negatief waren. Het feit dat de laag-positieve monsters correleerden met later therapiefalen en dat monsters van seronegatieve personen negatief waren, suggereert dat de test wel specifiek is. Behandelend artsen behoren op de hoogte te zijn van mogelijke discrepanties tussen tests.

Conclusie

Wegens de snelheid van mutatie van de hiv-1-stammen kan het gebeuren dat een virale-loadassay een bepaalde hiv-stam niet of onvoldoende kan detecteren. Commerciële tests werden oorspronkelijk vooral voor subtype B ontwikkeld. De nieuwe tests lijken beter in het kwantificeren van alle subtypen dan de oude tests en sommige assays kunnen stammen detecteren met een beperkt aantal mutaties in de ‘target’ voor amplificatie. Het virus zal echter nog verder muteren en recombineren. Het is dus van belang dat zowel bedrijven, laboratoria als behandelend artsen alert blijven. Bedrijven moeten doorgaan met surveillance en sequencen van stammen uit de gehele wereld, en laboratoria behoren de ontwikkelingen te volgen. Omdat geen enkele test alle mogelijke bestaande varianten adequaat kan kwantificeren, blijft het belangrijk dat behandelend artsen alert zijn op discrepanties tussen de virale ‘load’ en het absolute aantal CD4+ T-lymfocyten.

Referenties 1. Barré-Sinoussi F, Chermann JC, Rey F, Nugeyre MT, Chamaret S, Gruest J, et al. Isolation of a T-lymphotropic retrovirus from a patient at risk for acquired immune

170

vol.

5

nr.

5 - 2 0 10

deficiency syndrome (AIDS). Science 1983;220:868-71. 2. Goudsmit J, Paul DA, Lange JM, Speelman H, Van der Noordaa J, Van der Helm H, et al. Expression of human immunodeficiency virus antigen (HIV-Ag) in serum and cerebrospinal fluid during acute and chronic infection. Lancet 1986;ii:177-80. 3. Schüpbach J. Viral RNA and p24 antigen as markers of HIV disease and antiretroviral treatment success. Int Arch Allergy Immunol 2003;132:196-209. 4. Ou CY, Kwok S, Mitchell SW, Mack DH, Sninsky JJ, Krebs JW, et al. DNA amplification for direct detection of HIV-1 in DNA of peripheral blood mononuclear cells. Science 1988;239:295-7. 5. Hart C, Schochetman G, Spira T, Lifson A, Moore J, Galphin J, et al. Direct detection of RNA expression in seropositive subjects. Lancet 1988;2:596-9. 6. Ehrnst A, Sönnerborg A, Bergdahl S, Strannegård O. Efficient isolation of HIV from plasma during different stages of HIV infection. J Med Virol 1988;26:23-32. 7. Holodniy M, Katzenstein DA, Sengupta S, Wang AM, Casipit C, Schwartz DH, et al. Detection and quantification of human immunodeficiency virus RNA in patient serum by use of the polymerase chain reaction. J Infect Dis 1991;163:862-6. 8. Mellors JW, Munoz A, Giorgi JV, Margolick JB, Tassoni CJ, Gupta P, et al. Plasma viral load and CD4+ lymphocytes as prognostic markers of HIV-1 infection. Ann Intern Med 1997;126:946-54. 9. Semple M, Loveday C, Weller I, Tedder R. Direct measurement of vireamia in patients infected with HIV-1 and its relationship to disease progression and zidovudine therapy. J Med Virol 1991;35:38-45. 10. Holodniy M, Katzenstein DA, Israelski DM, Merigan TC. Reduction in plasma human immunodeficiency virus ribonucleic acid after dideoxynucleoside therapy as determined by the polymerase chain reaction. J Clin Invest 1991;88:1755-9. 11. Ho DD, Neumann AU, Perelson AS, Chen W, Leonard JM, Markowitz M. Rapid turnover of plasma virions and CD4 lymphocytes in HIV-1 infection. Nature 1995; 373:123-6.


