TEJSAV ENZIMATIKUS ÉSZTEREZÉSE IONOS FOLYADÉKOKBAN ÉS SZUPERKRITIKUS SZÉN-DIOXIDBAN

Pannon Egyetem Vegyészmérnöki Tudományok és Anyagtudományok Doktori Iskola

TEJSAV ENZIMATIKUS ÉSZTEREZÉSE IONOS FOLYADÉKOKBAN ÉS SZUPERKRITIKUS SZÉN-DIOXIDBAN DOKTORI (PH.D.) ÉRTEKEZÉS

Készítette: Németh Gergely okleveles környezetmérnök

Témavezető: Dr. Gubicza László Egyetemi tanár

Pannon Egyetem Biomérnöki, Membrántechnológiai és Energetikai Kutató Intézet

2013.

TEJSAV ENZIMATIKUS ÉSZTEREZÉSE IONOS FOLYADÉKOKBAN ÉS SZUPERKRITIKUS SZÉNDIOXIDBAN

Értekezés doktori (PhD) fokozat elnyerése érdekében Írta: Németh Gergely, okleveles környezetmérnök Készült a Pannon Egyetem Vegyészmérnöki Tudományok és Anyagtudományok Doktori Iskolája keretében Témavezető: Dr. Gubicza László, egyetemi tanár Elfogadásra javaslom (igen / nem) …………………………… (aláírás) A jelölt a doktori szigorlaton………. % -ot ért el Az értekezést bírálóként elfogadásra javaslom: Bíráló neve: ………………………. ………………………. igen /nem ………………………. (aláírás) Bíráló neve: ………………………. ………………………. igen /nem ………………………. (aláírás) Bíráló neve: ………………………. ………………………. igen /nem ………………………. (aláírás) A jelölt az értekezés nyilvános vitáján………% - ot ért el Veszprém, …………………………. a Bíráló Bizottság elnöke A doktori (PhD) oklevél minősítése…................................. ………………………… Az EDT elnöke

2

TARTALOMJEGYZÉK KIVONAT ......................................................................................................................................... 5 ABSTRACT ....................................................................................................................................... 6 AUSZUG ........................................................................................................................................... 7 Jelölésjegyzék..................................................................................................................................... 8 Bevezetés ......................................................................................................................................... 10 1. Irodalmi összefoglaló .................................................................................................................... 12 1.1. A tejsav, mint megújuló nyersanyag ....................................................................................... 12 1.2. Tejsav származékai ................................................................................................................ 14 1.2.1. Politejsav ......................................................................................................................... 14 1.2.2. Etil-laktát ........................................................................................................................ 15 1.3. Enzimatikus reakciók ............................................................................................................. 18 1.3.1. Tejsav enzimes észterezéséhez alkalmazott lipázok .......................................................... 18 1.3.2. Tejsav enzimes észterezése .............................................................................................. 20 1.3.2. Enantioszelektivitás ......................................................................................................... 21 1.3.3. Enantioszelektív reakciók ................................................................................................ 26 1.3.4. Tejsav enantioszelektív reakciói....................................................................................... 29 1.4. Enzimkatalízis nem konvencionális közegekben ..................................................................... 30 1.4.1. Ionos folyadékok jellemzése ............................................................................................ 30 1.4.2. Enzimek ionos folyadékokban ......................................................................................... 32 1.4.3. Szuperkritikus CO2 .......................................................................................................... 35 1.4.4. Szuperkritikus CO2 és ionos folyadék mátrix ................................................................... 37 1.4.5. Tejsav lipázos észterezése nem konvencionális közegekben ............................................. 38 1.5. Észterezési reakciót befolyásoló paraméterek ......................................................................... 39 1.5.1. Sav/alkohol mólarány ...................................................................................................... 39 1.5.2. A víz szerepe és eltávolításának lehetőségei ..................................................................... 40 1.6. Kísérlettervezés ...................................................................................................................... 42 Célok ............................................................................................................................................ 43 2. Anyagok és módszerek ................................................................................................................. 44 2.1. Felhasznált anyagok ............................................................................................................... 44 2.2. Alkalmazott készülékek .......................................................................................................... 46 2.3. Alkalmazott egyenletek .......................................................................................................... 47 2.4. Analízis .................................................................................................................................. 47 2.4.1. GC analízis ...................................................................................................................... 47 2.4.2. Víztartalom meghatározás................................................................................................ 48 2.5. Kísérleti módszerek ................................................................................................................ 49 2.5.1. Rázóinkubátoros kísérletek .............................................................................................. 49 2.5.2. Vízeltávolítás................................................................................................................... 50 2.5.3. Szuperkritikus CO2-dal végzett kísérletek ........................................................................ 52 3. Eredmények és értékelés ............................................................................................................... 54 3.1. Enzimek aktivitásának mérése ................................................................................................ 54 3.2. Enantioszelektivitás vizsgálata szerves oldószerekben ............................................................ 54 3.2.1. n-Hexán........................................................................................................................... 54 3.2.2. Etanolfelesleg (oldószermentes) ....................................................................................... 57 3.3. Ionos folyadékok katalizátor hatásának vizsgálata................................................................... 59 3.4. Enantioszelektivitás vizsgálata ionos folyadékokban............................................................... 63 3.4.1. Cyphos 103, 105, 109 és 110 ionos folyadékokban végzett kísérletek ............................... 64 3.4.2. Cyphos 104 ..................................................................................................................... 65

3

3.5. Candida antarctica lipáz B és Candida rugosa enzimek tulajdonságainak összehasonlítása Cyphos 104 ionos folyadékban ...................................................................................................... 70 3.5.1. Enantioszelektivitás és hozam vizsgálata CALB enzimmel .............................................. 70 3.5.2. Enantioszelektivitás és hozam vizsgálata Candida rugosa enzimmel ................................ 72 3.6. Szuperkritikus CO2-ban végzett kísérletek .............................................................................. 75 3.7. Cyphos 104-ben mért optimális paraméterek a maximális enantiomerfelesleg és hozam eléréséhez ..................................................................................................................................... 79 3.8. Vízeltávolítás ......................................................................................................................... 83 3.8.1. Zeolittal történő vízeltávolítás .......................................................................................... 84 3.8.2. Pervaporációval történő vízeltávolítás .............................................................................. 86 3.9. Kinetikus rezolválás, termék újbóli reakcióba vitele................................................................ 88 3.10. Az enzim újrahasználata ....................................................................................................... 94 4. Összefoglalás ................................................................................................................................ 97 Tézispontok .................................................................................................................................... 101 Theses ............................................................................................................................................ 104 Irodalomjegyzék ............................................................................................................................. 107 Saját publikációk listája .................................................................................................................. 116 Köszönetnyilvánítás ........................................................................................................................ 118 Függelék: ........................................................................................................................................ 119

4

KIVONAT A mérések célja racém tejsavból olyan anyag előállítása, mely megfelelő alapanyagként szolgál biológiailag lebontható műanyag előállításához. A doktori munka során végzett mérések azt kutatták, hogy milyen feltételek mellett észterezhető úgy a (D,L)-tejsav, hogy a képződött termék (etil-(L)-laktát) enantiomerfeleslege a maximális legyen. A vizsgálatok során a szakirodalomban részletezett befolyásoló paraméterek hatásainak optimalizálása történt. A kezdeti mérések rázatott lombikos kivitelben, konvencionális reakcióközegben történtek, majd különféle foszfónium-típusú ionos folyadékokban. A szerző a kísérleteket megelőzően meghatározta, mely Cyphos-típusú ionos folyadék katalizálja önmagában a legkevésbé a tejsav etanolos észterezését. Az ötféle ionos folyadék további vizsgálatát követően kétféle lipáz enzim (Candida antarctica lipáz B és Candida rugosa) enantioszelektivitásának összehasonlítása is megtörtént. A mérések tervezését és kiértékelését többfaktoros kísérlettervezéssel végezte el. A megfelelő oldószer és biokatalizátor kiválasztása után különböző reakciót befolyásoló tényezők optimális értékének megadására irányultak a mérések. A hőmérséklet, az alk/TS arány, az ionos folyadék/alk arány és a kezdeti víztartalom értékeinek beállításával elérhető volt az eddigiek során mért legnagyobb enantiomerfelesleg érték és észterhozam. A korábbiakban megszerzett tapasztalatok felhasználásával szuperkritikus CO 2-ban és szuperkritikus CO2/ionos folyadék kettős rendszerében történtek kísérletek az e.e. növelése céljából. A kapott eredmények sikeresen összevethetők a korábbi irodalmi adatokkal. A mérési elegy meghatározó víztartalmának csökkentését zeolittal és pervaporációs technológiával is csökkentette a szerző, annak érdekében, hogy az észterhozam és az enantioszelektivitás további növelésének lehetőségét vizsgálja. A legalkalmasabb mérési körülményeket felhasználva átfogó kísérletek folytak a képződött termék visszaforgatásával történő e.e. érték növelésére céljából. A munka befejező lépéseként a kiválasztott ionos folyadék kedvező hatásait bizonyította a szerző.

5

ABSTRACT The aim of the doctoral work was to produce an initial material for one type of biodegradable plastic. During this work the optimal parameters were investigated for obtaining the highest enantiomeric excess (e.e.) during the esterification of (D,L)-lactic acid with ethanol. The initial experiments were carried out in shaking incubator to select the suitable solvent for the measurements. The first goal of the author was to find a solvent where the e.e. values and the ester yield are high, furthermore, the solvent has no catalyzing effect on the reaction. Enantioselectivity of two enzymes (Candida antarctica lipase B and Candida rugosa) were investigated. By the application of the selected ionic liquid solvent and enzyme the temperature, substrate excess, initial water content and solvent amount were optimised. Also the supercritical CO2 and supercritical CO2/ionic liquid systems were investigated to enhance the ester yield. Partial removal of the water content during the reaction was achieved using zeolite and pervaporation with the aim of increasing the e.e. value and the ester yield. Using the parameters for the best results the enantiomeric excess was increased by the recycling of the reaction product. At the end of the work the beneficial effects of the ionic liquid in regard to the enzyme were proved.

6

AUSZUG Das Ziel der Doktorarbeit war die Herstellung eines geeigneten Ausgangsmateriales für bioabbaubare Kunstoffe. Während der Arbeit wurden die optimalen Parameter für den höchsten Enantiomerenüberschuss (e.e.) bei der Veresterung von (D,L)-Milchsäuere mit Ethanol bestimmt. Die ersten Versuche wurden in einem Schüttelinkubator durchgeführt, um das geeignete Lösungsmittel für die Messungen auszuwählen. Das erste Ziel des Verfassers war ein Lösungsmittel zu finden, wo die e.e.-Werte und die Esterausbeute hoch sind, wobei das Lösungsmittel

keinerlei

katalytische

Aktivität

auf

die

Reaktion

aufzeigt.

Die

Enantioselektivität der beiden Enzyme (Candida antarctica lipase B und Candida rugosa) war untersucht. Durch Anwendung der ausgewählten ionischen Flüssigkeit und Enzym wurden die optimalen Werte für die Temperatur, Überschuß an Substrat, Ausgangswassergehalt und die Menge des Lösungsmittels bestimmt. Auch die Systeme überkritisches CO2 und überkritisches CO2/ ionische Flüssigkeit wurden untersucht, um den Umsatz zu erhöhen. Wasserentfernung durch die Reaktion wurde mit Hilfe von Molekularsieben und Pervaporation durchgefürt, um die e.e-Werte bzw. die Esterausbeute zu verbessern. Bei Verwendung der besten Versuchsparameter sind die e.e.Werte mit dem Recycling des Reaktionsproduktes erhöht. Am Ende der Arbeit konnten die vorteilhafte Eigenschaften der ionischen Flüssigkeiten bewiesen werden.

7

Jelölésjegyzék PLA – politejsav (Polylactic acid) PLLA – poli-(L)-tejsav (Poly-(L)-lactic acid) CALA/CALB – Candida antarctica lipáz A/B LCA – életciklus elemzés (Life Cycle Analysis) IL – ionos folyadék (Ionic Liquid) scCO2 – szuperkritikus szén-dioxid GC – gázkromatográf (Gas Cromatograph) HPLC – folyadékkromatográf (High Performance Liquid Cromatograph) rpm – rázógép fordulatszáma (rotate per minute) m/m% – tömegszázalék M – moláris koncentráció pKa – savassági állandó Cx – szénlánc hossza kx – reakciósebességi állandó e.e. – enantiomerfelesleg* (enantiomeric excess) *(fordítható enantiomertöbbletnek is, ám a szaknyelv az előbbit használja) ees – szubsztrát enantiomerfeleslege eep – termék enantiomerfeleslege A/B – A/B szubsztrát koncentrációja A0/B0 – A/B szubsztrát kiindulási koncentrációja P/Q – a reakció A/B szubsztrátjából képződött termék EA/EB/EP/EQ – az enzimes reakció során az aktuális komponens enzimhez kapcsolódva SS/R – S/R szubsztrát PS/R – S/R szubsztrátból képződött termék y – hozam c – konverzió E – enantiomer arány Kx – egyensúlyi állandó Vx – reakciósebesség R – egyetemes gázállandó (8,314 J/mol/K) T – hőmérséklet (°C) H# – standard entalpiaváltozás 8

S# – standard entrópia változás D25 – optikai forgatóképesség (D)/(L) / (S)/(R) / (+/-) – balra/jobbra forgató enantiomer (D,L) / (±) – mindkét enantiomert 50-50%-ban tartalmazó elegy (racém elegy) – szerkezettől függő molekula módosulat O – orto R – metilcsoport EtOH – etil-alkohol BF4 – tetrafluoro-borát (anion) PF6 – hexafluoro-foszfát (anion) NTf2 – (trifluorometilszulfonil)imid (anion) CF3 – trifluoro-metil (anion) NO3 – nitrát (anion) SO3 – szulfit (anion) [EMIM][NTf2] – 1-etil-3-metilimidazólium-bisz(trifluorometilszulfonil)imid [BMIM]BF4 – 1-butil-3-metilimidazólium-tetrafluoro-borát [BMIM]PF6 – 1-butil-3-metilimidazólium-hexafluoro-foszfát [BMIM]Cl – 1-butil-3-metilimidazólium-klorid [MEBu3P][NTf2] – 2-metoxietil(tri-n-butil)foszfónium bisz(trifluoro-metánszulfonil)imid

9

Bevezetés Az 1800-as évektől fogva egyre növekszik az iparban és a társadalom mindennapjaiban felhasznált vegyszerek mennyisége [Wenda, 2011]. Ebből adódóan a növekvő vegyszerigény szükségessé tette a hatékonyabb előállítási folyamatok kifejlesztését, az utóbbi években viszont főként a már meglévők optimalizálására fókuszálnak, habár ennek ellenpéldája is előfordul. A klasszikus termelési folyamatoknak köszönhetően nagy mennyiségű hulladék keletkezett, ezért az elmúlt két évtizedben láthatóvá vált, hogy a vegyipar jelentős környezeti problémákat okoz, ezért a környezetbarát fejlesztések egyre inkább előtérbe kerülnek [Dunn, 2010]. A hulladékmennyiség növekedése mellett egy másik negatív tény, hogy toxikus reagenseket és veszélyes oldószereket alkalmaznak a szintézisek elvégzéséhez. Az ipar célja egyre inkább a zöldebb vegyipar fejlesztése, melyben a zöld kémia 12 alapelve érvényesül [Anastas, 2002]. A zöld kémia egyik fő szempontja, hogy olyan eljárásokat fejlesszünk, melyekben a reagenseket gazdaságosan és környezetbarát módon használjuk, ezzel elkerülhetjük a nagy mennyiségű hulladék keletkezését. A

folyamatok

átalakítása

és

a

hulladékprobléma

megoldása

érdekében

a

megújítható/megújuló nyersanyagok felhasználása egyre elterjedtebb. Ilyen széles körben alkalmazott alapanyagok a tejsav és észterei, melyeket az élelmiszeripar konzerválószerként, aromaanyagként, emulgeálószerként alkalmaz, továbbá a gyógyszeripar és kozmetikai ipar is felhasználja, valamint a biológiailag lebomló polimerek előállítása során is alapanyagként szolgál [Bousquet, 1999]. A tejsav mezőgazdasági termékek (főként a kukorica) biofinomítóban történő feldolgozása során kinyerhető vegyület. A tejsav egyik észtere az etillaktát, mely biológiai úton lebontható „zöld oldószer”, helyettesítheti a halogénezett és a toxikus kőolaj alapú oldószerek egy részét. A vegyiparban kénsavas katalizátorral történő szintézis során állítják elő [Pereira, 2009]. A tejsav egy különleges származéka a poli-tejsav, mely „zöld műanyagnak” is nevezhető, mivel mikroorganizmusok által bontható. A tejsav észterezési reakciói nagy érdeklődésnek örvendenek a tudományos világban, többek között azért, mivel ez egy hatékony tisztítási módszer, mellyel elválasztható a fermentáció során képződött más szerves savaktól. A fermentált tejsav tisztításához sokrétű tisztítási módszer szükséges, mely elkerülhető enzimes észterezési reakciók lejátszatásával. Ehhez a módszerhez olyan rövid szénláncú alkoholokat alkalmaznak, mint metanol, etanol, izopropanol és butanol [Data, 2006].

10

Az

ipari

folyamatok

átalakításához

biokatalizátorok

alkalmazhatók,

melyekkel

a

hagyományosan alkalmazott fém- vagy savkatalizátorok helyettesíthetők. Ezek segítségével az energiaszükséglet is csökken, mivel alacsonyabb hőmérsékleten is végbemegy a reakció. Esetünkben a lipázok a legalkalmasabb enzimek, melyek a hidrolázok csoportjába tartozó biokatalizátorok. Széles körben alkalmazzák őket a biotechnológiai folyamatokhoz, mint például gyógyszerek, mezőgazdasági vegyszerek előállításához [Jaeger, 1997]. Alkalmazásuk más szempontból is lényeges, mivel rendkívüli tulajdonságaiknak köszönhetően enantio-, regio- és kemoszelektív reakciók kivitelezésében is nagy szerepet játszanak [Jaeger, 2001]. A biotechnológiában való felhasználásukon kívül a mosószergyártásban, olajfinomításban, tejiparban és az orvosdiagnosztikában is elterjedt a használatuk. A fenti eljárások reakcióit képesek olyan nem konvencionális közegekben katalizálni, mint a szuperkritikus fluidumok, ionos folyadékok és különféle szerves oldószerek, de hagyományos vizes oldatokban is felhasználhatók. Az oldószerek tekintetében is változások figyelhetők meg. Az átalakítások során használt konvencionális oldószerek (hexán, fenol, tetrahidrofurán) olyan gyorsan párolgó vegyületek, melyek a környezetet is szennyezik, és az anyagveszteség is jelentős lehet, ha nem küszöbölik ki ezt a problémát. A kiküszöbölés nemcsak a jól tömített reaktorokra érthető, hanem az oldószerek kiváltására is, melyeket kevésbé illó vagy környezetre ártalmatlan anyagokkal lehet helyettesíteni. A helyettesítő oldószerek követelménye az is, hogy a környezetbe kerülve elkerülhető legyen a káros intermedierek képződése, vagy ne mérgezzék a környezeti egységeket, hanem biológiai úton lebonthatók legyenek. Doktori témámban vizsgált reakció a kémiai szintézissel előállított racém tejsav etanollal történő enantioszelektív észterezése, melyhez kétféle lipáz enzimet (Candida antarctica lipáz B, Candida rugosa) alkalmaztam különféle oldószerekben és reakciókörülmények között. A felhasznált oldószerek (ionos folyadékok, szuperkritikus CO 2) olyan környezetbarát vegyületek, melyeknek az a jellemzőjük, hogy összetételük vagy a reakciókörülmények változtatásával befolyásolhatók az oldószertulajdonságaik. Az említett reakció vizsgálata egy teljesen új terület, melyről még csak minimális irodalmi adat áll rendelkezésre. A kutatások célja az optimális reakciókörülmények meghatározása, melyek mellett a tejsav hozam és a képződött

észter

enantiomer

tisztasága

is

maximális

értéket

mutat.

A

számos

reakcióparaméter közül a hőmérséklet, a szubsztrátfelesleg és a kezdeti víztartalom hatásait vizsgáltam különböző nem konvencionális oldószerekben.

11

1. Irodalmi összefoglaló 1.1. A tejsav, mint megújuló nyersanyag Az elmúlt években a kőolajon alapuló nyersanyagok népszerűsége némileg csökkent, e helyett megnőtt a biológiailag megújítható anyagok iránti kereslet, így ma már a biobázisú anyagok jelentik a fenntartható gazdaság egyik fő pillérét. A természet évente 170 milliárd tonna biomasszát termel fotoszintézissel, melynek 75%-a a szénhidrátok közé tartozik, ám az emberiség ennek a mennyiségnek csupán a 3-4%-át használja fel. A szénhidrátok bőségesen rendelkezésre álló megújuló nyersanyagok, melyekre fontos nyersanyagként tekintenek a jövő zöld kémiájában. Ebben a jövőben a biofinomítók válhatnak az új bioipar pilléreivé, melyek működése hasonló a kőolaj finomítókéhoz, azzal a különbséggel, hogy biomasszából nyerik a nyersanyagokat, melyeket vegyszerekké, alapanyagokká, üzemanyagokká és energiává alakítanak át [Röper, 2002]. A tejsav (2-hidroxi-propionsav) egy fontos pontja a biológiailag megújítható forrásokon alapuló gazdaságnak. Olyan alfa-hidroxi-sav, mely hidroxil csoportot tartalmaz egy karboxil funkciós csoport szomszédságában. Két optikailag aktív konfigurációban létezik, az (L)- és a (D)-izomerek formájában [Holten, 1971]. A kémiai úton történő előállítás (1. ábra) nagy mennyiségű racém tejsavat termel [Kricheldorf, 1996], melyből az optikailag tiszta (L)-tejsav elválasztása gazdaságilag előnytelen. Következésképpen az (L)-tejsav előállítása nyereségesebb fermentáció útján. Bakteriális úton előállítható mind az (L)-, mind a (D)-izomer, az utóbbira viszont még nem létezik gazdaságos technológia. A leggyakoribb kereskedelmi tejsav polimer elsősorban (L)laktidot tartalmaz kis mennyiségű (D)- és mezo-laktid mellett, melynek szerepe a megfelelő rugalmasság és mechanikai szilárdság biztosítása [Corma Canos, 2007]. Ezért szükséges a két izomer külön-külön történő előállítása, hogy a polimerizációt megelőzően megfelelő arányt lehessen beállítani. Németh [Németh, 2011] régóta foglalkozik az (L)-tejsav előállításával, de a (D)-izomer bakteriális szintézisére is indított kutatásokat Lactobacillus coryniformis baktériumtörzs alkalmazásával. Mivel a (D)-tejsav előállítási technológiája még nem kiforrott, ezért a racém tejsav enantioszelektív észterezése során előállított (L)- és (D)-tejsav elegy szintézise egyszerűbbnek tűnik, mint a két izomer külön-külön történő fermentációja.

12

1. ábra: A tejsav kőölajból illetve megújuló nyersnyagokból történő előállításának lépései [Wee, 2006].

A tejsav legnagyobb mennyisége szénhidrátok fermentációjából származik, mint pl. glükózból (keményítőből), maltózból (specifikus enzimatikus keményítő átalakításból), szacharózból (szirupokból, gyümölcslevekből, melaszból) vagy laktózból (élesztővel) [Benninga, 1990; Corma Canos, 2007]. A tejsav fermentációs folyamatok osztályozása az alapján történik, hogy milyen baktériumtörzset alkalmaznak. A heterofermentatív módszerben 1 mol hexózból 1,8 molnál kisebb mennyiségű tejsav képződik, ezen felül jelentős mennyiségű metabolit, mint pl. ecetsav, etanol, glicerin, mannitol és szén-dioxid is keletkezik. A homofermentatív módszerben átlagosan 1,8 mol tejsav képződik 1 mol hexózból, és kis mennyiségű más metabolit termelődik. Mivel a második előállítási forma kevesebb mellékterméket és nagyobb tejsav hozamot eredményez, főként ezt használják az iparban [Kharas, 1994]. A fermentációs műveletekhez nagyrészt Lactobacilli nemzetséget alkalmaznak, mely nagy tejsav hozamot eredményez. Ha a tejsavat gyógyszerészetben vagy élelmiszeriparban használják fel, akkor desztilláció útján megtisztítandó. Előállításához alternatív nyersanyagokat is alkalmaznak. Az elmúlt években fűből is fermentáltak tejsavat [Thang, 2005], pl. Brandenburgban fűlével kevert hidrolizált gabonákból [Venus, 2007] vagy 2008-ban Utzenaichban fűsiló préslevéből tejsavat és aminosavakat választottak el [Mandl, 2010]. Jelenleg a kereskedelmi forgalomban lévő tejsavat glükóz fermentációjával állítják elő. A legfontosabb lépések egyike a termelésben a fermentlétől való elválasztás. A szeparációs és tisztítási lépések képviselik a teljes előállítási költség körülbelül 50%-át. A membrános szeparációban történt fejlesztések − különösen a 13

mikro- és ultraszűrésben valamint az elektrodialízisben − olyan eljárásokat hoztak létre, melyek csökkenthetik a tejsav előállítás költségeit [Wasewar, 2004]. Az éves termelés 350 ezer tonna körül mozog, és előreláthatóan évente 12-15% növekedéssel számolhatunk világszerte. A tejsav két funkciós csoportjának (hidroxil és karboxil csoport) köszönhetően intermolekuláris észterezés következik be 20 m/m%-osnál töményebb oldatában, mikoris lineáris dimerré és oligomer savakká alakul [Vu, 2005]. Egy 88%-os tejsav oldat 43,5 mol% monomert, 9,2 mol% dimert, 1,8 mol% trimert és kb. 45 mol% vizet tartalmaz. A 20 m/m%os vizes tejsav oldat csak monomerből és vízből áll, melyben az oldat monomer aránya 5,6 mol% [Asthana, 2006]. A savkoncentrációval együtt növekszik az önésztereződésre való hajlam is. Ez teszi bonyolulttá a reaktánsként való felhasználását pl. az etil-laktát szintézise során, mivel ha nagy a tejsav koncentráció, akkor az oligomerek aránya is magas lesz, melyek észterekké alakulnak, és szimultán hidrolizálódnak, átésztereződnek, ezzel egy olyan elegyet képezve, ami tartalmaz savat és észtert is monomer és oligomer formában is.

1.2. Tejsav származékai Számos olyan terméket származtatnak tejsavból, melyek vagy új vegyipari termékek vagy már létező vegyületek, és hagyományosan kőolajból állítják elő. Ezek közül talán a legérdekesebbek az akrilsav és a politejsav. Az előbbit polimer termékek nyersanyagaként használják felület bevonásnál, textíliáknál, ragasztóknál, papírkezelésnél, mosószereknél, szuperabszorbens anyagoknál; az utóbbit csomagolásnál, mezőgazdasági termékeknél, és széles körben gyógyításban, gyógyszerészetben és sebészetben [Xu, 2006; Fan, 2009]. Egy másik tejsavból előállítható vegyület a propilén-glikol, melyet pillanatnyilag nagyjából olyan áron állítanak elő tejsavból, mint kőolajból, de a nyersolaj árának emelkedésével és a tejsav előállítás továbbfejlesztésével gazdaságosabb lesz a biomassza alapú előállítása [Haveren, 2008]. 1.2.1. Politejsav A polilaktid (PLA) egy olyan polimer, mely tejsavból állítható elő. A PLA előállítása számos előnnyel jár: megújuló mezőgazdasági forrásból nyerhető, emiatt szén-dioxidot fogyaszt, energiatakarékos, újra felhasználható és komposztálható, a fizikai és mechanikai tulajdonságai pedig befolyásolhatók a polimer szerkezetével [Hiljanen-Vainio, 1996]. Széles körben tanulmányozzák az orvosi alkalmazhatóságát, mivel az emberi testben felszívódik, így varratok alapanyagaként használható [Tsuji, 2001]. Számításokkal is 14

igazolták, hogy a PLA csomagolóanyagként való felhasználása − műanyagpohár, fedőfólia, zöldségtároló [Hiljanen-Vainio, 1996] − gazdaságosan megvalósítható [Bogaert, 2000]. Általánosságban három módszer létezik nagy molekulatömegű (100000 Dalton) PLA előállítására: a direkt kondenzációs polimerizáció, az azeotróp dehidratációs kondenzáció és a laktid formáción át történő polimerizáció. A laktid formáción át történő polimerizációt a Cargill Inc. szabadalmaztatta 1992-ben [Drumright, 2000], és mindent összevetve ez a jelenlegi legjobb módszer PLA előállításra. A direkt kondenzációs polimerizáció a legkevésbé költséges módszer, annak ellenére, hogy nehéz kinyerni az oldószermentes, nagy molekulatömegű PLA-t. Itt a láncpárosító szerek és segédanyagok használata növeli a költségeket és a módszer bonyolultságát [Hyon, 1997]. 1.2.2. Etil-laktát Az etil-laktát egy egybázisú észter, mely ismert tejsav-etilészter néven is (IUPAC: etil-2hidroxipropanoát), molekulaképlete C5H10O3. Színtelen vagy halványsárga folyadék, mely a természetben kis mennyiségben is megtalálható olyan élelmiszerekben, mint a bor, csirke és számos gyümölcs. Felhasználható mint parfüm alkotóanyag, aromaanyag, gyógyszerészeti segédanyag, lágyítószer és környezetbarát oldószer, melynek hatékonysága hasonló a kőolajalapú oldószerekéhez [Weissermel, 1997]. A világon évente mintegy 15000 tonna oldószert állítanak elő, melyben az etil-laktát jelentős részt képvisel. Olyan vegyipari árucikknek tekintendő, mely egyre több figyelmet kapott az elmúlt években amiatt, hogy a tejsav és az etanol észterezési reakciója során állítják elő, ahol mindkét kiindulási reakciópartner biomasszából fermentálható, megújuló nyersanyag. Az etil-laktát előfordul levo (L) és dextro (D) formában, de a vegyiparban racém formában állítják elő egy reverzibilis folyamat során. Etil-laktát képzése, majd hidrolízise az egyik módszer a tiszta tejsav fermentléből történő kinyerésére [Barve, 2009; Inaba, 2009]. Weis és Visco [Weis, 2010] számítógépes molekulatervező programmal elemezték az etillaktátot, és megállapították, hogy a vegyület és annak előállítási folyamata esetén legalább 8 érvényesül a zöld kémia alapelvei közül: 1. Az etil-laktát előállítható megújuló nyersanyagokból, mely sokkal környezetbarátabb alternatíva, mint a petrolkémiai oldószerek alkalmazása (7. alapelv) 2. 100%-ban biodegradábilis, könnyű újra felhasználni, nem korrozív, nem karcinogén és nem ózonfogyasztó [Clark, 2006]. Az amerikai élelmiszer és gyógyszer igazgatóság jóváhagyta az élelmiszeripari felhasználását (3., 4., és 10. alapelv).

15

3. Etil-laktát előállítható heterogén katalízissel a reaktánsok feleslegének használata nélkül. Az ásványi sav katalizátorok helyettesítésével kiküszöbölhetjük a korrozív vegyületek használatát, és ezzel együtt elkerülhető azok semlegesítése is (1. és 9. alapelv). 4. Előállítható hibrid technológiákkal is, ahol a termék képzése és szeparációja egy egységben játszódik le, ezzel kiküszöbölve az oldószert, mely csökkenti a költségeket (kevesebb szeparációs egység szükséges), és így kevesebb energiát is igényel (5. és 6. alapelv). Az etil-laktát alkalmazási területei A legnépszerűbb zöld oldószerek a víz (vizes kétfázisú), a szuperkritikus CO 2 (scCO2) és az ionos folyadékok [Sheldon, 2005]. A növekvő érdeklődés ellenére kis figyelmet tulajdonítanak a bio-bázisú oldószereknek, mint a tejsavnak [Yang, 2012] és a laktátésztereknek [Aparicio, 2008], melyek közül legfontosabb az etil-laktát. Főként a bevonat iparban népszerű a nagy oldóképességének, magas forráspontjának, alacsony gőznyomásának és kis felületi feszültségének köszönhetően. Jól alkalmazható fa, polisztirén és fémek bevonásához, és nagyon hatásos festékek lehántásához vagy graffiti eltávolításához [Nikles, 2001], fémek felületének tisztításához, mivel hatékonyan távolítja el a zsírokat, olajokat, ragasztókat, továbbá képes eltávolítani a talajban lévő rézszennyezést [Pereira, 2011]. Olyan oldószereket is helyettesíthetünk vele, mint az n-metil-pirrolidin, a toluol, az aceton és a xilol, ezzel biztonságosabb munkakörnyezetet teremtve [Reisch, 2008]. Az oldószerek jelentős hányadát a gyógyászati szerek előállítási folyamataihoz használják, mivel e termékek közel 80%-ához szükséges oldószer felhasználása [Jiménez-González, 2004]. A fő szempont, hogy a szintetikus folyamatokat áttervezzék, azzal a céllal, hogy csökkentsék a felhasznált oldószerek mennyiségét, és helyüket nemtoxikus, veszélytelen anyagokkal váltsák fel, melyeket könnyű visszaforgatni és újra felhasználni. Ebből a szempontból

az

etil-laktát

a

gyógyszeriparban

is

használható

oldószerként/diszpergálószerként különféle biológiailag aktív szerekhez, anélkül, hogy a hatóanyag gyógyászati aktivitását befolyásolná [Pereira, 2011]. Használták már többek között aril-aldiminek [Bennett, 2009], szinparvolid B [Pereira, 2011] és vatiriol [Srinivas, 2010] zöld szintézisénél is. Az etil-laktát szintézise Az aromaésztereket karbonsavak és alkoholok reakciójával állítják elő. A reakció során képződött két termék az észter és a víz. Az észterek enzimatikus szintézisénél általánosságban négy fő paramétert kell szem előtt tartani: a megfelelő enzim használatát, a legmegfelelőbb 16

oldószer kiválasztását, a szubsztrátinhibíció elkerülését és a termékinhibíció kiküszöbölését. [Gubicza, 2000]. A laktátok előállításához általában homogén katalizátorokat használnak (foszforsav, kénsav és a vízmentes sósav). A heterogén katalizátorok (zeolit, ioncserélő gyanta) egyértelmű előnye, hogy azokat könnyebb elkülöníteni a reakcióelegytől, hosszú az élettartamuk, nagyobb terméktisztaság érhető el (a mellékreakciók elkerülhetők vagy kevésbé szignifikánssá tehetőek), és elkerülhető a korrozív környezet [Pereira, 2008]. Az etil-laktát hagyományos előállítási módja a tejsav etanollal történő észterezése, melyhez savkatalizátort használnak. Az etil-laktát szintézisével foglalkozó kinetikai tanulmányok közül néhányan 20 m/m%-os tejsav oldatot használtak azért, hogy elkerüljék az oligomerek képződését, de nagyobb koncentrációjú tejsav esetében is általában elhanyagolható az oligomerek jelenléte [Asthana, 2006]. Az észterezések autokatalitikus reakciók, mivel a parciálisan disszociált karbonsavból felszabadult hidrogén-kation szolgál katalizátorként a reakciónál. Ennek ellenére egy megfelelő katalizátor használata kézenfekvőbb a reakciósebesség növeléséhez, mert az autokatalizált reakció kinetikája rendkívül lassú, a sebessége a karboxil csoport autoprotolízisétől függ. Például a tejsav savassági állandója 25 °C-on pKa=3,86, ezért egy 85%-os (kb 10,8 M) vizes tejsav oldat pH-ja 1,4. Ipari etil-laktát előállítási módszerek Számos szabadalmaztatott etil-laktát előállítási technológia létezik, de a legtöbb közülük a tejsav etanollal történő egyensúlyi észterezése, melyet követően a terméket desztillációval eltávolítják a reakcióelegytől. Ahhoz, hogy túllépjék az egyensúlyi pontot, etanolfelesleget alkalmaznak erős savkatalizátor mellett, mely leggyakrabban foszforsav [Pereira, 2011]. Egy francia vegyipari cég, az Arkema fejlesztett ki két szabadalmaztatott eljárást az etil-laktát folyamatos észterezéssel történő előállítására, ahol a tejsav és etanol közötti reakció katalizátoraként kénsavat használt. Az első lényege, hogy a tejsav részleges átalakulási fokánál a reakcióközegből egy etil-laktátot, etanolt, vizet és különféle nagy móltömegű terméket tartalmazó elegyet extrahálnak, majd az elegyet betáplálják egy csökkentett nyomású desztilláló egységbe, melynek a fejterméke egy etil-laktát, etanol és víz elegy, melyet desztillációval történő frakcionálásnak vetnek alá. A másik eljárás során a reakcióelegyből egy közel azeotróp víz-etanol gázelegyet extrahálnak ki, majd ezt molekulaszűrőn víztelenítik, így két áram jön létre: egy gázfázisú etanol áram, melyet a reakcióelegybe recirkuláltatnak, és egy víz-etanol elegy áram, ami egy desztilláló oszlopra kerül. Az első 17

eljárásnál 95%-osnál nagyobb terméktisztaságot értek el 2,5-szörös moláris etanolfelesleggel 80 °C-on, ahol a szeparátort 85 °C-on és 50 mbar-on üzemeltették (a frakcionáló fej- és fenékhőmérséklete 77,2 °C illetve 155 °C), mialatt a második eljárással 97%-nál nagyobb tisztaságot valósítottak meg [Pereira, 2011]. A hatásfok javítása érdekében alkalmazhatnak multifunkcionális reaktorokat, melyekben a reakció és a szeparáció egy egységben megy végbe, ahonnan az egyik terméket folyamatosan el lehet távolítani. A limitáló termék (víz) eltávolításával növelhető a hozam és a terméktisztaság. Szeparációhoz membrán reaktort, reaktív desztillációt és kromatográfiás reaktorokat is tanulmányoztak.

