Samenvatting Eiwitten vervullen een essentiële rol binnen alle biologische systemen. Zo zijn ze onder andere betrokken bij het transport van kleine moleculen zoals zuurstof, het transport van energie en electronen, en bij het versnellen van chemische reacties. Bovendien vormen eiwitten de structurele basis voor bijvoorbeeld spierweefsel. Alleen al in het menselijk lichaam komen zo’n 100.000 verschillende soorten eiwitten voor, elk met een eigen specifieke functie. Eiwitten zijn opgebouwd uit eenentwintig verschillende soorten aminozuren die in een specifieke volgorde zijn gebonden aan een zogenaamde polypeptide keten. Elk eiwit kan worden gekarakteriseerd door de volgorde van deze aminozuren binnen de keten, die ook wel de primaire structuur van een eiwit wordt genoemd. Een eiwit is dus een langgerekt molecuul. In zijn functionele vorm is het echter altijd opgevouwen in een speciale ruimtelijke structuur, ook wel de tertiaire structuur genoemd. Deze tertiaire structuur, die vrijwel hetzelfde is voor elk exemplaar van een bepaald eiwit, wordt puur bepaald door de aminozuur volgorde. De bouwstenen waaruit eiwitten zijn opgebouwd, met name de aminozuren, zijn verschillend in hun fysisch chemische eigenschappen, sommige zijn bijvoorbeeld positief of negatief geladen, hydrofiel of hydrofoob (dit betekent of ze zich graag in de buurt van watermoleculen bevinden of juist niet, hetgeen belangrijk is omdat eiwitten vrijwel altijd in een waterige omgeving functioneren) en ook hun grootte verschilt sterk. Dit betekent dat verschillende bouwstenen elkaar kunnen afstoten of aantrekken. Het is zo dat als een eiwit is opgevouwen in zijn tertiaire structuur het aantal positieve (aantrekkende) wisselwerkingen groter is dan het aantal negatieve (afstotende) wisselwerkingen. Voor de meer ingewijden: het gaat hier bijvoorbeeld om Van der Waals interacties, waterstofbruggen en elektrostatische interacties. Dat wil zeggen dat onder de fysiologische omstandigheden waarin het eiwit functioneert (dat kunnen bijvoorbeeld de temperatuur, de druk of de zuurgraad zijn) het voor het eiwit energetisch gunstig is om zich in de opgevouwen toestand te bevinden. Zo bevinden de hydrofobe bouwstenen zich het liefst aan de binnenkant van de ruimtelijke structuur, waar ze zo min mogelijk in contact komen met watermoleculen, en bevinden zich de hydrofiele bouwstenen juist aan de buitenkant. Tot een aantal jaren geleden werd gedacht dat elk soort eiwit een unieke driedimensionale structuur bezit, die bovendien zeer sterk gerelateerd is aan de biochemische functie van het eiwit. Er moet dus een speciale manier zijn om het eiwit op te vouwen, die energetisch veel gunstiger is dan alle andere manieren. De relatie tussen structuur en functie kan hier het best worden uitgelegd aan de hand van een voorbeeld. De functie van sommige eiwitten is het binden en transporteren van een bepaald molecuul. Soms is de ruimtelijke structuur van het eiwit zodanig dat dit molecuul exact past in een holte in het eiwit. Tot voor kort werden eiwitten derhalve vooral gezien als statische en niet als dynamische systemen. Met dynamisch bedoelen we hier niet bewegingen van het eiwitmolecuul als geheel maar bewegingen van de atomen waaruit het eiwit is opgebouwd ten opzichte van elkaar en die dus 97
