Evidentie voor antitumorale immuunresponsen bij longcarcinoom

FACULTEIT GENEESKUNDE EN GEZONDHEIDSWETENSCHAPPEN

Academiejaar 2011 - 2012

Evidentie voor antitumorale immuunresponsen bij longcarcinoom.

Jonas Schoonackers

Promotor: Prof. Dr. Karim Vermaelen

Scriptie voorgedragen in de 2de Master in het kader van de opleiding

MASTER IN DE GENEESKUNDE

V OORWOORD Op het einde van derde bachelor kon ik het onderwerp van mijn thesis kiezen. Ik heb sterk getwijfeld tussen een experimentele thesis en een literatuurthesis maar heb uiteindelijk voor deze laatste gekozen. Toen ik in eerste master begon aan het opzoekwerk was ik zeer blij met deze beslissing omdat ik besefte dat ik er zeer veel uit zou leren. Het onderwerp “evidentie voor antitumorale immuunresponsen bij longcarcinoom” koos ik vanuit mijn interesse voor interne ziekten enerzijds en voor immunologie anderzijds. Dat longkanker een veel voorkomende pathologie is waar ik ongeacht mijn latere keuze wellicht nog veel mee in aanraking zal komen is zeker ook een pluspunt. Daarnaast koos ik deze titel omdat het gebied tumorimmunologie mij nog onbekend was vanuit de cursussen. De grootste moeilijkheid bij het opzoekwerk was echter juist om richting te vinden in dit mij volledig onbekend thema. Een tweede uitdaging was daarnaast om mij te beperken tot de titel en niet teveel uit te wijden in zowel mijn opzoek- als schrijfwerk. Het gebied van de tumor immunologie bleek immers bijzonder omvangrijk en het was moeilijk om niet verloren te lopen in details. Achteraf gezien ben ik zeer tevreden met het leerproces dat ik doorlopen heb en met het product dat ik aflever. Ik hoop in deze thesis een duidelijk overzicht te kunnen geven van de antigenen die een antitumorale immuunrespons bij longkanker kunnen opwekken en van de cellen die in deze immuunrespons een rol spelen, alsook van de implicaties hiervan naar immunotherapie toe.

Ik wil mijn promotor bedanken voor een uitstekende begeleiding en voor de vele onmisbare tips die hij mij gaf bij het opzoekwerk en bij het schrijven. Daarnaast wil ik mijn vriendin, familie en vrienden bedanken voor hun steun en aanmoediging.

I NHOUDSTAFEL 1.

Abstract ........................................................................................................................................... 1

2.

Inleiding........................................................................................................................................... 2 1.

Epidemiologie ..................................................................................................................... 2

2.

Tumorclassificatie en -stadiëring bij NSCLC ..................................................................... 3

3.

De standaardbehandeling van NSCLC ................................................................................ 3

4.

Immunotherapie................................................................................................................... 4

3.

Methodologie................................................................................................................................... 5

4.

Resultaten ........................................................................................................................................ 6 I.

Geschiedenis ............................................................................................................................... 6

II.

Tumorantigenen .......................................................................................................................... 6 A.

Tumor-specifieke antigenen .................................................................................................... 8 1.

Gemuteerde antigenen ......................................................................................................... 8

2.

Antigenen van virale oorsprong ........................................................................................ 11

B.

Tumor-geassocieerde antigenen (TAA’s) ............................................................................. 11 1.

Cancer-testis antigenen (CTA) .......................................................................................... 11

2.

Weefseldifferentiatie antigenen ......................................................................................... 15

3.

Oncofetale antigenen ......................................................................................................... 15

4.

Post-translationeel gemodificeerde antigenen ................................................................... 16

5.

Overexpressie van antigenen ............................................................................................. 17

III. Klinische en translationele evidentie voor antitumorale immuunresponsen bij longkanker .... 23 A.

Klinische fenomenen ............................................................................................................. 23

B.

Rol van de aangeboren immuniteit bij longkanker ................................................................ 24 1.

Macrofagen ........................................................................................................................ 24

2.

Myeloid-derived suppressor cells (MDSC) ....................................................................... 26

3.

Natural killer cellen (NK-cellen) ....................................................................................... 28

4.

Natural killer T-cellen (NKT) ........................................................................................... 29

5.

Mastcellen ......................................................................................................................... 30

C.

Rol van de verworven immuniteit bij longkanker ................................................................. 31 1.

Dendritische cellen ............................................................................................................ 31

2.

T-cellen .............................................................................................................................. 38

3.

Regulatoire T-cellen (Tregs) ............................................................................................. 42

4.

B-cellen ............................................................................................................................. 44

IV. Ontstaan van kanker ondanks de antitumorale immuunrespons............................................... 49 1.

Tumor immunoediting: de 3 E’s........................................................................................ 49

5.

2.

Tumor Escape mechanismen: Wat gaat er fout? ............................................................... 50

3.

Conclusie ........................................................................................................................... 53

Discussie........................................................................................................................................ 54 1.

De antitumorale immuunrespons tegen longkanker .......................................................... 54

2.

Tumor escape en immunosuppressie ................................................................................. 55

3.

Implicaties voor immunotherapie ...................................................................................... 55

6.

Besluit............................................................................................................................................ 57

7.

Referentielijst ................................................................................................................................ 58

V EEL GEBRUIKTE AFKORTINGEN ADCC

Antibody-dependent cellular cytotoxicity

APC

Antigen presenterende cel

CTA

Cancer-testis antigen

CTL

Cytotoxische T-lymfocyt

EGFR

Epidermal growth factor receptor

HLA

Human leukocyte antigen

IL

Interleukine

MHC

Major histocompatibility complex

NSCLC

Non-small cell lung cancer

SCLC

Small cell lung cancer

TAA

Tumor associated antigen

TCR

T-cel receptor

TGF-β

Transforming growth factor bèta

Th1

T-helper 1 cel

Th2

T-helper 2 cel

Ti-BALT

Tumor-induced bronchus associated lymphoid tissue

TIL

Tumor infiltrerend lymfocyten

TKI

Tyrosine kinase inhibitor

TLO’s

Tertiaire lymfoïde organen

VEGF

Vascular endothelial growth factor

1. A BSTRACT Longkanker is niet alleen een veel voorkomende, maar ook een zeer dodelijke kanker. Ondanks evoluties in de standaardtherapie is de prognose voor de meeste patiënten zeer slecht. Er is dus nood aan het ontwikkelen van nieuwe therapieën. Immunotherapie is hier een mogelijke piste. Voor het ontwikkelen van immunotherapieën voor longkanker is het echter essentieel om de onderliggende antitumorale immuunrespons te begrijpen en om te weten of er een spontane immuunrespons optreedt tegen longkanker die men met immunotherapie kan opdrijven. In deze scriptie wordt de huidige evidentie weergegeven die aantoont dat het menselijke immuunsysteem in staat is NSCLC te detecteren en er een antitumorale immuunrespons tegen op te bouwen. Dit blijkt enerzijds uit een aantal opmerkelijke klinische fenomenen en anderzijds uit het feit dat infiltratie van de longtumor met cellen van het immuunsysteem gerelateerd is aan een betere prognose. De evidentie hierrond wordt voor elke cel apart besproken. De belangrijkste component van de antitumorale immuunrespons is zonder twijfel de cellulaire immuunrespons. Hierin spelen niet alleen CD8+ cytotoxische T-cellen maar ook CD4+ T-helper cellen en dendritische cellen een cruciale rol. De cellulaire immuunrespons vertrekt van de tumorantigenen die voorkomen bij NSCLC. Deze worden uitvoerig besproken in het eerste deel van de scriptie. Niet alle tumorantigenen zijn echter even goede kandidaten voor vaccinatietherapie. De antitumorale immuunrespons wordt in klinische longtumoren echter omzeild en zelfs onderdrukt door de tumor. De tumor ontwikkelt door immunoselectie mechanismen om te ontsnappen aan het immuunsysteem en ontwikkelt zelfs immunosuppressieve mechanismen. In de tumoromgeving heerst hierdoor een immunosuppressief klimaat dat de antitumorale immuunrespons hindert. Bij longkanker zorgen voornamelijk dysfunctionele dendritische cellen en regulatoire T-cellen voor het ondermijnen van de natuurlijke immuunrespons. Het totnogtoe beperkte succes van immunotherapie is voor een deel te wijten aan tumor immunosuppressie; zelfs al kan een tumorvaccin bv. een T-cel respons opwekken, dan nog zal de invloed hiervan op de tumor beperkt blijven als T-cellen lokaal worden uitgeschakeld door de immunosuppressieve tumoromgeving. Dat de antitumorale immuunrespons bij longkanker een brede basis voor immunotherapie biedt is duidelijk. Er zijn echter nog een aantal hindernissen voor immunotherapie: één van de uitdagingen voor de toekomst is het combineren van immunotherapie gericht op het opwekken van een werkzame immuunrespons met een therapie die de immunosuppressieve cellen en mechanismen tegengaat.

1

2. I NLEIDING 1. Epidemiologie Longkanker is wereldwijd de derde meest voorkomende kanker met 1,6 miljoen nieuwe gevallen elk jaar. Het is bovendien ook de kanker de hoogste mortaliteitscijfers: 1,4 miljoen overlijdens jaarlijks (1). Bij Belgische mannen is longkanker de tweede meest frequente kanker na prostaatkanker. Bij vrouwen is het de derde meest voorkomende, de incidentie bij vrouwen neemt echter toe. Bij mannen is longkanker bovendien de belangrijkste oorzaak van kankersterfte en bij vrouwen de op één na belangrijkste, na borstkanker. In België worden jaarlijks meer dan 7000 nieuwe diagnosen van longkanker gesteld en overlijden jaarlijks 6400 personen aan longkanker. Dit zijn voor beide cijfers drie maal meer mannen dan vrouwen (2). Longkanker wordt onderverdeeld in 2 types die van elkaar verschillen wat behandelmogelijkheden en prognose betreffen: 85% van de longkankers zijn non-small cell lung cancer (NSCLC) en 15% small cell lung cancer (SCLC). NSCLC wordt op zijn beurt onderverdeeld in adenocarcinoom, plaveiselcelcarcinoom en grootcellig carcinoom (2). Deze scriptie behandelt uitsluitend NSCLC. Over het algemeen is de 5-jaarsoverleving van longkanker slechts 15%. De hoge mortaliteitsgraad heeft enerzijds te maken met het feit dat meer dan 60% van alle longkankers in een prognostisch slecht stadium (Stadium III of IV) worden vastgesteld (3, 4). In dit stadium is longkanker slecht behandelbaar met de huidige therapieën. Anderzijds is de prognose ook in een vroeg stadium niet gunstig: de 5-jaarsoverleving voor patiënten met een operabele longtumor van het type NSCLC is slechts 50% (5). Hieronder zijn deze gegevens in tabel 1 weergegeven: de distributie van de stadia is voor patiënten gediagnosticeerd tussen 1998 en 2006 (4); de stadiëring is (nog) volgens de 6e editie van de TNM classificatie (5).

Tabel 1 Stadium bij diagnose

Kenmerken van het stadium

Distributie van de stadia (4)

5-jaarsoverleving (5)

IA

Kleine tumor zonder uitzaaiing

26%

50%

IB IIA

40% Uitzaaiing naar lymfeklieren in de long aan dezelfde kant van de tumor

8%

IIB IIIA IIIB IV

24% 25%

Uitzaaiing naar lymfeklieren in het mediastinum of in de contralaterale long

28%

Metastase naar andere organen

38%

18% 8% 2%

2

2. Tumorclassificatie en -stadiëring bij NSCLC Tot voor kort werd voor de stadiëring van tumoren nog de 6e editie van de TNM classificatie gebruikt, die voor de stadiëring van NSCLC dezelfde richtlijnen gebruikte als de 5e editie uit 1997 (6). Aan de basis van de toenmalige richtlijnen lag een relatief kleine database van 5319 patiënten (7). In 2009 verscheen de 7e editie van de TNM classificatie voor maligne tumoren (8). Hierin zijn de richtlijnen voor classificatie van NSCLC herzien opdat het klinisch stadium beter de prognose van de ziekte zou weerspiegelen. Ze zijn gebaseerd op resultaten voortgekomen uit het Lung Cancer Staging Project dat in 1998 opgestart werd door de International Association for the Study of Lung Cancer (IASLC) (5). De 7e TNM classificatie werkt als volgt; de ‘T’ variabele beschrijft de grootte en lokale uitbreiding van de primaire tumor (tumour), uit ‘N’ leiden we af of er uitbreiding naar regionale lymfeklieren is (lymph node) en hoe ernstig deze is. ‘M’ tenslotte wijst op de verspreiding naar de contralaterale long, naar de pleura of naar andere organen (metastasis) (5, 9). De verschillende TNM klassen worden vervolgens gegroepeerd in klinische stadia op basis van een gelijkaardige overleving van verschillende TNM klassen. De verschillende stadia zijn IA, IB, IIA, IIB, IIIA, IIIB en IV. De nieuwe stadiëring groepeert, zowel door wijzigingen in de TNM classificatie als door wijzigingen in de indeling in klinisch stadium, longtumoren beter dan tevoren naar prognose. Het belang hiervan is dat de TNM classificatie en het klinisch stadium waarin longcarcinomen worden ingedeeld belangrijke implicaties hebben naar de behandeling toe (5, 9). Voor een gedetailleerde beschrijving van de TNM classificatie en indeling in klinische stadia verwijzen we naar het artikel van Goldstraw et al. (5) en dit door Detterbeck et al. (9).

3. De standaardbehandeling van NSCLC De huidige beste behandeling van NSCLC is chirurgie, alleen of in combinatie met chemo- en/of radiotherapie. Veel patiënten komen hier echter niet voor in aanmerking. De resultaten van de standaard behandelingen zijn, behalve voor zeer gelokaliseerde tumoren, erg teleurstellend (10, 11). 3.1. Chirurgie Voor longkanker die beperkt is tot de long en de omliggende lymfeknopen (stadium IA tot IIB en sommige stadium IIIA tumoren) is een chirurgische resectie de standaardtherapie, op voorwaarde dat de algemene toestand van de patiënt een dergelijke operatie toelaat. De operatie bestaat uit een lobectomie of pneumectomie met verwijdering van de drainerende lymfeknopen. Chirurgie biedt voor patiënten met een gelokaliseerde tumor de beste kans op genezing: er wordt een sterk verbeterde overleving gezien wanneer men opereert. Hoe vroeger bovendien het stadium en hoe kleiner de tumor, hoe beter de overleving is (10-12). 3.2. Chemo- en radiotherapie Weinig patiënten komt echter in aanmerking voor chirurgie omdat ze presenteren met een gevorderde tumor en velen ervaren alsnog recidief na chirurgie. Dit is wellicht te wijten aan de aanwezigheid van micrometastasen, dit zijn uitzaaiingen in de longen die zo klein zijn dat men ze niet kan detecteren. 3

Om de recidiefkans te verkleinen kan postoperatieve (adjuvante) chemotherapie gebeuren na resectie van de tumor. Bij een onvolledige resectie kan ook postoperatieve radiotherapie gebeuren. Neoadjuvante chemotherapie kan voorafgaand aan de operatie gegeven worden en heeft de bedoeling om naast eradicatie van micrometastasen de tumor te verkleinen vooraleer men overgaat tot chirurgie. Bij tumoren die men niet kan opereren (vooral stadium III) wordt concomitante chemoradiotherapie gegeven, voor sommige van deze tumoren voorafgegaan door radicale radiotherapie. Niet alle tumoren reageren echter even goed op chemo of radiotherapie; vooral recidieven en gevorderde tumoren zijn chemo- en/of radioresistent: een behandeling met chemo- of radiotherapie selecteert immers chemoen radioresistente cellen uit die vervolgens het recidief veroorzaken (10, 11, 13, 14). 3.3. Palliatie Bij stadium IV gemetastaseerde longtumoren is een palliatieve behandeling met chemotherapie de regel; deze kan de overleving met een aantal maanden verlengen. Een kleine groep patiënten komen ook in aanmerking voor behandeling met EGFR tyrosine kinase inhibitoren (TKI): bij deze behandeling wordt soms een initieel spectaculaire respons gezien maar ontstaat niet zelden toch therapieresistentie. Er bestaan ook doelgerichte therapieën tegen VEGF (10, 11, 13, 14).

4. Immunotherapie Ondanks een aantal evoluties in de therapie van NSCLC is de prognose nog steeds zeer slecht: de 5jaarsoverleving voor longkanker in het algemeen is 15%. Vooral voor de grote groep patiënten die niet in aanmerking komt voor chirurgie (zie tabel 1) is er weinig kans op genezing. Deze patiënten, maar ook patiënten die wel geopereerd kunnen worden, hebben baat bij de ontwikkeling van nieuwe therapieën

zoals

immunotherapie.

De

voordelen

van

immunotherapie

over

de

huidige

standaardtherapieën zijn talrijk: ze is niet afhankelijk van celproliferatie (zoals chemo- en radiotherapie) voor haar effect; ze is doelgericht: d.w.z. dat ook micrometastasen worden aangevallen en dat bijwerkingen door destructie van gezond weefsel in principe zeldzaam zouden zijn; immunotherapie is ook niet afhankelijk van 1 bepaalde mutatie (zoals EGFR TKI’s), er is daarentegen een heel repertoire aan doelwitten (antigenen) voor handen; daarnaast heeft de cellulaire immuunrespons ook een geheugen o.v.v. memory T-cellen: deze kunnen eventuele recidieven beperken. Er zijn evenwel ook nadelen: de meeste tumoren hebben tijdens hun groei immunosuppressieve mechanismen ontwikkeld (zie verder), waardoor vaccinatie bij patiënten met een aanwezige klinische tumor moeilijker respons kan opwekken. Vaccinatie kan wel toegepast worden ná de klassieke behandeling om recidiefkansen te verkleinen. Voor het ontwikkelen van immunotherapieën is het essentieel om te weten welke immuuncellen kunnen gerekruteerd worden om een immuunrespons tegen longkanker op te wekken en om te weten op basis van welke antigenen een effectieve T-cel respons tegen longkanker kan opgewekt worden. Daarnaast is het belangrijk te weten of er een spontane immuunrespons tegen longkanker bestaat en welke cellen en antigenen hierin een rol spelen: immunotherapieën gebruiken immers mechanismen 4

die al in het lichaam aanwezig zijn en kunnen deze boosten. Dat een immuunrespons tegen longkanker weldegelijk bestaat blijkt uit een aantal klinische fenomenen zoals bv. de verhoogde incidentie van longkanker bij immuungedeprimeerden en uit het feit dat longtumoren geïnfiltreerd worden door talrijke immuuncellen. Een longtumor groeit dus niet in een vacuüm, maar binnen een immuunsysteem –hetwelk evenwel faalt. Deze scriptie tracht een overzicht te geven van de rol van de gekende spelers in de antitumorale immuunrespons tegen NSCLC en van de antigenen bij NSCLC waartegen een cellulaire immuunrespons kan opgewekt worden of zelfs al in vivo is waargenomen.

3. M ETHODOLOGIE Voor de verzameling van gegevens werden zowel PubMed, ISI: web of science, Google scholar, als de Li-Hub search van Ugent databases gebruikt. Gegevens werden verzameld van september 2010 tot november 2011. Daarna werd de thesis geschreven en werden slechts occasioneel nog nieuwe referenties bijgenomen. De zoektermen waren steeds gericht op het terugkrijgen van zo veel mogelijk relevante en zo weinig mogelijk irrelevante literatuur i.v.m. het betreffende onderwerp. Wat de besproken cellen betreft werd steeds eerst gezocht naar reviewartikelen die de functie van een bepaalde cel in de tumor immunologie belichtten. Google Scholar en ISI: web of science waren hiervoor onmisbare zoekmachines vanwege de mogelijkheid om artikels te rangschikken naar “times cited”. Voor de gerichte opzoekingen naar data specifiek i.v.m. NSCLC werd zowel in pubmed als in google Scholar en ISI:web of science gezocht. Aan de desbetreffende zoektermen werd dan “AND (NSCLC OR “lung cancer”)” toegevoegd omdat deze combinatie van zoektermen op pubmed de andere mogelijke zoektermen (zoals de Mesh term voor NSCLC) overkoepelde. Voor de screening van gekende tumorantigenen op immunogeniciteit bij longkanker werd de database van Van den Eynde et al. als vertrekpunt genomen (15). Elk artikel vernoemd in deze database werd eerst bekeken en onderzocht op evidentie voor het voorkomen van een bepaald antigen bij NSCLC en daarna werd gekeken of de cytotoxische T-cellen (CTL) opgewekt in de studie ook uitgetest werden op longtumorcellen. Indien dit zo was werd dit beschouwd als bewijs dat het antigen gepresenteerd wordt in (sommige) longkankers en werd het artikel opgenomen in de referenties en het antigen besproken. Verder werd elk van de moleculen uit de database gebruikt als zoekterm in Pubmed. Hiervoor werden de Mesh-term voor de molecule én de plain text term voor de molecule gecombineerd met “AND (NSCLC OR “lung cancer”)”. Dit werd gezocht in Pubmed. Indien de met deze search bekomen resultaten nog te weinig specifiek of te talrijk waren werd de zoekregel verfijnd met één of meerdere van de volgende termen: t-cell / t cell / lymphocyte / CTL / TIL / immunity / immune response / cytotoxic / b-cell / b cell / CD4+ / CD8+. Of met de volgende Mesh-termen: “Immune System Phenomena”, “Immune System”, “Immune System Processes”, “Immunity” of subheadings daarvan. 5

4. R ESULTATEN I. Geschiedenis De respons van ons immuunsysteem op kankercellen wordt al geruime tijd onderzocht. Op vandaag zijn de mechanismen van de antitumorale immuunrespons dan ook vrij goed bestudeerd en beschreven. Men dacht vroeger nochtans dat het onmogelijk zou zijn een immuunrespons tegen kanker op te wekken zonder hierbij schade aan normale weefsels te veroorzaken. In zijn review over tumor immunologie stelde Woglom in 1929: “It would be as difficult to reject the right ear and leave the left ear intact as it is to immunize against cancers” (16, 17). In 1985 kwam er echter weer hoop voor het vakgebied toen Rosenberg et al. aantoonden dat toediening van hoge dosissen interleukine-2 (IL-2 is essentieel voor de rijping van T-cellen) tot regressie van solide tumoren kon leiden bij bepaalde patiënten (18). Het bestaan van tumor-reactieve T-cellen werd vervolgens in 1989 bij melanoom bevestigd door Van Den Eynde et al. (19): perifere lymfocyten van een patiënt met melanoom werden samen met tumorcellen uit een biopsie van het melanoom in kweek gebracht en T-cel groeifactor IL-2 werd toegevoegd. Hieruit ontstonden tumor specifieke T-cel klonen die men vervolgens van elkaar kon scheiden en verder kon laten prolifereren. Tenslotte bevestigde men voor de afzonderlijke klonen (in vitro) dat ze effectief tumorcellen konden vernietigen. Later werd door dezelfde groep één bepaald tumorantigen bepaald. Het werd melanoma antigen I of MAGE-I genoemd (20).

II. Tumorantigenen Het begrip “tumorantigenen” omschrijft een omvangrijke en heterogene groep eiwitten die voorkomen in

tumorcellen. Alle eiwitten in normale maar ook in neoplastische cellen worden door het

proteasoom van die cellen afgebroken tot korte aminozuurketens: peptiden. Deze peptiden kunnen vervolgens door MHC (major-histocompatibility-complex) klasse I moleculen op het oppervlak van de cel zelf en op antigen presenterende cellen (APC) zoals dendritische cellen (DC) gepresenteerd worden aan T-cellen (21). Niet alle antigenen komen voor bij longkanker en niet alle antigenen wekken een immuunrespons op. Expressie van tumorantigenen verschilt echter niet alleen tussen longkanker en andere kankers maar ook tussen individuele longkankerpatiënten en zelfs tussen tumorcellen (22). Er zijn dus ook verschillen in antigenexpressie tussen de histologische NSCLC types: adenocarcinoom, plaveiselcelcarcinoom en grootcellig carcinoom. De tot op heden geïdentificeerde tumorantigenen zijn in te delen in 2 groepen: enerzijds zijn er de tumorantigenen waartegen een antilichaamrespons optreedt die toelaat het antigen serologisch te merken en te identificeren. Hiertoe behoren ook tumorantigenen die gebruikt worden als tumormerkers in de diagnostiek van kanker. Deze antigenen worden weergegeven in de SEREX database: deze bevat meer dan 2000 tumorantigenen en is online te vinden op http://www.cancerimmunity.org/SEREX/ (23). Wellicht is echter niet zozeer de humorale maar eerder de cellulaire immuunrespons 6

verantwoordelijk voor rejectie van tumoren (17). Uit een recente review blijkt dat de aanwezigheid van antilichamen tegen tumorantigenen voor sommige antigenen positief en voor andere negatief correleert met de prognose van de patiënt. Bovendien is de humorale immuunrespons vaak tegen andere epitopen dan de cellulaire gericht. Men concludeert dat de humorale immuunrespons waarschijnlijk geen belangrijke functionele rol speelt in de afweer tegen tumoren en dat antilichamen gevonden tegen tumorantigenen louter de mate waarin het immuunsysteem aan dat antigen werd blootgesteld weerspiegelen (24). Anderzijds vinden we een groep antigenen waarvoor bewijsmateriaal van een CD4+ of CD8+ T cel respons bestaat: de T-cell defined tumor antigens (15). Deze antigenen zijn bijzonder interessant omdat ze in staat zijn een T-cel respons op te wekken die kan gebruikt worden door immunotherapieën of vaccins. Voor sommige antigenen is er geen evidentie voor een spontane immuunrespons, maar is wel een respons na vaccinatie gedocumenteerd. In dit deel wordt dieper ingegaan op de tumorantigenen aanwezig bij longkanker die in staat zijn een T-cel respons op te wekken (zie figuur 1.). Wanneer een dergelijke spontane immuunrespons

Antigenen bij longkanker

Longkankerantigenen met immunogeniciteit

Tumorantigenen met immunogeniciteit (immunogenen)

Figuur 1.

gevonden wordt zou het in principe mogelijk zijn deze te gebruiken voor immunotherapieën of vaccins. Van deze antigenen is er een subgroep waarvoor reeds trials in immunotherapie uitgevoerd zijn. Deze trials worden verderop bij het betreffende antigen vermeld. Antigenen die geen T-cel respons opwekken worden niet vernoemd. Sommige belangrijke antigenen waarvoor nog geen evidentie van een T-cel respons bestaat in longkanker maar wel in andere kankers en die daarenboven ook voorkomen bij longkanker worden kort vermeld. Vanuit het standpunt van “evidentie voor antitumorale immuunresponsen bij longcarcinoom” wordt echter de nadruk gelegd op antigenen waartegen een T-cel respons in longkanker werd gezien omdat het essentieel is te weten of het antigen van nature verwerkt wordt (door het proteasoom) en gepresenteerd kan worden (door MHC) in longtumorcellen.

Ons immuunsysteem herkent twee verschillende types tumorantigenen: tumor-specifieke antigenen en tumor-geassocieerde antigenen. Het zijn peptiden van een tumor-specifiek of tumor-geassocieerd eiwit die gepresenteerd worden op MHC I op het tumorceloppervlak. Met uitzondering van de antigenen van virale oorsprong zijn alle tumorantigenen in feite “self”-peptiden. De twee types tumorantigenen 7

kunnen verder onderverdeeld worden in verscheidene klassen (21, 25-32). Het belang van deze indeling is dat het expressiepatroon van een antigen bepaalt of het bruikbaar is voor immunotherapie. In de onderstaande opsomming werd geprobeerd alle antigenen tot op heden geïdentificeerd op te nemen (zie methodologie) maar er werden er zeker een aantal gemist. Een belangrijk hulpmiddel hiervoor was de database van Van den Eynde et al. (15). Voor de meeste tumorantigenen herkend door T-cellen heeft men deze T-cellen in vitro opgewekt door lymfocyten te stimuleren met tumorcellen of met antigen presenterende cellen (APC) die een peptide van het relevante antigen presenteren. Het is belangrijk dat hierna wordt bevestigd dat deze T-klonen ook de autologe tumorcellen herkennen en kunnen vernietigen. Hierdoor kan men zeker zijn dat de tumorcellen (hier NSCLC) het relevante peptide ook daadwerkelijk kunnen verwerken en presenteren. Een ander belangrijk gegeven is het HLA (human leukocyte antigen) waarop een specifiek peptide van een tumor antigen wordt gepresenteerd. HLA-A, B en C zijn componenten van het MHC klasse IA, B of C complex dat op elke kernhoudende cel teruggevonden wordt. MHC I presenteert in deze context antigenische peptiden voor herkenning door CD8+ cytotoxische T-cellen (CTL). MHC I op dendritische cellen speelt een rol in het selecteren van een CD8+ T-cel kloon om te doen prolifereren in de lymfeknoop of in tertiaire lymfoïde structuren rondom de longtumor. HLA-DR en -DQ bouwen het MHC klasse II complex op dat uitsluitend op APC’s en lymfocyten voorkomt. In de context van longkanker speelt het een rol in het opvoeden van CD4+ T-cellen tegen tumorantigenen (33-35). Het is belangrijk te weten dat welbepaalde peptiden gepresenteerd worden door welbepaalde HLAhaplotypen, die inter-individueel verschillend zijn. De meeste studies vermelden van welk HLA de herkenning van tumorcellen door cytotoxische T-cellen (CTL) afhankelijk was. Heel veel studies beschrijven zo HLA-A2-afhankelijke peptiden uit tumor antigenen omdat HLA-A2 het meest frequente MHC I type is in de algemene populatie. Er is echter toenemende evidentie dat veel tumorantigenen door zowel klasse-I als klasse-II complexen en door verschillende HLA-haplotypes gepresenteerd kunnen worden en dus aanleiding kunnen geven tot zowel CD4+ als CD8+ T-cellen (15, 33). Daarom werd geopteerd om het type HLA niet in de onderstaande opsomming te vermelden. Hiervoor wordt verwezen naar de respectievelijke studies, naar de review door Novellino (33) en de eerder aangehaalde database (15).

A. Tumor-specifieke antigenen Dit zijn moleculen die zeer specifiek zijn voor kankercellen, wat wil zeggen dat ze in geen enkele normale cel zullen voorkomen in de vorm waarin ze in kankercellen voorkomen (21).

1. Gemuteerde antigenen 1.1. Wat zijn gemuteerde antigenen? Gemuteerde tumorantigenen zijn eiwitten die in alle cellen van het beftreffende weefsel voorkomen maar die in de kankercel mutaties ondergaan hebben. Vaak gaat het om puntmutaties. Deze mutaties 8

kunnen al dan niet bijgedragen hebben tot de carcinogenese. Meestal gaat het om unieke mutaties maar bij tumor suppressor eiwitten, die zeer vaak gemuteerd zijn in kankercellen, worden specifieke mutaties soms meermaals teruggezien (25, 26, 28). Voorbeelden zijn p53, K-Ras en EGFR. Dit type antigen speelt een rol bij NSCLC.

1.2. Gemuteerde antigenen bij longkanker Hoewel mutaties van EGFR en K-Ras meer dan mutaties van p53 voorkomen bij NSCLC werd er geen CTL respons tegen gevonden in NSCLC. Er werd wel een CTL respons gevonden tegen overexpressie van EGFR en K-Ras: deze wordt verderop besproken. 1.2.1. Mutaties van p53 P53 is een belangrijk tumor suppressor proteïne dat gecodeerd wordt door het TP53 gen. p53 ontleent zijn bijnaam “guardian of the genome” aan zijn capaciteit om DNA te repareren. Mutaties in p53 vormen dan ook een belangrijke stap in de carcinogenese van de meeste kankers en worden gezien in 50% van de longtumoren (36). Dat p53 mutaties zo veel voorkomen maken hen een interessant doelwit voor immunotherapie, zeker aangezien deze mutaties vooral gezien worden bij tumoren die resistent aan chemo- en radiotherapie zijn (37). De gevonden mutaties verschillen echter tussen individuele tumoren en weerspiegelen de exo- en endogene factoren die bijdragen aan de carcinogenese (38). p53 mutaties komen in longkanker vaker voor in plaveiselcelcarcinoom dan in adenocarcinoom, maar ze zijn alleen in deze laatste gecorreleerd met een slechtere prognose (36). Wild-type p53 komt in alle cellen op een zeer laag niveau tot expressie en heeft een korte halfwaardetijd. De meeste p53 mutaties stabiliseren het eiwit en verlengen de halfwaardetijd, het stapelt zich hierdoor op in de celkern: er is dus sprake van overexpressie van het gemuteerd p53 (36). Niet alle p53 mutaties in longkanker leiden echter tot opstapeling van het eiwit (39, 40). Naast mutatie van p53 komt ook overexpressie van wild-type p53 voor (door mutaties in de nietcoderende regio van het TP53 gen) (36, 41). Om een CTL respons tegen p53 correct te kunnen categoriseren moeten we weten tegen welk peptide de T-cel receptor (TCR) van de gevonden CTL’s gericht is. Een aantal studies (niet bij longkanker) illustreren dat dit niet altijd duidelijk is. Azuma et al. vonden dat een gemuteerd p53 in colonkanker dat accumuleerde in de celkern een CTL respons opwekte die gericht was tegen een niet-gemuteerd peptide (37). Houbiers et al. konden in vitro een CTL respons opwekken op tegen zowel wild-type overexpressed als gemuteerd p53 (42). Fujita et al. vonden dat bepaalde CD4+ T-cel klonen zowel wild-type als gemuteerd p53 konden herkennen (43). Ito et al. vonden twee mutaties die CTL’s konden opwekken die zowel gemuteerd als wild-type p53 herkenden en één mutatie die een CTL kloon opwekte die specifiek gemuteerd p53 herkende (44). Het is dus niet eenvoudig om een CTL kloon met zekerheid in te delen als gericht tegen een mutatie in p53 dan wel tegen p53 overexpressie (zeker omdat sommige CTL’s de beide types herkennen) maar de beiden komen voor. Ook een humorale immuunrespons tegen p53 is niet ongewoon; zowel antilichamen tegen gemuteerd als tegen 9

wild-type overexpressed p53 komen voor. Anti-p53 antilichamen worden in 7 tot 27% van de longkankers gevonden (45, 46). Twee studies tonen CTL cytotoxiciteit in muizen aan tegen een p53 mutatie die ook voorkomt in NSCLC. Yanuck et al. (47) transplanteerden miltcellen met die p53 mutatie naar muizen en Ciernik et al. (48) deden hetzelfde met humane longkankercellen. Beiden zagen dat in de muizen een CTL respons werd opgewekt tegen gemuteerd p53 en dat deze CTL’s wild-type p53 niet herkenden. Daarnaast werden twee studies gevonden die ex vivo een CTL respons konden opwekken tegen gemuteerd p53 (dat zich opstapelde in de celkernen) (37, 49). Azuma et al. vonden een p53 mutatie bij een patiënt met longadenocarcinoom waarmee in vitro antigen-specifieke CTL’s konden opgewekt worden die cytotoxisch waren voor de tumorcellen. De CTL’s werden echter opgewekt door een nietgemuteerd peptide. Nochtans waren ze niet reactief tegen tumorcellen die de mutatie niet hadden (37). Ichiki et al. vonden bij een longkankerpatiënt met lange overleving dat ex vivo een CTL kloon kon opgewekt worden op basis van een gemuteerd peptide; de CTL’s waren cytotoxisch voor cellen met het gemuteerd p53. Men vond deze CTL kloon ook terug in tumorweefsel van de patiënt wat impliceert dat er ook in vivo een natuurlijke CTL respons kan bestaan tegen gemuteerd p53. Daarnaast werden antilichamen gezien tegen p53: humorale en cellulaire immuniteit tegen gemuteerd p53 kunnen dus in dezelfde patiënt naast elkaar bestaan. Hoewel de antilichamen ook reactief waren tegen wild-type p53 kon men geen CTL cytotoxiciteit tegen cellen met wild-type p53 detecteren. Het epitoop herkend door antilichamen bevatte dus niet de mutatie, terwijl de CTL kloon wél een epitoop met de mutatie herkende (49). Dezelfde patiënt vertoonde nog 2 andere CTL klonen: een CTL kloon tegen het overexpressie-antigen Tara (zie verder) (22) en een CTL kloon tegen een nog onbekend antigen (50). Anderzijds kan p53 in NSCLC ook op basis van overexpressie CTL responsen opwekken, maar dit wordt verderop besproken. P53 is dus een mogelijk doelwit voor immunotherapie. Barve et al. testten (fase II) een tumorvaccin dat 9 epitopen (waaronder 2 p53-mutaties) bevatte op 63 patiënten met gevorderde NSCLC. De patiënten kregen ook standaardtherapie. Het vaccin was veilig en de resultaten waren suggestief voor de werkzaamheid van dit vaccin: er was volledige regressie van een stadium IV NSCLC samen met krachtige CTL responsen tegen 7 epitopen bij één patiënt en partiële respons bij een andere patiënt bij wie de tumor later echter recidiveerde. Tegen één van de 2 p53 peptiden konden CTL’s gevonden worden in 60% van de patiënten. Men zag ook dat patiënten langer overleefden als zij responsen tegen meerdere gevaccineerde epitopen vertoonden (51).

