ENZIMKATALIZÁLT RESZOLVÁLÁS SZUPERKRITIKUS SZÉN-DIOXIDBAN

BUDAPESTI MŰSZAKI ÉS GAZDASÁGTUDOMÁNYI EGYETEM

ENZIMKATALIZÁLT RESZOLVÁLÁS SZUPERKRITIKUS SZÉN-DIOXIDBAN

Ph. D. értekezés

Készítette:

Utczás Margita

Témavezető: Dr. Székely Edit Konzulens: Dr. Simándi Béla

Kémiai és Környezeti Folyamatmérnöki Tanszék

2012

Köszönetnyilvánítás

Kiemelt köszönettel tartozom témavezetőmnek, Dr. Székely Editnek és konzulensemnek, Dr. Simándi Bélának szakmai segítségükért, támogatásukért és végtelen türelmükért. Köszönet illeti az Országos Tudományos Kutatási Alapprogramokat (OTKA 72861) a kutatás anyagi támogatásáért és Társadalmi Megújulás Operatív Programot (TÁMOP4.2.1/B-09/1/KMR-2010-0002) a doktorjelölti időszakban az ösztöndíjam finanszírozásáért. Köszönettel tartozom Dr. Szőllősy Áronnak az NMR, valamint Dr. Vida Lászlónak a GC-MS spektrumok felvételéért. Külön köszönöm Dr. Fülöp Ferencnek, Dr. Forró Enikőnek és Dr. Tasnádi Gábornak az előállított kiindulási anyagokat és a GC analízisek elvégzésében nyújtott segítséget, valamint a kutatómunka során adott hasznos tanácsokat. Köszönöm Dr. Kemény Sándornak a statisztikai kiértékelésekben, valamint Haragovics Máténak a számítógépes munkában nyújtott segítséget és hasznos ötleteket. Köszönöm Alekszi Norbertnek, Monek Évának, Szeleczky Zsoltnak és Szécsényi Ágnesnek a kísérleti munkában nyújtott segítséget. Köszönet illeti Benkéné Lődy Ilonát és Lantos Bélát, mivel technikai problémák esetén mindig segítőkészen a rendelkezésemre álltak, továbbá a Félüzemi Laboratórium többi munkatársát, akik segítették munkámat. Köszönöm továbbá Bánsághi Györgynek, Lévai Györgynek, Mucsina Gábornak, Tokai Zsoltnak és Varga Dánielnek a laboratóriumi munka során nyújtott számtalan segítséget és a kellemes munkakörnyezet biztosítását. Szeretettel ajánlom doktori értekezésemet családomnak, köszönöm hosszú éveken át tartó támogatásukat, segítségüket és megértésüket.

NYILATKOZAT

Alulírott Utczás Margita kijelentem, hogy ezt a doktori értekezést magam készítettem és abban csak a megadott forrásokat használtam fel. Minden olyan részt, amelyet szó szerint, vagy azonos tartalomban, de átfogalmazva más forrásból átvettem, egyértelműen, a forrás megadásával megjelöltem.

Budapest, 2012. november 26.

……………………………..

Jelölésjegyzék Rövidítések α γ κ ρ

optikai forgatóképesség sztöchiometriai együttható reakciósebességi együttható sűrűség

∆G # ∆H # ∆S # a A b c d e E ee g K k KM m m& M MR MT n n& O p P Prod R R r Re s S T t TOF TON

moláris aktiválási szabadenergia moláris aktiválási entalpia moláris aktiválási entrópia illesztett függvény konstans specifikus aktivitás illesztett függvény konstans koncentráció illesztett függvény konstans enzim enantioszelektivitás enantiomertisztaság illesztett függvény konstans egyesített együttható reakciósebességi állandó Michaelis-konstans tömeg tömegáram molekula tömeg mól arány melléktermék arány anyagmennyiség móláram oldhatóság termék nyomás produktivitás (R) enantiomer egyetemes gázállandó reakciósebesség Reynolds-szám szubsztrát (S) enantiomer hőmérséklet idő turnover frequency turnover number

[°] [-] [1/min] [g/ml] [kJ/mol] [kJ/mol] [kJ/mol] [mmol átalakított szubsztrát · g enzim-1 · h-1] [mmol/dm3]

[-] [%] [dm3· mmol-1 · min-1] [dm3· mmol-1 · min-1] [mmol/dm3] [g] [g/min] [g/mol] [-] [mol/mol] [mmol] [mmol/min] [mmol anyag/g oldószer] [MPa] [µmol keletkezett termék ·g enzim-1 · min-1] [J· mol-1 · K-1] [mmol· (dm3)-1 · min-1] [-]

[°C] [s], [min], [h] [mmol átalakított szubsztrát · g enzim-1 · min-1] [mmol átalakított szubsztrát · g enzim-1 · min-1]

w X Y

vízkoncentráció konverzió hozam

[g anyag/g víz] [%] [%]

Indexek (–) (+) (±) 0 I II e e–s elm eq es f holt hp kat krit max min p r re rel s sz tart

negatív irányba forgató enantiomer pozitív irányba forgató enantiomer racém keverék kezdeti első reakciólépés második reakciólépés enzim enzim – szubsztrát kapcsolódás elméleti egyensúlyi enzim – szubsztrát komplex folyamatos holt hármaspont katalizátor kritikus maximális minimális termék reakció reaktor relatív szubsztrát szakaszos tartózkodási

Vegyületek CAL-B CCH CCHAc CHD CHDAc CHDAc2 CO2 LAK MeOH PE

Candida antarctica lipáz B transz-2-hidroxiciklohexánkarbolnitril transz-2-acetoxiciklohexánkarbolnitril transz-1,2-ciklohexándiol transz-2-acetoxiciklohexán-1-ol transz-1,2-diacetoxiciklohexán szén-dioxid 4-fenilazetidin-2-on metanol 1-feniletanol

PE2 PEAc Phe VA

feniletiléter dimer (1-feniletil)-acetát fenilalanin vinil-acetát

Tartalomjegyzék Bevezetés .................................................................................................................................... 4 1

Irodalmi összefoglaló .......................................................................................................... 5 1.1

Kiralitás ........................................................................................................................ 5

1.1.1 1.2

Enantiomertiszta vegyületek fontossága a gyógyszerkutatásban.......................... 7

Tiszta enantiomerek előállítása .................................................................................... 8

1.2.1

Enantiomertiszta kiindulási anyagok .................................................................... 9

1.2.2

Eltávolítható királis segédanyagok ....................................................................... 9

1.2.3

Enantioszelektív kémiai katalízis .......................................................................... 9

1.2.4

Reszolválási technikák ........................................................................................ 10

1.2.4.1

Diasztereomersó-képzés .............................................................................. 10

1.2.4.2

Konglomerátumképzés ................................................................................ 11

1.2.4.3

Kromatográfiás módszerek .......................................................................... 11

1.2.4.4

Enzimes reszolválás ..................................................................................... 12 1.2.4.4.1 Enzimkatalízis ............................................................................ 13 1.2.4.4.2 Michaelis-Menten kinetika és az enzimreakciók jellemzése ..... 14 1.2.4.4.3 Lipázok ....................................................................................... 19 1.2.4.4.3.1 Candida antarctica lipáz B ....................................................... 21 1.2.4.4.4 Enzimkatalizált kinetikus reszolválás ........................................ 22 1.2.4.4.5 Dinamikus kinetikus reszolválás ................................................ 23

1.3

A szuperkritikus fluidumok........................................................................................ 24

1.3.1 1.4

A szuperkritikus szén-dioxid .............................................................................. 26

Enzimek viselkedése szuperkritikus széndioxidban .................................................. 28

1.4.1

Hőmérséklet, nyomás hatás................................................................................. 29

1.4.2

Vízaktivitás, víztartalom scCO2-ban ................................................................... 31

1.4.3

Enzimes reakciók scCO2-ban .............................................................................. 32

1.5

A vizsgált vegyületek ................................................................................................. 36

1.5.1

A 4-fenilazetidin-2-on ......................................................................................... 36 1

2

1.5.2

A transz-2-hidroxiciklohexánkarbonitril ............................................................ 37

1.5.3

A transz-1,2-ciklohexándiol................................................................................ 37

1.5.4

Az 1-feniletanol................................................................................................... 39

Kísérleti rész...................................................................................................................... 40 2.1

Anyagok és módszerek .............................................................................................. 40

2.1.1

Felhasznált anyagok ............................................................................................ 40

2.1.2

Szakaszos reaktor ................................................................................................ 41

2.1.3

Folyamatos reaktor .............................................................................................. 42

2.1.4

Analitikai módszerek .......................................................................................... 43

2.1.4.1

Királis állófázisú gázkromatográfia (GC) .................................................... 43 2.1.4.1.1 4-Fenilazetidin-2-on ................................................................... 43 2.1.4.1.2 Fenilalanin .................................................................................. 44 2.1.4.1.3 Transz-2-hidroxiciklohexánkarbonitril

és

transz-2-

acetoxiciklohexánkarbonitril (CCHAc) ....................................................... 44 2.1.4.1.4 Transz-1,2-ciklohexándiol, transz-1-acetoxiciklohexán-2-ol és transz-1,2- diacetoxiciklohexán ................................................................... 44 2.1.4.1.5 1-Feniletanol, (1-feniletil)-acetát (PEAc) .................................. 44 2.1.4.2

NMR ............................................................................................................ 45

2.1.4.3

Optikai forgatóképesség mérés .................................................................... 45

2.1.4.4

Víztartalom mérés ........................................................................................ 45

2.1.4.5

Opálosodási pont mérés ............................................................................... 45

2.1.5 2.2

Számítási módszerek ........................................................................................... 46

Eredmények értékelése............................................................................................... 49

2.2.1

A 4-fenilazetidin-2-on gyűrűnyitási reakciója .................................................... 49

2.2.2

A transz-2-hidroxiciklohexánkarbonitril acilezési reakciója .............................. 54

2.2.3

A transz-1,2-ciklohexándiol konszekutív acilezési reakciója ............................. 64

2.2.4

Az 1-feniletanol észterképzési reakciója............................................................. 74

2.2.4.1

Az (S)-1-feniletanol racemizálása szakaszos reaktorban ............................. 74

2.2.4.2

Az 1-feniletanol dinamikus-kinetikus reszolválása ..................................... 77 2

3

Összefoglalás ..................................................................................................................... 79

4

Irodalomjegyzék ................................................................................................................ 81

5

Függelék ............................................................................................................................ 99 5.1

Optimum receptek ...................................................................................................... 99

5.1.1

Enantiomertiszta (S)-4-fenilazetidin-2-on és (R)-β-fenilalanin előállítása szakaszos reaktorban ........................................................................................... 99

5.1.2

Enantiomertiszta

(1R,2S)-hidroxiciklohexánkarbonitril

és

(1S,2R)-

acetoxiciklohexán-karbonitril előállítása szakaszos reaktorban ......................... 99 5.1.3

Enantiomertiszta

(1S,2S)-1-acetoxiciklohexán-2-ol

és

(1R,2R)-1,2-

diacetoxiciklohexán előállítása szakaszos reaktorban ...................................... 100 5.1.4

Enantiomertiszta

(1S,2S)-1-acetoxiciklohexán-2-ol

és

(1R,2R)-1,2-

diacetoxiciklohexán előállítása folyamatos reaktorban .................................... 100 5.1.5

Enantiomertiszta

(S)-1-feniletanol

előállítása

dinamikus-kinetikus

reszolválással .................................................................................................... 101 5.2

Az értekezés témájában megjelent fontosabb publikációk ...................................... 104

3

Bevezetés

Napjainkban a gyógyszeripar egyre nagyobb hangsúlyt fektet a környezetbarát technológiák alkalmazására. A szerves oldószereknek bizonyos esetekben alternatívái lehetnek a szuperkritikus oldószerek, közülük is a legelterjedtebb a szuperkritikus széndioxid. Alacsony kritikus hőmérsékletének köszönhetően különösen alkalmas hőérzékeny és biológiailag aktív vegyületek esetében. A gyógyszerhatóanyagok és intermedier vegyületeik jelentős része királis vegyület. A hatóanyag két enantiomere eltérő biológiai aktivitással és tulajdonságokkal rendelkezhet, így a hatósági előírásoknak megfelelően a gyógyszerkészítményekben javasolt csak a hasznos enantiomer alkalmazása, a racém formával szemben. Az enantiomerek elválasztására számos fizikai (analitikai), kémiai és biokémiai módszer áll rendelkezésre. Az enzimes reszolválás segítségével lehetővé vált az enantiomertiszta vegyületek gyors, hatékony és környezetbarát előállítása. Az enzimes biokatalízist együtt alkalmazva a szuperkritikus szén-dioxidos reakcióközeggel megvalósítható lehet a szubsztrát-termék-enzim keverék elválasztása is, egymástól eltérő oldhatóságuknak köszönhetően. Így egy teljesen „zöld” technológiát hozhatunk létre, amely optimális esetben két enantiomertiszta vegyület előállítására és elválasztására alkalmas. Doktori munkám során négy különböző királis, a gyógyszeripar szempontjából ígéretes és hasznos vegyület enzimkatalizált reakcióját tanulmányoztam szuperkritikus szén-dioxidos közegben. A kísérletek során részletesen vizsgáltam a hőmérséklet, a nyomás, a vízkoncentráció és a szubsztrát koncentráció hatását a reakciósebességre, az egyensúlyi konverzióra és

a reakció

enantioszelektivitására.

Két

vizsgált

vegyület

esetében

meghatároztam a látszólagos váltásszámot („turnover number”) és az enzim kinetikai paramétereket (Michaelis-konstans és maximális kezdeti reakciósebesség). Az egyes vegyületeknél a kívánt eredmény érdekében a reszolválást különböző módszerekkel valósítottam meg, alkalmaztam enzimes kinetikus reszolválást szakaszos illetve folyamatos rendszerben, valamint kémiai és biokatalizátorok kombinálásával dinamikuskinetikus reszolválást. Ahol lehetőség nyílt rá, abban az esetben a termékelválasztást is kidolgoztam.