gepaard gaan met een verandering van de ruimtelijke structuur. Er komen steeds meer aanwijzingen, zowel vanuit het experiment als vanuit de theorie, dat eiwitten wel degelijk van structuur veranderen en zelfs dat structuurveranderingen van eiwitten een essentiële rol kunnen spelen bij hun functioneren. Structuurveranderingen kunnen het gevolg zijn van een externe factor, bijvoorbeeld het opvangen van zonlicht of het binden van een bepaald molecuul, maar kunnen ook “spontaan”, of beter gezegd ten gevolge van thermische fluctuaties, optreden. Een goed voorbeeld van het belang van spontane structuurveranderingen voor het functioneren van een eiwit is myoglobine. De functie van myoglobine is het transporteren van zuurstof in spierweefsel, en de ruimtelijke structuur van dit eiwit is al bekend sinds de jaren vijftig. Zuurstof bindt zich aan de binnenkant van het eiwit maar als men de ruimtelijke structuur beschouwt is er geen plaats voor het zuurstofmolecuul om binnenin het eiwit te komen. Dat betekent dat het eiwit dus “open” en “dicht” moet gaan om een zuurstofmolecuul te binden en ook om het later weer af te staan. Kortom, als de structuur van het eiwit volkomen star zou zijn, zou het nooit kunnen functioneren. Structuurveranderingen van eiwitten kunnen ook ziektes veroorzaken. Zo zijn de prionen die verantwoordelijk zijn voor het ontstaan van BSE, ook wel gekkekoeienziekte genoemd, in feite verkeerd opgevouwen versies van anders goed functionerende eiwitten. Het onderzoek naar het dynamisch gedrag van eiwitten is dus uiterst belangrijk vanuit een biologisch en biochemisch gezichtspunt. Met dynamisch gedrag bedoelen we dan met name de aard van structuurveranderingen, bijvoorbeeld de grootte van veranderingen en de tijdschaal waarop ze plaats vinden, dus of ze snel of langzaam zijn. De structurele vrijheidsgraden van een eiwit worden bepaald door de gevolgen van een structuurverandering op de totale energie van het systeem. Wat men graag zou willen weten is de energie behorende bij elke mogelijke driedimensionale structuur van het eiwit. In iets ingewikkelder taal betekent dit dat men het multidimensionale potentiaaloppervlak wil bepalen dat wordt opgespannen door de coordinaten van alle atomen in het eiwit. Dit is een ondoenlijke opdracht, met name vanwege het grote aantal atomen, dat zelfs al voor een klein eiwit enkele duizenden bedraagt. Wat men wel kan doen is proberen een vereenvoudige definitie van dit potentiaaloppervlak te geven om binnen dit kader het dynamisch gedrag van het eiwit te beschrijven. Een populaire beschrijving kent een sterke overeenkomst met het begrip “landschap”. De hoogte binnen dit “energielandschap” beschrijft de potentiële energie van het systeem, terwijl het horizontale vlak alle mogelijke driedimensionale structuren van het eiwit omvat. Binnen de oude beschrijving van eiwitten als statische systemen zou dit landschap eruit zien als een vlakte met daarin één diepe, steile put. Immers binnen de statische beschrijving heeft het eiwit een zeer scherp bepaalde structuur die overeenkomt met het diepste punt in de put, omdat deze structuur energetisch veel gunstiger is dan alle andere mogelijke ruimtelijke structuren. Binnen een nieuwe beschrijving, waarin we eiwitten beschouwen als systemen die structurele fluctuaties vertonen rondom een gemiddelde structuur, zal het totale energielandschap van het eiwit er nog steeds uitzien als een put die echter veel minder stijl is, omdat in deze beschrijving de structuur veel minder scherp bepaald is. 98
In het kader van dit proefschrift zijn we vooral geïnteresseerd in de dynamica van het eiwit in zijn functionele vorm. Dat betekent dat we de structuur van het energielandschap willen beschrijven in de buurt van het minimum. Aan hand van experimenten en computersimulaties is gebleken dat in dit gebied het potentiaaloppervlak sterke overeenkomsten vertoont met een ruw berglandschap met veel pieken en dalen. De dalen komen overeen met stabiele conformaties van het eiwit die ook wel conformationele subtoestanden worden genoemd. Binnen iedere subtoestand heeft het eiwit globaal dezelfde structuur, maar