1.2.2. Andere gemuteerde antigenen De meeste mutaties zijn uniek voor 1 individuele tumor en zijn daarom onaantrekkelijke doelwitten voor immunotherapie; studies zoals de onderstaande 5 zijn dan ook moeilijk reproduceerbaar. Alfa-actinine-4 is een eiwit dat in vele weefsels voorkomt. Echchakir et al. detecteerden een CTL kloon tegen een peptide van α-actinine-4 in het tumorinfiltraat van een longkankerpatiënt met lange 10

overleving. CTL herkenning van het antigen was afhankelijk van een zeldzame mutatie in het coderende gen ACTN4 die in geen van 50 andere longtumoren werd gevonden (52). Jaren na de tumor resectie kon de aanwezigheid van α-actinine-4 specifieke T-cellen in het bloed van de patiënt nog steeds aangetoond worden. Men heeft bij immunodeficiënte (SCID/NOD) muizen tumorcellen van de patiënt geïmplanteerd en bevestigd dat de CTL’s in vivo een antitumoraal effect hadden (53). Bij een andere patiënt met lange overleving werden in het bloed CTL’s gezien die tumorcellen herkenden op basis een peptide gecodeerd door een gemuteerd malaatenzym (ME1) gen (54). Hogan et al. vonden tumor-specifieke CTL’s tegen een peptide gecodeerd door een gemuteerd elongation factor 2 (ELF2) gen in een longplaveiselcelcarcinoom. Wellicht ging het om een zeldzame mutatie (55). Takenoyama et al. zagen een CTL respons in een patiënt met NSCLC tegen een vermoedelijk unieke mutatie in het gen coderend voor NF-Y-C. CTL’s werden gevonden in de drainerende lymfeknoop van de tumor en herkenden de tumorcellen o.b.v. dit antigen (56). DeltaNp73α (DNp73α of ΔNp73α), een getrunceerde vorm van p73α (verkort aan het N-uiteinde) is een tumor-specifiek antigen: het komt in geen enkel normaal weefsel voor maar wel in tumoren, o.a. in longkanker. Hu et al. konden met DC’s getransduceerd met ΔNp73α CTL’s opwekken die cytotoxisch waren voor o.a. ΔNp73α+ longtumorcellen. P73 is een lid van de p53 familie maar de verkorte vorm ΔNp73α speelt in tumoren een rol als inhibitor van wild-type p53 en expressie van het antigen is gecorreleerd met een slechte prognose (57).

2. Antigenen van virale oorsprong Dit zijn eiwitten die voorkomen in cellen geïnfecteerd met oncogene virussen. Het zijn de enige tumorantigenen die geen “self”-antigenen zijn (25, 30, 32). Voorbeelden zijn E6 en E7 bij humaan papillomavirus (HPV) en EBNA1 bij Eppstein-Barr virus (EBV). Tumorantigenen van virale oorsprong spelen geen rol in de antitumorale immuunrespons tegen NSCLC.

B. Tumor-geassocieerde antigenen (TAA’s) Dit zijn moleculen die ook voorkomen bij normale cellen maar een abnormale expressie kennen in kankercellen. Ze zijn dus niet specifiek voor tumorcellen (21).

1. Cancer-testis antigenen (CTA) 1.1. Wat zijn Cancer-testis antigenen? Cancer-testis antigenen, ook wel “Shared tumor-specific antigens” genoemd zijn moleculen die natuurlijk voorkomen in weefsels die afgeschermd zijn van het immuunsysteem: dit is voornamelijk de testis (testiculaire kiemcellen) maar ook de placenta of het oog. In andere weefsels is uiteraard wel DNA aanwezig voor codering van deze moleculen, maar de expressie ervan ligt stil (vaak door epigenetische mechanismen zoals promotor-methylatie). In kankercellen kan de productie van deze 11

moleculen weer aangeschakeld worden, leidend tot ectopische expressie van de molecule: zo kunnen ze een T-cel respons opwekken (27, 28, 30, 32). Deze is evenwel niet schadelijk voor spermatocyten en spermatogonia, omdat deze geen MHC klasse I of II vertonen kunnen ze enerzijds niet zelf een immuunrespons opwekken en anderzijds niet herkend worden door CTL’s. Ze zijn met andere woorden afgeschermd van het immuunsysteem. Dat er geen auto-immuunreactie kan optreden maakt dat ze tumor-specifiek zijn en maakt hen zeer aantrekkelijk als doelwitten voor immunotherapie (15, 33). CTA’s zijn in tegenstelling tot bv. weefseldifferentiatie antigenen wél goede kandidaten voor opwekken van een immuunrespons, omdat het immuunsysteem er immers nog niet tevoren aan is blootgesteld (27, 28, 30, 32). Bij melanomen werden eerst 3 families CTA’s omschreven: MAGE, BAGE en GAGE. Later ontdekte men nog meer CTA’s bij melanoom maar ook bij andere carcinomen. Voorbeelden zijn NY-ESO-1, SAGE, SSX2, etc. CTA’s komen ook voor in NSCLC en hun expressie is in NSCLC gelinkt aan een slechtere prognose (58-60). Hoewel veel CTA’s frequent voorkomen in NSCLC, is nog maar zelden spontane CTL activiteit ertegen gedetecteerd in tumorinfiltrerende lymfocyten (TIL) van NSCLC patiënten die niet met immunotherapie behandeld werden (61).

1.2. Cancer-testis antigenen bij longkanker 1.2.1. De MAGE-familie MAGE-A1 is het eerste ontdekte tumorantigen waartegen (bij melanoom) een T-cel respons gezien werd (32, 62). De leden van de MAGE-familie die ondertussen geïdentificeerd zijn zijn talrijk en velen komen ook voor bij NSCLC. Mage-A1, 2, 3, 4, 6, 10 en 12 komen allen frequent voor in NSCLC (6365). MAGE-C2, -C3, -B2 en -B6 worden minder vaak gezien (65, 66). MAGE-A1, 3 &-B2 worden al zeer vroeg in de carcinogenese van longkanker geactiveerd; expressie kan gezien worden in longweefsel van rokers zonder longkanker (65). MAGE-A3 is een veel voorkomend CTA (bij 40% van alle longkankers) wat het aantrekkelijk maakt voor immunotherapie, zeker ook omdat expressie ervan gerelateerd is aan een slechte prognose (58, 63, 67). Eifuku et al. toonden dat CTL’s geïnduceerd tegen een MAGE-A3 peptide longkankercellen die MAGE-A3 presenteerden konden herkennen en doden, wat suggereert dat dit peptide gebruikt kan worden voor immunotherapie (68). Tsuji et al. vonden MAGE-A3 specifieke CD4+ T-cellen in longkankerpatiënten na vaccinatie tegen MAGE-A3 (69). Atanackovic et al. konden met een MAGEA3 vaccin bij NSCLC patiënten antigenspecifieke antilichamen, CD4+ en CD8+ T-cellen induceren (70). In een vervolgtrial gaven zij patiënten die 3 jaar na de initiële vaccinatie nog tumorvrij waren nieuwe booster vacccinaties met MAGE-A3. Er werd gezien dat bij patiënten die het antigen samen met een adjuvans kregen toegediend de antilichaamtiters weer piekten en het spectrum van MAGE-A3 epitopen herkend door de T-cellen wijder werd. Dit was niet zo voor patiënten die het vaccin zonder adjuvans hadden gekregen. Hiermee toonde men dat er een immunologisch geheugen tegen MAGEA3 kan opgewekt worden met vaccinatie en dat toevoeging van adjuvantia hierbij belangrijk is (71). 12

Zo werd na een fase II studie die veiligheid en werkzaamheid toonde (72) ook de eerste grote fase III longkanker immunotherapie trial: de MAGRIT-trial, opgebouwd rond MAGE-A3 vaccinatie met een specifiek adjuvans. Deze trial is momenteel lopend (73). Karanikas et al. vonden dat er zowel in gezonde individuen als in longkankerpatiënten spontaan CTL’s tegen MAGE-A3 voorkomen en meer in patiënten dan in gezonde individuen (74). Groeper et al. vonden in de TIL van een longkankerpatiënt spontaan ontstane CD8+ T-cellen tegen een MAGE-A10 peptide. Dit is een zeldzaam gegeven; de meeste CTA’s wekken in NSCLC geen spontane immuunrespons op ondanks hun frequente voorkomen (61). Een andere studie vond een antigenisch peptide dat gecodeerd werd door verschillende MAGE genen. CTL’s opgewekt tegen dit peptide konden onder andere longkankercellen die één van de relevante MAGE antigenen bezaten herkennen en doden. Dit peptide zou interessant kunnen zijn voor vaccinatie omdat het door meerdere antigenen gecodeerd wordt (75). Alle andere MAGE antigenen die voorkomen bij longkanker (63, 66) en een CTL respons opwekken bij andere kankers zijn uiteraard ook kandidaten voor T-cel inductie bij longkanker, maar er werden geen studies gevonden die een spontane respons aantoonden, noch studies die respons na vaccinatie aantoonden. We kunnen dus besluiten dat spontane T-cel responsen tegen antigenen uit de MAGE familie zeldzaam zijn en dat het MAGE-A10 peptide gevonden door Groeper et al. het enige dergelijke geval is van een spontane immuunrepsons (61). MAGE-A3 komt op een groot aantal longtumoren voor en is daarom een aantrekkelijk doelwit voor immunotherapie. Een fase III trial naar MAGE-A3 vaccinatie voor NSCLC is lopende (73).

1.2.2. NY-ESO-1 NY-ESO-1 (ook wel LAGE-2 genoemd) (76) en LAGE-1 (77) zijn 2 verwante CTA’s die o.a. voorkomen in NSCLC en die een CTL respons kunnen opwekken bij melanoom (78, 79). In vitro opgewekte CD8+ T-cellen tegen NY-ESO-1 konden ook longkankercellen herkennen en doden (80). Knights et al. vonden memory CD8+ T-cellen in het bloed van longkankerpatiënten die tevens een humorale immuunrespons tegen NY-ESO-1 hadden (81) (Antilichamen tegen NY-ESO-1 komen voor bij ongeveer 20% van de longkankers (82)). Het ging om een polyclonale respons aangezien de cellen verschillende TCR’s hadden waarmee ze het antigen herkenden. Na vaccinatie met een NY-ESO-1 vaccin konden nog meer CD4+ en CD8+ T-cel klonen tegen NY-ESO-1 gevonden worden (81). Er is ook een case beschreven waar men bij een patiënt met longkanker een geïntegreerde CD4+ en CD8+ T-cel respons en een IgG respons detecteerde tegen NY-ESO-1 die samenging met spontane regressie van pleurale metastasen. Na 3 jaar tumor “equilibrium” nam het aantal T-cellen en antilichamen tegen NY-ESO-1 af en tegelijk nam het aantal regulatoire T-cellen (Tregs) toe. De tumor van de patiënt nam vervolgens geleidelijk weer toe in omvang (83, 84). Dit is een rechtstreeks bewijs dat NY-ESO-1 in NSCLC spontane immuunresponsen opwekt die bovendien effect hebben op de tumor. NY-ESO-1 is dus zeker een kandidaat antigen voor immunotherapie bij longkanker. 13

1.2.3. XAGE XAGE-1 is een CTA dat voorkomt bij longkanker. Ali Eldib et al. vonden antilichamen tegen XAGE1b, het dominante transcript van het gen in longadenocarcinoom, in de sera van longadenocarcinoom patiënten. Andere minder voorkomende transcripten zijn XAGE-1a, c en d (85, 86). Dezelfde groep vond later ook een spontane CD4+ T-cel respons tegen longadenocarcinoom o.b.v. een XAGE-1b epitoop (87). Deze bevindingen maken XAGE-1b een geschikte kandidaat voor immunotherapie bij longadenocarcinoom. Kikuchi et al toonden vervolgens dat hoewel XAGE-1b expressie alleen niet gerelateerd was aan overleving, longadenocarcinoom patiënten met XAGE-1b en HLA-1 expressie samen een langere overleving hadden en bovendien meer tumor nest infiltrerende CD8+ T-cellen hadden. Patiënten met XAGE-1b expressie maar verlies van HLA-1 expressie hadden een kortere overleving. Opmerkelijk was dat bij adenocarcinomen die geen XAGE-1b vertoonden er geen verschil was in overleving tussen HLA-1 positieve en -negatieve tumoren. Dit zijn aanwijzingen in de richting van een spontane immuunrespons tegen XAGE-1b in longadenocarcinoom (88). PRAME is een TAA dat op de meeste normale weefsels niet tot expressie komt, behalve in de testis en in zeer beperkte mate in endometrium, ovaria en bijnieren (89). Omwille van de lage expressie in een aantal andere weefsels word het bij de overexpressie-antigenen besproken en niet hier.

1.2.4. Andere CTA’s die voorkomen bij longkanker Monji et al. vonden een nieuw CTA, KM-HN-1 dat onder andere voorkomt in longadenocarcinoom. CTL’s tegen dit antigen waren reactief tegen longkankercellen die het vertoonden (90). Fukuyama et al. een vonden nieuw CTA: Kita-kyushu lung cancer antigen 1 of KK-LC-1 in longadenocarcinoom waartegen ze CTL’s konden induceren na incubatie van lymfocyten uit regionale lymfeknopen van de patiënt met de tumorcellen. Het antigen werd gedetecteerd in 40% van de andere onderzochte longtumoren maar niet in normale weefsels behalve testis. De opgewekte CTL’s herkenden succesvol de kankercellen van de patiënt en herkenden ook andere longkankercellijnen (afhankelijk van welk HLA-haplotype die hadden) (91). Andere T-cell defined CTA’s zijn BAGE1 (92), CAGE1 (93), GAGE1 en 2 (19), SAGE (94), HAGE (94), cell division cycle associated gene 1 (CDCA1) (95) en Taxol resistance associated gene 3 (TRAG-3) (96). Ze komen voor bij NSCLC maar er werd geen evidentie gevonden dat CTL’s ertegen opgewekt cytotoxisch waren voor longtumorcellen. CTL’s ertegen vertonen wel cytotoxiciteit tegen andere types tumoren. Cancer-testis antigenen worden ook wel “shared tumor-specific antigen” genoemd omdat ze exclusief tot expressie komen in immunogepriviligeerde weefsels (zoals de testis) en in tumorcellen. Lengsin is een proteïne dat uitsluitend voorkomt in de lens, wat net zoals de testis zo’n immunogepriviligeerde site is. Het komt niet voor in de testis en is stricto sensu dus geen cancer-testis antigen, maar het is wel een “shared tumor-specific antigen”. Daarom wordt het hier vermeld. Nakutsagawa et al. vonden dat Lengsin ook ectopisch tot expressie komt in NSCLC. Het ging 14

meerbepaald om een lengsin splicing variant 4. Lengsin werd gevonden in elk histologisch type longtumor maar niet in andere tumoren noch in andere weefsels behalve het menselijk oog. Men vond in de sera van longkankerpatiënten antilichamen tegen lengsin en deze patiënten hadden geen oogsymptomen, wat bevestigt dat de lens afgeschermd zit van het immuunsysteem (97). Later vonden zij ook dat CTL’s konden geïnduceerd worden tegen 2 peptiden van lengsin. Deze CTL’s waren cytotoxisch voor lengsin+ longtumorcellen, wat lengsin een nieuw mogelijk doelwit maakt voor immunotherapie bij longkanker (98).

2. Weefseldifferentiatie antigenen 2.1. Wat zijn weefseldifferentiatie antigenen? Dit zijn antigenen die in bepaalde normale weefsels en ook in tumoren voorkomen en die de oorsprong van een tumor weerspiegelen. Dit maakt enerzijds dat de drempel voor het opwekken van een immuunrespons hoger is, en anderzijds dat een immuunrespons ertegen ook reageert tegen de normale weefsels (een auto-immuunreactie). Vitiligo bij melanomen wordt hierdoor veroorzaakt (27, 28, 30, 32). Voorbeelden zijn Tyrosinase bij melanoom, PSA bij prostaatcarcinoom en CD20 bij B-cel lymfoom. PSA en CD20 zijn veelgebruikte tumormerkers. Er werd geen evidentie gevonden voor de rol van weefseldifferentiatie TAA’s in de antitumorale immuunrespons tegen NSCLC.

3. Oncofetale antigenen 3.1. Wat zijn oncofetale antigenen? Oncofoetale antigenen zijn de producten van genen die in de volwassen cel normaliter uit staan. Ze komen wel tot expressie in het embryonaal of foetaal stadium van de ontwikkeling. Ze kunnen opnieuw tot expressie komen in de tumorale cel. Voorbeelden zijn het α-foetoproteïne, het embryonale equivalent van albumine, dat gesecreteerd wordt door hepatocellulair carcinoom en kiemceltumoren. Gesecreteerde antigenen zijn evenwel geen goed doelwit voor antitumorale immuniteit. Andere voorbeelden zijn CEA (de carcinoembryonic antigens) en bèta-HCG bij choriocarcinoom. Oncofoetale antigenen zijn een groep tumorantigenen die al zeer lang beschreven is en deze antigenen worden vaak gebruikt als tumormerkers (31, 99, 100). CEA komt voor in NSCLC. 3.2. Oncofetale antigenen bij longkanker: CEA CEA wordt als tumormerker gebruikt in de diagnostiek van gastro-intestinale en andere epitheliale tumoren. CEA komt voor in embryonaal weefsel en komt terug tot expressie in bepaalde tumoren, o.a. in longkanker (33). Crosti et al. vonden in patiënten met CEA+ longtumoren een spontane CD4+ T cel respons tegen verschillende CEA epitopen. Deze T-cellen herkenden in vitro ook CEA positieve tumorcellen. Men vroeg zich af of bij een immuunrespons tegen CEA geen kruisreactiviteit aanwezig was met CEA in de thymus en homologe moleculen op hematopoïetische cellen, wat tot tolerantie tegen CEA in kankercellen zou kunnen leiden. Dit bleek niet het geval te zijn, wat suggereert dat 15

ofwel de tolerantie niet absoluut is of dat de tolerantie doorbroken wordt bij kanker (101). Wang et al. stimuleerden immature DC’s met totaal RNA van longkankercellen die positief waren voor CEA en MUC1 en stimuleerden hier autologe lymfocyten mee. Er werden CTL’s opgewekt die autologe tumorcellen konden herkennen en doden (102).

4. Post-translationeel gemodificeerde antigenen 4.1. Wat zijn post-translationeel gemodificeerde antigenen? Dit zijn normale eiwitten die in tumorcellen abnormale post-translationele wijzigingen ondergaan. Dit kan een gewijzigde glycosylatie, lipidatie, fosforylatie of hydroxylatie van een molecule zijn. Het typevoorbeeld is MUC1. Dit gen codeert in ductale adenocarcinomen zoals borst- en pancreasadenocarcinoom voor een mucine. Mucines zijn grote, post-translationeel geglycosyleerde eiwitten die op het celoppervlak van epitheliale cellen voorkomen of er door gesecreteerd worden. Het mucine gecodeerd door MUC1 wordt gevonden op het celoppervlak en kan herkend worden onafhankelijk van presentatie van een peptide ervan op MHC I. T-cellen herkennen namelijk een segment van het eiwit dat in normale cellen door de glycosylatie bedekt wordt en in tumorale cellen door een aberrante glycosylatie bloot ligt en dus immunogeen is (het is vreemd materiaal voor het immuunsysteem). Het eiwitsegment is dus een “natuurlijk antigen” (25, 27, 32). Er is vaak ook overexpressie van MUC1 en dit is (o.a. in longkanker) geassocieerd aan een slechtere prognose (103). MUC1 komt voor in borst- en pancreascarcinoom, maar ook in colorectaal carcinoom en NSCLC.

4.2. Post-translationeel gemodificeerde antigenen bij longkanker: MUC1 Hoewel MUC1 op borst-, prostaat- en pancreascarcinoom onafhankelijk van MHC I kan herkend worden door MUC1 specifieke natural killer T-cellen (NKT), herkennen deze NKT’s geen andere MUC1+ epitheliale tumoren (104-106). MHC-onafhankelijke herkenning van MUC1 kan nochtans interessant zijn voor immunotherapie bij NSCLC omdat MHC I expressie verloren gaat in ongeveer 40% van alle longkankers. Anderzijds vonden Koukourakis et al. dat in MUC1+ longkankers slechts 20% geen MHC I vertoont (103, 107, 108). Naast MHC-onafhankelijke herkenning door NKT’s kan ook een klassieke CD8+ of CD4+ T-cel respons optreden tegen MUC1 die afhankelijk is van MHC klasse I of II (109, 110). Wang et al. konden in lymfocyten van patiënten met MUC1-positieve NSCLC CTL’s opwekken met behulp van DC’s opgeladen met totaal RNA van de tumorcellen. Deze CTL’s herkenden en doodden autologe tumorcellen (102). We kunnen besluiten dat hoewel nog geen spontane CTL reactiviteit werd geobserveerd tegen MUC1 bij NSCLC, MUC1 een zeer interessant doelwit is voor immunotherapie bij NSCLC vanwege zijn expressiepatroon en tumorspecificiteit. Verschillende fase II trials behaalden reeds positieve resultaten met MUC1 vaccins die in patiënten met gevorderde longkanker een MUC1 specifieke CTL respons konden opwekken en een betere overleving gaven (111-115). Deze resultaten hebben aanleiding gegeven tot twee fase III trials, de START trial (116) en de INSPIRE trial (met 16

Aziatische patiënten) (117), waarin de werkzaamheid van een MUC1 vaccin (Stimuvax) bij longkanker wordt uitgetest. Ook een voor ander MUC1 vaccin (TG4010) is een fase III trial bij longkanker gepland (118).

5. Overexpressie van antigenen 5.1. Wat is overexpressie van een antigen? Hier gaat het om antigenen van normale weefsels die in groter aantal tot expressie komen in de tumor. Net zoals bij weefseldifferentiatie antigenen is de drempel voor het opwekken van een immuunrespons hier hoog (25, 30). Voorbeelden van overexpressie-antigenen zijn Her2/neu, p53, EGFR, Survivine, PSA, CEA, etc. Hierbij moet de opmerking gemaakt worden dat niet elk antigen slechts in één categorie past, zo zagen we PSA al eerder bij differentiatie antigenen en p53 al eerder bij mutatie van een antigen. P53 kan dus zowel mutaties (tumor-specifiek patroon) als overexpressie (tumorgeassocieerd patroon) vertonen. Overexpressie-antigenen spelen een belangrijke rol in het opwekken van een immuunrespons tegen NSCLC.

5.2. Overexpressie-antigenen bij longkanker 5.2.1. Epidermal growth factor receptor (EGFR) EGFR is een overexpressie-antigen in epitheliale tumoren, o.a. in NSCLC. Shomura et al. identificeerden 3 peptiden van EGFR waartegen een spontane humorale immuunrespons (IgG tegen EGFR in het serum van sommige NSCLC patiënten) werd gezien. Daarnaast konden ze met deze peptiden ook CTL’s induceren uit de perifere lymfocyten van de patiënten die cytotoxisch waren voor EGFR+ longtumorcellen (119). 5.2.2. HER2/neu Overexpressie van HER2/neu komt frequent voor bij NSCLC. Yoshino et al. konden uit TIL van NSCLC patiënten CTL’s opwekken die een HER2/neu peptide op longtumorcellen herkenden (120). Meerdere studies identificeerden verschillende HER2/neu peptiden die in vitro antigenspecifieke CTL’s konden induceren (121-123). Sommige studies testten deze CTL klonen ook uit tegen longtumorcellen met HER2/neu overexpressie en zagen dat deze succesvol herkend en vernietigd werden (124-126). Een belangrijke observatie die Scardino et al. hierbij maakten was dat herkenning van tumorcellen optrad ongeacht het niveau van HER2/neu overexpressie (dat varieerde tussen verschillende tumoren) (125, 126). 5.2.3. P53 In NSCLC werd in vivo alleen nog maar tegen een gemuteerd p53 epitoop een CTL kloon gevonden (49). P53 kan in NSCLC echter ook op basis van overexpressie CTL responsen opwekken, zoals aangetoond door Nikitina et al. die zagen dat CTL’s konden geïnduceerd worden op basis van DC’s opgeladen met volledige-lengte wild-type p53 proteïne (dus niet een specifiek peptide ervan). Deze CTL’s waren reactief tegen zowel longtumorcellen met overexpressie van wild-type p53 als tegen 17

longtumorcellen met overexpressie van gemuteerd p53 maar niet tegen tumorcellen met normale (zeer lage) expressie van gemuteerd of wild-type p53 (127). Daarnast vonden Umano et al. dat een peptide van het wild-type p53 CTL’s kon opwekken die cytotoxisch waren tegen longkankercellen met overexpressie van p53 (41). P53 is in longkanker dus ook een overexpressie-antigen. 5.2.4. PRAME Kessler et al. vonden dat CTL’s geïnduceerd tegen 4 epitopen van PRAME cytotoxisch waren voor o.a. PRAME+ longtumorcellen. PRAME komt voor op 50% van alle longkankers, op vele andere kankers maar niet op de meeste normale weefsels behalve testis en in zeer beperkte mate op endometrium, ovaria, en bijnieren. Het is dus geen zuiver cancer-testis antigen maar een overexpressie-antigen (89). 5.2.5. Human telomerase reverse transcriptase (hTERT) hTERT is een ribonucleoproteïne enzyme gelinked aan carcinogenese en er is overexpressie van hTERT in 85% van alle tumoren, ook in NSCLC. De meeste normale weefsels vertonen daarentegen geen hTERT. Verschillende onderzoeksgroepen konden CTL’s specifiek tegen hTERT induceren en deze CTL’s herkenden en doodden longkankercellen (128-130). Godet et al. vonden recent dat bepaalde MHC II bindende epitopen van hTERT een spontane CD4+ T-helper1-respons in gevorderde NSCLC opwekten en dat deze een synergistisch effect met chemotherapie had op de overleving: patiënten met een spontane CD4+ T-celrespons hadden en langere overleving (131). Karanikas et al. onderzochten voor een aantal peptiden van hTERT of er spontaan CD8+ T-cellen tegen voorkomen. Ze vonden dat bij patiënten met hTERT+ longkanker meer CTL’s tegen hTERT voorkomen dan bij gezonde mensen (74). Twee vaccinatiestudies behaalden bovendien reeds goede initiële resultaten met hTERT vaccins in NSCLC. Ze zagen geen auto-immune effecten op hematopoietische stamcellen, die ook hTERT hebben (132, 133). 5.2.6. Survivine en survivin-2b Survivine is een inhibitor-van-apoptose proteïne dat voorkomt in foetale weefsels, een zeer lage expressie in kent normale volwassen cellen maar een overexpressie-antigen is in neoplastische cellen, ook bij longkanker (134). CTL’s tegen survivine kunnen in vitro opgewekt worden (135, 136). Een splicing-variant van survivine: survivin-2b komt in zeer beperkte mate voor in volwassen weefsels met uitzondering van de thymus. Het komt ook voor op ca. 40% van de longtumoren; maar meer in plaveiselcelcarcinoom dan in adenocarcinoom. Eén studie kon CTL’s tegen survivin-2b in vitro induceren uit lymfocyten uit de regionale lymfeknopen van een longkankerpatiënt (137). Een andere toonde ook aan dat dergelijke CTL’s cytotoxisch waren voor survivin-2b-positieve longtumorcellen (138). Omdat expressie van survivine of survivine-2b in 95% van alle tumoren voorkomt onderzochten Karanikas et al. of er in het bloed van longkankerpatiënten een spontane T-cel respons tegen te detecteren is. Ze zochten hierbij naar T-cellen gericht tegen 2 natuurlijk voorkomende peptiden op basis van dewelke ook immunotherapieën ontwikkeld worden. Hun conclusie was dat er geen detecteerbare spontane cellulaire immuunrespons tegen survivine of survivine-2b is (139). 18

5.2.7. Wilms tumor proteïne 1 (WT1) WT1 komt tot expressie tijdens de embryonale ontwikkeling en later in een beperkt aantal normale weefsels alsook in verschillende types leukemie en in 80% van alle solide tumoren, waaronder longkanker (140). Makita et al. toonden dat het natuurlijk voorkomend WT1 peptide CTL’s kan opwekken die cytotoxisch zijn voor WT1+ longtumorcellen. Bovendien transplanteerden zij deze longtumorcellen in muizen en zagen inhibitie van de groei van de tumoren en een langere overleving in muizen behandeld met een anti-WT1 CTL kloon (141). Een andere studie idenficeerde op dezelfde manier nieuwe epitopen van WT1 (142). Tsuboi et al. konden met een gemodificeerd WT1-peptide, makkelijker dan met het natuurlijke peptide, CTL’s opwekken. Deze cellen waren cytotoxisch voor WT1+ longtumorcellen (143). Oka et al. voerden een fase I studie uit met een vaccin o.b.v. dit gemodificeerd peptide. De werkzaamheid bij longkanker was echter twijfelachtig (144). 5.2.8. Preprocalcitonine El Hage et al. vonden in de TIL van een longtumor een CTL kloon gericht tegen een peptide van preprocalcitonine gecodeerd door het CALCA-gen. Er is overexpressie van CALCA in longtumoren en andere tumoren. De gevonden CTL’s konden autologe longtumorcellen met overexpressie van het peptide herkennen (145). Dit was dezelfde patiënt met lange overleving als die waarbij eerder een gemuteerd α-actinine-4 antigen gevonden werd (52). 5.2.9. Cyclophiline B (Cyp-B) Gomi et al. beschreven peptiden gecodeerd door Cyp-B waartegen specifieke CTL’s werden gevonden in de TIL van een longadenocarcinoom. Longtumorcellen met dit antigen werden herkend door de CTL’s. Cyp-B komt voor in alle cellen en was een overexpressie-antigen in de onderzochte longtumor (146). Vaccinatiestudies met Cyp-B hadden tot nog toe weinig bemoedigende resultaten (147, 148). 5.2.10. Dikkopf-1 (DKK1) DKK1 is een inhibitor van de Wnt-pathway, dewelke een belangrijke rol speelt in de ontwikkeling van weefsels, in stamcelbiologie en bij de epitheel-mesenchymale transitie zoals bij tumorale progressie wordt aangetroffen. Forget et al. isoleerden CD8+ T-cellen gericht tegen DKK1 uit een patiënt met longkanker. Deze T-cellen waren geen zuivere CTL’s maar waren volgens de auteurs polyfunctionele CD8+ T-cellen met een gemengd cytotoxische T-cel / T-helper 1 cel (Th1) cytokinesecretie profiel (ze secreteerden o.a. IFN-γ en granzyme B). Deze cellen herkenden DKK1+ doelwitcellen maar hun cytotoxiciteit werd niet bevestigd tegen longkankercellen (149). Daarnaast komen er in 80% van de longtumoren antilichamen tegen DKK1 voor (150). 5.2.11. SOX2 en SOX4 SOX4 is een overexpressie-antigen in NSCLC. CTL’s tegen SOX-4 kunnen opgewekt worden uit menselijke lymfocyten en zijn cytotoxisch voor SOX-4+ longkankercellen (151). SOX2 vertoont overexpressie in diverse types NSCLC, doch hoofdzakelijk in plaveiselcelcarcinoom (152). Er werd geen evidentie gevonden van een cellulaire immuunrespons op basis van SOX2 bij NSCLC. Echter, (doorgaans humorale) immuunresponsen tegen SOX2 worden klassiek teruggevonden in SCLC (153). 19

5.2.12. Andere TAA’s De Eph familie zijn tyrosine kinase receptoren voor Ephrine. EphA2 is een overexpressie-antigen in longkanker. Alves et al. konden in muizen CTL’s opwekken tegen dit antigen die cytotoxisch waren voor humane longkankercellen. In een patiënt met prostaatcarcinoom vonden ze een spontane T-cel respons tegen EphA2 (154). EphA3 (155) komt ook voor bij NSCLC maar er werden geen studies gevonden die de cytotoxiciteit van EphA3-specifieke CTL’s aantoonden tegen longtumorcellen. Epithelial cell adhesion molecule (Ep-CAM) is een cel-cel adhesiemolecule dat een overexpressieantigen is in NSCLC. Trojan et al. konden zowel met natuurlijke Ep-CAM peptiden als met een gemodificeerd peptide CTL’s opwekken uit lymfocyten van longkankerpatiënten en deze CTL’s waren cytotoxisch voor Ep-CAM+ longkankercellen (156, 157). Een andere studie identificeerde een nieuw epitoop van Ep-CAM (158). Ribosomal protein L19 (RPL19): Kuroda et al. brachten regionale lymfeknoop lymfocyten van een longadenocarcinoom in cultuur met autologe tumorcellen en vonden zo een CTL kloon gericht tegen RPL19. Deze CTL’s waren cytotoxisch voor autologe RPL19+ tumorcellen. Overexpressie van RPL19 werd gezien in 40% van de onderzochte longtumoren (159). Wroblewski et al. konden met allogeneic mixed lymphocyte tumor cell cultures (MLTC: lymfocyten van één NSCLC patiënt en tumorcellen van een andere) CTL’s opwekken die cytotoxisch waren voor zowel de gebruikte longtumorcellen als andere tumorcellen. Ze vonden dat de CTL’s gericht waren tegen 2 nieuwe tumorantigenen: guanine nucleotide-binding protein, Gs (GNAS) en inositol myophosphatase (IMPA) en tegen allogeen HLA-CW3. Er was dus zowel tumor-specifieke als allogene reactiviteit. IMPA en GNAS komen ook voor op andere tumoren en op normale weefsels (160). Cell division cycle 45-like (CDC45L) is een overexpressie-antigen in de meeste longkankers. Tomita et al. konden CTL’s opwekken tegen CDC45L die cytotoxisch waren voor CDC45L+ longkankercellen. Anderzijds toonden ze dat behandeling met de CTL’s van muizen getransplanteerd met humane CDC45L+ longkankercellen de tumorgroei inhibeerde (161). Tara: Sugaya et al. vonden in de regionale lymfeknopen van een longkankerpatiënt die 8 jaar na resectie van een primaire tumor én een metastase in de rechter bijnier nog steeds tumorvrij was een CTL kloon die ze ook aantroffen in het perifeer bloed en in het tumorweefsel. Ze vonden dat deze CTL’s gericht waren tegen een splicing variant van het Tara gen en dat deze cytotoxisch waren voor autologe tumorcellen maar ook voor 3 van de 7 geteste allogene tumorcellijnen (waarin het dus wellicht ook een antigen was). Tara komt voor in alle weefsels en alle tumoren, een immuunrespons ertegen kan ontstaan bij overexpresie (22). Testin-related gene (TRG) kent een lage graad van expressie in normale weefsels maar is in vele tumoren een overexpressie-antigen, zo ook in longkanker. Ohkouchi et al. konden een CTL kloon gericht tegen TRG induceren uit de lymfocyten van een patiënt met longadenocarcinoom en deze CTL’s waren cytotoxisch voor TRG+ longkankercellen (162). 20

Calcium-actived chloride channel 2 (CLCA2) is een overexpressie-antigen in longkanker. Konopitzky et al. konden CTL’s ertegen opwekken die cytotoxisch waren voor o.a. CLCA2+ longkankercellen (163). STEAP is een overexpressie-antigen bij NSCLC (164). Alves et al. konden CTL’s opwekken tegen STEAP. Deze CTL’s waren cytotoxisch voor STEAP+ longkankercellen. Daarnaast werd aangetoond dat CTL’s tegen STEAP ook uit het bloed van NSCLC patiënten geïnduceerd kunnen worden (165). Recoverin is een overexpressie-antigen in sommige longtumoren. CTL’s ertegen kunnen geïnduceerd worden uit perifere lymfocyten en zijn cytotoxisch voor o.a. recoverin+ longadenocarcinoomcellen (166, 167). Immediate Early Response Gene X-1 (IEX-1) is een overexpressie-antigen bij longkanker. Sasada et al. konden CTL’s ertegen induceren die cytotoxisch waren voor IEX-1+ longkankercellen (168). Yamada et al. vonden 3 nieuwe antigen in een longadenocarcinoom: één codeerde voor een nog onbekend proteïne en werd clone 83 genoemd. De andere twee waren hairpin binding protein (HPB) en BTB domain containing 2 (BTBD2). Alle 3 konden ze antigenspecifieke CTL’s opwekken uit perifere lymfocyten van longkankerpatiënten en deze CTL’s konden longkankercellen herkennen en doden als die het betreffende antigen vertoonden (169). In een andere studie beschrijven dezelfde auteurs het multidrug resistance associated protein 3 (MRP3) dat een overexpressie-antigen is in NSCLC. Peptiden van MRP3 konden CTL’s induceren uit lymfocyten van patiënten met longkanker en deze CTL’s waren cytotoxisch voor MRP3+ longkankercellen (170). Kaieda et al. konden een humane CTL kloon opwekken die gericht was tegen antigen dat men ATM-1 noemde. Dit antigen kwam voor op 40% van de onderzochte longkankers. De CTL’s waren cytotoxisch voor ATM-1+ longkankercellen (171).

