Fehérje alapú módszerek a Rheumatoid arthritis kimutatására
Doktori értekezés tézisei
Készítette: Babos Fruzsina MTA-ELTE Peptidkémiai Kutatócsoport
Témavezető: Dr. Magyar Anna
Kémia Doktori Iskola Iskolavezető: Dr. Inzelt György Szintetikus kémia, anyagtudomány, biomolekuláris kémia program Programvezető: Dr. Perczel András
Budapest, 2013
1. Bevezetés A Rheumatoid arthritis (RA) progresszív, gyulladásos, autoimmun betegség. A betegség kialakulása során a peptidil-arginin deimináz enzim aktiválódik, és bizonyos fehérjék egyes argininjeit citrullinná alakítja át. Ez a módosítás változást idéz elő a fehérje harmadlagos szerkezetében, az immunrendszer aktiválódik, és saját fehérjéi ellen támad. A betegség az orvostudomány mai állása szerint gyógyíthatatlan, azonban megfelelő terápiát alkalmazva szinten tartható és a betegség előrehaladása lassítható. Ezért a betegség korai kimutatása kulcsfontosságú. A megoldást a betegség autoimmun jellege szolgáltatja a betegség felismerésére: a beteg vérében megjelenő anti-citrullinált peptid/protein autoantitestek (ACPA) kimutatásával [1]. A ma használt diagnosztikumok, amelyek ezeken a citrullinált fehérjéken (pl. fibrin, vimentin) vagy a citrullinált fehérjékből (filaggrin, kollagén) származó epitóp peptideken alapulnak, azonban nem elég specifikusak a betegségre. Az MTA-ELTE Peptidkémiai Kutatócsoport, együttműködésben az ELTE Immunológiai Tanszék és a toulouse-i UDEAR – Hopital Purpan kórház kutatóival, 2002 óta foglalkozik filaggrin és fibrin epitópok meghatározásával, valamint új, specifikus ELISA alapú diagnosztikum kifejlesztésével [2-4]. Doktori munkám során ebbe a kutatásba kapcsolódtam be. A RA korai diagnosztizálásán túl, nem felejtkezhetünk el a betegség gyógyításának lehetőségéről sem. A betegség autoimmun jellegéből kiindulva, az autoreaktív B-sejtek szelektív eltávolításával csökkenthető az autoimmunválasz erőssége. A cél elérésében a természetes immunrendszer tagjai (pl. makrofágok) segíthetnek, melyek effektor funkciójuk révén alkalmasak arra, hogy pl. fagocitózis révén eltávolítsák a szervezet számára nem kívánatos részecskéket, sejteket. Mindezt a felszínükön található Fcγ receptorok segítségével hajtják végre. Ezek az effektor funkciók immunkomplexszel vagy Fcγ receptor kötő peptidekkel indukálhatóak [5-7]. Doktori munkám másik részében, együttműködésben az ELTE Immunológiai Tanszék kutatóival, fagocitózist indukáló hatású peptidekkel foglalkoztam.
2. Célok Doktori munkám során célul tűztem ki olyan filaggrin és fibrin epitóp peptidek származékainak előállítását, amelyek alkalmasak lehetnek diagnosztikai alkalmazásra. A származékokat az alábbiak szerint terveztem:
2
A) Mivel a fejlesztendő diagnosztikai módszer az indirekt ELISA módszeren alapszik, mely során a peptidek kikötése a lemezhez biotinon keresztül történik, az avidin-biotin kölcsönhatás révén, a peptideket biotinált formában kívántam előállítani. B) Vizsgálni kívántam, hogy a biotin pozíciója milyen hatással van a kötődésre, ezért minden esetben N- és C-terminálison biotinált epitóp peptidek előállítását terveztem. C) Felvetődött az a kérdés, hogy az epitóp és a biotin közötti távolság mennyiben befolyásolja a kapott kötődési eredményeket, ezért kétféle távtartó beépítését terveztem a biotin és a peptidlánc közé: a 6-aminohexánsavat, valamint egy vízoldhatóságot javító etilénglikol származékot (Ttds = 4,7,10-trioxa-1,13-tridekándiamino-borostyánkősav). D) A módszerfejlesztés szempontjából az az igény is felmerült, hogy a kötődési vizsgálatokban legígéretesebbnek mutatkozó peptidből készítsünk olyan molekulákat, ahol egy hordozó molekulára több ugyanolyan epitóp is kapcsolódik, a hatékonyság növelése céljából.