kijkt men nauwkeuriger, dan ziet men kleine verschillen. De verschillende subtoestanden zijn van elkaar gescheiden door energiebarrières (de pieken). De dynamica van het eiwit kan beschreven worden in termen van overgangen tussen de conformationele subtoestanden. Om zo’n overgang te bewerkstelligen moet het eiwit energie onttrekken aan zijn omgeving. Dit proces is sterk afhankelijk van de temperatuur. Bij kamertemperatuur kan het eiwit vrij bewegen tussen alle toestanden in het energielandschap. Als men de temperatuur verlaagt zullen sommige barrières te hoog zijn om overschreden te worden en is het eiwit als het ware “ingevroren” in een klein gedeelte van zijn energielandschap. Dus bij lage temperatuur zullen de structurele veranderingen van het eiwit zowel langzamer als kleiner worden. Door nu de dynamica van het eiwit bij steeds lagere temperatuur te bestuderen kan inzicht worden verkregen in de structuur van het energielandschap. In dit proefschrift wordt de dynamica van myoglobine bestudeerd met behulp van optische technieken die gebruik maken van het feit dat myoglobine van nature een kleurstofmolecuul bevat. Een kleurstofmolecuul kan licht absorberen van een bepaalde golflengte (kleur). De precieze golflengte is echter afhankelijk van zijn omgeving, in dit geval dus het eiwit. Dit heeft tot gevolg dat structuurveranderingen van het eiwit fluctuaties teweegbrengen in de golflengte waarbij het eiwit licht absorbeert. Met behulp van lasertechnieken is het mogelijk te bestuderen hoe de eiwitmoleculen van kleur veranderen en op die manier informatie te onttrekken omtrent de structurele dynamica van het eiwit. Een van de aspecten van eiwitdynamica is dat zij over een zeer breed scala van tijdschalen kan plaatsvinden. In dit proefschrift wordt de dynamica bestudeerd tussen een miljardste en een tiende seconde. Specifiek meet het experiment de verdelingsfunctie van kleurverschuivingen die plaats vinden binnen een bepaald tijdsinterval dat steeds groter wordt gemaakt. Het experiment bezit een zekere overeenkomst met het maken van een foto van een bewegend object. Als de sluitertijd waarmee de foto wordt genomen veel kleiner is dan de tijdschaal waarop het object beweegt zal een scherpe foto worden verkregen. Echter als de sluitertijd van dezelde orde is als de tijdschaal waarop het object beweegt zal de foto onscherp worden. In het experiment nemen we als het ware een “foto” van het eiwit met een steeds langer wordende sluitertijd en kijken we hoe deze foto onscherper wordt naar mate de sluitertijd langer wordt gemaakt. Bij zeer lage temperatuur zien we dat in het begin steeds een scherpe foto wordt verkregen ook bij toenemende sluitertijd. Op een bepaald moment zien we de foto echter toch onscherper worden totdat de scherpte van de foto niet meer 99
verandert. Hieruit kunnen we concluderen dat het eiwit beweegt op een zeer scherp bepaalde tijdschaal. Immers als we een foto nemen van een object dat beweegt op een tijdschaal van een honderdste seconde zal het wel uitmaken of we een sluitertijd van één of van vijf honderdste van een seconde gebruiken. Het zal echter niet uitmaken of we een sluitertijd van één of van tien seconden gebruiken, de foto zal even onscherp zijn. Dit is precies wat we zien voor het eiwit, en op deze manier kan de snelheid waarmee het eiwit beweegt worden bepaald. In het totaal werden voor myoglobine tussen 1 en 10 Kelvin (dat is tussen -272 and -263 graden Celcius) drie van dit soort eiwitbewegingen gevonden. Verder werd ontdekt dat de snelheid waarmee het eiwit beweegt sterk afhankelijk is van de temperatuur. Daaruit kunnen we weer concluderen dat het eiwit constant beweegt tussen twee conformationele subtoestanden die gescheiden