ILVO
Evoluties en aandachtspunten in geaccrediteerde microbiologische labs – ervaringen van een RvA en BELAC auditeur Dr. ir. Koen De Reu - Senior researcher Jessy Claeys - Kwaliteitscoördinator
Instituut voor Landbouw en Visserij Onderzoek (ILVO) –Melle, België
Praktijkdag Microbiologie - VMT 29 april 2015 Amsterdam
ILVO
Evoluties Detectie Listeria monocytogenes Klassieke ISO 11290 referentiemethode (5-10 dagen) 20 alternatieve gevalideerde methoden (ISO 16140) Alternatieve klassieke cultuur methoden (2-3 dagen) - 8 methoden (AFNOR/MICROVAL) Immuno-enzymatische (IE) methoden (screening 24-50u) - 6 methoden (AFNOR/MICROVAL) Moleculaire hybridisatie (MH) (screening 18-24u) - 1 methoden (AFNOR/MICROVAL) PCR methoden (screening 12-24u) - 5 methoden (AFNOR/MICROVAL)
ILVO
Evoluties Detectie Listeria monocytogenes Snelle gevalideerde klassieke cultuur methoden
ISO 11290 Referentie methode
Aantal aanrijkingen
1 voor 24u
2 = totaal 72u
Aantal geïncubeerde platen
1 plaat na 24u
4 platen (na 24 en 72u)
Aantal bevestigingstesten
1 (of meer) testen
6 testen
Na 2 dagen Na 3 dagen
Na 5 dagen Na 10 dagen
Tijd voor resultaat Negatief resultaat Positief resultaat
Overige snelle gevalideerde methoden Screening (IE, MH, PCR) → bevestiging = isolatie
ILVO
Evoluties Klassieke tellingen • • • • •
Uitplaten in duplo Enkelvoudige uitplatingen (2 opeenvolgende verdunningen) Spiraalenter (3-4 verdunningen) AFNOR/MICROVAL methoden → bv. minder bevestigingen TEMPO
Goede werkflow, automatisatie, traceerbaarheid in LIMS (incl. bevestiging)
Degelijke validatiedossiers, meetonzekerheid
ILVO
Aandachtspunten
ILVO
Traject opleiding en bevoegdheidsverklaring
ILVO
Traject opleiding en bevoegdheidsverklaring Probleemstelling 1. Passieve volgperiode 2. Actieve uitvoering
3. Enig traceerbaar meetbaar criterium 1e lijn 4. Wildgroei van parafen 5. Beoordeling geschiktheid houdt geen rekening met prestatiekenmerken labo
ILVO
Traject opleiding en bevoegdheidsverklaring 1. Benodigde opleidingen 2. Opleidingsplan laborant a. Algemeenheden b. Specifiek microbiologisch labo
3. Geschiktheidsproef en -criteria - Stoorflora - Matrixeffect - Prestatiekenmerken labo: herh., meetonzekerheid, dectectielimiet
4. Bevoegdheidsverklaring
ILVO
Benodigde opleidingen en taken
1. Algemene kwaliteitsopleiding 2. Opleidingsplan laborant – analyse – monsterontvangst – LIMS - …. 3. Lijst bevoegdheden labo 4. Geheimhoudingsplicht
ILVO
Specifiek opleidingstraject micro Algemeen voorschrift: – Werkvoorschrift lezen – Passieve volgperiode – Actieve periode – Zelfstandige uitvoering met geschikheidsproef – Evaluatie t.o.v. relevante geschiktheidscriteria – Bevoegd verklaren – Verdere bijscholing
ILVO
Opleidingstraject en criteria Geschiktheidsproef = technische beoordeling 1. ->Tellingen – Per telmethode dubbele monsters analyseren – Dubbel monster = eenzelfde monster inzetten door laborant in opleiding en begeleider – Pos. monster + competitieve flora noodzakelijk • Grootste uitdaging • Natuurlijke monsters, PT monsters, spikes (+ platen nat. monsters) – Criteria: • Norm stellen voor verschil tussen 2 personen – Norm tussen herhaalbaarheid en meetonzekerheid – Garantie prestatiekenmerken labo • Goede resultaten voor 1ste lijnscontrole (pos. en (neg.) controle en blanco)