Doktori munkám másik célja olyan FcγR kötő peptid szintézise volt, mely fagocitózist indukálva az autoreaktív B-sejtek ellen felhasználható lehet. Az irodalmi előzmények alapján lineáris és ciklikus FcγR kötő peptidek szintézisét tűztem ki célul, C-terminálison biotinált formában. A biotinálásra ez esetben azért volt szükség, mert a peptidek fagocitózist indukáló hatását áramlási citometria módszerével terveztük vizsgálni, ahol avidinnal borított gyöngyöket illetve fluoreszceinnel jelölt avidint kívántunk alkalmazni.
A célkitűzések alapján a tervezett új vegyületek négy nagyobb csoportba sorolhatók: 1) Filaggrin epitóp peptidek és azok N-, illetve C-terminálison biotinált származékai 306
SHQESTXGXSXGRSGRSGS324
311
TXGRS315
2) Fibrin epitóp peptidek és azok N-, illetve C-terminálison biotinált származékai α 36GPXVVEXHQSACKDS50
α 40VEXHQSA46, α 36GPXVVEX42
β 60XPAPPPISGGGYXAX74
β 69GGYXAXPA76
3) Biotinált Fcγ receptorhoz kötődő peptidek FcγRI
Berntzen1
ADGACLRSGRGCGAAK
FcγRIIa
Berntzen2
WAWVWLTETAV
FcγRI
Bonetto
AQVNSCLLLPNLLGCGDDK
4) Négy azonos epitópot tartalmazó konstrukció (MAP konjugátum) 1. generációs lizinfára kapcsolt 4 azonos fibrin β60-74 epitóp
3
3. Alkalmazott módszerek Szilárdfázisú peptidszintézis: A tervezett új, biotinált filaggrin, fibrin és Fcγ receptor kötő peptideket szilárdfázisú peptidszintézissel, Fmoc/tBu stratégiával állítottam elő. A peptideket analitikai RP-HPLC és ESI-MS módszerekkel jellemeztem. Indirekt Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA): Az előállított biotinált filaggrin és fibrin peptidepitópok szérum autoantitest kötő képességének meghatározása indirekt ELISA módszerrel történt. Elektronikus cirkuláris dikroizmus spektroszkópia (ECD): Az N- és C-terminális biotinálás, vagyis a peptidek orientációjának hatását az ellenanyag kötődésre, ECD spektroszkópiával vizsgáltam a filaggrin epitópok esetében, konformációs analízissel. Áramlási citometria: Az előállított Fcγ receptor kötő peptidek fagocitózist indukáló hatásának vizsgálatát, valamint a több azonos epitópot tartalmazó MAP konjugátum autoreaktív B-sejtes vizsgálatát áramlási citometriával végeztük el.
4. Eredmények és következtetések A célkitűzéseimnek megfelelően előállítottam új N- és C-terminálison biotinált filaggrin és fibrin epitóp peptideket, kontrollként az eredeti peptidepitópokat, valamint Fcγ receptor kötő peptideket. Az azonos epitópokat tartalmazó MAP konjugátumok előállítása esetén több nehézségbe is ütköztem, emiatt a szintézisek csak részben sikerültek. A peptideket szilárdfázisú peptidszintézissel, manuális technika és SYRO automata peptidszintetizátor
segítségével,
Fmoc/tBu
stratégia
alkalmazásával
állítottam
elő.
A
nyerstermékeket RP-HPLC-vel tisztítottam, a végtermékeket analitikai RP-HPLC és ESI-MS módszerekkel jellemeztem.
