VYSOKÁ ŠKOLA CHEMICKO TECHNOLOGICKÁ V PRAZE Fakulta potravinářské a biochemické technologie. Chemie přírodních látek DIPLOMOVÁ PRÁCE

VYSOKÁ ŠKOLA CHEMICKO TECHNOLOGICKÁ V PRAZE Fakulta potravinářské a biochemické technologie Ústav chemie přírodních látek

DIPLOMOVÁ PRÁCE Polyfenoly rostlin čeledi Apiaceae

Vypracovala:

Lucie Vaníčková

Vedoucí diplomové práce:

Doc. RNDr. Oldřich Lapčík, Dr.

Konzultant:

Ing. Elena A. Prokudina

Studijní program:

Chemie a technologie potravin

Studijní obor:

Chemie a analýza potravin

Studijní zaměření:

Chemie přírodních látek

Prohlašuji, že jsem diplomovou práci zpracovala samostatně s vyznačením všech použitých pramenů a spoluautorství. Souhlasím se zveřejněním diplomové práce podle zákona č.111/1998 Sb., o vysokých školách, ve znění pozdějších předpisů. Byla jsem seznámena s tím, že se na moji práci vztahují práva a povinnosti vyplývající ze zákona č. 121/2000 Sb., autorský zákon, ve znění pozdějších předpisů.

V Praze dne 9. května 2008

SOUHRN Polyfenoly

jsou

sekundární

metabolity rostlin,

významné

svými četnými

biologickými aktivitami. Rostliny čeledi Apiaceae (miříkovité) byly již od starověku používány v tradičním lidovém léčitelství a v kulinářství pro své analgetické, antipyretické, diuretické a senzorické vlastnosti. Novodobé studie prokázaly možnost využití rostlin této čeledi, jako zdroje antioxidantů, které jsou významné při prevenci onemocnění jako je rakovina, atherosklerosa nebo Alzheimerova choroba. U devíti vybraných druhů čeledi Apiaceae byl kolorimetrickou metodou stanoven celkový obsah polyfenolů. Metody HPLC-DAD a HPLC-MS byly použity pro stanovení flavonoidů a kumarinů. Isoflavonoidy byly stanoveny imunospecifickými metodami ELISA a imunoafinitní chromatografií s detekcí MS. Obsah zkoumaných flavonoidů se pohyboval v rozmezí od 1 do 9600 µg/g sušiny, koncentrace kumarinů byly v rozmezí od 5 do 108 µg/g sušiny. Tato studie rozšiřuje poznatky o přítomnosti isoflavonů v čeledi Apiaceae. Jejich přítomnost byla prokázána u všech studovaných druhů. Koncentrace jednotlivých isoflavonů se pohybovaly v rozmezí 3-20000 ng/g sušiny.

SUMMARY Polyphenols are secondary plant metabolites, important for their numerous biological activities. Since medieval times herbs of Apiaceae family have been used in folk medicine and nutrition for their analgetic, antipyretic, diuretic and senzoric properties. Apiaceae herbs are a special object of interest due to their high content of antioxidants, which play an important role in the prevention of diseases such as cancer, atherosclerosis and Alzheimer’s. Selected Apiaceae were investigated for the total polyphenolic content using colorimetric method. HPLC-DAD and HPLC-MS were used for the determination of flavonoids and coumarins. Isoflavonoids were determined by immunospecific ELISA methods and immunoaffinity chromatography with MS detection. The content of flavonoids ranged from 1 to 9600 µg/g dry weight. The concentrations of coumarins ranged from 5 to 108 µg/g dry weight. This study increases the evidence for presence of isoflavonoids in the Apiaceae. The presence of isoflavonoids was recorded in all nine studied species. Their concentrations ranged from 3 to 20000 ng/g dry weight.

Poděkování Děkuji Doc. RNDr. Oldřichu Lapčíkovi, Dr. za odborné vedení, všestrannou pomoc a laskavý přístup při řešení mé diplomové práce. Velký dík patří Ing. Eleně A. Prokudině, Ing. Radce Koblovské a Ing. Petře Lankové za neocenitelnou pomoc a ochotu při zpracování této diplomové práce a za laskavé vedení při laboratorních technikách. Největší poděkování náleží mé rodině za podporu projevenou během celého studia.

OBSAH 1.

ÚVOD ................................................................................................................... 1

2.

SOUČASNÝ STAV ŘEŠENÉ PROBLEMATIKY............................................. 7

2.1

POLYFENOLY.................................................................................................. 7 2.1.1

Biogeneze polyfenolů ................................................................................. 7

2.1.2

Význam pro rostlinu ................................................................................... 9

2.1.3

Polyfenoly jako léčiva a potravinové doplňky ............................................. 9

2.1.4.1

Polyfenoly jako léčiva................................................................................. 9

2.1.4.2

Potravinové doplňky ................................................................................. 10

2.2

ČELEĎ APIACEAE ........................................................................................ 12

2.3

POLYFENOLY V APIACEAE ........................................................................ 17

2.4

2.3.1

Flavonoidy................................................................................................ 17

2.3.1.1

Isoflavonoidy………………………………………………………………14

2.3.2

Kumariny.................................................................................................. 21

2.3.3

Polyfenoly v listech a květech................................................................... 23

2.3.4

Polyfenoly v semenech ............................................................................. 24

ANALYTICKÉ METODY............................................................................... 25 2.4.1

Extrakce ................................................................................................... 25

2.4.2

Chromatografické metody......................................................................... 26

2.4.3

Elektroforetické metody............................................................................ 26

2.4.4

Imunochemické metody............................................................................ 27

3.

EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST…………………………………………………..30

3.1

CHEMIKÁLIE ................................................................................................. 30

3.2

PŘÍSTROJE A VYBAVENÍ ............................................................................ 32

3.3

ROZTOKY ...................................................................................................... 34

3.4

METODY ........................................................................................................ 36 3.4.1

Příprava rostlinných vzorků ...................................................................... 36

3.4.2

Kolorimetrické stanovení celkového obsahu polyfenolů............................ 37

3.4.3

Chromatografické metody......................................................................... 37

3.4.4

Imunoafinitní chromatografie na pevné fázi .............................................. 39

3.4.5

Nepřímá kompetitivní ELISA ................................................................... 40

4.

VÝSLEDKY A DISKUZE ................................................................................. 43

4.1

STANOVENÍ CELKOVÉHO OBSAHU POLYFENOLŮ ............................... 43

4.2

STANOVENÍ FLAVONOIDŮ A KUMARINŮ............................................... 45

4.3

4.2.1

Bedrník anýz (Pimpinella anisum) ............................................................ 45

4.2.2

Bedrník větší (Pimpinella major) .............................................................. 45

4.2.3

Čertovo lejno (Ferula asa-foetida)............................................................ 45

4.2.4

Fenykl obecný (Foeniculum vulgare)........................................................ 46

4.2.5

Halucha vodní (Oenanthe aquatica).......................................................... 46

4.2.6

Kmín kořenný (Carum carvi).................................................................... 46

4.2.7

Kopr vonný (Anethum graveolens)............................................................ 46

4.2.8

Sevlák zeleninový (Sium sisarum) ............................................................ 47

4.2.9

Smldník jelení (Peucedanum cervaria) ..................................................... 47

STANOVENÍ ISOFLAVONOIDŮ .................................................................. 51 4.3.1

ELISA metody.......................................................................................... 51

4.3.2

Imunoafinitní chromatografie.................................................................... 55

5.

ZÁVĚR ............................................................................................................... 60

6.

LITERATURA ................................................................................................... 61

7.

SEZNAM POUŽITÝCH ZKRATEK………………………………………… ..61

1. ÚVOD Polyfenoly jsou sekundární metabolity rostlin, syntetizovány šikimátovou či malonátacetátovou cestou. V rostlině zastávají širokou škálu funkcí. Působí jako obranné látky proti škůdcům, pigmenty květů či plodů, fungicidy a další. Z farmakologického a terapeutického

hlediska

jsou

polyfenoly

významné

svými

antioxidativními,

venoprotektivními, cytostatickými a hepatoprotektivními účinky1. V poslední době značně vzrostl zájem o rostlinné polyfenoly, které mohou nahradit syntetické antioxidanty v potravinách či léčivech2. Rostliny čeledi Apiaceae (miříkovité) byly již od starověku využívány v tradičním lidovém lěčitelství a v kulinářství pro své analgetické, antipyretické a diuretické vlastnosti. Novodobé studie prokázaly možnost využití vybraných druhů této čeledi, jako zdroje antioxidantů, které jsou důležité při prevenci degenerativních onemocnění3,4,5. Pro stanovení jednotlivých polyfenolických sloučenin v rostlinných extraktech a biologických materiálech jsou používány především metody chromatografické (kapalinová a plynová chromatografie – HPLC a GC), elektromigrační (kapilární elektroforéza – CE, micelární elektroforetická kapilární chromatografie – MECK) a metody imunochemické (kompetitivní nepřímá enzymová imunoanalýza – ELISA, radioimunoanalýza – RIA, fluorescenční imunoanalýza – FIA)6,7,8. Cílem této práce bylo připravit extrakty z vybraných zástupců čeledi Apiaceae a pokusit se s použitím chromatografických a imunochemických metod ověřit literární údaje o výskytu polyfenolů v této čeledi.

2. SOUČASNÝ STAV ŘEŠENÉ PROBLEMATIKY 2.1

POLYFENOLY Polyfenoly tvoří velkou skupinu rostlinných sekundárních metabolitů. Jsou

pozoruhodné bohatou strukturní variabilitou a širokým rozsahem biologických funkcí, a to jak v rostlině samotné, tak i v působení na organismy jiných druhů. Vznikají jako produkty několika základních biogenetických drah, vedoucích k omezenému počtu tříd klíčových meziproduktů. Z těch jsou pak dále syntetizovány tisíce takzvaných periferních derivátů, obvykle velmi jednoduchými enzymatickými transformacemi9. 2.1.1

Biogeneze polyfenolů

Nejběžnější metabolická dráha biogeneze polyfenolů vychází z monosacharidů a vede přes kyselinu šikimovou ke vzniku aromatických aminokyselin (fenylalanin, tyrosin) (Schéma 1). Klíčovým meziproduktem této biosyntézy je kyselina skořicová, nebo její deriváty. Další biosyntetické kroky vedou ke vzniku fenolických kyselin, flavonoidů, kumarinů a mnoha dalších metabolitů. Další významná metabolická dráha vychází z acetátu a vede k poly-β-keto esterům, které jsou dále transformovány Claisenovou či aldolovou kondenzací na polycykly, zahrnující isokumariny, xanthony, chinony a další10.

Schéma 1: Biosyntéza fenylpropanoidů (šikimátová dráha)9; PAL: fenylalaninamoniumlyasa, TAL: tyrosinamoniumlyasa. COOH

HO

OH OH

P-O-(C=CH2)-COOH COOH

COOH O

HO

O

p-OH-fenylpyruvát

fenylpyruvát

COOH

COOH NH2

HO

NH2

tyrosin

fenylalanin PAL

TAL

COOH

COOH HO

kyselina kumarová

kyselina skoricová Fenylpropanoidy (C6-C3)n

2.1.2

Význam pro rostlinu

Rostlinné polyfenoly vykazují širokou škálu biologických funkcí a účinků. Mají zásadní význam pro přežití druhu a tím i pro ekologické vztahy a fylogenetický vývoj v přírodě. Z hlediska chemické ekologie jde o interakce mezi rostlinou a organismem, který je na ní závislý. Nejznámější jsou interakce rostlina – mikroorganismus, rostlina – rostlina či rostlina – býložravec. Polyfenoly v rostlinách působí jako pigmenty květů a plodů (flavony, anthokyany, naftochinony), allelopatické substance (chinony), fungicidy (isoflavony), fytoalexiny (flavonoidy, isoflavonoidy, kumariny, třísloviny), zajišťují ochranu rostliny před škodlivými účinky UV záření (flavony)9,10. 2.1.3 2.1.4.1

Polyfenoly jako léčiva a potravinové doplňky Polyfenoly jako léčiva

Léčiva používaná k terapii nemocí gastrointestinálního ústrojí: Hepatika jsou různorodá skupina léčiv užívaných v terapii chronických onemocnění jater. Mechanismus jejich příznivého účinku na metabolismus a morfologii jaterní buňky je obvykle nejasný, příznivý terapeutický efekt u hepatopatií řady z nich nebyl dosud bezpečně prokázán. Zástupcem této skupiny léčiv je silymarin, což je směs izomerních flavonolignanů (silibininu, isosilibininu, silidianinu, a silichristinu) z plodů ostropestřce marijánského Silybum marianum. Silymarin působí příznivě na metabolismus hepatocytů, stabilizuje buněčné membrány. Je užíván při akutní virové hepatitidě, toxické a metabolické léze jater a polékovém poškození jater. Je účinnou složkou např. v léčivech Flavobion, Lagosa nebo Legalon11.

Léčiva používaná k terapii nemocí kardiovaskulárního systému: Venofarmaka jsou užívána v terapiích žilních nemocí. Působí příznivě na mikrocirkulaci, kde snižují permeabilitu a fragilitu kapilár a zlepšují lymfatickou drenáž. Tím brání vzniku otoku a zlepšují výživu tkáně. Nejčastěji jsou užívány přírodní flavonoidy: rutin (flavonoid s protiedémovým a venoprotektivním účinkem, je obsažen v léčivech Ascorutin,

Anavenol a dalších), diosmin (flavonoid s protizánětlivým a venoprotektivním účinkem, součástí léčiva Detralex) a hesperidin (flavonoid s protizánětlivým a venoprotektivním účinkem, je součástí léčiva Detralex)12.

Přípravky proti omrzlinám: Na omrznutím mírně poškozenou tkáň je vhodné aplikovat protizánětlivá kapilarotonicky působící léčiva. Aplikují se v mastech (Ichtoxyl), hodí se však pouze na drobnější, nehluboká poškození. Nejčastěji se používají externa obsahující peruánský balzám - balsamum peruvianum. Tento přírodní fenolický materiál, který se získává jako exudát z porušené kůry stromu Myroxylon balsamum, obsahuje směs kyselin: benzoové, skořicové a kávové a jejich esterů s fenolickými alkoholy13.