4

1 1.1

Irodalmi összefoglaló Kiralitás Az első kiralitáshoz kapcsolódó fizikai jelenséget, az optikai aktivitást, 1815-ben J. B.

Biot fedezte fel

[1]

. Megfigyelte, hogy amikor egy lineárisan polarizált fénynyaláb

keresztülhalad egy optikailag aktív vegyületen, a sík polarizációja jobbra vagy balra elfordul. Megállapodás szerint a balra forgató vegyületek (-), a jobbra forgatók (+) jelelölést kapnak. Louis Pasteur 1848-ban újrakristályosította a borkősav nátrium-ammónium sóját és a tartarát kristályok tanulmányozása közben megfigyelte, hogy két tükörképi vegyület képeződött, amelyeket szétválogatás után „jobbkezes” és „balkezes” kristályokként jellemzett [2] (1. ábra).

1. ábra Enantiomerek megjelenési formái a kristály szerkezetben Enantiomorf a) kvarc és b) nátrium ammónium tartarát kristályok [3]

Az enantiomerek eltolással és forgatással egymással fedésbe nem hozható tükörképi izomerek. Léteznek még további elnevezéseik; mint enantiomorfok, antipodok. Az enantiomerek minden vektoriális tulajdonságukban eltérnek, különbözik a kölcsönhatásuk a sík-polarizált fénnyel. Ha a sík-polarizált fény keresztülhalad egy tiszta enantiomer oldatán, akkor a fény síkja elfordul. A királis vegyületek ezen tulajdonságát optikai aktivitásnak, míg a forgatás mértékét optikai forgatóképességnek nevezzük, amelyet polariméterrel mérhetünk. Két enantiomer mindig ellentétes optikai aktivitást mutat, azonban a forgatás mértéke megegyezik, csak az iránya más. Enantiomer pár 1:1 arányú keverékének (racém elegy) optikai forgatása 0, mivel kioltják egymást. Az optikai izoméria, a kiralitás felismerése jelentősen megváltoztatta az addigi kémiai szemléletet. A királis és kiralitás elnevezés W. H. Thompson (Lord Kelvin) nevéhez fűződik, a görög „cheir” szóból, amelynek jelentése kéz, amely valóban az egyik legáltalánosabb természetes tükörképi „képződmény” [4]. 5

Az atomok molekulává szerveződését szerkezetnek nevezzük, míg az atomok térbeli elhelyezkedését

a konfiguráció

adja meg.

A szubsztituensek a kiralitáselemekre

(kiralitáscentrum, kiralitás sík, kiralitás tengely) vonatkozó valódi térbeli elhelyezkedését az abszolút konfiguráció határozza meg. A királis molekulák abszolút konfigurációjának nevezéktani problémáját Cahn, Ingold és Prelog oldotta meg, kidolgoztak egy olyan nomenklatúrát, amelyben a korábbi D és L jelöléseket

[5]

R és S jelölésre változtatták (a latin

„rectus” és „sinister” szavakból) az általuk megállapított szekvencia szabályoknak (CIPszabály) megfelelően

[6]

. A R/S jelölésrendszer hiányossága, hogy csak az egyszeres kötést

tartalmazó kiralitás centrumokra érvényes. A kettős kötést tartalmazókra a cisz/transz elnevezés nem elég szabatos, az E/Z (E: a német „entgegen” szóból ered, amelynek jelentése „ellenkező”, Z: a német „zusammen” szóból ered, amelynek jelentése „együtt”) rendszer a jelenleg preferált nomenklatúra rendszer (2. ábra).

Z

E 2. ábra Sztereoizomer nevezéktan

(A) az optikai aktivitásnak megfelelően a polarizáló lencsén áthaladt inkoherens fény keresztülmegy az enantiomer mintát tartalmazó polarimétercsövön. Az enantiomer által létrejött elfordulás szögét egy analizátorral (egy forgatható polarizáló lencse) összekapcsolt detektorral határozzák meg. (B) a D/L (Fischer-féle) nevezéktan glicerinaldehidre. (C és D) A CIP-szabály alapján az R/S és E/Z-nevezéktan [7].

6

A kémikusok körében a legfontosabb és legtöbbet alkalmazott, valamint az IUPAC által is javasolt nevezéktan az R/S rendszer, így én is ezt használtam a dolgozatomban. A továbbiakban bemutatom az enantiomerek között tapasztalható biológiai és farmakokinetikai különbségeket, valamint ezek jelentőségét és hatását az emberi szervezetre.

1.1.1

Enantiomertiszta vegyületek fontossága a gyógyszerkutatásban Egy gyógyszermolekula potenciális hatékonysága alapvetően a funkciós alegység

típusától és természetétől, valamint ezen csoportok térbeli elhelyezkedésétől függ. Az emberi szervezet aszimmetrikus vegyületekből épül fel, például a DNS jobb-sodrású hélixet képez D(vagy R-) konfigurációjú 2-dezoxi-ribóz szénhidrát monomerekből. A fehérje és gyógyszerhatóanyag metabolizmusban részt vevő enzimek, a szérum fehérjék és a transzport fehérjék pedig az akirális glicin kivételével L- (vagy (S)-, kivéve a cisztein, amely (R)-) aminosavakból épülnek fel. Az élő szervezetben egy racém vegyület egyik enantiomerének preferált kölcsönhatása egy királis makromolekulával jelentősen befolyásolja annak farmakokinetikai és farmakodinamikai hatását

[8-11]

[8, 9, 10, 11]

.

Ezen különbségek következtében egy gyógyszer hatóanyagban a különböző enantiomer jellegen alapuló eltérő biológiai aktivitások jelenléte a következőket okozhatja: •

kedvezőtlen mellékhatások,

•

az egyik enantiomer által okozott mérgezés,

•

jelentős különbségek az abszorbcióban, aktív transzportban, stb.,

•

nagy eltérések a szérum fehérjék kötődésében,

•

metabolizmus foka különböző,

•

toxikus anyaggá átalakulás (helytelen metabolizmus) és

•

más gyógyszer metabolizmusának megzavarása [12]. A királis vegyületeknek számtalan alkalmazási formája ismert, de egyik sem olyan

fontos, mint amelyek különböző biológiai célt szolgálnak. A biológiai receptorok királis természete teszi a királis ligandumokat a gyógyszerek és növényvédőszerek hatóanyagává. Emiatt ezen komponensek előállítására szolgáló módszerek fejlesztése fontos kihívás. Az 1954-es Contergan-botrány után egyre gyakrabban csak a kívánt hatással bíró hatóanyag enantiomert alkalmazták a gyógyszerkészítményekben. Bebizonyosodott ugyanis, hogy a Contergan hatóanyagának, a talidomidnak az egyik enantiomere rendelkezik a megfelelő gyógyhatás eléréséhez szükséges biológiai aktivitással, míg a másik teljesen eltérő hatásmechanizmussal rendelkezik és terhes nőknél súlyosan károsítja a magzatot. Ennek következtében több tízezer csecsemő jött világra súlyos születési rendellenességgel. 7

Amennyiben csak a hatásos enantiomer lett volna jelen a gyógyszerben, akkor elkerülhető lett volna ez a katasztrófa [13]. Az utóbbi években a fő irányvonal a királis gyógyszerhatóanyagok terén a tiszta enantiomerek alkalmazása. Míg a világpiacon 1996-ban 27 %, addig 2002-ben már 39 %-ban alkalmazták a készítményekben csak a hatásos enantiomert, és ez az arány napjainkban csak egyre nő [14]. Az Egyesült Államokban az FDA (Food and Drug Administration) 1992-ben közzétett útmutatója alapján a gyógyszerekben csak a terápiás hatással bíró enantiomerek kerülhetnek felhasználásra

és

külön-külön

vizsgálni

kell

az

egyes

gyógyszer

enantiomerek

farmakokinetikai és metabolikus útjait. Továbbá csak megalapozott indokkal lehet racém formában alkalmazni a királis gyógyszerhatóanyagokat [15]. Az enantiomerek biológiai hatása egymáshoz képest a következők szerint alakulhat: • egyenértékű enantiomerek (ekvipotenciális) (pl. ciklofoszfamid, flecainid); • az egyik enantiomer rendelkezik aktivitással (pl. nem szteroid gyulladáscsökkentők, βblokkolók); • mindkét enantiomer aktív, különböző mértékű, de egyforma terápiás vagy mérgező hatással (pl. warfarin); • mindkét enantiomer aktív, jelentősen eltérő terápiás vagy mérgező hatással (pl. verpamil)

[16-18] [16, 17, 18]

.

Ezeknek a kettős vagy ellentétes hatásoknak a kiküszöbölése érdekében rendkívül fontos a tiszta enantiomerek előállítása, és ezen felül az adott vegyület illetve reakció számára a legalkalmasabb módszer megtalálása.

1.2

Tiszta enantiomerek előállítása Enantiomertiszta vegyületek előállítására számos megvalósítási mód adódik; élhetünk a

természet nyújtotta enantiomertiszta vegyületek lehetőségeinek kiaknázásával, akirális (prokirális) vegyületek szintézisével, valamint a racém elegyből az egyes enantiomerek elválasztásával. A teljesség igénye nélkül a következő eljárások közül válogathatunk: aszimmetrikus katalízis reszolválás

[20]

[19]

, fermentatív királis szintézis, enzimes (dinamikus) kinetikus

, diasztereomer-képzés

[21]

, kromatográfiás

valamint királis membrán szeparációs technológiák extrakció

[25]

[24]

[22, 23]

, és elektroforézis módszerek,

és enantioszelektív folyadék-folyadék

. Mindegyik lehetőségnek megvannak a maga előnyei és hátrányai, így a

szakemberek feladata az adott vegyülethez a legmegfelelőbb módszert kiválasztani a megvalósíthatósági, a gazdaságossági, és a környezetvédelmi szempontokat is figyelembe véve. 8

1.2.1

Enantiomertiszta kiindulási anyagok A tiszta enantiomerek előállításának legkézenfekvőbb módja a természetben előforduló

enantiomertiszta vegyületek (aminosavak, cukrok, terpének) kinyerése a „királis készletből”, majd azok továbbalakítása. Ez az eljárás akkor alkalmazható jól, ha a kiindulási anyag nem drága és könnyen hozzáférhető, valamint amikor a szintézis sorozat a természetben fellelhető vegyülettől a célkomponensig direkt és egyszerű. A gyakorlatban sokszor a kívánatos, megfelelő sztereokémiájú termékhez csak sok reakciólépésen át juthatunk el.

1.2.2

Eltávolítható királis segédanyagok Aszimmetrikus szintézisben, ha egy akirális molekulát sztereoszelektíven királis

molekulává akarunk alakítani egy akirális reagenssel, akkor előtte az egyik reaktánst királissá kell alakítani. Ez úgy érhető el, ha egy olyan királis molekulát kapcsolunk a szubsztráthoz, amelyet később eltávolíthatunk és sértetlenül visszanyerhetünk az aszimmetrikus szintézist követően. Az ilyen királis molekulákat királis segédanyagoknak nevezzük. Az aszimmetrikus szintézis sztereoszelektivitását, az újonnan kialakult sztereocentrumon keresztül, a királis segédanyag sztereoszelektivitása határozza meg. A segédanyag eltávolítása után az egyik enantiomerben dúsabb terméket kapunk. Királis segédanyagként számos királis vegyületet alkalmaznak, de legtöbbjük a természetben előforduló „királis készlet” származéka (általában aminosav származékok). A királis segédanyagok alkalmazásának előnye a kiszámíthatóság és a megbízhatóság. A hátrányuk, hogy a királis segédanyagot a reakció sztöchiometriájának megfelelő, mólekvivalens mennyiségben kell alkalmazni, valamint a hozzákapcsolás és a leválasztás minimum további két lépéssel növelik a reakciósorozatot. Ennek következtében ipari léptékű megvalósítása nehézkes lehet, valamint kritizálható gyenge „atom hasznosítása” miatt, mivel új sztereocentrumok kialakításához mólekvivalens mennyiségben alkalmazzák. Bizonyos esetekben a királis segédanyagok visszanyerése és újrahasznosítása problémás lehet. Talán ez az oka, hogy napjainkra a korábbi évekhez képest csökkent ennek az enantiomer előállítási módszernek a jelentősége [26].

1.2.3

Enantioszelektív kémiai katalízis A királis segédanyag alkalmazásának legtöbb hátránya áthidalható enantioszelektív

katalízissel.

A

sztöchiometrikusnál

kisebb

mennyiségben

alkalmazzák

a

termék

sztereokémiáját szabályozó királis katalizátort. Enantioszelektív katalízissel az új kötés kialakulásának

sztereokémiai

kimenetele

meghatározott

és

egy

új

sztereocentrum

kialakulásához vezet. Továbbá egy katalizátor molekula ideális esetben akár több millió 9

átalakítást képes elvégezni

[27]

. A nagy átalakító-képességgel („turnover”-rel) rendelkező

katalizátorok esetében, még a viszonylag magas áruk ellenére is, gazdaságosan előállíthatók az enantiomertiszta termékek. Bár az enantioszelektív katalizátorok természetes prototípusai az enzimek, a szintetikus katalizátorok fejlesztése terén jelentős előrelépés történt. A megfelelő katalizátorok már elérhetők számos különböző szintetikus átalakításhoz. Sok esetben ezek a katalizátorok bizonyos mértékű szubsztrát függetlenséget mutatatnak, ennek köszönhetően meglehetősen hasznos és kiszámítható eszközei lehetnek enantioszelektív szintéziseknek.

1.2.4

Reszolválási technikák Reszolválási technikák közé azokat az eljárásokat soroljuk, amelyek racém elegyből

indulnak ki. Ezek ipari méretben széleskörűen használt módszerek. A legfontosabb megoldási lehetőségek: klasszikus reszolválás diasztereomersó-képzésen keresztül, konglomerátumképzők kristályosítása, kromatográfiás elválasztás és az enzimes reszolválás. Természetesen a reszolválási módszerek alkalmazhatók nem ekvimoláris összetételű keverékekre is, amelyek gyakran keletkeznek aszimmetrikus szintézisek esetén. A gyógyszeriparban leggyakrabban, kb. 60 %-ban valamely reszolválási módszerrel állítják elő az enantiomertiszta királis komponenseket. A vezető gyógyszergyárak az enantiomerek elválasztására a reszolválási módszerek közül az esetek jelentős részében sztereoszelektív sóképzést követő kristályosítást vagy kromatográfiás módszereket alkalmaznak

[28]

. A hozam javítása érdekében megoldást

jelenthet a dinamikus-kinetikus reszolválás.