zijn door een energiebarrière. Immers als de temperatuur wordt verhoogd is het voor het eiwit makkelijker om over deze barrière heen te komen en zal de beweging steeds sneller gaan. Door exact te meten hoe de snelheid van de beweging afhangt van de temperatuur kunnen we zelfs de hoogte van de barrières bepalen. Door de resultaten van onze metingen te vergelijken met die van anderen bij nog lagere temperaturen (tot een tiende graad boven het absolute nulpunt) en van weer anderen bij hogere temperaturen (tussen -263 en 25 graden Celsius) krijgen we een helder inzicht in de vorm van het energielandschap. Op die manier tonen we aan dat het energielandschap van myoglobine een hiërarchische structuur bezit. Deze structuur was al eens eerder voorgesteld maar was nog uiterst speculatief. Bovendien wordt met behulp van onze optische experimenten een veel gedetailleerder beeld gegeven. De hiërarchische structuur is enigszins te vergelijken met het “Droste-cacaobus” effect. Op het eerste gezicht lijkt het zo dat het energielandschap bestaat uit een aantal subtoestanden gescheiden door barrières van ongeveer dezelfde hoogte. Kijken we echter nauwkeuriger in een van de “dalen” dan zien we een min of meer identieke structuur, net zoals we steeds weer hetzelfde plaatje zien wanneer we kijken naar de cacaobus die op het dienblad staat dat de nachtzuster vasthoudt. Net als in het cacaobuseffect kan dit verschijnsel tot in het oneindige doorgaan. Op basis van onze analyse blijkt dit minstens vier keer te gebeuren voor het energielandschap van het eiwit. Er is dus sprake van een hiërarchie met minstens vier niveaus waarbij de structurele veranderingen gemeten in onze optische experimenten corresponderen met overgangen tussen subtoestanden binnen het laagste niveau.
100
List of Publications Structural studies of microemulsions stabilized by Aerosol-OT J. Eastoe, B.H. Robinson, D.C. Steytler, D. Thorn Leeson Adv. Colloid Interface Sci. 36 (1991) 1-31. On the source of the anomalous fluorescence of 4-(dialkylamino)benzonitrile in aromatic hydrocarbon solvents: the role of exciplexes M.C.C. de Lange, D. Thorn Leeson, K.A.B. van Kuijk, A.H. Huizer, C.A.G.O. Varma Chem. Phys. 174 (1993) 425-440. On the source of the anomalous fluorescence of ethyl esters of 4-(dialkylamino)benzoic acid in aromatic hydrocarbon solvents: the role of exciplexes M.C.C. de Lange, D. Thorn Leeson, K.A.B. van Kuijk, A.H. Huizer, C.A.G.O. Varma Chem. Phys. 177 (1993) 243-256. Low-temperature protein dynamics studied by the long-lived stimulated photon echo* D. Thorn Leeson, O. Berg, D.A. Wiersma J. Phys. Chem. 98 (1994) 3913-3916. Real time observation of low-temperature protein motions* D. Thorn Leeson, D.A. Wiersma Phys. Rev. Lett. 74 (1995) 2138-2141. Looking into the energy landscape of myoglobin* D. Thorn Leeson, D.A. Wiersma Nature struct. Biol. 2 (1995) 848-851. The energy landscape of myoglobin: an optical study* D. Thorn Leeson, D.A. Wiersma, K. Fritsch, J. Friedrich J. Phys. Chem. 101 (1997) 6331-6340. * Included in this thesis
Dankwoord De volgende personen wil ik bedanken voor hun technische en/of inhoudelijke bijdrage aan het totstandkomen van dit proefschrift: Douwe Wiersma, Otto Berg, Kees Lazonder, Foppe de Haan, Ben Hesp, Allard van Dijk, J.M. Vanderkooi, G.T. Robillard, Nanno Herder, Frank Everdij, Hans Frauenfelder, J. Friedrich. FOM, Shell Nederland B.V. en het ‘van der Woude fonds’ ben ik erkentelijk voor hun financiële steun bij mijn deelname aan buitenlandse congressen. Verder ben ik dank verschuldigd aan mijn naaste familie, vrienden en kennissen voor hun steun in de afgelopen vijf jaar. My special thanks go out to Lisa for making the past six months unforgettable :-)