Cytostatika určená k lokální aplikaci: Cytostatika jsou léčiva, která tlumí až zastavují růst a dělení buněk. Působí nejvíce na rychle se dělící buňky, tedy zejména na nádorové struktury. Působí však i na ostatní rychleji proliferující buňky. Cytostatika zasahují do metabolismu nukleových kyselin a ruší dělení buněk na různých úrovních buněčného cyklu. Z fenolických látek vykazují významnou cytostatickou aktivitu lignany podofylin a podofyllotoxin z oddenků noholistu Podophyllum peltatum nebo P. emodi. Tyto látky jsou obsaženy v léčivu Wartec Wolff 14. 2.1.4.2

Potravinové doplňky

Isoflavony, významné nejen svou fytoestrogenní aktivitou, jsou součástí mnoha potravinových doplňků (Isoflavone, Menoflavon, Femiflavon a řada dalších). Bylo prokázáno, že ženy s dostatečným příjmem fytoestrogenů mají méně typických klimakterických potíží, jako jsou návaly horka, pocení a nižší riziko vzniku osteoporózy a fraktur krčku kosti stehenní15. Lignan schizandrin, který je obsažen ve všech částech rostliny klanoprašky čínské (Schisandra chinensis), působí příznivě na lidský organismus. Preparáty ze semen a plodů klanoprašky mají povzbudivý účinek na centrální nervovou soustavu, stimulují cévní činnost a dýchání. Lihová tinktura ze semen a plodů se používá jako prostředek zvyšující pracovní schopnost, posiluje organismus při silném fyzickém vypětí, intelektuální únavě, ospalosti a

depresivních stavech. Preparáty z klanoprašky jsou kontraindikovány při zvýšené nervové vzrušivosti, nespavosti, zvýšeném arteriálním tlaku a při poruchách srdeční činnosti16. Extrakty z listů a semen vinné révy (Vitis vinifera) obsahují flavonoidy (kvercetin, kvercitrin, kaempferol-3-O-glykosid). Tyto látky jsou významné především antioxidačním působením a ovlivňují hladiny HDL cholesterolu17. Pro své protizánětlivé účinky se užívají při zánětlivých cévních onemocněních, ateroskleróze a prevenci infarktu myokardu. Zmíněné extrakty jsou součástí preparátů ActivinProtect, DetoxVenoProtect a dalších. Pycnogenol je přírodní extrakt, který se získává z kůry borovice přímořské (Pinus maritima). Tento strom roste v oblasti Biskajského zálivu ve Francii. Pycnogenol obsahuje ve velmi koncentrované formě více než 40 bioflavonoidů ze skupiny proanthocyanidinů s vysokým antioxidačním účinkem18.

2.2

ČELEĎ APIACEAE Apiaceae (jinými názvy Umbelliferae, Daucaceae), je rozsáhlá rostlinná čeleď ze

třídy dvouděložných (Magnoliopsida), reprezentovaná téměř 455 rody a přibližně 3750 druhy. Dělí se do 3 podčeledí: Hydrocotyloideae, Saniculoideae a Apioideae (Schéma 2)19. Rostliny čeledi Apiaceae jsou jednoleté, dvouleté či vytrvalé byliny, zřídka keře. Vyskytují se zejména v mírném a subtropickém pásu severní polokoule. Lodyhy jsou vzpřímené, duté a článkované. Střídavé jednoduché listy přisedají ke stonku širokou pochvou. Jsou skoro celistvé nebo laločnaté, většinou bohatě zpeřené. Květy jsou drobné, často oboupohlavné, pětičetné. Bývají sdruženy v okoličnatá květenství, nejčastěji ve složené okolíky. Okolíky bývají podepřeny listeny, zvanými obal. Plodem je poltivá dvounažka. Nažky jsou různě zvrásněné a žebernaté, někdy prodloužené v zobánek. Rostliny obsahují v pletivech siličné kanálky, proto Apiaceae po rozemnutí výrazně voní. Některé druhy také produkují pryskyřice, toxiny a alkaloidy. Mnoho druhů je od sebe těžko rozeznatelných. Určovacími znaky jsou např. chybějící obaly či obalíčky, dále vzhled nažek, nebo členění čepelí listů19.

Schéma 2: Taxonomické zařazení zkoumaných druhů čeledi Apiaceae20 Říše: rostliny (Plantae) Podříše: cévnaté rostliny (Tracheobionta) Oddělení: krytosemenné rostliny (Magnoliophyta) Třída: dvouděložné (Magnoliopsida) Čeled´: miříkovité (Apiaceae) Podčeled´: pupečníkovité (Hydrocotyloideae) žindarové (Saniculoideae) miříkové (Apioideae) Kmen: Apieae Rod: Anethum Druh: kopr vonný (Anethum graveolens) Rod: Bupleurum Druh: Bupleurum chinense, Bupleurum scorzonerifolium Rod: Carum Druh: kmín kořenný (Carum carvi) Rod: Foeniculum Druh: fenykl obecný (Foeniculum vulgare) Rod: Oenanthe Druh: halucha vodní (Oenanthe aquatica) Rod: Pimpinella Druh: bedrník anýz (Pimpinella anisum), bedrník větší (Pimpinella major) Rod: Sium Druh: sevlák zeleninový (Sium sisarum) Kmen: Peucedaneae Rod: Ferula Druh: čertovo lejno (Ferula asa-foetida) Rod: Peucedanum Druh: smldník jelení (Peucedanum cervaria)

Studované druhy rostlin: Bedrník anýz, (Pimpinella anisum) je jednoletá, anýzem vonící bylina s tenkým, vřetenovitým kořenem. Lodyha je větvená, jemně rýhovaná; listy lichozpeřené; květy drobné, bílé či růžové. Druh pravděpodobně pocházející z jihozápadní Asie, jeho kulturní využití je doloženo již od středověku. U nás se dříve pěstoval dosti často, dnes jen vyjímečně. Aromatické plody a silice (Oleum anisi) z nich získávaná jsou používány v lékařství (spasmolytikum, zvyšuje vylučování trávících enzymů, antiseptikum dýchacích cest). Je využíván také jako koření zejména při přípravě pečiva a likérů19,21. Berdník větší, (Pimpinella major) je vytrvalá bylina se silným vřetenovitým kořenem. Lodyha přímá, lysá, hranatě rýhovaná; listy řapíkaté, lichozpeřené; květy bílé či světle růžové. Používaná část je kořen, oddenek (Pimpinellae radix) a nať (Pimpinellae herba). Významné obsahové látky v nati jsou flavonoidy, v kořenu jsou silice (až 0.7 %), furanokumariny, estery kyseliny kávové. Nať se používá vnitřně při plicních onemocněních a k podpoře aktivity zažívacího traktu. Zevně při křečových žilách. Kořen je doporučován při zánětech průdušek, kašli a také při nachlazení nebo katarech horních cest dýchacích. V lidové medicíně je doporučován vnitřně při onemocnění vylučovacího systému, zánětech močového měchýře a ledvin. Vyskytuje se v Evropě, v jižní a jihovýchodní Asii, jižní Africe a Madagaskaru19. Čertovo lejno, (Ferula asa-foetida) má kořen vytrvalý, veliký, silně proniknutý pryskyřičnými kanálky. Listy veliké krátce pýřité, 3-4krát trojeně peřenodílné. Lodyha mohutná, až 3 m vysoká; květy v okolíku 20-30 paprsčitém. Pochází ze stepí Persie a vyskytuje se hojně mezi Perským zálivem a Aralským jezerem. Slouží jako lék (zklidňující prostředek, proti kašli, podporuje trávení), ale také jako koření v pokrmech (součást worcesterové omáčky). Drogou je mléčná pryskyřice, která na vzduchu tuhne. Tvoří zrna nebo hrudky, lesklé, červenohnědé barvy. Hlavní součástí pryskyřice jsou: kyselina ferulová a umbelliferon, silice a guma. Tato rostlina je studována pro své antioxidační a protirakovinové účinky22. Fenykl obecný, (Foeniculum vulgare) je vytrvalá, lysá, sivě zelená bylina s dlouhým, vřetenovitým kořenem a větvenou lodyhou. Listy jsou vícenásobně peřenosečné; květy v okolíku, žluté. Dosti často pěstovaný a občas zplaňující. Rozšířen od Kanárských ostrovů přes Evropu až po Střední Asii. Původní pravděpodobně jen ve Středozemí a západní Asii. U nás se pěstuje jako kořeninová rostlina a léčivka především pro aromatické plody

(convar. vulgare)20. Plody se používají jednak jako přísada do pokrmů a likérů, jednak do léčivých čajů. Působí jako karminativum a spasmolytikum, diuretikum23 a používají se k přípravě oficinálního extraktu Oleum foeniculi. Nať a plody obsahují éterické oleje, jejichž hlavními složkami jsou anethol a fenchon. Obsah chemických látek však může být různý podle kultiváru a původu rostliny. Halucha vodní, (Oenanthe aquatica) je jednoletá či dvouletá bahenní, rozkladitě větvená bylina; lodyhy přímé, až přes jeden metr vysoké, dole tlusté, duté. Listy pochvatě řapíkaté, až třikrát zpeřené. Okolíky jsou četné; květy bílé. Plody obsahují přibližně 2% silice, z čehož asi 80% tvoří phellandrin, a dále alkohol nadrol (který je příčinou nepříjemného zápachu rostliny), asi 20% oleje, 4% pryskyřice, 3% vosku, gumy, vlákniny, sloučeniny křemíku, hliníku a jiné látky. Toxické působení haluchy vodní není blíže prozkoumáno, tyto účinky se ale připisují pryskyřičné látce oenanthin, která je obsažena nejvíce v kořeni. Otrava se projevuje kolikovými bolestmi, průjmem a křečemi. V lidovém léčitelství je droga používána pro usnadnění vykašlávání, působí silně močopudně a proti nadýmání. Zejména v minulosti byla vyhlášeným lékem proti astmatu. Zevně se také používalo rozmačkané natě haluchy na různá poranění20. Kmín kořenný, (Carum carvi) je dvouletá lysá bylina s kůlovým kořenem, lodyhami obloukovitě vystoupavými a s listy lichozpeřenými; květy v okolíku čistě bílé, zřídka růžové. Vyskytuje se téměř v celé Evropě, severozápadní Africe, Sibiři, Dálném Východu, atd.. Pěstuje se jako kořeninová zelenina a léčivá rostlina pro aromatické plody. Používají se při přípravě pokrmů a ve farmacii ve formě extraktu (Oleum carvi). Sbírané plody planého kmínu se používají odedávna (archeologické nálezy je znají z celého středověku), zprávy o pěstování však pocházejí až ze začátku novověku. Ve zralých plodech se vyskytuje typická složka karvon, v květech a mladých plodech je přítomen limonen, vegetativní části obsahují směs těchto a dalších zejména monoterpenických látek20,22. Kopr vonný, (Anethum graveolens) má letní, tence vřetenovitý kořen a přímé, dvě až tři stopy vysoké, lysé lodyhy. Listy jsou třikrát zpeřené; květy drobné, žluté. Je to běžně pěstovaná kořeninová rostlina, často zplaňující. Užívá se především čerstvá nať jako přísada do pokrmů, nálevů a podobně, též různě konzervovaná a mražená. Z plodů se získává silice pro potravinářské účely; obsahuje především monoterpen karvon. Pochází pravděpodobně ze Středozemí, dnes je pěstován a příležitostně se zplaňuje v mírných a subtropických pásech celého světa. V minulosti byl užíván jako léčivka pro snížení krevního tlaku, zlepšení

prokrvení srdečního svalu. Působí proti nadýmání, tlumí břišní křečovité bolesti a zlepšuje trávení. Jeho pěstování je doloženo od starověku, u nás v archeologických nálezech od středověku20. Novodobé studie prokázaly možnost využití kopru při prevenci vzniku rakoviny24. Sevlák zeleninový, (Sium sisarum) je vytrvalá vodní a mokřadní bylina s dutou lodyhou. Listy jsou řapíkaté; květy jsou bílé ve složeném okolíku. Jeho kořen se pěstuje jako zelenina pro svou slabší aromatickou a sladkou chuť. V lidovém léčitelství je využíván pro zlepšení jaterní činnosti, zlepšení trávení a při hemoroidech. Rozšířen v Euroasii, Severní Americe a severní Africe20. Smldník jelení, (Peucedanum cervaria) je vytrvalá bylina s tlustým válcovitým oddenkem; stonek jemně proužkovaný, lysý; přízemní listy řapíkaté; květ je bílý, pouze v jediném okolíku. Rozšířen od Středozemí po Střední Asii, dále na Sibiři a Indickém poloostrově. V České Republice patří mezi ohrožené druhy20.