1.2.4.1 Diasztereomersó-képzés A királis reszolváló ágens tiszta enantiomerét a racém szubsztráthoz adva sóképzéssel az enantiomerek különböző fizikai-kémiai tulajdonságú diasztereomer sókká alakíthatók, amelyek irányítottan és a megfelelő reszolváló ágens adagolásával kristályosítással elválaszthatók. Reszolváló ágensként leggyakrabban természetben előforduló királis savakat vagy bázisokat (borkősav, kinin) használnak, manapság ez a kör kibővült további reagensekkel. Miután a sav vagy bázis felszabadult, a tiszta enantiomer visszanyerhető. A klasszikus reszolválás továbbra is az egyik leggyakrabban alkalmazott technika az ipari léptékű reszolválás terén. Egy további idekapcsolódó módszer a királis származékképző ágenssel kialakított kovalens diasztereomer származékok, amelyek kristályosítással, kromatográfiás eljárással vagy más módon elválaszthatók egymástól [29].

10

1.2.4.2 Konglomerátumképzés A racém vegyületek több módon kristályosíthatók. Többségük mindkét enantiomert egyforma mennyiségben, szabályos rendben tartalmazza a kristályrácsban. Tehát bármely kristály 1:1 arányban tartalmazza a kristályt alkotó két enantiomert. A racém keverékek kis százaléka konglomerátumként kristályosodik, vagyis két enantiomorf kristályt képeznek, amelyek mindegyike csak az egyik enantiomert tartalmazza, így a kristályok nagyon nagy enantiomertisztaságot mutatnak. A legrégebbi enantiomerek elválasztására alkalmas módszer a makroszkópikusan eltérő szerkezetű enantiomer konglomerátumok, tükörképi kristályok manuális szétválogatása. Ez a módszer nyilvánvalóan nem alkalmas ipari méretben tiszta enantiomerek előállítására (habár terveztek már néhány érdekes szétválogató berendezést 31]

[30,

). A nagyüzemi reszolválási eljárások alapja az indukált kristályosítás. Az eljárás során a

konglomerátumképző vegyületek racém keverékének túltelített oldatát ciklikusan beoltják felváltva az egyes enantiomorf kristályokkal, így elősegítve az egyes enantiomerek kristályosodását. A folyamat lényege, hogy az oltókristály felületén megkezdődik az egyik enantiomer kikristályosodása és ezzel egyidőben a másik enantiomer elkezd feleslegbe kerülni az oldatban. Ezután további racém összetételű anyagot adnak az anyalúghoz, majd a feleslegbe került tiszta enantiomerrel oltják be az oldatot és ezzel elősegítik a másik enantiomer kikristályosodását

[32]

. Az iparban gyakran csak az egyik enantiomer

kikristályosítása a cél, kinetikai kontroll segítségével csak a kívánt enantiomerből álló enantiomorf forma képződik. Fontos, hogy az a folyamat kinetikusan kontrollált legyen, mivel ha a kristályosítóban az összetétel elérhetné az egyensúlyt, akkor a két enantiomorf kristály 1:1 arányban keletkezne. A nem kívánt enantiomorf kristály keletkezése előtt elválasztva a terméket kitűnő enantiomertisztaság érhető el. Különösen ipari léptékű megvalósítás esetén a visszamaradó enantiomer további feldolgozása vagy újrahasznosítása fontos a gazdaságos üzemeltetés szempontjából. 1.2.4.3 Kromatográfiás módszerek A racém elegy szétválasztása tiszta enantiomerekre lehetséges fizikai módszerekkel, mint például a különböző kromatográfiás eljárások (GC, HPLC). Az analitikai eljárásoknak két fő megvalósítása van, az indirekt és a direkt módszerek. Az úgynevezett indirekt módszerek során az enantiomereket derivatizálják optikailag tiszta királis reagenssel a diasztereomer pár képzés érdekében, így már elegendő fizikai-kémiai különbség lesz közöttük ahhoz, hogy akirális kromatográfiás oszloppal elválaszthatók legyenek. Direkt úton a kovalens helyett inkább átmeneti diasztereomer komplexet képeznek az enantiomerek a mozgó vagy az álló kromatográfiás fázisban található királis szelektorokkal. Továbbá egy általános enantiomer elválasztási technika a királis állófázissal alkalmazott kromatográfia. Az ilyen elválasztás az enantiomer és az álló fázis között létrejövő különböző erősségű 11

kapcsolaton alapul. Ennek következtében az egyik enantiomert jobban visszatartja az oszlop, így különböző lesz az áthaladási vagy retenciós idejük. Mint a legtöbb szakaszos technológia esetén, a folyamatos üzem megvalósítása gazdaságosabbá teheti a folyamatot. Az iparban is gyakran alkalmazott kromatográfiás módszer, a HPLC egyik változata a szimulált mozgó ágyas (SMB) technika. A királis HPLC egy hagyományos technika, azonban nem folyamatos rendszerű, magas az oldószerfelhasználása és alacsony termelékenységgel üzemeltethető. Továbbá, ha az affinitás különbség a molekulák között nagyon kicsi, mindössze a mozgó- vagy állófázis változtatásával már nem lehet tovább javítani a felbontást. Ezen problémák kiküszöbölése érdekében az SMB technológiát alkalmazzák gyógyszeralapanyagok esetében, különösen az enantiomerek elválasztására. A mozgóágyas technikával a betáplálás és az elvétel folyamatos és egyidejű, azonban a valódi mozgóágyból fakadó gyakorlati problémák elkerülése végett a valódi mozgó ágy helyett szimulált mozgóágyat alkalmaznak. A betáplálásnak és a minta elvételének a helye folyamatosan változik, ezzel szimulálják a mozgó ágyat. Szimulált ellenáramú

mozgóágyas

rendszereket

alkalmaztak

már

számos

nem-szteroid

gyulladáscsökkentő, asztma ellenes és β-blokkoló gyógyszerhatóanyagok enantiomereinek elválasztására

[33,

34]

. Ipari méretben gyakran alkalmazzák integrált folyamatokban

adszorpcióval vagy kristályosítással egybekötött elválasztási lépés sorozatban, mivel a folyamatos üzemeltetés ezt könnyen lehetővé teszi. Ennek az elválasztás technikának a legnagyobb hátránya, hogy a nagy beruházási és üzemeltetési költsége. Ezt azonban jól kompenzálja a jobb hozam és a sokkal kisebb oldószer-felhasználás, valamint az egyszerű szakaszos elválasztásokhoz képest a sokkal magasabb produktivitás (adott idő alatt előállított termék mennyiség). 1.2.4.4 Enzimes reszolválás Az utóbbi években a kémiai valamint az enzimkatalizált reszolválást széles körben tanulmányozták. Mivel számos kémiai katalizátor csak magas hőmérsékleten működőképes, vagy mutat megfelelő aktivitást

[35]

(mely bomlási- és mellékreakciókhoz vezethet), egyre

nagyobb az érdeklődés a természetes katalizátorok, enzimek alkalmazása iránt. Ezenkívül a kutatók nagy hangsúlyt fektetnek az aktuális célnak legmegfelelőbb, nagyobb aktivitású és kémiai módszerekkel kombinálható enzimek készítésére, így folyamatosan nő a biokatalízis szerepe a racém keverékekből történő enantiomertiszta komponensek előállításában. Mivel doktori munkám témáját ez az enantiomer elválasztási technika adja, ezért ezt a módszert a következő alfejezetekben részletesen ismertetem.

12

1.2.4.4.1 Enzimkatalízis Az élő szervezetekben működő biokatalizátorokat enzimeknek (a görög „en zümè”, kifejezésből, vagyis „élesztőből származó”) nevezik. Az enzimek zöme fehérje, de egyes (ribo)nukleinsavak is rendelkeznek enzimaktivitással. Csaknem minden, a sejtben végbemenő reakciót enzimek katalizálnak, azonban sok esetben ezek a biokatalizátorok képesek nemtermészetes szubsztrátok átalakítására is

[36]

. A termodinamika törvényei természetesen

minden enzimek által katalizált reakcióra is érvényesek, ezért: • Az enzimek termodinamikailag előnyös reakciók lejátszódását segítik elő az által, hogy az aktiválási energiát csökkentik (3. ábra). • Az enzimek által katalizált reakciók egyensúlyi állandója azonos a nem-katalizált reakció egyensúlyi állandójával, azaz az enzimek nem változtatják meg az egyensúly helyzetét, csak meggyorsítják annak beálltát. A biológiai rendszerekben azért van szükség enzimekre, mert az élethez szükséges reakciók egyébként nem következnének be elég gyorsan. • Az enzimek akár 10-12 nagyságrenddel növelhetik a reakciók sebességét [37]. • A szervetlen katalizátorokkal ellentétben az enzimek enyhe körülmények között, pH 7 körül, általában 20-40 °C-on lehetővé teszik a reakciók lejátszódását [37].

enzim nélkül

G

∆G1#

∆G-1# ∆G-1#’

∆G1#’ Gs

enzimmel

∆G° Gp

Reakció koordináta 3. ábra Aktiválási energia enzimkatalizált és enzim nélküli reakciók során Egy s ↔ p egyszerű reverzibilis exoterm példa reakció szabadenergia (G) diagramja látható enzimkatalizált (szaggatott), illetve biokatalizátor nélküli (folytonos) esetben. Gs és Gp jelölik a kiindulási vegyület (szubsztrát) és a termék átlagos moláris szabad energiáját a kiindulási- és a végállapotban. A standard állapot szabadenergia változása ∆G°. A termékállapotba jutáshoz szükséges egy ún. átmeneti állapot (görbék maximumánál) elérése. ∆G1# és ∆G1#’ megadja az átmeneti állapot eléréséhez minimálisan szükséges energiát, míg ∆G-1# és ∆G-1#’ megadja a visszaalakulás (p → s) aktiválási energiáját.

13

1.2.4.4.2 Michaelis-Menten kinetika és az enzimreakciók jellemzése Az enzimek működését az aktivitással (SI egysége a kat, katalitikus aktivitás, amely kifejezi, hogy 1 másodperc alatt hány mól szubsztrát alakul át, nemzetközi egysége még a unit, U, általában az enzim vagy az enzimkészítmény tömegére vonatkoztatva (U/g)) jellemezhetjük. A katalitikus hatékonyság mellett azonban az enzimek fontos jellemzője a specifitás is. Minden enzim csak egy bizonyos típusú reakció lejátszódását és csak bizonyos vegyületek átalakulását katalizálja. Azokat a vegyületeket, amelyek a reakció során megváltoznak szubsztrátoknak (s) nevezzük, a keletkező vegyületek a termékek (p, q, stb.). Az enzim specifitása lehet abszolút vagy részleges. Míg az első esetben az enzim egyetlen szubsztráttal reagál, a részleges specifitást mutató enzimek több, szerkezetileg hasonló vegyület átalakulását katalizálják. Az enzimek jól jellemezhetők és rangsorolhatók az enzimkinetikai paramétereik alapján. Az enzimkinetika az enzimkatalizált reakció időbeli lefutását írja le. Az ilyen típusú reakciók leírására a két legismertebb modell a Michaelis-Menten [40]

Haldane modell

[38, 39]

illetve a Briggs-

. Részletesen a Michaelis-Menten modellel foglalkozom, mivel

dolgozatom során is ezt alkalmaztam az enzimkinetikai számításaimhoz. Mint minden modell, a Michaelis-Menten modell is bizonyos feltételezéseken alapul. Abból indultak ki, hogy az enzim (e) a szubsztráttal (s) aktivált komplexet képez és a termékképzési lépés irreverzibilis:

s+e

κ1 κ-1

es

κ2

e+p

, ahol κ1, κ-1 és κ2 az egyes lépések látszólagos reakciósebességi együtthatói. Továbbá azt feltételezték, hogy a rendszerben jelenlevő teljes enzimmennyiség ( n e0 ) a szabad (ne) és az aktív komplexben (nes) található enzimmennyiség összege (1. egyenlet): ne0 = ne + nes

(1)

Felírható egy differenciálegyenlet-rendszer, amely megfelelő feltételezésekkel élve megoldható, a részletes levezetésére nem térnék ki [41]. Az enzimkatalizált reakciók esetében nincs egyetlen elfogadott nevezéktani rendszer a reakciót leíró paraméterek (kezdeti reakciósebesség, „turnover number”, enantioszelektivitás) tekintetében. A kezdeti reakciósebesség, amelyet jelölhetünk V0, Vi (az angol szóhasználat után „initial” vagyis kezdeti), valamint teljesen az angol írásmódnak megfelelően („reaction rate’) r0 vagy ri-nek, leggyakrabban termék vagy átalakított szubsztrát anyagmennyiséggel 14

megadott koncentrációja/átalakítási idő alakban adják meg így mértékegysége legtöbbször mM/min. A továbbiakban az r0 jelölést használom a kezdeti reakciósebességre. Ha a reakció kezdeti sebességét (r0 (termék koncentráció/időegység) a szubsztrátkoncentráció (cs (M)) függvényében ábrázoljuk, akkor egy hiperbolát kapunk, ez a MichaelisMenten görbe (4. ábra), egyenletére az alábbi 2. összefüggés adódik:

r0 =

rmax ⋅ cs K M + cs

(2)

, ahol rmax a maximális kezdeti reakciósebesség és KM a Michaelis-konstans. Az rmax, akkor érhető el, ha az összes rendszerben található enzim enzim-szubsztrát komplexben van, vagyis ce0 ≅ ces , tehát: rmax = κ 2 ⋅ ce0

(3)

KM az a szubsztrát koncentráció, ahol a reakciósebesség rmax/2-nek felel meg, a

reakciósebességi együtthatók segítségével felírva:

KM =

κ −1 + κ 2 κ1

(4)

r0 es

rmax

e es

es

es

es

es e

rmax/2

r = 0

r ⋅c K +c max

M

s

s

KM

cs

4. ábra A Michaelis-Menten kinetika görbéje

es

e A folytonos vonal jelöli a hiperbola értelmes szakaszát, a szubsztrát, az enzim-szubsztrát komplex.

a szabad enzim, míg

15

A

kezdeti

szakaszban,

alacsony

szubsztrát

koncentráció

mellett

(cs ≈ 0)

a

reakciósebesség a cs elsőrendű függvénye:

r0 =

κ 2 ⋅ ce0 rmax ⋅ cs = ⋅ cs = K ⋅ ce0 ⋅ cs KM KM

(5)

, ahol κ2 a termékképződés reakciósebességi együtthatója, K egy egyesített együttható, ce0 a kiindulási enzim koncentráció, KM a Michaelis-konstans.