5.2.13. TAA’s met een nog onbekende functie De “squamous cell carcinoma antigen recognized by T cells” (SART) TAA’s zijn een aantal antigenen die werden geïdentificeerd op plaveiselcelcarcinomen op basis van een T-cel respons ertegen. De functies van deze genen of hun gecodeerde proteïnen zijn nog onbekend. Een gelijkaardige groep is “adenocarcinoma antigen recognized by T cells” (ART); deze antigenen werden op adenocarcinomen geïdentificeerd o.b.v. een T-cel respons ertegen en hun functie is onbekend. SART-1 codeert voor 2 proteïnen die, ondanks de benaming, aangetroffen worden in zowel longplaveiselcelcarcinoom als -adenocarcinoom. Ze komen ook voor op de meeste andere plaveiselcelcarcinomen maar niet op normale weefsels behalve testis en foetale lever. SART-1 verschilt echter van CTA’s doordat wel mRNA voor zijn producten kan gevonden worden in normale weefsels, maar niet de producten zelf (172). Shichijo et al. vonden CTL’s tegen peptiden van 1 proteïne gecodeerd door SART-1 die cytotoxisch waren voor longkankercellen (172, 173).

21

SART-2 codeert in tegenstelling tot SART-1 voor een proteïne dat in geen enkel normaal weefsel voorkomt, ook niet op testis of foetale lever, hoewel het mRNA voor dit product in alle weefsels wordt gevonden. Het product van SART-2 wordt wel gezien in longplaveiselcel- en longadenocarcinoom. Peptiden van dit product konden antigen-specifieke CTL’s opwekken uit de lymfocyten van o.a. longkankerpatiënten maar hun cytotoxiciteit werd alleen bevestigd op cellen van SART-2+ slokdarmkanker en niet op longkankercellen (174). SART-3 codeert net zoals SART-1 voor een proteïne dat enkel in tumorcellen en in testis en foetale lever voorkomt. Het gecodeerd proteïne kon uit de lymfocyten van zowel patiënten met longplaveiselcel- als longadenocarcinoom CTL’s induceren die o.a. SART-3+ longtumorcellen herkenden (175). Een tweede onderzoek haalde gelijkaardige resultaten: CTL’s konden opgewekt worden uit lymfocyten van een longkankerpatiënt en SART-3 specifieke CTL’s waren cytotoxisch voor o.a. longtumorcellen (176). ART-1 mRNA wordt gevonden in alle normale weefsels en in verschillende tumoren. Er werd geen informatie gevonden over het expressiepatroon van het gecodeerd proteïne. Nishizaka et al. konden CTL’s opwekken uit TIL van een longadenocarcinoom tegen 3 peptiden gecodeerd door ART-1 en 1 peptide kon ook CTL’s opwekken uit perifere lymfocyten van die patiënt. ART-1 specifieke CTL’s waren cytotoxisch voor longtumorcellen (177). ART-4 codeert voor een proteïne dat voorkomt in longkanker en andere tumoren, maar niet in normale weefsels behalve testis, placenta en foetale lever. Zijn mRNA komt echter in alle normale weefsels voor. Kawano et al. konden uit TIL en perifere lymfocyten van lonkankerpatiënten CTL’s opwekken tegen peptiden gecodeerd door ART-4 en deze CTL’s waren cytotoxisch voor ART-4+ longtumorcellen (178). Er werd 1 vaccinatiestudie gevonden die reeds positieve resultaten toonde voor vaccinatie tegen SART-1,-2 en -3 en ART-1 antigenen bij patiënten met NSCLC (148).

5.2.14. Conclusie Een aantal veel voorkomende antigenen zijn aantrekkelijke doelwitten voor vaccinatie bij NSCLC. Zeker die antigenen waartegen een spontane immuunrespons wordt gezien zijn goede doelwitten om te boosten met immunotherapie. Sommige antigenen zijn echter, vanwege hun zeldzaam voorkomen, geen goede doelwitten. Naast de klassieke vaccinatie met peptiden of eiwitten is een tweede mogelijkheid het “whole tumor extract” vaccin. Hierbij worden DC’s “opgeladen” met tumor RNA of met apoptotische tumorcellen en ex vivo gestimuleerd. Behandeling met de gestimuleerde DC’s kan vervolgens een T-cel respons opwekken tegen alle antigenen die de DC’s konden oppikken uit het RNA of de tumorcellen. Deze werkwijze laat toe om voor elke tumor de volledige waaier aan mogelijke antigenen die hij heeft te benutten om een T-cel respons te proberen uitlokken (179).

22

III. Klinische

en

translationele

evidentie

voor

antitumorale

immuunresponsen bij longkanker Dat het menselijk lichaam een immuunrespons kan ontwikkelen tegen longkanker blijkt al uit een aantal klinische fenomenen zoals paraneoplastische verschijnselen en de observatie dat immunosuppressie leidt tot een hogere longkankerincidentie. Ten tweede is graad van infiltratie van de tumor met verschillende immuuncellen gecorreleerd met een gunstige prognose. De antitumorale immuunrespons wordt in zijn geheel weergegeven in figuur 2 (p47). Hoe longtumoren de immuunrespons onderdrukken en in hun eigen voordeel aanwenden is het onderwerp van figuur 3 (p48).

A. Klinische fenomenen die een immuunrespons tegen longkanker doen veronderstellen In een case report uit 1970 werd een patiënt met een inoperabele longtumor beschreven waarbij na een lage dosis radiotherapie spontane regressie van de tumor optrad, een fenomeen dat niet verklaard kon worden door het effect van radiotherapie. Men vermoedde dat dit het resultaat was van een immuunrespons tegen de tumor (180, 181). Een retrospectieve analyse toonde verbeterde overleving in NSCLC aan bij patiënten die na resectie van een longtumor empyeem ontwikkelden. Dit werd geïnterpreteerd als een aanwijzing voor het bestaan van een immuunrespons bij longkanker (182), naar analogie met de bacteriële toxines die William Coley (“vader van de kanker immunotherapie”) gebruikte voor de behandeling van sarcomen in het begin van vorige eeuw. Twee studies zagen een negatief effect van bloedtransfusies op het ziektevrij interval na chirurgie bij longkankerpatiënten. Dit werd gelinkt aan het immunosuppressieve effect van allogene bloedtransfusies (183, 184). Imai et al. toonden in een 11 jaar lopende studie aan dat patiënten met een lage cytotoxische activiteit van NKcellen een hoger risico op longkanker en andere kankers hadden (185). Aidspatiënten en transplantpatiënten onder immunosuppressieve medicatie hebben ook een hoger risico op het ontwikkelen van NSCLC (186-188). Een recente observatie is dat NSCLC-overleving beter is in patiënten met actieve TBC. Dit wijst ook op het belang van een actieve immuniteit in het tegengaan van longkanker. Kuo et al. stellen dat dit effect misschien te wijten is aan een sterkere infiltratie van Tcellen in de tumor (189). Mogelijks heeft dit ook te maken met de TBC-geïnduceerde skewing naar een T-helper 1 cel immuunrespons (welke gecorreleerd is met betere antitumorale immuniteit). Een volgend bewijs van de immunogeniciteit van longkanker zijn de paraneoplastische syndromen en de paraneoplastische antilichamen. Sommige paraneoplastische syndromen worden veroorzaakt door antilichamen geproduceerd door een B-cel respons tegen tumorantigenen. Deze antilichamen kunnen kruisreageren met self-antigens elders in het lichaam en wekken zo een ziektebeeld op dat, hoewel het niet direct veroorzaakt wordt door de aanwezigheid van tumorcellen in de long of metastasen elders, 23

wel indirect het gevolg is van de tumor. Hoewel ze voornamelijk bij small cell lung cancer voorkomen zien we ook bij non-small-cell lung cancer een aantal paraneoplastische fenomenen. Een typisch voorbeeld is de encefalomyelitis bij SCLC die veroorzaakt wordt door anti-hu antilichamen. Niet voor elk paraneoplastisch syndroom is echter een antilichaam verantwoordelijk, en vaak kunnen geen specifieke antilichamen aangetoond worden. Men kan echter stellen dat deze syndromen het bewijs zijn van een humorale immuunrespons tegen longkanker (190, 191). Tenslotte zijn er tal van studies die een verband leggen tussen de graad van infiltratie van een longtumor met een bepaalde immuuncel en de prognose van die tumor. Als dit verband gunstig is kunnen we vermoeden dat de cel een rol speelt in de afweer tegen de tumor. Als het ongunstig is, is er misschien sprake van immunosubversie van die cel door de longtumor; dit uiteraard met enig voorbehoud wegens mogelijke onderliggende “confounding factors”. Niet alleen de graad van infiltratie met een type cel maar ook de plaats in de tumor waar deze zich voornamelijk bevinden is belangrijk. Een tumor kan histologisch ingedeeld worden in 2 gebieden: Tumor stroma is het geheel van regio’s van de tumor waar nog stromale cellen aanwezig zijn; immuuncellen bevinden zich hier op relatieve afstand van de tumorcellen. Cellen die zich hier bevinden worden soms ook “peritumorale” cellen genoemd. Tumor nesten zijn regio’s waar enkel een hoge concentratie tumorcellen te vinden is; immuuncellen bevinden zich hier in nauw contact met de tumorcellen. Deze plaats in de tumor wordt ook “tumor epitheel” genoemd en de infiltrerende immuuncellen “epitheliale” of “intratumorale” cellen (192). Hieronder volgt de bespreking van studies die graad en plaats van infiltratie van NSCLC met een bepaald type immuuncel bekijken en dit linken aan de prognose.

B. Rol van de aangeboren immuniteit bij longkanker Cellen van de aangeboren immuniteit hebben geen “opvoeding” nodig door antigen presenterende cellen (APC) maar kunnen zelfstandig pathogene cellen, zoals tumorcellen herkennen en aanvallen. Dit kan o.a. door fagocytose, cytotoxiciteit, secreteren van cytokines, etc. Ze kunnen ook de verworven immuunrespons ondersteunen of juist saboteren. Zie figuren 2 en 3 (p47-48) voor een overzicht van de cellen van de aangeboren immuniteit en hun rol in de antitumorale immuunrespons.

1. Macrofagen 1.1. De functie van macrofagen in de antitumorale immuunrespons Een groot deel van de immuuncellen die infiltreren in tumoren zijn macrofagen, ze worden in deze context ook tumor-associated macrophages (TAM) genoemd. TAM’s zijn afkomstig van circulerende monocyten die naar het tumorweefsel gerekruteerd worden door chemokines afkomstig van tumorcellen. Deze monocyten differentiëren daarna tot macrofagen onder invloed van transforming growth factor bèta (TGF-β) en IL-10 (dat de differentiatie van monocyten tot DC’s blokkeert). TAM’s kunnen vervolgens door cytokines in de tumor micro-omgeving gepolariseerd worden tot M1 24

of M2 macrofagen, dit zijn echter 2 uitersten van een continuüm. Volledig gepolariseerde M1- of “klassiek geactiveerde” macrofagen dragen bij tot tumor rejectie, volledig gepolariseerde M2- of “alternatief geactiveerde” macrofagen ondersteunen daarentegen tumorgroei, angiogenese, invasie en metastase en onderdrukken de verworven immuunrespons. Ze veroorzaken T-cel dysfunctie door direct celcontact en productie van immunosuppressieve mediatoren zoals prostaglandines, IL-10 en TGF-β (193-195). Aangezien in de tumor micro-omgeving vooral M2 type macrofagen voorkomen (196, 197) wordt met de term TAM vaak uitsluitend deze populatie bedoeld. M1 macrofagen komen echter ook voor en spelen weldegelijk een rol in de antitumorale immuunrespons (198). Voor de meeste kankers zijn TAM’s gelinkt aan een slechte prognose. Voor longkanker is er echter tegenstrijdige evidentie (194).

1.2. Evidentie voor de rol van macrofagen in de immuunrespons tegen longkanker In NSCLC zijn ongeveer 1/3 van alle inflammatoire cellen in het tumor stroma TAM’s. Ze zijn daarmee de tweede meest talrijke cellen na de T-cellen die 2/3 van alle immuuncellen uitmaken (199). Aangezien in de tumoromgeving van NSCLC vooral T-helper 2 (Th2) cytokines voorkomen zijn de meeste macrofagen (in tumor stroma en in stroma en nesten samengenomen) van het M2 type (196, 197). In tumor nesten worden echter vooral M1 type macrofagen gevonden (198). De rol van TAM’s in NSCLC is dan ook dubbel: er zijn zowel M1 macrofagen die een cytotoxisch effect hebben op tumorcellen, als M2 TAM’s die immunosuppressief zijn en tumorprogressie bevorderen (199). Kerr et al. vonden in 1998 reeds dat er een verband was tussen NSCLC regressie en een groot aantal TAM’s dicht bij de tumorcellen. Koukourakis et al. zagen daarentegen dat grote aantallen TAM’s in een longtumor gelinkt waren aan angiogenese en een slechte prognose (200). Kataki et al. vonden dat meer dan de helft van alle TAM’s in NSCLC tekenen van “antibody-dependent cellular cytotoxicity” (ADCC) vertoonden, wat zou kunnen wijzen op een cytotoxisch effect op tumorcellen. Anderzijds vonden ze dat TAM’s maar weinig cytotoxische cytokines, maar wel veel platelet-derived growth factor (PDFG) produceerden, wat angiogenese kan induceren en zo tumorgroei kan ondersteunen (199). Kurabayashi et al. vonden dat macrofagen in NSCLC vooral voorkwamen in tumor stroma en dat ze niet geassocieerd waren met apoptose van tumorcellen (201). Verschillende studiegroepen vonden een verband tussen het totaal aantal TAM’s in tumor nesten en een betere prognose in NSCLC (197, 198, 202-204). Ohri et al. vonden daarbij dat bij de groep met betere prognose zowel M1 als M2 TAM’s meer voorkwamen in tumor nesten dan in de groep met slechtere prognose en dit in een verhouding van ongeveer 70% M1 t.o.v. 30% M2 macrofagen. In tumor nesten van de groep met slechtere prognose waren evenveel M1 als M2 macrofagen aanwezig. Het totaal aantal TAM’s in tumor stroma was hetzelfde tussen de twee groepen maar in de groep met betere prognose waren er meer M2 dan M1 TAM’s in het stroma terwijl er in de andere groep geen verschil was. Men besloot dat een goede infiltratie van tumor nesten met TAM’s, en dan vooral met M1 TAM’s, gecorreleerd is met een betere prognose (198). Andere studies zien evenwel 25

dat voor alle patiënten samen meer M2 (gemiddeld 70%) dan M1 (gemiddeld 30%) TAM’s voorkomen in tumor nesten en stroma samen (197). Voor longadenocarcinoom was dit zelfs 80% versus 20% (196). Ma et al. vonden hierbij ook dat M1 densiteit in zowel tumor nesten, als in tumor stroma, als in stroma en nesten samen gecorreleerd was met langere overleving. Alleen M1 densiteit in tumor nesten was echter een onafhankelijke positieve prognostische factor (197). Dai et al. stellen dat hoewel het totale aantal macrofagen in NCSLC geen prognostische waarde heeft, het aantal macrofagen in tumor stroma een negatieve en het aantal macrofagen in tumor nesten een positieve invloed heeft op de overleving (204). Al-shibli et al. vonden daarentegen dat noch macrofagen in tumor stroma als in tumor nesten significant correleerden met overleving (205). Zhang et al. vonden dat M2 TAM’s in longadenocarcinoom in grotere aantallen aanwezig waren naarmate de tumor zich in een meer gevorderd stadium bevond omwille van een verdere verschuiving naar een Th2 respons in de tumor-omgeving. M2 TAM’s waren bovendien ook geassocieerd aan een slechtere prognose en aan meer lymfangiogenese en lymfatische metastasen (196). Uit deze gegevens kan men besluiten dat M1 TAM’s zich preferentieel naar tumor nesten zullen begeven en daar waarschijnlijk een cytotoxisch effect op tumorcellen zullen uitoefenen. Wanneer veel M1’s aanwezig zijn in de tumor (en dan vooral in tumor nesten) leidt dit tot een langere overleving. M2 TAM’s daarentegen bevinden zich zowel in tumor stroma als in tumor nesten en oefenen een immunosuppressieve en pro-tumorale werking uit. Wanneer M2 TAM’s overheersen leidt dit tot een snellere progressie van de tumor en een kortere overleving.

2. Myeloid-derived suppressor cells (MDSC) 2.1. De functie van MDSC’s in de antitumorale immuunrespons MDSC’s vormen een heterogene populatie immature leukocyten van myeloïde oorsprong. Hoewel granulocytaire en monocytoïde subsets van MDSC’s bij muizen goed gekarakteriseerd zijn, is er heden geen consensus over de fenotypische en functionele klassen van humane MDSCs. Ze stapelen zich op en prolifereren in bloed, lymfeknopen, beenmerg en op de tumorsite in antwoord op verscheidene groeifactoren en cytokines bij kanker, maar ook bij situaties waar er systemische inflammatie heerst zoals sepsis of polytrauma (206, 207). MDSC’s zijn in staat om o.a. via cel-cel contact, productie van arginase of zuurstofradicalen CD8+ en CD4+ T-cel responsen te onderdrukken, onder meer door inductie van apoptose van CD8+ Tcellen. Naast hun directe effecten op de T-cel respons hebben ze ook een indirect effect via het induceren van Tregs die op hun beurt effector T-cellen zullen inhiberen. Om Tregs te induceren kunnen ze onder meer IL-10 en TGF-β produceren (206-208). Naast hun effecten op T-cellen interageren ze ook met TAM’s die hierdoor meer IL-10 en minder IL-12 gaan produceren. Ze veroorzaken een pro-tumorale Th2 respons (209). MDSC’s interageren ook met NK-cellen en NKTcellen. Tenslotte inhiberen MDSC’s de antigen presenterende functie van DC’s (207). Een overzicht van de mechanismen die MDSC’s gebruiken om T-cellen en andere cellen te onderdrukken en meer 26

gedetailleerde informatie over MDSC’s is terug te vinden in de reviews door Ostrand-Rosenberg (207) en Gabrilovich (206). Dat ze inderdaad een belangrijke rol spelen in het ondermijnen van de antitumorale immuunrespons blijkt het feit dat uitputting van MDSC’s of inhibitie van de functie van MDSC’s met geneesmiddelen de effectiviteit van verscheidene immunotherapieën en tumor-vaccinaties ten goede komt (207, 210).

2.2. Evidentie voor de rol van MDSC’s in de immuunrespons tegen longkanker MDSC’s worden ook gevonden in NSCLC. Almand et al. observeerden dat ze zich opstapelen in het bloed en dat ze de capaciteit van DC’s om T-cellen te stimuleren ondermijnen. Verwijdering van MDSC’s liet in vitro terug DC stimulatie van T-cellen toe (210). MDSC’s inhiberen ook de T-cel functie via de productie van grote hoeveelheden arginase1 en inducible nitric oxide synthase (iNOS), dewelke al het L-arginine in de omgeving opgebruiken. L-arginine is essentieel voor de proliferatie van T-cellen (206). Liu et al. beschreven een bepaald subtype MDSC dat ze aantroffen in het bloed van patiënten met gevorderde NSCLC maar dat in mindere mate aanwezig was bij patiënten die goed reageerden op chemotherapie en in vroeg stadium NSCLC na resectie van de tumor. Dit toont aan dat een intacte longtumor MDSC’s kan opwekken en dat behandeling van de tumor het aantal MDSC’s doet dalen. De MDSC’s, die inderdaad arginase1 en iNOS produceerden, speelden wellicht een belangrijke rol in de suppressie van CD8+ T-cellen in NSCLC (211). Rodriguez et al. vonden dat in Lewis lung cancer bij muizen de expressie van arginase1 door MDSC’s afhankelijk was van cycloöxygenase-2

(COX-2)

productie

door

de

tumorcellen.

Prostaglandine-E2

(PGE2)

geproduceerd door COX-2 induceerde via een PGE2 receptor op MDSC’s de expressie van arginase1 (212). Dit is misschien ook een werkingsmechanisme van MDSC’s in humane longkankers. Wu et al. zagen bij longadenocarcinoom in muizen dat overexpressie van Signal Transducer and Activator of Transcription 3 (Stat3C) in de tumorcellen gekoppeld was aan een sterke expansie van de populatie MDSC’s en bijgevolg ook aan een verminderde hoeveelheid CD4+ en CD8+ T-cellen. Stat3C bleek namelijk verantwoordelijk voor productie van bepaalde pro-inflammatoire cytokines die de accumulatie van MDSC’s veroorzaakten. De rol van MDSC’s in humane longkanker zou dus gekoppeld kunnen zijn aan Stat3C overexpressie, wat vooral gezien wordt in longadenocarcinoom (213). Tenslotte is het interessant te vermelden dat hoewel MDSC’s uitermate krachtige immunosuppressieve cellen zijn, er ondanks hun aanwezigheid nog activatie van CD4+ T-cellen mogelijk is in NSCLC na toediening van een tumor-vaccin, mits toevoeging van de juiste adjuvantia (214). We kunnen besluiten dat MDSC’s in NSCLC krachtige immunosuppressieve cellen zijn waarvan alle werkingsmechanismen nog niet volledig zijn blootgelegd. Ook is er tot op heden nog geen enkele studie geweest die het prognostisch belang van infiltratie van MDSC’s in de tumoromgeving bij NSCLC onderzoekt. Dit zou een belangrijk doel kunnen zijn voor toekomstig onderzoek.

27

3. Natural killer cellen (NK-cellen) 3.1. De functie van NK-cellen in de antitumorale immuunrespons Aan hun oppervlak zijn NK-cellen gekenmerkt door een afwezigheid van CD3 en een aanwezigheid van CD56. Ze herkennen doelwitcellen op twee manieren, ten eerste via Fc-receptoren (CD16) die het Fc-fragment van IgG herkennen. Zo herkennen ze IgG-gecoate cellen. Dit IgG is dan weer deel van de verworven immuniteit, aangezien het aangemaakt wordt door B-cellen of plasmacellen. Dit mechanisme van herkenning heet “antibody-dependent cellular cytotoxicity” (ADCC). Het tweede systeem berust op de killer-activating en killer-inhibitory receptoren op het oppervlak van de NK-cel. Killer-inhibitory receptoren (KIR) worden normaalgezien continu geactiveerd door de aanwezigheid van MHC I met self-peptiden op normale cellen. Wanneer echter door een pathogeen proces (bijvoorbeeld mutaties in een tumorcel) de expressie van MHC I vervalt, is de NK-cel niet langer geïnhibeerd. Verlies van MHC I inhibitie betekent echter niet noodzakelijk celdood. De cel moet daarnaast stress-moleculen aan zijn oppervlak presenteren (dit gebeurt bij cellulaire stress: DNAschade, virale infectie, etc.) die de KIR binden om optimale activatie van de NK-cel te bekomen. Voor een uitgebreide bespreking van de verschillende KIR’s en hun doelwitmoleculen verwijzen we naar de reviews door Lanier (215), Caligiuri (216) en Bryceson et al. (217). ADCC enerzijds en afwezigheid van MHC I in combinatie met aanwezigheid van stress-moleculen op de doelwitcel anderzijds kunnen zo tot destructie van een tumorale cel door NK-cellen leiden. Dit kan via twee verschillende wegen: ten eerste kunnen NK-cellen perforines secreteren die de celmembraan van de tumorcel perforeren. Vervolgens secreteren ze granzymes die doorheen de perforaties de cel binnengaan en daar eiwitten (waaronder caspasen) knippen. Dit zet een apoptotische cascade in gang met celdood tot gevolg. De tweede weg is het stimuleren van een “death receptor” (bv. Fas, TRAIL-R) op de doelwitcel. NKcellen kunnen de respectievelijke liganden (Fas-L, TRAIL) op hun celmembraan dragen. Binden van een death receptor activeert een signaalcascade met uiteindelijk apoptose van de tumorcel tot gevolg (34, 218, 219). Dezelfde twee cytotoxische mechanismen vinden we terug bij CTL’s (zie verder) (35, 215-217, 220). Naast het elimineren van cellen kunnen NK-cellen ook cytokines secreteren. Met name IFN-γ is een typisch NK-cel cytokine dat een rol speelt in het ondersteunen van de antitumorale Th1 respons, MHC I expressie in APC’s kan stimuleren, macrofaag activiteit tegen intracellulaire pathogenen kan activeren en tenslotte antiproliferatieve effecten heeft op viraal of maligne getransformeerde cellen. Hoewel alle NK-cellen zowel celdodende als secreterende eigenschappen hebben, zijn ze in feite op te delen in 2 groepen: NK-cellen met weinig CD56 aan het oppervlak (CD56dim) worden vooral in het bloed en in zones van inflammatie gevonden en hebben vooral een celdodende functie, NK-cellen met veel CD56 aan het oppervlak (CD56bright) worden vooral aangetroffen in lymfeknopen en hebben meer een cytokine-secreterende functie. CD56bright NKcellen zijn precursorcellen van CD56dim NK-cellen (216, 221). In muismodellen is rejectie van getransplanteerde, geïnduceerde en spontane tumoren o.b.v. NK-cellen aangetoond (222). Bij mensen toonde een studie na 11 jaar follow-up dat verlaagde NK-cel activiteit 28

in het bloed gerelateerd is aan een hogere incidentie van kanker (185). Daarnaast zijn er verschillende studies die infiltratie van tumoren door NK-cellen linken aan een betere prognose (205, 221, 223). Tumoren kunnen echter vele strategieën gebruiken om te ontkomen aan NK-cel cytotoxiciteit (224).

3.2. Evidentie voor de rol van NK-cellen in de immuunrespons tegen longkanker Dat NK-cellen in NSCLC ook een rol spelen in de antitumorale afweer blijkt uit twee studies die NKcel infiltratie in de tumor konden linken aan een betere prognose in NSCLC (205, 223). Al-Shibli et al. zagen dat tumoren met veel NK-cellen in tumor stroma een betere overleving hadden (205). Villegas et al. zagen daarentegen dat een subset CD57+ NK-cellen tumor nesten infiltreerden bij longplaveiselcelcarcinoom en geassocieerd waren aan een betere overleving (223). (CD57 merkt naast NK-cellen echter ook sommige T-cellen, wellicht ging het hier dus om NKT-cellen en niet om klassieke NK-cellen.) Andere studies vonden echter geen verband tussen NK-cel infiltratie in NSCLC en overleving (225, 226). Esendagli et al. zagen dat NK-cellen in mindere mate aanwezig zijn in maligne gebieden van tumorweefsel dan in de niet-maligne gebieden (227). Vermoedelijk gaat het hier om een onderscheid tussen respectievelijk tumor nesten en tumor stroma. Schneider et al. vonden dat NK-cellen in het tumor centrum van longadenocarcinoom in veel kleinere aantallen aanwezig waren dan in de periferie van de tumor. Dit was geassocieerd aan het voorkomen van grote hoeveelheden CD4+ T-cellen en Tregs in het tumor centrum (228). Het verminderd voorkomen van NK-cellen in het tumor centrum is wellicht te wijten aan de immunosuppressieve effecten van Tregs. Carrega et al. vonden NK-cellen in tumor stroma maar niet in tumor nesten en observeerden dat er vooral CD56bright NK-cellen waren. Deze hadden zoals verwacht een goede cytokine-secreterende functie maar een beperkte cytotoxiciteit voor tumorcellen (229). Uit verschillende studies blijkt dat de populatie tumor-infiltrerende NK-cellen in NCSLC functionele defecten vertoont en naast een verminderde cytotoxiciteit ook minder IFN-γ produceert en Tcellen dus minder kan stimuleren (226, 230, 231). Lin et al. stellen dat HLA-G expressie, die voorkomt in ca. 40% van de longkankers, tumorcellen in staat stelt te ontsnappen aan cytolyse door NK-cellen (232). Dit kan misschien verklaren waarom HLA-G expressie bij NSCLC een slechte prognostische factor is (233). We kunnen besluiten dat NK-cellen een rol spelen in NSCLC maar dat hun cytotoxische functie door immune escape mechanismen (HLA-G expressie, Tregs, e.a.) van de tumor verhinderd wordt. Hun positief effect op de overleving is dus wellicht eerder te wijten aan secretie van cytokines als IFN-γ. Ook hun cytokine-secreterende functie kan echter geïnhibeerd zijn.

4. Natural killer T-cellen (NKT) 4.1. Functie van NKT’s in de antitumorale immuunrespons NKT’s zijn een type cellen die zowel eigenschappen van T-cellen als van NK-cellen vertonen. In de tumor immuniteit hebben ze zoals macrofagen een dubbele rol: type I NKT’s of iNKT-cellen zijn 29

betrokken in tumor rejectie en type II NKT’s hebben immunosuppressieve effecten en faciliteren tumor progressie. Dit doen ze onder andere door aantrekken van MDSC’s en M2 type macrofagen (207, 234, 235). Het stimuleren van type I NKT’s via specifieke liganden (vb. α-galactosyl ceramide) is een potentiële piste voor immunotherapie.

4.2. Evidentie voor de rol van NKT’s in de immuunrespons tegen longkanker. NKT’s komen ook voor in NSCLC en in één longtumor werd gezien dat ze cytotoxisch zijn voor tumorcellen (236, 237). Er zijn tot op heden echter nog geen studies gebeurd die het prognostisch belang van NKT infiltratie in NSCLC duidelijk maken.

5. Mastcellen 5.1. De functie van mastcellen in de antitumorale immuunrespons Mastcellen zijn zeer pleiotrope cellen die allerlei cytokines kunnen produceren. Mastcellen maken o.a. TNF (een antitumoraal Th1 cytokine) maar ook Th2 cytokines zoals IL4 en IL13 die TAM’s naar een immunosuppressief M2 fenotype polariseren (238). De rol van mastcellen in kanker is dan ook niet eenduidig; in sommige studies worden ze via een cytotoxisch effect gelinkt aan een betere prognose terwijl ze in andere verantwoordelijk gesteld worden voor angiogenese en een slechtere prognose (239, 240).

5.2. Evidentie voor de rol van mastcellen in de immuunrespons tegen longkanker Ook in NSCLC is de rol van mastcellen niet eenduidig: Tomita et al. vonden in longadenocarcinoom dat tumoren met veel mastcellen een significant betere prognose hadden (239). Daartegenover staat de studie van Takanami et al. die, eveneens in longadenocarcinoom, toonde dat mastcelinfiltratie gelinkt was aan microvessel density (MVD) in de tumor en aan een slechtere prognose (241). Alle meer recente studies naar het prognostisch effect van mastcellen in NSCLC tonen echter een neutrale rol voor mastcellen (202, 203, 240, 242). Dundar et al. vonden hierbij wel een verband tussen mastcelinfiltratie en MVD maar zagen geen invloed op de prognose (242). Al-Shibli et al. vonden mastcellen vooral in het tumor stroma en in beperkte mate in tumor nesten (240). Kawai et al. zagen anderzijds evenveel mastcellen in tumor stroma als in tumor nesten. Dit kan misschien veroorzaakt zijn door gebruik van een andere merker voor mastcellen (c-kit) dan Al-Shibli et al. (CD117). Kawai et al. vonden voor geen van beiden een significante invloed op de overleving (203). Gezien de tegenstrijdige resultaten (239, 241) is het mogelijk dat mastcellen, zoals vele andere immuuncellen, in de context van longkanker een dubbele rol hebben. Nieuwere studies pleiten echter voor een neutrale rol. Nochtans hebben mastcellen in andere tumoren soms cytotoxische effecten. Misschien worden deze al zeer vroeg in de ontwikkeling van longkanker omzeild, of misschien zijn mastcellen in de long niet in voldoende aantal aanwezig om een meetbare invloed op de overleving te veroorzaken. 30

C. Rol van de verworven immuniteit bij longkanker De verworven immuunrespons is opgebouwd rond antigen presenterende cellen (APC) zoals dendritische cellen (DC) die tumorantigenen opnemen en presenteren aan naïeve T-cellen. B-cellen herkennen tumorantigenen zonder presentatie door DC’s. De verworven immuunrespons kan onderverdeeld worden in de cellulaire (T-cellen) en de humorale (B-cellen en hun antilichamen) immuunrespons. Zoals reeds aangehaald is vooral de cellulaire immuunrespons belangrijk in de antitumorale immuniteit. De rol van B-cellen en antilichamen is wellicht minder belangrijk (17, 24). Een kritisch gegeven is wáár de antigen-presentatie en de rijping van T-cellen zich afspeelt. In NSCLC zou dit enerzijds op de klassieke manier in lymfeknopen gebeuren, maar anderzijds ook in tertiaire lymfoïde organen (TLO’s) die zich rondom de tumor vormen. Hierover en over de functie en rol in NSCLC van de specifieke immuuncellen van de verworven immuniteit wordt hier uitgeweid. Een overzicht van waar en hoe de antitumorale immuunrespons bij NSCLC zich afspeelt wordt gegeven in figuur 2 (p47). Figuur 3 bespreekt de immunosuppressieve mechanismen en -cellen in NSCLC (p48).