ILVO
Opleidingstraject en criteria Geschiktheidsproef = technische beoordeling 2. ->Detectiemethoden – Blind minstens 3 monsters aanbieden, waarvan minstens 1 positief en 1 negatief monster – Positief monster: beënt met targetorganisme (representatieve concentratie - detectielimiet) • Grootste uitdaging – Matrix keuze en competitieve flora aanwezig – Begeleider dient analyse niet mee uit te voeren – Criterium: Niet vals positief/vals negatief
3. ->Matrix invloeden
ILVO
Opleidingstraject en criteria Geschiktheidsproef = technische beoordeling 3. ->Matrix invloeden – Welke matrices worden in het labo aangeboden – Voldoende variatie: 3 – 5 relevant voor labo – Voor scoop alle voedingsmiddelen: Bv. gespreid over ISO 6887-part 2 tot 5 (event. 6) • • • • •
ISO ISO ISO ISO ISO
6887 – 2: vlees en vleeswaren 6887 – 3: vis en visserijproducten 6887 – 4: overige producten 6887 – 5: melk en melkproducten 6887 – 6: Omgevingsmonsters primaire prod.
ILVO
Telling aërobe kiemen bij 30°C in voedingsmiddelen (ML/01a)
19
02
2015
19
02
2015
ILVO
1/03/2015
ILVO
Opleidingstraject Registratie van het opleidingstraject Analyse
Telling aërobe kiemen bij 30°C in voedingsmiddelen (ML/01a)
Datum theoretische opleiding / methode lezen
19/02/2015
Datum passieve en/of actieve volg periode
20/02/2015 tot 25/02/2015
Datum geschiktheids proef
Datum geschikt verklaard
26/02/2015
1/03/2015
Paraaf LV
opmerking
Opnemen in bevoegdheidsmatrix van het labo
ILVO
Opleidingsplannen met criteria op teamleider niveau • • • • • • • •
Algemene kwaliteitsopleiding Theoretische opleiding procedures labo Praktische opleiding procedures in het labo Monsterontvangst, verifiëren, rapporteren, LIMS, … Zelfstandige leiding labo Bijwonen interne audit Achtergrondkennis microbiologie levensmiddelen ….
ILVO
Klachten en afwijkingen o.a. labo afwijkingen
ILVO
Klachten en afwijkingen REGISTRATIE
Gedachtengoed: Meer leren uit fouten dan uit wat goed loopt Klachten/afwijkingentool zorgt voor gestructureerde verbeteringen
ILVO
Klachten en afwijkingen
AFWIJKING/
ILVO
Klachten en afwijkingen
ILVO
Klachten en afwijkingen
Je
ILVO
Klachten en afwijkingen
Voorbeeld: Klant vroeg om factuur op te stellen op ander adres dan rapport
ILVO
Klachten en afwijkingen
Voorbeeld: Creditnota wordt gemaakt en nieuwe factuur op juist adres wordt opgesteld
ILVO
Klachten en afwijkingen
Voorbeeld: Aan IT wordt gevraagd om LIMS aan te passen en mogelijkheid verschillend adres rapport/factuur mogelijk te maken
ILVO
Klachten en afwijkingen
Voorbeeld: IT heeft nodige gedaan, voorval deed zich niet meer voor in 2014
ILVO