1.3. Enzimatikus reakciók 1.3.1. Tejsav enzimes észterezéséhez alkalmazott lipázok Az enzimkatalitikus eljárások alkalmazása nemcsak a hulladékproblémára ad megoldást, hanem energiatakarékos, és kevesebb nyersanyagot is igényel, ezáltal környezetbarát megoldásnak számít [Dunn, 2010]. A biokatalizátorok használata az ősi időkre nyúlik vissza, de tudatosan csak a 20. század elejétől használták őket, az 1930-as évektől pedig már az ipari termelésben is szerepet kaptak [Liese, 2006]. Az enzim felhasználáson alapuló biotechnológiai alkalmazások száma egyre növekszik, az alkalmazás pedig a speciális vegyületek szintézisétől egészen a tömegtermelési méretekig kiterjed [Straathof, 2002; Schmid, 2001]. Az ipari méretű biotechnológiai megvalósítások fő hajtóereje a főként gyógyszerészeti ágazatokban szükséges enantioszelektivitás és funkcionalitás, valamint a technológiai fejlődés és a fenntarthatóság igénye [Meyer, 2009]. Néhány szempont, hogy miért is előnyös a biotechnológia a kémia fenntarthatóságára nézve, és a biokatalizátorok miért nevezhetők zöld technológiai alkalmazásnak [Buchholz, 2005; Rozzell, 1999; Ghisalba, 2010; Wohlgemuth, 2010 a; Wohlgemuth, 2010 a]: Az enzimek nemtoxikus katalizátorként működnek. Nagy szelektivitásúak és nagytisztaságú terméket produkálnak. Alkalmazásukkal csökken a hulladék mennyisége. Mérsékelt működési körülmények mellett (hőmérséklet, nyomás, pH) csökken az energiafelhasználás. A biotranszformációk során főként vizes közeget alkalmaznak, mely nem minősül toxikusnak. 18

A biokatalízis alkalmazása csökkenti az előállítás idejét a nemkatalitikus reakcióhoz képest. Elkerülhető a nehézfémek és a szerves oldószerek használata. Természetes katalizátorok lévén úgy tekinthetők, mint megújuló forrásból előállított anyagok. A tejsav észterezéshez használt biokatalizátorok a lipázok. A lipázok közös jellemzője, hogy aktív helyük három aminosavból épül fel: szerinből, aszparaginsavból vagy glutaminsavból és hisztidinből, melyeket katalitikus triádnak is neveznek [Ghanem, 2007]. A lipázok mindenütt jelen lévő enzimek, melyek a szerin hidrolázok családjába tartoznak. Megtalálhatók állatokban, növényekben, gombákban és baktériumokban [Beisson, 2000]. Az enzimeket általában arról a reakciótípusról nevezik el, amelyet katalizálnak, ezért a lipázokat hivatalosan karboxilészterázoknak nevezik, melyek hosszú szénláncú acil-glicerinek reakcióit katalizálják, más szavakkal: zsírhasító, erjesztő anyagok. Ezek alapján nevezik őket triglicerid hidrolázoknak is [Ghanem, 2007]. Mivel a szerin hidrolázok csoportjába tartoznak, és nincs szükségük kofaktorokra, használhatók szabad vagy immobilizált állapotban is. A lipid-víz határfelületen fejtik ki hatásukat, ezért nem vízoldható szubsztrátok katalízisét is elvégzik. A többi hidrolitikus enzimtől az a tulajdonságuk különbözteti meg őket, hogy hidrofób közegben is aktívak. A szerves szintézisekben mérsékelt körülmények között alkalmazhatók (szobahőmérsékleten, semleges körüli pH-n) [Schoffers, 1996]. Az említett hasznos tulajdonságaik mellett a lipázok a többi enzimhez hasonlóan környezetbarátnak minősülnek és biológiai úton lebonthatók [Ghanem, 2007]. A Candida antarctica lipáz B (CALB) a leggyakrabban használt enzim a lipázok közül. A Candida antarctica gombából két fajta lipáz nyerhető ki: a CALA és a CALB, melyek eltérő tulajdonságokkal rendelkeznek [Kirk, 2002]. A CALB-ra jellemző reakciók az észterek, tioészterek, fehérjék, epoxidok, alkil-halogenidek hidrolízise és a

hidroxil-nitrilek

szénkötéseinek hasítása [Ollis, 1992]. Aktív centrumában katalitikus triádként Ser105His224-Asp187 található, ahol egy sztereospecifikus zseb is helyet kap, mely a nagy enantioszelektivitásért felelős. Mivel a másodrendű alkoholok ezt a zsebet csak bizonyos konformációval tudják megközelíteni, a reakciók során főként (R)-izomer képződik [Magnusson, 2005]. A Candida rugosa enzimet, melyet az azonos nevű élesztőgomba termel, az 1960-as években izolálták talajból. Eme enzimnek a természetben katalizált reakciói a nagy szénatom számú 19

zsírsavak glicerinnel képzett észtereinek reverzibilis lebontása. Az aktív centrumban Ser209His449-Glu341 található. Az aktív centrum mellett fontos egység az oxoanion gödör, mely aminosavainak

NH-csoportjai

stabilizálják

az

acil-donor

szubsztrátmolekula

karboxilcsoportjának oxoanionját azáltal, hogy H-híd kötést alakítanak ki vele [Gubicza, 2008 b]. 1.3.2. Tejsav enzimes észterezése Tejsav lipázos észterezését Rhizomucor miehei (Lipozyme IM20) lipázzal és sertés hasnyálmirigyből kinyert lipáz enzimmel Kiran és Divakar [Kiran, 2001] végezték el. A reakciók rázatott lombikos kivitelben és laborméretben is megtörténtek. Az optimális reakciókörülmények megismeréséhez olyan paramétereket vizsgáltak, mint az oldószer, a hőmérséklet, a szubsztrát és az enzim koncentráció, a puffer mennyiségének hatása, a víz mennyisége. A rázatott lombikos kísérletek során az etil-metil-keton bizonyult a leghatásosabb oldószernek, a laborméretű reakciókban pedig a kloroform. Palmitinsavval és sztearinsavval részletes kísérletek történtek, ahol a rázatott lombikos kísérletek 37,5% és 40%-os hozamot mutattak Lypozyme IM20 enzim mellett, mialatt a laborméretű kísérletek során 85,1% illetve 99%-os hozam mutatkozott. A C2-től C18-ig felhasznált savak közül csak a laurinsavas, a palmitinsavas és a sztearinsavas kísérletek mutattak 50% feletti hozamot. Torres és Otero [Torres, 2001] 4 féle lipáz enzimmel (CALB, Lypozyme, Candida rugosa, Pseudomonas sp.) és különböző zsírsavakkal vizsgálták a tejsav észterezésének körülményeit. Kísérleteik alapján megállapították, hogy CALB enzimmel érhető el a legnagyobb hozam, ezért ezzel végezték a további reakciókat. Vizsgálták, hogy n-hexán, aceton, dioxán, acetonitril és oldószermentes közegben milyen észterhozam érhető el. Számításaik szerint a felhasznált tejsav monomer tartalma 68% volt. (Az észterhozamot a bemért tejsav elegyből számolták, nem a monomer mennyiségéből.) Megállapították, hogy kaprilsavval történő észterezés esetén n-hexán közegében mutatkozott a legnagyobb hozam, mely 4 nap alatt 30%os volt. A továbbiakban vizsgálták a tejsav : zsírsav arányának hatását 60 °C-os reakcióhőmérsékleten. A tejsav mennyiségét konstans értéken tartották (35 mg/0,38 mmol), míg a kaprilsav mennyiségét 10-szeres feleslegig növelték. Kimutatták, hogy a hozam a zsírsav mennyiségének emelésével 55%-ra növekedett, de a savmennyiség 10-szeres érték feletti növelése nem eredményezett további hozamnövekedést. Kaprilsav, laurinsav és palmitinsav összehasonlításakor megállapították, hogy a reakciók hozama közel azonos volt. Hasegawa és társai [Hasegawa, 2008] Novozym 435 mellett vizsgálták az etanollal történő tejsav észterezést. A reakcióelegyek meghatározott mennyiségű tejsavat, etanolt (1 : 1 illetve 20

1 : 2 arányban) és szerves oldószereket tartalmaztak 1 ml teljes elegytérfogatban. Az enzimet 1 mg/ml koncentrációban adták a reakcióelegyhez, melyet 30 °C-on, 24 óráig reagáltattak rázógépen 100 rpm intenzitáson. A reakciót n-hexánban, oldószermentes közegben, éterekben és ketonokban vizsgálták. Az oldószermentes vizsgálatoknál további hozzáadott etanollal pótolták a szerves oldószert. n-Hexán esetében a rendszer kétfázisú volt, melyben nagyon alacsony hozamot figyeltek meg. A tejsav mennyiségének növekedésével még inkább csökkent az észterhozam, valószínűleg a megnövekedett sav-inhibíciónak köszönhetően, mely az elegy poláris fázisában erősebben hatott. Oldószermentes közegben az elegy egyfázisú volt, és nagyobb hozamot mutatott, mint n-hexánban, de az észterhozam 1 mol/dm3-es tejsav koncentrációnál elkezdett csökkenni, mely ugyancsak a sav inhibíciójának tudható be. Az etanol mennyiségének növelése hozamnövekedést eredményezett, mivel reakciópartner lévén megváltoztatta a reakció egyensúlyát. Éterekben és ketonokban is sikerrel hajtották végre az észterezést, és azt figyelték meg, hogy az enzim 2 mol/dm3-es tejsav koncentrációnál, és valamelyest felette, mutatja a maximális észterhozamot. A di-izopropil-éter és a di-n-propilketon esetében ekvimoláris tejsav-etanol aránynál mutatkoztak a legjobb hozamok. 1.3.2. Enantioszelektivitás A kinetikai rezolválás a IUPAC megfogalmazása szerint a következő: Ha egy reakció sebessége az egyik enantiomer esetében lényegesen eltérő a másik enantiomerétől, akkor az egyik sztereoizomer túlsúlyát kapjuk. A rezolválás az enantiomerek szétválasztását jelenti. A kinetikai rezolválás lehet részleges vagy teljes, mely a racém elegyben lévő enantiomerek egyenlőtlen reakciósebességéből adódóan valósítható meg. A két enantiomer eltérő reakciósebessége egy királis reakciópartnernek köszönhető, pl. katalizátor, oldószer, stb. [Moss, 1996]. A kinetikai rezolválás legegyszerűbb esetében a szubsztrát enantiomerek egy királis reagenssel vagy katalizátorral lépnek reakcióba, mely során két diasztereomer átalakulás játszódik le. Ezen versengő átalakulási állapotok szabadentalpiája befolyásolja a lassan és gyorsan reagáló komponens sebességi állandóját, ahol a k gyors/klassú határozza meg a termékek arányát. A lipázokkal történő kinetikai rezolválást Dalkin [Dalkin, 1903] vizsgálta elsőként. Ő sertésmájból kivont lipázzal végezte a racém etil-mandalát hidrolízisét. Eredményei megmutatták, hogy az enzimek nem tökéletesen enantioszelektívek, ezért számításba kell venni a relatív reakciókészséget és a konverzió mértékét is. A racém elegyekből enantiomer tiszta termék előállításához a hagyományos módszer a kinetikai rezolválás, ám ennek van egy lényeges korlátja. Még ideális esetben is meg kell 21

állítani a reakciót 50%-os konverziónál, mikor az összes reaktív enantiomer termékké alakult, vagyis mikor az enantiomer tiszta termék konverziója megtörtént. Sok esetben a konverzió még nem éri el az 50%-ot, de a reakciót mégis le kell állítani kisebb konverziónál, vagy amikor a két enantiomer reakciósebességének különbsége már nem elég nagy ahhoz, hogy megfelelő enantioszelektivitást biztosítson. Ezen felül az el nem reagált komponensek közül történő termékelválasztás is további problémákat vet fel. Az el nem reagált összetevők problémájára több megoldás is létezik: pl. prokirális szubsztrátok vagy mezo vegyületek használatával [Schoffers, 1996], a nemkívánt enantiomer sztereokémiájának megfordításával (sztereoinverzió)

[Stecher,

1997],

a

visszamaradt

szubsztrát

racemizáció

utáni

visszaforgatásával vagy dinamikus kinetikai rezolválással. A legutóbbi eljárásban a nemkívánt enantiomereket in situ racemizálják, és folyamatosan termékké alakítják [Dijksman, 2002]. A kinetikai rezolválás és a dinamikus kinetikai rezolválás (2. ábra) esetében egyaránt a gyorsabban reagáló (R)-szubsztrát (R)-termékké alakul. Az egyetlen különbség a két eljárás között az, hogy hagyományos esetben a lassan reagáló (S)-szubsztrát visszamarad el nem reagált komponensként, míg dinamikus rezolválás esetében az (S)-szubsztrát folyamatosan racemizálódik, így az (R)- és (S)-szubsztrát ismét egyensúlyba kerül. Ez teszi lehetővé, hogy a minden kiindulási anyag (R)-termékké alakuljon [Dijksman, 2002].

2. ábra: A kinetikai és dinamikus kinetikai rezolválás folyamata [Dijksman, 2002].

Kazlauskas és társai [Kazlauskas, 1991] elmélete szerint minden lipáznak ugyanolyan affinitása

van bizonyos

szubsztrátokhoz,

de más enantioszelektivitással.

Ennek

magyarázatára dolgozott ki egy modellt, melyben kifejti, hogy minden lipáz két különböző méretű „zsebbel” rendelkezik, egy nagy és egy kisméretűvel. A szubsztrátokra kifejtett enantioszelektivitás az alkoholok kisebb és nagyobb szubsztituenséből származik. A gyorsan reagáló enantiomer a 3. ábra bal oldalán mutatott aktív helyhez kapcsolódik. Ha a másik 22

enantiomer lép reakcióba a lipázzal, akkor arra van kényszerítve, hogy a nagyobb szubsztituenst illessze a kisebbik zsebbe (3. ábra jobb oldal). Ez alapján a szubsztituens és a zseb közötti sztérikus taszítás megrepeszti a katalitikus triádot, mellyel magyarázható az alacsonyabb reakciósebesség. A reakció irányától függetlenül, vagyis észterezés és hidrolízis esetén is az (R)-enantiomer reagál gyorsabban.

3. ábra: A gyorsan (bal) és lassan reagáló (jobb) enantiomerek kapcsolódása az enzim „zsebeihez” [Kazlauskas, 1991].

Chen és munkatársai alkottak modellt és írták le kvantitatív módszerekkel az irreverzibilis [Chen, 1982] és reverzibilis [Chen, 1987] enantioszelektív reakciókat. Összekapcsolták a reakciók három kulcsparaméterét: a racém szubsztrát konverziójának mértékét (c); az optikai tisztaságot; melyet enantiomerfeleslegben fejezünk ki (ee) a termékre vagy a fennmaradó szubsztrátra nézve; és az enantiomer arányt (E). Egy irreverzibilis reakció esetén A és B a gyorsan és a lassan reagáló enantiomerek, melyek az enzimnek ugyanazon helyéhez kapcsolódnak. Egy egyszerű háromlépéses kinetikus mechanizmushoz

felírtak egy egyenletet,

ahol a reakció

irreverzibilis

és

nincs

termékinhibíció: (1)

(2)

(3) c

1

ee( P)

A A0

B B0

(4)

P Q P Q

(5)

23

ahol kx: reakciósebességi állandó c: a konverzió mértéke ee(P): a termék enantiomerfeleslege Va/Vb: reakciósebesség A/B enantiomerre Ka/Kb: A/B enantiomer egyensúlyi állandója A/B: A/B enantiomer koncentrációja A0/B0: A/B enantiomer kezdeti koncentrációja P/Q: P/Q termék koncentrációja

Reverzibilis rendszereknél az enzimes rezolválás kinetikájában a következő figyelhető meg: a reakció kezdeti szakaszában az enzim kedvezően támadja a gyorsan reagáló (A) enantiomert és termékké (P) alakítja. A nagy enantiospecifikusság a két versengő reakció nagy nettó sebességkülönbségéből adódik. Ahogy a gyorsan reagáló komponens megközelíti az egyensúlyi állapotot, a nettó sebesség fokozatosan csökken, mialatt a lassan reagáló (B) enantiomer átalakulása is elkezdődik. Mikor a gyorsan reagáló komponens egyensúlya beáll (sebesség=0), a visszamaradt szubsztrát (eeS) és a képződött termék (eeP) optikai tisztasága elkezd esni a lassan reagáló komponens koncentrációjának növekedésének köszönhetően. A megfigyeléseket a következő egyenletekkel írták le: (6)

(7) K

A P

B Q

(8) (9)

Enantiomerek enzimes kinetikai rezolválása során, ha a két versengő reakció irreverzibilis, akkor a szubsztrát és termék optikai tisztasága a konverzió mértékétől (c) és az enantiomer aránytól (E) függ. Azonban reverzibilis biokatalitikus rendszereknél az eeS és eeP (a c-n és En kívül) a K egyensúlyi állandótól is függ. Végső soron a visszamaradó szubsztrát nagy optikai tisztasága (eeS>=0,98) nem valósítható meg 50%-on túlmenő konverzióval. A 4. ábrán látható grafikus ábrázolások lehetővé teszik E és K érték meghatározása után, hogy precízen megbecsüljük, mikor állítsuk meg a kinetikus rezolválást ahhoz, hogy maximáljuk a kémiai és 24

optikai hozamot. A rezolválás befejezésének optimális időpontját akkor érjük el, ha a gyorsan reagáló enantiomer eléri az egyensúlyt. Kézenfekvő, hogy magas enantiospecifikus észterezés végrehajtásához elengedhetetlen, hogy a víztartalmat a szerves közegben minimális értéken tartsuk, hogy elkerüljük a reverz hidrolitikus folyamatot [Chen, 1987]. A kinetikus rezolválás során keletkezett termékek (P>Q) hidrolizálhatók, mellyel visszanyerjük a kiindulási A és B komponenst. A kinyert frakció optikai tisztasága további reakcióban növelhető az első reakcióban használt reakciókörülmények mellett. A visszaforgatásos kísérletekben az ee0

(a kiindulási komponensekre

vonatkoztatott

enantiomerfelesleg) értéke nagyobb 0-nál.

4. ábra: Enantiomerfelesleg a konverzió függévényében különböző E és K értékeknél (E: 1 (1000, 2 (100), 3 (10), K: a (0), b (0,1), c (0,5), d (1), e (5)) [Chen, 1987].

Az enantioszelektivitás mérésére különböző módszereket használnak. A leggyakoribb technika egy racém szubsztrát elegy reakciójának vizsgálata, ahol a reakció hozamát és a szubsztrát vagy termék enantiomerfeleslegét mérik meghatározott reakcióidő után [Chen, 1982; Chen, 1987]. Az E érték feltételezhetően konstans a reakció lefutása alatt, de vannak utalások arra, hogy ez nem mindig igaz. Ennek a viselkedésnek a fő oka a reakció reverzibilitása, mely az idővel csökkenti az enantioszelektivitást. Egy másik módszer az 25

enantioszelektivitás meghatározására a két enantiomer specificitási konstansa arányának számolása két különálló reakcióban [Wehtje, 1997]. A harmadik módszer szerint az enzim aktivitásának mérésére különböző enantiomer arányú szubsztrátokkal lehetséges [Högberg, 1993]. A két utóbbi technika az egyik enantiomer tiszta formáját igényli. 1.3.3. Enantioszelektív reakciók A sztereoszelektivitást az egyes enantiomerek előállítása során használják ki, mely egyre fontosabbá válik a gyógyszeriparban és az agrokémiai iparban. Főként azért van szükség az enantioszelektív módszerekre, mivel csak az egyik enantiomer rendelkezik a kívánt hatással, míg a másik hatástalan vagy nem kívánt mellékreakciókat okoz. A sztereoszelektív reakciókban a leggyakrabban használt enzimek a lipázok. Ezek a reakciók olyan

paraméterektől

függhetnek,

mint

pl.

az

enantiotrópok

és

enantiomerek

differenciálódása, a szubsztrátok típusa, a szubsztrát és az enzim biokémiai kölcsönhatása, a szubsztrátok sztérikus interakciója, két különböző szubsztrát versengése, a sztereoszelektív reakció aktív helyének természete és elérhetősége, víz jelenléte és az oldószerek természete [Fan, 2010]. A számos reakciókörülmény közül elengedhetetlen a reakcióközeg vizsgálata. Ezek lehetnek vizes közegek, szerves oldószerek, kétfázisú rendszerek, melyek nagyban befolyásolhatják az enantioszelektivitást. Számos kutató alkalmazza az oldószermérnökség tudományát [Rotticci, 2000]. Azt is bebizonyították, hogy a CALB és Pseudomonas cepacia enzimek enantioszelektivitása számos szekunder alkohol esetében lényegesen növelhető ionos folyadék jelenlétében [Bornscheuer, 2002]. A hőmérséklet bizonyítottan hatással van az enantioszelektivitásra, és a kinetikai rezolválás során a következő egyenlet érvényes [Rotticci, 2000]: ln E

S# R

H# RT

(10)

R – egyetemes gázállandó (8,314 J/mol/K) T – hőmérséklet (°C) H# – standard entalpiaváltozás S# – standard entrópiaváltozás

Az enantioszelektivitás csökkenhet vagy növekedhet is a hőmérséklet függvényében az entrópia és az entalpia hatásaként. A legtöbb reakcióban a hőmérséklet csökkenésével fordított arányosságban növekszik az enantioszelektivitás [Rotticci, 2000]. Persson és társai [Persson, 2002] a 2-fenil-propionsav 1-heptanollal történő észterezése során kimutatták, hogy 26

más vizsgált lipázokhoz képest (Rhizopus oryzae, Candida rugosa, Rhizomucor miehei) a CALB az (R)-enantiomert részesíti előnyben, valamint az E-érték a többi esethez képest növekedés helyett csökkent a hőmérséklet csökkenésével. Ez azt jelenti, hogy mind a 4 fajta vizsgált lipáz enzim esetében a hőmérséklet csökkenése az (S)-enantiomer felé tolta el az enantiomer arányt. A szubsztrátok koncentrációja is nagyban befolyásolja az enantioszelektivitást, pl. lipázos észterezés esetében ez az egyensúlyi ponttól való távolság. Az enzim a termékképződés és a hidrolízis során is ugyanazt az enantiomert részesíti előnyben. Ha az egyensúlyi pontot a termékképzés irányába toljuk el, az a konverziót és az enantioszelektivitást is növeli. Ilyenkor viszont az alkohol inhibícióval kell számolni. Kisebb alkohol mennyiségek alkalmazásánál minden esetben nagyobb volt az enantioszelektivitás [Berglund, 2001]. Az oldószer víztartalma gyakran befolyásolja a reakciósebességet és az enantioszelektivitást is.

A

nagyszámú

vizsgálat

ellenére

nem

létezik

általános

szabály

az

enzim

enantioszelektivitásának optimalizálásához. Ez valószínűleg a természetben előforduló számos enzimtípusnak köszönhető, de ugyanez elmondható enzimtípusokon belülre is [Rotticci, 2000]. Az enzim hidratáltsága nagyban meghatározza a protein rugalmasságát és ez által a katalitikus aktivitását. Az alacsony hidratáltság kevésbé rugalmas enzimhez vezet, mely általában kevésbé aktív. Néhány tanulmány szerint a rugalmas enzimnek kisebb lehetősége van a két enantiomer között választani. Ennek ellenére, ha a merevebb enzim kevésbé tudna idomulni a gyorsabban reagáló enantiomerhez, mint a lassúhoz, akkor alacsony hidratáltsági foknál elvesztené az enantioszelektivitását. Tanulmányok igazolják, hogy a növekvő víztartalom növeli az enantioszelektivitást [Kitaguchi, 1990], de néhány esetben csökken [Bodnár, 1990], vagy épp semmi hatása nincs a víz hozzáadásának [Bovara, 1993], de e kísérletek mindegyikét más típusú enzimmel és szubsztráttal végezték. Persson és társai [Persson, 2002] kísérleteket végeztek a víztartalom szerepének vizsgálatára, ahol 4 féle lipáz enzimet használtak a 2-fenil-propionsav heptanollal történő észterezésénél. Megállapították, hogy a lipázok többségének enantioszelektivitására nem volt hatással a víztartalom. Az egyetlen kivétel az egyik fajta Candida rugosa volt, mely esetében az enantioszelektivitás csökkent a vízaktivitás növekedésével. A vinil-butirát 1-butanollal történő észterezését vizsgálták Lozano és társai [Lozano, 2002] CALB enzimet felhasználva. Az enzim vizes oldatát [EMIM][NTf2] ionos folyadékban feloldották, a reakciót pedig különböző hőmérsékleteken scCO2-ban játszatták le. Kimutatták, hogy az alacsony víztartalomnak (<4 m/m%) köszönhetően nagy szelektivitás mutatkozott (>95%). Az enantioszelektivitást ezen

27

felül előnyösen befolyásolta még a hőmérséklet emelése. 40-ről 100 °C-ra emelve a reakció hőmérsékletét a szelektivitás 96%-ról 99%-ra emelkedett. Végső soron megállapítható, hogy az előbb említett két paraméter hatásai nem egyértelműek, ezért az enantioszelektivitásra gyakorolt hatásukat nem tudjuk biztosan megjósolni. Számos tanulmány foglalkozik az enzimes úton történő aszimmetrikus észterezési reakciókkal. Ilyen például a (±)-mentol enantioszelektív észterezése [Zhang, 2008], a (D,L)fenilglicin-metil-észter hidrolízise [Lou, 2006], a racém ibuprofén észterezése [Ikeda, 2002]. Tejsav enzimatikus enantioszelektív észterezésével alig néhányan foglalkoztak, viszont a tejsavhoz hasonló, egy funkciós csoportban különböző molekula, a 2-klór-propionsav rezolválását vizsgálták Bodnár és munkatársai [Bodnár, 1990]. Ez a vegyület a herbicid gyártásban jelentős vegyület, de csak az (R)-enantiomer bizonyult hatásosnak. A reakciók során az oldószer-polaritás, a sav : alkohol mólarány, az alkohol szerkezet, a hőmérséklet és a reakcióelegy víztartalmának hatását vizsgálták Candida rugosa enzim használata esetén. A reakcióelegy 0,01 mol racém savat, 0,06 mol alkoholt és 50-100 cm3 vízmentes oldószert tartalmazott, melyhez 0-200 mg vizet adtak. Az oldószer vizsgálata során kiderült, hogy a legnagyobb, közel 80%-os konverziót az 1-butanollal való észterezés során n-hexán és metilciklohexán közegében érték el, 6 óra reakcióidő után. Az enantioszelektivitás kevéssé függött az oldószerektől, 42%-os konverziónál 62% és 74% közötti enantiomerfelesleg értékeket mértek. A víztartalom vizsgálatakor kimutatták, hogy a konverzió kisebb víztartalom esetén (0,25 m/m%) mutatta a maximumot. A termék enantiomer tisztasága 0,4 m/m% kezdeti víztartalom felett kezdett el csökkenni. Végeztek kísérleteket különböző szénlánc hosszúságú alkoholokkal, C8-ig, de metanollal és etanollal nem játszódott le észterezés. Kimutatták, hogy a legnagyobb hozamot 1-butanollal lehet elérni. Enantioszelektivitás szempontjából szintén az 1-butanol esetében mérték a legnagyobb értékeket (e.e.=74%, y=42%), de az 1- és 2-propanol is közel 70%-os enantiomerfelesleg értékeket hozott. Vizsgálták továbbá a sav : alkohol mólarányt, ahol az értékeket 1 : 1 és 1 : 10 tartományban változtatták. Az alkohol kis feleslege a reakciót lassúvá tette, de a felesleg növelése a reakciósebességet is növelte, a maximumot pedig 1 : 6 aránynál érte el. Az arány további növelésével a hozam csökkenni kezdett, viszont az enantiomer tisztaság ekkor érte el a maximumát. Ennek magyarázata az lehet, hogy az alkoholfelesleg növelése megváltoztatja a víz eloszlását a folyadék és szilárd (enzim) fázis között, így a növekvő alkohol mennyiség a folyadék fázisban csökkenti az enzim vízburkát. A hőmérséklet vizsgálata során 20 és 50 °C közötti értékeken mozogtak. A hozam 30 °C-on volt a legnagyobb.

28

Ulbert és munkatársai [Ulbert, 2004] a 2-szubsztituált-propionsavat szelektíven észterezték butanollal Candida rugosa enzim segítségével. A reakcióközegek n-hexán és [BMIM]PF6 ionos folyadék voltak. Sikeres enantioszelektív észterezést hajtottak végre klór, bróm, metoxi, etoxi, propoxi, izopropoxi és fenoxi szubsztituens esetében. A legnagyobb hozamot a 2-klórpropionsavval érték el, és az enantioszelektivitás is ennél a savnál érte el a legnagyobb értékeket. 1.3.4. Tejsav enantioszelektív reakciói A tejsav enzimes rezolválását alig néhány szerző vizsgálta. Torres és Otero [Torres, 2001], akik

kaprilsavval

történő

enzimes

észterezés

során

Novozym

435-tel

végeztek

enantioszelektív kísérleteket. Az észterezési reakciókat 4-szeres alkoholfeleslegben hajtották végre, ahol D25=224,2 és 223,5 forgatóképességet mértek. A lipáz 35% körüli hozamot mutatott (moláris arányokkal számolva) a tejsav enantiomerre nézve, mely igen jó eredménynek számít, tekintve, hogy a bemért tejsav elegy monomer tartalma 68%-os volt. Inaba és munkatársai vizsgálták CALB enzim jelenlétében az (L)-, (D)- és (D,L)-tejsav észterezését etanollal [Inaba, 2009]. A reakcióelegy 50 mg enzimet, 500 mM etanolt, 10 mM (L)-, (D)- és (D,L)-tejsavat tartalmazott vízzel telített heptánban, 50 °C-on. Az (L)-, (D)-tejsav kezdeti reakciósebessége közel ugyanaz volt, de az észter szintézis hatásfoka a (D)-tejsavra nézve nagyobb volt. A reakció nem volt kivitelezhető vízmentes oldószerben, mivel a tejsav nem oldódott vízmentes heptánban. Etanol feleslegének alkalmazásakor a reakciósebesség megnőtt, savfeleslegben pedig csökkent. A reakció hőmérsékletfüggése megmutatkozik abban, hogy 30 °C-on volt a legkisebb, 50 °C-on pedig a legnagyobb a konverzió. Oldószermentes közegben, alkohol feleslegében a konverzió elmaradt a vizes heptánban mértekhez képest, mely az alkohol inhibíciónak tudható be. A tejsav kinetikus rezolválását Ohara és társai vizsgálták. Munkájukban [Ohara, 2011] a butil(L)- és (D)-laktát optikai rezolválását immobilizált lipáz enzimmel végezték. A kísérlet során Novozym 435 (0,2 g) jelenlétében 2 g butil-(D,L)-laktátot reagáltattak, 80 °C-on. Folyamatos keverés mellett a butil-(D)-laktát oligomerizációja végbement, a butil-(L)-laktát viszont nem lépett reakcióba. Az enzimes reakció után a reakcióelegy 90,4% butil-(L)-laktátot és 9,6% butil-(D)-laktátot tartalmazott. A reakcióidő növelésével a butil-(L)-laktát tisztasága 95,2%-ra, majd 98,3-ra növekedett a reakcióelegyben 48 illetve 72 óra után. Az elegyből a nem kívánt reagensek eltávolításához 110 °C-on desztillációt alkalmaztak, és fokozatosan 30-ról 1 Hgmm-es vákuum alá helyezték. Az elvégzett kísérletek folyamatát az 5. ábra szemlélteti.

29

5. ábra: A butil-(D,L)-laktát enantioszelektív oligomerizációjának folyamata [Ohara, 2011]

1.4. Enzimkatalízis nem konvencionális közegekben 1.4.1. Ionos folyadékok jellemzése Az ionos folyadékok olyan sók, melyek szobahőmérsékleten folyékony halmazállapotúak. Az első előállított ionos folyadékot 1914-ben mutatták be ([EtNH3]NO3). Azóta jó néhány fajtáját előállították (6. ábra), melyeket számos iparterületen felhasználnak, mint pl. az energiaiparban, bevonatkészítésben, biotechnológiában (7. ábra). A biokatalízisben a legelterjedtebben használt ionos folyadékok az imidazólium bázisúak, mint pl. a [BMIM]PF 6 (1-butil-3-metilimidazólium-hexafluoro-foszfát). Széles körű kutatások folynak arra, hogy az ionos folyadékok zöld alternatívái legyenek a szerves oldószereknek, melyekhez képest elsődleges különbség, hogy gyakorlatilag nincs gőznyomásuk, ezáltal könnyebb az újrafelhasználhatóságuk

[Park,

2003].

Az

ionos

folyadékokat

„méretre

szabható

molekuláknak” is nevezik, mivel könnyen változtatható a szerkezetük, ezáltal az oldószer tulajdonságaik is. Például az 1-alkil-3-metilimidazóliumban lévő alkil szubsztituens kis változtatásaival a szubsztrát oldhatósága, ezáltal a regioszelektivitás és a hozam is növelhető [Park, 2001].

30

6. ábra: Az ionos folyadékok típusai [Pham, 2010].

7. ábra Az ionos folyadékok felhasználási területei [Pham, 2010].