4.1. A biotinált filaggrin epitópok szérum ellenanyag kötődése A szintetizált új, többféleképpen biotinált filaggrin epitóp peptidek RA-es beteg szérum autoantitest kötő képességét indirekt ELISA módszerével vizsgáltuk. Kontrollként egészséges és más autoimmunbetegségben (SLE = Systemic lupus erythematosus) szenvedő betegek szérumait vizsgáltuk. A vizsgálatok során három kérdésre kerestük a választ: 1. Van-e különbség az N- és C-terimálison biotinált származékok kötődési képességében? 2. A beépített távtartók befolyásolják-e az epitópok kötődési tulajdonságát? 3. Mennyire specifikusak a betegségre ezek az epitópok?
4
Azt tapasztaltuk, hogy a filaggrin306-324 epitóp régió esetén nincs különbség az N- és Cterminálison biotinált származékok kötődési tulajdonságában, ezzel szemben a filaggrin311-315 minimum epitópnál drasztikus változás lépett fel: az N-terminálison biotinált peptidnél a kötődés megszűnt, a C-terminálison biotinált származék viszont jó kötődést mutatott a szérum autoantitestekkel (1. ábra). A beépített távtartók lényegében nem befolyásolták a kötődést. Ezen kívül a filaggrin epitóp peptidek egyikét sem ismerték fel az SLE betegek szérumai, sem az egészséges véradók szérumai, így ezek az epitópok RA-re specifikusnak mondhatóak [s1,s2]. 330
CCP2+ szérumok (8 minta) SLE szérumok (CCP2-) (8 minta) egészséges szérumok (8 minta)
315 300
OD hányados
110
60
10 5 4
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Biotinil-TRGRS-NH2 Biotinil-TXGRS-NH2 BiotLC-TRGRS-NH2 BiotLC-TXGRS-NH2 Ac-TRGRSK(BiotLC)-NH2 Ac-TXGRSK(BiotLC)-NH2 Ac-TRGRSK(Biotinil-Ttds)-NH2 Ac-TXGRSK(Biotinil-Ttds)-NH2 Ac-TRGRS-Ttds-K(BiotLC)-NH2 Ac-TXGRS-Ttds-K(BiotLC)-NH2
3 2 1
7
1
3
5
2/
4/
6/
9
5
8/
7
9
6/
8/
7
10 /
10 /
5
8/
3 4/
6/
1 2/
0
1. ábra: A filaggrin minimum epitópjának (311TXGRS315) antitest kötődése, OD hányados = a citrullin tartalmú peptidek OD értéke, osztva az arginin tartalmú peptidek OD értékével
4.2. A filaggrin epitóp peptidek konformációja Az ELISA kísérletek eredményei alapján felvetődött az a kérdés, hogy mi lehet az oka annak, hogy a filaggrin311-315 minimum epitóp esetén van különbség az N- és C- terminálison biotinált származékok ellenanyag felismerésében, míg az epitóp régió esetén nincs. A peptid konformációja változik meg, vagy a biotin-avidin komplex árnyékolja az epitóp kötő helyet? A kérdés tisztázása céljából konformációs analízisnek vetettem alá a filaggrin epitópokat. Megvizsgáltam a biotin jelenlétének és helyzetének a filaggrin peptidek konformációra gyakorolt
hatását
ECD
spektroszkópia
segítségével.