Afwijking in labo • Klacht: Klant trekt resultaat op steriele UHT melk in twijfel – tellingen voor totaal kiemgetal • 4-O werkwijze: – Oorzaak: Kan niet meteen gevonden worden, blanco was O.K. – Omvang: Enkel dat monster – Oplossing: heranalyse + 5 extra flessen batch opvragen en analyseren → resultaat bevestigd – Operationaliteit: Juistheid labo niet in twijfel
Gedachtengoed: Meer leren uit fouten dan uit wat goed loopt via afwijkingentool
ILVO
Verdunningsoplossingen per matrix ISO 6887-1, 2, 3, 4, 5 SPECIALE VOORZIENINGEN BIJ DE BEREIDING VAN DE EERSTE VERDUNNING MATRIX
SPECIALE VOORBEHANDELING
VERDUNNINGSVLOEISTOF
Algemeen Bevroren producten
- Bij 18 - 27°C voor maximum 3 uren (voor vis en visproducten wordt deze methode geprefereerd voor 1 uur) OF - bij 2 ± 2°C voor maximum 24 uren
BPW
GRAM STAAL 10g
melkpoeder, andere poeders van melkprodukten
-goed homogeniseren -voeg poeder toe aan de verdunningsvloeistof, meng voorzichtig - 30 minuten resusciteren - stomacher eerste verdunning
BPW
10g
Citraatoplossing 45°C
10g
K2HPO4 pH 7.5
10g
BPW
10g
BPW - 45°C
50g
1 g/l tot 10g/l tween 80 toevoegen om emulsificatie te verbeteren (afhankelijk van vetgehalte) BPW
10g
kaas caseïnaten
- 2min stomacher, verwarm tot 37°C - laat 15min in WWB bij 37°C - laat schuim verdwijnen boter -plaats afgewogen deel in WWB bij 45°C; hou in WWB tot juist gesmolten. -voeg verdunningsvloeistof toe; stomacher boter , enkel waterige -voeg 42 ml verdunningsvloeistof toe. fase Plaats in WWB bij 47°C tot gesmolten. Meng. -max. 15min. scheiden in lagen, pipetteer van de waterige fase Producten met een Stomacher eerste verdunning hoog vetgehalte (>20% vetmassa) Gelatine - Teststaal in steriele fles
20g
ILVO
Aandachtspunten validatie methoden 1) Controleer scoop^alternatieve methoden (AFNOR-MICROVAL) 2) Hoeveel matrices - 3-5 relevante (alle levensmiddelen) – spreiding ISO 6887 2 tot 6 - 2 melk en melkproducten (bv. vast – vloeibaar) - Nieuwe matrix: bv. spike uitvoeren 3) Natuurlijke monsters (TK, Entero’s, …) 4) Meetonzekerheid: - Fouten - Geen verschillende batch media - Analist A versus B: ≠ batch, broedstoof - Enkel vloeibare matrices - Monsters buiten telgrens
ILVO
Inkoop van goederen en diensten ISO 17025 § 4.6 4.6.1 Procedures voor inkoop, ontvangst en opslag 4.6.2 Toezicht op en vaststellen dat producten voldoen aan eisen en registreren - ISO 11133:2014 4.6.3 Beoordeling en goedkeuring bijgeleverd certificaat 4.6.4 Aantoonbare beoordeling van leveranciers
ILVO
4.6.4 Aantoonbare beoordeling van leveranciers Inventarisatie en beoordeling van: - Toeleveranciers verbruiksgoederen
- Toeleveranciers referentiemateriaal - Toeleveranciers derde lijnscontroles - Toeleveranciers diensten (ook interne diensten – bv. IT)
Scoresysteem: maximum 3 Toeleveranciers gemiddelde score <2: worden schriftelijk of per mail op de hoogte gesteld van de tekortkomingen Toeleveranciers gemiddelde score >2 en <3: er wordt een opmerking geformuleerd
ILVO
4.6.4 Aantoonbare beoordeling van leveranciers
ILVO
Traceerbaarheid handelingen - Grotere
labs: nagenoeg alle traceerbaarheid in LIMS met borgingen BPW overenten in RVS (18 tot 24h bij 41,5 +/- 1°C) en MKTTn (18 tot 24h bij 37 +/- 1°C): datum en tijd in= datum en tijd uit=