A növekedés nagyobb cs mellett lelassul, nagy szubsztrát koncentráció esetén, ahol cs >> KM, a reakció független lesz a szubsztrát koncentrációtól, vagyis ebben a tartományban

nulladrendűvé válik, tehát r0 értéke aszimptotikusan tart egy adott rmax értékhez (r0 ≅ rmax). Az enzim kinetikai jellemzők a Michaelis-Menten görbe alapján grafikus úton többnyire csak pontatlanul határozhatók meg, azonban linearizálással kiküszöbölhető ez a probléma. A 2. egyenletet átrendezve három alakban felírható az egyenes egyenlete (6., 7. és 8. egyenletek [42-45]

[42,43,44,45]

): cs K M c = + s r0 rmax rmax

(6)

K 1 1 1 = + M ⋅ r0 rmax rmax c s

(7)

r0 = rmax − K M ⋅

r0 cs

(8)

Az rmax felhasználásával meghatározható egy, az enzimek katalitikus viselkedését jól jellemző paraméter, a „turnover number” (TON). A kutatók a TON-t alapvetően kétféleképpen definiálják, a biokémiai (enzimológiai) megközelítés alapján adott idő alatt egységnyi enzimmennyiség által átalakított szubsztrát molekula, telítési szubsztrát koncentráció mellett (tehát maximális reakciósebességgel), valamint vegyészmérnöki megközelítés alapján, különösen folyamatos rendszerek esetében (állandó térfogatáramra vonatkozóan) adott enzim mennyiség mellett átalakított szubsztrát mennyiség

[46]

. Az alábbiakban összefoglalom a

legfontosabb illetve leggyakrabban alkalmazott definíciókat. Boy és munkatársai [47] a TON meghatározásához a Michaelis – Menten kinetika szerint, a 3. egyenletből indultak ki. A szabad (összes bemért mennyiségű) enzim koncentráció ce0 (g/dm3)) ismeretében kiszámítható az enzimre vonatkozó specifikus aktivitás (A (mmol átalakított szubsztrát · g enzim-1 · h-1)) a 9. egyenlet alapján: A=

rmax c e0

(9)

16

Boy definíciója (10. egyenlet) szerint a TON (mmol átalakított szubsztrát/g enzim) a specifikus aktivitás idő szerinti integrálja:

TON = ∫

t ( a =amin )

0

A(t )dt

(10)

, ahol t az a reakció idő, amíg az enzim megőrzi aktivitását (Amin adott specifikus aktivitás értékig). Uludag-Demirer és munkatársai [48] egyszerűen a Michaelis – Menten kinetika szerint az enzim-szubsztrát komplexből (es) a termékképződés reakciósebességi állandóját κ2-t nevezték „turnover number”-nek. A 2. és 3. egyenletek alapján, ha cs >> KM, akkor:

κ 2 ≅ TON

(11)

Liese és munkatársai

[49]

folyamatos rendszerben definiálták a TON-t mind bio- mind

kémiai katalizátorokra az alábbi egyenlet szerint:

np

TON =

⋅

1

(12)

nkat ν p

, ahol np a reakció végéig keletkezett termék mennyisége (mmolban), nkat a kémai vagy biokatalizátor mennyisége (mmolban), νp a termék sztöchiometriai együtthatója. Az enzim aktivitására pedig definiálták a „turnover” frekvenciát (TOF), amelyet időegységre (t) vonatkoztattak:

TOF =

ns ne ⋅ t

(13)

, ahol ns az átalakított szubsztrát mennyisége (mmolban). Az enzimkatalizált reakciók egy további nagyon fontos paramétere a szelektivitás és ennek egy speciális esete az enantioszelektivitás, amely megadja a két enantiomer eltérő reakciósebességének arányát. Meghatározásához elengedhetetlen az egyes reakciólépésekben a szubsztrátok és termékek enantiomertisztaságának ismerete, amelyet a 14. egyenlettel

[50]

számíthatunk: ee =

c( + ) − c( − )

(14)

c( + ) + c( − )

, ahol c(+) a (+) irányba forgató enantiomer koncentrációja, c(-) a (-) irányba forgató enantiomer koncentrációja. Az enantioszelektivitás meghatározására többféle módszer közül választhatunk, így a rendelkezésünkre

álló

adatoknak

megfelelően

kiválaszthatjuk

a

legalkalmasabbat. 17

Irreverzibilis reakciók esetén négy módszer közül három, a 15. egyenletből 16.

[51]

, a 17.

[52]

és a 18. egyenlet

[51]

[51]

levezetve, a

gyakorlatilag a reakció lefutásának jellemző paramétereit

használja, mint a konverzió (X) és a termék valamint a szubsztrát enantiomer tisztasága, míg a negyedik módszer, a 19. egyenlet

[53]

reakciókinetikai és termodinamikai megfontolásokon

alapul.

E (K M , rmax ) =

E A (X , ee p ) =

ln (c ( + ) / c ( + ) 0 ) ln (c ( − ) / c ( − ) 0 )

=

rmax( + ) K M ( + )

(15)

rmax( − ) K M ( − )

ln(1 − (1 − X ) ⋅ (1 + ee p ))

(16)

ln(1 − (1 − X ) ⋅ (1 − ee p ))

, ahol X a konverzió, eep a termék enantiomertisztasága.

E B (ees , ee p ) =

ln((1 − ees ) /(1 + ees / ee p ))

(17)

ln((1 + ees ) /(1 + ees / ee p ))

, ahol ees a szubsztrát, eep pedig a termék enantiomertisztasága.

EC ( X , ees ) =

ln((1 − X ) ⋅ (1 − ees )) ln((1 − X ) ⋅ (1 + ees ))

(18)

, ahol X a konverzió, ees a szubsztrát enantiomertisztasága. Módosított Eyring-egyelettel:  ∆∆H #   1   ∆∆S #   ⋅   +   E D = − R T R      

(19)

, ahol ∆∆H#: a két enantiomer reakciójának moláris aktiválási entalpia különbsége, R: egyetemes gázállandó, T: abszolút hőmérséklet, ∆∆S#: a két enantiomer reakciójának moláris aktiválási entrópia különbsége. Reverzibilis

reakciókra

az

enantioszelektivitást

az

alábbi

bonyolultabb

összefüggésekkel (20. és 21. egyenlet) [54] adják meg a Kes egyensúlyi állandó segítségével.

E E ( X , ees , K es ) =

ln(1 − (1 + K es ) ⋅ ( X + ees ⋅ (1 − X ))) ln(1 − (1 + K es ) ⋅ ( X − ees ⋅ (1 − X )))

E F (X , ee p , K es ) =

ln(1 − (1 + K es ) ⋅ X ⋅ (1 + ee p )) ln(1 − (1 + K es ) ⋅ X ⋅ (1 + ee p ))

(20)

(21)

Az adott reakció katalizálására legalkalmasabb enzim kiválasztásához jó útmutatást adhatnak az enzimkinetikai konstansok, valamint az egyes enzimek ismert tűréstartományai a műveleti paraméterekkel szemben. Az enzimek, különösképpen a lipázok széles hőmérséklet, 18

nyomás, pH és só koncentráció tartományban és különböző közegekben, mint például vizes oldatokban, szerves oldószerekben és szuperkritikus fluidumokban képesek megőrizni aktivitásukat. 1.2.4.4.3 Lipázok

A lipázok (E.C.3.1.1.3) a szerin hidrolázok csoportjába tartozó, vízoldható, állatokban, növényekben, gombákban és baktériumokban előforduló enzimek. A lipázok természetes szubsztrátjai a vízoldhatatlan lipid molekulák, a bennük található észterkötés hidrolízisét katalizálják. Alapvető szerepet játszanak a legtöbb, ha nem az összes élő szervezet emésztésében, a transzport folyamatokban és a zsírok lebontásában. A lipázok genetikai kódjai még bizonyos vírusokban is megtalálhatóak [55, 56]. A lipázok katalitikus aktivitása drasztikusan megnő a víz-olaj határfelületen, ami akkor jön létre, amikor a szubsztrát koncentráció meghaladja a kritikus micella koncentrációt. Ezt a jelenséget nevezik határfelületi aktivitásnak. Minden olyan lipáz rendelkezik határfelületi aktivitással,

aminek

egy

vagy

több

hurokkal

vagy

hélixszel

(„tetővel”)

védett

Ser-His-Asp (Glu) típusú aktív centruma van. Feltételezhetően az aktív hely fölött elhelyezkedő „tető” okozza vizes fázisban az enzim aktivitás gátlását, míg a határfelületen bekövetkezik az aktiváció [57]. A határfelületen a lipázok konformáció-változáson mennek keresztül. A lipázok háromdimenziós szerkezetének feltárásakor igazolták, hogy az aktív centrum szabaddá válásához feltétlenül szükséges ez a konformáció-változás. A szerkezeti átrendeződések megváltozatják az enzimek felszíni tulajdonságait és néhány esetben oxoanion-lyukat képeznek. A „tető” mozgása hozzáférhetővé tesz egy nagy hidrofób területet az aktív hely körül, így olyan amfipatikus molekulák keletkeznek, amelyek képes megfelelő alakot felvenni a szubsztrátok aktív helyhez kapcsolódásához. Mindazonáltal a megfigyelt szubsztrát szelektivitás és sztereoszelektivitás valószínűleg az enzim és a szubsztrát kölcsönhatásának eredménye. Vizes közegben a zárt konformáció preferált, míg szerves oldószerek jelenlétében a nyílt. A Pseudomonas eredetű lipázok határfelületi aktivitását is leggyakrabban az enzimben lejátszódó

konformációváltozása

okozza.

[58]

Hasonló

aktivációs

mechanizmusra

következtethetünk a Rhizomucor miehei, a hasnyálmirigy illetve a Candida rugosa eredetű lipázok esetében. Ellenben a Candida antarctica eredetű lipáz B

[59]

és a kutináz

[60]

nem

rendelkezik „tetővel” elzárt aktív hellyel és nem aktiválódnak a határfelületen. Tehát a lipázok határfelületi aktivitásához elengedhetetlen a konformációváltozás. A biotechnológia területén számos felhasználási lehetőségük lehet ezeknek az enzimeknek. A legtöbb laboratóriumi kutatásra vagy ipari előállításra használt lipáz szubsztrát 19

toleráns, amely lehetővé teszi természetes és szintetikus szubsztrátok széles körének biotranszformációját. A lipázok nem igényelnek kofaktorokat. Mind natív, mind rögzített formában elérhetőek a kereskedelmi forgalomban, viszonylag olcsón és nagy stabilitással. Alapvetően a lipázok rendkívül alkalmasak szintetikus szerves kémiai reakciókban számos reszolválási reakció katalizálására különböző reakció közegekben (5. ábra). O

O

+ R1

H2O

OR2

O

R1

+

R1

O

O

O

OH

OR2

R3

c) R1

+

R3OH R1

OR2

O

O

OH

O

+ OR2

OR4

d)

O

+ R3

OR2

R2OH

OR3

O

+

R1

b)

O

+

R1

H2O

O

O R1

+

+ R3

OR2

a)

OR2

+ R1

R2OH

O R2OH

OH

R1

+ OH

R3

e) R1

OR2

OR4

O

+

R3NH2 R1

R2OH

f)

NHR3

5. ábra Lipáz katalizált reakció típusok a) enzimes hidrolízis (általában vizes közegben), b) enzimes észterezés, c) enzimes átészterezés acidolízissel, d) enzimes átészterezés alkoholízissel, e) enzimes keresztészterezés, f) enzimes aminolízis

Az enzimek rendkívül enantioszelektívek lehetnek, akár 99 % feletti enantiomer tisztaság is elérhető a reakciók során. Képesek prokirális szubsztrátból királis centrum képzésére vagy szelektív enantiomer megkülönböztetésre racém keverékben. Ez utóbbi tulajdonság teszi az enzimeket hatékony királis katalizátorrá. Egy hátrányuk, hogy a kívánt enantiomerre nézve a maximális elméleti hozam csak 50 % lehet, mivel racém elegyből indulunk ki. A visszamaradó enantiomer sok esetben felhasználható királis segédanyagként vagy más szintézisekben, azonban további alkalmazásához újabb műveleti lépések szükségesek. A 100 %-os hozam eléréséhez az egyik lehetséges megoldás a dinamikus-kinetikus reszolválás. Ez az eljárás ötvözi az enantioszelektív reszolválást és az in situ racemizálást, amely 20

segítségével a nem kívánt enantiomert folyamatosan átalakítjuk. Egy másik hasonló alternatíva lehet a deracemizálási eljárás, az enantiomer elválasztás helyett, egyiket a másikba alakítja, azonban erre a gyakorlatban kevés példát találunk (6. ábra).

Reszolválás

Dinamikus-kinetikus reszolválás

Deracemizálás

s

p

s

p

s

p

s’

p’

s’

p’

s’

p’

6. ábra Tiszta enantiomerek előállítási módszerei a reszolválás módszereivel s, s’: szubsztrát enantiomerek, p, p’: termék enantiomerek

1.2.4.4.3.1

Candida antarctica lipáz B

A Candida antarctica lipáz B (CAL-B) az egyik leggyakrabban alkalmazott lipáz, mivel nagyon széles a természetes és nem-természetes szubsztrát spektruma

[61]

. A CAL-B kristály

szerkezete ismert és azt mutatja, hogy az enzim az aktív helyén rendelkezik egy Ser–His–Asp katalitikus triáddal

[62]

(7. ábra). A szerkezet olyannak tűnik, hogy „nyitott” konformációban

egy viszonylag szűk bejárat van az aktív helyhez. Ez magyarázatul szolgál az enzim szubsztrát specificitásához és a nagyfokú sztereospecificitásához.