1. Dendritische cellen 1.1. De functie van dendritische cellen in de antitumorale immuunrespons De cellulaire immuunrespons wordt gemedieerd door CD8+ cytotoxische T-lymfocyten (CTL) en CD4+ T-helper cellen, deze moeten echter “opgevoed” worden om tumorantigenen te herkennen. Die functie wordt vervuld door professionele antigen presenterende cellen (APC) zoals macrofagen en dendritische cellen (DC), die de krachtigste APC’s zijn (243). De normale cellulaire immuunrespons tegen tumorcellen begint met het opnemen van tumorantigenen door immature DC’s in de tumoromgeving. Het antigen wordt vervolgens verwerkt door het proteasoom van de DC tot een antigenisch peptide en via het endoplasmatisch reticulum getransporteerd en gepresenteerd aan het oppervlak van de DC op zowel MHC I als MHC II moleculen. De DC matureert onder invloed van maturatiesignalen: dit zijn endogene of pathogeen-afgeleide “danger” signalen (bv. heat-shock proteïnes). De geactiveerde, mature DC’s migreren naar de drainerende lymfeknopen waar zich ook naïeve T-cellen bevinden. Om deze naïeve T-cellen te activeren stuurt de DC dan verschillende moleculaire signalen door. “Signaal 1” is dus het presenteren van deze antigen-afgeleide peptiden op MHC moleculen, die via de T-cel receptor worden vertaald in activatiesignalen. CD8+ T-cellen worden zo geselecteerd door de DC via presentatie van het antigen op een MHC I molecule en CD4+ T-cellen via presentatie op een MHC II molecule. “Signaal 2” is de zgn. costimulatie via costimulatoire moleculen die rijkelijk aanwezig zijn op het celoppervlak van DC’s (bv. B7.1, B7.2, CD40), en die overeenkomstige receptoren op de T-cel binden (CD28, CD40L). De expressie van MHC en T-cel costimulatoire moleculen wordt opgedreven nadat de DC is blootgesteld aan maturatiesignalen: de DC wordt een mature DC. Zonder signaal 2 is de antigen-specifieke T-cel activatie suboptimaal en abortief of ontstaat er anergie. In afwezigheid van maturatiesignalen blijft de DC dus immatuur en kan hij tolerantie tegenover de gepresenteerde (auto)antigenen veroorzaken en 31

Tregs induceren. “Signaal 3” is een moleculair signaal waarmee de DC T-helper cellen polariseert naar een bepaald effector patroon, nl. T-helper 1, T-helper 2, T-helper 3, T-helper 17, of induceerbare regulatoire T-cellen (iTreg, Tr1). Vaak zijn dit cytokines door de DC geproduceerd (bv. IL-12 induceert Th1 polarisatie, IL-10 eerder Tregs). Tenslotte wordt aangenomen dat DC’s een “signaal 4” doorgeven aan T-cellen dat bepalend is voor de recirculatie naar een gedefinieerd doelwitweefsel. Dit gebeurt door inductie van een patroon van bepaalde chemokine receptoren die de T-cel naar bepaalde anatomische locaties helpen navigeren om daar hun functie uit te oefenen. Na de primaire immuunrespons blijft er een verzameling memory T-cellen achter die kunnen dienen als effector cellen en als een snelle bron van nieuwe CTL’s bij ontstaan van nieuwe tumorhaarden en zo potentieel recidief zouden kunnen inperken (21, 34, 35, 206, 218, 219, 244, 245). DC’s hebben nog een tweede functie: zij kunnen natural killer cellen (NK-cellen) rekruteren en activeren. Dit is belangrijk wanneer tumorcellen de expressie van MHC I moleculen verliezen, en dus niet meer vatbaar zijn voor cellulaire immuniteit. In dat geval kunnen NK-cellen de cellen zonder MHC I opruimen (216, 217) (zie eerder).

1.2. Evidentie voor de rol van tertiaire lymfoïde organen (TLO’s) in de immuunrespons tegen longkanker Voor we dieper ingaan op het belang van DC’s op zich is het essentieel te weten wáár DC’s hun rol als “opvoeders” van T-cellen vervullen. De antigen presentatie en rijping van T-cellen gebeurt in NSCLC immers niet alleen op de klassieke manier in lymfeknopen, maar ook in tertiaire lymfoïde organen (TLO’s) die zich rondom de tumor vormen. Lymfocyten worden uit progenitorcellen geproduceerd in de thymus en het beenmerg, dit zijn de primaire lymfoïde organen. De secundaire lymfoïde organen zijn o.a. de lymfevaten, lymfeknopen en de milt. Naast primaire en secundaire zijn er echter ook tertiaire lymfoïde organen (TLO’s). In het gastro-intestinaal stelsel is er bijvoorbeeld het gut-associated lymphoid tissue of GALT. In de longen bestaat het BALT of bronchus-associated lymphoid tissue. BALT is beschreven in de longen van de foetus en het kind, maar verdwijnt in de volwassen long, waar het echter terug aangetroffen kan worden in bepaalde inflammatoire toestanden zoals pneumonie, COPD, bronchiolitis, pulmonale arteriële hypertensie en longfibrose. De aanwezigheid van BALT bij longkanker werd beschreven door Dieu-Nosjean et al. die ze in de context van longkanker Tumor-induced BALT of Ti-BALT noemden. Men onderzocht hiervoor longbiopsieën van 74 niet-kleincellige longtumoren in een vroeg stadium. De grootte en samenstelling van Ti-BALT verschilde sterk tussen verschillende tumoren. Uit immunohistochemisch onderzoek bleek dat de aggregaten vooral mature DC’s, CD4+ en CD8+ Tcellen en B-cellen bevatten, met soms een germinaal centrum van prolifererende B-cellen. De CD4+ T-cellen werden in clusters met mature DC’s aangetroffen in de TLO’s, met ernaast B-cel follikels. CD8+ T-cellen clusterden niet met DC’s maar infiltreerden wel het tumorweefsel (246). Een specifiek type CD4+ T-cellen, de (bet+) Th1 cellen, waren zowel in het tumor stroma als in de tumor nesten aanwezig, maar nooit in de lymfoïde aggregaten zelf (246). In hun samenstelling lijken deze 32

lymfoïde aggregaten erg op GALT en op lymfeknopen. Ze vertonen kenmerken van een lopende immuunrespons en zijn dus wellicht een locus van immuuncelactivatie (246). Men onderzocht vervolgens de prognostische waarde van Ti-BALT en van de verschillende celcomponenten ervan en men vond dat vooral de densiteit van mature DC’s in Ti-BALT correleerde met een betere overleving in vroeg stadium NSCLC. In de groep met een hoge densiteit aan mature DC’s (en dus een betere overleving) was er bovendien een hoger aantal tumor-infiltrerende lymfocyten (TIL), wat het belang van DC’s om T-cellen te rekruteren illustreert. Vooral CD4+ T-cellen en de subset (bet+) Th1 cellen, maar ook B-cellen, waren meer aanwezig in deze groep. De densiteit van CD8+ T-cellen verschilde minder tussen de twee groepen (246). Dieu-Nosjean et al. concludeerden dat het prognostisch belang van Ti-BALT vooral te wijten is aan de mature DC/CD4+ T-cel clusters die door hun nabijheid aan de tumor snel kunnen reageren op veranderende expressie van antigenen door de tumorcellen en nieuwe T-cel klonen kunnen induceren. Ook de B-cellen in Ti-BALT zouden een stimulerende rol voor de T-cel immuniteit kunnen spelen. Alle patiënten ondergingen weliswaar resectie van hun tumor (inclusief Ti-BALT) en men veronderstelde dat de verbeterde overleving te wijten was aan de aanwezigheid van memory T-cellen gemigreerd vanuit Ti-BALT naar lymfeknopen die intact gelaten werden. Deze memory T-cellen kunnen nieuwe subklinische tumorhaarden vernietigen en recidief verhinderen. Bij NSCLC is er sprake van micrometastasen die al zeer vroeg in de pathogenese aanwezig zijn en de oorzaak van recidief kunnen zijn; ook hierop kunnen memory Tcellen inwerken (246).

1.3. Evidentie voor de rol van tumor-drainerende lymfeknopen in de immuunrespons tegen longkanker T-cellen worden in NSCLC niet alleen in TLO’s opgevoed, maar ook in de drainerende lymfeknopen van de tumor. Kimura et al. toonden in hun experiment aan dat weefsel uit de tumor-drainerende lymfeknopen van patiënten met longkanker voornamelijk T-cellen, maar ook mature DC’s bevat en dat dit weefsel, in cultuur met IL-2, tot 2 maand na wegname uit het lichaam CTL’s blijft produceren gericht tegen tumorcellen. Men vond dat de CTL’s tumorcellen herkenden o.b.v. MHC I en CD8 moleculen. Na de eerste “productieve” fase van 2 maand konden er verder CTL’s geproduceerd worden mits toevoeging van nieuwe lymfocyten. Men besluit dat tumor-drainerende lymfeknopen alle nodige elementen bevatten om een immuunrespons tegen longkanker op te wekken (247).

1.4. Evidentie voor de rol van dendritische cellen in de immuunrespons tegen longkanker Reeds in 1985 toonden Knight et al. het belang van dendritische cellen voor de antitumorale immuunrespons aan (248). Dat dendritische cellen ook in de immuunrespons tegen longkanker een belangrijke rol vervullen blijkt uit de observatie dat longtumoren met een hogere graad van infiltratie met immature DC’s (meerbepaald S100+ Langerhans cellen) een betere prognose hebben (192, 249, 250). Kurabayashi et al. melden inderdaad dat op plaatsen met veel Langerhans cellen meer 33

apoptose van tumorcellen te zien is (201). Andere studies tonen anderzijds aan dat vooral de densiteit van mature DC’s in TLO’s positief correleert met de prognose van longkanker (246, 250). Dai et al. vonden dan weer dat zowel de hoeveelheid mature DC’s in tumor stroma, als in tumor nesten, als in tumor stroma en nesten samen verband hield met een betere prognose bij longkanker (204). 1.4.1. Dendritische cellen voeden T-cellen op tegen de tumorantigenen van longkanker Het positief prognostisch effect van infiltratie met DC’s is logisch gezien hun functie: ze zijn essentieel om een cellulaire immuunrespons op te wekken tegen tumorantigenen (245). Immature DC’s zijn daarbij vooral goed in het opnemen van antigenen uit hun omgeving en hebben ook een cytotoxisch effect op tumorcellen (zie verder), terwijl mature DC’s gespecialiseerd zijn in het presenteren van die antigenen aan naïeve T-cellen. Immature DC’s kunnen onderverdeeld worden in diverse subsets met verschillende functionaliteiten: Langerhans cellen (LC) bevinden zich voornamelijk in het epitheel van de long en interstitiële DC’s (intDC), plasmacytoïde DC’s (pDC) en myeloïde DC’s (mDC) in het stroma (251, 252). Mature DC’s kunnen van eender welke subset immature cellen afkomstig zijn en de oorspronkelijke subsets zijn niet meer te herkennen na maturatie: tijdens hun maturatie verliezen DC’s immers hun specifieke oppervlaktemerkers en vertonen ze een uniform patroon van costimulatoire moleculen (250). Sautès-Fridman et al. stellen dat de mature DC’s in TLO’s in NSCLC rechtstreeks van de immature DC’s in het tumor stroma afkomstig zijn. Ze bestudeerden drie subsets immature DC’s: LC’s kwamen vooral voor in tumor nesten, intDC’s en pDC’s in tumor stroma. Men zag een verband tussen de hoeveelheid LC’s en mature DC’s in NSCLC, wat impliceert dat mature DC’s vooral afkomstig zijn van de LC’s in tumor nesten, die immers in nauw contact staan met tumorcellen en hun antigenen. LC’s zijn daarenboven gespecialiseerd in het induceren van cellulaire immuniteit, en dit in tegenstelling tot intDC’s die vooral een humorale immuunrespons opwekken (250). Men bevestigde ook hun eerdere observatie dat mature DC’s in de context van tertiaire lymfoïde structuren voorkomen in clusters met T-cellen (246). Zowel de graad van infiltratie van de tumor door mature als door immature DC’s (en dan vooral LC’s) bleek gecorreleerd met een betere prognose (250). Dit stemt overeen met de bevindingen van de eerder aangehaalde studies. We kunnen besluiten dat naast de rol van mature DC’s als APC’s ook immature DC’s een belangrijke rol spelen in het initiëren van een immuunrespons doordat ze in nauw contact staan met tumorcellen en hun antigenen. Na opnemen van een nieuw antigen matureren ze en migreren ze naar de TLO’s en lymfeknopen, waar ze T-cellen opwekken tegen steeds nieuwe tumorantigenen van een tumor in progressie die, t.g.v. genomische instabiliteit, zijn antigenen continu verandert (246, 250). Dat een dergelijke immuunrespons ook in staat is om tumoren te vernietigen blijkt uit het onderzoek van Yu et al. dat toont dat het activeren van naïeve T-cellen kan leiden tot regressie van een tumor (253).

34

1.4.2. Dendritische cellen hebben ook directe cytotoxische effecten op longkankercellen Hoewel DC’s de verworven immuniteit dirigeren behoren ze in feite tot het aangeboren immuunsysteem. Net als NK-cellen kunnen zij zonder eerst opgevoed te worden tegen een bepaald antigen cellen in apoptose brengen door expressie van TNF, FasL en TRAIL aan hun oppervlak. Daarnaast kunnen ze apoptotische cellen fagocyteren, waarna ze hun antigenen kunnen presenteren. Dat deze mechanismen ook tegen kankercellen actief zijn is in vitro bevestigd (205, 254-260). Het type DC dat zich het dichtst bij de tumorcellen bevindt is de Langerhans cel (LC). Eerder werd vermeld dat een goede infiltratie van een longtumor met LC’s een betere prognose inhoudt (250). Kurabayashi et al. bevestigen dat LC’s vooral voorkomen in tumor nesten en tonen aan dat in regio’s waar LC’s geclusterd liggen binnen die tumor nesten er een hogere graad van apoptose van tumorcellen is dan op plaatsen waar ze verspreid liggen. Deze observatie kunnen we interpreteren als het gevolg van een direct cytotoxisch effect van LC’s op longtumorcellen (201). Anderzijds zou het ook zo kunnen zijn dat LC’s zich verzamelen op plaatsen waar reeds meer apoptotische cellen waren teneinde deze te kunnen fagocyteren. Baleeiro et al. bevestigen dat DC’s binnen longtumorweefsel een gespreid of geclusterd patroon kunnen vertonen (261). 1.4.3. Dendritische cellen in NSCLC zijn geblokkeerd in een immatuur stadium Zoals hoger reeds beschreven kunnen tumoren DC’s in een immatuur en tolerogeen stadium vasthouden; immature DC’s die niet rijpen en dus in afwezigheid van costimulatoire moleculen een tumorantigen presenteren aan naïeve T-cellen wekken zo tolerantie op en induceren Tregs (243, 245, 262). Concreet bewijs dat dit ook in NSCLC gebeurt vinden we in de studie door Perrot et al. waarin men in longtumorbiopten 3 subsets DC’s terugvond; CD11c- pDC’s, mDC’s rijk aan CD11c en een groep semi-mature mDC’s met intermediaire CD11c expressie die normaalgezien niet voorkomt in perifeer bloed en eigen was aan de tumoromgeving (263). De meeste cellen, en in het bijzonder de intermediaire groep, hadden een immatuur fenotype met weinig of geen expressie van costimulatoire moleculen. De intermediaire mDC’s vertoonden bovendien immunosuppressieve moleculen (zoals de T-cell co-inhibitorische molecule PD-L1/B7-H1) aan hun oppervlak: vermoedelijk waren deze cellen geconverteerd door de tumor tot immunosuppressieve cellen. Men onderzocht hen echter niet verder. Na incubatie met tumorcellen was er wisselende maturatie: alle subsets, en in het bijzonder pDC’s en intermediaire mDC’s, bleven immatuur en hun antigen presenterende functie bleef beperkt: ze konden naïeve T-cellen weinig of niet doen prolifereren (263). Men kan dus besluiten dat tumor-infiltrerende DC’s in NSCLC geblokkeerd zijn in een immatuur stadium en bovendien ongevoelig zijn aan stimulatie door tumorcellen. Sommige DC’s vertonen zelfs immunosuppressieve moleculen (263). 1.4.4. Mechanismen van DC suppressie in longtumoren Hoe longtumoren DC’s precies in een immatuur stadium blokkeren is complex en betreft een interactie van groeifactoren, immunosuppressieve en immunostimulerende moleculen in de micro-omgeving van 35

de tumor. Omdat dendritische cellen zo’n centrale rol in de immuunrespons tegen NSCLC spelen behoren de mechanismen waarmee tumoren de functie van DC’s kunnen hinderen dus tot de belangrijkste immunosuppressieve mechanismen die een tumor kan vertonen. Een overzicht van de gekende mechanismen waarmee tumoren DC’s in een immatuur stadium kunnen blokkeren en op andere manieren de functie van DC’s kunnen inhiberen kan gevonden worden in de review door Gabrilovich (243) en die door Bennaceur (264). Hieronder worden echter enkel mechanismen die aangetoond zijn bij longkanker besproken. Deze worden ook weergegeven in figuur 3 (p48).

Eén molecule dat een belangrijke rol speelt is VEGF, dat naast zijn rol in de neovascularisatie van de tumor ook de maturatie van en infiltratie door DC’s inhibeert. Inoshima et al. stellen dat er een omgekeerde correlatie tussen VEGF expressie en DC infiltratie in longkanker bestaat. VEGF expressie, bloedvat-densiteit en DC infiltratie waren onafhankelijke prognostische factoren (265). Het ganglioside GM3 is een inhibitor van de maturatie van DC’s. Longtumoren met hoge GM3 expressie hebben een lagere densiteit van mature DC’s en een slechtere prognose (266). In small cell lung cancer zijn neuro-endocriene factoren gevonden die de maturatie en functie van DC’s belemmeren. Dit zijn de bombesin-like peptides (BLP). BLP’s worden ook gevonden in NSCLC en spelen hier wellicht een gelijkaardige rol. De best bekende rol van BLP’s is echter als groeifactor voor tumorcellen en het verband tussen overexpressie van BLP’s en een slechtere prognose is dus waarschijnlijk vooral daaraan te wijten (267). Kuo et al. vonden dat humane longcarcinomen galectin-1 kunnen secreteren, een molecule dat expressie van heparin-binding EGF-like growth factor (HB-EGF) op tumor-geassocieerde DC’s doet toenemen, wat tumorcel groei en invasie bevordert (268, 269). Ito et al. tonen aan dat TGF-β in NSCLC door tumorcellen gesecreteerd wordt en in de drainerende lymfeknopen van de tumor DC’s in apoptose brengt, wat opwekken van nieuwe T-cellen bemoeilijkt en metastase naar die knoop vergemakkelijkt (270). Sharma et al. onderzochten het effect van tumor supernatant van een cycloöxygenase-2 (COX-2) secreterende tumor op de functie van DC’s en vonden dat deze niet meer in staat waren een antitumorale immuunrespons op te wekken en zelfs tumorgroei stimuleerden (271). Khuri et al. tonen daarnaast aan dat COX-2 overexpressie bij NSCLC een slechtere prognose inhoudt (272). COX-2 oefent zijn immunosuppressief effect onder meer uit via zijn metaboliet Prostaglandine-E2 (PGE2): Yang et al. toonden aan dat PGE2 de differentiatie en functie van DC’s en de cellulaire immuunrespons tegen tumorcellen tegengaat (273). PGE2 doet dit door de productie van Tissue inhibitors of metalloproteinases-1 (TIMP-1) in DC’s te verhogen. In vitro inhibeert TIMP-1 de migratie van DC’s en in vivo betekent dit waarschijnlijk dat DC-migratie naar drainerende lymfeknopen en naar TLO’s rond de tumor belemmerd wordt (274). COX-2 en PGE2 spelen bij longkanker dus ook een immunosuppressieve rol. Men mag echter niet vergeten dat COX-2 en PGE2 nog andere pro-tumor effecten hebben, ze induceren namelijk resistentie aan apoptose en promoten 36

neoangiogenese en metastase (275-277). De negatieve prognostische waarde van COX-2 overexpressie kan dus niet alleen verklaard worden vanuit zijn immunosuppressief effect. COX-2 lijkt dus een logisch doelwit voor therapie; in lewis lung cancer bij muizen zag men zoals verwacht dan ook een positief effect van COX-2 remmers zoals celecoxib (275). Bij studies op mensen zijn de resultaten echter wisselend. Het effect van COX-2 remmers is immers afhankelijk van de mate van overexpressie van COX-2 door de specifieke tumor. Anderzijds is er ook een belangrijke toxiciteit verbonden aan de benodigde dosissen COX-2 remmers die bij gevorderde longcarcinomen de voordelen overtreft. Zo toont de studie door Altorki et al. dat toevoeging van celecoxib aan de standaardtherapie goede resultaten kan geven in stadium IB tot IIIA NSCLC (278). In een studie op recidief NSCLC had therapie met celecoxib echter geen significant effect op de onderzochte populatie als geheel, maar wel op een subgroep (277). Zowel Koch et al. als Groen et al. tonen tenslotte dat celecoxib overleving in laat stadium NSCLC niet verbetert (279, 280). Een recent gegeven is lipidenaccumulatie in DC’s: een belangrijk percentage van de DC’s bij kankerpatiënten (en ook bij longkanker) hebben hogere triglyceridenniveaus dan controle DC’s. Er is in deze cellen een verhoogde opname van lipiden die waarschijnlijk veroorzaakt wordt door verhoogde expressie van scavenger receptors door de DC’s en dit wordt op zijn beurt wellicht veroorzaakt door factoren die de tumor produceert. Hoewel ze dezelfde MHC- en co-stimulatoire moleculen aan hun oppervlak tonen als controle DC’s, hebben lipiden-beladen DC’s een verminderde capaciteit om antigenen te verwerken en zijn ze niet in staat tot een effectieve antigenpresentatie en stimulatie van Tcellen. Dit laat de tumor toe te ontsnappen aan het immuunsysteem (281). Hoewel longtumoren zelf wel interleukine 10 (IL-10) produceren (282), zetten zij vooral T-cellen aan tot verhoogde IL-10 productie (283, 284). IL-10 is een pro-tumor Th2 cytokine en zorgt voor een verminderde functie van DC’s en van de T-cellen zelf (T-cel anergie). Sharma et al. zagen lewis lung cancer in muizen dat mature DC’s beladen met tumorantigenen afkomstig uit een milieu met veel IL-10 geen antitumorale T-cel respons opwekten (283). Schneider et al. vonden een verhoogde concentratie IL-10 in DC’s afkomstig van humane NSCLC (228). Baleeiro et al. onderzochten NSCLC weefsel van 15 patiënten en vonden een verband tussen minder IL-4 en meer TNF-α gesecreteerd door de tumorcellen en de aanwezigheid van meer immature DC’s dan in gezond longweefsel. Hoewel TNF-α, nochtans een belangrijke factor voor de maturatie van DC’s en macrofagen, dus wel in overvloed aanwezig was stellen de auteurs dat de aanwezigheid van immunosuppressieve cytokines als IL-10 en decoy-receptoren die TNF-α binden de immaturiteit van de DC’s zou kunnen verklaren (261). Granulocyte macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) wordt geproduceerd in sommige longcarcinomen (vooral in slecht gedifferentieerde plaveiselcelcarcinomen) en houdt verband met het aantal tumor-infiltrerende Langerhans cellen (LC). De productie van GM-CSF door de tumorcellen trekt dus LC’s aan naar de tumoromgeving maar heeft daarnaast wellicht ook invloed op de differentiatiegraad van deze cellen (285). Zoals eerder aangehaald heeft infiltratie door de tumor met 37

LC’s een positief prognostisch effect. Wanneer de LC’s echter verhinderd worden om te matureren tot effectieve antigen presenterende DC’s kunnen ze dit effect niet waarmaken. Àvila-moreno et al. onderzochten de DC’s in verschillende longkankers en vonden dat DC’s gelijkaardige fenotypische en functionele veranderingen ondergingen in longadenocarcinomen als in longplaveiselcelcarcinomen maar dat deze bij elk type veroorzaakt waren door andere immunosuppressieve moleculen. De blootgestelde DC’s hadden een verminderde capaciteit om naïeve T-cellen op te voeden. Mechanismen van immunosuppressie van DC’s verschillen dus tussen histologische types longtumoren onderling (284). Een andere observatie is dat het aantal circulerende dendritische cellen in het bloed gedaald is bij longkankerpatiënten (286). De biologische betekenis hiervan is echter niet gekend. Een dendritische cel die onder de invloed ligt van bovengenoemde factoren is zelf immunosuppressief. De immunosuppressieve effecten van deze DC’s zijn gemedieerd via onder andere de secretie van IL-10 door de DC (269, 284) en expressie van het co-inhibitoire molecule B7H3 aan het oppervlak van de DC (228). Deze dysfunctionele DC’s verliezen dus niet alleen hun APC functie maar dragen ook bij tot het immunosuppressieve klimaat in de tumoromgeving.

2. T-cellen 2.1. De functie van T-cellen in de antitumorale immuunrespons T-cellen zijn gekenmerkt door aanwezigheid van CD3, CD4 of CD8 en de T-cel receptor (TCR) op hun oppervlak. CD4+ T-cellen zijn cytokine-secreterende T-helper cellen met een ondersteunende functie. Er zijn verschillende soorten T-helper cellen: type 1 T-helper cellen (Th1) ondersteunen de cellulaire immuunrespons: ze helpen de proliferatie van CD8+ cytotoxische T-cellen (CTL) door ze te stimuleren met IL-2, IL-12 en IFN-γ en ze helpen het opbouwen van memory T-cellen. Daarnaast polariseren ze macrofagen naar een immunogene of anti-inflammatoire functie. Ze kunnen bovendien DC’s aanzetten om optimaal CTL’s te stimuleren via CD40-CD40L interactie. Type 2 T-helper cellen (Th2) zullen B-cellen stimuleren tot productie van antigenspecifieke antilichamen. Th1 cellen secreteren vooral IL-2, 3 en 12, IFN-γ alsook TNF-α en -β. IFN-γ inhibeert proliferatie van Th2 cellen. Th2 cellen produceren IL-4, 5, 6, 10 en 13 en IL-4 inhibeert proliferatie van Th1 cellen. Een sterke Th2 respons inhibeert dus de Th1 respons en bijgevolg ook de cellulaire antitumorale immuunrespons: een sterke Th2 respons promoot dus de tumor (34, 218, 219, 287). T-helper 17 cellen (Th17) zijn een relatief nieuwe subset van T-cellen die o.a. IL-17 produceren en verantwoordelijk zijn voor neutrofiele inflammatie in de context van bacteriële en schimmelinfectie alsook (ongewenst) bij auto-immuniteit. De rol van Th17 responsen in tumoren is controversieel en kan zowel pro-tumorigeen zijn door het onderhouden van chronische inflammatie, of antitumoraal aangezien een subtype van Th17 cellen ook GM-CSF en IFN-γ secreteren (34, 218, 219, 287).

38

CD8+ T cellen zijn cytotoxische T-cellen (CTL). Geactiveerde CTL’s herkennen via hun TCR de tumorcellen die het complementair peptide op hun MHC I presenteren. Ze kunnen doelwitcellen op 2 methodes doden: dit zijn dezelfde 2 die eerder besproken werden bij NK-cellen (34, 218, 219).

2.2. Evidentie voor de rol van T-cellen in de immuunrespons tegen longkanker 2.2.1. Cytotoxische T-cellen spelen een belangrijke rol in longkanker Wei et al. observeerden in 1989 dat, in tumoren met CTL infiltratie, tumorcellen laesies vertoonden die deden denken aan perforine/granzyme geïnduceerde apoptose (288). Törmänen-Näpänkangas et al. vonden dat het aantal tumorcellen in apoptose in NSCLC inderdaad gecorreleerd is met het aantal tumor-infiltrerende lymfocyten (TIL) en voornamelijk met het aantal CD8+ T-cellen. Dit doet vermoeden dat CD8+ T-cellen een cytotoxisch effect hebben op longtumorcellen (289). Daarnaast hebben tal van studies intussen de positieve prognostische waarde van een goede T-cel infiltratie in de tumor duidelijk gemaakt (192, 203, 204, 290-294). Twee cases van patiënten met lange overleving bij NSCLC tonen dat waarschijnlijk CTL’s verantwoordelijk waren voor de langdurige onderdrukking van de tumor (54, 295). CTL’s doden tumorcellen via herkenning van een tumorantigen op hun oppervlak: zo beschreven Nakamura et al. een case van spontane remissie van een longtumor welke vermoedelijk op basis van een anti-NY-ESO-1 immuunrespons ontstond. Men vond IgG, CD4+ en CD8+ T-cellen tegen NY-ESO-1 (84). We kunnen besluiten dat CTL’s belangrijke mediatoren van tumorcel apoptose zijn. Welke antigenen in staat zijn om een cellulaire antitumorale immuunrespons op te wekken werd eerder al besproken. 2.2.2. Zowel CD8+ CTL’s als CD4+ T-helper cellen spelen een rol in NSCLC In NSCLC zijn ongeveer 2/3 van de immuuncellen in het tumor stroma lymfocyten: 80% daarvan zijn T-cellen en 1/3 van de T-cellen zijn CD8+ T-cellen (199). Eerder werd vermeld dat er in een longtumor tertiaire lymfoïde organen (TLO’s) kunnen bestaan die eenzelfde functie als lymfeknopen vervullen. Mature DC’s en CD4+ T-cellen vertegenwoordigen het grootste aandeel van de cellen in deze TLO’s. CD8+ T-cellen daarentegen worden vooral in het tumorweefsel zelf gevonden. CD4+ T-cellen en (bet+) Th1 cellen zijn sterker gecorreleerd met de densiteit van mature DC’s in de tumor dan CD8+ T-cellen. Mature DC’s geclusterd met CD4+ T-cellen hebben een prognostisch belang omdat zij in staat zijn de continu veranderende antigenen van de tumor te presenteren aan nieuwe CTL klonen en deze te doen prolifereren (246). 2.2.3. Niet alleen de hoeveelheid T-cellen maar ook de plaats waar zij zich bevinden in de tumor is belangrijk. T-cellen kunnen in verschillende mate in tumor stroma en in tumor nesten aanwezig zijn. Het belang van dit onderscheid wordt geïllustreerd door de volgende studies: Lee et al. vonden dat lymfocyt infiltratie in tumor stroma bij NSCLC gecorreleerd was met langere overleving (296). Johnson et 39

al. vonden daarentegen dat in NSCLC vooral infiltratie van T-cellen in tumor nesten positief prognostisch was. Doordat men een CD3-merker gebruikte nam men hierbij CD4+ en CD8+ T-cellen samen. Wanneer men echter de CD8+ T-cellen apart bekeek, bleek er voor deze geen verband met overleving. CD4+ T-cellen werden niet afzonderlijk gemerkt. De stromale infiltratie had in deze studie geen prognostisch belang (192). Wakabayashi et al. vonden dat de graad van infiltratie van tumor stroma met CD4+ T-cellen geassocieerd was aan betere prognose in NSCLC en dit in tegenstelling tot de graad van infiltratie van tumor nesten met CD8+ T-cellen die een slechtere prognose inhield, maar enkel bij adenocarcinomen en niet bij plaveiselcelcarcinomen. De graad van infiltratie van CD4+ T-cellen in tumor nesten of van CD8+ T-cellen in tumor stroma had in deze studie geen verband met de overleving. Hun observaties suggereren in feite dat CD8+ T-cellen geen effector rol vervullen in NSCLC type adenocarcinoom (291). Dit is tegengesteld aan wat eerder in colorectaal carcinoom en andere kankers werd geobserveerd en stemt bovendien ook niet overeen met wat andere studies observeren (zie verder). Hoewel ook Johnson et al. geen verband vonden tussen intratumorale infiltratie met T-cellen en overleving (192), wijzen recentere studies toch op een prognostische waarde voor CD8+ T-cel infiltratie in NSCLC. In een studie op 1208 gereseceerde NSCLC’s, vond men dat TIL in tumor nesten in ¼ van de specimens voorkwamen en dat hun aanwezigheid gerelateerd was aan een betere overleving. TIL in tumor nesten waren vooral CD8+ T-cellen (294). Al-Shibli et al vonden dat zowel CD8+ T-cel infiltratie in tumor stroma als in tumor nesten positief prognostisch was en dat de CD4+ T-cel infiltratie in tumor stroma maar niet in tumor nesten positief prognostisch was (292). Dai et al. stellen dat de gecombineerde infiltratie van CD8+ cytotoxische Tcellen in tumor stroma en nesten samen geassocieerd is met langere overleving (204). 2.2.4. Een

efficiënte

antitumorale

immuunrespons

tegen

longkanker

vereist

samenwerking tussen CD8+ en CD4+ T-cellen. De observatie dat CD4+ T-cel infiltratie maar niet CD8+ T-cel infiltratie een gunstige prognostische waarde heeft (291) zou kunnen verklaard worden doordat CD4+ T-cellen nodig zijn voor het goed functioneren van CD8+ T-cellen, stellen Al-Shibli et al.; zij vonden dat gecombineerde infiltratie van tumor stroma met CD4+ en CD8+ T-cellen een onafhankelijke positief prognostische factor was (240, 292). Ook Hiraoka et al. vonden dat de gecombineerde infiltratie van CD4+ én CD8+ Tcellen in tumor stroma (doch niet in tumor nesten) positief prognostisch was (290). Yoshida et al. vonden dan weer dat de gecombineerde infiltratie van CD4+ en CD8+ T-cellen in tumor nesten verband hielden met een betere overleving (64). Een tweede studie door Al-Shibli et al. toont dit ook, maar voegt toe dat het verband minder sterk is als bij gecombineerde infiltratie in het tumor stroma (240). Op basis van deze resultaten kunnen we besluiten dat de antitumorale immuunrespons een samenwerking van CD4+ en CD8+ T-cellen vereist.