v o o r


12. Schuurman R, Nijhuis M, Van Leeuwen R, Schipper P, De Jong D, Collis P, et al. Rapid changes in human immunodeficiency virus 1 RNA load and appearance of drug-resistance virus populations in persons treated with lamivudine (3TC). J Infect Dis 1995;171:1411-9. 13. Mansky LM, Temin HM. Lower in vivo mutation rate of immunodeficiency virus type 1 than that predicted from the fidelity of purified reverse transcriptase. J Virol 1995;69:5087-94. 14. Ramirez BC, Simon-Loriere E, Galetto R, Negroni M. Implications of recombination for HIV diversity. Virus Res 2008;134:64-73. 15. Gao F, Bailes E, Robertson DL, Chen Y, Rodenburg CM, Michael SF, et al. Origin of HIV-1 in the chimpanzee Pan troglodytes. Nature 1999;397:385-6. 16. Van Heuverswyn F, Li Y, Neel C, Bailes E, Keele BF, Liu W, et al. Human immunodeficiency viruses: SIV infection in wild gorillas. Nature 2006;444:164. 17. Korber B, Gaschen B, Yusim K, Thakallapally R, Kesmir C, Detours V. Evolution and immunological implications of contemporary HIV-1 variation. Br Med Bull 2001;58:19-42. 18. Buonaguro L, Tornesello ML, Buonaguro FM. Human immunodeficiency virus type 1 subtype distribution in the worldwide epidemic: pathogenic and therapeutic implications. J Virol 2007;81:10209-19. 19. Gomes P, Palma AC, Cabanas J, Abecasis A, Carvalho AP, Ziermann R, et al. Comparison of the Cobas Taqman HIV-1 HPS with Versant HIV-1 RNA 3.0 assay (bDNA) for plasma RNA quantitation in different HIV-1 subtypes. J Virol Meth 2006;135:223-8. 20. Tang N, Huang S, Salituro J, Mak, W-B, Cloherty G, Johanson J, et al. A real-time HIV-1 viral load assay for automated quantitation of HIV-1 RNA in genetically diverse group M suntypes A-H, group O and group N samples. J Virol Meth 2007;146:236-45. 21. De Mendoza C, Koppelman M, Montés B, Ferre V, Soriano V, Cuypers H, et al. Multicenter evaluation of the NucliSens EasyQ HIV-1 v.1.1 assay for the quantitative detection of HIV-1 RNA in plasma. J Virol Meth 2005;127:54-9. 22. Elbeik T, Alvord WG, Trichavaroj R, De Souza M, Gewar R, Brown A, et al. Comparative analysis of HIV-1 viral load assays on subtype quantification: Bayer Versant HIV-1 RNA 3.0 versus Roche Amplicor HIV-1 monitor version 1.5. J Acquir Immune Defic Syndr 2002;29:330-9. 23. Gueudin M, Plantier JC, Lemeé V, Schmitt MP, Chartier L, Bourlet T, et al. Evaluation of the Roche Cobas TaqMan and Abbott TealTime extraction-quantification systems for HIV-1 subtypes. J Acquir Immune Defic Syndr 2007;44:500-5. 24. Schutten M, Peters D, Back NKT, Beld M, Beuselinck K, Foulogne V, et al. Multicenter evaluation of the new Abbott RealTime assays for quantitative detection of human immunodeficiency virus type 1 and hepatitis C virus RNA. J Clin


v o o r


Microbiol 2007;45:1712-1717. 25. Holguín A, López M, Molinero M, Soriano V. Performance of three commercial viral load assays, Versant human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) RNA bDNA v3.0, Cobas Ampliprep/Cobas TaqMan HIV-1, and NucliSens HIV-1 EasyQ v 1.2, testing HIV-1 non-B subtypes and recombinant variants. J Clin Microbiol 2008;46:2918-23. 26. Perrin L, Kaiser L, Yerly S. Travel and the spread of HIV-1 genetic variants. Lancet Infect Dis 2003;3:22-6. 27. Scott L, Carmona S, Stevens W. The performance of the new Roche Cobas Ampliprep/Cobas TaqMan HIV-1 version 2.0 assay. J Clin Microbiol 2009;47:3400-2. 28. Ruelle J, Jnaoui K, Lefèvre I, Lamarti N, Goubau P. Comparative evaluation of the Versant HIV-1 RNA 1.0 kinetic PCR molecular system (kPCR) for the quantification of HIV-1 plasma viral load. J Clin Virol 2007;44:297-301. 29. Lin C, Wagner C, Nicol S, Torres, R, Canchola J, Surtihadi J, et al. Performance of the new Versant HIV-1 RNA 1.0 assay. EACS Conference 2007: abstract P20. 30. Te raadplegen op www.biomerieux.com (bekeken op 8 december 2009). 31. Pas S, Rossen JW, Schoener D. Thamke D, Pettersson A, Babiel R, et al. Performance evaluation of the new Roche Cobas Ampliprep/Cobas TaqMan HIV-1 test v. 2.0 for quantification of Human Immunodeficiency Virus type 1 RNA. J Clin Microbiol 2010;48:1195-2000. Ontvangen 8 december 2009, geaccepteerd 26 april 2010.

Correspondentieadres Mw. dr A. M. Pettersson, medisch moleculair microbioloog VU medisch centrum Afdeling Medische Microbiologie en Infectiepreventie De Boelelaan 1117 1081 HV Amsterdam Tel.: 020 444 29 34 E-mailadres: [email protected] Mw drs. W. Kortmann, internist-infectioloog Medisch Centrum Alkmaar Wilhelminalaan 12 1815 JD Alkmaar Correspondentie graag richten aan de eerste auteur. Belangenconflict: geen gemeld. Financiële ondersteuning: geen gemeld.

vol.

5

nr.

5 - 2010

171

Hiv-1 virale-loadbepalingen: problemen en ontwikkelingen

Recommend Documents