A
spektrumokat
vízben
és
trifluoretanolban (TFE) vettem fel. Összehasonlítottam a filaggrin306-324 és a filaggrin311-315 epitópok arginin és citrullin tartalmú analógjainak spektrális tulajdonságait, és azt tapasztaltam, hogy nincs releváns
5
különbség a konformációjukban, tehát az arginin-citrullin csere nincs hatással a peptidek oldatbeli szerkezetére. Ezen kívül összehasonlítottam a citrullin-tartalmú biotin nélküli és biotinnal konjugált epitóp peptidek ECD spektrumát vízben és TFE-ban (2-3. ábra). a
b 311
4000
4000
2000
2000
0
0
-2000
víz
-4000
311
315
TXGRS 311 315 BiotLC- TXGRS 311 315 TXGRS K(BiotLC)
6000
[θ] M R
[θ]MR
315
TXGRS 311 315 BiotLC- TXGRS 311 TXGRS315K(BiotLC)
6000
-2000 -4000
TFE -6000 -8000 180
-6000
200
220
240
260
-8000 180
280
200
220
hullámhossz λ / nm
240
260
280
hullámhossz λ / nm
2. ábra: A filaggrin 311TXGRS315 minimum epitóp és biotinált konjugátumainak ECD spektrumai (a) vízben és (b) trifluoretanolban, az ECD értékeket aminosav egységre számolt moláris ellipticitásban adtuk meg ([θ]MR / deg cm2/dmol, ahol MR = mean residue)
Azt tapasztaltam, hogy a filaggrin311-315 epitóp esetén a biotin jelenléte és helyzete nagymértékben befolyásolja a minimum epitóp peptid konformációját, mind vízben, mind TFE-ben. Ezzel szemben a filaggrin306-324 epitóp régió konformációjára lényegében nincs hatással. a
30 6 SHQESTXGXSXGRSGRSGS3 24 306 324 BiotLC- SHQESTXGXSXGRSGRSGS 30 6 SHQESTXGXSXGRSGRSGS3 24K(BiotLC)
30000
b
306
SHQESTXGXSXGRSGRSGS 324 BiotLC-306SHQESTXGXSXGRSGRSGS324 306 SHQESTXGXSXGRSGRSGS 324K(BiotLC)
30000
20000 20000
10000
[θ]MR
[θ] MR
10000
0
víz
-10000
-20000 180
200
220
240
hullámhossz λ / nm
0
-10000
260
280
-20000 180
TFE
200
220
240
260
280
hullámhossz λ / nm
3. ábra: A filaggrin 306SHQESTXGXSXGRSGRSGS324 epitóp régió és biotinált konjugátumainak ECD spektrumai (a) vízben és (b) trifluoretanolban.
6
Az eredmények alapján arra a következtetésre jutottam, hogy a filaggrin306-324 epitóp régió esetén csak a peptid primer szerkezete határozza meg a RA-specifikus autoantitesthez való kötődést. A biotin helyzete ebben az esetben azért nem befolyásolta a kötődést, mert az epitóp magja, a minimum epitóp az epitóp régió szekvenciájának a közepén helyezkedik el, egyenlő távolságra mind az N-, mind a C-terminálistól. Ezzel szemben az filaggrin311-315 minimum epitóp peptid esetén mind a primer, mind a szekunder szerkezet hatással van az antitestkötődésre. Ezen kívül azt is bizonyítottam, hogy a biotin pozíciója nagymértékben befolyásolja a kötődést és így az ELISA érzékenységét is [s1]. Végső következtetésként arra jutottam, hogy a biotin-avidin komplex árnyékoló hatása érvényesül, vagyis a biotin pozíciója, és ezáltal a peptidek orientációja az ELISA kísérletekben meghatározó.
4.3. A biotinált fibrin epitópok szérum ellenanyag kötődése A fibrin peptidepitópok esetén is (ELISA mérések alapján) megfigyelhettük a filaggrin peptidepitópoknál is látható különbségeket, amelyet a biotin pozíciója és ezáltal a peptidek orientációja okoz: a fibrin α láncának epitópjai esetén a C-terminális biotinálás az előnyösebb. A fibrin β láncán lévő epitópok esetén az N-terminális biotinálás a kedvezőbb [s3].
4.4. Az azonos epitópokat tartalmazó MAP konjugátum reaktivitása B-sejtekkel A konjugátumok in vitro B-sejtekhez való kötődését áramlási citometria módszerével vizsgáltuk. Kontrollként acetilezett lizinfát és Streptavidin-FITC-t alkalmaztunk. A mérések aspecifikus kötődést mutattak, ugyanis a sejtek jóval nagyobb százalékban kötötték a konjugátumokat és a kontroll vegyületeket, mint amire az autoreaktív B-sejtek mennyiségéből következtetni lehet. Így ezen konstrukciók nem alkalmazhatóak az adott vizsgálati körülmények között. A továbbiakban érdemes az avidin-biotin rendszert kizárva, más jelölő molekulával kapcsolni ezeket a MAP konjugátumokat, valamint érdemes más hordozót is kipróbálni. 4.5. Az Fcγ receptor kötő peptidek fagocitózist indukáló hatása Az előállított három FcγR kötő peptid fagocitózist indukáló hatását áramlási citometria módszerével vizsgáltuk. A peptidekkel borított gyöngyöket hasonlóan fagocitálták a vizsgált U937 sejtek, de a pozitív kontrollhoz mérten elég kis mértékben, így ezek a peptidek nem
7
lennének alkalmasak a kellő hatás elérésére. A továbbiakban más Fcγ receptor kötő peptidek vizsgálata indokolt.