7. ábra A Candida antarctica lipáz B röntgen kristály szerkezete

21

Az észterezési reakciók mechanizmusát mutatja a 8. ábra, ping-pong-bi-bi [63-65] 64, 65] mechanizmuson keresztül [63, . A szabad enzimhez elsőként kapcsolódik az első szubsztrát (s

1) és kialakul az enzim-szubsztrát komplex (es 1) majd az átalakítást követően az első termék (p 1) leválik ez enzim aktív centrumáról. Az enzim ilyenkor módosult, acil enzim formában van jelen, vagyis kapcsolódik az s1-ről hozott reaktív csoporthoz. Az enzim ekkor megköti a második szubsztrátot (s 2) és kialakul egy acil enzim-szubsztrát (es 2) átmeneti komplex, majd a reakció végeztével a második termék (p 2) távozik az enzim felszínéről és visszamarad a szabad enzim az eredeti állapotban és reagálhat ismét egy újabb s1 molekulával.

8. ábra A CAL-B enzim reakció mechanizmusa [66] A Ser–His–Asp katalitikus triád működése észterezési reakció során

1.2.4.4.4 Enzimkatalizált kinetikus reszolválás

Királis biokatalizátorokkal, enzimekkel végzett reakciókban az enantiomerek különböző reakciósebességet mutatnak. Ha a különbség elég nagy, akkor csak az egyik enantiomer sztereoszelektív átalakításával a másik enantiomer visszamarad, így az enantiomerek elkülöníthetőek egymástól. Mivel a reakciósebességek különbségén alapul ez az eljárás, kinetikus

reszolválásnak

nevezik.

A

reakcióidővel

a

termék

enantiomertisztasága

folyamatosan változik, a reakciót a megfelelő időpontban leállítva maximális hozam és enantioszelektivitás érhető el a kívánt termékre nézve. Amennyiben gazdaságosan kivitelezhető, ez a technológia kifejezetten alkalmas ipari méretű enantiomer előállításra. A legfontosabb paraméter a kinetikus reszolválás során az enantioszelektivitás (E-érték), amely a két enantiomer eltérő reakciósebességétől függ. Míg elvileg bármilyen kicsi reakciósebesség különbség (E > 1) esetén keletkezhet enantiomertiszta vegyület, addig gyakorlatban csak 22

jelentősen lecsökkent hozam árán érhető el nagy enantiomertisztaság kis E-érték mellett. Másrészről nagy E esetén a hozam veszteség minimalizálható, így közel elméleti kihozatallal és enantiomertisztasággal kapjuk a terméket. Mint minden reszolválási eljárás esetén itt is nagyon fontos a visszamaradó enantiomer hasznosítása, újrafelhasználása. Az egyéb reszolválási módszerekhez képest kinetikus reszolválás esetében a két termék (visszamaradó szubsztrát és keletkező termék) keletkezése kémiailag eltérő. A királis vegyületek enzimes reszolválására számos lehetőség kínálkozik, többek közt megvalósítható enantioszelektív hidrolízissel

[67-69]] [67,

68,

69

, átészterezéssel

közegben mikrobiális eredetű lipázokkal végzett direkt észterezéssel

[70, 71]

[72, 73]

vagy nem-vizes

.

A legtöbb lipáz képes átalakítani nem-természetes szubsztrátokat is, sok esetben kitűnő enantioszelektivitással

[74-76] [74, 75, 76] .

Így a lipázok jól alkalmazhatók enantiomerek elválasztásában,

mint például racém karboxisavak és alkoholok kinetikus reszolválásban

[77]

. Számos királis

gyógyszerhatóanyag enzimes reszolválását is megvalósították már, többek között Candida rugosa, Candida antarctica és Rhizomucor miehei eredetű lipázokkal sikeresen reszolváltak

már ibuprofént [78], naproxént [79], suprofén [80] és flurbiprofént [81]. Ennek az eljárásnak a nyilvánvaló limitációja, hogy az ilyen típusú reakciók racém kiindulási szubsztrátra vonatkoztatott elméleti maximális kihozatala 50 % lehet

[82]

. A

probléma kiküszöbölésére számos módszert kidolgoztak; deszimmetrizálás (mezo-vegyületek és prokirális szubsztrátok alkalmazása), a visszamaradó enantiomer sztereo-inverziója valamint a dinamikus kinetikus reszolválás

[83]

,

[84-88] [84, 85, 86, 87, 88]

.

1.2.4.4.5 Dinamikus kinetikus reszolválás

A dinamikus-kinetikus reszolválás (DKR) a racém szubsztrát kinetikus reszolválásának és a kevésbé reaktív enantiomer racemizálásnak kombinációja

[84]

. Az elreagálatlan

enantiomert folyamatosan racemizálva a teljes folyamat alatt, a teljes kiindulási anyag hatékonyan a kívánt enantiomerré alakítható [88]. A racemizálási módszer kiválasztása a racemizálni kívánt szubsztrát természetétől függ. A leggyakrabban alkalmazott racemizáló szerek bázisok, Schiff-bázisok, enzimek és átmeneti fém katalizátorok

[89]

. A legszélesebb körben használt racemizálási módszer a bázis-katalizált

racemizálás, amely minden olyan esetben megfelelő, amikor az aszimmetriacentrumhoz kapcsolódó H-atom elegendően savas. Az aminosavak racemizálását legtöbbször Schiff-bázis segítségével végzik, ha a kiralitás centrumban szabad primer amino-csoportot tartalmaz a vegyület. Racemáz enzimekkel szintén végeznek racemizálási lépéseket, habár felhasználásuk főként csak az aminosav származékokra és az α-hidroxi-sav származékokra szűkül. Számtalan példa található az irodalomban hatékony DKR megvalósítására a felsorolt különböző racemizálási módszerekkel

[84, 87,8989-91] [84, 87, , 90, 91]

. Az utóbbi időben az enzimes kinetikus reszolválás és 23

az átmeneti fém katalizátorokkal végzett racemizálás kombinációjával elért eredmények is [82, 84, 86, 88-90]] nagy érdeklődésre adhatnak okot [82, 84, 86, 88, . 89, 90

Hatékony kemo-enzimatikus DKR kivitelezéséhez számos feltétel szükséges. A legfontosabb a megfelelő enzim – katalizátor pár kiválasztása, amely meglehetősen nehéz, mivel általában egészen más környezetben aktívak. Míg az enzimek számára legtöbbször a kíméletes hőmérséklet kedvez, addig a fém katalizátorok gyakran 80 °C fölött a leghatékonyabbak. A legtöbb hidrogén transzfer katalizátor hozzáadott bázis ko-katalizátor hozzáadását igényli, amely hatással lehet az enzim aktivitására, valamint mellékreakciók kialakulását eredményezheti. További paraméterek, mint például az oldószer, szintén jelentősen befolyásolhatják az enzim aktivitását és a fém katalizátor oldhatóságát, hozzáférhetőségét. Ez döntő fontosságú lehet, mert ha a racemizálási lépés sebessége legalább akkora, mint a gyorsabban reagáló enantiomer távozása a rendszerből, akkor jó esély van nagy konverzióval előállítani a kívánt terméket. Más szóval eredményes DKR-hez célszerű, hogy a racemizálási lépés gyorsabb legyen, mint a kinetikus reszolválás.

1.3

A szuperkritikus fluidumok Az utóbbi időben egyre nő az emberi szervezet és a környezet számára kevéssé

megterhelő oldószerek iránti igény. Ennek következtében kerültek a figyelem középpontjába a hagyományos, szerves oldószerek helyett egyéb alternatív reakcióközegek. Ezek közül is a víz és az ionos folyadékok mellett fontosak a szuperkritikus fluidumok, amelyeket a még gyakran kiaknázásra váró előnyeik miatt másnéven a „jövő oldószereiként” is emlegetnek. A szuperkritikus állapot minden anyag esetében egy rá jellemző kritikus nyomás (Pkrit) és hőmérséklet (Tkrit) fölött alakul ki (9. ábra). 1822-ben Baron Charles Cagniard de la Tour [92]

volt az első, aki definiálta a szuperkritikus fluidumokat, ő volt, aki először feljegyezte egy

anyag kritikus hőmérsékletét és nyomását.

24

9. ábra A CO2 nyomás-sűrűség fázisdiagramja

Ha az anyag hőmérséklete és nyomása eléri vagy megközelíti a kritikus hőmérsékletét és nyomását, a fizikai tulajdonságaiban jelentős változások következnek be. A hőmérséklet emelkedésével a hőtágulás következtében a folyadék fázis sűrűsége egyre csökken, a nyomás növelésével a gáz fázis egyre sűrűbbé válik. Egy adott ponton a két fázis, az egyensúlyi folyadék és a telített gáz sűrűsége megegyezik és eltűnik a köztük lévő fázishatár. Ezt nevezzük kritikus pontnak. Számos fizikai tulajdonság, mint például a viszkozitás, permittivitás, oldóképesség, amelyek szorosan összefüggenek a sűrűséggel, jelentős emelkedést mutatnak a nyomással

[93]

. A szuperkritikus oldószerek egyik legnagyobb előnye

is ebben rejlik, mivel a két függetlenül változtatható paraméter, a hőmérséklet és a nyomás segítségével egyszerűen szabályozhatóak az oldószer rekciósebességet és szelektivitást befolyásoló tulajdonságai (oldóképesség, a diffúziós állandó, az anyagátadási tényező).

25

Az 1. táblázatban néhány oldószer kritikus adatait foglaltam össze [93]: 1. táblázat Oldószerek kritikus paraméterei

Szén-dioxid

Molekula tömeg (g/mol) 44,01

Hőmérséklet (kritikus) (°C) 31,1

Nyomás (kritikus) (MPa) 7,4

Víz

18,02

374,1

22,1

Metán

16,04

-82,7

4,6

Etán

30,07

32,2

4,9

Propán

44,09

96,7

4,3

Etilén

28,05

9,3

5,0

Propilén

42,08

91,8

4,6

Metanol

32,04

239,5

8,1

Etanol

46,07

240,8

6,1

Aceton

58,08

508,1

4,7

Trifluormetán

70,01

26,2

48,6

Kloro-trifluormetán

104,47

28,9

38,7

Trikloro-fluormetán

137,37

198,1

44,1

Ammonia

17,03

132,4

113,5

Ciklohexán

84,16

280,4

40,7

n-Pentán

72,15

196,6

33,7

Toluol

92,14

318,7

41,0

Oldószer

A felsorolt oldószerek közül ipari léptékű szuperkritikus eljárásokban a leggyakrabban a szuperkritikus vizet és szén-dioxidot (scCO2) alkalmazzák, azonban a szubkritikus propán, és speciális esetekben a szuperkritikus flourozott oldószerek is teret kapnak. A táblázatból látszik, a szuperkritikus technológiának az egyik legjelentősebb hátránya a nagy nyomáson (legalább 5 MPa nyomáson) történő üzemeltetés, amelyhez megfelelő nyomásálló berendezésekre van szükség, ami megnöveli a beruházási költségeket.

1.3.1

A szuperkritikus szén-dioxid A normál állapotban gáz halmazállapotú CO2 nem jó oldószer, azonban a kritikus pontja

(31,1 °C,

7,38 MPa)

felett

oldóképessége

jelentősen

megnő,

fizikai

tulajdonságai

megváltoznak. A CO2 fázisátmeneteit az alábbi, 10. ábra szemlélteti: 26

10. ábra A CO2 szuperkritikus fluidum fázisának kialakulása A cellában folyadék és gáz halmazállapotú CO2 is jelen van. Az a) és b) ábrán látható, amint a cella hőmérsékletét és nyomását folyamatosan növeljük, majd a fázishatár kezd eltűnni (c) és a kritikus pont fölött kialakul a homogén szuperkritikus fluidum fázis (d), megfordítva a folyamatot, csökkentve a hőmérsékletet és a nyomást (e), (f) fázisszétválás után visszaáll a kiindulási állapot [94].

A scCO2, mint oldószer gazdasági, biztonságtechnikai és technológiai előnyöket is rejt magában. Nem toxikus, nem karcinogén, kémiailag inert, tehát többnyire nem lép reakcióba a benne oldott vegyületekkel, fiziológiailag összeférhető, nagy a diffúziós állandója. Alacsony kritikus paramétereinek köszönhetően alkalmas lehet biológiailag aktív vegyületekkel végzett reakciókhoz is, továbbá biztonságtechnikailag és az üzemeltetés szempontjából is kedvező. Olcsó, nagy mennyiségben rendelkezésre áll a természetben, nem tűzveszélyes és nem robbanásveszélyes

[93,

95]

.

Legnagyobb

technológiai

előnye,

hogy

egyszerű

nyomáscsökkentéssel gáz halmazállapotba hozva eltávozik a termékből, a visszamaradó minimális mennyiség pedig akár elő is segítheti a termék eltarthatóságát. A scCO2 felhasználását az korlátozhatja, hogy a poláris (erősen poláris) vagy nagy molekulatömegű vegyületek rosszul oldódnak benne. A probléma kiküszöbölésére számos módszert kifejlesztettek, mint például kis mennyiségű segédoldószer (etanol, metanol) javíthatja a polárisabb karakterű molekulák oldhatóságát a segédoldószer és a feloldani kívánt vegyület között létrejövő kölcsönhatással [95]. Kedvező tulajdonságai ellenére a scCO2-ot csak az 1970-es évek végétől alkalmazzák ipari eljárásokban. Elsőként a német Kaffee HAG (Bermen, Németország) vállalat alkalmazta a Zosel (Max Plank Institute) által kifejlesztett eljárást a nyers kávébab koffeinmentesítésére [96]

. A CO2 alacsony kritikus hőmérsékletének és kis reakcióképességének köszönhetően, az

extrahált anyagok nem denaturálódnak, és nem változik meg az állaguk, illatuk sem. Emiatt különösen alkalmas például gyógyszeripari, élelmiszeripari és kozmetikai ipari aktív szubsztrátok és illatanyagok extrakciójára, reakciójára. Ennek köszönhetően a későbbiekben 27

számos egyéb területen jól bevált oldó- és extrahálószer lett, többek között alkalmazzák a parfümipar számára fontos illóolajok, illatanyagok kivonására

[97]

, ruhatisztításhoz

[98]

, az

élelmiszeriparban zsírok, olajok íz- és illatanyagok extrakciójára, sterilizálásra, élelmiszerek tartós csomagolására, egészségügyben orvosi eszközök és műszerek sterilizálására polimerek habosítására

[100]

[99]

,

, valamint különböző kémiai reakciók – napjainkban akár

enzimkatalizált reakciók esetén is – oldószereként használják.