31

Az ionos folyadékok általában nem elegyednek szerves oldószerekkel, mint hexánnal vagy éterrel, de poláris oldószerekkel, mint pl. rövidebb szénláncú alkoholokkal, ketonokkal, diklórmetánnal és tetrahidrofuránnal igen [Park, 2003]. Kétfázisú rendszert alkotnak abban az esetben, ha nem elegyednek vízzel vagy szerves oldószerekkel, és általában nem elegyednek szuperkritikus CO2-dal sem, de nagy mennyiségben abszorbeálják azt [Blanchard, 2001 b]. Viszkozitásuk a molekuláris oldószerekéhez képest nagyobb, de hozzájuk hasonlóan az olyan ionok közötti kölcsönhatásoktól függ, mint a van der Waals erők és a hidrogénkötés, ezért a szerkezet, az összetétel, a hőmérséklet és a szennyező anyagok jelenléte erősen befolyásolja azt. Kis mennyiségű víz vagy szerves oldószer jelenléte, illetve a hőmérséklet emelkedése jelentősen csökkenti a viszkozitásukat. De, azt is kimutatták, hogy az erősebb van der Waals erőknek köszönhetően általában növekszik az alkillánc hosszával [Huddleston, 2001], az anion töltésének delokalizációja viszont csökkenti a hidrogén kötés gyengítése miatt [Bagno, 2005]. Összességében az anion cseréje jobban befolyásol, mint a kationé. Az oldószer viszkozitása erősen hat a biokatalitikus reakciók sebességére, mivel a nagy viszkozitás korlátozza az anyagátadást, vagyis általában a kevésbé sűrű közegben nagyobb enzim aktivitást figyeltek meg. [Moniruzzaman, 2010]. 1.4.2. Enzimek ionos folyadékokban Annak ellenére, hogy a biokatalízis hagyományos oldószere a víz, számos reakció (pl. kondenzáció) csak szerves közegben játszódik le, vagy gyorsabb a lefutása, mint vízben. 2000-ben a kutatók kimutatták, hogy az ionos folyadékok helyettesíthetik a szerves oldószereket. A legtöbb ilyen jellegű tanulmány az imidazólium-típusú ionos folyadékokra koncentrál, mivel ezek nem reagálnak vízzel, és a legelterjedtebben használják biokatalízishez [Park, 2003]. Az első

ionos folyadékkal végzett

biokatalitikus reakcióhoz 1,3-

dialkilimidazólium vagy n-alkilpiridínium kationt és egy gyengén koordináló aniont tartalmazó ionos folyadékot használtak. Mostanság a figyelem új struktúrák felé irányul [Carrea, 2008]. A szerves oldószerek — beleértve az ionos folyadékokat is — okozta enzim dezaktivációt általában az aktivitáshoz szükséges vízburok elvonásának tulajdonítják. Számos enzim valóban igényli az aktivitásához szükséges teljes hidrátburkot, de akadnak kivételek is szép számmal, mint a Candida antarctica lipáz B (CALB), mely fenntartja az aktivitását foszforpentoxid szárító hatása mellett is, valamint a szubtilizin proteáz, mely az aktivitásához enzimmolekulánként csupán kisszámú, szorosan kötött vízmolekulát igényel. Az alifás és aromás hidroxi-karbonsavak, éterek, alkoholok (metanol kivételével) csak gyenge interakciót 32

mutatnak az enzimmel. Azok az oldószerek, melyek erős kölcsönhatásba lépnek a proteinekkel, hajlamosak irreverzibilis aktivitásvesztést okozni [Carrea, 2008]. A szerves oldószerek több esetben inaktiválják az enzimeket [Park, 2001; Kaar, 2003], de az ionos folyadékok meglepő módon nem. Ennek a tulajdonságuknak köszönhetően az enzimkatalitikus reakciókat szélesebb oldószer polaritási tartományban lehet használni. Nagyobb polaritású oldószereket alkalmazva megnő a poláris szubsztrátok felhasználásának lehetősége (maltóz, glükóz vagy aszkorbinsav), továbbá gyorsabban lejátszódik a reakció, és a szelektivitás is változik. Példaként az aszkorbinsav oleinsavval történő acilezése során Candida antarctica lipáz B katalizátort alkalmazva nagyobb konverziót értek el (83%), mint hagyományos szerves oldószerekben (50%) [Park, 2003]. Ez az eredmény annak köszönhető, hogy az aszkorbinsav jobban oldódik ionos folyadékban, miközben az aktív enzimek nem oldódtak, hanem szuszpenzió formában maradtak. Mind a hidrolázok, mind az oxidoreduktázok megőrizték az aktivitásukat ionos folyadékokban. A korábbi tanulmányok inkább a hidrolázokra, mint a proteázokra és lipázokra fókuszálnak, lévén, hogy ezek a leggyakrabban alkalmazott enzimek a biokatalízisben, de a későbbi munkák beszámolnak már az oxidoreduktázokról (peroxidáz, dehidrogenáz) is. Mindegyik tanulmány megállapítja, hogy azok az enzimek, amelyek aktivitást mutatnak szerves oldószerekben, azok aktívak ionos folyadékban is [Park, 2003]. Nem minden ionos folyadék alkalmas biokatalízishez. Az enzimek általában aktívak olyan ionos folyadékokban, melyek BF4, PF6 és NTf2 anionokat tartalmaznak, de nem aktívak Cl-, NO3-, CF3-, SO32-, trifluoro-acetát vagy acetát anionoknál [Kaar, 2003]. Egy lehetséges válasz erre a különbségre, hogy az enzimmel kompatibilis anionoknak gyengébb a hidrogénkötésre való hajlamuk. Ez a tulajdonság minimalizálja az enzim belső hidrogénkötéseivel való kölcsönhatást. Ezért inaktív sok enzim [BMIM]Cl-ban, mely erősen hajlamos a hidrogénkötésre [Anderson, 2002]. A legújabb kísérletek bizonyították, hogy bizonyos hígítás mellett nem inaktiválja az enzimet cellulóz hidrolízise során [Megyeri, 2013]. Számos funkciós csoport nemcsak az enzim aktivitását növeli, hanem a stabilitását is. Például az -kimotripszin 17-szer [Lozano, 2001 a], a Candida antartctica 3-szor [Lozano, 2001 b] és a Bacillus stearothermophilus észteráz 30-szor [Persson, 2003] olyan stabil ionos folyadékban, mint szerves oldószerben. Néhány esetben a lipázok és proteázok nagyobb enantioszelektivitást mutattak ionos folyadékban, mint szerves oldószerben [Schöfer, 2001]. Noha a biokatalízissel foglalkozó publikációk leginkább az imidazólium-típusú ionos folyadékokat említik, az ezredforduló környékén kifejlesztett újfajta, foszfónium kationt tartalmazó ionos folyadékokat is egyre szélesebb körben alkalmazzák. Az első különbség 33

köztük és az ammónium-típusú ionos folyadékok között a stabilitásuk, különös tekintettel a különböző körülmények közötti lebomlásra. Magas hőmérsékleten mindegyikük belső átrendeződéssel bomlik le, de a foszfónium-sók hőtűrése nagyobb [Bradaric, 2003]. Ipari

alkalmazás

szempontjából

az

oldószerek

fontos

paramétere

a

viszkozitás.

Szobahőmérséklet körül a foszfónium-sók nagyobb viszkozitással rendelkeznek, mint az ammónium-só párjaik [Bradaric, 2003]. Az imidazólium-típusú ionos folyadékokkal összevetve különbséget találunk a sűrűségben. A legtöbb imidazólium-sónak általában 1 g/cm3 feletti a sűrűsége, a tetraalkilfoszfónium-sóké 0,8 és 1,2 g/cm3 között mozog, de általában 1 g/cm3 alattiak. A trihexil-tetradecil-foszfónium ionos folyadékok sűrűsége a molekulát felépítő anionok szerint a következőképpen változik: Cl− < [BF4]− < Br− < [PF6]− [Bradaric, 2003]. További fontos különbség az imidazólium- és foszfónium-sók között a savas protonok jelenléte az imidazólium kationban. Ezért ezek a kationok nem inertek, és kölcsönhatásba léphetnek az oldott anyaggal hidrogénkötés kialakítása során, vagy a gyűrűrendszer aromás természete révén. A tetraalkil-foszfónium sóknak nincsenek savas protonjaik és aromás gyűrűik, ezért kis mértékben képesek az oldott anyaggal való kölcsönhatásra [Bradaric, 2003]. Ennek ellenére Fan és társai [Fan, 2012] kimutatták, hogy a trihexil(tetradecil)foszfóniumtetrafluoro-borát hatásos katalizátor a fluorral végzett nukleofil aromás szubsztitúció során. Abe és társai vizsgáltak különféle foszfónium ionos folyadékokban lipáz katalizált, enantioszelektív észterezéses reakciókat [Abe, 2008]. Megállapították, hogy nagyobb konverzió

és

enantioszelektivitás

mutatkozott

2-metoxietil(tri-n-butil)foszfónium

bis(trifluoro-metánszulfonil)imid ([MEBu3P][NTf2]) ionos folyadékban, mint más (pl. diizopropil-éter) konvencionális oldószerben. A tejsav és a foszfónium-típusú ionos folyadékok kapcsolatáról is születtek publikációk. Marták és Schlosser [Marták, 2007] a tejsav fermentléből történő extrakciójához használtak 2,4,4,-trimetil-pentilfoszfin anionnal rendelkező ionos folyadékot (Cyphos 104), mely hatásos tejsav extrahálószernek bizonyult. Megoszlási hányadosa más folyadék extrahálószerekkel összehasonlítva nagyobb volt. Főként az anion szinergikus hatása felelős a tejsav megnövekedett megoszlási hányadosáért. Háromféle foszfónium-típusú ionos folyadékkal (Cyphos 101, 103, 104) tesztelték az (L)-tejsav extrakcióját Oliveira [Oliveira, 2012] másik két savval összehasonlítva ((L)-maleinsav, borostyánkősav). A három ionos folyadék közül a Cyphos 104-essel volt a leghatásosabb az (L)-tejsav extrakciója, mely a borostyánkősavat is hatásosan extrahálja.

34

A fermentlében lévő tejsav koncentrációja 22-120 g/l [Hetényi, 2010]. Az ebből extrahált tejsav betöményedik,

ezáltal polimerizáció

játszódik

le

a

víz

koncentrációjának

csökkenésével. Ám a foszfónium-típusú ionos folyadékok csoportja megoldást jelent az eddigi problémára, mivel nem volt hatékony extrahálószere, vagyis oldószere a tejsavnak. A tejsav enzimes észterezési reakcióiról szóló publikációk száma valószínűleg emiatt is csekély. 1.4.3. Szuperkritikus CO2 A szuperkritikus szén-dioxid használata alternatív oldószerként vált a növekvő érdeklődés tárgyává olyan reakcióknál, ahol eredetileg szerves oldószert használtak a szintézis során. Az olyan tulajdonságai, mint a sűrűség, dielektromos állandó, diffúzivitás, viszkozitás és oldhatóság a hőmérséklettel és a nyomással befolyásolható tényezők. Ez megkülönbözteti a scCO2-ot a hagyományos oldószerektől, mivel az oldószer tulajdonságok az oldószer változtatása nélkül befolyásolhatók. Továbbá a scCO2 nem karcinogén, nem toxikus, nem mutagén, nem gyúlékony és termodinamikusan stabil. A kritikus hőmérséklete a környezeti értékekhez közel áll, mivel 31,1 °C, kritikus nyomása 73 bar. Ez lehetővé teszi, hogy a legtöbb biokémiai folyamatban alkalmazható legyen [Paljevac, 2009]. Az első biotranszformációs folyamatok, melyekben szuperkritikus fluidumokat alkalmaztak az enzimes oxidáció, hidrolízis, észterezés, átészterezés és enantioszelektív szintézisek voltak. A

lipáz

aktív

helyének

konformációbeli

változásaiból

adódóan

megnövekedett

enantioszelektivitást is megfigyeltek. További előny, hogy a termékek és reaktánsok kinyeréséhez is alkalmas közegeknek bizonyultak. Szuperkritikus CO2-ban nemcsak az oldószer maga jelenti az enzimre gyakorolt hatást, hanem a körülmények, melyek befolyással vannak az enzim működésére (vízaktivitás, hőmérséklet, nyomás, pH, stb.). Számos enzim mutat nagy aktivitásnövekedést a nyomás függvényében. Ha egy enzim stabil szuperkritikus fluidumban, akkor a stabilitására általában nincs hatással a nyomás 300 bar-ig, a reakciósebességre pedig a legtöbb esetben pozitív vagy semmilyen hatással nincs. A nyomás általi dezaktiváció általában 1500 bar felett jelentkezik, a reverzibilis denaturáció pedig 3000 bar alatt már megtörténik, felette pedig irreverzibilissé válik. A hőmérséklet egyike a legfontosabb paramétereknek, mely jobban befolyásolja az enzim aktivitását, mint a nyomás. A reakció hőmérsékletének emelése két hatást vált ki: a reakciósebesség megnő, valamint az enzim aktivációja vagy dezaktivációja lép fel. Az utóbbi leginkább túl magas hőmérsékleten következhet be, ezért az enzim aktivitásának és a reakció hatásfokának az optimális hőmérséklete nem szükségszerűen ugyanaz. Jelenleg nincs elérhető összefüggés, mely leírja különféle enzimek stabilitását a hőmérséklet függvényében. A 35

nyomás és hőmérséklet függvényében a szubsztrátok és termékek oldhatósága változik, a magas hőmérséklet hatására általában az oldhatóság megnő [Knez, 2005]. A szuperkritikus CO2 olyan reakcióknál is alkalmazható, melyeknél extrahálószer szerepét tölti be. Székely és munkatársai [Székely, 2004] vizsgálták a parciális diasztereomer komplex képződését transz-2-kloro-ciklohexán-1-ol és O,O-dibenzoil-(2R,3R)-borkősav-monohidrát között, mely az alkohol olvadékában játszódott le. A legnagyobb rezolválási hatásfokot akkor érték el ((R,R)-enantiomerfeleslege 43,5%), mikor az el nem reagált alkoholt szuperkritikus CO2-dal extrahálták 33 °C-on és 100 bar nyomáson. A második lépésben a diasztereomer komplex in situ felbomlott az extraktorban 73 °C-on és 200 bar-on, majd az (S,S)-enantiomert is extrahálták. A szuperkritikus közeg előnye, hogy a bomlási hőmérséklet atmoszférikus nyomáson magasabb (100 °C felett), mint az extraktorban. Molnár és munkatársai [Molnár, 2006] vizsgálták az enantioszeparáció befolyásoló tényezőit racém ibuprofén és (R)-feniletil-amin közti reakcióban, mely után szuperkritikus fluidummal extrahálták az el nem reagált komponenseket. Az extrahálószer szempontjából csak a nyomás volt hatással a rezolválás hatásfokára. 33 °C-on és 150 bar nyomáson érték el a (±)-ibuprofén legnagyobb enantioszeparációját. Y. Lee és társai [Lee, 2012] szuperkritikus CO2-t használtak tejsav polimerizációjához és a reakció utáni tisztításhoz is. A hagyományos szintézishez olyan szerves oldószerek szükségesek, mint diklórmetán és toluol, majd a termék tisztításához és szeparációjához további oldószer szükséges. Az oldószer elégtelen eltávolítása a termék szennyezéséhez vezet, mely miatt akár mérgező is lehet, de a szerves oldószerek önmagukban is környezetterhelőek. A polimer előállítás során a scCO2 képes a PLA üvegesedési hőmérsékletét csökkenteni a polimer lágyítása folytán, valamint arra is szolgál, hogy felduzzasztja a polimert, és behatolva felold minden szennyeződést, ami a polimer mátrixba ragadt. Ez a hatás teszi lehetővé, hogy a polimert alacsonyabb hőmérsékleten állítsák elő. A szintézis után azt is vizsgálták, hogy a scCO2 alkalmas-e a termék a tisztításához. A kísérlet során irányított molekulatömegű PLLA szintézise történt, melyhez dietilén-glikolt és ón(II)-2-etilhexanoátot használtak, mint bifunkcionális iniciátor és katalizátor. A dietilén-glikol két hidroxil csoportot tartalmaz, melyek képesek mindkét oldalon iniciálni a polimerizálódást. A szerves fémkatalizátort pedig a nagy katalitikus aktivitása (>90%), a kis racemizáló hatása (<1%) és a nagy molekulatömegű polimer előállító képessége miatt választották. A vizsgálatokhoz (L)-tejsavat és dietilén-glikolt használtak 13 : 1, 50 : 1, 100 : 1 arányban. A hőmérsékletet állandó 100 °Cra, a nyomást 120 bar-ra állították, a reakcióidő pedig 5 óra volt. A hőmérséklet pozitív hatással volt a polimer képződés hozamára és a polimer molekulatömegére. A statisztikai 36

analízis is kimutatta, hogy a hőmérséklet az a domináns faktor, mely a molekulatömeget és a hozamot befolyásolta. Az (L)-tejsav olvadáspontja 1 bar nyomáson 96 °C, ennek ellenére csak 60 °C-ig emelhető a hőmérséklet nagy nyomású (300 bar) CO2-ban. 70 °C-on és 300 bar nyomáson az (L)-tejsav monomerjeinek csak a 48 m/m%-a oldódott scCO2-ban, a nagyobbik része megolvadt, mellyel a katalizátor és az iniciátor keveredett. A nyomás hatására a hozam és a molekulatömeg kissé emelkedett, valamint a polidiszperzitási index egy platót ért el, mikor a nyomást 120-ról 160bar-ra emelték. Szignifikáns emelkedés a molekulatömegben és a hozamban akkor mutatkozott, mikor a nyomást 160-ról 200-bar-ra emelték. Ez a hatás valószínűleg a nagy nyomás okozta szén-dioxid sűrűség emelkedésnek volt köszönhető, melynek hatására a polimer duzzadása következett be. A kísérlet során a hőmérséklet alacsonyabb volt, mint a hagyományos módszernél, de a hozam hasonló volt, mint a hagyományosan stabilizátorokat és felületaktív anyagokat alkalmazó technológiában [Lee, 2012]. 1.4.4. Szuperkritikus CO2 és ionos folyadék mátrix A legújabb kutatások kimutatták azt is, hogy lehetőség van a scCO 2 és az ionos folyadékok kombinációjára „zöld” szintézisekben, melyeknél enzimeket alkalmaznak. A két oldószer eltérő keveredési tulajdonsága kétfázisú rendszert hoz létre, mely lehetőséget kínál arra, hogy egyben a biokatalitikus folyamat lejátszódjon, valamint a termék extrakciója is végbemenjen [Paljevac, 2009]. A kettős rendszer előnye a lipáz katalízis során az, hogy a rendszer stabilizáló hatást fejt ki a nagy nyomás és hőmérséklet okozta enzimdezaktivációval szemben, mely az ionos folyadéknak tulajdonítható. Néhány ionos folyadékról bebizonyították, hogy a hagyományos

oldószerekhez

képest

2300-szor

nagyobb

felezési

időt

biztosít

a

biokatalizátornak. A lipáz főként az ionos folyadék fázisában helyezkedik el szuszpendált állapotban, ezáltal a lipáz stabil marad a katalízis során, továbbá aktivitása is növekszik. Extrém körülmények között

150 °C-on és 100 bar-on

is aktív maradt az enzim. A kettős

rendszer további előnye, hogy a termék szeparációt is megvalósítja, melyet az ionos folyadék önmagában nem képes [Fan, 2010]. Blanchard [Blanchard, 2001 a] mutatta be, hogy az ionos folyadékból scCO2 segítségével lehetséges extrahálni a végterméket, mely az után nem tartalmazott semmilyen ionos folyadékkal való szennyeződést. Ennek oka főként az, hogy a scCO 2 jól oldódik ionos folyadékban, miközben az ionos folyadék nem oldódik mérhetően a scCO2 fázisában. Ezzel alátámasztható, hogy a scCO2 nemcsak számos hidrofób anyag reakciójához használható fel, hanem csökkenti az ionos folyadék viszkozitását, így serkentve az anyagátadási folyamatokat. 37

Lozano és munkatársai [Lozano, 2004] vizsgálták ionos folyadék és scCO2 közegében a racém glicidol észterezését CALA, CALB és Mucor miehei lipáz enzimekkel. Az elegyhez 2 ml [EMIM][NTf2] ionos folyadékot alkalmaztak, a scCO2 reaktort 10 MPa nyomáson üzemeltette. CALA esetében nem játszódott le reakció, de az utóbbi két enzim képes volt a racém glicidol kinetikus rezolválását katalizálni. Csak ionos folyadék közegében végzett kísérletek során nagyobb enzim aktivitás mutatkozott, mint az IL/scCO 2 kettős rendszerben, de az enantioszelektivitás mindkét esetben ugyanakkora volt. A csökkent aktivitásnak az okát az anyagátadási korlátokban kell keresni, mivel a kettős rendszerben az enzim az ionos folyadékban szuszpendálódik, az ionos folyadék pedig nem oldódik scCO2-ban. Nem elhanyagolható az sem, hogy a scCO2-ban csökken az enzim aktivitása a kovalens módosulásoknak köszönhetően. (R,S)-1-feniletanol

Candida

antarcticaval

katalizált,

scCO2/[BMIM]BF4

közegében

lejátszódó észterezése során vizsgálták Paljevac és társai [Paljevac, 2009] az ionos folyadék koncentrációjának enzimre kifejtett hatását. A reakciók során 0-50 mmol ionos folyadékot használtak, a szubsztrátokat 1 : 1 arányban adták az elegyhez 40 °C-on, 100 bar nyomás mellett. Az eredmények azt mutatták, hogy az ionos folyadék beadása után a reakció hatásfoka megnőtt. Ez valószínűleg a külső anyagátadási korlátok csökkenésének volt köszönhető, mivel a reakció kétfázisú rendszerben ment végbe, mikor ionos folyadék nem volt jelen a rendszerben. A Candida antarctica részecskék szuszpendálódtak az ionos folyadékban, mialatt a szubsztrátok a szuperkritikus fázisban helyezkedtek el. Első lépésként a molekuláknak az ionos folyadékba kellett vándorolniuk az enzim irányába, második lépésként a terméknek vissza kellett jutnia a scCO2-ba. Ezáltal a legjobb eredmények akkor születtek, mikor a legnagyobb mennyiségű ionos folyadékot alkalmazták. 1.4.5. Tejsav lipázos észterezése nem konvencionális közegekben Major és társai [Major, 2010] folytattak kísérleteket (L)-tejsavval két konvencionális oldószerben és hat fajta foszfónium-típusú ionos folyadékkal, és azt vizsgálták, hogy melyik közegben érhető el nagyobb etil-laktát hozam. A szubsztrátok és a termékek mindegyike oldhatónak bizonyult a legtöbb vizsgált oldószerben, kivéve a Cyphos 110-est és a hexánt. A Cyphos 202 és a toluol közegében 82% illetve 95%-os konverziót értek el az észterezés során. Major és társai [Major, 2009] egy másik tanulmányukban a két kiválasztott Cyphos-típusú ionos folyadék mennyiségének hatását vizsgálták tejsav-etilészter enzimes előállítása során. A hozzáadott ionos folyadék mennyiségének hatásán kívül vizsgálták továbbá az alkalmazandó szubsztrátfelesleget és az enzim mennyiségét is. Az optimális tejsav : etanol mólarányt 1 : 7 38

értékben határozták meg. Az enzim mennyiségét (Novozym 435) 12,5 és 50 mg/mmol tejsav értékek között változtatták. Már a legkisebb mennyiség is 24 óra alatt a reakció teljes lefutását eredményezte. Mialatt az ionos folyadék mennyiségét 155 g/dm3-ről (0,2 mol/dm3) 346 g/dm3-re (0,44 mol/dm3) növelték, az észter hozam is növekedett, de ezen felüli ionos folyadék hozzáadása már nem volt jelentős hatással. 2012-ben publikáltuk a tejsav n-butanollal történő észterezése során szerzett tapasztalatainkat. A méréseket Candida antarctica lipáz B enzimmel scCO2 közegében, társoldószer jelenlétében és a nélkül is elvégeztük. A kísérlet célja a legnagyobb hozam elérése volt a reakciókörülmények

optimalizálásával.

A

nyomást

75-400

bar

intervallumban,

a

hőmérsékletet pedig 35 és 55 °C között változtattuk. A legnagyobb hozamot 26 órás reakcióidő után értük el n-hexán társoldószer jelenlétében, 400 bar nyomáson és 55 °C-on, ahol a hozam 99%-os volt. Kizárólag scCO2 közegében végrahajtott reakció esetében csupán 76%-os konverziót értünk el 55 °C-on és 300 bar nyomás mellett.

1.5. Észterezési reakciót befolyásoló paraméterek 1.5.1. Sav/alkohol mólarány Wehtje és munkatársai [Wehtje, 1994] tanulmányozták az enantioszelektivitást különféle lipáz enzimek esetében királis alkoholokkal végzett észterezés útján. Vizsgálataihoz Candida rugosa, immobilizált Candida antarctica, Pseudomonas sp., Rhizopus arrhizus és Lipozyme IM 20 enzimeket használtak. Az alkohol koncentrációt 10 és 100 mmol között változtatták, a savat állandó 100 mmol mennyiségben adták az elegyhez. A Michaelis-Menten kinetika szerint a két különböző enantiomer reakciósebességei megnövekedtek az alkohol koncentrációjának növelésével. Ennek ellenére a Candida rugosa esetében az alkalmazott alkoholfelesleg hatástalannak bizonyult. Hasonló eredmény született Pseudomonas sp. esetében is. A sav koncentrációjának emelésével a Candida rugosával végzett kísérletek enantioszelektivitása növekedett, az alkohol mennyisége eközben állandó volt. A nem királis szubsztrátok lipázokra gyakorolt enantioszelektív inhibíciójáról Berglund és társai készítettek tanulmányt [Berglund, 1995]. Megfigyelték, hogy a nem királis alkohol koncentrációja befolyásolta az enantioszelektivitást, és az E érték csökkent az alkohol koncentrációjával. Egy másik ok lehet a pH hatása a rendszerben, mely hatás a sav koncentrációjával növekszik. Gubicza és társai [Gubicza, 2000] az etanollal történő észterezés során vaj-, propion- és ecetsavat használtak n-hexán oldószerben 0,4 m/m% víztartalom mellett. Nagyobb 39

savkoncentrációnál az észterhozam elkezdett csökkenni. Megállapították, hogy 1 : 3 arányban kell beállítani a sav : alkohol mennyiségét. Fráter [Fráter, 2007] szintén vizsgálta az etil-acetát előállítása során a sav és az alkoholfelesleg hatását [BMIM]PF6 ionos folyadékban. A mérései során minden reakcióelegyben ugyanakkora savmennyiséget alkalmazott (0,786 mol/dm3), és ehhez képest csökkentette, illetve növelte az alkohol mennyiségét. A vizsgált értékek, sav : alkohol mólarányt tekintve: 6 : 1, 3 : 1, 1 : 1, 1 : 2 és 1 : 4 voltak. Azoknál a reakcióknál, ahol a sav feleslegben volt, a reakció konverziófoka a 65%-os értéket nem lépte túl. Az alkohol mennyiségének növelése monoton konverziónövekedést mutatott egészen a 3 : 1-es arányig, ám e felett a reakciósebesség elkezdett csökkenni. A 3-szoros alkoholfelesleg mellett a konverzió meghaladta a 85-90%-ot. A mérésekkel kapott konklúzióként azt állapította meg, hogy az ecetsav és az alkohol feleslege is szubsztrát inhibíciót idéz elő, de az utóbbi hatása kisebb mértékű. Delgado és társai [Delgado, 2007] a tejsav etanollal történő észterezését nem enzim, hanem Amberlyst 15 ioncserélő gyanta jelenlétében vizsgálták. A reakcióhoz abszolút etanolt és 20 m/m%-os vizes tejsav oldatot használtak. A számos vizsgált reakció paraméter közül esetünkben a kiindulási komponensek kezdeti arányáról közölt eredmények fontosak. Az etanol/tejsav mólarány hatását 0,5 és 6 közötti tartományban vizsgálták 7,5 órás reakcióidő alatt. Az eddigiekhez hasonló módon a nagyobb savtartalom kisebb konverziófokot eredményezett. 1-es etanol/tejsav arány 9%-os konverziót eredményezett, mely az etanol feleslegének növelésével 35%-ig növekedett. A termék hidrolízise esetében is az a tendencia mutatkozott, hogy a reakcióelegyben a víz mennyiségének növelésével javul az etil-laktát konverzió mértéke. Emellett, az egyik kiindulási komponens feleslegének növelésével viszont megnő a termék kihozatal költsége. 1.5.2. A víz szerepe és eltávolításának lehetőségei A legtöbb vizsgálat során az enantioszelektivitást Chen és társai [Chen, 1982; Chen, 1987] által kidolgozott módszerrel, racém elegyet használva határozzák meg. Mivel számos szubsztrát tiszta enantiomerjei nem vagy nehezen elérhetőek, ezért is gyakoribb ez a módszer. Wehtje [Wehtje, 1997] tanulmányában az enantioszelektivitás méréséhez a már korábban említettek közül két módszert alkalmaztak, a tiszta enantiomerekkel és a racém eleggyel végzett reakciókat, melyekhez 2-oktanolt és dekánsavat használtak. A tiszta enantiomerekkel történő mérések során 0 és 1 között változtak a vízaktivitás értékei. Megfigyeléseik alapján a vizsgált lipázok enantioszelektivitására sem volt hatással a vízaktivitás változtatása. A racém eleggyel történő reakciók során Candida rugosa lipáz esetében az enantioszelektivitást 6 40

különböző vízaktivitási értéknél határozták meg, a többi enzimet pedig 0,33 és 0,75 vízaktivitási értékek mellett vizsgálták. Eredményül ugyanúgy azt kapták, hogy a vízaktivitás változásának nincs hatása az enantioszelektivitásra, viszont az E értékekre más eredményt kapott. Ezek kisebbek voltak, mint a tiszta enantiomert felhasználó méréseknél mutatkoztak, kivétel a Candida rugosa esetében. A csökkenés különösen illik a Candida antarcticára, ahol az E érték 9000-ről 40-re, emellett Lipozyme esetében 100-ról 20-ra, Pseudomonas esetében 33-ról 15-re csökkent. Az utóbbi esetekben úgy tűnik, hogy az enantioszelektivitás más módszerrel történő mérése befolyással volt az E értékekre, hogy miért, azt nem tudták megállapítani. Végső konklúzióként megállapította, hogy az E érték nem változik a vízaktivitás változtatásával. Fráter [Fráter, 2007] az etil-acetát előállítása során a kezdeti víztartalom szerepét is vizsgálta. A méréseit 40 °C-on, 3-szoros alkoholfelesleggel és 10 mg/ml enzimkoncentráció mellett végezte. Megállapította, hogy a víztartalom növelésével egyidejűleg két hatás érvényesül. Egyrészt növekszik a hidratált állapotba kerülő enzim mennyisége, mely egy bizonyos víztartalom értékig növeli a reakciósebességet. Emellett viszont a víztartalom növekedése visszatartja az egyensúlyi reakció lefutását, tehát kisebb konverzió következik be (90%-ról 65%-ra csökkent). Az optimális víztartalmi érték 2 m/m% volt. Major és társai [Major, 2009] vizsgálták az (L)-tejsav etanollal való észterezése során a tejsav összetételét és a víztartalom szerepét a reakció során. A reakcióhoz 90 m/m%-os (L)-tejsav elegyet használtak.

Ennek az elegynek az összetételét HPLC-vel határozták meg, mely

szerint tartalma: 53 m/m% monomer tejsav, 26 m/m% nyíltláncú dimer tejsav, 7 m/m% ciklikus dimer tejsav és 14 m/m% víz. Az utóbbi értéket Karl-Fischer titrátorral mérték. Konvencionális és mikrohullámú hőközléssel folytatott kísérletekben az alacsony kezdeti víztartalom (2 m/m%) kis hozamot mutatott. Hagyományos hőközlés esetén a legnagyobb etil-laktát hozamot 4 m/m% víztartalomnál érték el, mikrohullámú hőközlés esetén 3 m/m%nál. A konverzió mindkét esetben 105% lett. A hagyományos hőközlés esetén 24 órás reakcióidő kellett a reakció befejezéséhez, míg a mikrohullámú hőközlés esetében elegendő volt a 7 óra is. A nyílt láncú dimer tejsav két monomer tejsav molekulává képes hidrolizálódni, ezzel további monomer tartalmat ad a reakcióelegynek, mely etil-laktáttá alakul. Ez az oka, hogy 100% feletti hozamot lehet elérni, ha a kiindulási monomer tejsav koncentrációra vonatkoztatunk. Engin és társai [Engin, 2003] szerint sem a hőmérséklet változtatása, sem katalizátor hozzáadása nem változtatja meg a nyílt láncú dimer tejsav és a víz dinamikus egyensúlyát, de az észterezés során keletkező víz a dimer tejsav hidrolízisét okozza. Úgy találták, hogy ez a 41

hidrolízis hagyományos melegítés során nagyon lassú folyamat, mely a reakcióban sebesség korlátozó lépés lehet, de a mikrohullámú hőközlés hatására gyorsabb hidrolízist figyeltek meg. A reakció során a ciklikus dimer tejsav koncentrációja állandó maradt [Major, 2009]. A víz eltávolítása az észterezések során általában növeli a konverziót, pl. izoamil-acetát [Fehér, 2009] vagy etil-acetát [Gubicza, 2008 a] előállításakor. Számos eljárás létezik, mellyel el lehet távolítani a képződő vizet a reakcióelegyből. Ye és Hayes [Ye, 2011] hasonlítottak össze különféle technikákat, mint a vákuum, molekulaszűrők, nitrogéngáz buborékoltatás és az utóbbi kettő kombinációja. Ezek közül a vákuumozás és a nitrogén buborékoltatás volt a leghatásosabb. Yan és társai [Yan, 2002] az azeotróp desztillációt alkalmazták vízeltávolításhoz. Ulbert

és

munkatársai [Ulbert,

2004]

a 2-klór-propionsav esetében alkalmaztak

pervaporációval történő vízeltávolítást, mellyel a konverziót növelni tudták. A reakcióelegyet a pervaporációs cella koncentrátum oldalán keringették, a permeátumot pedig száraz jéggel hűtött hideg csapdában fogták fel. A membrán modulban 10 cm2 felületű PERVAP 2212-es lapmembránt alkalmaztak, ahol a hőmérsékletet 30 °C-ra állították, a nyomást pedig 10 kPa-ra csökkentették. A betáplálás áramlási sebessége 30 cm3/min volt. A tejsavas észterezések esetében különleges a víz szerepe. Major és társainak egy későbbi munkájában [Major, 2010] megállapították, hogy ionos folyadékos közegben az (L)-tejsav etanollal történő észterezése során a vízeltávolítás hatása pont az ellenkező, mint a fenti esetekben. A vizet zeolittal és pervaporációval távolították el, de kisebb hozamot értek el, mint vízeltávolítás nélkül.

1.6. Kísérlettervezés A kísérlettervezés megkönnyíti az eredmények kiértékelését. Egy részről minimalizálja a kísérletek számát, de emellett nem rontja az eredmények minőségét. A kísérletek számának csökkentésével időt és költséget takaríthatunk meg. 1960-ban Box és Behnken tervezett olyan kísérletsorozatokat, melyek lehetővé teszik másodfokú modellek kivitelezését. Minden faktornak három szintje van: -1, 0 és 1. A háromfaktoros Box-Behnken kísérlettervezés egy kockára alapozható. Négy faktor esetében a kísérletek egy négydimenziós hiperkockán alapulnak. A kísérleti pontok nem a kocka sarokpontjain helyezkednek el, hanem a szélek és a lapok középpontjában valamint a kocka középpontjában. Ez az elrendezés azt jelenti, hogy minden kísérleti pont egyenlő távolságra helyezkedik el a vizsgált tartomány középpontjától, melyek egy gömbbel vagy hipergömbbel

42

írhatók le a dimenziók számától függően. A középponti kísérletek a gömb középpontjában helyezkednek el [Goupy, 2007]. A háromfaktoros kísérleti terv elméleti kockáját a 8. ábra szemlélteti. Hagyományosan három kísérleti pont helyezkedik el a kocka középpontjában, és egy-egy pont a kocka 12 éle mentén. Ezért a Box-Behnken háromfaktoros kísérleti tervnek 12+3=15 kísérleti pontja van. Ezzel a módszerrel a hagyományosan összeállított kísérleti terv méréseinek száma csökkenthető, a kapott adatok pedig számítógépes programmal kiértékelhetők.

8. ábra: A háromfaktoros Box-Behnken tervezés illusztrációja [Goupy, 2007].

Célok Az utóbbi évek gyakorlatának megfelelően a vegyipari műveletek tervezői egyre inkább abba az irányba haladnak, hogy a technológiák és termékeik minél kevésbé szennyezzék a környezetet, vagyis „zöld technológiák”, környezetbarát termékek kifejlesztése a cél. Ennek az egyik lépése, hogy olyan alapanyagokat használjanak fel, melyek biológiailag megújítható forrásból származnak és nem környezetszennyezők. A környezetbarát technológiához nemcsak az anyagok, hanem a reakciókörülmények megválasztása is fontos. Az észterezési reakciók végrehajtásához általában magas hőmérséklet szükséges. Ennek elkerülésére alkalmaznak katalizátorokat, melyek lehetnek különböző savak, de környezetvédelmi szempontból előnyösebb a biokatalizátorok (enzimek) használata. Enzimek segítségével a reakció lejátszódik alacsonyabb hőmérsékleten is, ezért a felhasznált energiát is csökkenteni lehet.

43

A hagyományos oldószerek alkalmazása több problémát is felvet. A biokatalízisben leggyakrabban használt oldószerek egy része mérgező, melyeknek igen nagy a gőznyomása, ezért a párolgásból adódó veszteség is számottevő. Továbbá ezek a hagyományos oldószerek általában nem újrafelhasználhatók, mivel nehezen tisztíthatók meg a reakció lejátszatása után vagy költséges a tisztításuk. Az említett problémák kiküszöbölésére a folyamatosan fejlesztett ionos folyadékok és a szuperkritikus CO2 említhetők. Az előbbiek esetében a kisebb gőznyomásuk miatt nincs párolgásból adódó veszteség, tisztításuk pedig vákuummal megoldható. A gyakorlatilag zérus gőznyomással rendelkező ionos folyadékok mellől minden más komponens kis nyomáson eltávolítható. A scCO2 esetében pedig a nyomás atmoszférikus értékre történő csökkentésekor az elegyből távozik a CO2, mely a környezetbe kerülve nem fejt ki mérgező hatást. Mint az irodalmi összefoglalóból is kiderül, a racém tejsav enzimatikus enantioszelektív észterezésével ionos folyadékos közegben senki nem foglalkozott mélyebben, ezért választottam ennek a reakciónak a vizsgálatát. A vizsgálat célja az volt, hogy az említett lehetőségeket kihasználva környezetbarát technológia segítségével állítsak elő tiszta (L)tejsav-észtert, mely további zöld technológiában felhasználható. Ilyen alapanyag és oldószer az etil-laktát. Erős oldó hatásának köszönhetően felveszi a versenyt a forgalomban lévő oldószerekkel. Az oldószerként való felhasználáshoz a racém etil-laktát előállítása elegendő. Ha viszont enzimatikus úton a reakciót enantioszelektíven tudjuk végezni, akkor az etil-(L)laktát kerül feleslegbe. Ez a termék pedig a reaktánsoktól való tisztítás és hidrolízis után a biodegradábilis politejsav alapanyagához vezet. A vegyiparban szintetizált racém tejsav elegy olcsóbban előállítható, mint a bakteriális úton fermentált (L)- illetve (D)-tejsav. A választott módszer a racém elegyből történő kinetikus rezolválás vizsgálata, mivel erre a megvalósításra még nem létezik technológia.