5. Összegzés Doktori munkám során sikeresen állítottam elő új biotinált filaggrin és fibrin epitóp peptideket. Az ellenanyag kötődési ELISA vizsgálatok eredményei alapján meghatároztam, hogy a filaggrin311-315, a filaggrin306-324 és a fibrin β60-74 epitópok RA-re specifikusak, és a Cterminálison biotinált filaggrin epitóp származékok, valamint az N-terminálison biotinált fibrin β60-74 epitóp, alkalmasak egy új diagnosztikai kit kifejlesztésére. Ezen kívül azt is megállapítottam, hogy a peptidek orientációja döntően meghatározza az epitópok ellenanyag általi hozzáférhetőségét, és ezáltal az ELISA kísérletek eredményeit. Ez a tény új megközelítést ad az ELISA alapú diagnosztikumok fejlesztésének.
Irodalomjegyzék: 1. Vincent, C., Nogueira, L., Clavel, C., Sebbag, M., Serre, G. (2005) Autoantibodies to citrullinated proteins: ACPA. Autoimmunity, 38, 17-24. 2. Magyar, A., Brózik, M., Hudecz, F. (2011) Filaggrin peptides with citrulline for diagnosis and monitoring of autoantibodies in Rheumatoid arthritis. Collection Symposium Series, 13, 80-84. 3. Sebbag, M., Moinard, N., Auger, I., Clavel, C., Arnaud, J., Nogueira, L., Roudier, J., Serre, G. (2006) Epitopes of human fibrin recognized by the Rheumatoid arthritisspecific autoantibodies to citrullinated proteins. Eur. J. Immunol., 36, 2250-2263. 4. Iobagiu, C., Magyar, A., Nogueira, L., Cornillet, M., Sebbag, M., Arnaud, J., Hudecz, F., Serre, G. (2011) The antigen specificity of the Rheumatoid arthritis-associated ACPA directed to citrullinated fibrin is very closely restricted. J. Autoimmunity, 37, 263-272. 5. Berntzen, G., Brekke, O.H., Mousavi, S.A., Andersen, J.T., Michaelsen, T.E., Berg, T., Sandlie, I., Lauvrak, V. (2006) Characterization of an FcγRI-binding peptide selected by phage display. Protein Eng. Des. Sel., 19, 121-128. 6. Bonetto, S., Spadola, L., Buchanan, A.G., Jermutus, L., Lund, J. (2009) Identification of cyclic peptides able to mimic the functional epitope of IgG1-Fc for human FcγRI. FASEB J., 23, 575-585. 7. Berntzen, G., Andersen, J.T., Ustgård, K., Michaelsen, T.E., Mousavi, S.A., Qian, J.D., Kristiansen, P.E., Lauvrak, V., Sandlie, I. (2009) Identification of a High Affinity FcγRIIA-binding Peptide That Distinguishes FcγRIIAfrom FcγRIIB and Exploits FcγRIIA-mediated Phagocytosis and Degradation. J. Biol. Chem., 284, 1126-1135.
8
A tézisek alapjául szolgáló közlemények listája s1 Babos, F., Szarka, E., Nagy, Gy., Majer, Zs., Sármay, G., Magyar, A., Hudecz, F. (2013) The role of N- or C-terminal biotinylation in autoantibody recognition of citrullin containing filaggrin epitope peptides in Rheumatoid arthritis. Bioconjugate Chem., 24, 817-827. s2 Szarka, E., Babos, F., Magyar, A., Huber, K., Szittner, Z., Papp, K., Prechl, J., Pozsgay, J., Nagy, Gy., Rojkovich, B., Kelemen, J., Baka, Zs., Brózik, M., Pazár, B., Poór, Gy., Hudecz, F., Sármay, G. (2013) Recognition of new citrulline-containing peptide epitopes by autoantibodies produced in vivo and in vitro by B cells of rheumatoid arthritis patients. Immunology, doi:10.1111/imm.12175. s3 Cornillet, M., Sebbag, M., Verrouil, E., Magyar, A., Babos, F., Ruyssen-Witrand, A., Hudecz, F., Cantagrel, A., Serre, G., Nogueira, L. (2013) The fibrin-derived citrullinated peptide β60-74Cit60,72,74 bears the major ACPA epitope recognised by the Rheumatoid Arthritis-specific anti-citrullinated fibrinogen autoantibodies and anti-CCP2 antibodies. Ann. Rheum. Dis., doi:10.1136/annrheumdis-2012-202868.