40

2.2.5. Slecht gedifferentieerde longtumoren trekken meer CTL’s aan Een vaak geobserveerd fenomeen is dat slecht gedifferentieerde longtumoren een hogere graad van CTL infiltratie in tumor nesten hebben. Dit kan verklaard worden doordat tumoren met een hoge graad van dedifferentiatie meer tumorantigenen vertonen en dus makkelijker CTL’s aantrekken (204, 290, 291). Een gevorderde tumor ontwikkelt echter vaak ook mechanismen om het immuunsysteem te ontwijken of om immuuncellen aan te wenden voor lokale immunosuppressie, en dit vooral m.b.t. cellen die zich dicht bij de tumorcellen bevinden zoals de CD8+ T-cellen in tumor nesten. Meer CTL’s in de tumor nesten betekent dus niet noodzakelijk een betere immuunrespons en een betere overleving. Dit wordt duidelijk geïllustreerd door de bevindingen van Wakabayashi et al. die CD8+ T-cellen in tumor nesten een negatief effect op de prognose toekenden (291). 2.2.6. Bedenkingen en conclusie Al-Shibli et al. maken de opmerking dat tumoren met veel CTL infiltratie in tumor stroma minder angiolymfatische invasie hebben: dit kan wijzen op een protectief effect van deze cellen in de angiolymfatische ruimte, of op productie van cytokines die lymfangiogenese tegengaan. Het positief prognostisch effect van CTL’s kan dus deels hierdoor gemedieerd zijn (292). Hiroaka et al. vermelden eveneens dat CTL infiltratie in tumor stroma verband houdt met verminderde lymfeknoop invasie door de tumor (290). De meeste bovenstaande studies onderzochten stadium I tot III NSCLC. De studie door Kawai et al. onderzocht echter specifiek stadium IV NSCLC en toont dat infiltratie van tumor nesten door CD8+ T-cellen ook in stadium IV NSCLC gecorreleerd is met betere prognose. Men vond ook dat patiënten met meer CD8+ T-cellen in tumor nesten dan in tumor stroma een betere overleving hadden dan de anderen (203). Deze bevinding is wederom in strijd met de bevindingen van Wakabayashi et al. (291) maar een verklaring ervoor kan misschien zijn dat de tumor micro-omgeving bij stadium IV NSCLC veranderd is t.o.v. vroegere stadia. Ten slotte merken Dai et al. op dat een tekortkoming van hun studie het gebruik van 1 enkele merker voor elk type cel is (204). Deze opmerking geldt echter voor alle hier besproken studies en houdt in dat wanneer men er van uit gaat dat één merker exclusief op een bepaald type cel voorkomt, men een foute meting maakt als de desbetreffende merker toch ook op een ander type cel (met een andere functie) blijkt voor te komen. Zo komt de CD8-merker in feite niet alleen op effector lymfocyten (CTL) voor, maar ook op sommige CD8+ regulatoire T-cellen (Treg). Deze Tregs hebben juist een immunosuppressief effect. Een aantal studies bevestigen de aanwezigheid van CD8+ Tregs in het bloed van patiënten met NSCLC (297, 298) , maar meer onderzoek is nodig naar hun aanwezigheid en rol in de tumor omgeving zelf. Tumoren kunnen het cytotoxisch effect van CTL’s op verschillende manieren (bv. door verbergen van hun antigenen of verliezen van MHC expressie) ontwijken: het is dus logisch dat CTL infiltratie niet altijd een positief prognostisch effect heeft. Dit wordt duidelijk weerspiegeld in de besproken studies. Anderzijds is hiermee de observatie dat sterke 41

CD8+ T-cel infiltratie in tumor nesten een slechtere prognose met zich meebrengt (291) niet verklaard en is dit misschien te wijten aan Tregs. Ook CD4+ Tregs bestaan en zijn zelfs beter beschreven dan CD8+ Tregs. Het netto effect van CD4+ T-cel infiltratie is in de gevonden studies echter steeds gunstig (292). We kunnen besluiten dat het belang van tumor-infiltrerende T-cellen controversieel blijft, met een algemene trend naar een positief prognostisch effect voor meer infiltratie. De vernoemde studies maken onderscheid tussen cellen in het tumor stroma en cellen in tumor nesten, maar maken geen onderscheid tussen effector T-cellen en Tregs. Meer studies zijn dus nodig die nauwkeurig T-cel types onderscheiden en de prognostische betekenis van elk type afzonderlijk bekijken.

3. Regulatoire T-cellen (Tregs) 3.1. De functie van regulatoire T-cellen in de antitumorale immuunrespons Regulatoire T-cellen hebben het vermogen om functie en proliferatie van CD4+ en CD8+ effector T-cellen, DC’s, NK-cellen en B-cellen via cel-cel contact te inhiberen (262, 299). Er zijn verschillende types Tregs en een belangrijk onderscheid is dat tussen natuurlijk voorkomende Tregs die ontstaan in de thymus en geïnduceerde Tregs die ontstaan in de periferie uit CD4+ CD25- naïeve of effector (Thelper of CTL) T-cellen die tot Tregs omgevormd worden onder invloed van TGF-β. Dit gebeurt door inductie van Forkhead box protein 3 (Foxp3) expressie en dit effect is dosisafhankelijk (300-302). Foxp3 is een specifieke merker voor Tregs, maar er bestaan Tregs die Foxp3- zijn (303). Een andere merker voor Tregs is CD25 (301). TGF-β kan afkomstig zijn van tumorcellen zelf en zo perifeer CD4+ T-cellen converteren naar Tregs (262, 304). TGF-β kan ook geproduceerd worden door DC’s die daartoe door de tumor worden aangezet zoals aangetoond door Dumitriu et al. die observeerden dat DC’s in kweek gebracht met longkankercellen meer TGF-β secreteerden en dat deze DC’s meer CD4+CD25+Foxp3+ Tregs konden opwekken (305). Interessant is dat Tregs zelf ook TGF-β produceren (299, 306).

3.2. Evidentie voor de rol van regulatoire T-cellen in de immuunrespons tegen longkanker Er zijn verschillende types Tregs geïdentificeerd bij mensen (301) maar vooral CD4+ Tregs zijn bestudeerd bij NSCLC. De aanwezigheid van CD4+ Tregs in TIL van NSCLC werd in 2001 door Woo et al. gemeld (306). Eén van hun effecten in longkanker werd later door dezelfde groep geïdentificeerd: ze inhiberen selectief de proliferatie van autologe T-cellen in longkanker (307). Shimizu et al. vonden dat Tregs vaker voorkomen in COX-2 producerende longtumoren en dat patiënten met veel Tregs sneller tumor recidief hadden (308). Het is inderdaad zo dat COX-2 en zijn metaboliet PGE2 Tregs kunnen induceren (309). Su et al. vonden dat naarmate een longtumor vordert, er meer en meer CD4+CD25+ Tregs aanwezig zijn in tumor-drainerende lymfeknopen. Hoe meer CD4+CD25+ Tregs er bovendien waren, hoe minder CD8+ T-cellen werden gevonden en hoe meer TGF-β en IL-10 in de lymfeknopen aanwezig was (310). Ju et al. vonden een subpopulatie sterk 42

immunosuppressieve CD13+CD4+CD25+ Tregs in het bloed van NSCLC patiënten. Naast CD13 vertoonden ze ook hoge Foxp3, CTLA-4, mTGFβ1 en B7-H1 expressie en secreteerden ze TGF-β en IL-10. Deze subpopulatie maakte een belangrijker deel uit van de totale populatie CD4+CD25+ Tregs naarmate de tumor een meer gevorderd stadium had maar hun aandeel nam af na resectie van de tumor. Toedienen van monoklonale antilichamen tegen CD13 kond secretie van IL-10 en TGF-β en het immunosuppressief effect op CD4+ T-cellen doen afnemen. CD13 is dus een potentieel doelwit om Treg activiteit te onderdrukken en het effect van immunotherapie op longtumoren te verbeteren (311). De studie door Tao et al. wijst een verband tussen Treg infiltratie en een slechtere overleving uit. Men telde hiervoor het aantal Tregs in tumor coupes (312). Aangezien CD8+ Tregs fenotypisch gelijkaardig zijn aan CD4+ Tregs (313) is het effect beschreven door Tao et al. dus wellicht te wijten aan de beide populaties Tregs samen. In de studie door Petersen et al. gebruikte men Foxp3 als merker om Tregs te tellen (293). Foxp3 komt echter niet alleen op CD4+ Tregs maar ook op CD8+ Tregs voor (313). Een belangrijke caveat is daarnaast dat Foxp3 expressie ook toeneemt bij humane T-cel activatie. Men vond geen verband tussen het aantal Foxp3+ cellen in de tumor en overleving maar wel tussen de ratio Treg/totaal aantal T-cellen in de tumor en de overleving; patiënten met veel Tregs in verhouding tot de totale T-cel infiltratie hadden een kortere ziektevrije overleving (293). Dat bovenstaande studies zowel CD8+ als CD4+ Tregs onderzochten kan de discrepantie verklaren met de resultaten van Kayser et al., die aantoonden dat CD4+ Tregs in het tumor stroma in feite een positieve prognostische waarde hebben in NSCLC, en dit vooral in adenocarcinoom (314). Het negatief prognostisch effect gevonden door Petersen (293) en Tao (312) zou dus veroorzaakt kunnen zijn door het meetellen van CD8+ Tregs. Wat CD8+ Tregs betreft werden in de context van NSCLC enkel studies gevonden die een verhoogde aanwezigheid van CD8+ Tregs in het bloed van NSCLC patiënten aantonen (297, 298). CD8+ Tregs kunnen zoals CD4+ Tregs ook Foxp3+ en CD25+ zijn en zijn fenotypisch gelijkaardig aan CD4+ Foxp3+ Tregs (313). In prostaatcarcinoom werd wel al een immunosuppressief effect van CD8+ Foxp3+ Tregs aangetoond: ze inhiberen daar via direct celcontact de proliferatie van naïeve T-cellen (315).

We kunnen besluiten dat Tregs een belangrijke immunosuppressieve rol spelen in NSCLC, maar dat nog niet geheel duidelijk is of zij per definitie de antitumorale immuunrespons ondersteunen dan wel ondermijnen. Kayser et al. zijn de eersten die het prognostisch effect van één specifieke Treg populatie (CD4+ Tregs) in één specifiek tumor compartiment (NSCLC stroma) onderzochten en vonden dat deze juist met een betere overleving verband hielden (314). Er is vooral meer onderzoek nodig naar de functie en prognostische betekenis van CD8+ Tregs in NSCLC om duidelijkheid te scheppen omtrent hoe deze zich verhouden tot de tumor, tot de prognose en tot de populatie CD4+ Tregs. Daarnaast is het inhiberen van Tregs een belangrijke piste om het effect van immunotherapieën te versterken. In de discussie wordt hierop dieper ingegaan. 43

Eén interessante case die de effecten van Tregs in NSCLC illustreert is de al eerder beschreven case van een patiënt waarbij spontane regressie van pleurale metastasen en verkleining van de primaire tumor optrad op basis van een anti-NY-ESO-1 immuunrespons met antigenspecifieke IgG’s, CD4+ en CD8+ T-cellen (84). Bij diezelfde patiënt trad later toch recidief op en dit ging gepaard met een afname van de antigenspecifieke IgG’s, CD4+ en CD8+ T-cellen enerzijds, maar anderzijds ook met een toename van Foxp3+ CD25+ Tregs en TGF-β in het serum (83).

4. B-cellen 4.1. De functie van B-cellen in de antitumorale immuunrespons Hoewel aan B-cellen in transplantatie- en auto-immuniteitmodellen een belangrijke rol (door synergie met T-cellen) wordt toegekend, worden zij in de tumor immunologie minder belangrijk geacht (316). Nochtans zouden de antilichamen geproduceerd door B-cellen in theorie kunnen bijdragen aan de antitumorale immuunrespons door faciliteren van celdoding door NK-cellen (ADCC), door opsonisatie van tumorantigenen, door een complementfunctie en door het moduleren van bepaalde proteïnen: ze kunnen bv. groeifactorreceptoren op het oppervlak van de tumorcel blokkeren (17, 316). De review door Reuschenbach et al. toont dat veel humane kankers en allerlei types tumorantigenen inderdaad tumorspecifieke antilichaamresponsen kunnen opwekken, maar deze hebben vaak geen prognostische waarde (24). Desalniettemin wordt infiltratie van een tumor door een groot aantal Bcellen vaak wel geassocieerd aan een betere prognose. Dit wijst op additionele effecten van B-cellen in de tumor zoals lokale inperking van tumorcellen en ondersteuning van de T-cel immuunrespons (24, 195, 292, 316, 317). Tumor-infiltrerende B-cellen (TIB) zijn aanwezig in een kwart van alle humane tumoren en worden aangetroffen in lymfoïde aggregaten samen met DC’s en T-cellen (246, 316). Wat lokale effecten van B-cellen betreft is er inderdaad evidentie voor directe cytotoxiciteit door B-cellen o.v.v. secretie van granzyme B en activatie van de TRAIL-pathway (316). Daarnaast spelen B-cellen een rol als immunoregulatoren: ze ondersteunen de effecten van andere immuuncellen via cytokines en oppervlaktereceptoren. Zo ondersteunen ze ook de cellulaire immuunrespons tegen de tumor (316, 318). Tenslotte kunnen B-cellen dienst doen als APC’s voor CD4+ en CD8+ T-cellen. Ze zijn hierin complementair aan DC’s: DC’s zorgen voor de initiële selectie en proliferatie van antigenspecifieke T-cellen terwijl B-cellen vooral T-cel expansie en vorming van memory T-cellen ondersteunen (316).

B-cellen zijn daarnaast ook in staat om zgn. tertiaire

lymfoïde structuren rond de tumor te helpen vormen door productie van lymfotoxines en chemokines die DC’s en T-cellen aantrekken en stimuleren (316, 319, 320). B-cellen hebben dus verschillende rollen in de antitumorale immuunrespons; productie van antilichamen, directe cytotoxiciteit, regulatie van andere immuuncellen en een antigen presenterende functie. Er bestaan echter ook regulatoire Bcellen die de immunosuppressieve cytokines IL-10 en TGF-β produceren en zo de immuunrespons tegen kanker afzwakken (316).

44

4.2. Evidentie voor de rol van B-cellen in de immuunrespons tegen longkanker 4.2.1. De humorale immuunrespons bij longkanker B-cellen produceren antilichamen tegen specifieke tumorantigenen. In NSCLC komen talloze antigenen voor waartegen zo’n humorale immuunrespons gedocumenteerd is. Meestal heeft deze echter geen effect op de prognose. Twee tumorantigenen bij NSCLC waartegen een humorale immuunrespons bestaat die wel geassocieerd is met de prognose zijn p53 en MUC1 (24). Anti-p53 antilichamen zijn in NSCLC geassocieerd aan een slechtere prognose en aan het voorkomen van maligne pleurale effusie. Naargelang het type mutatie in het p53 gen worden al dan niet anti-p53 antilichamen opgewekt; zo worden antilichamen zelden gezien in overexpressed p53. Deze antilichamen zouden misschien makkelijker opgewekt kunnen worden door agressievere mutaties in het gen, dit zou de negatieve prognostische waarde van deze antilichamen kunnen verklaren (321, 322). Anti-MUC1 IgG komt voor in gezonde individuen, het is een natuurlijk autoantilichaam. De hoeveelheid antilichamen tegen MUC1 is in NSCLC patiënten verlaagd ten opzichte van die in gezonde individuen. Er zijn echter onderlinge verschillen tussen NSCLC patiënten en Hirasawa et al. vonden dat een grotere hoeveelheid overblijvende antilichamen sterk correleerde met een betere overleving. Men stelt dat de vermindering in concentratie wellicht te wijten is aan complexvorming van de antilichamen op het oppervlak van longtumorcellen. Tumorcellen zouden zo aan elkaar kunnen klitten, wat tumorcel invasie zou kunnen verminderen. Daarnaast werd bij borstkanker beschreven dat therapie met anti-MUC1 IgG T-cel proliferatie en de T-cel cytotoxiciteit ondersteunt. Eén of meer van deze effecten zouden de positieve prognostische waarde van anti-MUC1 antilichamen in NSCLC kunnen verklaren (323). De meeste tumor-specifieke antilichamen hebben echter geen invloed op de prognose, wat zou kunnen betekenen dat hun rol in NSCLC eerder beperkt is. Zo vonden Venkataraman et al. dat de antilichaam producerende activiteit van B-cellen in gevorderde longkanker verlaagd is door gebrek aan T-helper cel stimulatie enerzijds en suppressie door T-cellen en andere immuuncellen anderzijds (324, 325). De B-cellen in deze studies waren uitsluitend afkomstig uit het bloed van de patiënten maar het is mogelijk dat B-cellen op de tumorsite een gelijkaardig functiedefect vertonen. Anderzijds is een verklaring voor het controversieel effect van antilichamen misschien dat hoewel de concentratie van antilichamen in het bloed altijd vrij laag is, de concentratie op de tumorsite hoger zou kunnen zijn doordat tumor-infiltrerende B-cellen (TIB) lokaal grote hoeveelheden antilichamen produceren (316). Dat TIB inderdaad antilichamen produceren in NSCLC en dat de antilichamen gevonden in het bloed niet louter van circulerende lymfocyten afkomstig zijn werd aangetoond door Yasuda et al. (326). Mizukami et al. bevestigden dat IgG afkomstig van humane TIB inderdaad een rol speelt in het inperken van de groei van humane longtumoren getransplanteerd naar muizen, maar enkel voor plaveiselcelcarcinomen (327).

45

4.2.2. Tumor-infiltrerende B-cellen in de longtumor Bij het bekijken van het prognostisch effect van tumor-infiltrerende B-cellen is het, net zoals bij Tcellen, belangrijk na te gaan waar de B-cellen zich bevinden: in tumor nesten of in tumor stroma. De gevonden resultaten zijn, zoals ook voor T-cellen, soms tegenstrijdig. Johnson et al. vonden geen verband tussen het aantal B-cellen in tumor nesten en de overleving in NSCLC (192). Anderzijds toonden Pelletier et al. aan dat de graad van B-cel infiltratie in tumor stroma een onafhankelijke positief prognostische factor was in stadium I tot III NSCLC (317). AlShibli et al. bevestigden dat zowel B-cellen in tumor stroma als die in tumor nesten gecorreleerd waren met een betere overleving, maar ze hadden geen onafhankelijke prognostische impact (292). Pelletier et al. stellen dat het positief prognostisch effect van B-lymfocyteninfiltratie in longkanker zou kunnen verklaard worden door een lokale inperking van tumorcellen, wat de incidentie van micrometastasen zou kunnen beperken. Anderzijds is het mogelijk dat de aanwezigheid van B-cellen niet meer is dan het gevolg van een goed werkende cellulaire immuunrespons en dat in feite deze laatste vooral verantwoordelijk is voor een betere prognose. Het is dus niet zeker dat deze resultaten op een rol voor B-cellen in de antitumorale immuunrespons tegen longkanker wijzen (317). Naast een direct effect van B-cellen kunnen de antilichamen die zij lokaal produceren een rol spelen via ADCC of andere mechanismen (zie hoger) (195). We treffen B-lymfocyten dus aan in tumor stroma en in tumor nesten, maar ze worden ook gevonden in B-cel follikels in de eerder beschreven TLO’s. Sommige van deze B-cel follikels hebben een actief germinaal centrum met prolifererende B cellen (246).

46

Figuur

2.

De

antitumorale

immuunrespons bij longkanker vindt plaats in verschillende compartimenten. In de tumoromgeving zelf vinden we M1

De antitumorale immuunrespons bij longkanker

macrofagen die een antitumorale functie uitoefenen: ze doden tumorcellen in tumor

Tumor

nesten. NK-cellen doden cellen via ADCC

NK

of via hun KIR wanneer de doelwitcel

DC

expressie van MHC I verloren is. Ze

IFN-γ IL-2 IL-12

produceren ook IFN-γ, dat de antitumorale Th1

respons

ondersteunt.

In

M1

de Th1

tumoromgeving vinden we ook immature

CTL

B

DC’s zoals Langerhans cellen (LC), die hier tumorantigenen opnemen en mogelijks ook

een

direct

cytotoxisch

effect Th1

uitoefenen. Deze DC’s matureren en migreren vervolgens naar Ti-BALT of naar tumor-drainerende

lymfeknopen.

en CD8+ T-cellen “opvoeden” tegen de CD8+

T-cellen

B

Long

CTL

De

mature DC’s zullen hier vervolgens CD4+

tumor-antigenen.

DC

Ti-BALT of lymfeknoop

zijn

CTL’s die migreren naar de tumor waar ze tumorcellen op een antigenspecifieke wijze kunnen doden. Het zijn de belangrijkste effector

cellen

in

de

antitumorale

immuunrespons. CD4+ T-cellen zijn Th1 of Th2 cellen. Th1 cellen ondersteunen de

CD4+ T-cel

Immature DC

CD8+ T-cel

Mature DC

Regulatoire T-cel

M1 macrofaag

B-cel

M2 macrofaag

NK-cel

MDSC

Stimulatie

Inhibitie

proliferatie en functie van CTL’s: ze komen voor in de tumoromgeving en ook in clusters met mature DC’s in Ti-BALT. Een goede samenwerking tussen CD4+ en CD8+ T-cellen is essentieel voor een effectieve antitumorale immuunrespons. Th1 cellen produceren o.a. IL-2, IL-12 en IFN-γ. Deze Th1 cytokines zijn essentieel voor een werkzame cellulaire immuunrespons. B-cellen vinden we terug in Ti-BALT waar ze T-cel proliferatie ondersteunen; ze komen ook voor in de tumoromgeving en hebben mogelijks cytotoxische effecten. Verder produceren ze antilichamen, maar de rol van antilichamen in de antitumorale immuunrespons is wellicht eerder beperkt.

47

Figuur 3. In de meeste longtumoren heerst een immunosuppressief milieu en treffen we talrijke cellen aan met een pro-tumor functie. De functies van de antitumorale

Tumor immunosuppressie en pro-tumor immuuncellen

immuuncellen worden tegengewerkt door dit milieu en deze cellen. M2 macrofagen

Tumor

veroorzaken T-cel dysfunctie door direct

NK DC

celcontact en dragen ook bij tot de

TGF-β IL-10 COX-2 PGE2

immunosuppressie door productie van o.a. IL-10 en TGF-β. MDSC’s kunnen T-cel Treg

responsen direct onderdrukken. Daarnaast

Th2

produceren ze IL-10 en TGF-β en

M2

CTL

verstoren ze ook de functie van DC’s en MDSC

NK-cellen. NK-cellen vertonen in NSCLC functionele defecten (o.a. door HLA-G Treg

expressie op de tumorcellen) en produceren minder IFN-γ. DC’s worden door de tumoromgeving

bij

NSCLC

in

DC

Th2

Long

CTL

een

immatuur stadium vastgehouden en ook hun migratie naar lymfeknopen en Ti-

Ti-BALT of lymfeknoop

T

Conversie o.i.v. TGF-β

Treg

BALT wordt verhinderd. Dit gebeurt o.a. onder invloed van TGF-β , IL-10, COX-2 CD4+ T-cel

Immature DC

CD8+ T-cel

Mature DC

Regulatoire T-cel

M1 macrofaag

cel respons op te wekken. Ze veroorzaken

B-cel

M2 macrofaag

tolerantie

NK-cel Stimulatie

MDSC

en PGE2. Dergelijke dysfunctionele DC’s zijn dus niet in staat om een effectieve T-

en

wekken

Tregs

op.

Ze

produceren bovendien zelf IL-10 en TGF-

Inhibitie

β. Tregs worden aangetrokken door het immunosuppressief milieu. TGF-β zorgt lokaal voor conversie van effector T-cellen naar Tregs en ook COX-2 en PGE2 dragen bij tot de vorming van Tregs. Tregs kunnen DC’s en T-cellen in apoptose brengen en produceren IL-10 en TGF-β. Tregs zijn naast dysfunctionele DC’s dus een belangrijke oorzaak van tolerantie tegenover de tumor doordat ze specifiek de functie van CTL’s inhiberen. CD8+ CTL’s worden tevens door dysfunctionele DC’s geïnhibeerd (o.a. doordat deze IL-10 en IDO produceren). Th2 cellen zijn CD4+ T-cellen die de humorale immuunrespons ondersteunen en de Th1 respons onderdrukken en zo dus de cellulaire immuunrespons tegenwerken. TGF-β en IL-10 zijn typische Th2 cytokines: het zijn dé kenmerkende cytokines van de immunosuppressieve tumoromgeving. Ze worden geproduceerd door tumorcellen zelf, door Th2 cellen, MDSC’s, M2 TAM’s, dysfunctionele DC’s en door Tregs. Ze trekken immunosuppressieve cellen aan en inhiberen effector cellen (ze veroorzaken bv. DC dysfunctie en T-cel anergie). COX-2 wordt geproduceerd door de tumorcellen zelf en samen met zijn metaboliet PGE2 speelt het een rol in aantrekken van Tregs en in DC dysfunctie. Voor de bespreking van andere immunosuppressieve mechanismen wordt verwezen naar de tekst.

48

IV. Ontstaan van kanker ondanks de antitumorale immuunrespons: Falen

van

de

immuunrespons

door

tumor

escape

en

immunosuppressie door de tumor. Hoewel de hierboven beschreven immuunresponsen wel in een beginstadium in staat zijn om neoplastische cellen te elimineren zullen tumorcellen er uiteindelijk toch in slagen om het immuunsysteem te omzeilen. Eerder werd al dieper ingegaan op de mechanismen die longtumoren kunnen ontwikkelen om de functie van DC’s tegen te gaan. Hier wordt een dieper ingegaan op welke strategieën tumoren (niet specifiek longtumoren) gebruiken om te ontsnappen aan het immuunsysteem en om het immuunsysteem te onderdrukken en in hun eigen voordeel aan te wenden. Figuur 3 (p48) biedt een overzicht van de belangrijkste immunosuppressieve mechanismen en cellen bij longkanker.

1. Tumor immunoediting: de 3 E’s De cellulaire immuniteit heeft als intrinsiek nadeel dat er na een periode van tumorceldestructie een aantal tumorcellen overblijven die geen antigenen dragen welke het immuunsysteem herkent (waar een CTL kloon tegen bestaat) of die op een andere manier ontsnappen aan het immuunsysteem (mechanismen van tumor escape: zie verder). Deze cellen zullen prolifereren en uiteindelijk toch tot vorming van een klinische tumor leiden. Vanuit dit fenomeen is het tumor “immuno-editing” model ontwikkeld. Dit model kent 3 fasen: elimination, equilibrium en escape (de 3 E’s). In de eliminatiefase slaagt het immuunsysteem erin om de tumor volledig te elimineren. In de evenwichtsfase (equilibrium) ontstaan er door de genetische instabiliteit van de tumor voortdurend nieuwe varianten van de tumorcel die vervolgens worden tegengewerkt door nieuwe T-cel klonen. Dit leidt uiteindelijk tot selectie van resistente tumorcellen die ontsnappen aan het immuunsysteem (escape). Tegelijk zal de groeiende tumor meer en meer immunosuppressieve mechanismen ontwikkelen door de zich opstapelende mutaties. Dit is het begin van de klinische fase van de tumor. De uiteindelijke vorm van de tumor is het resultaat van enerzijds eliminatie en anderzijds selectie van tumorcellen door het eigen immuunsysteem. Dit betekent dat het immuunsysteem zelf oorzaak is van het feit dat klinische tumoren reeds verschillende escape-mechanismen ontwikkeld hebben en dus nog maar weinig immunogeen zijn (21, 224, 328-332). Tal van experimentele onderzoeken hebben intussen bewijzen geleverd voor de immunoediting hypothese. Roithmaier et al. toonden in een studie op 905 transplantpatiënten aan dat de incidentie van nieuwe tumoren bij patiënten onder immunosuppressie gemiddeld 7.1 maal hoger lag dan in een gezonde populatie (333). De studie door Ikai et al. waarbij 3625 gezonde Japanse deelnemers 11 jaar werden opgevolgd toonde dat deelnemers met lymfocyten met sterkere cytotoxische eigenschappen een lager kankerrisico hadden dan deelnemers met minder sterk cytotoxische lymfocyten (185). 49

2. Tumor Escape mechanismen: Wat gaat er fout? 2.1. De tumor ontsnapt aan het immuunsysteem (21, 218, 219, 224, 264, 331, 334-336) Een tumor kan methoden ontwikkelen om aan het immuunsysteem te ontsnappen. Dergelijke tumorcellen met de capaciteit om verborgen te blijven voor het immuunsysteem worden in feite geselecteerd door het immuunsysteem zelf: dit heet immunoselectie. Hier worden een aantal van deze methoden besproken. Eén zeer veel voorkomende strategie is het downreguleren van moleculen die een rol spelen in de antigenpresentatie. Zo kan een tumor de expressie van MHC I verliezen. Dit is een zeer veel voorkomend mechanisme in longkanker: ongeveer 1/3 van de longtumoren heeft volledig verlies van MHC I, 1/3 heeft een verminderde expressie en 1/3 heeft normale expressie. Verminderde expressie van MHC I is gecorreleerd met een verminderde infiltratie van tumor nesten met CTL’s en met een slechtere overleving (337). Een tumor kan ook transporterproteïnes of moleculen van het proteasoom downreguleren. Een derde methode is het verliezen van het antigen zelf waartegen CTL’s bestonden. Op deze drie manieren kan een tumorcel zich verbergen voor het immuunsysteem. Een voor het immuunsysteem verborgen tumorcel zal enerzijds T-cellen minder goed stimuleren en anderzijds een moeilijk doelwit voor T-cellen zijn. Tumoren kunnen hun stressmoleculen of co-stimulatoire moleculen verbergen. Cellen presenteren als gevolg van maligne transformatie stressmoleculen aan hun oppervlak. Deze hebben een activerende functie voor zowel T- als NK-cellen en zijn ook nodig voor maturatie van DC’s. Een tumor kan de expressie van dergelijke stressmoleculen onderdrukken met als gevolg verminderde stimulatie van deze cellen. Voorbeelden van dergelijke stressmoleculen zijn MICA en MICB. Dit kan ook voor co-stimulatoire moleculen als B7 gebeuren. Co-stimulatie is essentieel voor het opwekken van een T-cel respons. Tumoren

kunnen

stressreceptoren

verzadigen.

Wanneer

tumoren

de

bovenvermelde

stressmoleculen (bv. MICA) in oplosbare vorm gaan secreteren, kunnen ze zo de receptoren voor die moleculen op T- en NK-cellen verzadigen. Tumorcellen kunnen weerstand aan bieden aan apoptose. Apoptose kan in gang gezet worden via 2 pathways; een mitochondriale (intrinsieke) pathway en een death-receptor (extrinsieke) pathway die beiden leiden tot het activeren van intracellulaire caspases. Een tumorcel kan anti-apoptotische proteïnes aanmaken: ovexpressie van survivine, MUC1, BCL-2, BCL-X en MCL1 inhiberen de mitochondriale pathway en FLIP kan de death receptor pathway inhiberen. MUC1 komt voor bij NSCLC en heeft naast anti-apoptotische ook immunomodulatoire eigenschappen; zo promoot het de differentiatie van monocyten naar regulatoire DC’s ten koste van differentiatie naar klassieke DC’s die CTL’s opwekken. Anti-apoptotische moleculen veroorzaken dus defecten in de apoptotische pathways: dit is belangrijk in de resistentie aan chemotherapie en aan immuun-effector cellen zoals CTL’s en NK-cellen. Anderzijds kunnen van deze moleculen dan weer antigenische peptiden gepresenteerd worden die nieuwe CTL-klonen opwekken. Ten tweede kunnen tumoren inhibitor-of50

apoptosis proteins (IAP’s) overproduceren. Voorbeelden zijn IAP1 en X-linked IAP. IAP’s inhiberen specifiek caspases. Naast overexpressie van anti-apoptische moleculen en overproductie van IAP’s kan een tumorcel ook expressie van moleculen die essentieel zijn voor de apoptotische pathway (zoals apoptotic-protease-activating factor1: APAF1) verliezen en zo resistent worden aan apoptose. Tenslotte kunnen de caspases zelf gemuteerd zijn in de immunogeselecteerde tumorcel. Tumorcellen ontwikkelen mechanismen om te vermijden dat ze gedood worden door CTL’s of NK-cellen. Eerder werd reeds aangehaald dat tumorcellen zich kunnen verbergen voor CTL’s, stressmoleculen kunnen verbergen of stressreceptoren kunnen verzadigen. Ze kunnen ook weerstand bieden aan apoptose (in gang gezet door perforine en granzyme of door activatie van een deathreceptor). Daarnaast kunnen tumorcellen echter strategieën ontwikkelen die direct interfereren met de perforine/granzyme of death-receptor pathways. Zo blokkeert overexpressie van PI9 (protease inhibitor-9) het granzyme B en inactiveert cathepsine B het perforine. Death-receptoren kunnen dan weer mutaties ondergaan of hun expressie kan onderdrukt zijn. Daarenboven kan het matrix metalloprotease-7 (MMP-7) Fas-moleculen intracellulair klieven en dus de tumorcel weerstandig maken aan FasL gemedieerde apoptose. Tumoren kunnen actief CTL’s elimineren. Geactiveerde CTL’s zijn zeer gevoelig aan apoptose, wanneer hun TCR chronisch getriggerd wordt door antigenen kan dit leiden tot massale T-cel apoptose. Dit kan het geval zijn in een tumoromgeving waar zich een hoge concentratie aan cellen met het betreffende antigen bevindt. Dit fenomeen heet activation induced cell death (AICD). Ten tweede kunnen sommige tumoren oplosbaar Fas-ligand (FasL) secreteren of FasL aan hun oppervlak presenteren. FasL contact met een antigen-specifieke T-cel leidt dan tot celdood van de T-cel. De graad van FasL expressie op tumorcellen is in onderzoek ook gelinkt aan de mate waarin de tumorcellen lymfeknopen kunnen invaderen of elders in het lichaam kunnen metastaseren. FasL expressie helpt de tumorcel immers te overleven in een sterk cytotoxische omgeving zoals de lymfeknopen. Oplosbaar FasL bindt op een gelijkaardige manier Fas+ lymfocyten in de tumoromgeving maar ook in de circulatie. Dit leidt tot dysfunctie of apoptose van deze lymfocyten. Daarnaast komt ook secretie van decoy-receptors voor TRAIL voor. Gesecreteerd FasL en TRAIL bevinden zich in door de tumor gemaakte microvesikels (exosomen) die tevens tumorantigenen bevatten, het zijn dus ideale decoy-doelwitten voor CTL’s en NK-cellen.