2.3

POLYFENOLY V APIACEAE Charakteristické polyfenoly vyskytující se v čeledi Apiaceae jsou flavonoidy a

kumariny25,26. Nejčastěji zastoupené aglykony flavonoidů jsou kaempferol, kvercetin, apigenin a luteolin27, které byly navrženy jako chemotaxonomické markery uvedené čeledi. Ze skupiny kumarinů jsou nejčastěji zastoupeny umbelliferon, aeskulin a furanokumariny bergapten a xanthotoxin28 . 2.3.1

Flavonoidy

Flavonoidy patří mezi jednu z nejvýznamnějších skupiny fenolických sloučenin. Jsou téměř vždy rozpustné ve vodě, jsou zodpovědné za barvu květů, plodů a někdy i listů. V některých případech fungují jako kopigmenty: bezbarvé flavonové a flavonolové kopigmenty chrání anthokyany. Flavonoidy jsou také součástí listové kutikuly a epidermálních buněk, kde zajišťují ochranu před škodlivými účinky UV záření29. Všechny flavonoidy mají stejný biosyntetický původ. Klíčovým krokem biosyntézy je kondenzace tří molekul malonyl-CoA s molekulou 4-kumaryl-CoA (ester koenzymu A a hydroxyskořicové kyseliny), katalyzovaná chalkonsynthasou (Schéma 3). Základní struktura flavonoidů je tvořena 2-fenylchromanem (A a C kruhy benzo-1-pyran-4-chinonu a B kruh) (Obr. 1). Flavonoidy se dále dělí na flavony (základní struktura), flavonoly (s hydroxylovou skupinou v poloze 3) (Obr. 1), flavanony (2-3 vazba je nasycená) (Obr. 1), katechiny (C-kruhem je 1-pyran), chalkony (C-kruh je otevřený) a anthokyany (C-kruhem je 1-pyran, 1-2 a 3-4 vazby jsou nenasycené). Jsou různě substituovány hydroxylovými a/nebo methoxylovými skupinami30,31. Glykosylované formy flavonoidů jsou ve vodě rozpustné, akumulují se ve vakuolách a epidermu listů. Cukerné složky glykosylflavonoidů mohou být mono-, di-, nebo trisacharidy. Z monosacharidů jsou nejčastěji zastoupeny D-glukosa, D-galaktosa, D-allosa, pentosy (D-apiosa, L-arabinosa), D-glukuronová nebo

D-galakturonová

kyselina. Glykosidy

tvořené di- nebo trisacharidy vykazují bohatou strukturní variabilitu (např. rutinosa = O-α-L-rhamnosyl-(1→6)-glukosa). Sacharid může být vázán na aglykon přes kteroukoliv

hydroxylovou skupinu. Speciální skupinu tvoří C-glykoflavonoidy, kde sacharid (glukosa, galaktosa, pentosa) je vázán přes asymetrický uhlík na uhlík aglykonu v poloze 6 nebo 830. R 3'

OH

4' 8 7 A

OH

C

1 O B

R

HO

O

HO

O

2 3

6 5

OH

4 OH

(1)

O

(2) R = OH: luteolin

OH

O

(3) R = H: kaempferol R = OH: kvercetin

Obr. 1: Základní struktura flavonoidů (1), flavonů (2) a flavonolů (3). V čeledi Apiaceae jsou nejběžněji zastoupenými flavonoidy kaempferol, kvercetin, apigenin a luteolin ve formě aglykonů. Flavanony isorhamnetin, chrysoeriol, akacetin a diosmetin se vyskytují v této čeledi méně často28. Glykosylace je běžná v pozici 3 u flavonolů a v pozici 7 u flavonů. Byl také publikován výskyt sulfatovaných flavonoidů32. Škála flavonoidů, převážně kaempferol, kvercetin a luteolin (Obr. 1), nalezených v různých podčeledích Apiaceae byla navržena jako taxonomické markery. Rostliny podčeledi Apioideae produkují flavonové glykosidy, které se nevyskytují u rostlin podčeledí Hydrocotyloideae a Saniculoideae33.

Schéma 3: Metabolická dráha flavonoidů. FNS: flavonsynthasa, FHT: flavanon 3β-hydoroxylasa, FLS: flavonolsynthasa, ANS: anthokyanidinsynthasa, DFR: dihydroflavonol 4-reduktasa, F3´H: flavonoid 3´-hydroxylasa34.

4-kumaroyl-CoA + 3 x malonyl-CoA

OH

OH

HO

O

OH

OH

OH

OH

FNS

HO

HO

O

OH

O

OH

O

FHT

OH

O

apigenin

FHT OH

OH

FLS

HO

O

OH

F3´H

HO

O

OH

OH OH

O

kvercetin

O

O

OH

OH

OH

HO

naringenin

eriodiktyol

O

FNS

F3´H

luteolin

HO

O

OH

FLS

OH

OH

O

OH

dihydrokaempferol

DFR

DFR OH

OH HO

O

O OH

OH OH

OH

OH

leukopelargonidin

leukokyanidin ANS

ANS OH OH

HO

O

OH HO

O

+

+

OH OH

kyanidin

OH OH

pelargonidin

O

kaempferol

OH

OH

O

OH

O

dihydrokvercetin

HO

OH HO

2.3.1.1

Isoflavonoidy

Isoflavonoidy tvoří specifickou větev flavonoidového metabolismu. Od ostatních flavonoidů se odlišují pozicí fenolického kruhu B (Obr. 2, Tab I). Jsou součástí interakcí mezi rostlinou a jejími přirozenými partnery (bakterie, houby, hmyz, měkkýši, obratlovci)35. Tyto látky vykazují zajímavé farmakologické aktivity – endokrinologické, antibakteriální, antivirální, protizánětlivé, aj. 36. Estrogenně aktivní isoflavony – genistein, daidzein a některé další – patří k nejčastěji studovaným fenolickým látkám. Isoflavonoidy jsou biosynteticky odvozeny ze stejných prekurzorů jako většina flavonoidů37..Těmito

prekurzory

jsou

jednoduché

flavanony

–

naringenin

(5,7,4´-

-trihydroxyflavanon), liquiritigenin (7,4´-dihydroxyflavanon)38 a pravděpodobně i některé 7-hydroxyflavanony39. V rostlinách produkujících isoflavonoidy jsou výše uvedené flavanony konvertovány isoflavonsyntasou na základní isoflavonoidy. Další sled enzymatických reakcí vede ke vzniku složitějších struktur zahrnujících glykosidy, rotenoidy, 3-arylkumariny, kumestany, kumaronochromony, dimery isoflavonoidů a jejich konjungáty40,41,42,43. Většina doposud známých a popsaných isoflavonů pochází z čeledi Fabaceae. Tato všeobecně známá skutečnost někdy vede k přehlížení přítomnosti těchto látek i v jiných, fylogeneticky vzdálených čeledích (např. Iridaceae, Rosaceae, Violaceae, Magnoliaceae aj.)29. V čeledi Apiaceae byl výskyt isoflavonů doposud publikován pouze u dvou zástupců rodu Bupleurum, v nichž byly nalezeny daidzin, puerarin a glykosid formononetinu nazvaný saikoisoflavonosid A (7-hydroxy-4‘-methoxy-isoflavon-7-O-β-D-glukopyranosyl-(1→6)-β-D-glukopyranosid)44. Tab. II: Struktury studovaných isoflavonoidů

1

R

O

3

R

O

2

R Obr. 2: Základní struktura isoflavonu

R1 Daidzin OGlc Genistin OGlc Daidzein OH Sissotrin OGlc Genistein OH Formononetin OH Isoformononetin OCH3 Prunetin OCH3 Biochanin A OH

R2 OH OH OH OCH3 OH OCH3 OH OH OCH3

R3 H OH H OH OH H H OH OH

2.3.2

Kumariny

Kumariny jsou laktony 2-hydroxy-Z-skořicové kyseliny (Obr. 3). Stejně jako ostatní fenylpropanoidy, vznikají kumariny metabolickou drahou vedoucí od fenylalaninu přes kyselinu skořicovou, kyselinu p-kumarovou. Doposud jich byly posány více než dva tisíce. Jsou hojně zastoupeny napříč celou rostlinnou říší. Některé čeledi krytosemenných rostlin produkují mnoho strukturních typů kumarinů: Fabaceae, Asteraceae a především Apiaceae a Rutaceae. 5

4

1

R

3

6

2 7

O 1

8

O

2

R

O

O

3

R

(1)

(2) R1 = R3 = H, R2 = OH (3) R1 = R3 = H, R2 = OCH3

Obr. 3: Základní struktury kumarinů (1) a struktura umbelliferonu (2) a herniarinu (3)

U většiny kumarinů se v pozici 7 vyskytuje hydroxylová skupina. Umbelliferon (Obr. 3), což je 7-hydroxykumarin, je prekurzorem 6,7-di- a 6,7,8-trihydroxylovaných kumarinů. Často se v přírodě vyskytují také methylované, glykosylované a prenylované deriváty. Vysoká reaktivita isoprenylového řetězce vysvětluje vznik velkého počtu strukturních derivátů (epoxidované, mono- a dihydroxylované, atd.). Prenylace benzenového kruhu dimethylallyl pyrofosfátem v 6- a 8-pozici 7-hydroxykumarinu vede ke vzniku polycyklických kumarinů, furanokumarinů a pyranokumarinů (Schéma 4).

Schéma 4: Biosyntetická dráha furanokumarinů46

CH3

CH3

H3C O H3C

H3C HO

O

O

HO

umbelliferon

O

HO

O

O

O

O

demethylsuberosin oxidace

OCH3 H3C O

O

O

O

O

O

O

bergapten

HO

4´ 5´ CH3 O

marmesin

Furanokumariny jsou známy fototoxickou aktivitou, která zapříčiňuje vznik přechodné kožní hyperpigmentace. Po přímém styku s rostlinami (např. z čeledi Apiaceae, Rutaceae), obsahujícími tyto látky a následném exponování na slunci, dochází ke vzniku akutních kožních onemocnění a puchýřů. Fototoxické složky, běžné ve všech těchto druzích rostlin, jsou lineární furanokumariny: psoralen, bergapten (5-methoxypsoralen) a xanthotoxin (xanthotoxol); angulární furanokumariny (pimpinellin, angelicin) jsou jen málo toxické. Každý z furanokumarinů se může podílet na cykloadiční reakci a mohou tak tvořit spojení mezi páry bazí nukleových kyselin a zapříčinit takto poškození genomu. Je možné, že tyto vlastnosti souvisejí s fototoxicitou furanokumarinů45,46.

2.3.3

Polyfenoly v listech a květech

J. B. Harborne a V. H. Heywood provedli roku 1969 rozsáhlou studii flavonoidů v listech 300 druhů rostlin čeledi Apiaceae. Většina zkoumaných druhů vykazovala přítomnost flavonoidů, či jiných polyfenolů (kumariny v listech Angelica a Seseli spp.)47. Ze systematického pohledu, nejvýznamnějším rysem je, že téměř všechny druhy obsahují buď flavonoly nebo flavony, ale ne oba najednou. Flavonoly se nejčastěji vyskytují u rodů Carum, Eryngium, Hydrocotyle, Peucedanum, Pimpinella a Sanicula. Flavony jsou časté u rodů Chaerophyllum, Conopodium a Torilis. Výjimkami jsou některé rody jako Daucus a Lasepitium, u nichž byla zaznamenána přítomnost jak flavonů, tak flavonolů. Na úrovni podčeledí, přítomnost flavonů odděluje Apioideae od ostatních dvou podčeledí. V rámci Apioideae můžeme rozlišit rody s ojedinělým (Peucedaneae, v jednom z šedesáti čtyř druzích), běžným (Dauceae, v sedmi z jedenácti druhů) a převládajícím (Caucalineae, dvacet jedna z dvaceti tří) výskytem flavonů. Flavonoidy vyskytující se v květech Apiaceae mají podobné struktury jako flavonoidy v listech. Studie flavonoidních glykosidů v čeledi Apiaceae poukazují na přítomnost jednoduchých glykosidů v listech. Ty jsou nejčastěji zastoupeny ve formě 7-O-glykosidů a 3-O-glykosidů. C-glykosylflavony se vyskytují zcela vyjímečně. Hydroxykumariny umbelliferon a aesculetin byly identifikovány v listech, avšak svým výskytem jsou spíše typické pro semena a kořeny29.

2.3.4

Polyfenoly v semenech

Jelikož semena některých Apiaceae jsou používána jako koření (fenykl, kmín) nebo jsou využívána ve farmaceutickém průmyslu (kopr, anýz), bylo jejich složení podrobně studováno. Polyfenoly identifikovány v semenech jsou značně podobné těm, které jsou obsaženy v listech. Nejčastěji se vyskytující látky jsou furanokumariny, které jsou charakteristické pro zkoumanou čeleď a jsou přítomny v každém rodu. Často se vyskytují jako složité směsi. V semenech Apaiceae se vyskytují také flavonoidy. Jejich přehled je uveden v Tab. III48,49.

Tab. III: Flavonoidy semen Apiaceae; podle Harborna50

Druh

Hlavní flavonoid

Vedlejší flavonoid

Flavonolové druhy Coriandreae

kvercetin

Smyrnieae

kvercetin

Apieae

kvercetin nebo kaempferol

Peucedaneae

kvercetin

luteolin jen v Conium glykoflavon v Smyrnium glukuronidy v Anethum isorhamnetin v několika rodech, KHSO4 soli v Oenanthe isorhamnetin v Pastinaca

Flavonové druhy Laserpitieae

luteolin

Scandieae

luteolin

Dauceae

luteolin

chrysoeriol, apigenin, luteolin jako 5- nebo 4‘-glukosid

2.4

ANALYTICKÉ METODY Mezi rychlé orientační techniky patří především tenkovrstvá (TLC) chromatografie.

Pro stanovení jednotlivých polyfenolických sloučenin v rostlinných extraktech a biologických materiálech jsou používány především metody chromatografické (kapalinová a plynová chromatografie – HPLC a GC) elektromigrační (kapilární elektroforéza – CE, micelární elektroforetická kapilární chromatografie – MECK) a metody imunochemické (kompetitivní nepřímá enzymová imunoanalýza – ELISA, radioimunoanalýza – RIA, fluorescenční imunoanalýza – FIA). Cenné informace o chemické struktuře studovaných metabolitů můžeme získat spektrofotometrickými metodami v ultrafialové a viditelné (UV-Vis) nebo 1

infračervené oblasti (IR), hmotnostní spektrometrií a nukleární magnetickou resonancí ( H13

-NMR, C-NMR).

2.4.1

Extrakce

Rostlinný materiál, který je používán pro získávání polyfenolických látek je jak čerstvý, tak sušený nebo lyofilizovaný50. Nejběžněji se polyfenoly extrahují z biologického materiálu vodnými roztoky rozpouštědel: methanolu51,52, ethanolu53,54,55,56, acetonu57, acetonitrilu58 nebo diethyletheru57,58,59. Extrakce se provádí buď dlouhodobější macerací (až 14 dnů) při laboratorní teplotě57, nebo pod refluxem po dobu 1– 4 hodin51,56. Vyššího výtěžku je docíleno sonikací v ultrazvukové lázni52,54. Extrakci často doprovází hydrolýza konjugátů, která může být provedena buď kysele nebo enzymaticky51. Získaný extrakt je dále nutno zbavit látek lipidického charakteru jejich extrakcí do hexanu nebo jiného nepolárního rozpouštědla57,60. Možné je i následné přečištění na pevné fázi (SPE)52. Finální extrakt je dále zpracováván buď přímo, anebo častěji po aplikaci některé ze separačních technik.