1.4

Enzimek viselkedése szuperkritikus széndioxidban Az enzimek természetes közege a víz. Számos szerves vegyület azonban gyakorlatilag

vízoldhatatlan, ezért a víz nem minden esetben alkalmazható a reakciók oldószereként. Néhány szerves molekula vízben instabillá válhat. Ezenkívül a reakció végén a víz eltávolítása a rendszerből bonyolult és költséges lehet magas forráspontjának és nagy párolgáshőjének köszönhetően. A nem kívánt hidrolízis, racemizáció, polimerizáció, bomlás és hasonló mellékreakciók csökkenthetik a vizes közegben végzett enzimes eljárások eredményességét. Ha a víz nem megfelelő oldószer, a hagyományos szerves oldószerek alkalmasak lehetnek az enzimkatalízishez is. Az enzimek egy része különböző szerves oldószerekben aktív marad többek között azért is, mivel a denaturációért jellemzően felelős kedvezőtlen hidrolitikus reakciók ritkán játszódnak le. Szerves oldószerekben a vizes közeghez képest nőhet az enzimek enantioszelektivitása és a nem-poláris szubsztrátok átalakítása gyorsabb lehet a megnövekedett oldhatóság következtében

[101, 102]

. Alacsony forráspontú oldószer

esetén a terméktől történő elválasztás is viszonylag egyszerűen megvalósítható. Egyes enzimek, különösen a lipázok képesek megőrizni aktivitásukat scCO2-ban Randolph és munkatársai

[104]

, valamint Hammond és munkatársai

[105]

[103]

.

írták le elsőként

scCO2-ban végzett sikeres enzim-katalizált reakciókat. A scCO2 azonban nemcsak mint oldószer, hanem mint a reakció utáni elválasztást végző közegként is funkcionálhat, így lehetőséget nyújt összetett eljárások megvalósítására. Így a reakció végeztével nem szükséges változtatni az oldószert a későbbi „downstream” feldolgozási lépések során. Egy ilyen integrált gyártási folyamat összteljesítménye jelentősen magasabb lehet, mint egy több különböző hagyományos szerves oldószert alkalmazó módszernek

[106]

. Szerves oldószerben

végzett enzimatikus reakciók esetén a tisztítási lépések költsége a teljes folyamat költségének több mint 70 % is lehet

[107]

. A termékek egymástól, illetve az enzimtől és az esetlegesen

jelenlevő víztől történő elválasztására a scCO2 eltérő oldhatóságuknak köszönhetően kedvező lehetőséget kínál a hőmérséklet és nyomás változtatásával szabályozható oldóképessége révén. 28

Számos előnye ellenére a scCO2 alkalmazása enzimes reakciók közegeként ipari méretben csak akkor nyerhet teret más megoldásokkal szemben, ha az adott vegyület más módon nem állítható elő megfelelő tisztasággal és hozammal, és az új technológia egyértelműen profitot termel, valamint ha a scCO2-os eljárás gazdasági szempontból nyereséget hoz.

1.4.1

Hőmérséklet, nyomás hatás Az enzimek összetett feltekeredett polipeptid molekulák, meghatározó negyedleges

szerkezetüket a H-kötések, ionos és hidrofób kölcsönhatások és a diszulfid-hidak tartják össze. Stabilitás szempontjából a diszulfid-hidakkal rendelkezők lényegesen jobban megőrzik szerkezetüket, mint az ilyen típusú kovalens kötés nélküli enzimek

[108]

.

Szuperkritikus rendszerekben végzett reakciók esetén a nyomás és a hőmérséklet a közeg fizikai tulajdonságainak változásán keresztül együttesen befolyásolja az enzimaktivitást, és ezáltal a reakciók lefutását. Ezt bizonyítja az is, hogy szerves oldószerben 1-120 bar közötti nyomás tartományban nincs hatása a nyomásváltozásnak a kinetikus reszolválás szelektivitására és produktivitására

[109]

. A scCO2 nyomásának változtatásával együtt

változnak a sűrűség-függő fizikai paraméterek, mint a megoszlási hányados, a dielektromos állandó és a Hildebrant oldhatósági paraméterek, amelyek közvetetten befolyásolják az enzimaktivitását, specificitását és stabilitását

[110, 111]

módon is hatással lehet az enzimaktivitásra

[112]

. A nyomás és a hőmérséklet direkt

és a reakcióparaméterekre, beleértve a

reakciósebességet is. A nyomás jelentősen befolyásolhatja az enzimkatalizált reakciók enantioszelektivitását is [113]. Alapvetően az enzimek a nagy nyomást a leggyakrabban vizsgált 10-40 MPa tartományban jól tolerálják, további növelés negatívan hathat, irreverzibilis denaturációjuk csak különösen nagy nyomás fölött (~ 400 MPa) következik be

[114]

, ezért már a nyomás

direkt módon hat az enzim molekulák konformációjára. A különböző reakciók esetén az enzimekre más-más lehet a nyomás hatása, míg ugyanaz az enzim ugyanolyan körülmények között nyomás függően állítja elő az egyik terméket és adott nyomás után a hozama jelentősen csökken, addig más termékeket tág tartományban nyomástól függetlenül képez

[115]

. Erre egy

szemléletes példa az etil-4-hidroxi-3-metoxicinnamát Novozym 435 lipázzal katalizált alkoholízise illetve átészterezési reakciója. Adott hőmérsékleten (80 °C-on) az alkoholízis esetében éles nyomás optimummal rendelkezik a reakció 10,3 és 13,8 MPa között (~ 60 %-os hozam), a további nyomás növelés jelentős hozamcsökkenést okoz (~ 35 MPa nyomáson már mindössze ~ 47 %-os a hozam). Ezzel ellentétben az átészterezési reakciónál a nyomástól (~ 14-35 MPa tartományban) szinte teljesen függetlenül keletkeznek a monoferuloil-

29

monooleoil-glicerin (~ 33-35 %-os hozammal) valamint a feruloil-dioleil-glicerin (~ 37-41 %os hozammal) zsírok. Az enzimek aktivitás csökkenését gyakran nem a nagy nyomás, hanem a nyomásváltozás, nyomásmentesítés idézi elő. Erre magyarázatul szolgál, hogy az enzim kötött vízrétegében oldott CO2 hirtelen távozása gyors nyomás csökkentés esetén az enzim konformációja maradandó károsodást szenved és denaturálódik

[116]

. A nyomásmentesítés a

visszamaradó enzimaktivitás növelése érdekében jobb, ha a szuperkritikus fázisból történik, mint lehűtést követően a folyadék fázisból, ugyanis a kritikus pont alatti hőmérsékleten történő nyomásmentesítés számottevő enzimaktivitás csökkenést okozhat. Míg fázisátalakulás hatására (a hőmérséklet változtatásával 40 fázisváltást (65 °C – 15 MPa és 20 °C – 51 bar.) követően szuperkritikus fázisból történő nyomásmentesítéssel) csak minimális, de észlelhető csökkenés következik be az enzimaktivitásban [108]. Állandó nyomáson a scCO2 sűrűsége nagyobb, ha a hőmérséklet kisebb. Ezért a hőmérséklet növelésével az oldóképessége csökken. Ezzel szemben a diffúziós állandó a hőmérséklet emelkedésével nő. A hőmérséklet növekedése, ha pusztán reakciókinetikai alapokat veszünk figyelembe, növeli a reakciósebességet, azonban mivel enzim katalízisről van szó, fontos szempont a biokatalizátor számára is megfelelő hőmérséklet beállítása. A legtöbb esetben a reakciósebesség hőmérséklet függése maximumos görbével írható le (11. ábra) [37].

r0

Arrhenius-összefüggés

Hődenaturálódás

Eredő görbe

T 11. ábra Az enzimek hőmérséklet optimuma

Az enzimek hőstabilitásától függően adott hőmérsékletig a reakciósebesség nő a [117, 118, 119] hőmérséklet emelésével, akár még 70-80 °C-nál magasabb hőmérsékleten is [117-119] , míg más

[120-122]

reakcióknál 40-50 °C körül kapták az optimális értéket 120, 121, 122]. Matematikailag a hőmérséklet [

30

enzimaktivitásra gyakorolt hatása leírható két jól definiált termikus paraméterrel: az Arrhenius aktiválási energiával, amely a hőmérséklet hatását írja le a katalitikus reakciósebességi állandóra és a termikus stabilitás, amely megadja a hőmérséklet hatását a termikus inaktivációs állandóra. Az enzimaktivitáson és ezáltal a reakciósebességen kívül egy nagyon fontos paramétere az enzimreakcióknak a szelektivitás. Az enzim konformáció változásán keresztül ezt a paramétert is mind a nyomás, mind a hőmérséklet befolyásolhatja. Matsuda és munkatársai [113]

1-(p-klorofenil)-2,2,2-trifluoroetanol Novozym katalizált acetilezését vizsgálták izoterm

körülmények között 8-19 MPa nyomás tartományban. Az E értékben folyamatos csökkenést figyeltek meg, amely feltehetően annak köszönhető a nyomásnövelés hatására scCO2 sűrűségében bekövetkező nagy változás miatt jelentősen megváltozott a CO2 és az enzim közötti kölcsönhatás, amely fokozatosan megváltoztatta az enzim konformációját és ezáltal a reakció enantioszelektivitását is. A hőmérséklet esetében hasonló függést tapasztaltak [123]. Az egyes enzimek a hőmérséklet/nyomás változásra akár reakciónként is egészen különböző módon reagálhatnak, jelentősen eltérő aktivitás változást mutathatnak, ezért rendkívül fontos adott enzim és adott reakció esetén az optimális működési paraméterek beállítása.

1.4.2

Vízaktivitás, víztartalom scCO2-ban Hidrolitikus reakciókban a víz az egyik reaktáns, továbbá szuperkritikus fluidumokban

entrainerként is viselkedhet, megváltoztathatja a közeg polaritását, és ezáltal az egyes anyagok oldhatóságát is, továbbá hatással van a reakció kinetikára is, és megkönnyítheti a reagensek diffúzióját. A víz jelenléte befolyásolja az enzim szerkezetét, és ezáltal az aktivitását is, a nem-kovalens kötéseken és a H-kötések bomlásán keresztül. Az enzimaktivitás jelentősen függ a reakció közegben jelenlevő víz mennyiségétől, az enzim aktivitásához alapvetően szükséges a hidratáltság, a víz teljes hiánya mellett az enzimek inaktívvá válnak

[124]

. Ha a víztartalom meghaladja az optimális értéket, szintén negatív

hatású lehet. Tehát a szuperkritikus fluidumokban a nyomás és a hőmérséklet mellett a víztartalom helyes beállítása is rendkívül fontos paraméter az enzimek megfelelő működéséhez. Marty és munkatársai különböző vízkoncentráció mellett vizsgálták a Lipozim enzimmel végzett reakció után visszamaradó enzimaktivitást, és azt találták, hogy az enzim irreverzibilisen denaturálódik túlzott vízfelesleg esetén. Azt feltételezték, hogy amikor nagy mennyiségű vizet adunk a rendszerhez, olyankor a víz adszorbeálódik az enzim felületén, és az enzim teljesen telítődik több réteg vízzel. Ez a jelenség okozza az aktivitás csökkenést, mivel a 31

vízrétegek akadályozzák az anyagtranszportot az enzim felülete és a reakció közeg között [125]

. Bizonyos mennyiségű vízre azonban szükség van, hogy az enzim megőrizze a H-

kötésekkel biztosított aktív konformációját. Az enzimek alakja változhat az enzimen kívül és belül a víz molekulák által kialakított H-kötések mennyiségének megfelelően

[126]

. Az

enzimet körülvevő mikrovízréteg és a reaktánsok polaritásától függően is másként viselkedhet az enzim. Míg az enzim körüli mikrovízréteg felelős az enzimaktivitásért, addig a vízréteg bármely fizikai tulajdonságának változása (pH, vastagság, oldóképesség) hatással lehet a reakció lefutására. A túlzott vízkoncentráció hozzájárul az enzim termostabilitásának csökkenéséhez. A víz növeli a fehérje molekulák mobilitását és fokozza a széttekeredést. A víz jelenléte a diszulfid hidak bomlását és átrendeződését, az aszparagin és a glutamin deaminálódását, valamint a peptid kötések hidrolízisét okozhatja [118]. Emiatt sok esetben az enzimek stabilitása sokkal nagyobb nem vizes közegben, mint vizes oldatban. A megfelelő víztartalmat az adott hőmérséklethez kell beállítani. Bár különböző becslések vannak a megfelelő aktivitáshoz szükséges hidratáltsági fokra, azonban az általánosan elfogadott érték kb. 0,2 g víz / g enzim, vagyis 20 m/m %, amely a natív, rögzítetlen enzimre vonatkozik

[127, 128]

. Bár szerves oldószerekben is szükséges valamilyen

mértékű vízkoncentráció, azonban a minimális mennyiség sokszor meglepően alacsony, vízmentes oldószerben (< 0,02 V/V %) is képesek magas aktivitásra

[129-132] ] [129, 130, 131, 132

. Az optimális

aktivitás eléréséhez enzimenként és reakciónként különböző lehet a vízigény is.