Par.: Par:
Par. LV: Indien bevestiging nodig: zie bijlage
- Geen
RVS en MKTTn overenten op XLD (18 tot 24h bij 37 +/- 1°C) en Rap. Salm. (18 tot 24h bij 37 +/- 1 °C) datum en tijd in= datum en tijd uit=
Par.: Par.:
Datum + tijd aanvang incubatie (BPW) (16u tot 20u bij 37°C +/- 1°C) : Datum + tijd einde incubatie BPW:
Par.: Par.:
duidelijke registraties bevestigingstesten
ILVO
Overige aandachtspunten • Inzicht in analyse resultaten (grotere labs): – TK, Entero’s, coliformen, E. coli – Verhitte, steriele producten, MAP, …
• Onzinnige analyses: – vb. Campylobacter in chocolade – vb. Totaal kiemgetal op yoghurt, kaas – vb. houdbaarheid = bederforganismen TK, MZB, G&S en geen hygiëne-indicatoren
ILVO
e 1
lijnscontroles
Berekening grenzen voor een controle kaart
Normale verdeling Controle batch : Normale verdeling
Stam : Batch-nr : Medium : SOP-nr :
Gegevens Controle kaart: Kaartnummer
1
X(gem)-3s X(gem)-2s X(gem)
Batch controle
X(gem)+2s X(gem)+3s
Telling 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
Datum
Analist
Grubbs test
Printen
>
Opmerkingen Norm aal verdeeld Log getransform eerd
- Ook meelopen met bevestigingstesten
- Ondubbelzinnige datum - Resultaat steeds invullen - Analist in opleiding - Niet steeds opmerking bij afwijking
Gem. : ######## ######## Std. afw. : Aantal N : x-3s : ######## ######## x-2s : ######## ######## x= gem : ######## ######## x+2s : ######## ######## x+3s : ######## ######## Normaal verdeeld
Log transformatie Kalman Filtering
ILVO
Vervallen
e 1
lijn controles
• Gedocumenteerde onderbouwing waarom referentiemateriaal verder kan gebruikt worden • Conclusie dat ondanks overschrijden nog geschikt voor beoogde gebruik – Bv. zichtbaar via controlekaarten, historische data
ILVO
Take home messages • Evolutie naar snel, goedkoop en minder arbeidsintensief • Optimalisatie werkflow, automatisatie en sluitende registratie (o.a. via LIMS) • Relevante opleidingen en geschiktheidscriteria (prestatiekenmerken labo) • Klachten en afwijkingensysteem: Meer leren uit fouten dan uit wat goed loopt – 4 O systematiek • Juiste verdunningsoplossing
ILVO
Take home messages • Validatie methoden: nat. monsters meetonzekerheid • Aantoonbare beoordeling van leveranciers met relevante criteria • Blijvende aandacht voor traceerbaarheid handelingen en resultaten • Eerste lijnscontrole: bevestigingstesten, datum ondubbelzinnig, vervallen, …
Jarenlange werking labs conform ISO 17025: performantere werking en juiste resultaten
ILVO
Bedankingen • • • • •
Henk Stegeman Veerle Robbens (Biotox/Ecca) Herman Jansen en Paul in ‘t Veld (nVWA) Kirsten Mooijman (RIVM) Labo microbiologie ILVO-T&V
Some references and sources: Google and Bing images
ILVO
www.bsfm.be
ILVO
Dank u wel
Instituut voor Landbouwen Visserijonderzoek Brusselsesteenweg 370 9090 Melle – België T + 32 (0)9 272 30 00 F +32 (0)9 272 30 01
[email protected] www.ilvo.vlaanderen.be
References and sources: Google and Bing images