2.4.2

Chromatografické metody

Vysokoúčinná kapalinová chromatografie (HPLC) Kapalinová chromatografie je charakterizována používáním kapaliny jako mobilní fáze. Pro analýzu polyfenolů (flavonů, isoflavonů, kumarinů) je vhodná chromatografie na reverzní fázi. Stacionární fáze je nepolární, nejčastěji C18 (oktadecyl silikagel). Mobilní fáze je polární, jedná se o vodné roztoky methanolu51,55 acetonitrilu51,52,53,54, octanu amonného51,52,55, kyseliny mravenčí52, octové54 nebo trifluoroctové (TFA)51,53 a jejich směsí, eluce je nejčastěji gradientová. Identifikace analytů je založena na porovnání retenčních časů a absorpčních spekter se standardy sledovaných látek. Detekce eluovaných analytů je prováděna detektory UV-VIS (např. diodové pole – DAD)52,53,54, fluorescenčními54 elektrochemickými53 nebo hmotnostními (MS)51,53,55. Hmotnostní spektrometrie představuje v současné době nejcitlivější a nejselektivnější analytickou metodu pro kvalitativní i kvantitativní stanovení jak známých analytů, tak neznámých struktur. Takto získaná data jsou dále pro ověření porovnávána s NMR nebo IR experimenty51. Plynová chromatografie (GC) Plynová chromatografie představuje spojení výhod v podobě výborné separační schopnosti na straně jedné a nevýhod v podobě složité úpravy vzorku na straně druhé. Aby mohl být vzorek analyzován metodou GC, musí být těkavý, tedy snadno převeditelný do plynné fáze. Látky s vysokým bodem varu, je proto nutné derivatizovat převedením některým ze standardních postupů na silylderiváty61,.62,63. Mezi nevýhody této techniky patří omezení separace pouze na aglykony zkoumaných látek. Pro určení ztrát při úpravách vzorku se používají interní standardy, deuterovaná analoga stanovovaných analytů60,63. Detekce se provádí nejčastěji pomocí hmotnostního spektrometru (MS) v režimu SIM (selected ion monitoring), který představuje dostatečně selektivní a citlivou variantu60,62,63,64. 2.4.3

Elektroforetické metody

Podstatou elektromigračních metod je pohyb nabitých částic (iontů) vlivem vloženého stejnosměrného elektrického pole. K dělení dochází v kapalné fázi, převážně ve

vodném prostředí. Existuje značné množství různých modifikací: elektroforéza volná (s pohyblivým rozhraním), zónová (elektroforéza na nosičích), rovnovážná (isoelektrická fokusace a isotachoforéza) a kapilární64. Kapilární elektroforéza (CE) Kapilární elektroforéza se oproti HPLC vyznačuje kratšími časy analýz, vyšší účinností a menší spotřebou vzorku. Tato metoda je aplikovatelná pro širové spektrum analytů, které jsou přítomny ve vodném pufru jako nabité částice. Jedná se o elektroforetickou metodu, která se provádí v kapiláře o vnitřním průměru nejčastěji 25 – 75 μm a délkou 100 – 1000 mm. Oba konce kapiláry jsou ponořeny do elektrodových nádobek naplněných, stejně jako kapilára, nosným elektrolytem, v nichž jsou vloženy platinové elektrody. Poblíž katodového konce kapiláry je umístěn detektor (obvykle UV), vzorek se aplikuje na anodovém konci. Vedle elektroforetického principu dělení, se při separaci látek uplatňuje také elektroosmotický tok (EOF). Je to spontání tok kapaliny v kapiláře v důsledku náboje na její vnitřní straně. CE se vyznačuje vysokou účinností, která dosahuje řádově až 105 teoretických pater65.

Micelární elektroforetická kapilární chromatografie (MEKC)

Tato metoda je modifikací kapilární elektroforézy. MEKC využívá pro separaci neutrálních molekul přídavku dodecylsíranu sodného (SDS) jako iontově párového činidla. Analyt je obklopen molekulami SDS a kapilárou se pohybuje jako micela. Separace pak probíhá na základě velikosti, tvaru a náboje micely58.

2.4.4

Imunochemické metody

Imunochemické metody jsou založeny na specifické reakci mezi protilátkou a antigenem, proti kterému byla protilátka vytvořena. Protilátky mají velmi vysokou specifitu, umožňující vychytávání konkrétních sloučenin ze vzorku. Imunoanalýzy jsou obvykle klasifikovány podle použité značky (radioisotopové, enzymové, fluorescenční...), separace

(homogenní, heterogenní...) nebo způsobu provedení (kompetitivní, nekompetitivní, sendvičová...). Enzymová imunoanalýza (EIA) Enzymová imunoanalýza (EIA) souhrnně označuje skupinu analytických metod, které ve fázi kvantifikace nebo detekce používají enzymovou reakci, přičemž enzym je kovalentně vázán na některou reakční složku (antigen, protilátku, druhou protilátku)66.

Nejvíce používanou, modifikovanou metodou EIA je nepřímá kompetitivní enzymová imunoanalýza na pevné fázi (ELISA = Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay)61,67,68,69,70. Principem je kompetice antigenu zakotveného na pevnou fázi s volným antigenem ze vzorku o omezený počet vazebných míst na molekulách protilátky (Schéma 5). Nenavázané složky se odstraní promytím pevné fáze a kvantifikace se provede pomocí druhé, enzymem značené protilátky (ta je vytvořena proti primární protilátce). Konečná detekce je založena na spektrofotometrickém stanovení barevného produktu, který vzniká při enzymové reakci (Schéma 6).

Schéma 5: Princip nepřímé kompetitivní ELISA71

Publikované metody jsou založeny na použití polyklonálních králičích protilátek proti konjugátům haptenů (isoflavonoidů) s hovězím sérovým albuminem (BSA = bovine serum albumin)61,68,70,71 nebo hemocyaninem (KLH = keyhole limpet hemocyanin)69. Při vlastním provedení je ideální použití mikrotitračních polystyrenových destiček s 96 jamkami. Ty dovolují jednoduše zpracovat velké množství vzorků a poskytují vhodný povrch pro imobilizaci. Pro imobilizaci se používají bílkovinné konjugáty thyreoglobulinu (Thyr)61,68,70,71 a ovalbuminu (OVA)69.

Radioimunoanalýza (RIA) RIA je název pro imunochemické metody, při nichž je jeden z imunoreaktantů označen radionuklidem. Ke značení se nejčastěji používají radionuklidy

125

I a 3H. Princip

stanovení je analogický jako u kompetitivní enzymové imunoeseje: značený analyt soutěží se stanovovaným o omezené množství protilátky72. Fluorescenční imunoanalýza (FIA) Metodám FIA je společná fluorescenční značka. Fluorofory mají schopnost pohlcovat světelnou energii o určité vlnové délce a následně tuto energii emitovat v podobě světla o vlnové délce o 30-80 nm vyšší. Citlivost těchto metod výrazně omezuje interference balastních látek z biologických vzorků. Elegantním řešením tohoto problému je metoda TR-FIA (time - resolved fluoroimmunoassay), která místo tradičního fluoroforu používá ke značení chelát europia. Tato technika vykazuje srovnatelnou či ještě lepší cilivost v porovnání s metodami ELISA či FIA73.

Imunoafinitní chromatografie Imunoafinitní chromatografie je vysoce selektivní metoda, která patří do skupiny metod extrakcí na pevnou fázi (SPE = solide phase extraction). Jako stacionární fáze se používá vhodný nosič (např. afigel) s ukotvenou protilátkou. Výhodou takovýchto sorbentů je, že mohou být specifické jak pro jeden analyt, tak pro jeho strukturně podobná analoga (Obr. 4). Tato přednost imunosorbentů je způsobena vazbou antigen – protilátka, plynoucí z prostorové komplementarity a intramolekulárních interakcí. Zavedením imunoafinitní chromatografie do procesu kvantifikace a detekce polyfenolů lze dosáhnout přesnějších výsledků, díky zakoncentrování analytu na imunoafinitním sorbentu74,75,76.

3. EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST 3.1

CHEMIKÁLIE

a) Pliva-Lachema (Brno, ČR) dihydrogenfosforečnan draselný, p. a. hydrogenfosforečnan sodný, p. a. chlorid draselný, p. a. uhličitan sodný, p.a. b) Penta (Chrudim. ČR) chlorid sodný, p. a. kyselina sírová, p. a. hydrogenuhličitan sodný, p. a. c) SEVAC (Praha, ČR) SwAR/Px (konjugát prasečí protilátky proti protilátce králičí s křenovou peroxidasou)

d) Sigma (St. Louis, Missouri, USA) o-fenylendiamin (OPD) (kat. č. P-1526) citrát-fosfátový pufr (tablety) hovězí sérový albumin (BSA) daidzein (4´,7-hydroxyisoflavon), genistein (4´,5,7-trihydroxyisoflavon), genistin (4´,5,7-trihydroxyisoflavon

7-D-glukosid),

prunetin

formononetin (7-hydroxy-4´-methoxyisoflavon) peroxid vodíku

e) Fluka Chemie AG (Švýcarsko) želatina (gelatine D. A. B. powder for microbiology) biochanin A (5,7-dihydroxy-4´-methoxyisoflavon)

(4´,5-dihydroxy-7-methoxyisoflavon),

f) Indofine (Somerville, New Jersey, USA) sissotrin (biochanin A-7-glukosid), kaempferol (3,4´,5,7-tetrahydroxyflavon), 7-hydroxy-6-methoxykumarin, 4-hydroxykumarin

g) ROTH, Karlsruhe, Německo Tween-20

h) MERCK, Německo Folinovo-Ciocalteuovo činidlo aceton ethanol methanol kyselina octová propylester kyseliny gallové

i) daidzin (daidzein 7-O-glukosid) laskavě daroval Dr. Takaaki Yasuda (Tohoku College of Pharmacy, Miyagi, Japonsko)

j) luteolin (3´,4´,5,7-tetrahydroxyflavon) laskavě daroval prof. Adlercreutze (Department of Chemistry, University of Helsinki, Finsko)

k) kvercetin (3,3´,4´,5,7-pentahydroxyflavon) a kvercetin-3-glukosid laskavě věnoval Ing. Prokop (Interfarma, Praha) l) isoformononetin připravil selektivní methylací daidzeinu Dr. Ivan Černý (Ústav organické chemie a biochemie, AV ČR, Praha)57

m) imunoafinitní sorbenty byly připraveny Ing. Elenou A. Prokudinou (ÚCHPL, FPBT, VŠCHT v Praze)81

n) konjugáty BSA s daidzeinem (daidzein-4´-BSA a daidzein-7-BSA) a genisteinem (genistein-4´-BSA a genistein-7-BSA) a všechna použitá králičí antiséra připravil Doc. RNDr. Oldřich Lapčík, Dr. (ÚCHPL, FPBT, VŠCHT v Praze)77,78

3.2

PŘÍSTROJE A VYBAVENÍ

Chromatografické systémy: Systém HPLC-UV: řídící jednotka SCL 10-10 AVP, automatický injektor SIL-10 ADVP, pumpa LC10-ADVT, gradientová jednotka FCV 10 ALVT, UV-VIS detektor s diodovým polem SPD-M10 AVT, sběrač frakcí FRC-10A (Shimadzu, Japonsko) kolona LiChroCART® 250-10 HPLC-Cartidge, Purospher® STAR RP-18 endcapped (5µm) (Merck, Německo)

Systém HPLC-MS: odplyňovací vakuová jednotka G1 322A, pumpa G1310A, automatický injektor G1329A, termostat G1316A, detektor s proměnnou vlnovou délkou G1314A, hmotnostní spektrometr G1956B (Agilent Technologies, USA) kolona LiChroCART® 125-4 HPLC-Cartridge, Purospher® RP-18 endcapped (5µm) (Merck, Německo)

Imunoafinitní chromatografie: uzavírací ventil: 2-Way Stopcock, No. 100015393 (Bio-Rad Laboratories, Herkules, CA, USA). SUPELCO (Bellefonte, PA, USA): kolonky : Filtration Tubes without frits 1 ml, 57240-U. Filtration Tubes without frits 6 ml, 57242. filtr: Polyethylene Frits for 1 ml SPE Tubes, 57244. redukce: Adapters for Sample Reservoirs, 57020-U.

Enzymová imunoanalýza na pevné fázi (ELISA): předvážky, typ EK-200G (A&D Company Japonsko) analytické váhy, typ ER-182A (A&D Company Japonsko) spektrofotometr pro mikrotitrační destičky Labsystem Multiscan MCC/340 (Finsko) inkubátor Dynatech AM 89A (Velká Británie) promývačka Labsystem Multiwash (USA) promývačka Labwash, P-LAB (Velká Británie) automatické pipety (Dynatech a Biohit, Velká Británie a Nichipet Japonsko) shaker R5 (ČR) shaker P-LAB (EU) polystyrenové mikrotitrační destičky: Costar 9018/high binding (Corning Incorporated USA) magnetická míchačka IKA (Laboratortechnik Německo)

Úprava rostlinného materiálu: lyofilizátor Cat. 7740030 (LABCONCO, Kansas City, MO, USA). ultrazvuková lázeň Polsonic, Cat. 072295 (Varšava, Polsko) filtr: papírový filtr No. 5891 (Schleicher & Schuell A.G., Zürich, Švýcarsko) filtr: Iso-Disc Filters PTFE-13-4, 13 mm x 0,45 µm, 54132-U (SUPELCO, Bellefonte, PA, USA). mlýnek Fex IKA A11 (Německo). Ostatní přístroje: rotační vakuová odparka, CentrVap Concentrator, Cat. 7810001 (LABCONCO, Kansas City, MO, USA). centrifuga Beckman GS-6R (USA). spektrofotometr Helios λ, Spectronic Unicam (Německo)

3.3

ROZTOKY

Kolorimetrické stanovení celkového obsahu polyfenolů79 Série standardních roztoků propylesteru kyseliny gallové 0,05; 0.1; 0.,15; 0,2; 0,25; 0,3 mg propylesteru kyseliny gallové 1 ml deionisované H2O 2% Na2CO3 2 g Na2CO3 100 ml deionisované H2O Enzymová imunoanalýza na pevné fázi (ELISA) a imunoafinitní chromatografie80,81 0,1M PBS (phosphate buffered saline) 80 g NaCl 29 g Na2HPO4.12H2O 2 g KH2PO4 2 g KCl doplnit do 1000 ml deionizovanou vodou 0,01M PBS, pH = 7,4 100 ml 0,1M PBS 900 ml deionizované vody promývací roztok PBS-0,05%Tween 1000 ml 0,01M PBS, pH = 7,4 0,5 ml Tween-20 0,05M karbonát-bikarbonátový pufr (vazebný), pH = 9,6 1,59 g Na2CO3 2,93 g NaHCO3 1000 ml deionizované vody 0,05M citrát-fosfátový pufr, pH = 5,0 1 tableta citrát-fosfátového pufru (Sigma P-4809)