1.4.3

Enzimes reakciók scCO2-ban A scCO2-ban végzett enzimes reakciók gyakorlatilag enzimes hidrolízisre valamint

enzimes szintézisre bonthatók. A scCO2 reakcióközegként történő felhasználásának egyik fontos területe a növényi olajok enzimes hidrolízise. Az esszenciális zsírsavak táplálkozási szempontból nagyon fontosak, mivel az emberi szervezet nem képes előállítani azokat. Az ehhez szükséges kiindulási anyagok, a növényi olajok scCO2-dal jól extrahálhatók így lehetőség nyílhat folyamatos rendszerben kapcsolt extrakció-reakció megvalósítására is. A továbbiakban bemutatok néhány érdekes, a dolgozatom szempontjából fontos eredményt, különös tekintettel a folyamatos technológiára. ScCO2-ban napraforgóolaj lipáz (Aspergillus niger) katalizált hidrolízisét két különböző típusú nagynyomású reaktorban is elvégezték, egy kevert tartály reaktorban

[133]

, majd az

optimalizált eredményekre (maximális enzimaktivitás 20 MPa nyomáson és 50 °C hőmérsékleten) alapozva folyamatos membrán reaktorban

[134]

. A reakciósebesség mindkét

esetben nagyobb volt, mint hagyományos oldószerben végzett reakciók esetén. A nagyobb 32

konverziót a kevert tartály reaktorban kapták 48 h után, azonban a folyamatos reaktorban mindössze 1 h után elérték a maximális konverziót. A folyamatos rendszer esetén optimálták a szubsztrát térfogatáramát (0,1 dm3/min (Vre: 0,045 dm3)) is, valamint a reagensek egymáshoz viszonyított arányát (1:1 szubsztrát:víz arány). Sovová és Zarevúcka

[135-137] [135,

136,

137]

feketeribizli olaj és feketeribizlimag-olaj hidrolízise során a konverziót vizsgálták a nyomás, a hőmérséklet, a CO2 térfogatárama és víztartalma, valamint a reaktorban az enzim töltés és eloszlás függvényében. A biokatalízishez makropórusos anionos gyantán rögzített Mucor miehei eredetű lipázt használtak. A reakciót folyamatos reaktorban 10-28 MPa nyomáson, 30-

50 °C hőmérsékleten 55-100 %-os víz telítettség mellett végezték. A lipáz aktivitása magas volt és hosszú időn keresztül sem tapasztaltak csökkenést. A vizsgált tartományban a nyomás és a hőmérséklet hatása nem volt jelentős, azonban 50 °C fölötti hőmérsékleten aktivitás csökkenést tapasztaltak. A CO2 víztelítettségének hatása szinte elhanyagolható volt az eredményekre nézve. A víz enzimekre gyakorolt hatása ismeretében ez egy kissé meglepő tapasztalat, de ez feltételezhetően annak a következménye, hogy ennek az enzimnek ebben a vízkoncentráció-tartományban nem változik a szerkezete. Ha víztartalomról beszélünk enzimes reakciók esetén, akkor a rendszerbe bevitt vízen kívül fontos paraméter az enzim saját víztartalma is. Hampson és Foglia rögzített CAL-B ágyon keresztül áramoltatott scCO2ban, 60 °C hőmérsékleten és 27,5 MPa nyomáson vizsgálták a tripalmitin palmitinsavvá alakulásának konverzióját és az enzim víztartalmának fontosságát az enzimaktivitás szempontjából. Megfigyelték, hogy a CO2 térfogatáramának megfelelően az enzim vízrétegéből a scCO2-os fázisba beoldódik a víz, így az enzim ágy folyamatosan veszít a víztartalmából. Az optimális enzim víztartalmat 23,5 m/m %-ra becsülték, ennél a beállításnál hosszú ideig közel állandó produktivitással katalizál az enzim [138]. Az összekötött extrakció – reakció típusú eljárás kifejlesztéséhez modellreakcióként Rezaei és Temelli kanola olaj Lipozim (Mucor miehei eredetű) katalizálta hidrolízisét tanulmányozták (10-38 MPa, 3555 °C és a CO2 térfogatáram: 1,0-3,7 dm3/min), ahol a zsírsavat olajas magvakból extrahálták, majd alakították át scCO2 felhasználásával. Ilyen technológiánál a nyomás és a hőmérséklet mellett a térfogatáram hatása befolyásolja mind az extrakció sebességét, mind pedig az enzim számára biztosított tartózkodási időt, így jelentős hatása lehet a konverzióra valamint a termékek enantiomertisztaságára. Maximális 63-67 %-os konverziót 24-38 MPa nyomáson, 55 °C hőmérsékleten értek el és a térfogatáram 3,7 dm3/min (Vre: 0,02 dm3) volt. A konverzió további növelése az enzim/szubsztrát arány növelésével lehetséges, vagy alacsonyabb térfogatárammal csökkenthető az extrahált olaj mennyisége [139]. A hidrolizáláson kívül az lipázok nem csak zsírok, lipidek, hanem egyéb szubsztrátok, például zsírsavak, alkoholok átalakítására is képesek észterezésen keresztül, sőt alkalmazásuk jelentős részét ez a terület adja. Jelentősége abban rejlik, hogy egyrészről lehetővé teszi az egyik enantiomer átalakításával a reszolválást, másrészről az alkoholok acilezése azért is 33

fontos feladat mivel hasznos és hatékony védelmi protokollt jelent többlépéses szintetikus folyamatokban. Ezeknél a reakcióknál az általánosan vizsgált paramétereken kívül fontos még a reagens helyes megválasztása, amely nem feltétlenül azonos az adott reakcióhoz szerves oldószerben megfelelő donor vegyülettel. Összegezve néhány fontosabb enzimes szintézist mutatok be példaként a 2. táblázatban, amelyben szembetűnő, hogy akár ugyanaz az enzim két különböző reakciót jelentősen eltérő paraméterek mellett is katalizálhat jó hatásfokkal, valamint ezek a paraméterek befolyásolhatják a keletkezett termék enantiomertisztaságát is. Ezért is fontos az egyes reakciók, vegyületek egyedi beállításainak maghatározása. Ugyan a korábbi tapasztalatok alapján becsülhető a várható optimális hőmérséklet, nyomás, valamint vízkoncentráció-tartomány, de a technológia továbbfejlesztéséhez és az esetleges ipari megvalósításhoz ez az ismeret elengedhetetlen fontosságú. Számos további példa van az irodalomban a biokatalitikus szintézisekre, azonban közülük csak keveset optimáltak bioreaktorban a nagyléptékű előállítás fontossága ellenére

[140-142] [140, 141, 142]

. Ipari megvalósítások a

titoktartási szerződések miatt még többnyire nem ismertek.

34

2. táblázat Enzimkatalizált szintézisek scCO 2 -ban

Szubsztrát

Reagens

Enzim

P

T

Eredmények

izoamil-alkohol

ecetsav-anhidrid

CAL-B

8-30 MPa

40 °C

szakaszos és folyamatos reaktorban, a Pnak nincs hatása a vizsgált tartományban

1-butanol

vinil-butanoát

CAL-B

8 MPa

60 °C

szakaszos és folyamatos, hozzáadott víz nélkül a legnagyobb az enzimaktivitás

monoterpének

ecetsav

CAL-B

10 MPa

60 °C

szakaszos reaktorban, P hatása elhanyagolható, további T növelés E csökkenését okozza

mentol

izopropenil-acetát

észteráz EP-10

10 MPa

50 °C

szakaszos reaktorban, hozzáadott víz nélkül a legnagyobb az enzimaktivitás

1-hexanol

butil-acetát

Novozym 435

10 MPa

35 °C

szakaszos reaktorban, telítési koncentrációig nincs hatása a víznek, fölötte aktivitás csökkenést okoz

ibuprofén

vinil-acetát

Novozym 435

15 MPa

90 °C

szakaszos reaktorban, csak részlegesen szelektív a reakció

1-feniletanol

vinil-acetát

Novozym 435

15 MPa

95 °C

szakaszos reaktorban, a termék ee hőmérséklet független tág tartományban (< 130 °C)

palmitinsav

etanol

Novozym 435

8 MPa

55 °C

szakaszos reaktorban

Hivatkozás [143]

[144]

[145]

[146]

[147]

[148]

[148]

[149]

35

1.5

A vizsgált vegyületek

1.5.1

A 4-fenilazetidin-2-on A β-laktám gyűrű egy heterociklusos gyűrű, amely három szén és egy nitrogén atomot

tartalmaz, valójában egy ciklikus amid (12. ábra). O NH

12. ábra A (rac)-4-fenilazetidin-2-on szerkezeti képlete

A β-laktám vegyületeket és β-aminosav származékait a vegyipar számos területén (peptid-, kombinatorikus-, heterociklusos-, alkaloidkémia) előszeretettel alkalmazzák. A βlaktám származékok a jól ismert penicillin és cephalosporin antibiotikumok alapvázai de egyéb számos biológiailag fontos hatással is rendelkeznek. A baktériumok gyorsan kialakuló rezisztenciája, az erősebb antibiotikumok és a hatékonyabb β-laktamáz inhibitorok iránti igény újabb és újabb származékok előállítására sarkallja a kutatókat, amelyek alapját az enantiomertiszta intermedier és kiindulási laktám vegyületek adják. Néhányuk antibakteriális aktivitást mutat, néhány β-fenilalanin (Phe)

[150]

és β-laktám származék

[151]

ígéretes

rákellenes, gyulladáscsökkentő, antivirális, fájdalomcsillapító vagy plazma koleszterinszint csökkentő [152] hatású. A 4-fenilazetidin-2-on (LAK) (CAS szám: 5661-55-2) vegyület és származékainak enzimes reszolválását már vizsgálták hagyományos szerves oldószerekben. Li és munkatársai [153]

aceton-víz elegyben N-hidroximetilezett β-laktám származékok kemoenzimatikus kettős

reszolválását végezte Burkholderia cepacia lipáz jelenlétében. Nagy optikai tisztaságú (ee > 99 %) fluorozott illetve nem-fluorozott LAK-ot állítottak elő. Nagai és munkatársai [154] N-aciloximetil β-laktám származékok szerves oldószerben végzett lipáz katalizált hidrolízisét és átészterezési reakcióját vizsgálták, a termékek kiváló enantiomertisztasággal keletkeztek. Két lépéses lipáz B típusú enzimmel enantioszelektív hidrolízisen keresztül állítottak elő LAK-ot

[155]

. Forró és munkatársai

[156]

a LAK CAL-B katalizált enantioszelektív

gyűrűnyitási reakciójával optikailag tiszta (ee > 99 %) (R)-Phe-t állítottak elő. Ezenkívül további LAK származékok lipáz katalizált hidrolízisét végezték tetrahidrofuránban kiváló konverzióval (X > 49,9 %) és 98 % feletti enantiomertisztasággal [157].

36

A transz-2-hidroxiciklohexánkarbonitril

1.5.2

A transz-2-hidroxiciklohexánkarbonitril (CCH) (CAS szám: 63301-31-5) és származék enantiomerei egy bíztató androgén receptor antagonista gyógyszer intermedierei (13. ábra) [158-160]

[158, 159, 160

. CN *

OH *

13. ábra A (rac)-transz-2-hidroxiciklohexánkarbonitril szerkezeti képlete

A transz-CCH-t már több módon, különböző oldószerekben sikeresen reszolválták enzimkatalízissel. Höenig és munkatársai

[161]

metanolban 2 lépéses reakcióval állították elő

az (1S,2R)-CCH enantiomert. Az első lépésben vajsavanhidriddel kémiai úton kapott butanoil-CCH

köztiterméket

Pseudomonas

fluorescens

hidrolizálva kapjuk az egyik enantiomert. Forró és munkatársai

lipázzal [162]

enantioszelektíven

diizopropil-éterben vinil-

acetáttal (VA) Pseudomonas cepacia eredetű lipáz katalizált direkt acilezéssel reszolválták mind a cisz-, mind a transz-CCH enantiomereket az elméletileg elérhető maximális konverzióval (50 %) és kitűnő termék enantiomertisztasággal (ee > 99 %). Lourenço és munkatársai

[163]

ionos folyadékban CAL-B-vel reszolválták a CCH-t, 100 torr (13,3 kPa)

nyomáson és 35 °C hőmérsékleten, 4 nap után az (1R,2S)-CCH esetében 70 %-os hozamot és 29 %-os ee-t, míg az (1S,2R) izomer esetében pedig 25 %-os hozamot és 96 %-os termék ee-t értek el.

1.5.3

A transz-1,2-ciklohexándiol A ciklohexán vicinális diolja két kiralitás centrumot tartalmaz, így a lehetséges

diasztereomerek száma 4 (14. ábra). Az (1R,2R) és (1S,2S) konfigurációjú diasztereomereket nevezik transz-1,2-ciklohexándiolnak (CHD) (CAS szám: 1460-57-7). A transz-1,2diasztereomereket és származékaikat aszimmetrikus szintézisekben királis építőelemként, segédanyagként koronaéter

[166]

[164, 165]

, valamint gyógyszerkémiai-, agrokémiai- valamit optikailag aktív

szintézishez használják fel leggyakrabban. (1S,2S)-CHD-lal végezték például

α,α-diszubsztituált

α-aminosav

származékok

aszimmetrikus

szintézisét

[167]

,

illetve

cinnamaldehid foszfonilezése során (1S,2S)-CHD – Ti(OPr)4 komplex-szel 70 % optikai tisztaságot értek el [168].