2. Anyagok és módszerek 2.1. Felhasznált anyagok Ionos folyadékok Az 1. táblázat mutatja a felhasznált ionos folyadékok kereskedelmi forgalomban használatos nevét, a nevezéktan szerinti elnevezését és a szerkezeti képletét. Tulajdonságaikat a Függelék 21. táblázata ismerteti.

44

1. táblázat: A kísérleteim során felhasznált ionos folyadékok Ionos folyadék

Név

Cyphos 102

Trihexil-tetradecil foszfónium bromid

Cyphos 103

Trihexil-tetradecil foszfónium dekanoát

Cyphos 104

Trihexil-tetradecilfoszfónium-bisz (2,4,4trimetilpentil) foszfinát

Cyphos 105

Cyphos 106

Cyphos 109

Szerkezeti képlet

Trihexil-tetradecilfoszfónium dicianamid

Triizobutil-metil-foszfónium tozilát

Trihexil-tetradecilfoszfónium bisz-triflamid

Cyphos 110

Trihexil-tetradecilfoszfónium hexafluorofoszfát

Cyphos 163

Tetrabutil-foszfónium bromid

Cyphos 166

Tetraoktil-foszfónium bromid

Cyphos 201

Tributil-tetradecil-foszfónium dodecilbenzolszulfonát

45

Egyéb vegyszerek 2. táblázat: A kísérleteim során felhasznált egyéb vegyszerek Sűrűség Anyag

Gyártó

Töménység

25 °C-

Törésmutató

M

Forráspont

(m/m%)

on

nD20

(g/mol)

(°C)

3

(g/cm ) (D,L)-

Reanal

tejsav

(Magyarország)

(L)-tejsav

Scharlab (Magyarország)

Abszolút

Merck

etanol

(Németország)

n-Hexán

Merck (Németország)

122

90

1,209

1,425

90,08

90

1,209

1,425

90,08

99

0,8

1,3614

46,07

78

>96

0,66

1,375

86,18

69

>98

1,042

1,413

118,13

154

-

-

-

-

Etil-(L)-

Sigma-Aldrich

laktát

(Magyarország)

Ioncserélt

Pannon

Vezetőképesség:

víz

Egyetem

1 S/cm

(15 Hgmm) 122 (15 Hgmm)

Enzimek Candida antarctica lipáz B (CALB): Novozym 435, triacilglycerol hidrolase, E. C. 3.1.1.3., Novo Nordisk (Basvaerd, Dánia). Candida rugosa: liofilizált, E. C. 3.1.1.3., Sigma-Aldrich (Buchs, Svájc)

2.2. Alkalmazott készülékek Gázkromatográf (HP 5890) Karl-Fischer titrátor (METTLER DL 35) Szuperkritikus CO2 reaktor Pervaporációs készülék Automata pipetta 100-1000 μl (BIOHIT PROLINE) Digitális analitikai mérleg (SARTORIUS A200S) Rázóinkubátor (IKA KS 4000i)

46

2.3. Alkalmazott egyenletek Hozam (y) Hozam (%)

( D, L) etil laktát (mmol ) 100 kiindulási ( D, L) monomer tejsav (mmol )

Enantiomerfelesleg (e.e.) e.e. (%)

( L) etil laktát (mmol ) ( L) etil laktát (mmol )

( D) etil laktát (mmol ) *100 ( D) etil laktát (mmol )

Alkohol/monomer tejsav mólarány alk / TS

kiindulási( D, L) monomer tejsav (mmol ) e tan ol (mmol )

Ionos folyadék/alkohol tömegarány a reakcióelegyekben IL / alk

ionos folyaék ( g ) e tan ol ( g )

2.4. Analízis 2.4.1. GC analízis A gázkromatográfiás analízist HP 5890 típusú gázkromatográffal végeztem közvetlen mintavétel után. Az enantioszelektivitás és a hozam meghatározásához használt kolonna: LIPODEX-E Ciklodextrin (Macherey-Nagel), 30 m x 0,25 mm. A gázkromatográf lángionizációs detektorral üzemel. Az alkalmazott fejnyomás 90 kPa, 90 °C-os konstans hőmérsékleten. Injektor felfűtés 150 °C-ra, detektor 250 °C-ra. H2 nyomás 160 kPa, levegőnyomás 140 kPa. Total flow 67,42 ml/min, AUX 19,67 ml/min. A kalibrációt etil-(L)-laktáttal végeztem. A kalibráló sorozat 1, 5, 10 és 20 m/m%-os oldatokból állt, melyekben n-hexánnal elegyítettem az etil-(L)-laktátot. A reakcióelegyek ionos folyadék tartalma nem injektálható a GC-re, mivel viszkózus folyadékként a kolonna belsejébe jutva lerakódást képeznek, mely eltömődést okoz. A nagy hőmérséklet miatt pedig bomlásnak indulnak, így a mérési eredmény pontosságát befolyásolják, nem kívánt csúcsok jelennek meg a kromatogramon. A mérések során általában extrakcióval elválasztják a mérendő komponenseket az ionos folyadéktól, és így injektálják a kolonnára. A mérések pontossága érdekében az injektor betétbe üveggyapotot és nagy felületű adszorbens anyagot helyeztem, mely visszatartotta az ionos folyadékot az injektálás után, az analizálandó 47

komponensek pedig a magas hőmérséklet miatt gázfázisba kerülve jutottak tovább a kolonnára. Ezzel a módszerrel elkerültem azt, hogy a terméket extrahálni kelljen a reakcióelegyből, így az extrakciós hatásfok méréséből adódó hibákat is kiküszöböltem. Közvetlen mintavétel után 0,5 l mintát injektáltam a gázkromatográfra. Az adatok kiértékelése Clarity 3.0 szoftverrel történt. A 9. ábrán látható egy mérés kromatogramja, melyen a termékek retenciós ideje: etil-(L)-laktát: 6,23 min etil-(D)-laktát: 6,8 min

9. ábra: A reakciótermék kromatogramja Clarity 3.0 szoftver alkalmazásával

2.4.2. Víztartalom meghatározás A mérések során vizsgáltam a kezdeti víztartalom szerepét, ezért szükség volt a minták kezdeti víztartalmának beállítására. A kívánt reakciópartnerek és oldószeres mérés esetén az oldószer bemérése után homogenizáltam az elegyet, és ez után mértem a víztartalmat, majd igény esetén számolt mennyiségű vizet adtam az elegyhez, és ismét meghatároztam a víztartalmát. A kezdeti víztartalom meghatározása METTLER DL 35 típusú Karl-Fischertitrátorral történt. A készülékbe közvetlen mintavétel után 20

l mintát injektáltam. A

méréseket 3 párhuzamos minta injektálásával végeztem, ha a szórás nagyobb volt 5%-nál, akkor további párhuzamos méréseket végeztem, az eredményeket pedig átlagoltam.

48

2.5. Kísérleti módszerek 2.5.1. Rázóinkubátoros kísérletek A reakcióelegyeket 10 ml-es Erlenmeyer-lombikokba mértem, melyeket temperálható rázóinkubátorba helyeztem, a rázatási intenzitást pedig minden esetben 150 rpm-re állítottam. A mérések az esetek többségében 24 órán át tartottak, a reakcióidő kezdetét pedig az enzimek hozzáadásának pillanatától mértem. A méréseket 3 hőmérsékleti értéken végeztem, 30 °C, 50 °C illetve 70 °C-on. A reakcióelegyek az adott méréstől függően (D,L)- és/vagy (L)-tejsavat és etanolt tartalmaztak szubsztrátként, oldószerként pedig további mennyiségű etanolt, különböző összetételű foszfónium-típusú ionos folyadékokat vagy n-hexánt és a biokatalizátort (CALB, Candida rugosa). A mérési elegyekbe minden esetben az etanolt mértem be állandó mennyiségben, és ebből számoltam a szükséges monomer tejsavat, melyből megkaptam a bemérendő tejsav elegy mennyiségét. Az ionos folyadékokat a szubsztrátként felhasznált etanolhoz viszonyítottan mértem be. A reakcióelegy összetevői közül a tejsav oldat tartalmazott legnagyobb mennyiségben vizet, ezért a bemérésnél ezt figyelembe kellett venni. A legkisebb tejsav mennyiség hozzáadása esetében a kezdeti víztartalom 3 m/m% körüli értéket mutatott, ha ennél nagyobb mennyiségben adtam a tejsavat az elegyhez, a víztartalom egyenes arányosságban növekedett. Mivel a mérések közötti összehasonlítás azonos víztartalomnál lehetséges, a legnagyobb tejsavmennyiség bemérésekor kapott víztartalmat vettem alapnak, és erre az értékre állítottam a kezdeti víztartalmat, mely 8 m/m%-os volt. Ezért az összehasonlító vizsgálatokat nagyobb víztartalommal végeztem, mint amennyi az elérhető minimális mennyiség. A méréseket a pontos eredmények érdekében minden vizsgálat során 3 alkalommal végeztem el. Az így kapott eredményekből átlagot számítottam. Ahol az eredmények szórása 5%-nál nagyobb volt, ott újból elvégeztem a mérést. Ha a 3-ból 2 mérés már egymást megközelítő eredményt mutatott, akkor a két mérés átlagát fogadtam el végső eredményként. A kereskedelmi forgalomban kapható tejsav elegyek monomer tejsav tartalmát többen is mérték [Torres, 2001; Asthana, 2006], de Major és társainak mérési eredményeit vettem alapul, mivel ők azonos víztartalmú és ugyanazon gyártótól származó tejsav elegyet használtak a reakciókhoz. HPLC-vel történt méréseik szerint a Reanalnál forgalmazott 90%os tejsav elegy monomer tartalma 53%-os [Major, 2010]. Bebizonyították, hogy ha a hozamot a kezdeti monomer tartalomra vonatkoztatjuk, ez esetben 100% feletti értékeket is elérhetünk, mivel az észterezési reakció során a kondenzációs reakcióban keletkező víz a dimerekből és 49

oligomerekből további monomer tejsavat hidrolizál, mely szintén reakcióba léphet az etanollal. A hozamot minden esetben a kezdeti monomer tejsav mennyiségre vonatkoztattam. Chen szerint az enantioszelektív reakciót meg kell állítani legalább 50%-os hozamnál [Chen, 1987]. Az enantioszelektivitást vizsgáló mérési eredmények bemutatásánál az 50%-os hozam pontját abban az esetben jelöltem, amikor 24 órán belül elérte azt, és emellett számottevő (50% hozamnál 20% feletti) enantioszelektivitást is mértem. A reakció teljesebb megismerése érdekében a reakciót nem állítottam meg az 50%-os ponton, mert adott reakcióidő után tekintettem befejezettnek a méréseket. Azon kísérletsorozatok esetében, mikor az oldószer hatását vizsgáltam, a kísérleti tervet a „Statistica 8” kísérlettervező szoftverrel állítottam össze, és az eredményeket is a számítógépes

programmal

értékeltem ki.

n-Hexánban,

etanolfeleslegben és

ionos

folyadékokban végzett kísérletekhez 3 faktoros, 3 szintes (9 mérési pont) tervet készítettem, mivel ekkor még nem vizsgáltam az ionos folyadék mennyiségének hatását. A középponti mérések 3-szori ismétlésének átlagából volt számolható a szórás. Egyes későbbi vizsgálatokat hagyományos kísérlettervezéssel végeztem, melyben 4 faktort 3 szinten vizsgáltam 3-szori középponti mérések átlagával. 2.5.2. Vízeltávolítás Az észterezés során képződött víz eltávolításához a zeolit [Major, 2010] és a pervaporáció elterjedt megoldásnak számítanak [Ulbert, 2004; Major, 2010]. Az első módszer esetében 4Å pórusméretű (Buchs, Svájc) zeolitot adtam két különböző mennyiségben az elegyekhez, és a reakciók végén összehasonlítottam a hatást a zeolit nélkül elvégzett kísérlet eredményeivel. A pervaporációs eljárás lényege, hogy hidrofil membránon át vákuum segítségével távolítjuk el a rendszerben lévő felesleges vizet, melynek hatásfokát a fluxussal jellemezzük. A fluxus függ a membrán anyagától, felületétől, a hőmérséklettől és a vákuum nagyságától. Az alkalmazott rendszer sémáját a 10. ábra. ábra szemlélteti, képe a 11. ábra11. ábrán látható. A reaktorban (R) lévő mágneses keverővel kevertetett elegyet perisztaltikus pumpával (P-1) adjuk fel a membránmodulra (M). A csökkentett víztartalmú áramot visszavezetjük a reaktorba, a gőzfázisban lévő permeátumot pedig a C-1, C-2-es folyékony nitrogénes hidegcsapdákkal kondenzáltatjuk le. A membránmodul egy vizes termosztáttal (T) fűthető. Ennek lényege az, hogy a reakcióelegy hőmérsékletét a membrán feladási oldalán megemelve a víz könnyebben alakul át gőzfázisba, mely egy plusz hajtóerőt jelent. Az itt felmelegedett reakcióelegyet a duplafalú reaktor köpeny részében keringtetett hűtővíz tartja az adott reakcióhőmérsékleten. A P-2 jelű vákuumszivattyú biztosítja a membrán permeátum oldalán a 50

vákuumot. Az S-1, S-2 és Z-1 (szilikonolajos és zeolitos) csapdák védik a szivattyút az esetlegesen a hidegcsapdából tovább jutó víztől. Az alkalmazott membrán típusa PERVAP 2201 (Sulzer Chemtech GmbH, Németország). A reaktor mérete miatt a reagenseket 14-szeres mennyiségben mértem be a rázólombikos kísérletek mennyiségeihez képest. A mérési paraméterek a következők voltak: Membránfelület: 10 cm2 Vákuum: 0,1 bar Membrán modulba betáplált áram: 87 cm3/min Fluxus: 0,0017 cm3/(cm2*min) víz

10. ábra: A pervaporációs rendszer sémája

T: termosztát; R: duplafalú, kevert reaktor; M: temperálható membránmodul; P-1: perisztaltikus pumpa; P-2: vákuum szivattyú; C-1, C-2: hidegcsapdák; S-1, S-2: szilikonolajos csapdák; Z-1: zeolitos csapda; V-1, V-2, V-3: kétállású csapok; V-4: háromállású csap; T-1, T-2: hőmérsékletmérő; PI-1: nyomásmérő

51

11. ábra: A pervaporációs berendezés fényképe

2.5.3. Szuperkritikus CO2-dal végzett kísérletek A mérésekhez a berendezést a Maribori Egyetem Kémiai és Vegyészmérnöki Tanszéke biztosította. A reaktor egy 50 cm3 befogadóképességű nyomástartó edény, melyben egy mágneses keverő helyezkedik el, fenntartva ezzel az elegy homogenitását. A reaktort olajfürdő fűti a kívánt hőmérsékletig, az aktuális hőmérséklet pedig az elegybe merülő, külső csatlakozással ellátott hőmérsékletmérővel követhető. A CO2 külső kompresszor segítségével egy szabályozó szelepen keresztül juttatható a reaktortérbe. A belső nyomás nyomásmérő segítségével követhető. Mintavételre a reaktor fedél részébe épített szelep alkalmas. A reaktor védelmére egy hasadótárcsát is beépítettek, mely 320 bar nyomásnál hasad. A berendezés kapcsolási vázlata a 12. ábrán, képe a 13. ábrán látható.

52

12. ábra: A scCO2 reaktor kapcsolási rajza

P: szivattyú, C: CO2 előkezelő oszlop, T: hőmérsékletmérés, PI: nyomás mérő, R: kevert reaktor, M: mágneses keverő, V: golyós csap, SV: mintavevő csap, RV: hasadótárcsa, M: mintatartó edény

13. ábra: Berendezés a scCO2-dal végzett kísérletekhez

53

3. Eredmények és értékelés 3.1. Enzimek aktivitásának mérése A kísérletek során felhasznált kétfajta enzim aktivitásának vizsgálata azért volt szükséges, hogy azonos aktivitású enzimmennyiséggel történjenek az összehasonlító mérések. A kapott aktivitások alapján számoltam a bemérendő mennyiségeket. Az enzimek aktivitását 50 °C-on, 7-szeres alk/TS mólarány mellett, ionos folyadék hozzáadása nélkül határoztam meg etillaktát 24 órás előállítási reakciójában. Az aktivitás egységét 1 mU=1 mmol termék/(s*g enzim) értékben fejeztem ki (3. táblázat) 3. táblázat: A kísérletekhez felhasznált enzimek mért aktivitása és az egyes mérésekhez felhasznált mennyiségük Enzim

Aktivitás

Bemérendő mennyiség

Novozym 435

mU=1,2

0,05 g

Candida rugosa

mU=3,0

0,02 g

3.2. Enantioszelektivitás vizsgálata szerves oldószerekben A vizsgálatok során elsősorban az ionos folyadékokra és szuperkritikus CO 2-os rendszerekre koncentráltam, de az enantioszelektivitás összehasonlításához a méréseket n-hexánban és etanolfeleslegben (egyéb oldószer felhasználása nélkül) is elvégeztem, tekintve, hogy a tejsav etanollal történő észterezése során a hozam vizsgálatára már történtek mérések szerves oldószeres közegben [Hasegawa, 2008; Inaba, 2009; Major, 2010], de az enantioszelektivitást még senki sem határozta meg. Bodnár [Bodnár, 1990] és Ulbert [Ulbert, 2004] a tejsavhoz hasonló molekulát, a 2-klór-propionsavat észterezték n-hexánban. Mindkettőjük esetében 70% körüli enantiomerfelesleget értek el. Az eredményeikből kiindulva ennél nagyobb enantiomerfelesleg értékeket a méréseim során sem várhattam, mivel a 2-klór-propionsavhoz képest a tejsav oldódása rosszabb. Ennek ellenére alacsony értékek mellett jobban összehasonlíthatók a paraméterek hatásai. 3.2.1. n-Hexán Ebben az alfejezetben az n-hexánban folytatott mérési eredményeket mutatom be. A 4. táblázatban részletezett beállítások mellett 0,14 g (22,7 mmol) hexánt alkalmaztam oldószerként.

54

A 4. táblázat adataiból és a 15. ábra oszlopairól elsőként megállapítható, hogy a hozam egyik esetben sem haladta meg a 60%-ot, maximális értéke 55% volt, melyet a 6-os és a 9-es mérési pontok esetében mértem. Azonban n-hexán esetében ez korántsem mondható alacsony értéknek. Az említett pontoknál 70 °C-on zajlott a reakció 3-as alk/TS arány mellett. Ugyanezen a hőmérsékleten 11-es alk/TS aránynál a hozam csaknem a felére csökkent, de az is jól látható, hogy az alacsonyabb hőmérséklet is erősen csökkenti az észterhozamot. Elmondható tehát, hogy a magas hőmérséklet és a kisebb alk/TS arány volt pozitív befolyással a hozamra a vizsgált intervallumon. A magas hőmérsékleten nagyobb hozam ténye alátámasztja Inaba és társai [Inaba, 2009] mérési eredményeit, ám ők csak 50 °C-ig vizsgálták a hőmérséklet hatását. Hasegawa és munkatársai [Hasegawa, 2008] kimutatták, hogy hexános közegben a savmennyiség növekedésével tovább csökkent az amúgy is alacsony hozam (50 °C-on). Esetünkben ugyanígy igaz a tendencia, valamint a 14. ábra azt is bizonyítja, hogy a legnagyobb hatással az alk/TS arány és a hőmérséklet van a hozamra. 4. táblázat: n-Hexános közegben végzett 3 faktoros, 3 szintes kísérletek és a kiegészítő mérések beállításai és az ezekhez tartozó eredmények, CALB ezim jelenlétében Minta száma

1

2

3

4

5

6

7

8

9

k1

k2

T (°C)

30

30

30

30

50

70

70

70

70

50

50

alk/TS arány

3

11

11

3

7

3

11

11

3

15

19

víztartalom (m/m%)

8

8

16

16

12

8

8

16

16

4

4

1h

1,8

2,0

0,7

2,1

2,2

10,8

3,9

4,0

12,2

2,5

7,3

3h

4,8

3,4

1,5

4,7

7,6

29,5

11,2

11,2

30,6

4,4

15,1

5h

7,4

4,8

2,1

6,7

9,1

44,9

17,9

17,8

42,3

5,6

20,3

24 h

26,6

12,0

9,5

25,9

38,5

55,3

25,3

24,0

55,5

17,4

41,0

1h

2,4

32,7

6,0

0,2

1,7

0,2

4,2

1,9

0,3

28,3

30,3

3h

0,7

28,5

3,6

0,1

1,3

0,1

1,5

0,5

0,1

24,9

27,8

5h

0,1

25,5

2,3

0,1

1,1

0,1

0,8

0,2

0,1

21,9

26,3

24 h

0,10

11,9

1,1

0,0

0,1

0,1

0,4

0,1

0,0

0,3

20,0

hozam (%)

e.e. (%)

55

14. ábra: Az n-hexánban végzett mérések paramétereinek hatása a hozamra, CALB ezim jelenlétében

Major és társai [Major, 2010] 40 °C-on vizsgálták a reakciót n-hexános közegben. A reakcióelegy 0,2 mmol/cm3 racém tejsavat, 1 mmol/cm3 etanolt és 250 mg enzimet tartalmazott tejsav mmol-onként, ahol a reakcióelegy 5 cm3 térfogatú volt, a kezdeti víztartalom pedig 4,5 m/m%. Méréseik során enzim alkalmazása nélkül nem játszódott le a reakció. Az említett mennyiségű Novozym 435 használata mellett 14%-os hozamot mértek monomer tejsavra vonatkoztatva. A reakciót 5-ös alk/TS aránnyal végezték, mely közel áll a 2-es mérési pont paramétereihez, ahol a hozam közel azonos a mért eredményükkel. Az enantioszelektivitást nem lehet összehasonlítani irodalmi adatokkal, mivel erre a reakcióra más szerző még nem végzett méréseket. A 2. pont esetében mértem a legnagyobb enantioszelektivitást (e.e.1h=33%), mely a 24 órás reakcióidő végére 12%-ig csökkent. Az n-hexánban történt mérések egyértelműen mutatják, hogy alacsony hőmérséklet, alacsony víztartalom és nagy alk/TS arány szükséges az enantioszelektív reakció megvalósításához, de ebben az esetben a hozam csupán 12%-os volt. Mivel a 2. pont esetében az enantioszelektivitás értéke kiugróan nagy volt a többi mérési ponthoz képest, ezért a kísérleti adatokat két kiegészítő méréssel pontosítottam. A két további mérés 15-ös (k1) és 19-es (k2) alk/TS arány mellett történt 4 m/m%-os kezdeti víztartalom mellett 50 °C-on. Az k1-es pont estében az enantiomerfelesleg értéke 28% volt az első órában, de csekély hozam (17%) mellett. A k2-es pont viszont jobb eredményeket mutatott, itt az enantiomerfelesleg értéke 30% volt az első órában és a mérés végén is 20%-os maradt 41%-os hozam mellett. Elmondható, hogy a nagy alk/TS arány a vizsgált tartományban 56

nemcsak a hozamot emeli kisebb hőmérsékleten, hanem az e.e. értékét is. Ahogy látható a víztartalom csökkentésének hatása a vizsgálatoknak ezen a szintjén nem érzékelhető a hozamra nézve, az enantioszelektivitást kismértékben növeli, pl. a 2, 3-as pontok esetében.(További kiegészítő adatok a Függelék 58-64. ábráin láthatók)

Hozam (%) Enantiomerfelesleg (%)

Hozam (%) 24 óra után Enantiomerfelesleg (%) 1 óra után Enantiomerfelesleg (%) 24 óra után

80 70 60 50 40 30 20 10 0 1

2

3

4

5

6

7

8

9

k1

k2

Minta 15. ábra: Az n-hexánban történt 3 faktoros, 3 szintes kísérleti terv és a kiegészítő mérési pontok eredményei, CALB ezim jelenlétében

3.2.2. Etanolfelesleg (oldószermentes) Ebben a kísérletsorozatban nem használtam hozzáadott oldószert, csupán az alkohol feleslege jelentette a közeg médiumát. Az előző mérésekhez képest eltérő módon az alk/TS arányt nagyobbra állítottam. Az eddigi 3, 7 és 11-es alk/TS arányok helyett 7, 11 és 15-es arányt alkalmaztam, a többi paraméter értéke ugyanaz maradt (5. táblázat). Torres és társai [Torres, 2001] az oldószermentes közeg vizsgálatánál nem alkalmaztak további etanol mennyiséget, viszont Hasegawa és munkatársai [Hasegawa, 2008] a többi szerves oldószerben végzett kísérletükben alkalmazott etanol mennyiség kétszeresét adták az oldószermentes elegyhez, melynek következményeképp nagyobb észterhozamot mutattak ki, mint kisebb mennyiségű etanol esetében. Ez az oka annak, hogy az n-hexános kísérletekhez képest nagyobb mennyiségű etanollal vizsgáltam az oldószermentes közeg hatásait.

57

5. táblázat: Az etanolfeleslegben végzett kísérleti terv és a kiegészítő mérések beállításai a kapott eredményekkel, CALB ezim jelenlétében Minta száma

1

2

3

4

5

6

7

8

9

k1

k2

T (°C)

30

30

30

30

50

70

70

70

70

50

50

alk/TS arány

7

15

15

7

11

7

15

15

7

15

19

víztartalom (m/m%)

8

8

16

16

12

8

8

16

16

4

4

1h

1,3

3,5

0,9

0,9

1,8

7,5

4,3

2,4

5,5

4,3

2,8

3h

2,7

4,7

1,4

2,1

4,9

18,1

9,8

6,9

16,3

8,0

4,7

5h

4,0

6,7

2,2

3,2

7,0

27,0

14,3

11,1

25,8

11,2

6,2

24 h

15,5

12,9

6,4

11,2

37,5

81,2

42,9

40,1

73,6

37,8

13,7

1h

5,2

40,5

16,5

1,6

4,1

0,8

5,6

2,7

0,4

19,5

30,1

3h

2,6

37,5

10,8

1,2

1,4

0,3

2,6

0,9

0,3

12,7

28,1

5h

2,1

35,8

7,0

0,7

0,8

0,1

1,7

0,7

0,2

9,4

26,8

24 h

0,3

22,2

1,9

0,4

0,2

0,0

1,0

0,0

0,1

2,9

18,6

hozam (%)

e.e. (%)

16. ábra: Etanolfeleslegben végzett mérések paramétereinek hatása a hozamra, CALB ezim jelenlétében

Az 5. táblázatban és a 17. ábrán (valamint a Függelék 65-71. ábráin) bemutatott eredmények szerint a 2. pont paraméterkombinációjával értem el a legnagyobb enantiomerfelesleget 40% értékben, viszont emellett a hozam csak 13%-os lett. Egyértelműen látszik, hogy a nagy hőmérséklet miként növeli a hozamot az enzim aktivitásának növelésével, ám ezzel együtt az enantioszelektivitás csökken. A 16. ábra megmutatja, hogy a legnagyobb hatást a hőmérséklet 58

játssza a reakció során. Az eredmények értékeléséből kiderül, hogy az enantiomerfeleslegnek inkább az alacsony hőmérséklet, a nagy alk/TS arány és a kis víztartalom kedvez, ahogy a 2. pontban látható. A nagy enantiomerfelesleg értéke miatt kiegészítő méréseket végeztem a hexános kísérlettel azonos módon. Ahogy az alk/TS arányt növeltem, a 3 faktoros, 3 szintes kísérleti terv 2-es pontjában bemutatott enantiomerfelesleg értéke csökkent, viszont a hozam növekedett. Erre a jelenségre igaz Bodnár és társainak [Bodnár, 1990] megfigyelése. Ahogy az alkohol feleslegét növelték, először növekedni kezdett a hozamot, majd csökkentette azt. Ez figyelhető meg a 67, 9-8, k1-k2 pontokat összehasonlítva. Magyarázata az volt, hogy a növekvő alkoholmennyiség megváltoztatja a folyadék és szilárd fázis közötti víz eloszlását. Az enzim vízburkának csökkenése miatt következik be a hozam csökkenése. Azt is leírta, hogy az enantioszelektivitást az alkohol mennyiségének növelésével érte el a maximális értéket, mely a k1-k2 pontok esetében is megfigyelhető. Inaba [Inaba, 2009] megállapítása is érvényes, mivel a magasabb hőmérséklet itt is előnyösen befolyásolta az észterhozamot.

Hozam (%) Enantiomerfelesleg (%)

Hozam (%) 24 óra után Enantiomerfelesleg (%) 1 óra után Enantiomerfelesleg (%) 24 óra után

90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 1

2

3

4

5

6

7

8

9

k1

k2

Minta 17. ábra: Etanolfeleslegben történt 3 faktoros, 3 szintes kísérleti terv és a kiegészítő mérési pontok eredményei, CALB ezim jelenlétében

3.3. Ionos folyadékok katalizátor hatásának vizsgálata A biokatalitikus reakciók közegeként előszeretettel alkalmaznak ionos folyadékokat, mert stabilizálják az enzimet, valamint aktivitását is egyes esetekben növelik. Az irodalomban viszont számos olyan vizsgálati eredményt is találhatunk [Yue, 2011; Fan, 2012], melyek az ionos folyadékok katalitikus hatását mutatják be, tehát néhány közülük katalizálja a 59

reakciókat, sok esetben az enzim hatását elnyomva, mely méréseim során hátrányt jelent. Célom az volt, hogy az enzimek enantioszelektivitását vizsgáljam, az ionos folyadékok melyek savas katalizátorokként működnek [Bradaric, 2003]

viszont nem enantioszelektívek,

így a reakció az ionos folyadék katalízise révén zajlik le, melynek végeredményeképp racém termékelegy képződik, az enzim működése pedig háttérbe szorul. Ezért elsőként megvizsgáltam 10 olyan Cyphos-típusú ionos folyadékot, melyek az észterezési reakció során várhatóan felhasználhatók. A megfelelő ionos folyadék minimálisan vagy egyáltalán nem katalizál, vagyis az oldószer szerepét kell betöltenie, mely az enzimre pozitív hatást gyakorol. A méréseket 30 és 70 °C-on végeztem, mely a kísérleteim általános hőmérsékleti intervalluma. A 30 °C-on történő kísérletekhez mind a 10 ionos folyadékot felhasználtam. Egy további referenciaelegyhez pedig nem adtam ionos folyadékot, hogy a reakció autokatalízisével összehasonlítható legyenek az ionos folyadékokban vizsgált reakciók. Fontos megjegyezni, hogy 30 °C-on a Cyphos 110, 163 és 166-os ionos folyadékok szilárd halmazállapotúak. A Cyphos 163 és 166 oldódását segíti az alkohol jelenléte melegítés nélkül is, ezért a kísérletek elvégezhetőek voltak 30 °C-on. A Cyphos 110-es ionos folyadék nem oldódik a reagensekben, és 39 °C felett válik folyadék halmazállapotúvá, ezért ez esetben 40 °C-on vizsgáltam a katalitikus hatást (6. táblázatban *-gal jelölve). A Cyphos 110 a többi ionos folyadéktól eltérően nem elegyedik vízzel, ezért a rendszer kétfázisú volt (immobilizált enzimet is beleértve 3 fázisú), a termék a vizes fázisban helyezkedett el. Mindegyik reakcióelegy 2 g (44 mmol) etanolt, 1,1 g (D,L)-tejsavat (monomer tejsav tartalma 6,2 mmol) (alk/TS arány=7) tartalmazott, az IL/alk arányt 0,5-szörös értékre állítottam, kivétel az autokatalízis vizsgálata esetében. Az eredményeket a 18. és 19. ábrák és a 6. táblázat mutatja be.

60

120

Ionos folyadék nélkül Cyphos 102 Cyphos 103 Cyphos 104 Cyphos 105 Cyphos 106 Cyphos 109 Cyphos 110 Cyphos 163 Cyphos 166 Cyphos 201

100

Hozam (%)

80 60 40 20 0

0

5

10

15

20

25

30

Idő (h)

18. ábra: A vizsgált észterezés hozama enzim hozzáadása nélkül, 10 különböző ionos folyadékban és a nélkül 30 °C-on, 24 óra reakcióidő során (Cyphos 110 esetében 40 °C-on)

140 Ionos folyadék nélkül

120

Cyphos 103

Hozam (%)

100

Cyphos 104

80

Cyphos 105 60 Cyphos 109 40

Cyphos 110 20

0 0

5

10

15

20

25

30

Idő (h)

19. ábra: A vizsgált észterezés hozama enzim hozzáadása nélkül, 10 különböző ionos folyadékban és a nélkül 70 °C-on, 24 óra reakcióidő során

61

6. táblázat: Az ionos folyadékok katalitikus hatásának számszerű eredményei 30 és 70°C-on, 24 óra után Hozam (%)

Reakcióközeg

30 °C

70 °C

IL nélkül

2,1

30,7

Cyphos 102

118,3

-

Cyphos 103

9,0

59,1

Cyphos 104

12,7

70,7

Cyphos 105

6,4

44,6

Cyphos 106

108,8

-

Cyphos 109

33,8

110,4

Cyphos 110

26,2*

130,1

Cyphos 163

100,4

-

Cyphos 166

54,7

-

Cyphos 201

99,5

-

Hozam (%) 30 °C-on Hozam (%) 70 °C-on

140

Hozam (%)

120 100 80

60 40 20 0

Reakcióközeg

20. ábra: A vizsgált ionos folyadékok katalizátor hatása 24 óra reakcióidő után, 30 és 70 °C-on

A 20. ábrán jól látható, hogy a 30 °C-os vizsgálatoknál a 10-ből 5 ionos folyadék erős katalitikus hatást mutatott. A Cyphos 102 118%, a Cyphos 106 108%, a Cyphos 163 100%, a Cyphos 166 55% és a Cyphos 201 100%-os hozamot eredményezett a 24 órás kísérlet végére, melyekhez képest a referenciaelegyben csak 2,1%-os (nem enantioszelektív) észterhozamot mértem. Az eredmények alapján kijelenthető, hogy az említett 5 ionos folyadék nem alkalmas reakcióközegként való felhasználáshoz az enantioszelektív reakciók végrehajtása során.

62

70 °C-on csak azt az 5 ionos folyadékot vizsgáltam, melyek 30 °C-on nem eredményeztek nagy hozamot. A referenciaelegyben 30%-os észterhozamot mértem. Ez az érték reális, mivel a reakció autokatalizált lehet [Asthana, 2006] a parciálisan disszociált karbonsavból felszabadult hidrogén kation miatt, mely a katalízisért felelős. A reakciósebesség pedig a hőmérséklettel növekszik, így a 70 °C-os hőmérséklet a mérések szerint már nem alkalmas az enantioszelektivitás vizsgálatára, de a továbbiakban célszerű volt meghatározni, hogy mi az a hőmérsékleti határ, ahol még jól mérhető enantioszelektivitás tapasztalható. Az ionos folyadék nélküli reakció hozamát a Cyphos 109 és 110 nagymértékben felülmúlta, 110% és 130% értékben. Az adatok alapján kijelenthető, hogy a mérések kivitelezéséhez legalkalmasabb ionos folyadékok a Cyphos 103, 104 és 105. Összehasonlítva eredményeimet a korábbi munkákkal, Major [Major, 2010] 7 fajta Cyphos ionos folyadék katalitikus hatását tanulmányozta (Cyphos 102, 104, 106, 110, 163, 166 és 202). Enzim használata nélkül 40 °C-on történtek a kísérletek. A reakcióelegyek 1,3 mmol/cm3 tejsavat, 9,3 mmol/cm3 etanolt tartalmaztak. Az elegyek teljes térfogata 1,5 cm3 volt, az ionos folyadék pedig 3 m/m% víztartalommal rendelkezett. Vagyis az elegyekben az alkohol 7-szer akkora mennyiségben volt jelen, mint a monomer tejsav. Cyphos 104 és Cyphos 202 közegében mérte a legkisebb hozamot 2%-os értékben. Cyphos 102-ben 59%, 106-ban 72%, 166-ban 87%, 163-ban pedig 102%-os hozamot ért el. Észlelte, hogy a Cyphos 104-es kis katalitikus hatással bír alacsony hőmérsékleten, utána a Cyphos 110-es következik a sorban. Mérései alapján is egyértelműen kijelenthető, hogy a Cyphos 102, 106, 163 és 166 közegében elegendően nagy hozam érhető el ahhoz, hogy a reakciók kivitelezéséhez alkalmatlannak nyilvánítsuk őket.