2.2. De tumor doet zelf aan immunosuppressie (21, 218, 219, 224, 264, 331, 334-336) Een zich ontwikkelende tumor ontwikkelt naast escape mechanismen ook immunosuppressieve mechanismen. Hij kan met immunosuppressieve moleculen het immuunsysteem (lokaal of systemisch) onderdrukken of in zijn eigen voordeel aanwenden. Dit wordt ook wel immunosubversie genoemd. Hier worden een aantal van die moleculen en mechanismen besproken. Sommige tumoren produceren het enzym indolamine-2,3-dioxygenase (IDO). De natuurlijke functie van IDO is tolerantie van het maternele immuunsysteem tegen antigenen van de foetus te 51

induceren. Het staat echter ook bekend als regulator van auto-immuniteit door inhibitie van T-cel activatie; IDO kataboliseert tryptofaan waardoor nog niet geactiveerde T-cellen “uitgehongerd” worden (ze hebben tryptofaan nodig om te ontwikkelen) en stilvallen in een inactief stadium. Ook in de meeste longtumoren wordt IDO geproduceerd (338) en treedt tryptofaandegradatie op (339). Een ander immunosuppressief molecule is transforming growth factor bèta (TGF-β). TGF-β kan effector T-cellen converteren naar regulatoire T-cellen (Tregs). Het heeft daarnaast nog andere immunosuppressieve eigenschappen die al eerder besproken werden. Regulatoire T-cellen (Treg) onderdrukken andere T-cellen via productie van TGF-β en van IL-10. Verder kunnen Tregs via gesecreteerde factoren of via direct celcontact effector T-cellen in de tumoromgeving omzetten tot Tregs. De natuurlijke functie van Tregs is het tegengaan van autoimmune processen. Ze zijn gekenmerkt door CD4 en CD25 aan hun oppervlak alsook door de specifieke (en noodzakelijke) expressie van Foxp3 in de kern. Het is aangetoond dat een hoge graad van Treg infiltratie in een tumor een negatieve prognostische waarde heeft. Dit mechanisme van tumor geïnduceerde immunosuppressie kan systemisch zijn of tot de micro-omgeving van de tumor beperkt blijven. Zo ziet men vaak Tregs in de tumoromgeving van NSCLC (306). Anderzijds is bij melanomen een toename van de Tregs in het perifeer bloed (systemisch) geobserveerd (21, 304). De rol van Tregs in NSCLC werd reeds uitvoerig besproken. Naast Tregs kan de tumor ook andere immunosuppressieve cellen rekruteren: Tumorgeassocieerde macrofagen (TAM) zijn meestal M2-klasse macrofagen, die de Th2-respons promoten ten koste van de Th1-respons. De tumor kan ook plasmacytoide DC’s (pDC’s) aantrekken, dit zijn immature DC’s die in staat zijn grote aantallen Tregs te rekruteren. Vaak ziet men ook myeloid-derived suppressor cells (MDSC’s) in een tumor: MDSC’s produceren mediatoren die de functie van zowel DC’s als NK-cellen als effector T-cellen verstoren. Hierdoor wordt de groei van de tumor vergemakkelijkt (207, 340). Al deze immunosuppressieve cellen kunnen zich ten slotte ook verspreiden naar de tumor-drainerende lymfeknopen en alle potentiële effector T-cellen daar treffen. Sommige tumoren zijn in staat om zelf IL-4, IL-10 of IL-13 te produceren. Dit zijn typische Th2 cytokines, die een humorale, op B-cellen gerichte immuunrespons stimuleren en een cellulaire immuunrespons tegengaan, alsook macrofagen polarizeren naar een tumor-ondersteunend M2fenotype. In dat opzicht zijn ze tegenhangers van IFN-γ, wat een typisch Th1 cytokine is. IL-10 is toegenomen in 80% van de longtumoren en dit is gecorreleerd met een slechtere prognose (282). IL-6, IL-10, GM-CSF en M-CSF zijn cytokines die monocytendifferentiatie in de richting van immunosuppressieve TAM’s duwen en weg van differentiatie naar functionele DC’s. M-CSF inhibeert daarbij de differentiatie van progenitorcellen naar DC’s en GM-CSF stimuleert de productie van APC’s met een immunosuppressieve rol. IL-6 en IL-10 houden DC’s in een immature toestand en IL10 inhibeert daarnaast ook de functie van DC’s. Een verminderd aantal mature DC’s betekent minder antigen-specifieke CTL’s, wat overleving van de tumor ten goede komt. Dergelijke immature DC’s

52

kunnen bovendien zelfs Tregs induceren die de cellulaire immuniteit verder onderdrukken (zie eerder). Tregs kunnen ten slotte ook de functie van DC’s verder inhiberen. Stikstofmonoxide (NO) en arginase-1 inhiberen T-cel functie en kunnen overmatig geproduceerd worden door zowel de tumorcel zelf als door tumor-geassocieerde myeloïde cellen. De combinatie van NO en O2-radikalen genereert peroxynitrieten die de TCR van CTL’s inactiveert. Prostaglandines (PG) hebben naast anti-inflammatoire ook immunosuppressieve effecten. Ze worden ofwel geproduceerd door de tumor zelf, ofwel door macrofagen die daartoe door de tumor worden aangezet. Vandaar dat enzymen als cycloöxygenase-2 (COX-2) die verantwoordelijk zijn voor de productie van PG’s ook een rol kunnen spelen in immunosuppressie wanneer zij geproduceerd worden door de tumorcellen zelf. Onder de prostaglandines springt PGE2 bijzonder in het oog vanwege zijn rol in NSCLC (zie eerder). Vascular endothelial growth factor (VEGF) is een belangrijke factor voor tumor progressie; enerzijds zorgt het voor een betere vascularisatie van de tumor, maar anderzijds heeft het ook bewezen immunosuppressieve effecten. In vitro is aangetoond dat VEGF DC maturatie kan verhinderen en bij reeds mature DC’s voor een verminderde productie van IL-12 en een verminderde T-cel stimulatie zorgt (341, 342). Dit effect kan geneutraliseerd worden met VEGF-antilichamen (343). Ook in NSCLC hindert VEGF de DC maturatie en Inoshima et al. toonden aan dat een er een negatief verband bestaat tussen VEGF expressie en prognose van de longtumor (265). Veel tumorgesecreteerde producten hebben naast een immunosuppressieve werking ook andere functies die de groei van de tumor kunnen bevorderen. Zo speelt VEGF een rol in de angiogenese en hebben IL-6 en IL-10 een rol als groeifactoren.

3. Conclusie We kunnen dus besluiten dat de tumor die immunoselectie heeft ondergaan een aantal mechanismen ontwikkeld zal hebben om te ontsnappen aan destructie door immuuncellen. Daarnaast zal hij ook mechanismen ontwikkelen om het immuunsysteem te onderdrukken en er zelfs in slagen om immuuncellen in zijn eigen voordeel aan te wenden (immunosubversie).

53

5. D ISCUSSIE Longkanker is niet alleen een veel voorkomende, maar ook een zeer dodelijke kanker. Ondanks evoluties in de standaardtherapie schiet deze voor de meeste patiënten nog tekort. Alleen resectie van een beperkte tumor biedt een redelijke kans op genezing. De meeste longtumoren zijn bij diagnose echter al te ver gevorderd om nog te opereren. Deze patiënten, maar ook patiënten die recidiveren na een tumor-resectie, zouden baat hebben bij ontwikkelen van nieuwe therapieën. Immunotherapie is hier een mogelijke piste. Voor het ontwikkelen van immunotherapieën voor longkanker is het echter essentieel om de onderliggende antitumorale immuunrespons te begrijpen en om te weten of een spontane immuunrespons optreedt tegen longkanker.

1. De antitumorale immuunrespons tegen longkanker In deze scriptie werd geprobeerd om aan te tonen dat het menselijke immuunsysteem in staat is NSCLC te detecteren en er een antitumorale immuunrespons tegen op te bouwen. Dit blijkt eerst en vooral uit een aantal klinische fenomenen die een immuunrespons doen vermoeden: zo hebben aidspatiënten of transplantpatiënten onder immunosuppressieve medicatie bijvoorbeeld een hoger risico op ontwikkelen van NSCLC (186-188). Er werd vervolgens evidentie gegeven voor de rol van verschillende cellen die longtumoren infiltreren. De graad en plaats van infiltratie door deze cellen, hun complexe onderlinge interacties en de interacties met de tumor micro-omgeving zijn gerelateerd aan tumor progressie en aan de overleving van de patiënt. Zowel cellen van de aangeboren als van de verworven immuniteit spelen een rol in de antitumorale immuunrespons bij longkanker, maar uiteindelijk is vooral de verworven immuniteit, en met name de cellulaire immuunrespons, verantwoordelijk voor de afstoting van tumorcellen. Hoewel CD8+ cytotoxische T-lymfocyten de belangrijkste mediatoren van tumor cel apoptose zijn, spelen CD4+ Thelper-1 cellen een niet te onderschatten rol in het ondersteunen van de cellulaire immuunrespons en zijn dendritische cellen essentieel als coördinatoren van de cellulaire immuunrespons en opvoeders van T-cellen. Niet alleen een cellulaire maar ook een humorale immuunrespons komt voor bij longkanker, maar de rol van deze laatste is wellicht eerder beperkt. Antitumorale CTL responsen worden opgewekt door tumorantigenen aanwezig op longtumoren. Er werd geprobeerd de huidige evidentie te verzamelen omtrent welke tumorantigenen CTL responsen kunnen opwekken bij longkanker. Er zijn echter maar weinig klinische tumoren waar een natuurlijke immuunrespons nog veel invloed kan hebben op de tumor. Met tumor vaccins kan men echter de immuunrespons aanwakkeren en meerdere vaccinatiestudies zagen reeds positieve resultaten. Vaccins tegen MAGE-A3 en MUC1 worden al in fase III trials uitgetest. Een eerste belangrijke eigenschap die een tumorantigen een aantrekkelijk doelwit maakt voor immunotherapie is tumor-specificiteit: een tumor-specifiek antigen zal makkelijker een immuunrespons opwekken en een respons ertegen

54

veroorzaakt geen auto-immune symptomen. Gemuteerde antigenen zijn hier een voorbeeld van, ze komen niet voor op normale weefsels. De meeste mutaties zijn echter uniek of zeer zeldzaam en alleen tegen mutaties van p53 zijn al vaccins uitgetest (fase II) (51). Ten tweede moet een tumorantigen bij voorkeur voorkomen op een groot aantal tumoren: dit laat toe om met één vaccin een zo groot mogelijke groep patiënten te behandelen. Een voorbeeld hiervan zijn de overexpressie-antigenen: deze komen vaak voor op een aanzienlijk percentage van de longtumoren, maar hebben als nadeel dat ze ook voorkomen op normale weefsels en dus minder immunogeen zijn. Helaas komen deze 2 eigenschappen zelden samen voor. MAGE-A3 bezit ze wel allebei: als cancer-testis antigen is het tumor-specifiek en het komt bij ongeveer 40% van de longtumoren voor. Het is dus niet verwonderlijk dat juist met dit antigen al een fase III vaccinatiestudie loopt (73).

2. Tumor escape en immunosuppressie Longtumoren ontsnappen uiteindelijk aan de controle van het immuunsysteem; hierbij ontwikkelen ze niet alleen zgn. escape-mechanismen (bv. verbergen van MHC) maar zijn er echter ook duidelijke aanwijzingen dat de tumoromgeving de immuunrespons actief saboteert; het belangrijkste niveau waarop dit bij NSCLC gebeurt is op niveau van DC’s. Er werd voldoende evidentie naar voor gebracht in de resultaten om dit te staven. Verder spelen ook Tregs een belangrijke rol. M2 type macrofagen, MDSC’s en een Th2 type respons ten koste van Th1 activiteit spelen ook mee.

3. Implicaties voor immunotherapie Dat een natuurlijke immuunrespons bestaat is een goed vertrekpunt voor immunotherapie. Dit wil immers zeggen dat immunotherapie gebruik kan maken van mechanismen die reeds aanwezig zijn in het menselijk lichaam en deze kan boosten. Nieuwe inzichten in tumor immunologie hebben geleid tot de ontwikkeling van immunotherapieën zoals vaccinatie met peptiden of volledige eiwitten. Initiële hoopgevende resultaten met MAGE-A3 vaccinatie (72) vormden zo de basis voor de MAGRIT trial: de eerste grote fase III vaccinatie trial bij NSCLC (73). Ook voor vaccinatie o.b.v. MUC1 zijn fase III trials lopend of gepland (116-118). Er zijn ook tumor vaccins die (peptiden van) meerdere antigenen bevatten met het oog op een bredere toepasbaarheid. Ten tweede zijn er DC vaccins: hierbij worden monocyten uit het bloed van een patiënt gehaald om er mature DC’s uit op te wekken, die met tumorantigenen op te laden en daarna te gebruiken om de patiënt mee te behandelen. Bovenstaande vaccins maken gebruik van gekende tumorantigenen of hun peptiden. Omdat echter nog lang niet alle tumorantigenen van longkanker gekend zijn kunnen met de klassieke vaccins nooit de volledige waaier aan antigenen die een tumor vertoont benut worden. Een derde aanpak is daarom een “whole tumor extract” vaccin waarbij DC’s worden “opgeladen” met tumor RNA of apoptotische tumorcellen en in vitro gestimuleerd worden. Behandeling met die DC’s kan vervolgens CTL responsen opwekken tegen alle antigenen die de DC’s konden oppikken uit het “extract” (179). Stimuleren van type I NKT’s is tenslotte nog een mogelijke piste voor immunotherapie bij NSCLC. 55

In een intacte tumoromgeving zal echter een immunosuppressief milieu gehandhaafd blijven dat een effectieve immuunrespons bemoeilijkt, zoniet onmogelijk maakt. De vraag blijft dus of zelfs de antitumorale immuunrespons geboost met een tumor vaccin wel optimaal verloopt. Het zou immers zinloos zijn om met vaccins CTL’s te gaan opwekken tegen bepaalde antigenen als deze CTL’s verlamd worden van zodra ze in de tumoromgeving aankomen. Een eerste stap om tumor immunosuppressie tegen te gaan is chirurgie: de primaire tumoromgeving wordt immers weggehaald; ter hoogte van overblijvende micrometastasen (die oorzaak kunnen zijn van recidief) is er misschien niet zo’n sterk immunosuppressief milieu. Voor patiënten met een operabele longtumor is postoperatieve of adjuvante vaccinatie dus zeker een goede modaliteit. (De MAGRIT trial onderzoekt de werkzaamheid van adjuvante vaccinatie tegen MAGE-A3 (73).) Men kan zich afvragen of bij patiënten die niet in aanmerking komen voor chirurgie een CTL respons opgewekt door een vaccin dan volledig tenietgedaan wordt door het tumor milieu: de initiële positieve resultaten van vaccinatiestudies bij gevorderde NSCLC (bv. met een MUC1 vaccin (114)) doen vermoeden dat dit niet zo is. Desalniettemin is het tegengaan van tumor immunosuppressie een belangrijke doelstelling voor immunotherapie. Er wordt op dit vlak aanzienlijke vooruitgang geboekt, o.a. met monoclonale antilichamen die specifiek de suppressie op effector lymfocyten moeten ontheffen: antilichamen tegen CTLA-4 (ipilimumab, tremulimumab) en tegen PD-1 (MDX-1106, CT-011). Hodi et al. toonden in een fase III studie bij patiënten met metastatisch melanoom dat ipilimumab in monotherapie of in combinatie met een tumor vaccin de overleving verbetert ten opzichte van monotherapie met het vaccin. Er traden bij 10-15% van de patiënten immuungerelateerde “adverse events” op die soms ernstig, maar meestal reversibel waren met de juiste therapie (344). Wat NSCLC betreft toonden Lynch et al. in een fase II studie bij stadium IIIb/IV NSCLC dat ipilimumab in combinatie met chemotherapie veilig is; immuungerelateerde “adverse events” waren reversibel (345). Nog een aantal andere trials die ipilimumab onderzoeken bij NSCLC zijn gepland of lopend: onder andere één fase III trial die het effect op overleving van ipilimumab in combinatie met chemotherapie bij NSCLC zal evalueren (346). Rosenblatt et al. toonden aan bij multipel myeloom dat T-cel responsen opgewekt door een “whole tumor extract” vaccin konden verbeterd worden met anti-PD-1. Ze zagen dat de immuunrespons kantelde naar een Th1 respons en dat de hoeveelheid Tregs drastisch verminderde (347). Een fase I studie toonde de veiligheid van anti-PD-1 bij NSCLC, men zag bij een aantal patiënten ook significante regressie van de tumor (348). Twee andere fase I trials lopen momenteel die de veiligheid van anti-PD-1 in monotherapie en in combinatie met chemotherapie bij NSCLC onderzoeken. Een tweede methode om tumor immunosuppressie tegen te gaan is om zich te richten op Tregs: depletie van Tregs kan door cyclyfosfamide (349) en denileukin (262) en laat tumor vaccins toe om een effectievere respons op te wekken. Antilichamen tegen CD25 putten Tregs ook uit maar hebben waarschijnlijk ook effect op CD25+ effector T-cellen en zijn daarom minder geschikt (262). Larmonier et al. melden dat imatinib naast zijn functie als tyrosine kinase inhibitor ook de 56

immunosuppressieve functie van Tregs tegengaat. Men toont aan bij imatinib-resistente lymfomen dat antitumorale immuunresponsen opgewekt door een DC vaccin sterker waren wanneer imatinib werd gegeven (350). Er zijn verder nog vele andere methoden om te interfereren met de functie van Tregs (262, 351). Andere pistes voor immunotherapie zouden zich kunnen richten op ontheffen van DCinhibitie of op het uitputten of inhiberen van immunosuppressieve MDSC’s. Eén van de uitdagingen voor de toekomst is dus het combineren van immunotherapie gericht op het opwekken van een werkzame immuunrespons met therapie die de immunosuppressieve cellen en mechanismen tegengaat.

6. B ESLUIT Met deze scriptie hoop ik een overzicht gemaakt te hebben van de cellen en antigenen die de antitumorale immuunrespons tegen longkanker opbouwen. Dat die antitumorale immuunrespons een brede basis voor immunotherapie bij longkanker biedt is duidelijk. Patiënten met longkanker zijn bovendien bij uitstek kandidaten voor immunotherapie vanwege de slechte prognose van de ziekte met de huidige behandelingen. Hoewel al goede initiële resultaten behaald werden met tumor vaccinatie is het belangrijk om, zeker bij gevorderde NSCLC, ook oog te hebben voor de immunosuppressieve eigenschappen van de tumor die opgewekte effector cellen alsnog kunnen verhinderen om hun werk te doen. Daarom is exploreren van nieuwe pistes in de immunotherapie die zich hierop richten zo belangrijk. Hopelijk kunnen immunotherapieën voor longkanker in de toekomst een verschil maken voor longkankerpatiënten en hun families.

57

7. R EFERENTIELIJST 1. Ferlay J SH, Bray F, Forman D, Mathers C, Parkin DM. GLOBOCAN 2008 v1.2, Cancer Incidence and Mortality Worldwide: IARC CancerBase No. 10 [Internet]. Lyon, France: International Agency for Research on Cancer; 2010 [cited 2011 10/08]; Available from: http://globocan.iarc.fr. 2. Cancer Incidence in Belgium, 2008, Belgian Cancer Registry, Brussels 2011. 3. Cancer Incidence in Belgium, 2004-2005, Belgian Cancer Registry, Brussels 2008. 4. Morgensztern D, Ng SH, Gao F, Govindan R. Trends in Stage Distribution for Patients with Non-small Cell Lung Cancer: A National Cancer Database Survey. Journal of Thoracic Oncology. 2010;5(1):29-33 10.1097/JTO.0b013e3181c5920c. 5. Goldstraw P, Crowley J, Chansky K, Giroux DJ, Groome PA, Rami-Porta R, et al. The IASLC lung cancer staging project: Proposals for the revision of he TNM stage groupings in the forthcoming (seventh) edition of the TNM classification of malignant tumours. Journal of Thoracic Oncology. [Article]. 2007 Aug;2(8):706-14. 6. Sobin L, Wittekind C. TNM Classification of Malignant Tumours, Sixth edition. New York: Wiley-Liss; 2002. 7. Mountain CF. Revisions in the International System for Staging Lung Cancer. Chest. [Article]. 1997 Jun;111(6):1710-7. 8. Sobin LH, Gospodarowicz MK, Wittekind C. TNM Classification of Malignant Tumours, 7th Edition. 7 ed. New York: Wiley-Blackwell; 2009. 9. Detterbeck FC, Boffa DJ, Tanoue LT. The New Lung Cancer Staging System. Chest. [Article]. 2009 Jul;136(1):260-71. 10. National Cancer Institute: PDQ® Non-Small Cell Lung Cancer Treatment. Bethesda: MD: National Cancer Institute.; [updated 06/23/2011, accessed 09/15/2011]; Available from: http://www.cancer.gov/cancertopics/pdq/treatment/non-small-cell-lung/healthprofessional. 11. Diagnosis and Treatment of Lung Cancer. London: National Collaborating Centre for Acute Care; 2005. 12. Manser R, Wright G, Hart D, Byrnes G, Campbell D, Wainer Z, et al. Surgery for local and locally advanced non-small cell lung cancer. Cochrane Database of Systematic Reviews. 2005(1). 13. O'Rourke N, Roqué i Figuls M, Farré Bernadó N, Macbeth F. Concurrent chemoradiotherapy in non-small cell lung cancer. Cochrane Database of Systematic Reviews. 2010(6). 14. Non-Small Cell Lung Cancer Collaborative G. Chemotherapy for non-small cell lung cancer. Cochrane Database of Systematic Reviews. 2000(2). 15. Van den Eynde B, Van der Bruggen P. Peptide database of Tcell defined tumor antigens. 2001-2012 [updated January 10, 2012]; Available from: http://www.cancerimmunity.org/peptidedatabase/Tcellepitopes.htm. 16. Woglom W. Immunity to transplantable tumors. Cancer Res. 1929. 17. Rosenberg SA. Progress in human tumour immunology and immunotherapy. Nature. 2001 May 17;411(6835):380-4. 18. Rosenberg SA, Lotze MT, Muul LM, Leitman S, Chang AE, Ettinghausen SE, et al. Observations on the systemic administration of autologous lymphokine-activated killer cells and recombinant interleukin-2 to patients with metastatic cancer. N Engl J Med. 1985 Dec 5;313(23):1485-92. 19. Van den Eynde B, Hainaut P, Herin M, Knuth A, Lemoine C, Weynants P, et al. Presence on a human melanoma of multiple antigens recognized by autologous CTL. Int J Cancer. 1989 Oct 15;44(4):634-40. 20. van der Bruggen P, Traversari C, Chomez P, Lurquin C, De Plaen E, Van den Eynde B, et al. A gene encoding an antigen recognized by cytolytic T lymphocytes on a human melanoma. Science. 1991 Dec 13;254(5038):1643-7. 21. Finn OJ. Cancer immunology. N Engl J Med. 2008 Jun 19;358(25):2704-15. 22. Sugaya M, Takenoyama M, Shigematsu Y, Baba T, Fukuyama T, Nagata Y, et al. Identification of HLA-A24 restricted shared antigen recognized by autologous cytotoxic T lymphocytes from a patient with large cell carcinoma of the lung. Int J Cancer. 2007 Mar 1;120(5):1055-62. 58

23. Chen Y. Identification of human tumor antigens by serological expression cloning: an online review on SEREX. Cancer Immun. 2004. 24. Reuschenbach M, von Knebel Doeberitz M, Wentzensen N. A systematic review of humoral immune responses against tumor antigens. Cancer Immunol Immunother. 2009 Oct;58(10):1535-44. 25. Boon T, Coulie PG, Van den Eynde B. Tumor antigens recognized by T cells. Immunol Today. 1997 Jun;18(6):267-8. 26. Coulie PG. Human tumour antigens recognized by T cells: new perspectives for anti-cancer vaccines? Mol Med Today. 1997 Jun;3(6):261-8. 27. Coulie PG, Van den Eynde BJ, van der Bruggen P, Van Pel A, Boon T. Antigens recognized by T-lymphocytes on human tumours. Biochem Soc Trans. 1997 May;25(2):544-8. 28. Van den Eynde BJ, Boon T. Tumor antigens recognized by T lymphocytes. Int J Clin Lab Res. 1997;27(2):81-6. 29. Lucas S, Coulie PG. About human tumor antigens to be used in immunotherapy. Semin Immunol. 2008 Oct;20(5):301-7. 30. Van den Eynde BJ, van der Bruggen P. T cell defined tumor antigens. Curr Opin Immunol. 1997 Oct;9(5):684-93. 31. Lachmann PJ. Tumour immunology: a review. J R Soc Med. 1984 Dec;77(12):1023-9. 32. Boon T. Tumor antigens recognized by T lymphocytes. Annual Review of Immunology. 1994;12(1):337. 33. Novellino L, Castelli C, Parmiani G. A listing of human tumor antigens recognized by T cells: March 2004 update. Cancer Immunology, Immunotherapy. 2005;54(3):187-207. 34. Delves PJ, Roitt IM. The immune system. Second of two parts. N Engl J Med. 2000 Jul 13;343(2):108-17. 35. Delves PJ, Roitt IM. The immune system. First of two parts. N Engl J Med. 2000 Jul 6;343(1):37-49. 36. Mitsudomi T, Hamajima N, Ogawa M, Takahashi T. Prognostic significance of p53 alterations in patients with non-small cell lung cancer: a meta-analysis. Clin Cancer Res. 2000 Oct;6(10):405563. 37. Azuma K, Shichijo S, Maeda Y, Nakatsura T, Nonaka Y, Fujii T, et al. Mutated p53 gene encodes a nonmutated epitope recognized by HLA-B*4601-restricted and tumor cell-reactive CTLs at tumor site. Cancer Res. 2003 Feb 15;63(4):854-8. 38. Hollstein M, Sidransky D, Vogelstein B, Harris CC. P53 Mutations in Human Cancers. Science. [Article]. 1991 Jul;253(5015):49-53. 39. Bodner SM, Minna JD, Jensen SM, D'Amico D, Carbone D, Mitsudomi T, et al. Expression of mutant p53 proteins in lung cancer correlates with the class of p53 gene mutation. Oncogene. 1992;7(4):743-9. 40. Top B, Mooi WJ, Klaver SG, Boerrigter L, Wisman P, Elbers HR, et al. Comparative analysis of p53 gene mutations and protein accumulation in human non-small-cell lung cancer. Int J Cancer. 1995 Apr 21;64(2):83-91. 41. Umano Y, Tsunoda T, Tanaka H, Matsuda K, Yamaue H, Tanimura H. Generation of cytotoxic T cell responses to an HLA-A24 restricted epitope peptide derived from wild-type p53. Br J Cancer. 2001 Apr 20;84(8):1052-7. 42. Houbiers JG, Nijman HW, van der Burg SH, Drijfhout JW, Kenemans P, van de Velde CJ, et al. In vitro induction of human cytotoxic T lymphocyte responses against peptides of mutant and wildtype p53. Eur J Immunol. 1993 Sep;23(9):2072-7. 43. Fujita H, Senju S, Yokomizo H, Saya H, Ogawa M, Matsushita S, et al. Evidence that HLA class II-restricted human CD4+ T cells specific to p53 self peptides respond to p53 proteins of both wild and mutant forms. Eur J Immunol. 1998 Jan;28(1):305-16. 44. Ito D, Visus C, Hoffmann TK, Balz V, Bier H, Appella E, et al. Immunological characterization of missense mutations occurring within cytotoxic T cell-defined p53 epitopes in HLA-A*0201+ squamous cell carcinomas of the head and neck. Int J Cancer. 2007 Jun 15;120(12):2618-24. 45. Kumar S, Mohan A, Guleria R. Prognostic implications of circulating anti-p53 antibodies in lung cancer--a review. Eur J Cancer Care (Engl). 2009 May;18(3):248-54. 59

46. Iizasa T, Fujisawa T, Saitoh Y, Hiroshima K, Ohwada H. Serum anti-p53 autoantibodies in primary resected non-small-cell lung carcinoma. Cancer Immunol Immunother. 1998 Aug;46(6):3459. 47. Yanuck M, Carbone DP, Pendleton CD, Tsukui T, Winter SF, Minna JD, et al. A mutant p53 tumor suppressor protein is a target for peptide-induced CD8+ cytotoxic T-cells. Cancer Res. 1993 Jul 15;53(14):3257-61. 48. Ciernik IF, Berzofsky JA, Carbone DP. Human lung cancer cells endogenously expressing mutant p53 process and present the mutant epitope and are lysed by mutant-specific cytotoxic T lymphocytes. Clin Cancer Res. 1996 May;2(5):877-82. 49. Ichiki Y, Takenoyama M, Mizukami M, So T, Sugaya M, Yasuda M, et al. Simultaneous cellular and humoral immune response against mutated p53 in a patient with lung cancer. J Immunol. 2004 Apr 15;172(8):4844-50. 50. Nagata Y, Hanagiri T, Takenoyama M, Fukuyama T, Mizukami M, So T, et al. Identification of the HLA-Cw*0702-restricted tumor-associated antigen recognized by a CTL clone from a lung cancer patient. Clin Cancer Res. 2005 Jul 15;11(14):5265-72. 51. Barve M, Bender J, Senzer N, Cunningham C, Greco FA, McCune D, et al. Induction of immune responses and clinical efficacy in a phase II trial of IDM-2101, a 10-epitope cytotoxic Tlymphocyte vaccine, in metastatic non-small-cell lung cancer. J Clin Oncol. 2008 Sep 20;26(27):441825. 52. Echchakir H, Mami-Chouaib F, Vergnon I, Baurain JF, Karanikas V, Chouaib S, et al. A point mutation in the alpha-actinin-4 gene generates an antigenic peptide recognized by autologous cytolytic T lymphocytes on a human lung carcinoma. Cancer Res. 2001 May 15;61(10):4078-83. 53. Mami-Chouaib F, Echchakir H, Dorothee G, Vergnon I, Chouaib S. Antitumor cytotoxic Tlymphocyte response in human lung carcinoma: identification of a tumor-associated antigen. Immunol Rev. 2002 Oct;188:114-21. 54. Karanikas V, Colau D, Baurain JF, Chiari R, Thonnard J, Gutierrez-Roelens I, et al. High frequency of cytolytic T lymphocytes directed against a tumor-specific mutated antigen detectable with HLA tetramers in the blood of a lung carcinoma patient with long survival. Cancer Res. 2001 May 1;61(9):3718-24. 55. Hogan KT, Eisinger DP, Cupp SB, 3rd, Lekstrom KJ, Deacon DD, Shabanowitz J, et al. The peptide recognized by HLA-A68.2-restricted, squamous cell carcinoma of the lung-specific cytotoxic T lymphocytes is derived from a mutated elongation factor 2 gene. Cancer Res. 1998 Nov 15;58(22):5144-50. 56. Takenoyama M, Baurain JF, Yasuda M, So T, Sugaya M, Hanagiri T, et al. A point mutation in the NFYC gene generates an antigenic peptide recognized by autologous cytolytic T lymphocytes on a human squamous cell lung carcinoma. Int J Cancer. 2006 Apr 15;118(8):1992-7. 57. Hu Y, He Y, Srivenugopal KS, Fan S, Jiang Y. In vitro antitumor cytotoxic T lymphocyte response induced by dendritic cells transduced with DeltaNp73alpha recombinant adenovirus. Oncol Rep. 2007 Nov;18(5):1085-91. 58. Gure AO, Chua R, Williamson B, Gonen M, Ferreira CA, Gnjatic S, et al. Cancer-testis genes are coordinately expressed and are markers of poor outcome in non-small cell lung cancer. Clinical Cancer Research. 2005 Nov;11(22):8055-62. 59. Melloni G, Ferreri AJ, Russo V, Gattinoni L, Arrigoni G, Ceresoli GL, et al. Prognostic significance of cancer-testis gene expression in resected non-small cell lung cancer patients. Oncol Rep. 2004 Jul;12(1):145-51. 60. Shigematsu Y, Hanagiri T, Shiota H, Kuroda K, Baba T, Mizukami M, et al. Clinical significance of cancer/testis antigens expression in patients with non-small cell lung cancer. Lung Cancer. 2010 Apr;68(1):105-10. 61. Groeper C, Gambazzi F, Zajac P, Bubendorf L, Adamina M, Rosenthal R, et al. Cancer/testis antigen expression and specific cytotoxic T lymphocyte responses in non small cell lung cancer. Int J Cancer. 2007 Jan 15;120(2):337-43. 62. Weynants P, Lethe B, Brasseur F, Marchand M, Boon T. Expression of mage genes by nonsmall-cell lung carcinomas. Int J Cancer. 1994 Mar 15;56(6):826-9.