A dolgozat témájában megjelent további publikációk jegyzéke Baka, Zs., Barta, P., Losonczy, Gy., Krenács, T., Pápay, J., Szarka, E., Sármay, G., Babos, F., Magyar, A., Géher, P., Buzás, E., Nagy, Gy. (2011) Specific expression of PAD4 and citrullinated proteins in lung cancer is not associated with anti-CCP antibody production. Int. Immunol., 23, 405-414. Konferencia absztraktok Baka, Zs., Barta,. P., Losonczy, Gy., Krenács, T., Pápay, J., Szarka, E., Sármay G., Babos, F., Magyar A., Buzás, E., Falus, A., Nagy, Gy. (2011) RF and serum PAD4 in lung cancer is not associated with anti CCP antibody production. Clin. Exp. Rheumatol. 29, 162. Baka, Zs., Barta,. P., Losonczy, Gy., Krenács, T., Pápay, J., Szarka, E., Sármay G., Babos, F., Magyar A., Buzás, E., Falus, A., Nagy, Gy. (2011) Increased serum PAD4 and Rf in lung cancer is not associated with anti CCP antibody production. Ann. Rheum. Dis. 70, A4. Szarka, E., Ádori, M., Babos, F., Magyar A., Hudecz, F., Nagy, Gy., Pozsgay, J., Sármay G. (2011) Short citrullinated epitope of filaggrin is recognized by sera as well as antibodies produced in vitro by B-cells of Rheumatoid Arthritis patients. Ann. Rheum. Dis.70, A64. Babos, F., Szarka, E., Nagy, Gy., Majer, Zs., Sármay, G., Magyar, A., Hudecz, F. (2012) Nor C-terminal biotinylated citrullin containing filaggrin epitope peptides: The effect of biotinylation on the antibody recognition in Rheumatoid Arthritis. J. Pept. Sci., 18, S96. Babos, F., Szarka, E., Nagy, Gy., Majer, Zs., Sarmay, G., Magyar, A., Hudecz, F. (2012) The role of N- or C-terminal biotinylation in antibody recognition of citrullin containing filaggrin epitope peptides. Eur. J. Clin. Invest., 42, 66. Baka, Zs., Barta, P., Losonczy, G., Krenacs, T., Papay, J., Szarka, E., Sarmay, G., Babos, F., Magyar, A., Geher, P., Buzas, E.I., Falus, A., Nagy, Gy. (2012) Increased citrullination in
9
lung cancer does not lead to the production of anti-citrullinated protein antibodies. Eur. J. Clin. Invest., 42, 61. Szarka, E., Pozsgay, J., Huber, K., Kemenes, K., Babos, F., Baka, Z., Magyar, A., Hudecz, F., Nagy, Gy., Sarmay, G. (2012) New possibility of characterization of rheumatoid arthritis Bcells: citrulline containing peptides. Eur. J. Clin. Invest., 42, 62-63. Szittner, Z., Szarka, E., Papp, K., Prechl, J., Babos, F., Magyar, A., Hudecz, F., Sarmay, G., Nagy, Gy. (2012) Application of a microarray platform in rheumatoid arthritis for the detection of anti-citrullinated peptide antibodies and rheumatoid factors. Eur. J. Clin. Invest., 42, 62. Szarka, E., Huber, K., Pozsgay, J., Babos, F., Gáti, T., Magyar, A., Hudecz, F., Rojkovich, B., Nagy, Gy., Sármay, G. (2013) Detection of ACPA producing B-cells by a citrulline peptide panel. Ann. Rheum. Dis., 72, A34.
10