3.4. Enantioszelektivitás vizsgálata ionos folyadékokban A katalitikus előkísérleteket követően az 5 kiválasztott ionos folyadék közegében 9-pontos (3 faktoros, 3 szintes) kísérleti tervben meghatározott paraméterkombinációkkal (7. táblázat) (paraméterek: hőmérséklet, alk/TS arány, kezdeti víztartalom) tanulmányoztam az enantioszelektivitás és a hozam mértékét CALB enzim jelenlétében (50 mg). Az alkoholt konstans 2 g (44 mmol) mennyiségben adtam hozzá az elegyekhez, a tejsav mennyiségét ennek megfelelően állítottam be 3-as (14,6 mmol), 7-es (6,2 mmol) és 11-es (4 mmol) alk/TS arányt produkálva. A kezdeti víztartalom értékei: 8, 12, 16 m/m%. Az ionos folyadékot 1 IL/alk arányban adtam az elegyekhez. A mérésekhez azért használtam CALB enzimet, mivel a legtöbb munkában ezt alkalmazták a tejsav észterezés során [Hasegawa, 2008; Inaba, 2009; Major, 2010; Ohara, 2011]. Más 63

enzimekkel összehasonlítva is CALB-bal érték el a legnagyobb hozamot [Torres, 2001]. A Candida rugosa lipázzal való összehasonlításra a későbbiekben (3.5.2. fejezet) került sor. 7. táblázat: Az ionos folyadékokkal végzett mérések 3 faktoros, 3 szintes kísérleti terve Minta száma

1

2

3

4

5

6

7

8

9

T (°C)

30

30

30

30

50

70

70

70

70

alk/TS arány

3

11

11

3

7

3

11

11

3

víztartalom (m/m%)

8

8

16

16

12

8

8

16

16

3.4.1. Cyphos 103, 105, 109 és 110 ionos folyadékokban végzett kísérletek A 22. táblázat és a Függelék 72-79. ábrái mutatja a Cpyhos 103-mal végzett kísérletek mérési eredményeit. Látható, hogy a 2-es és 3-as kísérleti pontban mutatkoztak a legnagyobb e.e. értékek (22 illetve 20%) a 24 órás mérés végére. A két pont közül a 2-diknál volt számottevő a hozam: közel 50%. A szoftveres kiértékelés azt mutatta, hogy a hőmérséklet játssza a legnagyobb szerepet (p=2,97): a hozam esetében inkább a magasabb hőmérséklet a kedvező, az enantioszelektivitás esetében viszont inkább az alacsony. Az említett két pont alapján elmondható, hogy a hozam és az enantioszelektivitás azonos pontban mérhető nagy értékeinek eléréséhez a kisebb hőmérséklet és víztartalom valamint a nagyobb alk/TS arány előnyös. A 2. pontban mért nagy hozam és enantioszelektivitás miatt kiegészítő méréseket végeztem (k1, k2), 50 °C-on és 15-, 19-es alk/TS arány mellett, 4 m/m% kezdeti víztartalommal (Függelék 17. táblázat). Az alk/TS arány növelésének és a víztartalom csökkentésének nem volt szignifikáns hatása az enantioszelektivitásra, az alk/TS arány további növelése pedig rontott a hozam mértékén. A Függelék 18. táblázatának adatai és 80-87. ábrái szemléltetik a Cyphos 105-tel végzett kísérletek eredményeit. Az enantioszelektivitás értékei elhanyagolhatóan alacsonyak voltak, ezért a következőkben már nem vizsgáltam tovább ezt az ionos folyadékot. A hozam 70 °Con mutatott 46 illetve 38%-os értékeket a 7-es és 8-as pont esetében. Tehát annyi elmondható a Cyphos 105-ös ionos folyadék közegében végzett kísérletekről, hogy a magas hőmérséklet előnyösen befolyásolja a hozamot. A két pont esetében az alk/TS arányt 11-es értékre állítottam, mely az eddigi tapasztalatok példáját követve nagy hozamot eredményezett. A 7-es pont esetében 8-szoros, a 8-as pont esetében 16-szoros kezdeti víztartalommal indult a

64

reakció. Látható az is, hogy az alacsonyabb víztartalommal közel 10%-kal nagyobb hozamot értem el. A Cyphos 109-cel végzett mérések eredményei a Függelék 19. táblázatában és a 88-95. ábráin láthatók.

Ebben

az

esetben

is

elmondható,

hogy nem

mutatkozott

számottevő

enantioszelektivitás. Annyi talán megemlíthető, hogy a 3-as és 9-es pontok esetében megfigyelhető némi enantioszelektivitás. Ha a 9-es pontban mért csekély értéktől eltekintünk, akkor megállapítható, hogy a 3-as pontban mért e.e. érték valószínűleg a nagy alk/TS aránynak köszönhető, de ennek hatását nem lehet kihasználni az általunk kitűzött célokhoz. Hozamra nézve mutatkoztak 100% közeli és a feletti értékek is a 7, 8, 9 pontok esetében. Megfigyelhető, hogy mindhárom érték magas hőmérséklet mellett volt mérhető. Ehhez hozzájárul az a korábban kapott eredmény, hogy az ionos folyadékok katalizátor hatásának vizsgálata során a Cyphos 109-es 70 °C-on már 100% feletti hozamot mutatott, vagyis a jelenlegi magas érték 70 °C-on már valószínűleg nem az enzim működésének köszönhető, hanem az aktuális ionos folyadéknak. A 3.3-as fejezetben bemutatott eredmények szerint a Cyphos 110-es erősen katalizál 70 °Con, ezért ezen a hőfokon nem végeztem kísérleteket, mivel mindenképp elnyomja az enzim hatását. Tekintve, hogy a Cyphos 110-es 30 °C felett válik folyadék halmazállapotúvá, a legalacsonyabb hőmérsékleten is elhagytam a vizsgálatokat. Ezért csak három reakció lefutását vizsgáltam különböző paraméter értékek mellett: 1-es pont: 3-as alk/TS arány, 16 m/m% kezdeti víztartalom 2-es pont: 7- es alk/TS arány, 12 m/m% kezdeti víztartalom 3-as pont: 11- es alk/TS arány, 8 m/m% kezdeti víztartalom Az 50 °C-os vizsgálati eredményeket a Függelék 20. táblázata szemlélteti. A hozam az alk/TS arány növelésével és a víztartalom csökkentésével csökkent 68%-ról 40%-ra, tehát Cyphos 110 esetében nem érvényesülnek az eddigi tendenciák. Az enzim ebben az ionos folyadékban csekély mértékű enantioszelektivitást mutatott. 3.4.2. Cyphos 104 A 21. ábra és a Függelék 21. táblázatának eredményei mutatják a Cyphos 104-es ionos folyadékban végzett 3 faktoros, 3 szintes kísérlettervezés eredményeit. Látható, hogy a 2. és 3. pont esetében nagy enantioszelektivitást mértem (e.e.2/1 h=35%, e.e.3/1h=33%), mely a 2. pont esetében a 24 órás reakció végére csak 22%-os értékre csökkent a 3-as pontban mért 17%-kal szemben. A mért legnagyobb hozam a legnagyobb enantioszelektivitás mellett 56% és 18%, melyek közül a 2. pont kiemelkedőnek számít, mivel az összes ionos folyadékos, n65

hexános és alkoholfeleslegben végzett kísérletek közül ez az a pont, ahol a nagy hozam mellé nagy enantioszelektivitás párosul. Az említett 2. és 3. mérési pont esetében is 30 °C-os hőmérsékleten és 11-es alk/TS arány mellett zajlott a reakció. A 6-9-es pontokkal összehasonlítva megfigyelhető, hogy a magas hőmérséklet (70 °C) az enzim aktivitását növeli, de egyúttal csökkenti annak enantioszelektivitását. Az is egyértelműen látszik, hogy a nagyobb alk/TS arány is növeli a hozamot (7., 8. pont), és kisebb hőmérséklet mellett az e.e. értékeket is. Ami a víztartalmat illeti, a 2-3. és 7-8-as pontok összevetésekor megbizonyosodhatunk róla, hogy mind a hozamot, mind az enantioszelektivitást csökkenti. Ezeket a tényeket alátámasztják a szoftveres kiértékelés eredményei, melyek a 22-29. ábrákon láthatók. A 25. ábra a hozamra vonatkoztatott pareto diagramot mutatja, melyen azt is megadja, hogy ebben a rendszerben a leginkább befolyásoló faktor a hőmérséklet és a kezdeti víztartalom. Az enantioszelektivitásra szintén a hőmérséklet a legerősebben ható paraméter, utána következik az elegy kezdeti víztartalma (26. ábra). Az előzőekben vizsgált egyes reakcióközegekhez képest nagyobb számban végeztem kiegészítő méréseket Cyphos 104 esetében. Ezért és a mérések felépítése miatt a következő fejezetekben mutatom be ennek eredményeit.

Hozam (%) Enantiomerfelesleg (%)

Hozam (%) 24 óra után Enantiomerfelesleg (%) 1 óra után Enantiomerfelesleg (%) 24 óra után

80 70 60

50 40 30 20 10 0 1

2

3

4

5

6

7

8

9

Minta 21. ábra: A 3 faktoros, 3 szintes kísérlettervezés eredményei Cyphos 104-es ionos folyadékban, CALB ezim jelenlétében

66

22. ábra: A hőmérséklet és az alk/TS arány hatása a hozamra Cyphos 104-ben, CALB enzim használata mellett

23. ábra: A kezdeti víztartalom és az alk/TS arány hatása a hozamra Cyphos 104-ben, CALB enzim használata mellett

24. ábra: A hőmérséklet és a kezdeti víztartalom hatása a hozamra Cyphos 104-ben, CALB enzim használata mellett

25. ábra: A Cyphos 104-ben végzett reakciók paramétereinek hatása a hozamra, CALB enzim használata mellett

26. ábra: A hőmérséklet és az alk/TS arány hatása az enantioszelektivitásra Cyphos 104ben, CALB enzim használata mellett

27. ábra: A kezdeti víztartalom és az alk/TS arány hatása az enantioszelektivitásra Cyphos 104-ben, CALB enzim használata mellett

67

29. ábra: A Cyphos 104-ben végzett reakciók paramétereinek hatása az enantiomerfeleslegre, CALB enzim használata mellett

28. ábra: A hőmérséklet és a kezdeti víztartalom hatása az e.e. értékre Cyphos 104ben, CALB enzim használata mellett

Számos szerző megállapította, hogy az enzimes szintézisek nagyobb hozammal játszódnak le ionos folyadékokban, mint hagyományos oldószerekben. Schöfer [Schöfer, 2001] szerint ionos folyadékban az enantioszelektivitás is magasabb, Bornscheuer pedig CALB enzim esetében állapította meg ugyanezt [Bornscheuer, 2002]. Abe és társai [Abe 2008] foszfóniumtípusú ionos folyadékban és diizopropil-éterben végeztek lipázos észterezést, és kimutatták, hogy ionos folyadékban nagyobb észterhozam érhető el. Az eddigi eredmények részben igazolják, részben cáfolják e megállapításokat. A különböző közegekben végzett mérések eredményeit a 30. ábra hasonlítja össze, melyen a legnagyobb mért e.e. értékeket (24 h) és az ezekhez tartozó hozamot ábrázoltam. n-Hexános közegben végzett kísérletekhez képest általánosságban véve valóban növekedett a hozam az ionos folyadékokkal összehasonlítva. A legnagyobb hozam hexánban 55%-os volt, a vizsgált ionos folyadékokban pedig 46% és 121% között változott. Az n-hexános kísérletekhez képest (e.e.24 h=20%) az enantioszelektivitás hasonló volt Cyphos 103-as és 104es ionos folyadékokban (e.e.24 h=21%, 22%). Az etanolfeleslegben végzett tejsav észterezés eredményei kissé meghaladták az egyes Cyphosokban mért értékeket, mivel a legnagyobb e.e. 22%, hozam esetében pedig 81% volt, viszont más-más mérési pontban. Végül elmondható, hogy Cyphos 104-es IL-ben jobb eredményeket értem el abból a szempontból, hogy találtam paraméter értékeket, melyek alkalmazásával egy mérési pontban érhető el viszonylag nagy hozam és enantioszelektivitás. Cyphos 104 esetében azonos paraméter értékek mellett mértem 56%-os etil-laktát hozamot és 22%-os e.e. értéket 24 óra után. Az ionos folyadékos rendszer mellett szóló további érv az is, hogy az oldószermentes (etanolfelesleg) közeghez képest kevesebb vegyszerre van szükség, ráadásul az ionos folyadék újra felhasználható lényegében 68

veszteség nélkül. Ezért lett a további vizsgálatok tárgya a Cyphos 104-es ionos folyadékos rendszer bővebb megismerése. Hozam (%) 24 óra után

Enantiomerfelesleg (%) 24 óra után

Hozam (%) Enantiomerfelesleg (%)

70 60 50 40 30 20 10 0

Oldószer 30. ábra: Különböző közegekben mért legnagyobb enantiomerfelesleg és az ezzel egy pontban mért hozam 24 óra reakcióidő elteltével, CALB enzim használata mellett

A 4. ábrán Chen különböző E értékek mellett ábrázolta a reakciók enantiomerfeleslegének alakulását a hozam függvényében. A 31. ábrán látható a Cyphos 103, 104, 105, 109 ionos folyadékokkal végzett kísérletek eredményeit ábrázoló hasonló diagram. Az E értékei a következők: ECyphos 103: 1,89 ECyphos 104: 1,95 ECyphos 105: 1,11 ECyphos 109: 1,46 Látható, hogy az E értékek a 4. ábra 3A részével hasonlíthatók össze, ahol a 10-es nagyságrend érvényes. Ez azt is jelenti, hogy az enantioszelektivitás nem mondható nagynak, de ahhoz, hogy az optimális paraméter értékeket meghatározzuk, elegendő.

69

40 35

Enantiomerfelesleg (%)

30 25 Cyphos 103

20

Cyphos 104

15

Cyphos 105

10

Cyphos 109

5 0 0

10

20

30

40

50

60

Hozam (%)

31. ábra: A 24 óra reakcióidő után mért enantiomerfelesleg a hozam (24 h) függvényében különböző ionos folyadékokban, CALB enzim használata mellett

3.5. Candida antarctica lipáz B és Candida rugosa enzimek tulajdonságainak összehasonlítása Cyphos 104 ionos folyadékban 3.5.1. Enantioszelektivitás és hozam vizsgálata CALB enzimmel A megfelelő reakcióközeg kiválasztása után összehasonlítottam a CALB és Candida rugosa enzimek hatásait. Az előző kísérletsorozatokhoz képest annyival bővítettem ki a méréseket, hogy az ionos folyadék mennyiségét is a független paraméterek között vizsgáltam a hőmérséklet, az alk/TS arány és a kezdeti víztartalom mellett. Egy 4 faktoros, 3 szintes kísérleti tervet állítottam össze (8. táblázat), mely a következő rendszerre épült: Először az alk/TS arányt és az ionos folyadék mennyiségét mértem együtt 5 mérési pontban, ahol a 3, 7 és 11-es alk/TS arány értékeit együtt vizsgáltam a 0,5; 0,75; 1-es IL/alk aránnyal. A szélső értékeket közös pontokban mértem, a köztes értékekkel pedig egy középponti mérést történt. A többi paramétert eközben állandó értékre állítottam. A mérési pontok: 3-as alk/TS arány, 0,5-ös IL/alk arány 3-as alk/TS arány, 1-es IL/alk arány 7-as alk/TS arány, 0,75-ös IL/alk arány 11-es alk/TS arány, 0,5-ös IL/alk arány 11-es alk/TS arány, 1-es IL/alk arány

70

A következőkben az alk/TS arány mellett a változó paraméter a hőmérséklet volt, majd a kezdeti vízmennyiség az előzőekhez hasonló módszerre alapozva. 8. táblázat: A Cyphos 104-ben, CALB enzimmel végzett 4 faktoros, 3 szintes kísérleti terv mérési pontjai és eredményei Minta száma

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

T (°C)

50

50

50

50

50

70

70

30

30

50

50

50

50

alk/TS arány víztartalom (m/m%)

3

3

7

11

11

3

11

3

11

7

3

11

7

8

8

8

8

8

8

8

8

8

8

16

16

12

IL/alk arány

0,5

1

0,75

0,5

1

1

1

1

1

1

1

1

1

1h

1,0

0,1

0,1

2,3

9,1

5,4

6,7

0,5

4,4

3,5

1,8

1,5

2,2

3h

5,6

5,0

3,2

3,2

20,0

17,5

20,1

1,3

12,6

5,7

4,1

2,8

3,7

5h

9,3

7,3

8,1

9,0

27,3

22,4

33,9

2,0

17,8

7,0

5,8

3,4

4,9

24 h

35,1

31,8

25,7

37,5

57,1

66,0

73,4

5,9

55,5

21,1

21,3

10,8

14,5

1h

0,7

6,6

11,9

29,3

30,8

2,6

13,0

10,2

35,1

11,0

3,78

10,4

6,34

3h

0,6

3,2

10,1

22,2

28,2

0,8

2,4

5,7

34,6

9,8

3,7

5,2

2,7

5h

0,3

0,6

4,8

18,2

26,8

0,2

0,0

3,6

32,5

5,0

0,5

2,6

1,2

24 h

0,1

0,0

1,0

14,7

19,0

0,0

0,0

0,9

22,1

1,0

0,1

0,5

0,5

21,8

0,0

hozam (%)

e.e. (%)

e.e. (%) 50%os hozamnál

22,8

Hozam (%) Enantiomerfelesleg (%)

Hozam (%) 24 óra után Enantiomerfelesleg (%) 1 óra után Enantiomerfelesleg (%) 24 óra után

80 70 60 50 40 30 20 10 0 1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

Minta 32. ábra: A Cyphos 104-ben, CALB enzimmel végzett 4 faktoros, 3 szintes kísérleti terv eredményei

71

A 32. ábra mutatja a mérési eredményeket, melyen jól látható a hozam és az e.e. érték együttes alakulása. Azok a pontok számítanak eredményesnek, ahol a nagy hozam mellett 24 óra után is nagy e.e. értékeket mértem. Ennek értelmében az 5. és a 9. pont számít kedvezőnek. A hozam mindkét esetben túllépte az 50%-ot. Az 5. pont esetében az e.e. érték az első órában 31% volt, és a reakció végére is megmaradt 19%-on, a 9. pont esetében 35% és 22% körül alakultak az értékek. Az eredmények és az előző fejezetek megállapításait is figyelembe véve kijelenthető, hogy a hőmérséklet az a paraméter, mely ellentétesen hat a hozamra és az enantioszelektivitásra, mivel előbbit előnyösen befolyásolja, az utóbbit viszont csökkenti. 3.5.2. Enantioszelektivitás és hozam vizsgálata Candida rugosa enzimmel Az eddigi tapasztalatok szerint a Candida antarctica lipáz B enzimen kívül más enzimek is mutathatnak enantioszelektivitást a tejsav észterezése során, ezért az irodalomban sokat említett Candida rugosa (korábban Candida cylindracea) enzimmel is végeztem kísérleteket. A vizsgálathoz ugyanazt a kísérleti tervet használtam fel, mint a 3.5.1-es fejezetben, de az azonos aktivitás érdekében 20 mg enzimet mértem a reakcióelegyekhez (9. táblázat). A 33. ábra mutatja a kapott kísérleti eredményeket, melyen a hozam és az enantioszelektivitás összevethető. A Candida rugosa-val végzett kísérleti eredmények azt mutatták, hogy azonos körülmények között alacsonyabb a hozam, mint CALB esetében. A 2. és a 9. vizsgálati pont első órájában figyelhető meg nagy enantioszelektivitás, melyek e.e. értékei 1 óra után 38% illetve 32%, melyek a vizsgálat végére 0-hoz közelítettek. Az említett pontok esetében a hozam 33% és 25%, melyek elmaradnak a CALB-bal végzett kísérletek 5. és 9. pontjától (34, 35. ábra). A Candida rugosa-val végzett mérések eredményei arra engednek következtetni, hogy az adott körülmények között ez az enzim nem alkalmas a céljaink megvalósítására. Bodnár [Bodnár, 1990] és Ulbert [Ulbert, 2004] vizsgálataiban Candida rugosa enzimet alkalmaztak 2-klór-propionsav enantioszelektív észterezéséhez. Esetükben a maximális e.e. érték 70%-körüli volt 42%-os hozam mellett. Ez meghaladja a méréseim során kapott értékeket, de az eltérés magyarázható a különböző reakcióval. Persson és társai megfigyelték, hogy a lipázok többségének enantioszelektivitására nincs hatással a reakcióelegy víztartalma, kivéve Candida rugosa esetében, ahol a kisebb víztartalom nagyobb enantiomerfelesleget eredményezett [Persson, 2002]. Bodnár és munkatársainak megfigyelései ugyanezt támasztják alá. Méréseim során nem csak a víztartalom szerepét vizsgáltam, ezért az 1-10 pontok esetében más paraméterek hatása is érvényesül a kis víztartalom mellett, de kimondható, hogy nagy víztartalmi értékek mellett az enzim nem mutatott számottevő enantioszelektivitást. 72

Torres és társai [Torres, 2001] 4 féle lipáz enzimmel (CALB, Lypozyme, Candida rugosa, Pseudomonas sp.) vizsgálták a tejsav észterezésének körülményeit. Megállapították, hogy a felsorolt enzimek közül CALB-bal érhető el a legnagyobb hozam. A mérési eredményeim alátámasztják Torres megállapítását. 9. táblázat: Cyphos 104-ben Candida rugosa lipázzal végzett 4 faktoros, 3 szintes kísérleti terv eredményei hozam (%)

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

1h

0,5

0,4

0,1

0,2

7,6

3,3

2,1

0,5

2,9

3,3

0,5

1,4

2,0

3h

4,4

2,8

2,5

5,4

15,3

13,6

7,4

1,6

7,6

5,2

2,4

2,5

3,1

5h

7,1

5,2

6,4

7,0

23,7

20,8

10,9

2,2

10,5

6,7

3,1

3,2

4,1

24 h

33,2

32,9

23,1

13,8

35,4

40,0

41,3

4,7

25,0

22,4

10,3

10,4

15,8

1h

2,7

38,3

4,6

11,9

15,9

1,2

4,7

10,4

32,1

4,0

5,6

13,3

8,0

3h

1,5

11,4

3,7

4,1

3,3

0,7

1,4

3,0

10,9

3,0

1,8

10,2

7,5

5h

0,6

1,1

2,9

3,3

4,9

0,6

1,0

1,5

7,4

2,5

0,3

7,6

3,3

24 h

0,0

0,5

0,7

2,9

0,6

0,2

0,1

0,3

2,6

0,4

0,1

0,0

1,6

e.e. (%)

Hozam (%) Enantiomerfelesleg (%)

Hozam (%) 24 óra után Enantiomerfelesleg (%) 1 óra után Enantiomerfelesleg (%) 24 óra után

50 40 30 20 10 0 1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

Minta 33. ábra: A 4 faktoros, 3 szintes kísérleti terv eredményei Candida rugosa esetében, Cyphos 104-es ionos folyadékban

73

Hozam (%) 24 óra után - Candida antarctica Hozam (%) 24 óra után - Candida rugosa

80

Hozam (%)

70 60 50 40 30 20 10

0 1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

Minta 34. ábra: A Candida antarctica lipáz B és Candida rugosa enzimekkel, Cyphos 104-ben mért hozamok összehasonlítása 24 óra után

Enantiomerfelesleg (%) 24 óra után - Candida antarctica

Enantiomerfelesleg (%)

Enantiomerfelesleg (%) 24 óra után - Candida rugosa

25

20 15 10 5 0 1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

Minta 35. ábra: A Candida antarctica lipáz B és Candida rugosa enzimekkel, Cyphos 104-ben mért enantiomerfelesleg értékek összehasonlítása 24 óra után

A 3.2. fejezetben n-hexánban és oldószermentes (etanolfelesleg) közegben vizsgáltam a választott paraméterek hatásait. Mindkét esetről elmondható, hogy nem találtam olyan kísérleti pontot, melynél az e.e. értéke és a hozam is elegendően nagy lett volna. Ezért a vizsgálatokat ionos folyadékos közegben folytattam. Ekkor 10 féle Cyphos-típusú ionos folyadék katalizátor hatását mértem. Közülük 5-nek volt olyan kismértékű a katalitikus 74

hatása, hogy felhasználható az enzimes kísérletek elvégzéséhez. A Cyphos 103, 104, 105, 109 és 110 közül a Cyphos 104-esben mértem a legjobb eredményeket. A Cyphos 103 esetében ugyanaz mondható el, mint a szerves oldószereknél, tehát nem egy pontban mértem nagy hozamot és e.e. értékeket. A Cyphos 105, 109, 110-ben folytatott mérések során nem tapasztaltam számottevő enantioszelektivitást, a reakcióidő előrehaladtával gyorsan elérték a 0-hoz közeli értékeket. A továbbiakban Cyphos 104 közegében összehasonlítottam a CALB és a Candida rugosa enzimek hatását. Megállapítható volt, hogy az előbbi — bizonyos esetekben 45%-kal — nagyobb hozamot és enantioszelektivitást mutatott. Az eddigi méréseket összegezve megállapítható, hogy Cyphos 104-es ionos folyadékban CALB enzim alkalmazása mellett értem el a legjobb eredményeket. Ezt a rendszert a későbbiekben tovább vizsgáltam.

3.6. Szuperkritikus CO2-ban végzett kísérletek A

méréseket

a

3.5.

fejezetben

bemutatott,

legeredményesebbnek

bizonyult

paraméterkombinációval végeztem, 11-es alk/TS arány mellett, CALB enzimmel. A víztartalmat 4 m/m%-ra állítottam, mert ennél a kísérletsorozatnál a tejsav mennyiségét nem változtattam. A nagyobb reaktortérfogat miatt a reakcióelegyet 7-szeres mennyiségben mértem be: tejsav 4,95 g (28 mmol), 14 g etanol (300 mmol), 7 g ionos folyadék (10,6 mmol) és 0,35 g Novozym 435. A hőmérséklet hatását 35, 50 és 70 °C-on vizsgáltam, a nyomásét 100, 200 és 300 bar-on. A 3-3 kísérleti érték összesen 9 mérési pontot határoz meg, viszont a scCO2 közegének hatását ionos folyadékkal és a nélkül is vizsgáltam. Így 18 különböző paraméterkombináció mellett történtek a kísérletek (Függelék 22., 23. táblázat) Továbbra is a hozamot és az enantioszelektivitást vizsgáltam függő változóként. A Függelék 22. táblázata és a 36. ábra mutatja az ionos folyadék nélküli mérések eredményeit. Megfigyelhető, hogy a reakciók észterhozama magasabb hőmérsékleten nagyobb, vagyis az enzimek aktivitása megnő. Az eredmények a nyomástól függetlenül mutatták ezt a tendenciát. 35 °C-on 15-16%-os volt a hozam, 50 °C-on 22-23%, és 70 °C-on nagy ugrás látható, mivel itt mind a három nyomás érték mellett túllépte a 100%-ot (120130%). Ismert tény, hogy a scCO2-os rendszerben a hőmérséklettel növekszik a hozam, a nyomás pedig kevésbé befolyásoló tényező [Knez, 2005]. A 37. ábra (továbbá Függelék 23. táblázata) az ionos folyadékkal történt mérések eredményeit szemlélteti. Az előző mérésekhez képest alacsonyabb hőmérsékleten is nagyobb hozamot mértem, melyek minden esetben elérték a 80%-ot. Ennek magyarázata feltételezhetően az, hogy a Cyphos 104-ben jól oldódik a tejsav, mely alacsony hőmérsékleten is biztosítja azt, 75

hogy az enzim jobban hozzáférjen a szubsztrátokhoz. Az is megfigyelhető, hogy nagyobb nyomáson nem történt olyan mértékű hozamnövekedés, mint kisebb nyomások esetében. A tendencia azt mutatja, hogy nagyobb hozam magasabb hőmérsékleten mérhető, mivel ilyen paraméterek mellett 100-130%-os érték is elérhető. A nyomás hatása nem ilyen egyértelmű. Lozano és társai imidazólium ionos folyadék és scCO2 közegében észterezték a racém glicidolt [Lozano, 2004]. Csak ionos folyadékban nagyobb aktivitást figyeltek meg, mint a kettős rendszerben, de az enantioszelektivitás ugyanakkora maradt. Paljevac és társai az ionos folyadék ([BMIM]BF4) mennyiségének szerepét vizsgálták scCO2-ban (0-50 mmol) [Paljevac, 2009]. Már a legkevesebb ionos folyadék hozzáadása után is tapasztalták a hozam növekedését, és a maximumot a legnagyobb ionos folyadék mennyiség mellett mérték. A Maribori Egyetemmel közösen végeztünk tejsav észterezést n-butanollal scCO2 közegében. A nyomás és a hőmérséklet hozamra gyakorolt hatását vizsgáltuk. Társoldószerként n-hexánt is adtunk a reakcióelegyhez. Megfigyeltük, hogy társoldószer használatával mintegy 15%-kal növelhető volt a hozam. Méréseim során ionos folyadék hozzáadásával nagymértékben növekedett az észterhozam olyan paraméterek mellett, ahol korábban ionos folyadék nélkül kis hozamot mértem.

Hozam (%)

150 100 50

300 200

0 35

100 50

Nyomás (bar)

70

Hőmérséklet (°C) 36. ábra: scCO2-ban, ionos folyadék hozzáadása nélkül vizsgált reakciók hozama 24 óra után, CALB enzim használatával

76

Hozam (%)

150 100

300

50

200

0 35

100

Nyomás (bar)

50 70

Hőmérséklet (°C) 37. ábra: scCO2/Cyphos 104 ionos folyadék elegyben vizsgált reakciók hozama 24 óra után, CALB enzim használatával

A Függelék 22. táblázata és a 38. ábra mutatja az ionos folyadék nélküli rendszer enantioszelektivitását. A hőmérséklet pontosan ellenkező hatást mutat, mint a hozam esetében, mivel a magas hőmérséklet rontja az enantioszelektivitást. A nyomás hatása kisebb mértékű, mint a hőmérsékleté. A nagy nyomás valamit javított az enantiomerfelesleg értékein. A legjobb eredményt 300 bar nyomáson és 35 °C-on kaptam (1 óra után e.e.=27%), innen a hőmérséklet emelkedésével és a nyomás csökkenésével folyamatos csökkenő tendenciát mutattak az értékek. A reakcióidő előrehaladtával az eddigiekhez hasonlóan az e.e. értékek folyamatosan csökkentek. A 35 °C-on történt mérések esetében az enantiomerfelesleg értékei 24 óra után is 20% körüli értéken maradtak. A 39. ábrán és a Függelék 23. táblázatában láthatók az ionos folyadékot is tartalmazó rendszer e.e. értékei. A hőmérséklet hasonlóan hatott, mint az ionos folyadék nélküli rendszer esetében. A magasabb hőmérséklet csökkentette az enantioszelektivitást, de nem egyértelmű módon. A nyomás növelése ebben az esetben is kisebb mértékben hatott, de hasonlóan, mint az ionos folyadék nélküli rendszernél, emelésével kis mértékben csökkentek az enantiomerfelesleg értékei. A legjobb eredmények kis és közepes nyomáson születtek, alacsonyabb hőmérsékleten. Ilyen körülmények között a 22-28% körüli e.e. értékek a reakcióidő végére 14-16%-os értékre csökkentek. A szuperkritikus CO2-ban végzett mérések során nem találtam olyan mérési pontot, melyben elfogadható enantioszelektivitást mértem volna 50%-os hozam után. Az eddigiekben bemutatott oldószerek közül a Cyphos 104 közegében mértem a legjobb eredményeket. Ezért 77

a továbbiakban meghatároztam, hogy mekkora hozam szükséges nagy enantioszelektivitás

Enantiomerfelesleg (%)

eléréséhez, illetve a mindegyikük nagy értékéhez.

30 20 10

300 200

0 35

Nyomás (bar)

100

50 70

Hőmérséklet (°C)

Enantiomerfelesleg (%)

38. ábra: scCO2-ban, ionos folyadék hozzáadása nélkül vizsgált reakciók enantiomerfeleslege 1 óra után, CALB enzim használatával

30 20 10

300 200

0 35

100 50

Nyomás (bar)

70

Hőmérséklet (°C) 39. ábra: scCO2/Cyphos 104 ionos folyadék elegyben vizsgált reakciók enantiomerfeleslege 1 óra után, CALB enzim használatával

Ha összehasonlítjuk a rázatott lombikos és a scCO2-ban végzett kísérletek eredményeit, akkor megállapítható, hogy ha nagy enantioszelektivitásra törekszünk, abban az esetben az előbbi mérések voltak hatásosabbak. Az eddigi eredményeket összevetve kiderül, hogy Cyphos 104es ionos folyadék közegében és CALB enzim használata mellett volt egyszerre elérhető a legnagyobb észterhozam és enantioszelektivitás. Ezért az optimális paramétereket Cyphos 78

104-ben határoztam meg rázatott lombikos kivitelben, melynek részletei a 3.7. fejezetben olvashatók.

3.7. Cyphos 104-ben mért optimális paraméterek a maximális enantiomerfelesleg és hozam eléréséhez A Cyphos 104-gyel végzett kísérletek paramétereit eddig olyan intervallumon vizsgáltam, melyekből nem derül ki, hogy milyen értékek mellett érvényesül maximálisan a hatásuk. Ezért

kiegészítésként

további

méréseket

végeztem,

hogy teljes képet

kapjak

a

reakciókörülmények hatásáról. A fejezetben bemutatott mérések rázatott lombikos kivitelben, Cyphos 104-es ionos folyadék és CALB enzim felhasználásával történtek 24 órás időtartamban. A kísérletek kivitelezése során csak egy paramétert változtattam, a másik hármat állandó értéken tartottam. Az alk/TS arányt a 3-as és 19-es értékek között, a kezdeti víztartalmat 4-12 m/m% között állítottam, mindkét esetben 4-esével növeltem az értékeket. Az IL/alk arányát 0,5 és 2-es értékek között változtattam 0,5-tel növelve, a hőmérsékletet pedig 30, 50 és 70 °C-on vizsgáltam. Az eredményeket a 40-47. ábrák mutatják be. A hozam mértékére jól látható hatással volt a hőmérséklet, nagyobb hozamok eléréséhez magasabb hőmérséklet az ideális, — melyet az irodalmi adatok [Inaba, 2009] is alátámasztanak —, hiszen az enzim aktivitását növeli. Az alk/TS arány a legnagyobb értékénél eredményezte a legnagyobb hozamot, melynek magyarázata, hogy az egyik reakciópartner feleslege növeli az egyensúlyi reakció hajtóerejét. Ezt bizonyították Bodnár és társai [Bodnár, 1990], akiknél az alkohol/sav arány növelése során a kisebb értékek csökkenést, majd egyértelmű növekedést mutattak a hozamban 1 : 6-os arányig, mely után csökkenést figyeltek meg. Csökkenést nem, viszont stagnálást megfigyeltem 3 és 7 alk/TS aránynál, de a további növelés négyszeres értékre emelte a hozamot. 19-es arány felett nem végezem méréseket, így nem derül ki, hogy a továbbiakban okoz-e lassulást a reakció lefutásában. Valószínűleg a kezdeti víztartalom játssza a legnagyobb szerepet, mivel itt a 4 m/m%-os érték mellett értem el a legnagyobb hozamot. A hozam a víztartalom növelése során 12 m/m%-ig meredeken csökkent egészen 10%-os értékig (24 h), 12 m/m% felett nem látható további csökkenés, 16 m/m%-ig nem változik. Ebben az esetben is az egyensúlyi reakcióra való ráhatás lehet a magyarázat, mivel a termék oldalon lévő egyre nagyobb vízmennyiség egyre erősebben gátolja a reakció lefutását. Az IL/alk arányt 1-es értékig növelve figyelhetünk meg növekvő hozamot, ez érték felett nem tapasztalható további növekedés. Mivel az ionos folyadék láthatóan csak bizonyos 79

mennyiségig fejt ki pozitív hatást a hozamra, — negatív behatást viszont a vizsgált tartományban nem észleltem —, az arányt nem indokolt 1-nél nagyobbra állítani. Ez az érték fejtheti ki a legnagyobb stabilizáló hatást az enzimre, valamint valószínűleg a további mennyiség az anyagátadást nehezíti a viszkozitás növekedése miatt. Major és társai [Major, 2009] 0,2 mol/dm3 és 0,44 mol/dm3 értékek között vizsgálták az ionos folyadék mennyiségének hatását, mely során az utóbbi érték nagyobb hozamot eredményezett. Mivel az IL/alk arány vizsgálatakor a többi paraméter értéke változatlan maradt, ezért koncentrációban is kifejezhető az IL mennyisége. Méréseim során 0,15 mol/dm3 (0,5 IL/alk arány) és 0,6 mol/dm3 (2 IL/alk arány) értékek között vizsgáltam a hatást, melynek eredményei jól összevethetők Major megfigyeléseivel. A koncentráció növelésével ugyanúgy növekedett a hozam, de valamivel 0,3 mol/dm3 felett nem mértem további pozitív eredményt.