60

63. van der Bruggen P, Zhang Y, Chaux P, Stroobant V, Panichelli C, Schultz ES, et al. Tumorspecific shared antigenic peptides recognized by human T cells. Immunol Rev. [Review]. 2002 Oct;188:51-64. 64. Yoshida N, Abe H, Ohkuri T, Wakita D, Sato M, Noguchi D, et al. Expression of the MAGEA4 and NY-ESO-1 cancer-testis antigens and T cell infiltration in non-small cell lung carcinoma and their prognostic significance. Int J Oncol. 2006 May;28(5):1089-98. 65. Jang SJ, Soria JC, Wang L, Hassan KA, Morice RC, Walsh GL, et al. Activation of melanoma antigen tumor antigens occurs early in lung carcinogenesis. Cancer Research. 2001 Nov;61(21):795963. 66. Lucas S, De Plaen E, Boon T. MAGE-B5, MAGE-B6, MAGE-C2, and MAGE-C3: four new members of the MAGE family with tumor-specific expression. Int J Cancer. 2000 Jul 1;87(1):55-60. 67. Sienel W, Varwerk C, Linder A, Kaiser D, Teschner A, Delire A, et al. Melanoma associated antigen (MAGE)-A3 expression in Stages I and II non-small cell lung cancer: results of a multi-center study. European Journal of Cardio-Thoracic Surgery. 2004 Jan;25(1):131-4. 68. Eifuku R, Takenoyama M, Yoshino I, Imahayashi S, So T, Yasuda M, et al. Analysis of MAGE-3 derived synthetic peptide as a human lung cancer antigen recognized by cytotoxic T lymphocytes. International Journal of Clinical Oncology. 2001;6(1):34-9. 69. Tsuji T, Altorki NK, Ritter G, Old LJ, Gnjatic S. Characterization of Preexisting MAGE-A3Specific CD4(+) T Cells in Cancer Patients and Healthy Individuals and Their Activation by Protein Vaccination. Journal of Immunology. 2009 Oct;183(7):4800-8. 70. Atanackovic D, Altorki NK, Stockert E, Williamson B, Jungbluth AA, Ritter E, et al. VaccineInduced CD4+ T Cell Responses to MAGE-3 Protein in Lung Cancer Patients. The Journal of Immunology. 2004 March 1, 2004;172(5):3289-96. 71. Atanackovic D, Altorki NK, Cao Y, Ritter E, Ferrara CA, Ritter G, et al. Booster vaccination of cancer patients with MAGE-A3 protein reveals long-term immunological memory or tolerance depending on priming. Proc Natl Acad Sci U S A. 2008 Feb 5;105(5):1650-5. 72. Vansteenkiste J. Final results of a multi-center, double-blind, randomized, placebo-controlled phase II study to assess the efficacy of MAGE-A3 immunotherapeutic as adjuvant therapy in stage IB/II non-small cell lung cancer (NSCLC). Journal of Clinical Oncology. 2007;25(18 suppl):7554. 73. Tyagi P, Mirakhur B. MAGRIT: the largest-ever phase III lung cancer trial aims to establish a novel tumor-specific approach to therapy. Clin Lung Cancer. 2009 Sep;10(5):371-4. 74. Karanikas V, Zamanakou M, Soukou F, Kerenidi T, Gourgoulianis KI, Germenis AE. Naturally occurring tumor-specific CD8+ T-cell precursors in individuals with and without cancer. Immunol Cell Biol. 2010 Jul;88(5):575-85. 75. Breckpot K, Heirman C, De Greef C, van der Bruggen P, Thielemans K. Identification of new antigenic peptide presented by HLA-Cw7 and encoded by several MAGE genes using dendritic cells transduced with lentiviruses. J Immunol. 2004 Feb 15;172(4):2232-7. 76. Chen YT, Scanlan MJ, Sahin U, Tureci O, Gure AO, Tsang S, et al. A testicular antigen aberrantly expressed in human cancers detected by autologous antibody screening. Proc Natl Acad Sci U S A. 1997 Mar 4;94(5):1914-8. 77. Lethe B, Lucas S, Michaux L, De Smet C, Godelaine D, Serrano A, et al. LAGE-1, a new gene with tumor specificity. Int J Cancer. 1998 Jun 10;76(6):903-8. 78. Jager E, Chen YT, Drijfhout JW, Karbach J, Ringhoffer M, Jager D, et al. Simultaneous humoral and cellular immune response against cancer-testis antigen NY-ESO-1: definition of human histocompatibility leukocyte antigen (HLA)-A2-binding peptide epitopes. J Exp Med. 1998 Jan 19;187(2):265-70. 79. Aarnoudse CA, van den Doel PB, Heemskerk B, Schrier PI. Interleukin-2-induced, melanomaspecific T cells recognize CAMEL, an unexpected translation product of LAGE-1. Int J Cancer. 1999 Jul 30;82(3):442-8. 80. Jager E, Karbach J, Gnjatic S, Jager D, Maeurer M, Atmaca A, et al. Identification of a naturally processed NY-ESO-1 peptide recognized by CD8+ T cells in the context of HLA-B51. Cancer Immun. 2002 Sep 19;2:12. 81. Knights AJ, Nuber N, Thomson CW, de la Rosa O, Jager E, Tiercy JM, et al. Modified tumour antigen-encoding mRNA facilitates the analysis of naturally occurring and vaccine-induced CD4 and CD8 T cells in cancer patients. Cancer Immunol Immunother. 2009 Mar;58(3):325-38. 61

82. Tureci O, Mack U, Luxemburger U, Heinen H, Krummenauer F, Sester M, et al. Humoral immune responses of lung cancer patients against tumor antigen NY-ESO-1. Cancer Lett. 2006 May 8;236(1):64-71. 83. Isobe M, Eikawa S, Uenaka A, Nakamura Y, Kanda T, Kohno S, et al. Correlation of high and decreased NY-ESO-1 immunity to spontaneous regression and subsequent recurrence in a lung cancer patient. Cancer Immun. 2009;9:8. 84. Nakamura Y, Noguchi Y, Satoh E, Uenaka A, Sato S, Kitazaki T, et al. Spontaneous remission of a non-small cell lung cancer possibly caused by anti-NY-ESO-1 immunity. Lung Cancer. 2009 Jul;65(1):119-22. 85. Ali Eldib AM, Ono T, Shimono M, Kaneko M, Nakagawa K, Tanaka R, et al. Immunoscreening of a cDNA library from a lung cancer cell line using autologous patient serum: Identification of XAGE-1b as a dominant antigen and its immunogenicity in lung adenocarcinoma. Int J Cancer. 2004 Feb 10;108(4):558-63. 86. Nakagawa K, Noguchi Y, Uenaka A, Sato S, Okumura H, Tanaka M, et al. XAGE-1 expression in non-small cell lung cancer and antibody response in patients. Clin Cancer Res. 2005 Aug 1;11(15):5496-503. 87. Shimono M, Uenaka A, Noguchi Y, Sato S, Okumura H, Nakagawa K, et al. Identification of DR9-restricted XAGE antigen on lung adenocarcinoma recognized by autologous CD4 T-cells. Int J Oncol. 2007 Apr;30(4):835-40. 88. Kikuchi E, Yamazaki K, Nakayama E, Sato S, Uenaka A, Yamada N, et al. Prolonged survival of patients with lung adenocarcinoma expressing XAGE-1b and HLA class I antigens. Cancer Immun. 2008;8:13. 89. Kessler JH, Beekman NJ, Bres-Vloemans SA, Verdijk P, van Veelen PA, KloostermanJoosten AM, et al. Efficient identification of novel HLA-A(*)0201-presented cytotoxic T lymphocyte epitopes in the widely expressed tumor antigen PRAME by proteasome-mediated digestion analysis. J Exp Med. 2001 Jan 1;193(1):73-88. 90. Monji M, Nakatsura T, Senju S, Yoshitake Y, Sawatsubashi M, Shinohara M, et al. Identification of a novel human cancer/testis antigen, KM-HN-1, recognized by cellular and humoral immune responses. Clin Cancer Res. 2004 Sep 15;10(18 Pt 1):6047-57. 91. Fukuyama T, Hanagiri T, Takenoyama M, Ichiki Y, Mizukami M, So T, et al. Identification of a new cancer/germline gene, KK-LC-1, encoding an antigen recognized by autologous CTL induced on human lung adenocarcinoma. Cancer Res. 2006 May 1;66(9):4922-8. 92. Boel P, Wildmann C, Sensi ML, Brasseur R, Renauld JC, Coulie P, et al. BAGE: a new gene encoding an antigen recognized on human melanomas by cytolytic T lymphocytes. Immunity. 1995 Feb;2(2):167-75. 93. Shim E, Shim H, Bae J, Lee H, Jeoung D. CAGE Displays Oncogenic Potential and Induces Cytolytic T Lymphocyte Activity. Biotechnology Letters. 2006;28(7):515-22. 94. Martelange V, De Smet C, De Plaen E, Lurquin C, Boon T. Identification on a human sarcoma of two new genes with tumor-specific expression. Cancer Res. 2000 Jul 15;60(14):3848-55. 95. Harao M, Hirata S, Irie A, Senju S, Nakatsura T, Komori H, et al. HLA-A2-restricted CTL epitopes of a novel lung cancer-associated cancer testis antigen, cell division cycle associated 1, can induce tumor-reactive CTL. Int J Cancer. 2008 Dec 1;123(11):2616-25. 96. Zhu B, Chen Z, Cheng X, Lin Z, Guo J, Jia Z, et al. Identification of HLA-A*0201-restricted cytotoxic T lymphocyte epitope from TRAG-3 antigen. Clin Cancer Res. 2003 May;9(5):1850-7. 97. Nakatsugawa M, Hirohashi Y, Torigoe T, Asanuma H, Takahashi A, Inoda S, et al. Novel spliced form of a lens protein as a novel lung cancer antigen, Lengsin splicing variant 4. Cancer Sci. 2009 Aug;100(8):1485-93. 98. Nakatsugawa M, Horie K, Yoshikawa T, Shimomura M, Kikuchi Y, Sakemura N, et al. Identification of an HLA-A*0201-restricted cytotoxic T lymphocyte epitope from the lung carcinoma antigen, Lengsin. Int J Oncol. 2011 Oct;39(4):1041-9. 99. Coggin JH, Jr. Oncofetal antigens. Nature. 1986 Jan 30-Feb 5;319(6052):428. 100. Coggin JH, Jr., Barsoum AL, Rohrer JW, Thurnher M, Zeis M. Contemporary definitions of tumor specific antigens, immunogens and markers as related to the adaptive responses of the cancerbearing host. Anticancer Res. 2005 May-Jun;25(3c):2345-55. 62

101. Crosti M, Longhi R, Consogno G, Melloni G, Zannini P, Protti MP. Identification of novel subdominant epitopes on the carcinoembryonic antigen recognized by CD4+ T cells of lung cancer patients. J Immunol. 2006 Apr 15;176(8):5093-9. 102. Wang K, Zhou Q, Guo AL, Xu CR, An SJ, Wu YL. An autologous therapeutic dendritic cell vaccine transfected with total lung carcinoma RNA stimulates cytotoxic T lymphocyte responses against non-small cell lung cancer. Immunol Invest. 2009;38(7):665-80. 103. Koukourakis MI, Giatromanolaki A, Guddo F, Kaklamanis L, Vignola M, Kakolyris S, et al. c-erbB-2 and episialin challenge host immune response by HLA class I expression in human nonsmall-cell lung cancer. J Immunother. 2000 Jan;23(1):104-14. 104. Barnd DL, Lan MS, Metzgar RS, Finn OJ. Specific, major histocompatibility complexunrestricted recognition of tumor-associated mucins by human cytotoxic T cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 1989 Sep;86(18):7159-63. 105. Jerome KR, Barnd DL, Bendt KM, Boyer CM, Taylor-Papadimitriou J, McKenzie IF, et al. Cytotoxic T-lymphocytes derived from patients with breast adenocarcinoma recognize an epitope present on the protein core of a mucin molecule preferentially expressed by malignant cells. Cancer Res. 1991 Jun 1;51(11):2908-16. 106. Wajchman HJ, Pierce CW, Varma VA, Issa MM, Petros J, Dombrowski KE. Ex Vivo Expansion of CD8+CD56+ and CD8+CD56− Natural Killer T Cells Specific for MUC1 Mucin. Cancer Research. 2004 February 1, 2004;64(3):1171-80. 107. Korkolopoulou P, Kaklamanis L, Pezzella F, Harris AL, Gatter KC. Loss of antigenpresenting molecules (MHC class I and TAP-1) in lung cancer. Br J Cancer. 1996 Jan;73(2):148-53. 108. So T, Takenoyama M, Mizukami M, Ichiki Y, Sugaya M, Hanagiri T, et al. Haplotype loss of HLA class I antigen as an escape mechanism from immune attack in lung cancer. Cancer Res. 2005 Jul 1;65(13):5945-52. 109. Hiltbold EM, Ciborowski P, Finn OJ. Naturally processed class II epitope from the tumor antigen MUC1 primes human CD4+ T cells. Cancer Res. 1998 Nov 15;58(22):5066-70. 110. Brossart P, Heinrich KS, Stuhler G, Behnke L, Reichardt VL, Stevanovic S, et al. Identification of HLA-A2-restricted T-cell epitopes derived from the MUC1 tumor antigen for broadly applicable vaccine therapies. Blood. 1999 Jun 15;93(12):4309-17. 111. Rochlitz C, Figlin R, Squiban P, Salzberg M, Pless M, Herrmann R, et al. Phase I immunotherapy with a modified vaccinia virus (MVA) expressing human MUC1 as antigen-specific immunotherapy in patients with MUC1-positive advanced cancer. J Gene Med. 2003 Aug;5(8):690-9. 112. Ramlau R, Quoix E, Rolski J, Pless M, Lena H, Lévy E, et al. A Phase II Study of Tg4010 (Mva-Muc1-Il2) in Association with Chemotherapy in Patients with Stage III/IV Non-small Cell Lung Cancer. Journal of Thoracic Oncology. 2008;3(7):735-44 10.1097/JTO.0b013e31817c6b4f. 113. Butts C, Murray N, Maksymiuk A, Goss G, Marshall E, Soulières D, et al. Randomized Phase IIB Trial of BLP25 Liposome Vaccine in Stage IIIB and IV Non–Small-Cell Lung Cancer. Journal of Clinical Oncology. 2005 September 20, 2005;23(27):6674-81. 114. Sangha R, Butts C. L-BLP25: a peptide vaccine strategy in non small cell lung cancer. Clin Cancer Res. 2007 Aug 1;13(15 Pt 2):s4652-4. 115. Quoix E, Ramlau R, Westeel V, Papai Z, Madroszyk A, Riviere A, et al. Therapeutic vaccination with TG4010 and first-line chemotherapy in advanced non-small-cell lung cancer: a controlled phase 2B trial. Lancet Oncol. 2011 Nov;12(12):1125-33. 116. ClinicalTrials.gov [Internet]. Available from: http://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT00409188. 117. ClinicalTrials.gov [Internet]. Available from: http://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT01015443. 118. ClinicalTrials.gov [Internet]. Available from: http://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT01383148. 119. Shomura H, Shichijo S, Komatsu N, Matsueda S, Mine T, Rikimaru T, et al. Identification of epidermal growth factor receptor-derived peptides recognised by both cellular and humoral immune responses in HLA-A24+ non-small cell lung cancer patients. Eur J Cancer. 2004 Jul;40(11):1776-86. 120. Yoshino I, Goedegebuure PS, Peoples GE, Parikh AS, DiMaio JM, Lyerly HK, et al. HER2/neu-derived peptides are shared antigens among human non-small cell lung cancer and ovarian cancer. Cancer Res. 1994 Jul 1;54(13):3387-90. 121. Kawashima I, Hudson SJ, Tsai V, Southwood S, Takesako K, Appella E, et al. The multiepitope approach for immunotherapy for cancer: identification of several CTL epitopes from various tumor-associated antigens expressed on solid epithelial tumors. Hum Immunol. 1998 Jan;59(1):1-14. 63

122. Kawashima I, Tsai V, Southwood S, Takesako K, Sette A, Celis E. Identification of HLA-A3restricted cytotoxic T lymphocyte epitopes from carcinoembryonic antigen and HER-2/neu by primary in vitro immunization with peptide-pulsed dendritic cells. Cancer Res. 1999 Jan 15;59(2):431-5. 123. Rongcun Y, Salazar-Onfray F, Charo J, Malmberg KJ, Evrin K, Maes H, et al. Identification of new HER2/neu-derived peptide epitopes that can elicit specific CTL against autologous and allogeneic carcinomas and melanomas. J Immunol. 1999 Jul 15;163(2):1037-44. 124. Okugawa T, Ikuta Y, Takahashi Y, Obata H, Tanida K, Watanabe M, et al. A novel human HER2-derived peptide homologous to the mouse K(d)-restricted tumor rejection antigen can induce HLA-A24-restricted cytotoxic T lymphocytes in ovarian cancer patients and healthy individuals. Eur J Immunol. 2000 Nov;30(11):3338-46. 125. Scardino A, Alves P, Gross DA, Tourdot S, Graff-Dubois S, Angevin E, et al. Identification of HER-2/neu immunogenic epitopes presented by renal cell carcinoma and other human epithelial tumors. Eur J Immunol. 2001 Nov;31(11):3261-70. 126. Scardino A, Gross DA, Alves P, Schultze JL, Graff-Dubois S, Faure O, et al. HER-2/neu and hTERT cryptic epitopes as novel targets for broad spectrum tumor immunotherapy. J Immunol. 2002 Jun 1;168(11):5900-6. 127. Nikitina EY, Clark JI, Van Beynen J, Chada S, Virmani AK, Carbone DP, et al. Dendritic cells transduced with full-length wild-type p53 generate antitumor cytotoxic T lymphocytes from peripheral blood of cancer patients. Clin Cancer Res. 2001 Jan;7(1):127-35. 128. Vonderheide RH, Anderson KS, Hahn WC, Butler MO, Schultze JL, Nadler LM. Characterization of HLA-A3-restricted cytotoxic T lymphocytes reactive against the widely expressed tumor antigen telomerase. Clin Cancer Res. 2001 Nov;7(11):3343-8. 129. Vonderheide RH, Hahn WC, Schultze JL, Nadler LM. The telomerase catalytic subunit is a widely expressed tumor-associated antigen recognized by cytotoxic T lymphocytes. Immunity. 1999 Jun;10(6):673-9. 130. Minev B, Hipp J, Firat H, Schmidt JD, Langlade-Demoyen P, Zanetti M. Cytotoxic T cell immunity against telomerase reverse transcriptase in humans. Proc Natl Acad Sci U S A. 2000 Apr 25;97(9):4796-801. 131. Godet Y, Fabre-Guillevin E, Dosset M, Lamuraglia M, Levionnois E, Ravel P, et al. Analysis of spontaneous tumor-specific CD4 T cell immunity in lung cancer using promiscuous HLA-DR telomerase-derived epitopes: potential synergistic effect with chemotherapy response. Clin Cancer Res. 2012 Mar 8. 132. Brunsvig PF, Aamdal S, Gjertsen MK, Kvalheim G, Markowski-Grimsrud CJ, Sve I, et al. Telomerase peptide vaccination: a phase I/II study in patients with non-small cell lung cancer. Cancer Immunol Immunother. 2006 Dec;55(12):1553-64. 133. Bolonaki I, Kotsakis A, Papadimitraki E, Aggouraki D, Konsolakis G, Vagia A, et al. Vaccination of patients with advanced non-small-cell lung cancer with an optimized cryptic human telomerase reverse transcriptase peptide. J Clin Oncol. 2007 Jul 1;25(19):2727-34. 134. Ambrosini G, Adida C, Altieri DC. A novel anti-apoptosis gene, survivin, expressed in cancer and lymphoma. Nat Med. 1997 Aug;3(8):917-21. 135. Schmidt SM, Schag K, Muller MR, Weck MM, Appel S, Kanz L, et al. Survivin is a shared tumor-associated antigen expressed in a broad variety of malignancies and recognized by specific cytotoxic T cells. Blood. 2003 Jul 15;102(2):571-6. 136. Schmitz M, Diestelkoetter P, Weigle B, Schmachtenberg F, Stevanovic S, Ockert D, et al. Generation of survivin-specific CD8+ T effector cells by dendritic cells pulsed with protein or selected peptides. Cancer Res. 2000 Sep 1;60(17):4845-9. 137. Ichiki Y, Hanagiri T, Takenoyama M, Baba T, Fukuyama T, Nagata Y, et al. Tumor specific expression of survivin-2B in lung cancer as a novel target of immunotherapy. Lung Cancer. 2005 May;48(2):281-9. 138. Hirohashi Y, Torigoe T, Maeda A, Nabeta Y, Kamiguchi K, Sato T, et al. An HLA-A24restricted cytotoxic T lymphocyte epitope of a tumor-associated protein, survivin. Clin Cancer Res. 2002 Jun;8(6):1731-9. 139. Karanikas V, Soukou F, Kalala F, Kerenidi T, Grammoustianou ES, Gourgoulianis KI, et al. Baseline levels of CD8+ T cells against survivin and survivin-2B in the blood of lung cancer patients and cancer-free individuals. Clin Immunol. 2008 Nov;129(2):230-40. 64

140. Oka Y, Elisseeva OA, Tsuboi A, Ogawa H, Tamaki H, Li H, et al. Human cytotoxic Tlymphocyte responses specific for peptides of the wild-type Wilms' tumor gene ( WT1  ) product. Immunogenetics. 2000;51(2):99-107. 141. Makita M, Hiraki A, Azuma T, Tsuboi A, Oka Y, Sugiyama H, et al. Antilung Cancer Effect of WT1-specific Cytotoxic T Lymphocytes. Clinical Cancer Research. 2002 August 1, 2002;8(8):2626-31. 142. Asemissen AM, Keilholz U, Tenzer S, Muller M, Walter S, Stevanovic S, et al. Identification of a highly immunogenic HLA-A*01-binding T cell epitope of WT1. Clin Cancer Res. 2006 Dec 15;12(24):7476-82. 143. Tsuboi A, Oka Y, Udaka K, Murakami M, Masuda T, Nakano A, et al. Enhanced induction of human WT1-specific cytotoxic T lymphocytes with a 9-mer WT1 peptide modified at HLA-A*2402binding residues. Cancer Immunology, Immunotherapy. 2002;51(11):614-20. 144. Oka Y, Tsuboi A, Taguchi T, Osaki T, Kyo T, Nakajima H, et al. Induction of WT1 (Wilms' tumor gene)-specific cytotoxic T lymphocytes by WT1 peptide vaccine and the resultant cancer regression. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 2004 September 21, 2004;101(38):13885-90. 145. El Hage F, Stroobant V, Vergnon I, Baurain JF, Echchakir H, Lazar V, et al. Preprocalcitonin signal peptide generates a cytotoxic T lymphocyte-defined tumor epitope processed by a proteasomeindependent pathway. Proc Natl Acad Sci U S A. 2008 Jul 22;105(29):10119-24. 146. Gomi S, Nakao M, Niiya F, Imamura Y, Kawano K, Nishizaka S, et al. A cyclophilin B gene encodes antigenic epitopes recognized by HLA-A24-restricted and tumor-specific CTLs. J Immunol. 1999 Nov 1;163(9):4994-5004. 147. Gohara R, Imai N, Rikimaru T, Yamada A, Hida N, Ichiki M, et al. Phase 1 clinical study of cyclophilin B peptide vaccine for patients with lung cancer. J Immunother. 2002 Sep-Oct;25(5):43944. 148. Mine T, Gouhara R, Hida N, Imai N, Azuma K, Rikimaru T, et al. Immunological evaluation of CTL precursor-oriented vaccines for advanced lung cancer patients. Cancer Sci. 2003 Jun;94(6):548-56. 149. Forget MA, Reuben A, Turcotte S, Martin J, Lapointe R. Polyfunctionality of a DKK1 selfantigen-specific CD8(+) T lymphocyte clone in lung cancer. Cancer Immunol Immunother. 2011 Aug;60(8):1119-25. 150. Yao X, Jiang H, Zhang C, Wang H, Yang L, Yu Y, et al. Dickkopf-1 autoantibody is a novel serological biomarker for non-small cell lung cancer. Biomarkers. 2010 Mar;15(2):128-34. 151. Friedman RS, Bangur CS, Zasloff EJ, Fan L, Wang T, Watanabe Y, et al. Molecular and immunological evaluation of the transcription factor SOX-4 as a lung tumor vaccine antigen. J Immunol. 2004 Mar 1;172(5):3319-27. 152. Chen H-Y, Yu S-L, Chen C-H, Chang G-C, Chen C-Y, Yuan A, et al. A Five-Gene Signature and Clinical Outcome in Non–Small-Cell Lung Cancer. New England Journal of Medicine. 2007;356(1):11-20. 153. Titulaer MJ, Klooster R, Potman M, Sabater L, Graus F, Hegeman IM, et al. SOX Antibodies in Small-Cell Lung Cancer and Lambert-Eaton Myasthenic Syndrome: Frequency and Relation With Survival. Journal of Clinical Oncology. 2009 September 10, 2009;27(26):4260-7. 154. Alves PM, Faure O, Graff-Dubois S, Gross DA, Cornet S, Chouaib S, et al. EphA2 as target of anticancer immunotherapy: identification of HLA-A*0201-restricted epitopes. Cancer Res. 2003 Dec 1;63(23):8476-80. 155. Chiari R, Hames G, Stroobant V, Texier C, Maillere B, Boon T, et al. Identification of a tumor-specific shared antigen derived from an Eph receptor and presented to CD4 T cells on HLA class II molecules. Cancer Res. 2000 Sep 1;60(17):4855-63. 156. Trojan A, Tun-Kyi A, Odermatt B, Nestle FO, Stahel RA. Functional detection of epithelial cell adhesion molecule specific cytotoxic T lymphocytes in patients with lung cancer, colorectal cancer and in healthy donors. Lung Cancer. 2002 May;36(2):151-8. 157. Trojan A, Witzens M, Schultze JL, Vonderheide RH, Harig S, Krackhardt AM, et al. Generation of Cytotoxic T Lymphocytes against Native and Altered Peptides of Human Leukocyte Antigen-A*0201 Restricted Epitopes from the Human Epithelial Cell Adhesion Molecule. Cancer Research. 2001 June 15, 2001;61(12):4761-5. 65

158. Tajima K, Demachi A, Ito Y, Nishida K, Akatsuka Y, Tsujimura K, et al. Identification of an epitope from the epithelial cell adhesion molecule eliciting HLA-A*2402-restricted cytotoxic Tlymphocyte responses. Tissue Antigens. 2004 Dec;64(6):650-9. 159. Kuroda K, Takenoyama M, Baba T, Shigematsu Y, Shiota H, Ichiki Y, et al. Identification of ribosomal protein L19 as a novel tumor antigen recognized by autologous cytotoxic T lymphocytes in lung adenocarcinoma. Cancer Sci. 2010 Jan;101(1):46-53. 160. Wroblewski JM, Yannelli JR. Identification of HLA-CW3, GNAS and IMPA as cytotoxic Tlymphocyte (CTL) target antigens using an allogeneic mixed lymphocyte tumor cell culture (MLTC) system and subsequent cDNA library screening. Cancer Biother Radiopharm. 2007 Apr;22(2):206-22. 161. Tomita Y, Imai K, Senju S, Irie A, Inoue M, Hayashida Y, et al. A novel tumor-associated antigen, cell division cycle 45-like can induce cytotoxic T-lymphocytes reactive to tumor cells. Cancer Sci. 2011 Apr;102(4):697-705. 162. Ohkouchi S, Kawamoto N, Koga M, Sakanashi F, Shichijo S, Saijo Y, et al. Identification of a CTL-directed epitope encoded by an intron of the putative tumor suppressor gene Testin of the common fragile site 7G region: a peptide vaccine candidate for HLA-B52+ and HLA-62+ cancer patients. Eur J Immunol. 2003 Nov;33(11):2964-73. 163. Konopitzky R, Konig U, Meyer RG, Sommergruber W, Wolfel T, Schweighoffer T. Identification of HLA-A*0201-restricted T cell epitopes derived from the novel overexpressed tumor antigen calcium-activated chloride channel 2. J Immunol. 2002 Jul 1;169(1):540-7. 164. Challita-Eid PM, Morrison K, Etessami S, An Z, Morrison KJ, Perez-Villar JJ, et al. Monoclonal antibodies to six-transmembrane epithelial antigen of the prostate-1 inhibit intercellular communication in vitro and growth of human tumor xenografts in vivo. Cancer Res. 2007 Jun 15;67(12):5798-805. 165. Alves PM, Faure O, Graff-Dubois S, Cornet S, Bolonakis I, Gross DA, et al. STEAP, a prostate tumor antigen, is a target of human CD8+ T cells. Cancer Immunol Immunother. 2006 Dec;55(12):1515-23. 166. Maeda A, Ohguro H, Maeda T, Wada I, Sato N, Kuroki Y, et al. Aberrant expression of photoreceptor-specific calcium-binding protein (recoverin) in cancer cell lines. Cancer Res. 2000 Apr 1;60(7):1914-20. 167. Maeda A, Ohguro H, Nabeta Y, Hirohashi Y, Sahara H, Maeda T, et al. Identification of human antitumor cytotoxic T lymphocytes epitopes of recoverin, a cancer-associated retinopathy antigen, possibly related with a better prognosis in a paraneoplastic syndrome. Eur J Immunol. 2001 Feb;31(2):563-72. 168. Sasada T, Takedatsu H, Azuma K, Koga M, Maeda Y, Shichijo S, et al. Immediate early response gene X-1, a stress-inducible antiapoptotic gene, encodes cytotoxic T-lymphocyte (CTL) epitopes capable of inducing human leukocyte antigen-A33-restricted and tumor-reactive CTLs in gastric cancer patients. Cancer Res. 2004 Apr 15;64(8):2882-8. 169. Yamada A, Kawano K, Koga M, Takamori S, Nakagawa M, Itoh K. Gene and peptide analyses of newly defined lung cancer antigens recognized by HLA-A2402-restricted tumor-specific cytotoxic T lymphocytes. Cancer Res. 2003 Jun 1;63(11):2829-35. 170. Yamada A, Kawano K, Koga M, Matsumoto T, Itoh K. Multidrug resistance-associated protein 3 is a tumor rejection antigen recognized by HLA-A2402-restricted cytotoxic T lymphocytes. Cancer Res. 2001 Sep 1;61(17):6459-66. 171. Kaieda T, Imawari M, Yamasaki Z, Ohnishi S, Koike M, Idezuki Y, et al. Identification of a tumor-associated target antigen, ATM-1, for a human T-cell clone with activated killer activity and its existence in sera of cancer patients. Cancer Res. 1988 Sep 1;48(17):4848-54. 172. Shichijo S, Nakao M, Imai Y, Takasu H, Kawamoto M, Niiya F, et al. A gene encoding antigenic peptides of human squamous cell carcinoma recognized by cytotoxic T lymphocytes. J Exp Med. 1998 Feb 2;187(3):277-88. 173. Kikuchi M, Nakao M, Inoue Y, Matsunaga K, Shichijo S, Yamana H, et al. Identification of a SART-1-derived peptide capable of inducing HLA-A24-restricted and tumor-specific cytotoxic T lymphocytes. Int J Cancer. 1999 May 5;81(3):459-66. 174. Nakao M, Shichijo S, Imaizumi T, Inoue Y, Matsunaga K, Yamada A, et al. Identification of a gene coding for a new squamous cell carcinoma antigen recognized by the CTL. J Immunol. 2000 Mar 1;164(5):2565-74. 66

175. Yang D, Nakao M, Shichijo S, Sasatomi T, Takasu H, Matsumoto H, et al. Identification of a gene coding for a protein possessing shared tumor epitopes capable of inducing HLA-A24-restricted cytotoxic T lymphocytes in cancer patients. Cancer Res. 1999 Aug 15;59(16):4056-63. 176. Ito M, Shichijo S, Miyagi Y, Kobayashi T, Tsuda N, Yamada A, et al. Identification of SART3-derived peptides capable of inducing HLA-A2-restricted and tumor-specific CTLs in cancer patients with different HLA-A2 subtypes. Int J Cancer. 2000 Nov 15;88(4):633-9. 177. Nishizaka S, Gomi S, Harada K, Oizumi K, Itoh K, Shichijo S. A new tumor-rejection antigen recognized by cytotoxic T lymphocytes infiltrating into a lung adenocarcinoma. Cancer Res. 2000 Sep 1;60(17):4830-7. 178. Kawano K, Gomi S, Tanaka K, Tsuda N, Kamura T, Itoh K, et al. Identification of a new endoplasmic reticulum-resident protein recognized by HLA-A24-restricted tumor-infiltrating lymphocytes of lung cancer. Cancer Res. 2000 Jul 1;60(13):3550-8. 179. Benencia F, Courreges M, Coukos G. Whole tumor antigen vaccination using dendritic cells: Comparison of RNA electroporation and pulsing with UV-irradiated tumor cells. Journal of Translational Medicine. 2008;6(1):21. 180. Bell JW. Possible immune factors in spontaneous regression of bronchogenic carcinoma. Ten year survival in a patient treated with minimal (1,200 r) radiation alone. Am J Surg. 1970 Dec;120(6):804-6. 181. Van den Heuvel MM, Burgers SA, van Zandwijk N. Immunotherapy in non-small-cell lung carcinoma: from inflammation to vaccination. Clin Lung Cancer. 2009 Mar;10(2):99-105. 182. Ruckdeschel JC, Codish SD, Stranahan A, McKneally MF. Postoperative empyema improves survival in lung cancer. Documentation and analysis of a natural experiment. N Engl J Med. 1972 Nov 16;287(20):1013-7. 183. Tartter PI, Burrows L, Kirschner P. Perioperative blood transfusion adversely affects prognosis after resection of Stage I (subset N0) non-oat cell lung cancer. J Thorac Cardiovasc Surg. 1984 Nov;88(5 Pt 1):659-62. 184. Blajchman MA, Bordin JO. Mechanisms of transfusion-associated immunosuppression. Curr Opin Hematol. 1994 Nov;1(6):457-61. 185. Imai K, Matsuyama S, Miyake S, Suga K, Nakachi K. Natural cytotoxic activity of peripheralblood lymphocytes and cancer incidence: an 11-year follow-up study of a general population. Lancet. 2000 Nov 25;356(9244):1795-9. 186. Kirk GD, Merlo C, P OD, Mehta SH, Galai N, Vlahov D, et al. HIV infection is associated with an increased risk for lung cancer, independent of smoking. Clin Infect Dis. 2007 Jul 1;45(1):10310. 187. Bellil Y, Edelman MJ. Bronchogenic carcinoma in solid organ transplant recipients. Curr Treat Options Oncol. 2006 Jan;7(1):77-81. 188. Potaris K, Radovancevic B, Thomas CD, Gregoric I, Vaporciyan AA, Riggs SA, et al. Lung cancer after heart transplantation: a 17-year experience. Ann Thorac Surg. 2005 Mar;79(3):980-3. 189. Kuo CH, Lo CY, Chung FT, Lee KY, Lin SM, Wang CH, et al. Concomitant active tuberculosis prolongs survival in non-small cell lung cancer: a study in a tuberculosis-endemic country. PLoS One. 2012;7(3):e33226. 190. Monsieur I, Meysman M, Noppen M, de Greve J, Delhove O, Velckeniers B, et al. Non-smallcell lung cancer with multiple paraneoplastic syndromes. Eur Respir J. 1995 Jul;8(7):1231-4. 191. Holland-Frei. Chapter 92. Cancer of the Lung. In: Kufe DW PR, Weichselbaum RR, et al., editor. Cancer Medicine, 6th edition: BC Decker; 2003. 192. Johnson SK, Kerr KM, Chapman AD, Kennedy MM, King G, Cockburn JS, et al. Immune cell infiltrates and prognosis in primary carcinoma of the lung. Lung cancer (Amsterdam, Netherlands). 2000;27(1):27-35. 193. Mantovani A, Sozzani S, Locati M, Allavena P, Sica A. Macrophage polarization: tumorassociated macrophages as a paradigm for polarized M2 mononuclear phagocytes. Trends Immunol. 2002 Nov;23(11):549-55. 194. Bingle L, Brown NJ, Lewis CE. The role of tumour-associated macrophages in tumour progression: implications for new anticancer therapies. J Pathol. 2002 Mar;196(3):254-65. 195. Bremnes RM, Al-Shibli K, Donnem T, Sirera R, Al-Saad S, Andersen S, et al. The Role of Tumor-Infiltrating Immune Cells and Chronic Inflammation at the Tumor Site on Cancer 67

Development, Progression, and Prognosis: Emphasis on Non-small Cell Lung Cancer. Journal of Thoracic Oncology. 2011;6(4):824-33 10.1097/JTO.0b013e3182037b76. 196. Zhang B, Yao G, Zhang Y, Gao J, Yang B, Rao Z, et al. M2-Polarized tumor-associated macrophages are associated with poor prognoses resulting from accelerated lymphangiogenesis in lung adenocarcinoma. Clinics. 2011;66:1879-86. 197. Ma J, Liu L, Che G, Yu N, Dai F, You Z. The M1 form of tumor-associated macrophages in non-small cell lung cancer is positively associated with survival time. BMC Cancer. 2010;10:112. 198. Ohri CM, Shikotra A, Green RH, Waller DA, Bradding P. Macrophages within NSCLC tumour islets are predominantly of a cytotoxic M1 phenotype associated with extended survival. Eur Respir J. 2009 Jan;33(1):118-26. 199. Kataki A, Scheid P, Piet M, Marie B, Martinet N, Martinet Y, et al. Tumor infiltrating lymphocytes and macrophages have a potential dual role in lung cancer by supporting both hostdefense and tumor progression. J Lab Clin Med. 2002;140(5):320-8. 200. Koukourakis MI, Giatromanolaki A, Kakolyris S, O'Byrne KJ, Apostolikas N, Skarlatos J, et al. Different patterns of stromal and cancer cell thymidine phosphorylase reactivity in non-small-cell lung cancer: impact on tumour neoangiogenesis and survival. Br J Cancer. 1998 May;77(10):1696703. 201. Kurabayashi A, Furihata M, Matsumoto M, Hayashi H, Ohtsuki Y. Distribution of tumorinfiltrating dendritic cells in human non-small cell lung carcinoma in relation to apoptosis. Pathol Int. 2004 May;54(5):302-10. 202. Welsh TJ, Green RH, Richardson D, Waller DA, O'Byrne KJ, Bradding P. Macrophage and mast-cell invasion of tumor cell islets confers a marked survival advantage in non-small-cell lung cancer. J Clin Oncol. 2005 Dec 10;23(35):8959-67. 203. Kawai O, Ishii G, Kubota K, Murata Y, Naito Y, Mizuno T, et al. Predominant infiltration of macrophages and CD8(+) T Cells in cancer nests is a significant predictor of survival in stage IV nonsmall cell lung cancer. Cancer. 2008 Sep 15;113(6):1387-95. 204. Dai F, Liu L, Che G, Yu N, Pu Q, Zhang S, et al. The number and microlocalization of tumorassociated immune cells are associated with patient's survival time in non-small cell lung cancer. BMC Cancer. 2010;10:220. 205. Al-Shibli K, Al-Saad S, Donnem T, Persson M, Bremnes RM, Busund LT. The prognostic value of intraepithelial and stromal innate immune system cells in non-small cell lung carcinoma. Histopathology. 2009 Sep;55(3):301-12. 206. Gabrilovich DI, Nagaraj S. Myeloid-derived suppressor cells as regulators of the immune system. Nat Rev Immunol. [10.1038/nri2506]. 2009;9(3):162-74. 207. Ostrand-Rosenberg S, Sinha P. Myeloid-derived suppressor cells: linking inflammation and cancer. J Immunol. 2009 Apr 15;182(8):4499-506. 208. Bronte V, Wang M, Overwijk WW, Surman DR, Pericle F, Rosenberg SA, et al. Apoptotic death of CD8+ T lymphocytes after immunization: induction of a suppressive population of Mac1+/Gr-1+ cells. J Immunol. 1998 Nov 15;161(10):5313-20. 209. Sinha P, Clements VK, Bunt SK, Albelda SM, Ostrand-Rosenberg S. Cross-Talk between Myeloid-Derived Suppressor Cells and Macrophages Subverts Tumor Immunity toward a Type 2 Response. The Journal of Immunology. 2007 July 15, 2007;179(2):977-83. 210. Almand B, Clark JI, Nikitina E, van Beynen J, English NR, Knight SC, et al. Increased Production of Immature Myeloid Cells in Cancer Patients: A Mechanism of Immunosuppression in Cancer. The Journal of Immunology. 2001 January 1, 2001;166(1):678-89. 211. Liu CY, Wang YM, Wang CL, Feng PH, Ko HW, Liu YH, et al. Population alterations of Larginase- and inducible nitric oxide synthase-expressed CD11b+/CD14/CD15+/CD33+ myeloidderived suppressor cells and CD8+ T lymphocytes in patients with advanced-stage non-small cell lung cancer. J Cancer Res Clin Oncol. 2010 Jan;136(1):35-45. 212. Rodriguez PC, Hernandez CP, Quiceno D, Dubinett SM, Zabaleta J, Ochoa JB, et al. Arginase I in myeloid suppressor cells is induced by COX-2 in lung carcinoma. J Exp Med. 2005 Oct 3;202(7):931-9. 213. Wu L, Du H, Li Y, Qu P, Yan C. Signal Transducer and Activator of Transcription 3 (Stat3C) Promotes Myeloid-Derived Suppressor Cell Expansion and Immune Suppression during Lung Tumorigenesis. The American Journal of Pathology. 2011;179(4):2131-41. 68