100 ml deionizované vody substrátový roztok pro peroxidasu 5 mg o-fenylendiaminu (Sigma P-1526) 10 ml 0,05M citrát-fosfátového pufru, pH = 5,0 10 µl 30% H2O2 zastavovací roztok pro peroxidasu 2M H2SO4

3.4

METODY

3.4.1

Příprava rostlinných vzorků

Rostlinný materiál byl poskytnut a určen Doc. Ing. Václavem Zeleným CSc. (Fakulta agrobiologie, potravinových a přírodních zdrojů, Česká zemědělská universita, Praha). Vzorky rostlin byly ihned po odběru zamraženy (-20°C) a poté lyofilizovány. Lyofilizovaný materiál byl homogenizován na ručním mlýnku. Poté jsem ho extrahovala (macerovala) 70% methanolem (100 mg sušiny do 2 ml methanolu) po dobu 5 dnů při laboratorní teplotě za občasného míchání. Extrakt jsem odstředila a odebraný supernatant dále uchovávala při teplotě 4°C. Takto upravené vzorky byly dále analyzovány metodami HPLCUV, HPLC-MS, ELISA a imunoafinitní chromatografií (IAC). Vzorky rostlin pro kolorimetrické stanovení jsem extrahovala ethanolem (g sušiny jsem extrahovala 4 ml ethanolu po dobu 20 min v ultrazvukové lázni, tuto extrakci jsem provedla celkem pětkrát, do té doby než extrakční solvent nezůstal čirý). Takto upravené vzorky jsem odpařila na rotační vakuové odparce a upravila jejich koncentraci na 2 mg hrubého extraktu/ml ethanolu. Pro orientační stanovení přítomnosti hledaných látek jsem použila dvě vzájemě se doplňující imunoafinitní metody (ELISA a IAC/HLPC MS). Pro toto stanovení jsem použila hrubé extrakty ředěné v poměru 1:9 v 0,01M PBS pufru. Poté jsem hrubé extrakty podrobila HPLC separaci na semipreparativní koloně (kap. 3.4.3). K nástřiku jsem použila přefiltrovaný hrubý extrakt. Získaných 50 frakcí jsem odpařila na vakuové rotační odparce, odparek naředila v 1 ml 0,01M PBS pufru a opět analyzovala pomocí ELISA metod (kap. 3.4.5). Takto zpracované frakce jsem pro další analýzy uchovávala v mrazícím boxu.

3.4.2

Kolorimetrické stanovení celkového obsahu polyfenolů

Principem kolorimetrického stanovení je reakce Folinova-Ciocalteuova činidla s polyfenoly za vzniku barevných komplexů. Zmíněné činidlo je tvořeno žlutým kyselým roztokem, který obsahuje komplex iontů fosfomolybdenové a fosfowolframové kyseliny. Činidlo oxiduje fenoláty a heteropolykyselina je částečně redukována z oxidačního stupně +6 na směs +6 a +5 za vzniku modrých molybden-wolframových komplexů80. Obecný postup82 Pro sestavení kalibrační křivky jsem použila sérii standardních roztoků (0,05 - 0,3 mg/ml) propylesteru kyseliny gallové. 1 ml rostlinného ethanolového extraktu vzorku (standardu) jsem rozpustila v 45 ml deionisované H2O a přidala jsem 1 ml FolinovaCiocalteuova činidla a řádně promíchala. Po 3 minutách jsem k roztoku přidala 3 ml 2% Na2CO3 a nechala inkubovat při pokojové teplotě na automatické třepačce po dobu 2 hodin. Poté jsem proměřila absorbanci získaných roztoků při vlnové délce 760 nm. Pro slepý pokus jsem použila 1 ml deionisované H2O namísto 1 ml ethanolového extraktu. Výsledky jsem vyjádřila v mg ekvivalentů propylesteru kyseliny gallové (EPKG) na g rostlinného extraktu (Tab. VI). 3.4.3

Chromatografické metody

HPLC semipreparativní systém: Přefiltrované extrakty byly frakcionovány na koloně Merck C18 v systému reverzní fáze (LichroCART 250-10, Purospher STAR RP-18e; 5 µm). Absorbance byla měřena v UV oblasti v rozmezí od 190 nm do 370 nm s krokem 1 nm. Byl použit nástřik na kolonu 500 µl. Použitá mobilní fáze se skládala z methanolu (A) a 0,5 % kyseliny octové ve vodě (B), obě rozpouštědla byla odplyněna heliem. Podmínky lineární gradientové eluce byly: a) 0 min, 50:50 (A:B); 5min, 60:40; 20 min, 70:30; 25 min, 80:20; 45 min, 100:0; následovala regenerace kolony 5 min,ukončení eluce v 55. min 50:50, b) teplota 25°C, c) průtok mobilní fáze 2,5 ml/min, e) sběr 50 frakcí po 2 ml. Získané frakce jsem odpařila do sucha a upravila pro analýzu metodou ELISA (kap. 3.4.1).

HPLC-MS: Přefiltrované extrakty a

vzorky získané

imunoafinitní chromatografií

byly

analyzovány na koloně Merck C18 v systému reverzní fáze (LiChroCART 125-4, Purospher STAR RP-18 e; 5µm). Použitá metoda gradientové eluce s mobilní fází A (methanol, 0,5 % kyseliny octové) a B (destilovaná voda, 0,5 % kyseliny octové) probíhala následujícím způsobem: 0 min, 40:60 (A:B); 5 min, 52:48; 20 min, 70:30; 25 min 100:0; 45 min, 100:0; pak zpět k 40:60. V 55. minutě eluce skončila a následovala regenerace kolony 5 min. Absorbance byla měřena v UV při vlnové délce 254 nm. Byl použit nástřik na kolonu 10 µl. Chromatografický eluent byl po ESI ionizaci (ESI = electrospray ionization) přiveden přímo do kvadrupólu hmotnostního spektrometru. Tlak zmlžovacího plynu byl 60 psi, průtok sušícího plynu byl 12 l/min při teplotě 300°C a kapilární napětí bylo 3500 V. Kumariny, flavonoidy (Tab. IV) a isoflavony (Tab. III) byly identifikovány porovnáním jejich retenčních časů (tR), a molekulových hmotností iontů [M+H]+ se standardy. Kvůli zvýšení citlivosti metody byl v daném časovém intervalu módu SIM1 a SIM2 měřen omezený počet vybraných molekulových hmotností iontů (Tab. III, Tab. IV).

Tab. III: Přehled metod pro stanovení isoflavonů HPLC MS v pozitivním módu SIM +

Standard

tR [min]

[M+H] (m/z)

daidzein genistein isoformononetin formononetin prunetin biochanin A

9,12 11,83 14,47 15,83 19,64 20,44

255 271 269 269 285 285

daidzin genistin sissotrin

3,18 4,70 10,88

417 433 447

Časový interval SIM módu [min]

SIM 1 mód

Metoda

2 - 13 13 - 18 18 - 25

SIM 2 mód Metoda

0-4 4 - 25

Tab. IV: Přehled metod pro stanovení standardů flavonů a kumarinů HPLC MS v pozitvním SIM módu

Standard

tR [min]

[M+H]+ (m/z)

Časový interval SIM módu [min]

4,31

193

0-5

6,15 8,01 10,36 11,55 13,83

465 163 287 287 303

5-7 7-9

4,31

193

6,15 8,01 10,36 11,55 13,83

465 163 287 287 303

SIM 1 mód

Metoda 1 - Metoda 5

7-hydroxy-6-methoxykumarin kvercetin-3-glukosid 4-hydroxykumarin kaempferol luteolin kvercetin

9 - 20

SIM 2 mód Metoda 1 Metoda 2 Metoda 3 Metoda 4 Metoda 5

3.4.4

7-hydroxy-6-methoxykumarin kvercetin-3-glukosid 4-hydroxykumarin kaempferol luteolin kvercetin

0 - 20

Imunoafinitní chromatografie na pevné fázi

Pro aplikaci na imunoafinitní sorbenty (IS), byly extrakty ředěny 1:9 v 0,01M PBS pufru. Vzorky byly před aplikací na IS ochlazeny na 4°C. Obecný postup82 Kvůli většímu objemu aplikovaných vzorků (6 ml) se PBS pufr používaný k ředění extraktů dal do ultrazvukové lázně k odvzdušnění (15 min). Na kolonku plněnou směsí anti-7-biochanin-IS, anti-7-daidzein-IS, anti-7-genistein-IS a anti-4’-genistein-IS (po 100 µl usazeniny IS) jsem aplikovala rostlinný vzorek. Postup imunoextrakce (PBS, vzorek, destilovaná voda a methanol na předeluci 4°C): 1) aktivace IS 14 ml 0,01M PBS; 2) nanesení vzorku; 3) odstranění neadsorbovaných složek (2 ml PBS);

4) propláchnutí složek zachycených nespecifickými interakcemi 25% methanolem (1 ml); 5) eluce 90% methanolem (4 ml, -20°C); 6) reaktivace 14 ml PBS. Eluát z bodu 5 jsem odpařila v rotační vakuové odparce. Odparek jsem rozpustlia v 0,5 ml 40% methanolu. 10 µl takto upraveného vzorku bylo analyzováno HPLC-MS. 3.4.5

Nepřímá kompetitivní ELISA

Použila jsem pět nepřímých kompetitivních ELISA metod, které jsou založeny na použití polyklonálních protilátek proti konjungátům isoflavonoidu (daidzeinu, genisteinu, biochaninu A a jejich derivátů) s BSA77. Metody daidzein-4´ (detekční limit: 1,40 – 28,04 pg/jamku) a genistein-4´ (detekční limit: 1,19 – 23,80 pg/jamku) umožňují, díky jevu křížové reaktivity (Tab. V), rozpoznání 4´-methoxyderivátů, formononetinu a biochaninu A. Metodami založenými na identifikaci analytů s hapteny v pozici 7 (detekční limit metody daidzein-7: 2,91 – 58,22 pg/jamku; detekční limit metody genistein-7: 1,40 – 27,91 pg/jamku; detekční limit metody biochanin-7: 2,80 – 55,99 pg/jamku) je možno identifikovat 7-O-glukosidy daidzeinu, genisteinu a biochaninu

A,

jmenovitě daidzin,

genistin,

sissotrin a aglykony 4´-hydroxy 7-

-methoxyisoflavon (isoformononetin) a 4´,5-dihydroxy 7-methoxyisoflavon (prunetin). Obecný postup81 (1) Zásobní roztok antigenu (konjugát isoflavonu s bílkovinou) jsem naředila v karbonát – bikarbonátovém pufru a pipetovala do mikrotitračních destiček v množství 100 μl/jamka. Imobilizace na stěny jamek probíhala sorpcí přes noc při laboratorní teplotě. (2) Nenavázané imunoreagencie jsem odstranila čtyřikrát opakovaným promytím 400 μl roztoku PBS-0,05%Tween (promývačka). (3) Do jamek jsem pipetovala blokační (sytící) roztoky v množství 100 μl/jamka. Používané blokační roztok: PBS-0,05%Tween-1%želatina. Inkubace probíhala 0,5 hodiny při laboratorní teplotě. (4) Promytí stejné jako v bodě (2).

(5) Do jamek jsem pipetovala 50 μl vzorku testovaného na obsah antigenu (ředěno v roztoku 0,01 M PBS). (6) Do jamek jsem pipetovala 50 μl protilátky (ředěno v roztoku PBS-0,05%Tween nebo PBS-0,05%Tween-0,1%BSA). Následná inkubace probíhala 1,5 hodiny při laboratorní teplotě za mírného třepání. (7) Promytí stejné jako v bodě (2). (8) Do jamek jsem pipetovala sekundární prasečí protilátku proti protilátce králičí konjugovanou s peroxidasou (SwAR-Px). Konjugát jsem ředila v roztoku PBS-0,05%Tween na koncentraci 1:4000. Do jamek jsem roztok konjugátu dávkovala v množství 100 μl/jamka. Inkubace probíhala 1 hodinu při laboratorní teplotě za mírného třepání. (9) Promytí stejné jako v bodě (2). (10) Do jamek jsem v množství 100 μl/jamka pipetovala substrát pro peroxidasu (Schéma 6.), připravený těsně před reakcí. Inkubace probíhala 15 minut při laboratorní teplotě za mírného třepání. Schéma 6: Enzymová reakce NH2 + 3 H2O2

2

peroxidasa

NH2 OPD

N

NH2 +

N

6 H2O

NH2

fenazin

(11) Reakci jsem zastavila 2M kyselinou sírovou, kterou jsem dávkovala v množství 50 μl/jamka. Jednu jamku jsem vysála, promyla a napipetovala do ní 150 μl redestilované vody. Absorbanci v jamkách mikrotitrační destičky jsem měřila při 492 nm proti jamce s redestilovanou vodou.

Křížová reaktivita Protilátky použité v metodách ELISA jsou specifické pro úzkou skupinu strukturně příbuzných látek, jmenovitě pro karboxyderiváty daidzeinu, genisteinu a biochaninu A v polohách 7 a 4‘ (Obr. 4). V tabulce V je uvedena křížová reaktivita jednotlivých ELISA metod s množstvím potenciálních křižových reaktantů.