60 Hozam (%)

Hozam (%)

80 40 20

0 0

20

40

60

80

100 80 60 40 20 0 0

40. ábra: A hőmérséklet hatása a hozamra 24 óra reakcióidő után, CALB enzim és Cyphos 104-es ionos folyadék használata mellett

10

15

20

41. ábra: Az alk/TS arány hatása a hozamra 24 óra reakcióidő után, CALB enzim és Cyphos 104es ionos folyadék használata mellett

100 80 60 40 20 0

80 60 Hozam (%)

Hozam (%)

5

Alk/TS arány

Hőmérséklet (°C)

0

5

10

15

20

40 20 0 0

Kezdeti víztartalom (m/m%)

1

2

3

IL/alk arány

42. ábra: A kezdeti víztartalom hatása a hozamra 24 óra reakcióidő után, CALB enzim és Cyphos 104-es ionos folyadék használata mellett

43. ábra: Az IL/alk arány hatása a hozamra 24 óra reakcióidő után, CALB enzim és Cyphos 104es ionos folyadék használata mellett

Az enantioszelektivitásra a hőmérséklet erősebb befolyással volt, mint a hozamra. Itt a legjobb eredmények a 30 °C-on végzett reakció során születtek. Egyértelműen, ha az enzim aktivitása nagyobb, a viszkozitás pedig csökken, tehát a reakció gyorsabb lefutású, akkor a 80

lassabban reagáló enantiomer reakcióba lépése előbb történik meg, ezért kapunk kisebb e.e. értékeket. Az alk/TS arány esetében a hozammal párhuzamosan 11-es értékig növekedést figyeltem meg, ám e felett nem tapasztaltam további pozitív hatást az enantioszelektivitásra. A vizsgált legnagyobb (19) értékig nem volt megfigyelhető további változás. A növekedés okát Berglund [Berglund, 2001] azzal magyarázza, hogy az egyensúlyi pont eltolódik a termékképződés irányába, ezzel növeli mind a hozamot, mind az enantioszelektivitást. 4 és 8 m/m%-os víztartalmi értékek mellett nagy enantiomerfelesleg mutatkozott, de a további emelés meredeken csökkentette az e.e. értéket. Bodnár és társai [Bodnár, 1990] 0,4 m/m% kezdeti víztartalom felett tapasztaltak csökkenő enantioszelektivitást. A kiértékelés során hasonló eredményre jutottam, de a csökkenés a vizsgált intervallumon 8 m/m% víztartalom felett következik be. Ionos folyadék hozzáadásával az e.e értékek számottevően nagyobbak voltak, mint IL nélkül. 0,5-ös és 1-es IL/alk arány esetében az e.e. értékek 14, majd 19%-ra növekedtek 24 óra után, ám e felett nem volt pozitív hatással a további aránynövelés, feltehetően itt is az anyagátadási korlátozás érvényesül, mint a hozam esetében. Az eredményeket tekintve elmondható, hogy egyidejűleg a maximális hozam és enantioszelektivitás megvalósításához 30 °C vagy 50 °C hőmérsékletet ajánlott alkalmazni. Az észterezéses reakciók hozamára előnyösen hat a magasabb hőmérséklet [Inaba, 2009], de az enantioszelektivitás esetében ez nem jelenthető ki ilyen egyértelműen, bár általában a hőmérséklet csökkentése növeli az e.e. értékeit [Rotticci, 2000], viszont Persson és társai kimondják, hogy a hatás pont az ellenkező [Persson, 2002]. Eredményeim a gyakrabban megfigyelt állítást erősítik meg, mivel a magasabb hőmérsékleten lejátszatott reakciók esetében kisebb e.e. értékeket mértem. A továbbiakban a 30 °C-os reakció hőmérsékletet részesítettem előnyben a nagyobb enantioszelektivitás érdekében, valamint azért is, hogy zöld technológiára törekedve alacsonyabb hőmérsékleten kisebb energiafelhasználással menjen végbe a folyamat.

81

40

1h

30

Enantiomerfelesleg (%)

Enantiomerfelesleg (%)

40

24 h

20

10 0 0

20

40

60

80

Hőmérséklet

Enantiomerfelesleg (%)

Enantiomerfelesleg (%)

24 h

20 10 0 0

5

10

15

10 0 0

5

10

15

20

Alk/TS arány

40

1h

30

24 h

20

45. ábra: Az alk/TS arány hatása az enantioszelektivitásra 1 és 24 óra után, CALB enzim és Cyphos 104-es ionos folyadék használata mellett

44. ábra: Hőmérséklet hatása az enantioszelektivitásra 1 és 24 óra után, CALB enzim és Cyphos 104-es ionos folyadék használata mellett

40

1h

30

20

Kezdeti víztartalom (m/m%)

46. ábra: A kezdeti víztartalom hatása az enantioszelektivitásra 1 és 24 óra után, CALB enzim és Cyphos 104-es ionos folyadék használata mellett

1h

30

24 h

20 10 0 0

1

2

3

IL/alk arány

47. ábra: IL/alk arány hatása az enantioszelektivitásra 1 és 24 óra után, CALB enzim és Cyphos 104-es ionos folyadék használata mellett

Ha a szubsztrátok arányának változtatásával a termékképződés felé toljuk el az egyensúlyt, akkor láthatóan bizonyos mértékig a hozam és az enantioszelektivitás is növekszik. Ezzel együtt az alkohol túlzott feleslegénél inhibíciós hatás érvényesülhet. Berglund szerint [Berglund, 2001] kisebb alkoholfelesleg esetében az enantiomerfelesleg értéke nagyobb. Méréseim során az alk/TS arány növelésével mind a hozam, mind az enantioszelektivitás növekedett. Az utóbbi 11-es érték után nem mutatott további növekedést, tehát nem célszerű e feletti alkoholmennyiséget alkalmazni. Az IL/alk arány 1-es érték felett már nem mutatott további hozamnövelő hatást, mely hasonlóan igaz az enantioszelektivitásra is. Ezek alapján kijelenthető, hogy ez a mennyiségű IL nagymértékű pozitív hatást fejt ki a vizsgált paraméterekre, azonban az arány további növelése nem indokolt. Észterezéskor a víztartalom erősen befolyásolja a reakció lefutását [Fehér, 2009; Major, 2010]. Esetünkben a kezdeti víztartalom növelése hátrányos hatással volt a hozamra. A 82

lipázok többségének enantioszelektivitására pedig nincs egyértelmű hatással a víztartalom [Persson, 2002]. Mérési eredményeim mutatják, hogy a vizsgált reakció során a víztartalom növekedése 8 m/m% felett csökkentette az e.e. értéket. A hozam pedig még 4 m/m%-nál sem értem el a maximumot, mely valószínűleg ez érték alatt mérhető. Major és társai [Major, 2009] 4 m/m%-nál mérték a legnagyobb hozamot. A 10. táblázatban összevetettem különböző kezdeti víztartalmak hatásait 30 °C-on, 11-es alk/TS arány és 1-es IL/alk arány mellett. Az említett három paraméter értéke az előbbiekben a vizsgált intervallumon pontosan meghatározható volt, a kezdeti víztartalom azonban nem. Mivel ilyen értékek mellett a kísérleti elegy elérhető legkisebb víztartalma 2,5 m/m% körüli, ezért a mérést tovább folytattam. Látható, hogy az enantiomerfelesleg 4 m/m%-on mutat maximumot, ez érték alatt enyhe csökkenés figyelhető meg. A hozam a víztartalom csökkentésével 4 m/m% alatt már csak enyhén növekszik. Ha a reakciót 50%-os átalakulási foknál megállítjuk, akkor 4 m/m%-os víztartalom esetén az e.e. érték 30,4%. Ezek az eredmények azt mutatják, hogy a kezdeti víztartalmat 4 m/m%-ra állítva érhető el a legjobb eredmény. 10. táblázat: A kezdeti víztartalom hatása 2,5-8 m/m% intervallumon a reakció hozamára és enantioszelektivitására, CALB enzim és Cyphos 104-es ionos folyadék használata mellett Hőmérséklet (°C)

alk/TS arány

30

11

Kezdeti víztartalom (m/m%) 8

30 30

11 11

4 2,5

IL/alk arány

Hozam (%)

e.e. (%)

1

55,5

22,1

e.e. (%) 50%-os hozamnál 22,8

1 1

77,1 79,5

25,4 21,2

30,4 22,5

3.8. Vízeltávolítás A 3.7-os fejezetben a Cyphos 104-es ionos folyadékban történő észterszintézis optimális paramétereit írtam le. A továbbiakban a reakció közben képződő víz eltávolítását valósítottam meg, melyhez két módszert alkalmaztam: Elsőként az adszorpciós elven működő zeolitos vízeltávolítást, a későbbiekben pedig pervaporációval történő víztartalom csökkentést. A kiindulási tejsav elegy legjobbnak talált víztartalmát közvetlenül nem célszerű csökkenteni, mivel ez esetben eltolódik a monomer/oligomer arány, és a pontos számoláshoz külön analízist lenne szükséges végezni a megváltozott arány megállapításához. Ezért célszerű a reakció közben, a kondenzáció során keletkezett „felesleges” vizet eltávolítani, melynek előnye, hogy a reakció hajtóerejét nem befolyásolja negatívan. 83

3.8.1. Zeolittal történő vízeltávolítás A zeolitos vízeltávolítást két különböző mennyiségű zeolit hozzáadásával végeztem el azonos körülmények és elegy összetétel mellett, melyeket összehasonlítottam a már előzőleg kapott mérési eredményekkel (30 °C, 11-es alk/TS arány, 4 m/m% kezdeti víztartalom, 1-es IL/alk arány). A méréseket 48 órás reakcióidővel végeztem. Ezekhez olyan zeolitot alkalmaztam (4Å, Buchs, Svájc), mely oldószerek vízelvonásához használatos. A zeolit elméleti vízmegkötő képessége: tömegének 30%-a, gyakorlatilag 23% vizet volt képes megkötni. 11. táblázat: A zeolitos vízeltávolítás során mért (0: 0 mg, 1: 70 mg, 2: 110 mg zeolit) hozam és e.e. értékek Cyphos 104-es ionos folyadék és CALB enzim használata mellett hozam (%)

0

1

2

1h

7,3

5,7

4,0

3h

17,4

14,5

12,5

5h

23,9

20,0

16,7

24 h

77,1

55,1

50,2

25 h

80,4

55,9

53,2

27 h

83,6

58,4

58,9

29 h

84,8

62,3

68,9

48 h

92,4

86,1

80,4

1h

38,4

33,3

34,62

3h

38,3

33,7

32,34

5h

34,4

31,5

31,8

24 h

25,4

25,3

23,29

25 h

24,0

22,9

23,94

27 h

22,5

22,1

22,79

29 h

21,2

21,0

22,05

48 h

18,5

15,2

15,71

e.e. (%) 50%-os hozamnál

30,4

27,1

24,6

e.e. (%)

A mérési pontok eredményeit a 11. táblázat és a 48., 49. ábrák szemléltetik. A 0. pont a zeolit nélküli mérés eredményeit mutatja, mely összehasonlításul szolgál. Az 1. és 2. pont esetében 70 mg illetve 110 mg mennyiségben adtam zeolitot az elegyhez. Látható, hogy zeolit nélkül 24 óra után 26%-os, 48 óra után pedig 19%-os enantiomerfelesleget mértem 78% illetve 92%os hozam mellett. Zeolit alkalmazása nélkül kaptam a legjobb eredményeket, melyhez képest a másik két mérési pont esetében a hozam csökkent a hozzáadott zeolit mennyiségének függvényében, az e.e. értékek pedig nem változtak számottevően. Az eredmények magyarázata lehet, hogy a víztartalom növekedése nem tolta el a monomer/oligomer tejsav arányt a monomer képződés irányába, melynek a bemérthez képest további mennyisége az 84

észterképződés hajtóerejét növelné. Major mérési eredményei is azt mutatták, hogy a tejsav észterezése során a zeolitos vízeltávolítás csökkentette a hozamot, mellyel alátámasztja azt az elméletét, hogy a nagyobb víztartalom megváltoztatja a monomer tejsav mennyiségét [Major, 2010].

Hozam (%) 24 óra után

Hozam (%)

Hozam (%) 48 óra után 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 0

1

2

Minta

Enantiomerfelesleg (%)

48. ábra: A hozam alakulása különböző mennyiségű zeolit hozzáadása, Cyphos 104-es ionos folyadék és CALB enzim használata mellett, 24 és 48 h után Enantiomerfelesleg (%) 1 óra után Enantiomerfelesleg (%) 24 óra után Enantiomerfelesleg (%) 48 óra után

40 35 30 25 20 15 10 5 0 0

1

2

Minta 49. ábra: Az enantiomerfelesleg alakulása különböző mennyiségű zeolit hozzáadása, Cyphos 104-es ionos folyadék és CALB enzim használata mellett, 1, 24 és 48 h után

85

3.8.2. Pervaporációval történő vízeltávolítás A pervaporációval történő vízeltávolítás szabályozottabb formában távolítja el a reakcióban képződő vizet, mint a zeolit. Ezért használják elterjedten az észterezéses reakciók során. A vízeltávolítás hatását 5 órán át vizsgáltam. A kapott értékeket a 12. táblázat és az 50. szemlélteti, melyben a 0 pont a vízeltávolítás nélküli eredményeket mutatja a 3.7.1. fejezetben leírt paraméterek mellett, de 2,5 m/m%-os kezdeti víztartalommal. Az előző fejezetben megállapítást nyert, hogy a zeolitos vízeltávolítás során 4 m/m%-os kezdeti víztartalom esetén a monomer/oligomer tejsav arány növekedése nem gyorsítja a reakciót. A 10. táblázatban bemutattam, hogy 2,5 m/m%-os kezdeti víztartalom mellett gyorsabb a reakció, ezért a pervaporációt is ilyen víztartalom mellett vizsgáltam. Feltételeztem, hogy a vízeltávolítás során csökkent hajtóerőt kompenzálni lehet a kisebb víztartalommal. Az 1-es pont a pervaporációs vízeltávolítás eredményeit mutatjaa. Látható, hogy kezdetben nagyobb volt az enantioszelektivitás mértéke, mint pervaporáció nélkül (40% és 44%), de ez az előny a reakcióidő előrehaladtával megszűnt. 5 óra után a pervaporáció nélküli enantiomerfelesleg 34%-ra csökkent, ezzel szemben pervaporáció esetében 27%-ra. A hozam esetében látható, hogy a pervaporáció az első órákban segítette a termékképződést, de a vizsgálat végére mégis nagyon hasonló (23%) eredményeket mértem. 12. táblázat: A pervaporációval történő vízeltávolítás hozama és e.e. értékei (0: pervap. nélkül, 1: pervap. alkalmazásával) Cyphos 104-es ionos folyadék és CALB enzim használata mellett hozam (%)

0

1

0,5 h

3,1

6,2

1h

6,8

7,0

3h

15,6

17,3

5h

22,8

22,9

0,5 h

39,5

44,4

1h

38,4

32,9

3h

38,3

32,1

5h

34,4

26,6

e.e. (%)

86

Hozam (%)

50 45 40 35 30 25 20 15 10 5 0

Hozam (%) pervaporáció nélkül Hozam (%) pervaporációval Enantiomerfelesleg (%) pervaporáció nélkül Enantiomrfelesleg (%) pervaporációval 0

1

2

3

4

5

6

Idő (h) 50. ábra: A hozam és e.e. értékek a reakció lefutása során pervaporációval és a nélkül, Cyphos 104-es ionos folyadék és CALB enzim használata mellett

A víztartalom alakulását az 51. ábra szemlélteti. A kezdeti 2,5 m/m%-os víztartalom az 1-es esetben elérte a 3 m/m%-ot fél óra elteltével, majd az első óra végére 3,5 m/m%-ig emelkedett. Ez után figyelhető meg a képződött vízmennyiség csökkenése, melyet a dimer tejsav hidrolízise „fogyaszt el”, ám ennek sebessége hagyományos hőközlés esetében kicsi [Engin, 2003], valószínű ezért jelentkezik csak 1 óra után. Ez a folyamat 3 m/m% körülire csökkentette a víztartalmat 5 óra után. A pervaporáció során a kezdeti reakciósebesség nagyobb volt, mely annak tudható be, hogy a vízeltávolítás miatt gyorsabban indult a reakció. Ez után viszont a kisebb víztartalom miatt nem következik be olyan mértékű dimer tejsav hidrolízis, mely a reakció egyensúlyát a termékképződés felé tolná. Ezért lassul a reakció, melynek lefutása a 12. táblázatban követhető. Az enantioszelektivitás kezdetben kissé nagyobb volt, mint vízeltávolítás nélkül, de mértéke gyorsabban csökkent, mivel láthattuk, hogy a maximumot 4 m/m% körül mutatta. A vízeltávolítás eredményei összevethetők Major [Major, 2010] mérési eredményeivel. A tejsav észterezés során történő vízeltávolítás hatását vizsgálta, és megfigyelte, hogy a tejsav elegy egyedi összetétele miatt a vízeltávolítás hátrányosan hat a hozamra. Továbbá azt is mérte, hogy az idő előrehaladtával növekszik a dimer tejsav mennyisége, vagyis a monomer tejsavat nem csak az etil-laktát képződése fogyasztja, hanem a dimer tejsavé is. Erre az esetre viszont nincsenek olyan közlemények, melyek a tejsav észterezés enantioszelektivitásáról számolnának be.

87

Víztartalom (m/m%)

5 4,5 4 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0

Víztartalom (%) pervaporáció nélkül

Víztartalom (%) pervaporációval

0

1

2

3

4

5

6

Idő (h)

51. ábra: A víztartalom értékei a reakció lefutása során pervaporációval és a nélkül, Cyphos 104-es ionos folyadék és CALB enzim használata mellett

3.9. Kinetikus rezolválás, termék újbóli reakcióba vitele A zeolitos és pervaporációs vízeltávolítás egyike sem eredményezett olyan kedvező hatást, mely indokolta volna, hogy a további kísérletekhez alkalmazzam őket. Szuperkritikus CO 2ban kiemelkedően nagy hozamot mértem, de emellett az enzim kisebb enantioszelektivitást mutatott, mint a rázatott lombikos kísérletek esetében. A továbbiakban az enantiomerfelesleg növeléséhez más módszert alkalmaztam rázatott lombikos kísérletek során 30 °C-on, 11-es alk/TS, 1-es IL/alk aránnyal, 4 m/m%-os kezdeti víztartalommal, Novozym 435 enzim jelenlétében. Chen [Chen, 1982] szerint a termék enantiomerfeleslege úgy növelhető, hogy a reakcióelegyből kinyerjük a több (L)-enantiomert tartalmazó észtert, majd azt hidrolízissel visszaalakítjuk a kiindulási vegyületekké (tejsav), és a visszakapott terméket újra reakcióba visszük. Dalkin [Dalkin, 1903] korán felfedezte, hogy lipáz enzimmel lehetséges az észterek hidrolízise, Kazlauskas [Kazlauskas, 1991] és Berglund [Berglund, 2001] pedig azt is kimondják, hogy a reakció irányától függetlenül, vagyis hidrolízis esetén is az (L)-enantiomer reagál gyorsabban. Lou és társai [Lou, 2006] pedig (D,L)-fenilglicin-metil-észter hidrolízisét végezték el lipáz enzim segítségével. Az említett megfigyelések alapján az etil-laktát hidrolízise is lejátszatható enantioszelektíven. A termék illetve a tejsav kinyerését forráspontkülönbség alapján történő elválasztással vagy extrakcióval lehet megvalósítani. Ezt a folyamatot alapul véve alkalmaztam a méréseimhez a 88

termék újbóli reakcióba vitelét. Az első reakcióban képződött termék hidrolízise során kapott (D)- és (L)-tejsav elegye újra reagáltatható, de az (L)-tejsav többlete miatt a második reakció termékének enantiomerfeleslege nagyobb lesz, mint az elsőé. A termék kinyerését, tisztítását, hidrolízisét a gyakorlatban nem valósítottam meg. Ezért a kísérleteket úgy valósítottam meg, hogy az minden előző 24 órás mérés végén (n) kapott (L)tejsav-észter enantiomerfeleslegével (eep/n) állítottam össze a következő kísérlet (n+1) kiindulási tejsav enantiomerfeleslegét (ee0/n+1), melyet (L)- és (D,L)-tejsav megelelő arányú keverésével állítottam elő. Ezt a sorozatot addig folyatattam, míg az enantioszelektivitás elérte a 80% körüli értéket, mely azt jelenti, hogy az (L) és (D) enantiomerer aránya 9 : 1. Ez az elegy már alkalmas arra, hogy az elegyből való kinyerése után polimerizálható legyen, mivel itt már megfelelő a (D)- és az (L)-tejsav aránya a kívánt polimer tulajdonságokhoz. A kísérlet elméleti sémája az 52. ábrán látható. A hidrolízishez CALB enzim használható víz feleslege mellett, mellyel a reakció egyensúlya a tejsav képződése irányába tolható el. A termékkinyerés során visszamaradt (D)-tejsav is felhasználható. CALB-bal történő észterezés során optikai tisztasága növelhető.

(D>L)-tejsav (további feldolgozás) etanol

(D,L)-tejsav elegy

CALB

(L>D)-etillaktát és más termékek, (D>L)-tejsav

VÁKUUM DESZTILLÁCIÓ

(L>D)-etillaktát

hidrolízis (D)-tejsav < (L)-tejsav

A tejsav újbóli reakcióba vitelével növelhető az enantiomerfelesleg.

(D)-tejsav < (L)-tejsav

etanol

52. ábra: A termék újbóli reakcióba vitelének lehetősége az e.e. értékek növelése céljából 89

A kísérleteket három különböző módszerrel végeztem el. Első esetben a reakciókat 24 órás lefutásban vizsgáltam, a második esetben 50%-os, a harmadik esetben pedig 30%-os hozamnál megállítottam a reakciót. A 24 órás reakciók során a hozam 70-87%-os értékeket ért el. Látható (13. táblázat), hogy az első reakciók során kezdetben a 77%-os hozam elkezdett emelkedni 87%-ig, majd csökkenő tendenciát mutatott. Az enantiomerfelesleg alakulását az 53. ábra szemlélteti. Az első mérés során a kezdeti 40% körüli enantiomerfelesleg értéke a 24 óra múlva 25% körülire csökkent. A továbbiakban már nem volt megfigyelhető ilyen mértékű e.e. csökkenés a reakció végére. A 8 reakció eredményeit összevetve látható, hogy az enantiomerfelesleg értékei telítési görbe formájú növekedést mutattak. A 7. visszaforgatást követően 89%-os e.e. értéket mértem fél óra elteltével, a reakcióidő végére ez 78%-ig csökkent. Itt már a reakcióidő függvényében kisebb az enantiomerfelesleg értékének csökkenése, mivel kevesebb (D)-tejsav van a rendszerben, mely a reakciója során közelíthetné az (L)-észter mennyiségét. 13. táblázat: A tejsav többszörös reakcióba vitele során mért hozam és e.e. értékek Cyphos 104-es ionos folyadék és CALB enzim használata mellett Újra felhasználás hozam (%)

0

1

2

3

4

5

6

7

0,5 h

3,7

2,4

2,6

3,0

3,6

4,4

1,9

1,6

1h

7,3

5,5

6,4

7,6

7,5

8,2

4,7

4,1

3h

17,4

17,0

15,4

18,7

18,6

16,3

13,5

13,0

5h

23,9

23,9

25,6

29,8

27,8

27,3

25,0

20,5

24 h

77,7

68,3

87,7

81,7

84,9

86,5

72,9

68,5

0,5 h

39,3

56,0

67,6

72,8

77,3

82,8

85,6

88,6

1h

38,6

55,6

66,4

72,7

76,4

82,2

85,0

86,4

3h

38,2

55,9

65,1

72,7

72,0

82,1

83,1

85,1

5h

33,9

54,7

60,4

67,9

71,0

81,3

81,6

83,6

24 h

26,3

46,2

54,9

64,7

67,8

75,6

77,5

78,1

e.e. (%)

90

Enantiomerfelesleg (%)

0,5h

1h

3h

5h

24h

100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 0

1x

2x

3x

4x

5x

6x

7x

Újbóli reakcióba vitel 53. ábra: A tejsav többszörös reakcióba vitele során mért e.e. értékek Cyphos 104-es ionos folyadék és CALB enzim használata mellett, 24 órás reakcióidők után

A két következő ábra számított értékeket mutat. Az 54. ábrán látható (számszerű eredmények a Függelék 24. táblázatában), hogy ha 50%-os hozamnál megállítjuk a reakciókat, akkor azonos reakciókörülmények mellett a kívánt e.e. érték eléréséhez elegendő 4-szeri visszaforgatás. A reakciók 50%-os hozama kb. 15 óra után érhető el. Az 55. ábra mutatja (eredmények a Függelék 25. táblázatában) az enantiomerfelesleg értékeket abban az esetben, ha a reakciókat 30%-os hozamnál állítanám meg. A visszaforgatások száma nem csökkent, viszont fele annyi idő alatt elérhető a 80% körüli e.e. érték, mint az előző esetben.

91

Enantiomerfelesleg (%)

0,5h

1h

3h

5h

15h

100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 0

1x

2x

3x

4x

Újbóli reakcióba vitel

54. ábra: 50%-os hozam után a tejsav többszörös reakcióba vitele során mért e.e. értékek Cyphos 104es ionos folyadék és CALB enzim használata mellett

Enantiomerfelesleg (%)

0,5h

1h

3h

5h

7,5h

100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 0

1x

2x

3x

4x

Újbóli reakcióba vitel 55. ábra: 30%-os hozam után a tejsav többszörös reakcióba vitele során mért e.e. értékek Cyphos 104es ionos folyadék és CALB enzim használata mellett

A három módszer közül az első igényli a legtöbb lépést. Ha a termékkinyerést és tisztítást elvégeznénk, akkor a lépések számával emelkedne az eljárás költsége, de a termékkihozatal szempontjából ez a leghatásosabb. A három módszer időigényét a 14. táblázatban hasonlítottam össze. Ha a második módszernél háromszoros mennyiségű kiindulási anyaggal végeznénk a reakciót, akkor meghaladná az 1-ben számolt kihozatalt. A nagyobb mennyiség kezelése még így is kevesebb költséget igényelne, mint a több lépésben elvégzett terméktisztítás. Ez azért mondható ki, mert a terméktisztításhoz sorozatos desztillációt, 92

vákuumdesztillációt kell alkalmazni, az ebből adódó nagy hőmérséklet és a vákuum előállítása pedig energiaigényes a 30 °C-ra fűtött reakció lejátszatásával szemben. A kihozatal javításához a további enantiomerfelesleg érték növelése lehetne a cél. 14. táblázat: A termék újbóli felhasználása során vizsgált három módszer időigényének és a reakcióba vitelek számának összehasonlítása Módszer

Időigény (h)

Újbóli reakcióba vitel

1.) 24 órás (75% hozam)

192

7

2.) 50%-os hozam

75

4

3.) 30%-os hozam

36

4

A mérési eredményekből tapasztalatai egy elméleti rendszer modelljéhez nyújtanak alapot. Ezzel a rendszerrel szakaszosan lehet megvalósítani a poli-tejsav alapanyagának kinyerését a vegyiparban előállított racém tejsav elegyből. A technológia sémája az 56. ábrán látható.

56. ábra: A tejsav enantioszelektív észterezése során képződött termék újbóli reakcióba vitelének folyamatábrája

A kiindulási anyagokat az 1-es reaktorba adagoljuk, ahol 30 °C-os hőmérsékleten megtörténik a reakció 50%-os hozamig. A reakció végén (15 h) a keverő leállításával az immobilizált enzim leülepszik, majd a reaktorból egy (P) szivattyúval elvezetjük a reakcióelegyet az 1-es

93

szeparáló egységre. Itt a kisebb forráspontú komponenseket (etanol, víz, (L>D)-etil-laktát, egyéb laktátok) csökkentett nyomáson elkülönítjük, így az ionos folyadék magas hőmérsékleten történő bomlása nem következik be. A fenéktermékeket (D>L)-tejsav

egy

következő

(3-as)

szeparációs

egységre

ionos folyadék és továbbítjuk,

ahol

vákuumdesztilláció segítségével a tejsavat eltávolítjuk az ionos folyadéktól. Az utóbbit újból felhasználjuk a követező reakcióknál, a tejsavat pedig további feldolgozásra eltároljuk. A 2-es szeparátor desztilláció útján 96%-os etanolt különít el, melyet a következő reakciónál fel lehet használni. A fenékterméket a 2-es reaktorba továbbítjuk, ahol az etil-laktát hidrolízisét enzimes úton (CALB) elvégezzük. Savas katalizátor használata azért nem előnyös, mivel a hidrolízis termékét racemizálja, ezzel az enantioszelektív reakció során kapott tejsav enantiomerfeleslege a hidrolízist követően ismét 0% lenne. A hidrolízis közben az etanolt desztillációval vagy membrános eljárással folyamatosan eltávolítjuk a rendszerből, mely a tejsavképződés irányába tolja el a reakciót. A 2-es szeparátorban és a 2-es reaktorban eltávolított 96%-os etanol membránszeparációs vagy extrakciós lépéssel vízteleníthető, vagy a víztartalmát számba véve felhasználható a következő reakcióhoz. A 4-es szeparátorban az elegyből a felesleges vizet eltávolítjuk olyan mennyiségben, hogy a visszamaradó tejsav elegyünk víztartalma 10%-os legyen. Ezzel elérhetjük ugyanazt az egyensúlyi állapotot, mely a kísérletekhez használt tejsav elegyben beállt. Az oligomer tejsav észterek hidrolízisével visszakapjuk az oligomer tejsav tartalmat, mely az egyensúly beálltához szükséges. A monomer/oligomer egyensúly beállta után az elegyet újra felhasználjuk a következő reakció során. A munka következő lépése lehetne az 50%-os hozamig történő laborméretű rendszer megvalósítása, melyhez ebben a dolgozatban csak az elvi lehetőséget vázoltam fel.

3.10. Az enzim újrahasználata A továbbiakban összehasonlítottam oldószermentes (etanolfelesleg) közegben és Cyphos 104 ionos folyadékban az enzim aktivitásvesztését az újrafelhasználások során. A kísérleteket 30 °C-on, 4 m/m%-os kezdeti víztartalom mellett végeztem 1-es IL/alk arány mellett. Az ionos folyadékos közegben 11-es alk/TS arányt alkalmaztam, az ionos folyadék nélküli elegyben az oldószer pótlása miatt 15-öset. 24 óra reakcióidő után a reakcióelegyből leszűrtem az immobilizált enzimet, melyet 5 cm3 abszolút etanollal háromszor mostam, hogy minden, az elegyből visszamaradt vegyületet eltávolítsak a felületéről.

94

80 70 Cyphos 104-ben

Hozam (%)

60 50

Ionos folyadék nélkül

40 30 20 10 0 0

1

2

3

4

5

6

Újra felhasználás 57. ábra: A hozam alakulása a CALB enzim 5-szöri újrafelhasználása során Cyphos 104-es ionos folyadékban és a nélkül, 24 óra reakcióidő után

15. táblázat: CALB enzim 5-szöri újrahasználata során mért hozamok Cyphos 104-es ionos folyadékban és a nélkül, 24 óra reakcióidő után Újrahasználat

Ionos folyadék nélkül

hozam (%)

0

1

2

3

4

5

1h

6,5

2,4

1,5

1,1

0,9

0,7

3h

8,1

4,8

3,6

2,6

1,8

1,3

5h

16,0

7,3

5,5

4,2

2,8

2,2

24 h

49,6

21,5

19,6

16,2

10,8

9,1

1h

7,3

3,5

4,1

3,2

1,8

1,3

3h

17,4

8,5

9,4

5,9

3,9

2,3

5h

23,9

15,5

13,7

9,2

6,6

4,0

24 h

77,1

56,4

54,8

40,1

27,1

19,9

hozam (%) Cyphos 104-ben

A 15. táblázat és az 57. ábra (és a Függelék 26. táblázata) mutatja a kísérletek eredményeit. Az enzimet mindkét esetben 5-ször használtam újra. Ionos folyadék közegében a kezdeti 77%-os hozam kb. a negyedére (20%-ra) csökkent az 5. felhasználás után, de már az első újrafelhasználást követően is mintegy 30%-os csökkenés volt megfigyelhető. Az oldószermentes közegben végzett reakció kezdeti hozama 49%-ról ötödére (9%-ra) csökkent az ötödik visszaforgatás során. Hasonlóan nagymértékű csökkenés figyelhető meg az első újrahasználat során, mint ionos folyadékban. Ionos folyadék első újrahasználata során a kiindulási állapothoz képest 27%-os, oldószermentes közegben 57%-os aktivitáscsökkenést

95

mértem. A két reakcióelegy eredményeit összehasonlítva megállapítható, hogy 5-szöri újrahasználat után az enzim kétszer akkora hozamot mutat ionos folyadékban, mint a nélkül. Az irodalmi hivatkozások [Park, 2003] is alátámasztják, hogy ionos folyadékban megnő az enzim

stabilitása

és

aktivitása.

Ennek

következményeképp

az

enzim

többszöri

újrafelhasználása során nem, vagy kevésbé veszít aktivitásából, mint ionos folyadék alkalmazása nélkül. Mérési adataim alátámasztják ezeket a tapasztalatokat, mivel 5-szöri újrahasználat után is nagyobb aktivitást mutatott az enzim, mint ionos folyadék nélkül.