214. Srivastava MK, Bosch JJ, Thompson JA, Ksander BR, Edelman MJ, Ostrand-Rosenberg S. Lung cancer patients' CD4(+) T cells are activated in vitro by MHC II cell-based vaccines despite the presence of myeloid-derived suppressor cells. Cancer Immunol Immunother. 2008 Oct;57(10):1493504. 215. Lanier LL. - Up on the tightrope: natural killer cell activation and inhibition. 2008;- 9(- 5):502. 216. Caligiuri MA. Human natural killer cells. Blood. [Review]. 2008 Aug;112(3):461-9. 217. Bryceson YT, March ME, Ljunggren HG, Long EO. Activation, coactivation, and costimulation of resting human natural killer cells. Immunol Rev. [Review]. 2006 Dec;214:73-91. 218. Bradbury PA, Shepherd FA. Immunotherapy for lung cancer. J Thorac Oncol. 2008 Jun;3(6 Suppl 2):S164-70. 219. Loose D, Van de Wiele C. The immune system and cancer. Cancer Biother Radiopharm. 2009 Jun;24(3):369-76. 220. Bryceson YT, March ME, Ljunggren HG, Long EO. Synergy among receptors on resting NK cells for the activation of natural cytotoxicity and cytokine secretion. Blood. 2006 Jan 1;107(1):15966. 221. Waldhauer I, Steinle A. NK cells and cancer immunosurveillance. Oncogene. 2008;27(45):5932-43. 222. Vivier E, Tomasello E, Baratin M, Walzer T, Ugolini S. Functions of natural killer cells. Nat Immunol. 2008 May;9(5):503-10. 223. Villegas FR, Coca S, Villarrubia VG, Jimenez R, Chillon MJ, Jareno J, et al. Prognostic significance of tumor infiltrating natural killer cells subset CD57 in patients with squamous cell lung cancer. Lung Cancer. 2002 Jan;35(1):23-8. 224. Zitvogel L, Tesniere A, Kroemer G. Cancer despite immunosurveillance: immunoselection and immunosubversion. Nat Rev Immunol. 2006 Oct;6(10):715-27. 225. Karadayi S, Kayi Cangir A, Ozturk S, Dizbay Sak S, Akal M, Akay H. [The prognostic effect of natural killer cell infiltration to tumoral tissues in stage I non-small cell lung cancer]. Tuberk Toraks. 2008;56(3):251-6. 226. Platonova S, Cherfils-Vicini J, Damotte D, Crozet L, Vieillard V, Validire P, et al. Profound coordinated alterations of intratumoral NK cell phenotype and function in lung carcinoma. Cancer Res. 2011 Aug 15;71(16):5412-22. 227. Esendagli G, Bruderek K, Goldmann T, Busche A, Branscheid D, Vollmer E, et al. Malignant and non-malignant lung tissue areas are differentially populated by natural killer cells and regulatory T cells in non-small cell lung cancer. Lung Cancer. 2008;59(1):32-40. 228. Schneider T, Hoffmann H, Dienemann H, Schnabel PA, Enk AH, Ring S, et al. Non-small Cell Lung Cancer Induces an Immunosuppressive Phenotype of Dendritic Cells in Tumor Microenvironment by Upregulating B7-H3. Journal of Thoracic Oncology. 2011;6(7):1162-8 10.097/JTO.0b013e31821c421d. 229. Carrega P, Morandi B, Costa R, Frumento G, Forte G, Altavilla G, et al. Natural killer cells infiltrating human nonsmall-cell lung cancer are enriched in CD56(Bright)CD16(-) cells and display an impaired capability to kill tumor cells. Cancer. [Article]. 2008 Feb;112(4):863-75. 230. Al Omar SY, Marshall E, Middleton D, Christmas SE. Increased numbers but functional defects of CD56+CD3+ cells in lung cancer. Int Immunol. 2012 Feb 24. 231. Al Omar SY, Marshall E, Middleton D, Christmas SE. Increased killer immunoglobulin-like receptor expression and functional defects in natural killer cells in lung cancer. Immunology. 2011 May;133(1):94-104. 232. Lin A, Zhu CC, Chen HX, Chen BF, Zhang X, Zhang JG, et al. Clinical relevance and functional implications for human leucocyte antigen-g expression in non-small-cell lung cancer. J Cell Mol Med. 2010 Sep;14(9):2318-29. 233. Yie SM, Yang H, Ye SR, Li K, Dong DD, Lin XM. Expression of human leucocyte antigen G (HLA-G) is associated with prognosis in non-small cell lung cancer. Lung Cancer. 2007 Nov;58(2):267-74. 234. Smyth MJ, Godfrey DI. NKT cells and tumor immunity--a double-edged sword. Nat Immunol. 2000 Dec;1(6):459-60. 69

235. Moodycliffe AM, Nghiem D, Clydesdale G, Ullrich SE. Immune suppression and skin cancer development: regulation by NKT cells. Nat Immunol. 2000 Dec;1(6):521-5. 236. Dorothee G, Echchakir H, Le Maux Chansac B, Vergnon I, El Hage F, Moretta A, et al. Functional and molecular characterization of a KIR3DL2/p140 expressing tumor-specific cytotoxic T lymphocyte clone infiltrating a human lung carcinoma. Oncogene. 2003 Oct 16;22(46):7192-8. 237. Semino C, Ferlazzo G, Ratto GB, Melioli G. Analysis of HLA-class-I specific natural killer cell receptors expressed on T lymphocytes infiltrating non-small-cell lung cancer. Lung Cancer. 2001 Dec;34(3):395-405. 238. Theoharides TC, Conti P. Mast cells: the JEKYLL and HYDE of tumor growth. Trends in Immunology. 2004;25(5):235-41. 239. Tomita M, Matsuzaki Y, Onitsuka T. Correlation between mast cells and survival rates in patients with pulmonary adenocarcinoma. Lung Cancer. 1999 Nov;26(2):103-8. 240. Al-Shibli K, Al-Saad S, Andersen S, Donnem T, Bremnes RM, Busund LT. The prognostic value of intraepithelial and stromal CD3-, CD117- and CD138-positive cells in non-small cell lung carcinoma. APMIS. 2010 May;118(5):371-82. 241. Takanami I, Takeuchi K, Naruke M. Mast cell density is associated with angiogenesis and poor prognosis in pulmonary adenocarcinoma. Cancer. 2000 Jun 15;88(12):2686-92. 242. Dundar E, Oner U, Peker BC, Metintas M, Isiksoy S, Ak G. The significance and relationship between mast cells and tumour angiogenesis in non-small cell lung carcinoma. J Int Med Res. 2008 Jan-Feb;36(1):88-95. 243. Gabrilovich D. Mechanisms and functional significance of tumour-induced dendritic-cell defects. Nat Rev Immunol. 2004 Dec;4(12):941-52. 244. Vermaelen K, Pauwels R. Pulmonary Dendritic Cells. Am J Respir Crit Care Med. 2005 September 1, 2005;172(5):530-51. 245. Chaput N, Conforti R, Viaud S, Spatz A, Zitvogel L. The Janus face of dendritic cells in cancer. Oncogene. 2008 Oct 6;27(45):5920-31. 246. Dieu-Nosjean MC, Antoine M, Danel C, Heudes D, Wislez M, Poulot V, et al. Long-term survival for patients with non-small-cell lung cancer with intratumoral lymphoid structures. J Clin Oncol. 2008 Sep 20;26(27):4410-7. 247. Kimura H, DOBRENKOV K, IIDA T, SUZUKI M, ANDO S, YAMAMOTO N. Tumordraining Lymph Nodes of Primary Lung Cancer Patients: A Potent Source of Tumor-specific Killer Cells and Dendritic Cells. Anticancer Research. 2005 January-February 2005;25(1A):85-94. 248. Knight SC, Hunt R, Dore C, Medawar PB. Influence of Dendritic Cells on Tumor-Growth. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. [Article]. 1985;82(13):4495-7. 249. Zeid NA, Muller HK. S100 Positive Dendritic Cells in Human Lung-Tumors Associated with Cell-Differentiation and Enhanced Survival. Pathology. 1993 Oct;25(4):338-43. 250. Sautès-Fridman C, Cherfils-Vicini J, Damotte D, Fisson S, Fridman WH, Cremer I, et al. Tumor microenvironment is multifaceted. Cancer and Metastasis Reviews. 2011;30(1):13-25. 251. Liu YJ. Dendritic cell subsets and lineages, and their functions in innate and adaptive immunity. Cell. 2001 Aug 10;106(3):259-62. 252. Ito T, Liu YJ, Kadowaki N. Functional diversity and plasticity of human dendritic cell subsets. Int J Hematol. 2005 Apr;81(3):188-96. 253. Yu P, Lee Y, Liu W, Chin RK, Wang J, Wang Y, et al. Priming of naive T cells inside tumors leads to eradication of established tumors. Nat Immunol. 2004 Feb;5(2):141-9. 254. Chapoval AI, Tamada K, Chen L. In vitro growth inhibition of a broad spectrum of tumor cell lines by activated human dendritic cells. Blood. 2000 Apr 1;95(7):2346-51. 255. Fanger NA, Maliszewski CR, Schooley K, Griffith TS. Human dendritic cells mediate cellular apoptosis via tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL). J Exp Med. 1999 Oct 18;190(8):1155-64. 256. Liu S, Yu Y, Zhang M, Wang W, Cao X. The involvement of TNF-alpha-related apoptosisinducing ligand in the enhanced cytotoxicity of IFN-beta-stimulated human dendritic cells to tumor cells. J Immunol. 2001 May 1;166(9):5407-15.

70

257. Lu G, Janjic BM, Janjic J, Whiteside TL, Storkus WJ, Vujanovic NL. Innate direct anticancer effector function of human immature dendritic cells. II. Role of TNF, lymphotoxin-alpha(1)beta(2), Fas ligand, and TNF-related apoptosis-inducing ligand. J Immunol. 2002 Feb 15;168(4):1831-9. 258. Yang R, Xu D, Zhang A, Gruber A. Immature dendritic cells kill ovarian carcinoma cells by a FAS/FASL pathway, enabling them to sensitize tumor-specific CTLs. Int J Cancer. 2001 Nov 1;94(3):407-13. 259. Albert ML, Pearce SF, Francisco LM, Sauter B, Roy P, Silverstein RL, et al. Immature dendritic cells phagocytose apoptotic cells via alphavbeta5 and CD36, and cross-present antigens to cytotoxic T lymphocytes. J Exp Med. 1998 Oct 5;188(7):1359-68. 260. Albert ML, Sauter B, Bhardwaj N. Dendritic cells acquire antigen from apoptotic cells and induce class I-restricted CTLs. Nature. 1998 Mar 5;392(6671):86-9. 261. Baleeiro R, Anselmo L, Soares F, Pinto C, Ramos O, Gross J, et al. High frequency of immature dendritic cells and altered in situ production of interleukin-4 and tumor necrosis factor-α in lung cancer. Cancer Immunology, Immunotherapy. 2008;57(9):1335-45. 262. Zou W. Regulatory T cells, tumour immunity and immunotherapy. Nat Rev Immunol. [10.1038/nri1806]. 2006;6(4):295-307. 263. Perrot I, Blanchard D, Freymond N, Isaac S, Guibert B, Pacheco Y, et al. Dendritic cells infiltrating human non-small cell lung cancer are blocked at immature stage. J Immunol. 2007 Mar 1;178(5):2763-9. 264. Bennaceur K, Chapman J, Brikci-Nigassa L, Sanhadji K, Touraine J-l, Portoukalian J. Dendritic cells dysfunction in tumour environment. Cancer Letters. 2008;272(2):186-96. 265. Inoshima N, Nakanishi Y, Minami T, Izumi M, Takayama K, Yoshino I, et al. The influence of dendritic cell infiltration and vascular endothelial growth factor expression on the prognosis of nonsmall cell lung cancer. Clin Cancer Res. 2002 Nov;8(11):3480-6. 266. van Cruijsen H, Ruiz M, amp, lle, van der Valk P, de Gruijl T, et al. Tissue micro array analysis of ganglioside N-glycolyl GM3 expression and signal transducer and activator of transcription (STAT)-3 activation in relation to dendritic cell infiltration and microvessel density in non-small cell lung cancer. BMC Cancer. 2009;9(1):180. 267. Makarenkova VP, Shurin GV, Tourkova IL, Balkir L, Pirtskhalaishvili G, Perez L, et al. Lung cancer-derived bombesin-like peptides down-regulate the generation and function of human dendritic cells. J Neuroimmunol. 2003 Dec;145(1-2):55-67. 268. Kuo PL, Huang MS, Cheng DE, Hung JY, Yang CJ, Chou SH. Lung cancer-derived galectin-1 enhances tumorigenic potentiation of tumor associated dendritic cells by expressing HB-EGF. J Biol Chem. 2012 Jan 30. 269. Kuo PL, Hung JY, Huang SK, Chou SH, Cheng DE, Jong YJ, et al. Lung cancer-derived galectin-1 mediates dendritic cell anergy through inhibitor of DNA binding 3/IL-10 signaling pathway. J Immunol. 2011 Feb 1;186(3):1521-30. 270. Ito M, Minamiya Y, Kawai H, Saito S, Saito H, Nakagawa T, et al. Tumor-derived TGFbeta-1 induces dendritic cell apoptosis in the sentinel lymph node. J Immunol. 2006 May 1;176(9):5637-43. 271. Sharma S, Stolina M, Yang S-C, Baratelli F, Lin J, Atianzar K, et al. Tumor cyclooxygenase 2-dependent suppression of dendritic cell function. Clinical cancer research : an official journal of the American Association for Cancer Research. 2003;9(9a1f92a4-47f7-a95b-4a0a-3b814b46bf8b):961-9. 272. Khuri FR, Wu H, Lee JJ, Kemp BL, Lotan R, Lippman SM, et al. Cyclooxygenase-2 overexpression is a marker of poor prognosis in stage I non-small cell lung cancer. Clin Cancer Res. 2001 Apr;7(4):861-7. 273. Yang L, Yamagata N, Yadav R, Brandon S, Courtney RL, Morrow JD, et al. Cancerassociated immunodeficiency and dendritic cell abnormalities mediated by the prostaglandin EP2 receptor. J Clin Invest. 2003 Mar;111(5):727-35. 274. Baratelli FE, Heuze-Vourc'h N, Krysan K, Dohadwala M, Riedl K, Sharma S, et al. Prostaglandin E2-dependent enhancement of tissue inhibitors of metalloproteinases-1 production limits dendritic cell migration through extracellular matrix. J Immunol. 2004 Nov 1;173(9):5458-66. 275. Qadri SS, Wang JH, Redmond KC, AF OD, Aherne T, Redmond HP. The role of COX-2 inhibitors in lung cancer. Ann Thorac Surg. 2002 Nov;74(5):1648-52. 276. Sandler AB, Dubinett SM. COX-2 inhibition and lung cancer. Semin Oncol. 2004 Apr;31(2 Suppl 7):45-52. 71

277. Csiki I, Morrow JD, Sandler A, Shyr Y, Oates J, Williams MK, et al. Targeting cyclooxygenase-2 in recurrent non-small cell lung cancer: a phase II trial of celecoxib and docetaxel. Clin Cancer Res. 2005 Sep 15;11(18):6634-40. 278. Altorki NK, Keresztes RS, Port JL, Libby DM, Korst RJ, Flieder DB, et al. Celecoxib, a selective cyclo-oxygenase-2 inhibitor, enhances the response to preoperative paclitaxel and carboplatin in early-stage non-small-cell lung cancer. J Clin Oncol. 2003 Jul 15;21(14):2645-50. 279. Groen HJ, Sietsma H, Vincent A, Hochstenbag MM, van Putten JW, van den Berg A, et al. Randomized, placebo-controlled phase III study of docetaxel plus carboplatin with celecoxib and cyclooxygenase-2 expression as a biomarker for patients with advanced non-small-cell lung cancer: the NVALT-4 study. J Clin Oncol. 2011 Nov 10;29(32):4320-6. 280. Koch A, Bergman B, Holmberg E, Sederholm C, Ek L, Kosieradzki J, et al. Effect of celecoxib on survival in patients with advanced non-small cell lung cancer: a double blind randomised clinical phase III trial (CYCLUS study) by the Swedish Lung Cancer Study Group. Eur J Cancer. 2011 Jul;47(10):1546-55. 281. Herber DL, Cao W, Nefedova Y, Novitskiy SV, Nagaraj S, Tyurin VA, et al. Lipid accumulation and dendritic cell dysfunction in cancer. Nat Med. 2010 Aug;16(8):880-6. 282. Hatanaka H, Abe Y, Kamiya T, Morino F, Nagata J, Tokunaga T, et al. Clinical implications of interleukin (IL)-10 induced by non-small-cell lung cancer. Ann Oncol. 2000 Jul;11(7):815-9. 283. Sharma S, Stolina M, Lin Y, Gardner B, Miller PW, Kronenberg M, et al. T cell-derived IL-10 promotes lung cancer growth by suppressing both T cell and APC function. J Immunol. 1999 Nov 1;163(9):5020-8. 284. Àvila-Moreno F, López-González JS, Galindo-Rodríguez G, Prado-García H, Bajaña S, Sánchez-Torres C. Lung squamous cell carcinoma and adenocarcinoma cell lines use different mediators to induce comparable phenotypic and functional changes in human monocyte-derived dendritic cells. Cancer Immunology, Immunotherapy. 2006;55(5):598-611. 285. Tazi A, Bouchonnet F, Grandsaigne M, Boumsell L, Hance AJ, Soler P. Evidence that granulocyte macrophage-colony-stimulating factor regulates the distribution and differentiated state of dendritic cells/Langerhans cells in human lung and lung cancers. J Clin Invest. 1993 Feb;91(2):56676. 286. Wojas K, Jacek T, Małgorzata J, Jacek R. Dendritic cells in peripheral blood of patients with breast and lung cancer--a pilot study. Folia Histochemica et Cytobiologica. 2004;42(1):45-8. 287. Lai Y-P, Jeng C-J, Chen S-C. The Roles of CD4+ T Cells in Tumor Immunity. ISRN Immunology. 2011;2011. 288. Wei YQ, Hang ZB. In situ observation of lymphocyte-tumor cell interaction in human lung carcinoma. Immunol Invest. 1989 Nov-Dec;18(9-10):1095-105. 289. Tormanen-Napankangas U, Soini Y, Paakko P. High number of tumour-infiltrating lymphocytes is associated with apoptosis in non-small cell lung carcinoma. APMIS. 2001 JulAug;109(7-8):525-32. 290. Hiraoka K, Miyamoto M, Cho Y, Suzuoki M, Oshikiri T, Nakakubo Y, et al. Concurrent infiltration by CD8+ T cells and CD4+ T cells is a favourable prognostic factor in non-small-cell lung carcinoma. Br J Cancer. 2006 Jan 30;94(2):275-80. 291. Wakabayashi O, Yamazaki K, Oizumi S, Hommura F, Kinoshita I, Ogura S, et al. CD4+ T cells in cancer stroma, not CD8+ T cells in cancer cell nests, are associated with favorable prognosis in human non-small cell lung cancers. Cancer Sci. 2003 Nov;94(11):1003-9. 292. Al-Shibli KI, Donnem T, Al-Saad S, Persson M, Bremnes RM, Busund LT. Prognostic effect of epithelial and stromal lymphocyte infiltration in non-small cell lung cancer. Clin Cancer Res. 2008 Aug 15;14(16):5220-7. 293. Petersen RP, Campa MJ, Sperlazza J, Conlon D, Joshi MB, Harpole DH, Jr., et al. Tumor infiltrating Foxp3+ regulatory T-cells are associated with recurrence in pathologic stage I NSCLC patients. Cancer. 2006 Dec 15;107(12):2866-72. 294. Ruffini E, Asioli S, Filosso PL, Lyberis P, Bruna MC, Macrì L, et al. Clinical Significance of Tumor-Infiltrating Lymphocytes in Lung Neoplasms. The Annals of Thoracic Surgery. 2009;87(2):365-72. 295. Weynants P, THONNARD J, MARCHAND M, DELOS M, BOON T, COULIE PG. Derivation of Tumor-specific Cytolytic T-Cell Clones from Two Lung Cancer Patients with Long 72

Survival. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 1999 January 1, 1999;159(1):55-62. 296. Lee TK, Horner RD, Silverman JF, Chen YH, Jenny C, Scarantino CW. Morphometric and morphologic evaluations in stage III non-small cell lung cancers. Prognostic significance of quantitative assessment of infiltrating lymphoid cells. Cancer. 1989 Jan 15;63(2):309-16. 297. Meloni F, Morosini M, Solari N, Passadore I, Nascimbene C, Novo M, et al. Foxp3 expressing CD4+ CD25+ and CD8+CD28- T regulatory cells in the peripheral blood of patients with lung cancer and pleural mesothelioma. Hum Immunol. 2006 Jan-Feb;67(1-2):1-12. 298. Karagoz B, Bilgi O, Gumus M, Erikci AA, Sayan O, Turken O, et al. CD8+CD28- cells and CD4+CD25+ regulatory T cells in the peripheral blood of advanced stage lung cancer patients. Med Oncol. 2010 Mar;27(1):29-33. 299. Beyer M, Schultze JL. Regulatory T cells in cancer. Blood. 2006 Aug 1;108(3):804-11. 300. Pyzik M, Piccirillo CA. TGF-beta1 modulates Foxp3 expression and regulatory activity in distinct CD4+ T cell subsets. J Leukoc Biol. 2007 Aug;82(2):335-46. 301. Allan SE, Broady R, Gregori S, Himmel ME, Locke N, Roncarolo MG, et al. CD4+ Tregulatory cells: toward therapy for human diseases. Immunol Rev. 2008 Jun;223:391-421. 302. Chen W, Jin W, Hardegen N, Lei KJ, Li L, Marinos N, et al. Conversion of peripheral CD4+CD25- naive T cells to CD4+CD25+ regulatory T cells by TGF-beta induction of transcription factor Foxp3. J Exp Med. 2003 Dec 15;198(12):1875-86. 303. Vieira PL, Christensen JR, Minaee S, O'Neill EJ, Barrat FJ, Boonstra A, et al. IL-10-secreting regulatory T cells do not express Foxp3 but have comparable regulatory function to naturally occurring CD4+CD25+ regulatory T cells. J Immunol. 2004 May 15;172(10):5986-93. 304. Liu VC, Wong LY, Jang T, Shah AH, Park I, Yang XM, et al. Tumor evasion of the immune system by converting CD4(+) CD25(-) T cells into CD4(+) CD25(+) T regulatory cells: Role of tumor-derived TGF-beta. Journal of Immunology. 2007;178(5):2883-92. 305. Dumitriu IE, Dunbar DR, Howie SE, Sethi T, Gregory CD. Human dendritic cells produce TGF-beta 1 under the influence of lung carcinoma cells and prime the differentiation of CD4+CD25+Foxp3+ regulatory T cells. J Immunol. 2009 Mar 1;182(5):2795-807. 306. Woo EY, Chu CS, Goletz TJ, Schlienger K, Yeh H, Coukos G, et al. Regulatory CD4(+)CD25(+) T cells in tumors from patients with early-stage non-small cell lung cancer and latestage ovarian cancer. Cancer Res. 2001 Jun 15;61(12):4766-72. 307. Woo EY, Yeh H, Chu CS, Schlienger K, Carroll RG, Riley JL, et al. Cutting edge: Regulatory T cells from lung cancer patients directly inhibit autologous T cell proliferation. J Immunol. 2002 May 1;168(9):4272-6. 308. Shimizu K, Nakata M, Hirami Y, Yukawa T, Maeda A, Tanemoto K. Tumor-infiltrating Foxp3+ regulatory T cells are correlated with cyclooxygenase-2 expression and are associated with recurrence in resected non-small cell lung cancer. J Thorac Oncol. 2010 May;5(5):585-90. 309. Sharma S, Yang SC, Zhu L, Reckamp K, Gardner B, Baratelli F, et al. Tumor cyclooxygenase-2/prostaglandin E2-dependent promotion of FOXP3 expression and CD4+ CD25+ T regulatory cell activities in lung cancer. Cancer Res. 2005 Jun 15;65(12):5211-20. 310. Su YJ, Ren K, Li H, Ren XB, Wang CL. [Clinical significance of CD4+ CD25+ regulatory Tcells detection in tumor-draining lymph nodes of nonsmall cell lung cancer patients]. Zhonghua Zhong Liu Za Zhi. 2007 Dec;29(12):922-6. 311. Ju S, Qiu H, Zhou X, Zhu B, Lv X, Huang X, et al. CD13+CD4+CD25hi regulatory T cells exhibit higher suppressive function and increase with tumor stage in non-small cell lung cancer patients. Cell Cycle. 2009 Aug 15;8(16):2578-85. 312. Tao H, Mimura Y, Aoe K, Kobayashi S, Yamamoto H, Matsuda E, et al. Prognostic potential of FOXP3 expression in non-small cell lung cancer cells combined with tumor-infiltrating regulatory T cells. Lung Cancer. 2012 Jan;75(1):95-101. 313. Mayer CT, Floess S, Baru AM, Lahl K, Huehn J, Sparwasser T. CD8+ Foxp3+ T cells share developmental and phenotypic features with classical CD4+ Foxp3+ regulatory T cells but lack potent suppressive activity. Eur J Immunol. 2011 Mar;41(3):716-25. 314. Kayser G, Schulte-Uentrop L, Sienel W, Werner M, Fisch P, Passlick B, et al. Stromal CD4/CD25 positive T-cells are a strong and independent prognostic factor in non-small cell lung cancer patients, especially with adenocarcinomas. Lung Cancer. 2012 Jan 31. 73

315. Kiniwa Y, Miyahara Y, Wang HY, Peng W, Peng G, Wheeler TM, et al. CD8+ Foxp3+ regulatory T cells mediate immunosuppression in prostate cancer. Clin Cancer Res. 2007 Dec 1;13(23):6947-58. 316. Nelson BH. CD20+ B cells: the other tumor-infiltrating lymphocytes. J Immunol. 2010 Nov 1;185(9):4977-82. 317. Pelletier MP, Edwardes MD, Michel RP, Halwani F, Morin JE. Prognostic markers in resectable non-small cell lung cancer: a multivariate analysis. Can J Surg. 2001 Jun;44(3):180-8. 318. Deola S, Panelli MC, Maric D, Selleri S, Dmitrieva NI, Voss CY, et al. Helper B cells promote cytotoxic T cell survival and proliferation independently of antigen presentation through CD27/CD70 interactions. J Immunol. 2008 Feb 1;180(3):1362-72. 319. Bystry RS, Aluvihare V, Welch KA, Kallikourdis M, Betz AG. B cells and professional APCs recruit regulatory T cells via CCL4. Nat Immunol. 2001 Dec;2(12):1126-32. 320. Schaniel C, Pardali E, Sallusto F, Speletas M, Ruedl C, Shimizu T, et al. Activated murine B lymphocytes and dendritic cells produce a novel CC chemokine which acts selectively on activated T cells. J Exp Med. 1998 Aug 3;188(3):451-63. 321. Lai CL, Tsai CM, Tsai TT, Kuo BI, Chang KT, Fu HT, et al. Presence of serum anti-p53 antibodies is associated with pleural effusion and poor prognosis in lung cancer patients. Clin Cancer Res. 1998 Dec;4(12):3025-30. 322. Komiya T, Hirashima T, Takada M, Masuda N, Yasumitsu T, Nakagawa K, et al. Prognostic significance of serum p53 antibodies in squamous cell carcinoma of the lung. Anticancer Res. 1997 Sep-Oct;17(5B):3721-4. 323. Hirasawa Y, Kohno N, Yokoyama A, Kondo K, Hiwada K, Miyake M. Natural autoantibody to MUC1 is a prognostic indicator for non-small cell lung cancer. Am J Respir Crit Care Med. 2000 Feb;161(2 Pt 1):589-94. 324. Venkataraman M, Rao DS, Iyer BS, Westerman MP. The functional deficiency of B lymphocytes in patients with lung cancer is due to inadequate T-cell help and excessive suppression by T and non-T cells. Cancer Invest. 1989;7(1):7-16. 325. Venkataraman M, Rao DS, Levin RD, Westerman MP. Suppression of B-lymphocyte function by T-lymphocytes in patients with advanced lung cancer. J Natl Cancer Inst. 1985 Jan;74(1):37-41. 326. Yasuda M, Mizukami M, Hanagiri T, Shigematsu Y, Fukuyama T, Nagata Y, et al. Antigens recognized by IgG derived from tumor-infiltrating B lymphocytes in human lung cancer. Anticancer Res. 2006 Sep-Oct;26(5A):3607-11. 327. Mizukami M, Hanagiri T, Shigematsu Y, Baba T, Fukuyama T, Nagata Y, et al. Effect of IgG produced by tumor-infiltrating B lymphocytes on lung tumor growth. Anticancer Res. 2006 MayJun;26(3A):1827-31. 328. Dunn GP, Bruce AT, Ikeda H, Old LJ, Schreiber RD. Cancer immunoediting: from immunosurveillance to tumor escape. Nat Immunol. 2002 Nov;3(11):991-8. 329. Dunn GP, Old LJ, Schreiber RD. The immunobiology of cancer immunosurveillance and immunoediting. Immunity. [Review]. 2004 Aug;21(2):137-48. 330. Dunn GP, Koebel CM, Schreiber RD. Interferons, immunity and cancer immunoediting. Nat Rev Immunol. 2006 Nov;6(11):836-48. 331. Dunn GP, Old LJ, Schreiber RD. The three Es of cancer immunoediting. Annual Review of Immunology. [Review]. 2004;22:329-60. 332. Shankaran V, Ikeda H, Bruce AT, White JM, Swanson PE, Old LJ, et al. IFNgamma and lymphocytes prevent primary tumour development and shape tumour immunogenicity. Nature. 2001 Apr 26;410(6832):1107-11. 333. Roithmaier S, Haydon AM, Loi S, Esmore D, Griffiths A, Bergin P, et al. Incidence of malignancies in heart and/or lung transplant recipients: a single-institution experience. J Heart Lung Transplant. 2007 Aug;26(8):845-9. 334. Malmberg KJ, Ljunggren HG. Escape from immune- and nonimmune-mediated tumor surveillance. Semin Cancer Biol. 2006 Feb;16(1):16-31. 335. Whiteside TL. Immune suppression in cancer: Effects on immune cells, mechanisms and future therapeutic intervention. Seminars in Cancer Biology. 2006;16(1):3-15. 336. Whiteside TL. Tricks tumors use to escape from immune control. Oral Oncol. 2009 Oct;45(10):e119-23. 74

337. Kikuchi E, Yamazaki K, Torigoe T, Cho Y, Miyamoto M, Oizumi S, et al. HLA class I antigen expression is associated with a favorable prognosis in early stage non-small cell lung cancer. Cancer Sci. 2007 Sep;98(9):1424-30. 338. Karanikas V, Zamanakou M, Kerenidi T, Dahabreh J, Hevas A, Nakou M, et al. Indoleamine 2,3-dioxygenase (IDO) expression in lung cancer. Cancer Biol Ther. 2007 Aug;6(8):1258-62. 339. Engin AB, Ozkan Y, Fuchs D, Yardim-Akaydin S. Increased tryptophan degradation in patients with bronchus carcinoma. Eur J Cancer Care (Engl). 2010 Nov;19(6):803-8. 340. Frey AB. Myeloid suppresser cells regulate the adaptive immune response to cancer. Journal of Clinical Investigation. [Editorial Material]. 2006 Oct;116(10):2587-90. 341. Gabrilovich DI, Chen HL, Girgis KR, Cunningham HT, Meny GM, Nadaf S, et al. Production of vascular endothelial growth factor by human tumors inhibits the functional maturation of dendritic cells. Nat Med. 1996 Oct;2(10):1096-103. 342. Oyama T, Ran S, Ishida T, Nadaf S, Kerr L, Carbone DP, et al. Vascular Endothelial Growth Factor Affects Dendritic Cell Maturation Through the Inhibition of Nuclear Factor-κB Activation in Hemopoietic Progenitor Cells. The Journal of Immunology. 1998 February 1, 1998;160(3):1224-32. 343. Alfaro C, Suarez N, Gonzalez A, Solano S, Erro L, Dubrot J, et al. Influence of bevacizumab, sunitinib and sorafenib as single agents or in combination on the inhibitory effects of VEGF on human dendritic cell differentiation from monocytes. Br J Cancer. 2009;100(7):1111-9. 344. Hodi FS, O'Day SJ, McDermott DF, Weber RW, Sosman JA, Haanen JB, et al. Improved survival with ipilimumab in patients with metastatic melanoma. N Engl J Med. 2010 Aug 19;363(8):711-23. 345. T. J. Lynch INB, A. Luft, P. Serwatowski, F. Barlesi, R. T. Chacko, M. Sebastian, J. Siegel, J. Cuillerot and M. Reck. Phase II trial of ipilimumab (IPI) and paclitaxel/carboplatin (P/C) in first-line stage IIIb/IV non-small cell lung cancer (NSCLC). Journal of Clinical Oncology, 2010 ASCO Annual Meeting Proceedings (Post-Meeting Edition) 2010;Vol 28(No 15_suppl (May 20 Supplement)):2010: 7531. 346. ClinicalTrials.gov [Internet]. Available from: http://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT01285609. 347. Rosenblatt J, Glotzbecker B, Mills H, Vasir B, Tzachanis D, Levine JD, et al. PD-1 blockade by CT-011, anti-PD-1 antibody, enhances ex vivo T-cell responses to autologous dendritic cell/myeloma fusion vaccine. J Immunother. 2011 Jun;34(5):409-18. 348. Brahmer JR, Drake CG, Wollner I, Powderly JD, Picus J, Sharfman WH, et al. Phase I study of single-agent anti-programmed death-1 (MDX-1106) in refractory solid tumors: safety, clinical activity, pharmacodynamics, and immunologic correlates. J Clin Oncol. 2010 Jul 1;28(19):3167-75. 349. Ghiringhelli F, Larmonier N, Schmitt E, Parcellier A, Cathelin D, Garrido C, et al. CD4+CD25+ regulatory T cells suppress tumor immunity but are sensitive to cyclophosphamide which allows immunotherapy of established tumors to be curative. European Journal of Immunology. 2004;34(2):336-44. 350. Larmonier N, Janikashvili N, LaCasse CJ, Larmonier CB, Cantrell J, Situ E, et al. Imatinib Mesylate Inhibits CD4+CD25+ Regulatory T Cell Activity and Enhances Active Immunotherapy against BCR-ABL– Tumors. The Journal of Immunology. 2008 November 15, 2008;181(10):6955-63. 351. Byrne WL, Mills KH, Lederer JA, O'Sullivan GC. Targeting regulatory T cells in cancer. Cancer Res. 2011 Nov 15;71(22):6915-20.

75