O

O

O

O

O

O

OH OH

1 HO

HO

O

R O

4

O

OH

O

OH

2

O

O

R

R

R

3

O

CH3

O

O

R O

5

Obr. 4: Struktury analytů detegovatelných ELISA metodami a zachytitelných IAC metodami. R = libovolný substituent. Karboxyderiváty daidzeinu-7 (1), genisteinu-7 (2), biochaninu-7 (3), daidzeinu-4‘ (4) a genisteinu-4‘ (5) Tab. V: Křížová reaktivita (%) jednotlivých metod ELISA83 Metoda

Biochanin A-7

Daidzein-4´

Daidzein-7

Genistein-4´

Genistein-7

Křížová reaktivita (%) Biochanin A Daidzein Genistein Sissotrin Daidzin Formononetin Isoformononetin 3´-OH-daidzein Genistin Prunetin 5- Methoxygenistein 7,4´Dimethoxygenistein Glycitin Glycitein 6,7,4´Trihydroxyisoflavon 7,3´,4´Trihydroxyisoflavon Apigenin Naringenin Naringin Kaempferol Steroidy Chalkony Flavony

100 < 0.01 2.80 116 < 0.01 1.60 < 0.01 < 0.01 < 0.01 5.00 < 0.01

0.50 100 0.50 0.02 0.03 192 0.20 3.50 0.03 < 0.01 < 0.01

< 0.01 100 3.50 5.0 41.0 6.0 342 3.40 46.0 30.0 5.20

178 14.70 100 0.10 < 0.01 6.50 < 0.01 0.10 < 0.01 2.40 0.15

0.40 9.30 100 4.80 1.20 < 0.01 37.0 2.70 32.0 215 0.40

46.50

< 0.01

< 0.01

< 0.01

0.20

0.02 < 0.01

< 0.01 0.11

2.54 1.82

< 0.01 0.32

0.01 0.10

< 0.01

< 0.01

< 0.01

< 0.01

< 0.01

0.02

2.53

1.68

0.36

0.62

0.09 0.03 < 0.01 0.59 < 0.01 < 0.01 < 0.01

0.01 0.16 < 0.01 < 0.01 < 0.01 < 0.01 < 0.01

0.23 0.42 0.40 1.89 < 0.01 < 0.01 < 0.01

0.05 0.13 0.13 0.18 < 0.01 < 0.01 < 0.01

0.08 < 0.01 0.34 0.48 < 0.01 < 0.01 < 0.01

4. VÝSLEDKY A DISKUZE 4.1

STANOVENÍ CELKOVÉHO OBSAHU POLYFENOLŮ Celkový obsah polyfenolů v rostlinných extraktech (kap. 3.4.1) byl stanoven

Folinovou-Ciocalteuovou kolorimetrickou metodou, v modifikaci popsané Singletonem a Rossim79. Jako standard byl použit propylester kyseliny gallové. Byla sestavena kalibrační křivka propylesteru kyseliny gallové v rozmezí 0,05-0,3 mg/ml (Obr. 5). Obsah celkových polyfenolů ve zkoumaných druzích rostlin se pohyboval od 8 po 125 mg EPKG /g rostlinného extraktu. V semenech kmínu kořenného (Carum carvi), byly zaznamenány nejvyšší hodnoty obsahu polyfenolů (125 mg EPKG/g extraktu). Rostlinou s nejnižším naměřeným obsahem polyfenolů (8 mg EPKG /g extraktu) byl kopr vonný (Anethum graveolens). Folinova-Ciocalteuova metoda poskytuje pouze hrubý odhad celkového množství polyfenolů obsažených v rostlinných extraktech. S činidlem může reagovat mnoho interferujících látek a tak ovlivnit výsledek analýzy. Z tohoto důvod dochází často ke zvýšení reálných hodnot koncentrací polyfenolů80.

0,3

y = 0,8229x - 0,0044 R2 = 0,9979

0,25

absorbance

0,2

0,15

0,1

0,05

0 0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

0,35

koncentrace ekvivalentů propylesteru kyseliny gallové (mg/ml)

Obr. 5: Graf kalibrační křivky standardů propylesteru kyseliny gallové. Měřená absorbance při vlnové délce λ = 760 nm.

Tab. VI: Celkový obsah polyfenolů ve zkoumaných druzích čeledi Apiaceae Rostlina Anethum graveolens Carum carvi semeno Ferula asa-foetida Foeniculum vulgare Foeniculum vulgare semeno Oenanthe aquatica Peucedanum cervaria Pimpinella anisum semeno Pimpinella major Sium sisarum

Obsah ekvivalentů propylesteru kys. gallové mg/g extraktu 8 125 82 19 80 22 31 86 95 55

4.2

STANOVENÍ FLAVONOIDŮ A KUMARINŮ K identifikaci flavonoidů a kumarinů v extraktech vybraných druhů Apiaceae byla

použita metoda HPLC-MS (kap. 3.4.3) v pozitivním módu SIM, který umožňuje detekci hledaných látek s vysokou citlivostí84,85. Jako standardy (Tab. IV) byly vybrány flavonoidy luteolin, kaempferol, kvercetin, kvercetin-3-glukosid; standardy kumarinů byly 7-hydroxy-6methoxykumarin a 4-hydroxykumarin. Výsledky této analýzy jsou shrnuty v Tab. VIII.

4.2.1

Bedrník anýz (Pimpinella anisum)

V semenech bedrníku anýzu jsem identifikovala luteolin, jako majoritní složku a kvercetin-3-glukosid v minoritním zastoupení. Z kumarinů jsem určila jak 4-hydroxykumarin, tak 7-hydroxy-6-methoxykumarin (skopoletin). Tyto poznatky potvrzují publikovaná data, která uvádějí přítomnost trans-anethol86, jako hlavní složku semen, a dále pak kumariny, skopoletin,

umbelliferon87,

kvercetin-3-glukuronid,

luteolin-7-glukosid

a

apigenin-7-

glukosid88. 4.2.2

Bedrník větší (Pimpinella major)

V extraktech bedrníku většího jsem stanovila všechny studované flavonoidy. Nejvíce zastoupen

byl

kvercetin-3-glukosid.

7-hydroxy-6-methoxykumarin

byl

zastoupen

v minoritním množství. Publikovaná literatura uvádí přítomnost kvercetin-3-rutinosidu a absenci kumarinů29. V této studii se tedy pravděpodobně jedná o první stanovení zkoumaných flavonoidů a skopoletinu (7-hydroxy-6-methoxykumarin) u tohoto druhu. 4.2.3

Čertovo lejno (Ferula asa-foetida)

V extraktech listů a květů čertova lejna jsem identifikovala luteolin, kaempferol, kvercetin a kvercetin-3-glukosid. V předchozích studiích byla publikována přítomnost kvercetinu v příbuzném druhu F. sadlerana29 umbelliferonu, farnesiferolu, ferulové

kyseliny89, derivátů kumarinu foetidinu a kamolonolu90. V této studii se tedy pravděpodobně jedná o první identifikaci flavonoidů luteolinu, kaempferolu a kvercetinu-3-glukosidu ve F. asa-foetida. 4.2.4

Fenykl obecný (Foeniculum vulgare)

V rostlině fenyklu jsem identifikovala kvercetin-3-glukosid jako majoritní flavonol, a jeho aglykon jako minoritní složku. Stejně tomu bylo i u semen fenyklu, kde jsem navíc identifikovala luteolin a kaempferol. V obou částech rostliny jsem zaznamenala 7-hydroxy-6methoxykumarin. Naměřená data byla ve shodě s publikovanými. Dřívější studie fenyklu obecného doložily přítomnost rutinu, isokvercetinu, glykosylovaných derivátů kvercetinu a kaempferolu89,91,92. 4.2.5

Halucha vodní (Oenanthe aquatica)

V extraktu haluchy jsem identifikovala téměř všechny analyzované standardy. Potvrdila jsem přítomnost kaempferolu a kvercetinu29. V této studii jsem prokázala přítomnost flavonu luteolinu a 7-hydroxy-6-methoxykumarinu, které nebyly doposud u tohoto druhu publikovány. V dřívějších studiích byly identifikovány lignany93. 4.2.6

Kmín kořenný (Carum carvi)

V semenech kmínu jsem stanovila kvercetin-3-glukosid jako jediný ze zkoumaných flavonoidů a z kumarinů jsem identifikovala 7-hydroxy-6-methoxykumarin. Přítomnost kaempferolu nebyla v této studii potvrzena. Určení glykosylovaného derivátu kvercetinu94 se shodovalo s literárními daty, která uváděla také přítomnost kaempferolu, isokvercetinu a glykosylovaného isorhamnetinu50,89. 4.2.7

Kopr vonný (Anethum graveolens)

V hrubých extraktech kopru jsem identifikovala kaempferol, kvercetin ve formě aglykonů. Kvercetin-3-glukosid byl zastoupen jako hlavní složka. Z kumarinů jsem zaznamenala 7-hydroxy-6-methoxykumarin. Naměřená data odpovídala spektrálním údajům

standardů.

Výsledky studie jsou ve shodě s publikovanými daty95, které zazanamenaly

přítomnost isorhamnetinu, kaempferolu a kvercetinu (ve formě glukuronových konjungátů), kvercetin-rhamnoglukosidu, kvercetin a isorhamnetin 3-glukuronidu v listech kopru, kaempferol-3-glukuronidu v semenech96.

4.2.8

Sevlák zeleninový (Sium sisarum)

U sevláku zeleninového jsem zaznamenala přítomnost všech zkoumaných flavonolů, z nichž

nejvíce

byl

zastoupen

kvercetin.

Dále

jsem

identifikovala

7-hydroxy-6-

methoxykumarin. Ve dřívějších studiích byla publikována přítomnost kvercetin-3rutinosidu29. 4.2.9

Smldník jelení (Peucedanum cervaria)

V extraktu smldníku jsem zjistila přítomnost luteolinu, kvercetinu a kvercetin-3glukosidu. Z kumarinů jsem identifikovala 7-hydroxy-6-methoxykumarin. Z flavonoidů jsem potvrdila výskyt kvercetinu ale nepotvrdila přítomnost kaempferolu v P. cervaria29,97,98. V rodu

Peucedanum

umbelliferonu29.

byla dříve publikována přítomnost

kumarinů

aeskuletinu

a

Tab. VII: Přehled flavonoidů a kumarinů poprvé identifikovaných ve studovaných druzích čeledi Apiaceae. Rostlina Ferula asa-foetida

Oenanthe aquatica

Pimpinella major

Sium sisarum

Flanonoid

Kumarin

luteolin, kaempferol kvercetin-3-glukosid luteolin luteolin, kaempferol, kvercetin, kvercetin-3-glukosid luteolin, kaempferol, kvercetin, kvercetin-3-glukosid

7-hydroxy-6-methoxykumarin

7-hydroxy-6-methoxykumarin

7-hydroxy-6-methoxykumarin

Apiaceae je čeleď známá akumulací furanokumarinů a flavonoidů. Podčeleď Apioideae produkuje flavonové glykosidy, které se nevyskytují u podčeledí Hydrocotyloideae a Saniculoideae. Luteolin, kaempferol a kvercetin, identifikované v několika podčeledích Apiaceae, byly navrženy jako taxonomické markery34. V této studii jsem potvrdila přítomnost flavonu luteolinu u šesti z devíti zkoumaných druhů Apiaceae. V nejvyšší koncentraci byl zastoupen v semenech anýzu (Pimpinella anisum). Luteolin se v Apiaceae nachází ve formě 7-glukosidu88. Glykosylovaný derivát kvercetinu (3-glukosid) byl identifikován u všech vybraných druhů. Nejhojněji byl zastoupen v čertovu lejnu (Ferula asa-foetida) a v smldníku jelením (Peucedanum cervaria). Aglykon kvercetinu byl zaznamenán jako majoritní složka v sevláku zeleninovém (Sium sisarum) a čertovu lejnu. Kaempferol se nejvíce vyskytoval v haluše vodní (Oenanthe aquatica). Kmeny Apieae a Peucedaneae jsou známy produkcí kumarinů umbelliferonu, aeskuletinu a furanokumarinů a zmíněných tří flavonoidů (luteolin, kaempferol, kvercetin)34. V této studii jsem téměř u všech zkoumaných druhů identifikovala 7-hydroxy-6-methoxykumarin. 4-hydroxykumarin jsem zaznamenala pouze u jediného druhu bedrníku anýzu (Pimpinella anisum) v semenech. V Tab. VII je uveden přehled flavonů a kumarinů, které v rámci této studie byly vůbec poprvé identifikovány u studovaných druhů čeledi Apiaceae.

MSD1 TIC, MS ES-API, SIM1

1

x 103

200

A

175 150 125

3

100 75 50

4

2

5

6

25 0 2

4

6

8

10

12

14

16

18

min

MSD1 TIC, MS ES-API, SIM1

B

2

x 103

900 800 700 600 500 400 300

5

200

1

100

4

6

0 2

4

6

8

10

MSD2 TIC, MS ES-API, SIM2

12

14

16

18

5

x103

160

min

C

140 120 100 80 60

4

40

1

20

2 6

0 0

2

4 2

6

8

10

12 2

14 2

16

18

min

Obr. 6: HPLC-MS chromatogramy extraků Pimpinella major v módu SIM1(B) a SIM2 (C) měřeno metodou 5 (Tab. IV); chromatogram standardů flavonoidů a kumarinů v módu SIM1 (A). Identifikace elučních pásů: 1, 7-hydroxy-6-methoxykumarin; 2, kvercetin-3-glukosid; 3, 4-hydroxykumarin; 4, kvercetin; 5, luteolin; 6, kaempferol

Tab. VIII: Hodnoty koncentrací (µg/g sušiny) flavonoidů a kumarinů ve zkoumaných rostlinných druzích čeledi Apiaceae stanovené metodou HPLC-MS Kumarin Rostlina 4-hydroxykumarin

Flavonoid Flavonol

Flavon

7-hydroxy-6methoxykumarin 5

Anethum graveolens

-

Carum carvi semeno

-

Ferula asa-foetida

-

-

Foeniculum vulgare semeno

-

Foeniculum vulgare

7

luteolin

kaempferol kvercetin

kvercetin-3-glukosid

-

17

20

1340

-

-

-

230

1530

55

970

9660

38

25

122

266

434

-

46

-

-

1

3470

Oenanthe aquatica

-

21

21

10500

690

2190

Peucedanum cervaria

-

11

57

-

85

5700

21

8

2270

-

-

Pimpinella major

-

28

1320

199

152

4330

Sium sisarum

-

108

-

129

2870

201

Pimpinella anisum semeno

42

4.3

STANOVENÍ ISOFLAVONOIDŮ Pro stanovení isoflavonoidů u vybraných druhů Apiaceae byly použity imunoafinitní

metody (ELISA, IAC/HPLC MS) které jsou díky specifické interakci antigen – protilátka vysoce selektivní a umožňují identifikaci hledaných látek i ve velmi nízkých koncentacích. 4.3.1