96

4. Összefoglalás Doktori munkám során azt vizsgáltam, hogy milyen közegben, milyen reakciókörülmények mellett végezhető a legnagyobb enantiomerfelesleg értékkel és hozammal a tejsav etanollal történő enzimes észterezése. A vizsgált témáról eddig nem születtek munkák, csak a tejsavhoz hasonló vegyülettel (2-klór-propionsav), de ez esetben is kismértékű enantioszelektivitást figyeltek meg. A munkám során multifaktoriális kísérlettervezést alkalmazva új közegeket teszteltem a hasonló reakciókról szóló hivatkozásokban feltüntetett reakciókörülmények mellett. A reakcióval környezetbarát oldószerhez és a politejsav alapanyagához jutunk. Mivel szerves oldószerben történő tejsav észterezésre vannak korábbi referenciák, a hozamot összehasonlíthattam velük, de az enantioszelektivitást eddig még nem vizsgálták. A reakciókat n-hexánban és oldószermentes közegben (alkoholfelesleg) is elvégeztem. n-Hexán közegében 55% körüli hozamot mértem, a maximális enantiomerfelesleg érték pedig 33% volt az első óra után, mely 24 óra után 12%-ra csökkent. A két maximális érték nem azonos paraméterkombináció mellett valósult meg. Munkám ezen a téren előrelépés, mivel Major és társai [Major, 2010] a mérések során n-hexános közegben csupán 14%-ot értek el a tejsav hozama. Oldószermentes közegben 81% körüli hozamot valamint 40%-os e.e. értéket mértem, de ahogy n-hexán esetében is történt, itt is különböző paraméterek mellett érhető el a maximális hozam illetve enantioszelektivitás. Méréseim így megerősítik Hasegawa és társainak [Hasegawa, 2008] munkáját, akik etanolban és n-hexánban vizsgálták az észterezés hozamát, ahol ugyanaz a tendencia figyelhető meg, mint az általam végzett kísérleteknél. Hozzám hasonlóan kimutatták, hogy n-hexánban kisebb hozam realizálható, mint oldószermentes közegben. Ezen felül megállapítottam,

hogy a legnagyobb észterhozamok ionos

folyadékokban érhetők el (46-121%), és az enantioszelektivitás is ebben a közegben volt a legnagyobb. Cyphos 104-ben határoztam meg olyan paraméterkombinációt, mely mellett mindkét vizsgált függő változó nagy értékeket mutatott (y=56%, e.e.=22%). Mivel az irodalmi hivatkozások szerint az ionos folyadékos közegben az enzimek aktivitása és enantioszelektivitása is növekszik, ezért tízféle Cyphos-típusú ionos folyadék katalitikus aktivitását vizsgáltam. A cél az volt, hogy kiválasszam közülük azokat, amelyek katalizátor hatása csekély, ezáltal az enzim kifejtheti enantioszelektivitását az ionos folyadék közegében. A vizsgálatok tárgya a Cyphos 102, 103, 104, 105, 106, 109, 110, 163, 166 és 201 ionos folyadékok voltak. A kísérletek során megállapítottam, hogy 70 °C-os reakcióhőmérsékleten az említettek közül csak 5 (Cyphos 103, 104, 105, 109, 110) mutatott kismértékű 97

katalizátorhatást, vagyis ezek az enantioszelektív reakciók közegeként felhasználhatónak bizonyultak. Az eredmények Major és társainak [Major, 2010] megfigyeléseihez hasonlóak voltak, bár ők csak 6 fajta ionos folyadékot vizsgáltak az említett 10 közül. A továbbiakban az előző kísérletek során alkalmasnak talált ötféle ionos folyadékban vizsgáltam a CALB enzim észterhozamát és enantioszelektivitását. Vizsgálataim szerint a Cyphos 104-es ionos folyadék bizonyult a leghatásosabb oldószernek, mivel jelenlétében 55%-os hozam és 24 óra után 22%-os enantiomerfelesleg érték valósítható meg egy paraméterkombináció mellett. A szakirodalom szerint a CALB enzimen kívül más lipáz enzimmel is végeztek enantioszelektív kísérleteket. Ezek közül a leghatásosabbnak általában a Candida rugosa lipázt találták. A legmegfelelőbb reakcióközegben (Cyphos 104) hasonlítottam össze a CALB és Candida rugosa hatásait, emellett további paraméterként vizsgáltam az ionos folyadék mennyiségének hatását is. A 4 faktoros, 3 szintes kísérleti terv eredményei azt mutatták, hogy nagy hozam érhető el Candida rugosa lipáz jelenlétében (41%), és emellett az enantiomerfelesleg értéke elérte a 38%-ot (1 h), de a 24 órás kísérleti idő elteltével 0-hoz közeli értékre csökkentek. Ezeket az értékeket több mérési pontban figyeltem meg. A mérési adatok azt mutatják, hogy CALB alkalmazása mellett azonos körülmények között magasabb észterhozam érhető el, és emellett az enantioszelektivitás is nagyobb, tehát a Candida rugosa lipáz kevésbé alkalmas célom megvalósításához. Torres [Torres, 2001] eredményei is alátámasztják, hogy Candida antarctica lipáz B enzimmel nagyobb hozam érhető el, mint Candida rugosa enzim alkalmazása mellett. Az ionos folyadék/scCO2 elegy kiválóan alkalmas enzimes reakciók végrehajtásához, ahol az ionos folyadék stabilizálja az enzimet, a scCO2 pedig segíti az anyagátadási folyamatokat. Kísérleteimet 35, 50, 70 °C és 100, 200, 300 bar nyomásértékek mellett végeztem ionos folyadék hozzáadásával és a nélkül is. Cyphos 104 nélkül végzett kísérletekben a hozam csak magas hőmérsékleten volt számottevő (>100%), az enantioszelektivitás pedig — ezzel ellentétesen — alacsony hőmérsékleten és kisebb nyomáson. A rendszerhez ionos folyadék hozzáadását követően az észterhozam már alacsony hőmérsékleteken is, minden nyomásérték mellett, túllépte a 80°-ot. A legjobb eredményeket kis és közepes nyomáson és alacsonyabb hőmérséklet mellett mértem. Az enantioszelektivitás esetében nem mértem jobb értékeket, mint a hagyományos módszer esetében, de a hozamot nagyban növelte a scCO2/IL elegye. Hasonló eredményre jutottunk tejsav észterezés során n-butanollal a Maribori Egyetemen végzett közös munkák során. Mérési eredményeink is azt mutatták, hogy a magas hőmérsékleten nagyobb a hozam, de a méréseink során nem használtunk ionos folyadékot. 98

Paljevac és társai pedig bizonyították, hogy kis mennyiségű ionos folyadék már jelentősen növeli a hozamot a kettős rendszerben [Paljevac, 2009]. Mivel az előzőekben végzett kísérletek közül a legnagyobb hozamot és enantioszelektivitást Cyphos 104 ionos folyadékban értem el, egy bizonyos paraméterkombináció mellett, Candida antartctica lipáz B enzim jelenlétében, ezért ebben az ionos folyadékban kiegészítő vizsgálatokat folytattam, mely során meghatároztam a négy reakcióparaméter (alk/TS arány, kezdeti víztartalom, hőmérséklet és az IL/alk arány) optimális értékeit, melyek mellett maximális észterhozam és enantioszelektivitás mérhető. Hozam esetében 30 illetve 50 °C-os hőmérséklet között nem figyeltem meg nagy változást, az alk/TS arány növelésével viszont folyamatosan növekedett. Kismértékű hatást mutatott az IL/alk aránya, melynek maximumát 1-es értéknél figyeltem meg. A legnagyobb hatása a kezdeti víztartalomnak van, mivel a 4 m/m%-os érték növelésével meredeken csökken az észterhozam. Az enantioszelektitivásra is hasonlóan hatott a víztartalom, de ez esetben 4 és 8 m/m% között figyelhető meg maximális érték. A hőmérséklet erősebben hat az e.e-re, mint a hozamra, mivel a hőmérséklet növelésével már 30 °C után csökkenést figyeltem meg. 11-es alk/TS és 1-es IL/alk arány eredményezte a legnagyobb e.e. értékeket. Hozam esetében az ionos folyadék mennyiségének hatása hasonlónak mondható a Major [Major, 2009] által leírtakhoz. Az észterezés hatásfokát növeli a hőmérséklet emelkedése Inaba szerint [Inaba, 2009], mely részben igaznak bizonyult a hozam tekintetében is. Rotticci megállapításai [Rotticci, 2000] megerősítik a mérési eredményeimet, miszerint a hőmérséklet csökkenése fordított arányosságban áll az enantioszelektivitással. Ennek értelmében az alacsonyabb hőmérséklet a legmegfelelőbb érték, mely a technológia energiafelhasználását is csökkenti. A további mérésekhez 11-es alk/TS és 1-es IL/alk arányt alkalmaztam. A kísérletek során megállapítottam, hogy a víztartalom 4 m/m% alá történő csökkentése hátrányosan befolyásolja a hozamot és az enantioszelektivitást is, ezért legalkalmasabbnak a 4 m/m/%-ot ítéltem meg. A legalkalmasabbnak talált paraméterek mellett megvizsgáltam, hogy a Candida antarctica lipáz B enzim mellett az észterezés során képződő víz eltávolítása milyen hatást okoz. A reakcióelegyekhez 70 illetve 110 mg zeolitot adtam. 48 órás reakcióidő után megállapítható volt, hogy tejsav észterezése során a vízeltávolítás hátrányosan befolyásolja a hozamot és az enantioszelektivitást. A referenciaelegyhez képest (92%) 86% illetve 80%-ra csökkent a hozam a zeolit mennyiségével fordított arányosságban, az enantiomerfelesleg értékei pedig már a reakció elején kisebbek voltak, ám a különbség nem olyan mértékű, mint az előbbi esetében. Major mérési eredményei is hasonló hatást írnak le, mivel a tejsav észterezésekor a víz mennyisége a monomer/oligomer arányokat megváltoztatja [Major, 2010]. 99

A pervaporáció széles körben alkalmazott vízeltávolítási technika az észterezések során. Hatását 5 órás reakcióban vizsgáltam PERVAP 2201-es membrán segítségével. A referenciaelegyhez képest a pervaporáció során mért nagyobb kezdeti enantioszelektivitás a reakció lefutása során csökkent, és kisebb értéket mutatott, mint pervaporáció nélkül. A hozam a reakció első három órájában nagyobb volt, mint a referenciaelegy esetében, de 5 óra után végül szinte ugyanazt az értéket érte el. Mindkét vízeltávolítási technika esetében megfigyelhető volt, hogy alkalmazásuk során nem javulnak, hanem romlanak is a vizsgált paraméterek értékei, mely a miatt következik be, hogy a tejsav monomer tartalma nem pótolja a kiindulási reakciópartnert, ezért a hajtóerő kisebb. Ezt a megfigyelést Engin [Engin, 2003] és Major [Major, 2010] munkája is alátámasztja. Chen és társai [Chen, 1987] fogalmazták meg, hogy reverzibilis folyamatok termékét tisztítás és hidrolízis után újra felhasználva a reakció során növelhető a termék enantiomer tisztasága. Ezt az elvet követve végeztem el a fentebb említett optimális paraméterkombináció mellett a termék újbóli reakcióba vitelét. A kísérletsorozatok úgy álltak össze, hogy a reakció végén képződött termék enantiomerfelesleg értékével állítottam össze a következő reakcióelegy tejsavtartalmát. A termékkinyerést és tisztítást a technika komplikáltsága miatt nem végeztem el. A kísérletsorozatokban kiderült, hogy a megváltozott enantiomertisztaságú termékből visszakapott szubsztrát újbóli reakcióba vitelével nagyban növelhető az enantiomerfelesleg. Az első kísérletek 24 órán át tartottak, és az előző reakció végén kapott e.e. értéket állítottam be minden soron következő elegy esetében. A későbbiekben 50% illetve 30%-os hozamnál megállítottam a mérést, és az aktuális e.e. értékkel kezdtem a következő reakciót. Az adatok azt mutatták, hogy 50%-os hozamnál történő megállításkor végezhető el az újbóli reakcióba vitel a leghatékonyabb módon, mivel 7 helyett csak 4 reakciót igényel, és a másik két módszerrel összehasonlítva itt valósítható meg a legkisebb költségek mellett a legnagyobb termékkihozatal. Az ionos folyadékban történt aktivitásvesztés sokkal lassabban következik be, mint oldószermentes közegben.

8-szori újrahasználattal mértem a CALB aktivitásának

csökkenését. Az első használat után mindkét esetben meredek, több mint 30%-os hozamcsökkenést mértem, a további reakciók során pedig fokozatosan csökkent az enzim aktivitása. A kapott eredmények azt mutatják, hogy a jövőben kifejleszthető egy olyan technológia, mely az iparban előállított olcsóbb racém tejsav elegyből választja el az (L)-tejsav enantiomert, melyből biológiai úton lebomló műanyagot lehet gyártani.

100

Tézispontok 1. Enantioszelektivitás és hozam szempontjából vizsgáltam a tejsav enzimes észterezését különböző közegekben. A szakirodalomban fellelhető eredmények között az enzimes tejsavészterezés

enantioszelektivitásának

vizsgálata

teljesen

új

terület,

melynek

vizsgálatáról nem állnak rendelkezésre adatok. Megállapítottam, hogy n-hexánban és oldószermentes (etanolfelesleg) közegben a tejsav etil-észter enzimes (Candida antarctica lipáz B) előállítása során kismértékű enantioszelektivitás mérhető. n-Hexán esetében monomer tejsavra vonatkoztatva a legnagyobb hozam 55%, az enantiomerfelesleg 20%, oldószermentes közegben pedig 81% illetve 22% volt, mindkét esetben 24 óra reakcióidő után. A továbbiakban 10 Cyphos-típusú ionos folyadékot vizsgáltam enzim nélküli tejsav észterezéses reakcióban, és megállapítottam, hogy közülük 5 rendelkezik elegendően alacsony katalitikus aktivitással ahhoz, hogy felhasználhatók legyenek enzimes reakciók oldószereként. A kisebb katalitikus aktivitással rendelkező ionos folyadékok a 30 °C-on mért hozammal: Cyphos 103: 9% Cyphos 104: 13% Cyphos 105: 6% Cyphos 109: 34% Cyphos 110: 26% Oldószermentes közegben: 2% Mérésekkel igazoltam, hogy az öt ionos folyadék közül a Cyphos 104 — trihexiltetradecil-foszfónium-bisz (2,4,4-trimetilpentil) foszfinát — a legalkalmasabb közeg tejsav és etanol enantioszelektív reakcióinak kivitelezéséhez. A kísérlettervezés kiértékelése során megállapítottam, hogy a három paraméter mért intervallumaiban a legnagyobb hozam és enantioszelektivitás 30 °C-on, 11-es alk/TS arány és 8 m/m%-os kezdeti víztartalom mellett érhető el y=56%, e.e.=22%-os értékekben, 50%-os hozamnál az e.e.=23%. (1. publikáció) 2. Méréseim igazolták, hogy a Candida antarctica lipáz B nagyobb aktivitást és enantioszelektivitást mutat a vizsgált körülmények között, mint a Candida rugosa. 4 reakcióparaméter (hőmérséklet, kezdeti víztartalom, alk/TS arány, IL/alk mennyisége) változtatása mellett hasonlítottam össze a két enzimet. CALB-bal szinte valamennyi 101

paraméterkombináció mellett nagyobb hozamot értem el, enantioszelektivitás esetében pedig egyértelműen CALB esetében mértem nagyobb e.e. értékeket 24 óra reakcióidő után. (4. publikáció) 3. A szuperkritikus CO2-ban és scCO2/IL rendszerben folytatott mérések eredményeiből megállapítottam, hogy a tejsav etanollal történő észterezése 100% feletti hozamot is elérhet, miközben az enantioszelektivitás kicsi marad. A hőmérséklet értékét 35, 50 és 75 °C-on, a nyomást pedig 100, 200, 300 bar-on vizsgálva megállapítottam, hogy a scCO2 mellé Cyphos 104-es ionos folyadékot adagolva pozitív hatást figyelhető meg a vizsgált észterezésre. Ionos folyadék nélkül csak magas hőmérsékleten mérhető 100% feletti hozam (123-131%), az enantiomerfelesleg értékei pedig ezzel ellenkező módon, alacsony hőmérsékleten mutattak 21-27% közötti értékeket nagyobb nyomás mellett 1 óra reakcióidő után. Ionos folyadékos közegben már 30 °C-on is mértem 120%-os hozamot, ennek ellenére az enantiomerfelesleg értékei nem mutattak növekvő tendenciát az ionos folyadék nélküli rendszerhez képest. Az ionos folyadékban és scCO2-ban végzett kísérletek eredményeit összehasonlítva megállapítottam, hogy Cyphos 104-es ionos folyadék közegében és CALB enzim használatával érhető el a legnagyobb hozam és enantiomerfelesleg. (2. publikáció) 4. A hőmérséklet, az alk/TS arány, a kezdeti víztartalom és a Cyphos 104 IL/alk arány optimális értékeit meghatározva megállapítottam a reakció maximális hozamát és enantioszelektivitását CALB enzim használata mellett. Kimutattam, hogy az optimális értékeket az enzim működéséből adódóan a következő intervallumokon kívül nem indokolt mérni: 30-70 °C, 3-19-es alk/TS arány, 2,5-16 m/m% kezdeti víztartalom, 0-2 IL/alk arány. Meghatároztam, hogy az adott mérések során a legjobb eredmények 30 °C-on, 11-es alk/TS arány, 4 m/m%-os kezdeti víztartalom és 1-es IL/alk arány mellett érhetők el (y=77%, e.e.1h=38%, e.e.(y=50%)=30%). (4. publikáció) 5. Bebizonyítottam, hogy a vízeltávolítás a hozamon kívül az enzim enantioszelektivitását is csökkentette a tejsav enantioszelektív észterezésekor. A vizsgálatok során a képződött vizet zeolittal (4Å) és pervaporációval (PERVAP 2201) távolítottam el a reakcióelegyből. Zeolit alkalmazásakor a referenciaeleggyel összehasonlítva [y=92%, e.e.(y=50%)=30%] 86% és 80%-os hozamot illetve 24% és 25%-os e.e. értékeket (y=50%-nál) értem el 48 órás reakcióidő után. Pervaporáció esetében 5 óra reakcióidő elteltével a hozam 22%-os 102

volt, mely megegyezik a referenciaelegynél mért értékkel, az e.e. érték pedig 26% volt (referenciaelegy e.e.=34%). (3. publikáció) 6. Elméleti számításokkal és mérésekkel bizonyítottam, hogy az egyszeri reakció során kapott enantiomerfelesleg értéke nagymértékben növelhető a termékből visszanyert szubsztrát újbóli reakcióba vitelével. A meghatározott optimális paraméter értékek mellett a megváltozott enantiomer arányú termékből visszanyerhető kiindulási anyag (tejsav) újbóli reakciójával tovább növeltem az enantiomerfelesleg értéket. Három módszer közül órás reakciók ill. 50%-os és 30%-os hozam utáni visszaforgatás

24

az 50%-os hozam utáni

módszerrel értem el a legjobb eredményeket. Ebben az esetben a legkisebb a visszaforgatások száma, ezáltal a várható költségek (4x, e.e.=79%). (4. publikáció) 7. Meghatároztam az enzim dezaktiváció mértékét Cyphos 104-es ionos folyadékban, és igazoltam az ionos folyadék enzimstabilizáló hatását. A hatás abban mutatkozott, hogy ötszöri újrafelhasználás után is nagyobb aktivitást mértem, mint ionos folyadék nélkül. Ionos folyadék közegében a kezdeti 77%-os hozam 5 újrahasználat után 20%-ra csökkent. Az ionos folyadék nélküli reakcióban a hozam 50%-ról 9%-ra csökkent az ötödik visszaforgatás után. (4. publikáció)

103

Theses 1. Lactic acid esterification was investigated in different medias regarding to the ester yield and enantioselectivity. There are no references in the literature to the investigation of enantioselective lactic acid esterification, accordingly this topic is a brand new research area. It was demonstrated when using n-hexane and alcohol excess as a solvent low enantioselectivity can be measured during enzymatic (Candida antarctica lipase B) ethyllactate synthesis. It was found that the highest yield in the media of n-hexane was 55% and the e.e. value was 20%, in alcohol excess the yield and the e.e. value were 81% and 22%, respectively, both cases after 24 hours. The catalytic activity was investigated of 10 Cyphos-type ionic liquids without any added enzyme during the esterification of lactic acid. Five of them had as low catalytic activity as to be a suitable solvent for my reactions. The ionic liquids with lowest catalytic activity at 30°C and the corresponding measured yields are the followings: Cyphos 103: 9% Cyphos 104: 13% Cyphos 105: 6% Cyphos 109: 34% Cyphos 110: 26% Solvent free system: 2% Cyphos 104 was the most appropriate ionic liquid for being the media of enantioselective lactic acid esterification. After evaluating the datas of the experimental design it was proved that the highest ester yield (56%) and e.e. value (22%) (after 50% yield the e.e.=23%) could be observed at 30°C, near 11 alcohol/LA ratio and 8 w/w% initial water content. (1. publication)

2. It was identified that the Candida antarctica lipase B showed higher activity than Candida rugosa near the same reaction conditions. The comparison of the two lipases was achieved near varying 4 reaction parameters (temperature, initial water content, alcohol/LA ratio and IL/alcohol ratio). Based on the findings CALB showed higher ester yield as good as in case of all reaction conditions, and the enantioselectivity was higher in any case after 24 hours. (4. publication)

104

3. It was concluded that in scCO2 and scCO2/IL mixture the ester yield could be higher than 100%, while the e.e. values were low. The results confirmed that the presence of Cyphos 104 ionic liquid in scCO2 has positive effect on the reaction near 35, 50 and 70°C and 100, 200, 300 bar pressure. Yields above 100% (123-131%) without addition of ionic liquid could be measured just at high temperature, on the contrary the e.e. values were higher (2727%) at lower temperature near higher pressure after 1 hour reaction time. In case of adding ionic liquid at 30°C could be observed 120% ester yield, despite the enantioselectivity was not increased compared to the system without any ionic liquid. Comparing the scCO2 with the IL medium it was demonstrated that in Cyphos 104 ionic liquid as a solvent and using CALB enzyme the highest yield and e.e. values could be measured. (2. publication)

4. The maximal ester yield and e.e. values were observed applying CALB when the optimal values of temperature, alcohol/LA ratio, initial water content and Cyphos 104 IL/alcohol ratios were determined. It was concluded that the optimal values could be find in the following intervals: 30-70 °C, 3-19 alcohol/LA ratio, 2,5-16 w/w% initial water content, 02 IL/alcohol ratio. The best results were found at 30°C, near 1 alcohol/LA ratio, 4 w/w% initial water content and 1 IL/alcohol ratio (y=77%, e.e.1h=38%, e.e.(y=50%)=30%). (4. publication)

5. It was demonstrated that removal of the originate water during the raction was decreased the ester yield and the enantioselectivity, as well. The water was removed by adding zeolite (4Å) to the reaction mixture and by pervaporation (PERVAP 2201). Applying of zeolite compared to the reference mixture [y=92%, e.e.(y=50%)=30%] 86% and 80% yield and 24% és 25% e.e. values were observed (at y=50%) after 48 hours reaction time. In case of pervaporation after 5 hours the yield was 22% which is the same value like without pervaporation, and the e.e. value was 26% (reference mixture e.e.=34%). (3. publication)

6. It was concluded through theoretical calculations and experiments that the e.e. value, observed after a single reaction, could be increased when the substrate (lactic acid) obtained from the synthetized product is reacted again. The best result were obtained out the three methods (24 hours reactions, recycling after 50% or 30% yield) when recycling happened after 50% yield. The number of recycling and the costs are the lowest with this method (4x, e.e.=79%). (4. publication) 105

7. Decreasing of the enzyme activity was identified in Cyphos 104 ionic liquid. Based on the findings the ionic liquid has enzyme stabilizing effect. After 5 times recycling the yield was decreased from 77% to 20% in Cyphos 104, but without ionic liquid the initial yield (50%) was decreased to 9%. (4. publikáció)

106

Irodalomjegyzék Abe, Y., Kude, K., Hayase, S., Kawatsura, M., Tsunashima, K., Itoh, T.: Design of phosphonium ionic liquids for lipase-catalyzed transesterification, Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic 51 (2008) 81-85. Anastas P. T., Warner, J. C.: Green Chemistry: Theory and Practice, Oxford University Press, New York (1998). Anastas, P. T., Kirchhoff, M. M.: Origins, current status, and future challenges of green chemistry, Accounts of Chemical Research 35 (2002) 686-694. Anderson, J. L., Ding, J., Welton, T., Armstrong, D. W.: Characterizing ionic liquids on the basis of multiple solvation interactions, Journal of American Chemical Society 124 (2002) 14247-14254. Aparicio, S., Halajian, S., Alcalde, R., García, B., Leal, J.M.: Liquid structure of ethyl lactate, pure and water mixed, as seen by dielectric spectroscopy, solvatochromic and thermophysical studies, Chemical Physics Letters 454 (2008) 49-55. Asthana, N., Kolah, A., Vu, D. T., Lira, C. T., Miller, D. J.: A Continuous Reactive Separation Process for Ethyl Lactate Formation, Organic Process Research Development 9 (2005) 599-607. Asthana, N. S., Kolah, A. K., Vu, D. T., Lira, C. T., Miller, D. J.: A Kinetic Model for the Esterification of Lactic Acid and Its Oligomers, Industrial & Engineering Chemistry Research 45 (2006) 5251-5257. Bagno, A., Butts, C., Chiappe, C., D’amico, F., Lord, J. C. D., Pieraccini, D., Rastrelli, F.: Characterization and comparison of hydrophilic and hydrophobic room temperature ionic liquids incorporating the imidazolium cation, Organic and Biomolecular Chemistry 3 (2005) 1624-1630. Barve, P. P., Rahman, I., Kulkarni, B. D.: Pilot plant study of recovery of lactic acid from ethyl lactate, Organic Process Research and Development 13 (2009) 573-575. Beisson, F., Tiss, A., Riviere, C., Verger, R.: Methods for lipase detection and assay: a critical review, European Journal of Lipid Science and Technology 102 (2000) 133–153. Benedict, D. J., Parulekar, S. J., Tsai, S. P.: Esterification of Lactic Acid and Ethanol with/without Pervaporation, Industrial & Engineering Chemistry Research 42 (2003) 2282-2291. Bennett, J. S., Charles, K. L., Miner, M. R., Heuberger, C. F., Spina, E. J., Bartels, M. F., Foreman, T.: Ethyl lactate as a tunable solvent for the synthesis of aryl aldimines, Green Chemistry 11 (2009) 166168. Benninga, H.: A History of Lactic Acid Making: A Chapter in the History of Biotechnology, Kluwer Academic Publishers, The Netherlands (1990). Berglund, P., Holmquist, M., Hult, K., Högberg, H.-E.: Alcohols as enantioselective inhibitors in a lipase catalysed esterification of a chiral acyl donor, Biotechnology Letters 17 (1995) 55-60. Berglund, P.: Controlling lipase enantioselectivity for organic synthesis, Biomolecular Engineering 18 (2001) 13–22.

107

Blanchard, L. A., Brennecke, J. F.: Recovery of Organic Products from Ionic Liquids Using Supercritical Carbon Dioxide, Industrial & Engineering Chemistry Research 40 (2001 a) 287-292. Blanchard, L. A., Gu, Z., Brennecke, J. F.: High-Pressure Phase Behavior of Ionic Liquid/CO2 Systems, Journal of Phisical Chemistry B 105 (2001 b) 2437-2444. Bodnár, J., Gubizca, L., Szabó, L.-P.: Enantiomeric separation of 2-chloropropionic acid by enzymatic esterification in organic solvents, Journal of Molecular Catalysis 61 (1990) 353-361. Bogaert, J.-C., Coszach, P.: Poly(lactic acids): a potential solution to plastic waste dilemma, Macromolecular Symposia 153 (2000) 287-303. Bornscheuer, U. T.: Methods to increase enantioselectivity of lipases and esterases, Current Opinion in Biotechnology 13 (2002) 543–547. Bousquet, M. P., Willemot, R. M., Monsan, P., Boures, E.: Lipase catalyzed a-butylglucoside lactate synthesis in organic solvent for dermo-cosmetic application, Journal of Biotechnology 68 (1999) 61– 69. Bovara, R., Carrea, G., Ottolina, G., Riva, S.: Water activity does not influence the enantioselectivity of Lipase PS and lipoprotein lipase in organic solvents, Biotechnology Letters 15 (1993) 169-174. Bradaric, C. J., Downard, A., Kennedy, C., Robertson, A. J. and Zhou, Y.: Industrial preparation of phosphonium ionic liquids, Green Chemistry 5 (2003) 143-152. Buchholz, K., Kasche, V., Bornscheuer, U. T.: Biocatalysts and Enzyme Technology,Wiley-VCH Verlag GmbH. & Co, Weinheim (2005). Carrea, G., Riva, S.: Organic Synthesis with Non-Aqueous Media, Viley-VCH Verlag GMBH & Co., Weinheim (2008). Chen, C. S., Fujimoto, Y., Girdaukas, G., Sih, C. J.: Quantitative analyses of biochemical kinetic resolutions of enantiomers, Journal of American Chemical Society 104 (1982) 7294-7299. Chen, C. S., Hsiung Wu, S., Girdaukas, G., Sih, C. J.: Quantitative analyses of biochemical kinetic resolution of enantiomers. 2. Enzyme-catalyzed esterifications in water-organic solvent biphasic systems, Journal of American Chemical Society109 (1987) 2812-2817. Clark, J. H., Tavener, S. J.: Alternative Solvents: Shades of Green, Organic Process Research Development 11 (2006) 149-155. Corma Canos, A., Iborra, S., Velty, A.: Chemical routes for the transformation of biomass into chemicals, Chemical Reviews 107 (2007) 2411-2502. Dakin, H. D.: The hydrolysis of optically inactive esters by means of enzymes, The Journal of Physiology 30 (1903) 253–263. Data, R., Henry, M.: Lactic acid: recent advances in products, processes and technologies — a review, Journal of Chemical Technology and Biotechnology 81 (2006) 1119–1129. Delgado, P., Sanz, M. T, Beltrán, S.: Kinetic study for esterification of lactic acid with ethanol and hydrolysis of ethyl lactate using an ion-exchange resin catalyst, Chemical Engineering Journal 126 (2007) 111–118. 108

Dijksman, A., Elzinga, M. J., Li, Y.-X., Arends, I., Sheldon, R.: : Efficient ruthenium-catalyzed racemization of secondary alcohols: application to dynamic kinetic resolution, Tetrahedron: Asymmetry 13 (2002) 879–884. Drumright, R. E., Gruber, P. R., Henton, D. E.: Polylactic Acid Technology, Advanced Materials 12 (2000) 1841-1846. Dunn, P. J., Wells, A., Williams, M. T.: Green Chemistry in the Pharmaceutical Industry,Wiley-VCH Verlag GmbH. & Co., Weinheim (2010). Engin, A., Haluk, H., Gurkan, K.: Production of lactic acid esters catalyzed by heteropoly acid supported over ion-exchange resins, Green Chemistry 5 (2003) 460-466. Fan, Y., Zhou, C., Zhu, X.: Selective catalysis of lactic acid to produce commodity chemicals, Catalysis Reviews: Science and Engineering 51 (2009) 293-324. Fan, Y., Qian, J.: Lipase catalysis in ionic liquids/supercritical carbon-dioxide and its applications, Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic 66 (2010) 1-7. Fan, A., Chuah, G.-K.., Jaenicke, S.: Phosphonium ionic liquids as highly thermal stable and efficient phase transfer catalysts for solid–liquid Halex reactions, Catalysis Today 198 (2012) 300-304. Fehér, E., Major, B., Bélafi-Bakó, K., Gubicza, L.: Semi-continuous enzymatic production and membrane assisted separation of isoamyl acetate in alcohol - ionic liquid biphasic system, Desalination 241 (2009) 8-13. Fráter, T.: Ionos folyadékok alkalmazása katalitikus reakcióközegként, PhD értekezés, Pannon Egyetem, Műszaki Kémiai Kutató Intézet, Veszprém (2007). García, T.: Biodegradable ionic liquids: Part I. Concept, preliminary targetsand evaluation, Green Chemistry 6 (2004) 166-175. García, T.: Biodegradable ionic liquids. Part II. Effect of the anion and toxicology, Green Chemistry 7 (2005) 9-14. Ghanem, A.: Trends in lipase-catalyzed asymmetric access to enantiomerically pure/enriched compounds, Tetrahedron 63 (2007) 1721–1754. Ghisalba, O., Meyer, H. P., Wohlgemuth, R.: Encyclopedia of Industrial Biotechnology: Bioprocess, Bioseparation, and Cell Technology, Wiley & Sons Inc., New York (2010). Goupy, J., Creighton, L.: Introduction of Design of Experiments with JMP examples, 3rd edition, SAS Institute Inc., USA (2007). Gubicza, L., Kabiri-Badr, A., Keoves, E., Bélafi-Bakó, K.: Large-scale enzymatic production of natural flavour esters in organic solvent with continuous water removal, Journal of Biotechnology 84 (2000) 193–196. Gubicza, L., Bélafi-Bakó, K., Fehér, E., Fráter, T.: Waste-free process for continuous flow enzymatic esterification in ionic liquid medium, Green Chemistry 10 (2008 a) 1284-1287.

109

Gubicza, L.: Nem konvencionális közegekben lejátszódó enzimkatalitikus észterezési reakciók vizsgálata, MTA doktori értekezés, Pannon Egyetem, Műszaki Kémiai Kutató Intézet, Veszprém (2008 b). Hasegawa, S., Azuma, M., Takahashi, K.: Stabilization of enzyme activity during the esterification of lactic acid in hydrophobic ethers and ketones as reaction media that are miscible with lactic acid despite their high hydrophobicity, Enzyme and Microbial Technology 43 (2008) 309–316. Haveren, J. V., Scott, E. L., Sanders, J.: Bulk chemicals from biomass Biofuels, Bioproducts and Biorefining 2 (2008) 41-57. Hetényi, K. Zs.: Biofinomító technológiáinak optimalizálása, PhD értekezés, Budapesti Műszaki Egyetem, Alkalmazott Biotechnológia és Élelmiszertudományi Tanszék, Budapest (2010). Hiljanen-Vainio, M., Varpomaa, P., Seppala, J., Tormala, P.: Modification of poly(L-lactides) by blending: mechanical and hydrolytic behavior, Macromolecular Chemistry and Physics 197 (1996) 1503-1523. Högberg, H-E., Edlund, H., Berglund, P., Hedenström, E.: Water activity influences enantioselectivity in a lipase-catalysed resolution by esterification in an organic solvent, Tetrahedron: Asymmetry 4 (1993) 2123–2126. Holten, C. H.: Lactic acid, Verlag Chemie, Copenhagen, Denmark (1971). Huddleston, J. G., Visser, A. E., Reichert, W. M., Willauer, H. D., Broker, G. A., Rogers, R. D.: Green Chemistry 3 (2001) 156-164. Hyon, S. H., Jamshidi, K., Ikada, Y.: Synthesis of polylactides with different molecular weights, Biomaterials 18 (1997) 1503-1508. Ikeda, Y., Kurokawa, Y.: Enantioselective Esterification of Racemic Ibuprofen in Isooctane by Immobilized Lipase on Cellulose Acetate-Titanium Iso-Propoxide Gel Fiber, Journal of Bioscience and Bioengineering 93 (2002) 98-100. Inaba, C., Maekawa, K., Morisaka, H., Kuroda, K., Ueda, M.: Efficient synthesis of enantiomeric ethyl lactate by Candida antarctica lipase B (CALB)-displaying yeasts, Applied Microbiology and Biotechnology 83 (2009) 859-864. Jaeger, K. E., Schneidinger, B., Rosenau, F., Werner, M., Lang, D., Dijkstra, B. W., Schimossek, K., Zonta, A., Reetz, M. T.: Bacterial lipases for biotechnological applications, Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic 3 (1997) 3–12. Jaeger, K. E., Eggert, T.: Lipases for biotechnology, Current Opinion in Biotechnology 13 (2002) 390–397. Jiménez-González, C., Curzons, A., Constable, D., Cunningham, V.: Cradle-to-Gate Life Cycle Inventory and Assessment of Pharmaceutical Compounds: a Case-Study, International Journal of Life Cycle Assessment 9 (2004) 114-121. Kaar, J. L., Jesionowski, A. M., Berberich, J. A., Moulton, R., Russell, A. J.: Impact of ionic liquid physical properties on lipase activity and stability, Journal of American Chemical Society 125 (2003) 4125-4131. 110

Kazlauskas, R. J., Weissfloch, A. N. E., Rappaport, A. T., Cuccia, L. A.: Rule to predict which enantiomer of a secondary alcohol reacts faster inreactions catalyzed by cholesterol esterase, lipase from Pseudomonas cepacia, and lipase from Candida rugosa, Journal of Organic Chemistry 56 (1991) 2656–2665. Kharas, G. B., Sanchez-Riera, F., Severson, D. K.: Polymers of Lactic Acid - Plastics from Microbes, Hanser Publishers, Munich (1994). Kiran, K. R., Divakar, S.: Lipase catalyzed synthesis of organic acid esters of lactic acid in nonaqueous media, Journal of Biotechnology 87 (2001) 109–121. Kitaguchi, H., Itoh, I., Ono, M.: Effects of water and water-mimicking solvents on the lipase-catalyzed esterification in an apolar solvent, Chemistry Letters 19 (1990) 1203-1206. Knez, Ž., Habulin, M., Primožič, M.: Enzymatic reactions in dense gases, Biochemical Engineering Journal 27 (2005) 120-126. Kricheldorf, H. R., Kreiser-Saunders, I., Jurgens, C., Wolter, D.: Polylactides - synthesis, characterization and medical application, Macromolecular Symposia 103 (1996) 85-102. Lee, S. Y., Valtchev, P. and Dehghani, F.: Synthesis and purification of poly(L-lactic acid) using a one step benign process, Green Chemistry 14 (2012) 1357-1366. Liese, A., Seelbach, K., Wandrey, C.: Industrial Biotransformations, Wiley-VCH Verlag GmbH. & Co, Weinheim, 2nd edition (2006). Lou, W., Zong, M., Liu, Y., Wang, J.: Efficient enantioselective hydrolysis of d,l-phenylglycine methyl ester catalyzed by immobilized Candida antarctica lipase B in ionic liquid containing systems, Journal of Biotechnology 125 (2006) 64-74. Lozano, P., de Diego, T., Guegan, J. P., Vaultier, M., Iborra, J. L.: Stabilization of a-chymotrypsin by ionic liquids in transesterification reactions, Biotechnology and Bioengineering 75 (2001 a) 563-569. Lozano, P., de Diego, T., Carrie, D., Vaultier, M., Iborra, J. L.: Overstabilization of Candida antarctica lipase B by ionic liquids in ester synthesis, Biotechnology Letters 23 (2001 b) 1529-1533. Lozano, P., de Diego, T., Carrié, D., Vaultier, M., Iborra, J. L.: Continuous green iocatalytic processes using ionic liquids and supercritical carbon dioxide, Chemical Communications 7 (2002) 692-693. Lozano, P., de Diego, T., Carrie, D., Vaultier, M., Iborra, J. L.: Synthesis of glycidyl esters catalyzed by lipases in ionic liquids and supercritical carbon dioxide, Journal of Molecular Catalysis A Chemical 214 (2004) 113–119. Major, B., Kelemen-Horváth, I., Csanádi, Zs., Bélafi-Bakó, K., Gubicza, L.: Microwave assisted enzymatic esterification of lactic acid and ethanol in phosphonium type ionic liquids as co-solvents, Green Chemistry 11 (2009) 614-616. Mandl, M. G.: Status of green biorefining in Europe, Biofuels, Bioproducts and Biorefining 4 (2010) 268-274. Marták, J., Schlosser, S.: Extraction of lactic acid by phosphonium ionic liquids, Separation Purification Technology 57 (2007) 483-494.

111

Megyeri, G., Bélafi-Bakó, K., Nemestóthy, N., Gubicza, L.: Effect of [Bmim]Cl ionic liquid pretreatment on the lignocellulose conversion to fermentable sugars, Bioresource Technology, Submitted Meyer, H. P. and Turner, N. J.: Biotechnological manufacturing options for organic chemistry, MiniReviews in Organic Chemistry 6 (2009) 300-306. Molnár, P., Székely, E., Simándi, B., Keszei, S., Lovász, J., Fogassy, E.: Enantioseparation of ibuprofen by supercritical fluid extraction, Journal of Supercritical Fluids 37 (2006) 384–389. Moniruzzaman, M., Nakashima, K., Kamiya, N., Goto, M.: Recent advances of enzymatic reactions in ionic liquids, Biochemical Engineering Journal 48 (2010) 295–314. Moss, G. P.: Basic terminology of stereochemistry, Pure and Applied Chemistry 68 (1996) 2193– 2222. Németh Á., Kiss Á., Sevella B., Műszaki Kémiai Napok, Veszprém, Proceedings (2011) 202-205. Nikles, S. M., Piao, M., Lane, A. M., Nikles, D. E.: Ethyl lactate: A green solvent for magnetic tape coating, Green Chemistry 3 (2001) 109-113. Ohara, H.,Yamamoto, M., Onogi, A., Hirao, K., Kobayashi, S.: Optical resolution of n-butyl D- and Llactates using immobilized lipase catalyst, Journal of Bioscience and Bioengineering 111 (2011) 1921. Oliveira, F. S., Araújo, J. M.M., Ferreira, R., Rebelo, L. P. N., Marrucho, I. M: Extraction of llactic, l-malic, and succinic acids using phosphonium-based ionic liquids, Separation and Purification Technology 85 (2012) 137–146. Paljevac, M., Knez, Ž., Habulin, M.: Lipase-Catalyzed Transesterification of (R,S)-1-Phenylethanol in SC CO2 and in SC CO2/Ionic Liquid Systems, Acta Chimica Slovenica 56 (2009) 815-825. Park, S., Kazlauskas, R. J.: Improved preparation and use of roomtemperature ionic liquids in lipasecatalyzed enantio- and regioselective acylations. Journal of Organic Chemistry 66 (2001) 8395-8401. Park, S., Kazlauskas, R. J.: Biocatalysis in ionic liquids - advantages beyond green technology, Current Opinion in Biotechnology 14 (2003) 432-437. Pereira, C. S. M., Pinho, S. P., Silva, V. M. T. M., Rodrigues, A. E.: Thermodynamic equilibrium and reaction kinetics for the esterification of lactic acid with ethanol catalyzed by acid ion-exchange resin, Industrial & Engineering Chemistry Research 47 (2008) 1453-1463. Pereira, C. S. M., Zabka, M., Silva, V. M. T. M., Rodrigues, A. E.: A novel process for the ethyl lactate synthesis in a simulated moving bed reactor (SMBR), Chemical Engineering Science 64 (2009) 3301-3310. Pereira, C. S. M., Silva, V. M. T. M., Rodrigues, A. E.: Ethyl lactate as a solvent: Properties, applications and production processes — a review, Green Chemistry 13 (2011) 2658-2671. Persson, M., Costes, D., Wehtje, E., Adlercreutz, P.: Effects of solvent, water activity and temperature on lipase and hydroxynitrile lyase enantioselectivity, Enzyme and Microbial Technology 30 (2002) 916–923.

112

Persson, M., Bornscheuer, U. T.: Increased stability of an esterase from Bacillus stearothermophilus in ionic liquids as compared to organic solvents, Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic 22 (2003) 21-27. Pham, T. P. T., Cho, C.-W., Yun, Y.-S.: Environmental fate and toxicity of ionic liquids: A review, Water Research 44 (2010) 352–372. Reisch, M.: Drugs at the starting line, Chemical & Engineering News 86 (2008) 25-29. Romeroa, A.: Toxicity and biodegradability of imidazolium ionic liquids, Journal of Hazardous Materials 151 (2008) 268-273. Rotticci, D.: Understanding and Engineering the Enantioselectivity of Candida antarctica Lipase B towards sec-Alcohols, Kungl Tekniska Högskolan, Stockholm (2000). Rozzell, J. D.: Commercial Scale Biocatalysis: Myths and Realities, Bioorganic & Medical Chemistry 7 (1999) 2253-2261. Röper, H.: Renewable raw materials in Europe - industrial utilisation of starch and sugar, Starch/Staerke 54 (2002) 89-99. Schmid, A., Dordick, J. S. Dordick, Hauer, B., Kiener, A., Wubbolts, M., Witholt, B.: Industrial biocatalysis today and tomorrow, Nature 409 (2001) 258-268. Schöfer, S. H., Kaftzik, N., Wasserscheid, P., Kragl, U.: Enzyme catalysis in ionic liquids: lipase catalysed kinetic resolution of 1-phenylethanol with improved enantioselectivity, Chemcal Communications 5 (2001) 425-426. Schoffers, E., Golebiowski, A., Johnson, C. R.: Enantioselective synhesis through enzymic asymmetrization, Tetrahedron 52 (1996) 3769–3826. Sheldon, R. A.: Green solvents for sustainable organic synthesis: state of the art, Green Chemistry 7 (2005) 267-278. Srinivas, B., Sridhar, R., Rao, K. R.: Stereoselective total synthesis of (+)-varitriol, Tetrahedron 66 (2010) 8527-8535. Stecher, H., Faber, K.: Biocatalytic deracemization techniques: dynamic resolutions and stereoinversions, Synthesis 1 (1997) 1–16. Straathof, A. J. J., Panke, S., Schmid, A.: The production of fine chemicals by biotransformations, Current Opinion in Biotechnology 13 (2002) 548-556. Suna, J.: Synthesis and physical property characterisation of phosphonium ionic iquids based on P(O)2(OR)2- and P(O)2(R)2- anions with potential application for corrosion mitigation of magnesium alloys, Electrochimica Acta 54 (2008) 254-260. Székely, E., Simándi, B., Illés, R., Molnár, P., Gebefügi, I., Kmecza, I., Fogassy, E.: Application of supercritical fluid extraction for fractionation of enantiomers, Journal of Supercritical Fluids 31 (2004) 33–40.

113

Thang, V. H., Koschuh, W., Kulbe, K. D., Novalin, S.: Detailed investigation of an electrodialytic process during the separation of lactic acid from a complex mixture, Journal of Membrane Science 249 (2005) 173-182. Torres, C., Otero, C.: Part III. Direct enzymatic esterification of lactic acid with fatty acids, Enzyme and Microbial Technology 29 (2001) 3–12. Tsuji, H., Sumida, K.: Poly(L-lactide): v. effects of storage in swelling solvents on physical properties and structure of poly(L-lactide), Journal of Applied Polymer Science 79 (2001) 1582-1589. Ulbert, O., Fráter, T., Bélafi-Bakó, K., Gubicza, L.: Enhanced enantioselectivity of Candida rugosa lipase in ionic liquids as compared to organic solvents, Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic 31 (2004) 39-45. Venus, J., Richter, K.: Development of a Pilot Plant Facility for the Conversion of Renewables in Biotechnological Processes, Engineering in Life Sciences 7 (2007) 395-402. Vu, D. T., Kolah, A. K., Asthana, N. S., Peereboom, L., Lira, C. T., Miller, D. J.: Oligomer distribution in concentrated lactic acid solutions, Fluid Phase Equilibria 236 (2005) 125-135. Wasewar, K. L., Yawalkar, A. A., Moulijn, J. A., Pangarkar, V. G.: Fermentation of Glucose to Lactic Acid Coupled with Reactive Extraction: A Review, Industrial & Engineering Chemistry Research 43 (2004) 5969-5982. Wee, Y.-J., Kim, J.-N., Ryu, H.-W.: Biotechnological Production of Lactic Acid and Its Recent Applications, Food Technology and Biotechnology 44 (2006) 163-172. Weis, D. C., Visco, D. P.: Computer-aided molecular design using the Signature molecular descriptor: Application to solvent selection, Computers and Chemical Engineering 34 (2010) 1018-1029. Wehtje, E., Costes, D., Adlercreutz, P.: Enantioselectivity of lipases: effects of water activity, Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic 3 (1997) 22 l-230. Weissermel, K. and Arpe H.: Industrial Organic Chemistry, 3rd editionn, VCH Publishers Inc., New York (1997). Wenda, S., Illner, S., Mell, A., Kragl, U.: Industrial biotechnology — the future of green chemistry?, Green Chemistry 13 (2011) 3007-3047. Wohlgemuth, R.: Asymmetric biocatalysis with microbial enzymes and cells, Current Opinion in Biotechnology 13 (2010 a) 283-292. Wohlgemuth, R.: Biocatalysis-key to sustainable industrial chemistry, Current Opinion in Biotechnology 21 (2010 b) 713-724. Xu, X., Lin, J., Cen, P.: Advances in the Research and Development of Acrylic Acid Production from Biomass, Chinese Journal of Chemical Engineering 14 (2006) 419-427. Yan, Y., Bornscheuer, U. T., Schmid, R. D.: Efficient water removal in lipase-catalyzed esterifications using a low-boiling-point azeotrope, Biotechnology and Bioengineering 78 (2002) 3134.

114

Yang, Jie, Tan, J-N., Yang, Y. G. J.: Lactic acid as an invaluable bio-based solvent for organic reactions, Green Chemistry 14 (2012) 3304-3317. Ye, R., Hayes, D. G.: Optimization of the solvent-free lipase-catalyzed synthesis of fructose oleic acid ester through programming of water removal, Journal of American Chemical Society 88 (2011) 13511359. Yue, C., Fang, D., Liu, L.,Yi, T.-F.: Synthesis and application of task-specific ionic liquids used as catalysts and/or solvents in organic unit reactions, Journal of Molecular Liquids 163 (2011) 99-121. Zhang, D., Bai, S., Ren, M., Sun, Y.: Optimization of lipase-catalyzed enantioselective esterification of (±)-menthol in ionic liquid, Food Chemistry 109 (2008) 72-80.

115

Saját publikációk listája A dolgozat alapjául szolgáló publikációk 1. Findrik, Z., Németh, G., Gubicza, L., Bélafi-Bakó, K., Vasić-Rački, Đ.: Evaluation of factors influencing the enantioselective enzymatic esterification of lactic acid in ionic liquid, Bioprocess and Biosystems Engineering 35 (2012) 625-635. IF=1,809 2. Knez, Ž., Kavčič, S., Gubicza, L., Bélafi-Bakó, K., Németh, G., Primožič, M., Habulin, M.: Lipase-catalyzed esterification of lactic acid in supercritical carbon dioxide, Journal of Supercritical Fluids 66 (2012) 192-197. IF=2,860 3. Findrik, Z., Németh, G., Vasić-Rački, Đ., Bélafi-Bakó, K., Csanádi, Zs., Gubicza, L.: Pervaporation-aided enzymatic esterifications in non-conventional media, Process Biochemistry 47 (2012) 1715–1722. IF=2,627 4. Németh, G., Bélafi-Bakó, K., Nemestóthy, N., Gubicza, L.: Asymmetric lactic acid esterification with biocatalysts in ionic liquid, Hungarian Journal of Industrial Chemistry, 39 (2012) 419-425. Hasonló témában megjelent publikációk 5. Major, B., Németh, G., Bélafi-Bakó, K.,: Unique role of water content in enzymatic synthesis of ethyl lactate using ionic liquid as solvent, Chemical Papers 64 (2010) 261264. 6. Németh, G.: Zöld oldószer, lebomló műanyag, Élet és Tudomány 40 (2011) 1257-1259. Egyéb publikációk 7. Németh, G., Reich, K., Fazekas, B., Pitás, V., Kárpáti, Á., A rothasztott szennyvíziszap nehézfém-tartalmának csökkentési lehetősége, Hírcsatorna 3 (2009) 11-14. 8. Pitás, V., Németh, G., Reich, K., Fazekas, B., Biofilm hordozó hatása biofilmes/hibrid reaktorok működésére, Műszaki Információ. Környezetvédelem, 6 (2009) 63-74. Proceedings 9. Gubicza, L., Bélafi-Bakó, K., Csanádi, Zs., Németh, G.: Microwave assisted enzymatic esterification of lactic acid in phosphonium type ionic liquids, EUCHEM 2010, Conference on Molten Salts and Ionic Liquids, Bamberg, Németország, 2010. március 1419., pp. 149., poszter 10. Nemestóthy, N., Németh, G., Csanádi, Zs., Gubicza, L.: Continuous enzymatic esterification in pervaporation-aided system using ionic liquids as solvent, International Scientific Conference on Pervaporation, Vapor Permeation and Mambrane Distillation, Torun, Lengyelország, 2010. április 18-21., pp. 86., poszter 11. Gubicza, L., Németh, G., Csanádi, Zs., Bélafi-Bakó, K., Vrasalovic Presecki, A., Nemestóthy, N.: Enzimkatalitikus észterezés ionos folyadékokban, Veszprém, Műszaki Kémiai Napok, 2010. április 27-29., pp. 85-89., előadás

116

12. Németh, G., Bányai, T., Nemestóthy, N., Findrik, Z., Gubicza, L.: Tejsav enantioszelektív észterezése Cyphos 104 ionos folyadékban, Műszaki Kémiai Napok, Veszprém, 2010. április 27-29., pp. 101-104., előadás 13. Németh, G., Nemestóthy, N., Findrik, Z., Gubicza, L.: Enantioselecive enzymatic esterification of lactic acid in ionic liquids, 37th International Conference of Slovak Society of Chemical Engineering, Tatranské Matliare, Szlovákia, 2010. május 24-28., pp. 1225–1230., előadás 14. Németh, G., Csanádi, Zs., Findrik, Z., Gubicza, L.: Investigation of the enantioselectivity of different lipase enzymes during the esterification of lactic acid in ionic liquid cosolvent, Applied biocatalysis, 6th meeting of students and university professors, Zágráb, Horvátország, 2010. június 9., pp. 9., előadás 15. Németh, G., Csanádi, Zs., Bélafi-Bakó, K., Gubicza, L.: Effect of ionic liquids' properties on the enantioselective esterification of lactic acid, 8th European Symposium on Biochemical Engineering Sciences, 2010. szeptember 5-8., Bologna, Olaszország, pp. 193., poszter 16. Németh, G., Kavčič, S., Nemestóthy, N., Habulin, M., Knez, Z., Gubicza, L.: Asymmetric esterification of low carbon atom number carboxylic acids in ionic liquid as a co-solvent, Slovenski kemijski dnevi 2010, 2010. szeptember 23-24., Maribor, Szlovénia, pp. 132., előadás 17. Németh, G., Bányai, T., Nemestóthy, N., Findrik, Z., Gubicza, L.: Tejsav enantioszelektív észterezése Cyphos 104 ionos folyadékban, Műszaki Kémiai Napok, Veszprém, 2011. április 27-29., pp. 101-104., előadás 18. Gubicza, L., Németh, G., Csanádi, Zs., Bélafiné Bakó, K., Vrasalovic Presecki, A., Nemestóthy, N.: Enzimkatalitikus észterezés ionos folyadékokban, Műszaki Kémiai Napok, Veszprém, 2011. április 27-29., pp. 85-89., előadás 19. Németh, G., Bélafi-Bakó, K., Gubicza, L.: Enzymatic enantioselective esterification of lactic acid with low carbon chain alcohols in ionic liquids, 7th International Conference on Renewable Resources and Biorefineries, 2011. június 8-10., Bruges, Belgium, pp. 13., poszter 20. Németh, G., Habulin, M., Knez, Ž., Primožič, M., Gubicza, L.: Comparison of the enzymatic production of lactic acid ethyl ester in ionic liquid and supercritical CO 2, 2nd Conference on Applied Biocatalysis and 7th Meeting of Students and University Professors from Maribor and Zagreb, Maribor, Szlovénia, 2011. november 7-8., pp. 49., előadás 21. Németh, G., Findrik, Z., Vasić-Rački, D., Bélafi-Bakó, K., Gubicza, L.: Effect of ionic liquids on the enantioselectivity of Candida antarctica lipase B during lactic acid esterification, 9th International Conference on Protein Stabilization, 2012. május 2-4., Lisszabon, Portugália, pp. 43., poszter

117

Köszönetnyilvánítás Ezúton szeretnék köszönetet mondani mindazoknak, akik lehetővé tették, hogy ez a dolgozat elkészülhessen. Köszönetet mondok témavezetőmnek, Dr. Gubicza László egyetemi tanárnak, aki türelemmel törekedett arra, hogy az enzimes reakciók és ionos folyadékok terén szerzett szakmai tudását átadja, továbbá segítsen a tudományos életben történő akadályok leküzdésében, a külföldi utak zavartalan lebonyolításában. Hálával tartozom Bélafiné Dr. Bakó Katalin intézetigazgató egyetemi tanárnak, aki irányította munkámat, és megalapozta a biotechnológia iránti érdeklődésemet. Köszönet illeti Dr. Nemestóthy Nándor tudományos munkatársat, aki naprakészen segített a gyakorlati munkák kivitelezésében, és megosztotta velem szakmai tapasztalatait. Köszönet illeti még a Biomérnöki, Membrántechnológiai és Energetikai Kutatóintézet többi munkatársát (dr. Csanádi Zsófia, Lővitusz Éva, Zsargó Szilvia), Ph.D. hallgató társaimat (Varga Zsanett, Németh Dóra, Csrjési Petra, Szentgyörgyi Eszter, Boór András, Bányai Tamás, Tóth Gábor, Bakonyi Péter, Vajda Balázs), továbbá a Műszaki Kémiai Kutatóintézet és a Szerves Kémia Intézeti Tanszék munkatársait, akiknek a segítségére mindig számíthattam. Ezúton mondok köszönetet az anyagi támogatásért a TÁMOP-4.2.2-08/1/2008-0018 azonosító számú „Élhetőbb környezet, egészségesebb ember – Bioinnováció és zöld technológiák kutatása a Pannon Egyetemen”, „Az ionos folyadékok, mint zöld oldószerek alkalmazása biokatalitikus átalakításokban és szeparációkban” pályázatnak, az SI-13/2009 számú szlovén-magyar TéT pályázatnak, a HR-26/2008 horvát-magyar TéT pályázatnak, a „PEREGRINATIO I.” alapítványnak és az NTP-OKA-VIII-B) pályázatnak. Hálával tartozom továbbá családomnak, barátaimnak és páromnak, amiért mindvégig bíztattak és szeretetükkel, megértésükkel támogattak.

118

Függelék: 16. táblázat: A mérések során felhasznált ionos folyadékok tulajdonságai IL

Összegképlet

Cyphos 102 Cyphos 103 Cyphos 104 Cyphos 105

Tisztaság

Víztartalom

M

Sűrűség 25 °C3

Viszkozitás

Olvadáspont

(%)

(m/m%)

(g/mol)

on (g/cm )

(mPas) (°C)

(°C)

C32H68BrP

96,7

0,40

563,76

0,9546

2094 (25)

-61

C42H87O2P

94

2,54

655,11

0,8879

318,9 (25)

-43

C40H85O2P2

93,7

1,20

660,05

0,892

805,8 (28)

NA

C34H68N3P

96,5

1,03

549,9

0,8985

280,4

NA

Cyphos 106

C20H37O3PS

>99

0,32

388,55

szilárd (25)

45

Cyphos 109 Cyphos 110 Cyphos 163 Cyphos 166 Cyphos 201

C34H68F6NO4PS2

98,6

NA

764,0

1,0652

292,5 (25)

-72,4

C32H68F6P2

96,7

0,29

628,82

NA

427,7 (45)

39,74

C16H36BrP

95,2

0,90

339,33

-

50,34 (100)

91,1

C32H68BrP

98,2

0,59

563,76

0,9377

860,9 (40)

35,4

C44H85O3PS

98

NA

725,18

NA

NA

NA

22 °C-1,102 25 °C-1,07

n-Hexánban végzett kísérletek eredményei

58. ábra: A vizsgált paraméterek hatása az enantioszelektivitásra n-hexánban, CALB enzim használata mellett

119

59. ábra: A hőmérséklet és a kezdeti víztartalom hatása a hozamra n-hexánban, CALB enzim használata mellett

60. ábra: A hőmérséklet és az alk/TS arány hatása a hozamra n-hexánban, CALB enzim használata mellett

61. ábra: Az alk/TS arány és a kezdeti víztartalom hatása a hozamra n-hexánban, CALB enzim használata mellett

62. ábra: A hőmérséklet és a kezdeti víztartalom hatása az enantioszelektivitásra n-hexánban, CALB enzim használata mellett

63. ábra: A hőmérséklet és az alk/TS arány hatása az enantioszelektivitásra n-hexánban, CALB enzim használata mellett

64. ábra: Az alk/TS arány és kezdeti víztartalom hatása az enantioszelektivitásra n-hexánban, CALB enzim használata mellett

120

Oldószermentes (etanolfelesleg) közegben végzett kísérletek eredményei

65. ábra: Egyes paraméterek hatása az enantioszelektivitásra etanolfeleslegben, CALB enzim használata mellett

66. ábra: A hőmérséklet és a kezdeti víztartalom hatása a hozamra etanolfeleslegben, CALB enzim használata mellett

67. ábra: A hőmérséklet és az alk/TS arány hatása a hozamra etanolfeleslegben, CALB enzim használata mellett

68. ábra: Az alk/TS arány és a kezdeti víztartalom hatása a hozamra etanolfeleslegben, CALB enzim használata mellett

69. ábra: A hőmérséklet és a kezdeti víztartalom hatása az enantioszelektivitásra etanolfeleslegben, CALB enzim használata mellett

121

70. ábra: A hőmérséklet és az alk/TS arány hatása az enantioszelektivitásra etanolfeleslegben, CALB enzim használata mellett

71. ábra: Az alk/TS arány és a kezdeti víztartalom hatása az e.e. értékre etanolfeleslegben, CALB enzim használatával

Cyphos 103-mal végzett kísérletek eredményei 17. táblázat: A Cyphos 103-mal végzett kísérletek mérési pontjai és eredményei, CALB enzim használata mellett Minta száma

1

2

3

4

5

6

7

8

9

k1

k2

T (°C)

30

30

30

30

50

70

70

70

70

50

50

alk/TS arány

3

11

11

3

7

3

11

11

3

15

19

víztartalom (m/m%)

8

8

16

16

12

8

8

16

16

4

4

1h

1,2

3,9

3,3

1,0

1,6

5,6

4,5

3,2

5,4

6,3

3,3

3h

2,0

9,7

5,7

1,6

3,1

14,3

10,5

6,4

10,3

13,3

6,1

5h

2,9

15,2

7,6

2,2

4,2

21,7

14,8

9,5

16,8

20,5

10,2 20,7

hozam (%)

8,3

49,5

17,3

6,6

15,1

70,1

56,2

38,2

52,9

51,9

1h

2,2

29,7

24,0

2,3

10,0

1,8

3,1

1,6

0,2

29,7

29,0

3h

2,5

28,5

22,2

2,3

5,4

1,1

1,5

0,9

0,2

28,3

26,8

5h

0,9

27,5

20,9

0,5

3,8

0,2

1,0

0,3

0,1

25,9

22,1

24 h

0,2

21,9

19,5

0,5

0,5

0,1

0,3

0,3

0,0

13,4

12,6

24 h e.e. (%)

122

72. ábra: Egyes paraméterek hatása a hozamra Cyphos 103-ban, CALB enzim használata mellett

73. ábra: Egyes paraméterek hatása az e.e. értékre Cyphos 103-ban, CALB használatával

74. ábra: A hőmérséklet és a kezdeti víztartalom hatása a hozamra Cyphos 103-ban, CALB enzim használata mellett

75. ábra: A hőmérséklet és az alk/TS arány hatása a hozamra Cyphos 103-ban, CALB enzim használata mellett

76. ábra: Az alk/TS arány és a kezdeti víztartalom hatása a hozamra Cyphos 103-ban, CALB enzim használata mellett

77. ábra: A hőmérséklet és a kezdeti víztartalom hatása az enantioszelektivitásra Cyphos 103-ban, CALB enzim használata mellett

123

78. ábra: A hőmérséklet és az alk/TS arány hatása az enantioszelektivitásra Cyphos 103ban, CALB enzim használata mellett

79. ábra: Az alk/TS arány és a kezdeti víztartalom hatása az enantioszelektivitásra Cyphos 103-ban, CALB enzim használata mellett

Cyphos 105-tel végzett kísérletek eredményei 18. táblázat: A Cyphos 105-tel végzett kísérletek mérési pontjai és eredményei, CALB enzim használata mellett Minta száma

1

2

3

4

5

6

7

8

9

T (°C)

30

30

30

30

50

70

70

70

70

alk/TS arány

3

11

11

3

7

3

11

11

3

víztartalom (m/m%)

8

8

16

16

12

8

8

16

16

1h

1,4

1,1

0,8

1,8

1,0

2,0

3,9

3,3

2,5

3h

3,0

1,6

1,7

3,8

1,8

4,0

10,2

7,9

4,8

5h

3,2

2,0

2,2

4,9

2,6

5,9

13,6

9,7

5,6

24 h

10,9

4,8

5,2

17,9

5,6

14,0

46,3

37,7

19,8

1h

3,0

3,5

3,5

1,3

9,0

4,6

2,5

2,0

0,7

3h

2,2

1,4

1,0

0,6

3,3

2,6

0,3

1,5

0,5

5h

0,3

0,7

0,4

0,2

2,9

2,2

0,3

0,3

0,2

24 h

0,1

0,4

0,3

0,2

0,5

0,3

0,1

0,1

0,0

hozam (%)

e.e. (%)

124

80. ábra: Egyes paraméterek hatása a hozamra Cyphos 105-ben, CALB enzim használata mellett

81. ábra: Egyes paraméterek hatása az e.e. értékre Cyphos 105-ben, CALB használatával

82. ábra: A hőmérséklet és a kezdeti víztartalom hatása a hozamra Cyphos 105-ben, CALB enzim használata mellett

83. ábra: A hőmérséklet és az alk/TS arány hatása a hozamra Cyphos 105-ben, CALB enzim használata mellett

84. ábra: Az alk/TS arány és a kezdeti víztartalom hatása a hozamra Cyphos 105-ben, CALB enzim használata mellett

85. ábra: A hőmérséklet és a kezdeti víztartalom hatása az enantioszelektivitásra Cyphos 105-ben, CALB enzim használata mellett

125

86. ábra: A hőmérséklet és az alk/TS arány hatása az enantioszelektivitásra Cyphos 105ben, CALB enzim használata mellett

87. ábra: Az alk/TS arány és a kezdeti víztartalom hatása az enantioszelektivitásra Cyphos 105-ben, CALB enzim használata mellett

Cyphos 109-cel végzett kísérletek eredményei 19. táblázat: A Cyphos 109-cel végzett kísérletek mérési pontjai és eredményei, CALB enzim használata mellett Minta száma

1

2

3

4

5

6

7

8

9

T (°C)

30

30

30

30

50

70

70

70

70

alk/TS arány

3

11

11

3

7

3

11

11

3

víztartalom (m/m%)

8

8

16

16

12

8

8

16

16

1h

3,0

1,5

2,5

6,0

3,8

3,6

8,6

13,4

7,6

3h

6,8

3,6

4,6

15,4

10,0

7,9

38,6

35,0

21,5

50,0

42,8

27,3

hozam (%)

5h

7,9

5,6

4,5

21,1

14,7

12,6

24 h

42,9

18,4

16,6

78,0

57,7

43,7 121,4 110,9 91,8

1h

0,3

1,9

8,4

0,3

0,4

1,1

0,6

1,9

3,3

3h

0,3

1,5

3,7

0,3

0,3

0,6

0,3

1,4

0,9

5h

0,1

0,7

3,2

0,1

0,0

0,4

0,2

0,6

0,5

24 h

0,0

0,3

1,7

0,1

0,0

0,3

0,1

0,1

0,1

e.e. (%)

126

88. ábra: Egyes paraméterek hatása a hozamra Cyphos 109-ben, CALB enzim használata mellett

89. ábra: Egyes paraméterek hatása az e.e. értékre Cyphos 109-ben, CALB használatával

90. ábra: A hőmérséklet és a kezdeti víztartalom hatása a hozamra Cyphos 109-ben, CALB enzim használata mellett

91. ábra: A hőmérséklet és az alk/TS arány hatása a hozamra Cyphos 109-ben, CALB enzim használata mellett

92. ábra: Az alk/TS arány és a kezdeti víztartalom hatása a hozamra Cyphos 109-ben, CALB enzim használata mellett

93. ábra: A hőmérséklet és a kezdeti víztartalom hatása az enantioszelektivitásra Cyphos 109-ben, CALB enzim használata mellett

127

94. ábra: A hőmérséklet és az alk/TS arány hatása az enantioszelektivitásra Cyphos 109ben, CALB enzim használata mellett

95. ábra: Az alk/TS arány és a kezdeti víztartalom hatása az enantioszelektivitásra Cyphos 109-ben, CALB enzim használata mellett

Cyphos 110-zel végzett kísérletek eredményei 20. táblázat: A Cyphos 110-zel végzett kísérletek mérési pontjai és eredményei, CALB enzim használata mellett Minta száma

1

2

3

T (°C)

50

50

50

alk/TS arány

3

7

11

víztartalom (m/m%)

16

12

8

1h

6,1

2,0

1,8

3h

14,5

7,4

6,9

5h

21,5

13,7

9,0

24 h

68,2

44,0

39,1

1h

1,8

1,1

2,2

3h

0,8

0,9

1,2

5h

0,4

0,4

0,5

24 h

0,1

0,1

0,1

hozam (%)

e.e. (%)

128

Cyphos 104-gyel végzett kísérletek eredményei 21. táblázat: A Cyphos 104-gyel végzett kísérletek mérési pontjai és eredményei, CALB enzim használata mellett Minta száma

1

2

3

4

5

6

7

8

9

T (°C)

30

30

30

30

50

70

70

70

70

alk/TS arány

3

11

11

3

7

3

11

11

3

víztartalom (m/m%)

8

8

16

16

12

8

8

16

16

1h

0,5

4,4

3,4

0,6

2,2

5,4

6,7

2,5

4,2

3h

1,3

12,6

6,8

1,1

3,7

17,5

20,1

6,4

10,6

5h

2,0

17,8

9,6

1,3

4,9

22,4

33,9

9,0

15,7

24 h

5,9

55,5

17,5

4,9

14,5

66,0

73,4

67,8

50,9

1h

10,2

35,1

33,4

19,9

6,4

2,6

13,0

1,3

11,1

3h

5,7

34,6

31,8

9,8

2,7

2,5

2,4

1,3

4,3

5h

3,6

32,5

25,3

5,5

1,2

2,0

1,4

0,6

3,4

24 h e.e. (%) 50%-os hozamnál

1,5

22,0

16,5

1,1

0,3

1,2

0,5

0,2

7,3

1,8

1,0

0,4

hozam (%)

e.e. (%)

22,8

96. ábra: A kezdeti víztartalom optimális értéke Cyphos 104-ben, CALB enzim használata mellett

97. ábra: Az alk/TS arány optimális értéke Cyphos 104-ben, CALB enzim használata mellett

98. ábra: A hőmérséklet optimális értéke Cyphos 104-ben, CALB enzim használata mellett

129

100. ábra: Az optimális paraméter értékek mellett elérhető hozam Cyphos 104-ben, CALB enzim használata mellett

99. ábra: Az optimális paraméter értékek mellett elérhető e.e. érték Cyphos 104-ben, CALB enzim használata mellett

Szuperkritikus CO2-ban végzett kísérletek eredményei 22. táblázat: scCO2-ban végzett kísérleti pontok és eredményeik, CALB enzim használata mellett, ionos folyadék hozzáadás nélkül mérési pont

1

2

3

4

5

6

7

8

9

T (°C)

30

30

30

50

50

50

70

70

70

nyomás (bar)

100

100

100

200

200

200

300

300

300

1h

3,6

2,1

8,6

4,3

3,1

10,6

60,7

45,8

50,7

2h

5,4

3,5

8,3

6,7

5,3

14,5

75,6

70,5

75,6

3h

6,5

5,6

10,1

10,4

6,9

17,8

88,7

85,6

90,3

4h

6,7

7,8

11,7

13,3

9,5

18,5

95,8

108,7

105,6

hozam (%)

5h

7,8

9,2

13,2

15,6

13,5

20,8

105,3 120,4

124,3

24 h

15,2

16,4

16,1

23,6

22,4

23,8

123,4 128,7

131,0

1h

21,0

25,0

27,0

13,0

14,0

15,0

1,4

1,8

5,0

2h

11,4

24,3

24,5

12,6

13,3

13,7

1,0

1,2

4,4

3h

11,3

23,5

21,8

10,9

10,1

12,6

0,7

0,6

3,2

4h

10,6

20,8

21,0

10,0

9,7

8,3

0,3

0,1

2,0

5h

7,7

13,9

19,3

9,5

6,5

6,9

0,0

0,0

0,8

24 h

4,2

6,7

7,4

7,1

5,3

4,5

0,0

0,0

0,0

e.e. (%)

130

23. táblázat: scCO2/Cyphos 104 rendszerben végzett kísérleti pontok és eredményeik, CALB enzim használata mellett mérési pont

1

2

3

4

5

6

7

8

9

T (°C)

30

30

30

50

50

50

70

70

70

nyomás (bar)

100

100

100

200

200

200

300

300

300

1h

17,9

20,8

22,0

80,5

22,4

42,5

56,0

62,8

42,3

2h

35,1

32,0

26,1

87,3

35,6

55,7

62,8

87,0

61,5

3h

54,3

43,6

30,0

97,2

48,9

63,6

66,7

93,9

71,1

4h

73,4

49,8

36,9

105,3

56,3

66,4

83,6

100,5

81,2

5h

80,3

60,5

42,4

111,2

63,4

70,2

93,2

105,2

85,6

24 h

96,6

118,9

81,4

132,2 115,5 100,6 103,3 122,0

101,5

1h

22,0

28,2

16,5

15,3

19,7

22,0

0,6

11,0

12,0

2h

21,0

24,2

15,5

11,2

12,5

17,4

0,3

10,1

7,8

3h

20,6

23,7

14,0

9,2

11,9

16,1

0,0

8,5

6,6

4h

19,9

20,5

12,1

6,3

11,1

15,9

0,0

6,7

6,1

5h

16,4

16,4

10,3

4,3

9,2

10,5

0,0

5,6

5

24 h

14,3

5,3

6,4

0,9

3,1

8,3

0,0

4,0

2,2

hozam (%)

e.e. (%)

Az újbóli reakcióba vitel eredményei 24. táblázat: Az 50%-os hozamnál történő újbóli reakcióba vitel kísérleteinek eredményei Cyphos 104-ben, CALB enzim használata mellett hozam (%)

0

1

2

3

4

0,5 h

3,7

3,6

3,7

3

4,4

1h

7,3

7,5

7,3

7,6

7,8

3h

17,4

18,6

17,4

18,7

16,3

5h

23,9

27,8

26,5

28,8

27,3

15 h

50,0

50,0

50,0

50,0

50,0

0,5 h

39,3

59,4

70,9

77,1

82,5

1h

38,6

57,8

69,0

75,0

80,3

3h

38,2

57,7

68,8

74,8

80,1

5h

33,9

55,9

67,7

74,0

79,5

15 h

29,8

52,4

65,6

72,4

78,2

e.e. (%)

131

25. táblázat: A 30%-os hozamnál történő újbóli reakcióba vitel kísérleteinek eredményei Cyphos 104ben, CALB enzim használata mellett hozam (%)

0

1

2

3

4

0,5 h

3,7

3,7

3,8

3,2

4,6

1h

7,3

7,6

7,5

8,0

8,2

3h

17,4

18,8

18,2

18,6

16,5

5h

23,9

28,3

28,2

28,5

28,3

7,5 h

30,0

30,0

30,0

30,0

30,0

0,5 h

39,3

61,8

71,9

77,8

83,3

1h

38,6

60,2

70,0

75,8

81,1

3h

38,2

60,0

69,8

75,6

80,9

5h

33,9

57,5

68,5

74,9

80,4

7,5 h

33,0

55,2

66,8

73,3

79,0

e.e. (%)

Az enzim újrahasználatának eredményei 26. táblázat: Az enzim újrahasználatának eredményei az enantioszelektivitásra Cyphos 104 ionos folyadékban és a nélkül, CALB enzim használata mellett

Ionos folyadék nélkül

e.e. (%)

0

1

2

3

4

5

1h

38,4

35,7

35,5

38,6

33,0

26,6

3h

38,3

32,7

30,1

31,5

31,2

25,7

5h

34,4

31,6

29,8

30,8

30,7

24,9

24 h

26,0

24,7

19,2

22,4

26,1

20,0

1h

42,2

28,8

28,2

22,4

19,0

12,8

3h

39,7

25,2

20,6

23,0

15,1

12,4

5h

38,3

24,0

20,1

21,6

14,5

10,4

24 h

33,2

23,8

18,4

18,2

13,8

5,7

e.e. (%) Cyphos 104ben

132