ELISA metody

Imunoreaktivita hrubých extraktů Extrakty byly analyzovány metodami ELISA. Výsledky této semikvantitativní analýzy jsou shrnuty na Obr. 7. Všechny hrubé extrakty zkoumaných druhů rostlin čeledi Apiaceae vykázaly imunoreaktivitu v metodách specifických pro daidzein, genistein a biochanin A. Nejvyšší imunoreaktivity byly naměřeny metodami genistein-4´ a genistein-7, které detegují genistein a jeho deriváty nesoucí různé substituenty v polohách 4´ nebo 7. Bedrník větší (Pimpinella major) (Obr. 9) a halucha vodní (Oenanthe aquatica) vykazovaly nejvyšší hodnoty imunoreaktivit u všech použitých metod. Hrubé extrakty všech zkoumaných zástupců Apiaceae byly dále podrobeny frakcionaci na semipreparativní koloně (kap. 3.4.3) pro detailnější analýzu výskytu jednotlivých isoflavonoidů. Sium sisarum Pimpinella major Pimpinella anisum semeno Peucedanum cervaria

Oenanthe aquatica

Foeniculum vulgare semeno

genistein-7

Foeniculum vulgare

biochanin-7 Ferula asa-foetida

genistein-4' Carum carvi semeno

daidzein-7 daidzein-4'

Anethum graveoleus

0

50

100 orientační množství isoflavonů (ng/g sušiny)

Obr. 7: Orientační množství isoflavonů (ng/g sušiny) ve zkoumaných druzích čeledi Apiaceae

Imunoreaktivita HPLC frakcí Části hrubých extraktů byly odpařeny pod vakuem do sucha a odparky byly naředěny v mobilní fázi (50:50, A:B). Pro frakcionaci hrubých extraktů jsem použila chromatografii na semipreparativní koloně (kap. 3.4.3). Sesbíráno bylo 50 frakcí pro každou rostlinu. Frakce byly odpařeny do sucha a poté analyzovány pěti ELISA metodami (kap. 3.4.5). Výsledkem těchto analýz byly chromatogramy imunoreaktivit v jednotlivých rostlinách (Obr. 8). Chromatogramy extraktů většiny studovaných rostlin obsahovaly imunoreaktivní eluční pásy. Chromatografická pohyblivost imunoreaktivních frakcí byla porovnána se standardy (Tab. III). Při analýze těchto dat byla uvažována také křížová reaktivita jednotlivých metod (Tab. V). Každá z pěti použitých ELISA metod je specifická pro úzkou skupinu látek. Tyto specifity se v několika případech překrývají, takže pozitivní signál zaznamenaný ve stejné HPLC frakci druhou (jinou) metodou, může být považován za nezávislé ověření90.Souhrn získaných dat pro imunoreaktivity jednotlivých HPLC frakcí u vybraných druhů Apiaceae je uveden v Tab IX. Vzhledem ke specifitě metody biochanin-7 byl stanoven sissotrin (frakce 25-26) a biochanin A (frakce 40). Přítomnost biochaninu A byla potvrzena metodou genistein-4´. Imunoreaktivita genisteinu (frakce 23-24) byla stanovena metodou genistein-7. Tato metoda vykazuje široké spektrum křížových reaktivit. Kromě genisteinu byly stanoveny i jeho 7-O-glukosid (genistin ve frakcích 10-11) a prunetin (frakce 39). Metoda daidzein-4´, specifická pro daidzein (frakce 18-20), vykazovala imunoreaktivitu pro formononetin (frakce 30-31). Druhá ze specifických metod pro daidzein, metoda daidzein-7, potvrdila imunoreaktivitu daidzinu (frakce 7-8), prunetinu (frakce 39) a isoformononetinu (frakce 28-29). Imunoreaktivní odezva metod daidzein-4´a daidzein-7 ve frakci 13 nasvědčuje přítomnosti blíže neidentifikovaného isoflavonu. Stejná situace nastala i ve frakci 15. Mohlo by se jednat o přítomnost 4´-O-glykosidů či 7-O-glykosidů99. Frakce 42 vykazovala imunoreaktivitu při všech použitých ELISA metodách. Retenční čas této frakce odpovídá látkám s nižší polaritou, než je kterýkoli z použitých standardů. Mohlo by se jednat o isoflavonoid substituovaný nepolárními skupinami, například prenylovaný či geranylovaný derivát100. Nejhojněji zastoupenými aglykony byly genistein a formononetin. Z glykosidů byl v nejvyšší koncentraci zaznamenán genistin v bedrníku větším (Pimpinella major) (Obr. 9).

280 260 240

biochanin A

220 200 genistein

180 160 140

80 60

sissotrin

daidzin

100

daidzein

120

neznámý isoflavon

genistin

imunoreaktivita (ng/g sušiny)

formononetin

Pimpinella major 300

daidzein-4´ daidzein-7 genistein-4´ genistein-7 biochanin-7

40 20 0 0

10

20

30

40

HPLC frakce

Obr. 8: Imunoreaktivita isoflavonoidů HPLC frakcí bedrníku většího (Pimpinella major). Pro kalibraci jdenotlivých ELISA metod byly použity: daidzein pro metodu daidzein-4´ a daidzein-7, genistein pro metodu genistein-4´ a genistein-7, biochanin A pro metodu biochanin-7

Obr. 9: Pimpinella major101

Tab. IX: Stanovení isoflavonoidů (ng/g sušiny) v jednotlivých HPLC frakcích vybraných druhů Apiaceae pěti ELISA metodami: daidzein-4´, daidzein-7, genistein-4´, genistein-7, biochanin-7; n. isf.=neidentifikovaný isoflavon

Frakce *

Isoflavon

7-8

daidzin

10-11

genistin

13

n. isf.

15

n. isf.

18-20

daidzein

23-24

genistein

25-26

sissotrin

28-29

isoformononetin

30-31

formononetin

39

prunetin

40

biochanin A

42

n. isf.

Anethum graveolens

Carum carvi semeno

Ferula asafoetida

Foeniculum vulgare

Oenanthe aquatica

Pimpinella anisum semeno

Pimpinella major

190 2186 285 239 58 90

159

162

265

228

963 304

280 5

198

18

*semipreparativní HPLC na koloně LiChroCART 250-10 RP-18 (kap. 3.4.3)

3

16391

208 5000 20000

4.3.2

Imunoafinitní chromatografie

Jako srovnávací metodu pro stanovení isoflavonoidů jsem použila HPLC-MS v kombinaci s imunoafinitní chromatografii. Pro přečištění vzorků před HPLC jsem použila kolonku plněnou směsí imunosorbenů anti-7-biochanin-IS, anti-7-daidzein-IS, anti-7-genistein-IS a anti-4’-genistein-IS (kap. 3.4.4)82. Získané eluáty jednotlivých studovaných rostlin jsem odpařila pod vakuem do sucha a odparky jsem naředila mobilní fází (40:60, A:B) pro HPLC-MS (kap. 3.4.3). Výsledky analýzy jsou shrnuty v Tab. X. Přítomnost isoflavonů byla touto metodou potvrzena. V každém z měřených vzorků byl pozorován formononetin. Dále se často vyskytoval daidzin a biochanin A. Největší škála isoflavonoidů byla identifikována v extraktech bedrníku většího (Pimpinella major) a oproti ostatním vzorkům bylo naměřeno v bedrníku nejvíce genistinu a biochanin A. Glykosylované deriváty daidzeinu (daidzin) a biochaninu A (sissotrin) byly zastoupeny v nižších koncentracích. Pro názornost jsou v obrázcích 10 a 11 uvedena hmotnostní spektra standardů a extraktu bedrníku většího (P. major) přečištěného IAC. Výsledky naměřené ELISA metodami a IAC/HPLC-MS jsou porovnány v Tab. XI. Tab. X: Přehled isoflavonů identifikovaných metodou IAC/HPLC-MS ve vybraných druzích Apiaceae (Materiál: C. carvi - semeno, ostatní druhy – nať) Rostlina Anethum graveolens Carum carvi Foeniculum vulgare Oenanthe aquatica

Pimpinella major

Isoflavon daidzin formononetin formononetin biochanin A daidzin formononetin biochanin A daidzin genistin sissotrin daidzein genistein formononetin biochanin A

Koncentrace isoflavonu ng/g sušiny 15 365 249 758 29 142 220 31 4804 99 188 2351 1804 8013

VWD1 A, λ=254 nm

4

mAU

A

14 12 10

3

1

5

8 6

8

9

7

6 4

2

2 1 0 6 0

5

MSD1 TIC, ES-API, SIM1 140

x103

10

15

3

20

25

min

6 B

7

120 100

5

8

80 %

9

60 40 20 0 0

5

10

15

20

25

min

3

MSD2 TIC, ES-API, SIM2 x103 160

C

1

140 120 100 % 80 60 40

2

20 0 0

5

10

15

20

25

min

Obr. 10: HPLC-MS chromatogramy standardů isoflavonoidů s DAD detekcí (A), v módu SIM1 (B) a v módu SIM2 (C) (Tab. I, Tab. III). Identifikace elučních pásů: 1, daidzin; 2, genistin; 3, daidzein; 4, sissotrin; 5, genistein; 6, isoformononetin; 7, formononetin; 8, prunetin; 9, biochanin A

MSD1 TIC, ES-API, SIM1

9

D

x103 25

20

7

5

% 15

10

3 5

0 5

10

15

20

min

MSD2 TIC, ES-API, SIM2 x103

E

10

2

8 % 6

4

4 2

1 5

10

15

20

min

Obr. 11: HPLC-MS chromatogramy extraktů bedrníku většího (Pimpinella major) přečištěných imunoafinitní chromatografií. SIM1 (D) a SIM2 (E) (Tab. I, Tab. III). Identifikace elučních pásů: 1, daidzin; 2, genistin; 3, daidzein; 4, sissotrin; 5, genistein; 6, isoformononetin; 7, formononetin; 8, prunetin; 9, biochanin A (Tab. X)

Výskyt isoflavonoidů v čeledi Apiaceae byl poprvé publikován autory Tanem a Zhao u dvou rodů Bupleurum (B. chinense, B. scorzonerifolium). Identifikovanými isoflavonoidy byly daidzin, puerarin a glykosid formononetinu (saikoisoflavonosid A)44. Zmínka o možné přítomnosti genisteinu v kmínu (C. carvi) byla uvedena Mazurem v rámci potravinářského screeningu102. V této studii byla imunospecifickými metodami nově identifikována přítomnost řady dalších isoflavonoidů, které doposud v čeledi Apiaceae nebyly publikovány. Šest rodů rostlin, jmenovitě Anethum, Carum, Ferula, Foeniculum, Oenanthe a Pimpinella, u kterých byly identifikovány isoflavonoidy, se řadí v taxonomickém systému do dvou různých kmenů Apieae a Peucedaneae. Ve kmeni Peucedaneae jde tedy o vůbec první, doposud nepublikovanou identifikaci isoflavonoidů. Byly zaznamenány jak kvalitativní (Tab. XI) tak kvanitativní (Tab. IX, Tab. X) rozdíly výskytu isoflavonoidů mezi jednotlivými druhy Apiaceae. Tato studie dále prokázala přítomnost aglykonů i glykosidů isoflavonů; methoxyisoflavony se vyskytovaly častěji než hydroxyisoflavony. Z těchto výsledků lze usoudit,

že

v čeledi

Apiaceae

je

přítomna

metabolická

dráha

isoflavonoidů100.

Tab. XI: Přehled isoflavonů identifikovaných metodami IAC/HPLC-MS (I) a ELISA (E) ve vybraných druzích Apiaceae

Isoflavon Daidzin

Anethum graveolens

Carum carvi

Ferula asa-feotida

Foeniculum vulgare

I

E

I

E

I, E

E

I, E

E

E

I

E

E

E

I, E

E

Sissotrin

Isoformononetin Formononetin

I

I, E

Prunetin Biochanin A

.

Pimpinella major I, E

Daidzein

E

Pimpinella anisum

I, E

Genistin

Genistein

Oenanthe aquatica

E

I, E

E I

I

I, E

5. ZÁVĚR •

Kolorimetrickou

metodou

bylo

stanoveno

orientační

množství

polyfenolů

v rostlinných extraktech vybraných devíti druhů čeledi Apiaceae (8-125 mg EPKG /g rostlinného extraktu). •

Metodou HPLC-MS se podařilo ověřit přítomnost vybraných flavonů, flavonolů a kumarinů a v případě některých druhů i nově popsat jejich výskyt (5-9660 µg/g sušiny)

•

Kombinací semipreparativní HPLC se specifickými ELISA metodami byly nově detegovány isoflavony ve všech devíti studovaných druzích čeledi Apiaceae. Koncentrace jednotlivých isoflavonů se pohybovala v rozmezí 3-20000 ng/g sušiny.

•

Kombinací metod IAC a HPLC-MS se podařilo identifikovat isoflavony v pěti druzích čeledi Apiaceae.

•

Spektrum analytů detegovaných kombinací HPLC-ELISA bylo širší, než v případě IAC/HPLC-MS.

6. LITERATURA 1 Sakakibara H., Honda Y., Nakagawa S., Ashida H., Kanazawa K.: J. Agric. Food Chem. 2003, 51, 571. 2 Velioglu Y. S., Maaza G., Gao L., Oomah B. D.: J. Agric. Food Chem. 1998, 46, 4113. 3 Djeridane A., Yousfi M., Nadjemin B., Boutssouna D., Stocker P., Vidal N.: Food Chem. 2005, 97, 654. 4 Graham J. G., Quinn K. L., Fabricant D. S., Farnswoth N. R.: J. Ethnopharmacol. 2000, 73, 347. 5 Yang Y., Huang C. Y., Peng S. S., Li J.: Biomed. Environ. Sci. 1996, 9, 386. 6 Wang H.Z., Zhang Y., Xie L. P., Yu X. Y., Zhang R. Q.: J. Nutr. Biochem. 2002, 13, 421. 7 Wilkinson A.P., Wahala K., Williamson G.: J. Chromatogr. 2002, B 777, 93. 8 Vitková M., Macková Z., Fukal L., Lapčík L.: Chem. Listy 2004, 98, 1135. 9 Harmatha J., Hertweck Ch., Chodounská H., Kasal A., Moravcová J., Piel J., Svatoš A., Valterová I., Žďárek J.: Chemie a biochemie přírodních látek, Vol. 27, str. 117-120, UOCHAB AV ČR, Praha 2002. 10 Bruneton J.: Pharmacognosy Phytochemistry Medical Plants, 2nd ed., str. 227-228, Lavoisier Publishing, Paris 1999. 11 Suchopár J.: Remedia Compendium, str. 33, Panax, Praha 1997. 12 Suchopár J.: Remedia Compendium, str. 102–103, Panax, Praha 1997. 13 Suchopár J.: Remedia Compendium, str. 537–538, Panax, Praha 1997. 14 Suchopár J.: Remedia Compendium, str. 558–559, Panax, Praha 1997. 15 Turčan P.: Interní medicína pro praxi 2004, 8, 410. 16 Bruneton J.: Pharmacognosy Phytochemistry Medical Plants, 2nd ed., str. 290-291, Lavoisier Publishing, Paris 1999. 17 Orhan N., Aslan M., Deliorman O., Ergun F., Yesilada E.: J. Ethnopharmacol. 2006, 108, 280. 18 Zibadi S., Rohdewald P. J., Park D., Watson R. R.: J. Nutrition Research 2008, 28, 315. 19 Slavík B.: Květena České republiky, str. 269-427, Academia, Praha 1997. 20 www.itis.gov staženo 5.4 2008 v 14:15.

21 Mathioli P. O.: Herbář neboli bylinář, Fontána, Praha 2000. 22 Saleem M., Alam A., Sultan S.: Life Sci. 2001, 68, 1913. 23 Tanina M. O. M., Shah A. H., Moshin A., Ageel A. M., Qureshi S.: Phytother. Res. 1996, 10, 33. 24 Lisiewska Z., Kmiecik W., Slupski J.: Food Chem. 2004, 84, 511. 25 Heywood V. H.: The Biology of the Umbelliferae, str. 31. Academic Press, London 1971. 26 Hegnauer R.: Chemotaxonomie der Pflanzen, Vol. 6, str. 554. Birkhaüser, Basel 1973. 27 Harborene J. B.: The Biology anh Chemistry of the Umbelliferrae, str. 293. Academic Press, London 1971. 28 Crowden R. K., Harborne J. B., Heywood V.H.: Phytochemistry 1969, 8, 1963. 29 Bruneton J.: Pharmacognosy Phytochemistry Medical Plants, 2nd ed., str. 310-337, Lavoisier Publishing, Paris 1999. 30 Shirley B.W.: Seed Sci. Res. 1998, 8, 415. 31 Dixon R.A.: Comprehensive Natural Products Chemistry, Elsevier, London 1999. 32 Harborne J. B., King L.: Biochem. Syst. Ecol. 1976, 4, 111. 33 Gebhardt Y., Witte S., Forkmann G., Lukačin R., Matern U., Martens S.: Phytochemistry 2005, 66, 1273. 34 Martens S., Forkmann G., Britsch L., Wellmann F., Matern U., Lukačin R.: FEBS Lett. 2003, 544, 93. 35 Dakora F. D., Philips D. A.: Physiol. Mol. Plant Patol. 1996, 49, 1. 36 Cornwell T., Cohick W., Raskin I.: Phytochemistry 2004, 65, 995. 37 Schijlen E. G. W. M., de Vos C. H. R., van Tunen A. J., Bovy A. G.: Phytochemistry 2004, 65, 2631. 38 Lapčík O.: Phytochemistry 2007, 68, 2909. 39 Kim S. T., Cho K. S., Yu S., Kim S. G., Hong J. C., Han C., Bae D. W., Nam M. H., Kang K. Y.: Proteomics 2003, 3, 2368. 40 Crombie L., Whitig D. A.: Phytochemistry 1998, 49, 1479. 41 Lopéz-Meyer M., Paiva N. L.: Physiol. Mol. Plant Pathol. 2002, 61, 15. 42 Tahara S., Ibrahim R. K.: Phytochemistry 1995, 38, 1074. 43 Veitch N.: Nat. Prod. Rep. 2007, 24, 417. 44 Tan L., Zhao Y. Y., Wang B., Zhang R. Y.: Chinese Chem. Lett. 1998, 9, 71.

45 Bruneton J.: Pharmacognosy Phytochemistry Medical Plants, 2nd ed., str. 263-276, Lavoisier Publishing, Paris 1999. 46 Herz W., Falk H., Kirby G. W., Moore R. E.: Progress in the Chemistry of Ogranic Natural Products, Springer-Verlag, Wien 2002. 47 Harborne J. B.: Comparative Biochemistry of the Flavonoids, Academic Press, London 1967. 48 Nielsen J. G. in: Biology and chemistry of the Umbelliferae, Heywood, New York 1971. 49 Harborne J. B., Williams A. C.: Phytochemistry 1972, 11, 1741. 50 Yasuda T., Kano Y., Saito K., Ohsawa K.: Biol. Pharm. Bull. 1994, 17, 1369. 51 Mikelová R., Klejdus B., Zehnálek J., Vacek J., Kizek R.: CHEMagazín 2004, 1, 13. 52 Prasaix J. K., Jones K., Kirk M., Wilson L., Smith-Johnson M., Weaver C., Barnes S.: J. Agric. Food Chem. 2003, 51, 4213. 53 Franke A. A., Custer L. J., Cerna C. M., Narala K.: P. Soc. Exp. Biol. Med. 1995, 208, 18. 54 Setchell K. D. R., Welsh M. B., Lim C. K.: J. Chromatogr. 1987, 386, 315. 55 Wang W., Tanaka Y., Han Z., Chen J.: J. Agric. Food. Chem. 1994, 42, 1584. 56 Lapčík O., Hill M., Černý I., Lachman J., Al-Maharik N., Adlercreutz H., Hampl R.: Plant Sci. 1999, 148, 111. 57 Baggett B. R., Cooper J. D., Hogan E. T., Carper J., Paiva N., Smith J. T.: Electrophoresis 2002, 23, 1642. 58 Wu P. S., Yasuda S., Tachibana H., Yamada K.: Food Sci. Technol. Res. 2003, 9, 180. 59 Mazur W., Fotsis T., Wähälä K., Ojala S., Salakka A., Adlercreutz H.: Anal. Biochem. 1996, 233, 169. 60 Bennetau-Pelissero C., Arnal-Schnebelen B., Lamothe V., Sauvant P., Sagne J. L., Verbruggen M. A.: Food Chem. 2003, 82, 645. 61 Heinonen S., Wähälä K., Adlercreutz H.: Anal. Biochem. 1999, 274, 211. 62 Heinonen S., Hoikkala A., Wähälä K., Adlercreutz H.: J. Steroid Biochem. 2003, 87, 285. 63 Tekel J., Daeseleire E., Heeremans A., van Peterghem C.: J. Agric. Food Chem. 1999, 47, 3489. 64 Králová B., Rauch P.: Bioanalytické metody, str. 210-211, VŠCHT, Praha 1995. 65 Králová B., Rauch P.: Bioanalytické metody, str. 224-226, VŠCHT, Praha 1995. 66 Králová B., Rauch P.: Bioanalytické metody, str. 130-131, VŠCHT, Praha 1995.

67 Bennetau-Pelissero C., Gontier Latonnelle K., Lamothe V., Shinkaruk-Poix S., Kaushik S. J.: Phytochem. Anal. 2004, 15, 40. 68 Creeke P. I., Wilkinson A. P., Lee H. A., Morgan M. R. A., Price K. R., Rhodes M. J. C.: Food Agr. Immunol. 1998, 10, 325. 69 Bennetau-Pelissero C., Le Houérou C., Lamothe V., Le Menn F., Babin P., Bennetau B.: J. Agric. Food Chem. 2000, 48, 305. 70 Le Houérou C., Bennetau-Pelissero C., Lamothe V., Le Menn F., Babin P., Bennetau B.: Tetrahedron 2000, 56, 295. 71 Králová B., Rauch P.: Bioanalytické metody, str. 134, VŠCHT, Praha 1995. 72 Hemmilä I., Ståhlberg T., Morttram P.: Bioanalytical applications of labeling technologies, str. 18, Wallac, Turku 1994. 73 Králová B., Rauch P.: Bioanalytické metody, str. 144-145, VŠCHT, Praha 1995. 74 Philips T.M., Krum J.M.: J. Chromatogr. B 1998, 715, 55. 75 Shahtaheri S.J., Kwasowski P., Stevenson D.: Chromatgraphia 1998, 47, 453. 76 Dietrich R., Usleber E., Martlbauer E.: Analyst 1998, 123, 2749. 77 Lapčík O., Vítkova M., Klejdus B., Al-Maharik N., Adlercreutz H.: J. Immunol. Methods 2004, 294, 155. 78 Al-Maharik N., Kaltia S.A., Wahala K.: Mol. Online 1999, 3, 20. 79 Singleton V. L., Rossi J. A.: Am. J.Enol. Viticult. 1965, 16, 144. 80 Macková Z.: ELISA metody pro stanovení isoflavonoidů, Diplomová práce, VŠCHT, Praha 2004. 81 Prokudina E. A.: Imunoafinitní sorbenty pro isoflavonoidy, Diplomová práce, VŠCHT, Praha 2007. 82 Coruh N., Sagdicoglu Celep A. G., Ozgokce F.: Food Chem. 2007, 100, 1237. 83 Koblovská R., Macková Z., Vítková M., Kokoška L., Klejdus B., Lapčík O.: Phytochem. Anal. 2008, 19, 64. 84 Nielsen S. E., Freese R., Cornett C., Dragsted L. O.: Anal. Chem. 2000, 72, 1530. 85 Raffaeli A., Moneti G., Mercati V., Toja E.: J.Chromtogr. A 1997, 777, 223.

86 Sousa M. P., Matos E. O., Matos J. J. A., Machado M. I. L., Craveiro A. A.: Constituintes quimicos ativos de plantas madicinais Brasileiras, Edicao UFC/Laboratorio de Produtos Naturais, Fortaleza, Brazil 1991. 87 Burkhardt G., Reichlig J., Martin R., Becker H.: Pharm. Weekly Sci. 1986, 8, 190. 88 Kunzemann J., Herrmann K.: Z. Lebensm. Unters. For. 1977, 164, 194. 89 Caglioti L., Naef H., Arigoni G., Jeper O.: Helv. Chim. Acta 1959, 42, 2557. 90 Hofer O., Widhalm M., Greper H.: Monatshefe für Chemie 1984, 115, 1207. 91 Oktay M., Gülcin Ö, Küfrevioglu I.: Lebensm. Wiss. Technol. 2003, 36, 263. 92 Parejo I., Viladomat F., Bastida J., Schmeda-Hirschmann G., Burillo J., Codina C.: J. Agric. Food Chem. 2004, 52, 1890. 93 Coran S. A., Bombagiotti-Alberti M., Vincieri F. F., Moneti G.: J. Pharm. Biomed. Anal. 1987, 5, 509. 94 Saleh N. A. M., El-Negoumy S. I., El-Hadidi M. N., Hosni H. A.: Phytochemistry 1983, 22, 1417. 95 Justesen U.: J. Chromatogr. A 2000, 902, 369. 96 Teuber H., Herrmann K.: Z. Lebensm. Unters. For. 1978, 167, 101. 97 Waluckja A. G., Pimienow M. G.: Rastit. Resur. 1984, 20, 481. 98 Bartnik M.: Ph.D. Thesis. Medical University, Lublin 2004. 99 Lapčík O., Klejdus B., Kokoška L., Davidová M., Afandi K., Kubáň V., Hampl R.: Biochem. Syst. Ecol. 2005, 33, 983. 100 Fuendjiep V., Nkengfack A E., Fomun Z. T., Sondengam B. L., Bodo B.: Phytochemistry 1998, 47, 113. 102 http://commons.wikimedia.org/wiki/Image:Pimpinella_major_Sturm11.jpg staženo 15.4 2008 v 15:54. 103 Mazur W.: Ph.D. Thesis. University of Helsinki, Helsinki 2000.

7. SEZNAM POUŽITÝCH ZKRATEK AcCoA

acetylkoenzym A

AG

antigen

ANS

anthokyanidinsynthasa

AOT

tenzid dioktylsulfosukcinát

BSA

hovězí sérový albumin

CE

kapilární elektroforéza

CoASH

koenzym A

DAD

detektor s diodovým polem

DCC

dicyklohexylkarbodiimid

DFR

dihydroflavonol 4-reduktasa

DMF

dimethylformamid

DMS

dimethylsulfoxid

DNA

kyselina deoxyribonukleová

EIA

enzymová imunoanalýza

ELISA

enzymová imunoanalýza na pevné fázi

EOF

elektroosmotický tok

EPKG

ekvivalenty propylesteru kyselina gallové

ESI

electrospray ionization

F3´H

flavonoid 3´-hydroxylasa

FHT

flavanon 3β-hydoroxylasa

FIA

fluorescenční imunoanalýza

FLS

flavonolsynthasa

FNS

flavonsynthasa

GC

plynová chromatografie

Glc

glukosa

HDL

high density lipoprotein

HPLC

vysokoúčinná kapalinová chromatografie

IAC

imunoafinitní chromatografie

IFS

isoflavonsynthasa

IR

infračervená (spektroskopie)

IS

imunoafinitní sorbent

KLH

keyhole limpet hemocyanin

LC

kapalinová chromatografie

MEKC

micelární elektrokinetická separace

MS

hmotnostní spektroskopie

MeO, resp OMe.

methoxyl

NHS

N-hydroxysukcinimid

NMR

nukleární magnetická rezonance

O-DMA

O-desmethylangolensin

OPD

o-fenylendiamin

OVA

ovalbumin

PAL

fenylalaninamoniumlyasa

PBS

fosfátový pufr

PL

protilátka

RIA

radioimunoanalýza

SDS

dodecylsíran sodný

SPE

extrakce na pevné fázi

SIM

selected ion monitoring

TAL

tyrosinamoniumlyasa

TFA

trifluoroctová kyselina

Thyr

thyreoglobulin

TLC

chromatografie na tenké vrstvě

TME

tyrosylmethylester

TR-FIA

time resolved floroimunoassay

UV

ultrafialová (spektroskopie)

UV-VIS

ultrafialová a viditelná (spektroskopie)