37

OH *

OH *

14. ábra A (rac)-transz-1,2-ciklohexándiol szerkezeti képlete

(1R,2R)-CHD-t

sikeresen

aszimmetrikus szintézisében

[169]

alkalmazták

tetraszubsztituált

1,4-dioxánszármazékok

valamint (1R,2R)-CHD-ból kiindulva SN2 típusú reakcióval

C2-szimetrikus két kén- illetve két szelénium-leadásra képes és C1 kevert kén és szeléniumleadásra képes ligandumokat készítettek [170]. Elsőként Kawai és munkatársai

[171]

vizsgálták transz-1,2-diacetoxiciklohexándiol

(CHDAc2) Rhizopus nigricans teljes sejtes biokatalizált hidrolízisét, ahol a kapott (R,R)-CHD enantiomertisztasága 50 % volt. Crout és munkatársai

[172]

50 %-os, elméletileg maximális,

konverzióval és 95 %-nál nagyobb enantiomertisztasággal kapták mind az (R,R)-CHD-t, mind az (S,S)-CHDAc2-ot. Később azonban Laumen és munkatársai

[173]

igazolták nagy

mennyiségű racém monoacetát keletkezését preparatív léptékben. További kutatások eredményeképpen 96 % és 97 %-os ee-vel kapták az (R,R)-1-acetoxiciklohexán-2-olt ((R,R)CHDAc) és az (S,S)-CHDAc2-ot

[174]

. A CHDAc2 kinetikus reszolválását megvalósították

Pseudomonas cepacia lipázzal is, így 99 % fölötti ee-vel kapták az (R,R)-CHD-t és az (S,S)-

CHDAc2-ot

[175]

. Naemura és munkatársai

[176 - 178] 178] [176,

177,

di-izopropiléterben vizsgálták, hogy

különböző lipázokkal katalizált acilezés során melyik a gyorsabban reagáló enantiomer a két transz izomer közül, és minden esetben azt találták, hogy az (R,R) enantiomer a reaktívabb.

Bortoliniék

[179]

vicinális diolok, így a CHD Bacillus stearothermophilus eredetű diacetil

reduktáz katalizált kinetikus reszolválását vizsgálták. Jó szelektivitással (ee > 99 %) kapták a megfelelő α-hidroxi-ketont minden esetben, azonban transz-CHD esetében 88 %-os termék hozam mellett. Bódai és munkatársai

[180]

számos transz-cikloalkán-1,2-diol enantioszelektív

kinetikus reszolválását vizsgálták. Lipáz AK enzimmel maximális konverzió (50 %) mellett 97 és 99 % fölötti ee-vel kapták az (S,S)-CHDAc-ot és az (R,R)-CHDAc2-ot. Detry és munkatársai

[181]

Bacillus subtilis A és B lipázokkal végezték a CHDAc2 enantioszelektív

hidrolízisét. Azt találták, hogy mindkét vizsgált lipáz rendkívül szelektív az (R,R) enantiomerre. Preparatív léptékben is 99 % fölötti ee értékkel kinyerhető volt mindkét enantiomer. A felsorolt három vegyület a LAK, a CCH és a CHD kinetikus reszolválása szakaszos reaktorban, szerves oldószerekben és/vagy ionos folyadékban jól ismert, kidolgozott eljárás. Azonban egyik vegyület enzimes kinetikus reszolválása sem ismert scCO2-ban. Mivel ez nem 38

egy atmoszférikus nyomáson végzett technológia, ezért a hagyományos oldószerek esetén vizsgált műveleti paramétereken (hőmérséklet, szubsztrát koncentráció, vízaktivitás) kívül a nyomás is fontos szerepet kap.

1.5.4

Az 1-feniletanol Az 1-feniletanol (PE) (CAS: 98-85-1) az egyik legegyszerűbb szekunder alkohol, kiváló

modell vegyület (15. ábra).

H3C

*

OH

15. ábra A (rac)-1-feniletanol szerkezeti képlete

Az optikailag aktív 1-PE-t királis építőelemként, szintetikus intermedierként a finomkémia, a gyógyszer- és növényvédőszeripar területén hasznosítják

[182 - 188] [182,

183,

184,

185,

186,

187,

. Mindkét

188]

enantiomer alkalmas lehet kémiai analízisek elvégzéséhez, királis reagensként az enantiomertisztaság meghatározására gyűrűnyitására

[189]

, valamint ciklikus anhidridek és epoxidok

[190-192]

[190, 191, 192]

. Az optikailag tiszta (R)-1-PE-t széles körben alkalmazza a kozmetikai

ipar illatanyagként, mivel enyhe virágillata van egyik összetevőjeként

[193]

. Használják még szolvatokróm festékek

[194]

, szemvédőszerként valamint koleszterin-csökkentőként, mivel

gátolja a bélben a koleszterin felszívódását [195]. A rac-1-PE vegyület enzimkatalizált kinetikus reszolválása, általában acilezésen keresztül, szinte az egyik legtöbbet vizsgált modell reakció. Tanulmányok készültek műveleti paraméter optimalizálásra különböző oldószerekben, így szerves oldószerben folyadékban

[197, 198]

és szuperkritikus közegben

továbbá reaktormodellezést

[199]

[148]

[196]

, ionos

is, szakaszos és folyamatos készülékben,

is végeztek már a kapott eredmények alapján. Hatékony,

melléktermékképzés-mentes dinamikus-kinetikus reszolválási eljárást azonban még nem sikerült megvalósítani.

39

2

Kísérleti rész

2.1

Anyagok és módszerek

2.1.1

Felhasznált anyagok

3. táblázat Felhasznált anyagok

Anyag CAL-B PS-CI

a

Halmazállapot

Tisztaság

Előállító/Szállító

szilárd

-

Sigma-Aldrich Kft.

b

szilárd

-

Sigma-Aldrich Kft.

c

szilárd

-

PS-IM

Sigma-Aldrich Kft. d

Sigma-Aldrich Kft.

transz-1,2-CHD

szilárd

96 %

rac-1-PE

folyadék

98 %

Sigma-Aldrich Kft.

(S)-(-)-1-PE

folyadék

99,5 %

Sigma-Aldrich Kft.

metanol (MeOH)

folyadék

99,99 %

Sigma-Aldrich Kft.

vinil-acetát (VA)

folyadék

99 %

Sigma-Aldrich Kft.

egyéb oldószerek

folyadék

> 99 %

Molar Chemicals Kft.

LAK

szilárd

99,5 %

Szegedi Tudományegyetem

CCH

szilárd

98 %

Szegedi Tudományegyetem

CO2

gáz

99,5 %

Linde Gáz Mo. Zrt.

BASF Pd/G1-21

szilárd

-

BASF catalyst Llc.

BASF Pd/K3-10

szilárd

-

BASF catalyst Llc.

BASF Pd/R1-10

szilárd

-

BASF catalyst Llc.

BASF Pd/R3-11

szilárd

-

BASF catalyst Llc.

Pd/C

szilárd

-

BASF catalyst Llc.

Pd

szilárd

-

BASF catalyst Llc.

VOSO4 · xH2O

szilárd

97 %

Sigma-Aldrich Kft.

e

szilárd

96 %

Sigma-Aldrich Kft.

f

szilárd

-

Sigma-Aldrich Kft.

CoCl2 · 6H2O

szilárd

-

Reanal Rt.

Benzolszulfonsav

szilárd

-

Merck Kft.

Nafion NR-50

szilárd

-

Sigma-Aldrich Kft.

Nafion SAC 13

szilárd

-

Sigma-Aldrich Kft.

Zeolit

szilárd

99,9 %

Zeolyst International

KIPRu(II) KPRu(II)

a

makropórusos gyantán rögzített genetikailag módosított Aspergillus niger szubmerz fermentációjával előállított Candida antarctica lipáz B (≥ 10 000 U/g) (rendelési kód: L4777), a továbbiakban az immobilizált enzimkészítményeket csak röviden enzimként fogom nevezni, így bemérések esetén is a hordozó és az enzim tömegét vettem enzim tömegnek. b kerámia gyöngyön rögzített Pseudomonas cepacia eredetű „Amano” lipáz (≥ 30 000 U/g) (rendelési kód: 534897, már nem forgalmazzák) c kovaföldön rögzített Pseudomonas cepacia eredetű „Amano” lipáz (≥ 500 U/g) (rendelési kód: 709603) d felhasználás előtt scCO2-os extrakcióval tisztítva GC-MS alapján > 99,8 % tisztaságú e KIPRu(II): Klorodikarbonil(1-(izopropilamino)-2,3,4,5-pentafenilciklopentadienil)ruténium(II) f KPRu(II): Klorodikarbonil(1,2,3,4,5-pentafenilciklopentadienil)ruténium(II)

40

2.1.2

Szakaszos reaktor A szakaszos üzemű kinetikus reszolválási kísérleteket a 16. ábrán látható nagynyomású

autoklávban (Pmax: 25 MPa, Tmax: 100 °C, Vhasznos: 30 ml) végeztem, amely valójában egy kevert tartályreaktor.

16. ábra A nagynyomású tartályreaktor vázlata 1. CO2 puffertartály, 2. nagynyomású szivattyú, 3. CO2 bevezető szelep, 4. mágneses keverő mag, 5. manométer, 6 hasadótárcsa 7. hőmérő, 8. szűrő, 9. leeresztő szelep, 10. minta, 11. termosztát, 12. mágneses keverő

Az enzim, a szubsztrát és a reagens beadagolása után a cella lezárását követően a már a megfelelő hőmérsékletre termosztált reaktort az (1) CO2 puffertartályból (a CO2 palackban jelen lévő egyensúlyi gőz-folyadék elegyből a gőz fázisból elvett CO2-ot egy kondenzátorban lekondenzáltattam, majd így az egyszeri desztillációs lépést követően az állandó víztartalmú folyadék CO2-ot a puffertartályban tároltam) a (2) nagynyomású szivattyún át a (3) bevezető szelepen keresztül a kívánt nyomásra töltöttem fel folyadék CO2-dal, amely a reaktor hőmérsékletén már szuperkritikus állapotba került. Amennyiben a víz hatását is vizsgáltam, a (3) szelep előtt egy szilikagéllel töltött oszlopot is bekötöttem, ami az átvezetett CO2 víztartalmát megkötötte. A beadagolt anyagok megfelelő keveredését és érintkeztetését egy szabályozható fordulatszámú mágneses keverő (12) biztosította. A reakció követése vagy szelektív termék kioldás céljából a reaktor üzemeltethető folyamatos kevert tartály reaktorként is, vagyis a leeresztéssel egy időben az állandó nyomás biztosításához CO2-ot áramoltattam át (tömegáram: ~ 0,30-0,50 g/min) a reaktoron. A CO2 pontos mennyiségét a szivattyú dugattyújának térfogatváltozásából, illetve az adott nyomás és hőmérséklet értékekhez tartozó sűrűséggel számoltam a 22. egyenlet szerint:

41

mCO2 = VCO2 ⋅ ρCO2

(22)

, ahol mCO2 az átáramlott CO2 tömege, VCO2 a szivattyú térfogatváltozása, ρ CO2 a CO2 sűrűsége az adott nyomáson és hőmérsékleten. A megfelelő keveredés biztosítására a CO2-ot a reaktor aljára vezettem be, míg az elvétel a felső homogén fázisból történt a (7) szűrővel ellátott leeresztő szelepen keresztül. A mintavételek esetén adott időközönként előre meghatározott mennyiségű (ált. 2-2,5 ml) CO2dal mostam a rendszert. Feltételezve, hogy a reaktorban homogén elegy van jelen, a levett minta összetétele megegyezik a reaktorban található elegy összetételével. A termék elválasztás esetében a teljes reaktor térfogat 2-3-szoros mennyiségének megfelelő (60-90 ml) CO2-dal mostam a rendszert. A mérés végeztével a reaktort minden esetben a (7) leeresztő szelepen keresztül nyomásmentesítettem, majd a benne maradt anyagokat kimostam a megfelelő oldószerrel.

2.1.3

Folyamatos reaktor Folyamatos rendszerben kinetikus reszolválást a CHD és a PE vegyületekkel, míg

dinamikus-kinetikus reszolválást kizárólag a PE vegyülettel végeztem. A készülék felépítése mindegyik esetben hasonló volt, a 17. ábrán látható elrendezés a CHD folyamatos kinetikus reszolválására lett tervezve.

17. ábra Folyamatos üzemű reaktor vázlata 1. CO2 puffertartály, 2. Jasco PU-2080-CO2 szivattyú, 3. CO2 bevezető szelep, 4. visszacsapó szelep, 5. szűrő, 6. előmelegítő csőkígyó, 7. szubsztrát extraktor oszlop, 8. statikus keverővel ellátott T-elágazás, 9. enzimreaktor oszlop, 10. hőmérő, 11. manométer, 12. leeresztő szelep, 13. minta, 14. visszacsapó szelep, 15. bevezető szelep, 16. manométer, 17. HPLC pumpa, 18. szubsztrát, 19. termosztált vízfürdő

42

Az elrendezés alapelve, hogy a scCO2-os fázist és a szubsztrát fázist egymással szemben vezetjük be és elegyítjük a reakció előtt. A CO2 az (1) CO2 puffertartály (egyszeri desztilláció után kapott állandó víztartalmú CO2) a (2) hűtővel felszerelt CO2 szivattyún, a (3) bevezető és (4) visszacsapó szelepeken át eljut a már termosztált csőkígyóig, ahol szuperkritikus fázisba kerül. A CHD kinetikus reszolválása során, mivel a CHD szilárd, de scCO2-ban oldódó vegyület, a (7) oszlopba töltött CHD szubsztrátot a CO2 kioldja, és továbbhaladva a keverős T-csatlakozóban találkozik és keveredik az acilezőszerrel, amely a (18) tárolóból a (17) HPLC pumpa segítségével a (15) bevezető és (14) visszacsapó szelepeken keresztül érkezik. A PE kinetikus reszolválása esetén mindössze annyi a változás, hogy mindkét szubsztrát (PE, VA) folyadék halmazállapotú, így a (18) tárolóban már homogén elegyként együtt vannak jelen, a (7) szubsztrát oszlopra pedig nincsen szükség. A homogén scCO2-szubsztrát keverék ezután a (9) immobilizált enzimmel töltött reaktorba jut, ahol a mérési beállításoknak megfelelő mértékben végbemegy a reakció. A dinamikuskinetikus reszolválás esetén a korábbiakhoz képest annyiban módosul az elrendezés, hogy a (9) oszlopba nem pusztán az enzim, hanem a racemizálásért felelős, az enzimtől fizikailag szeparált kémiai katalizátor is jelen van. A tartózkodási időt elsősorban a CO2 térfogatáramával lehet szabályozni. A termékek a (12) szelepen keresztül nyomásmentesítés után összegyűjthetők a (13) mintaszedőben.

2.1.4

Analitikai módszerek

2.1.4.1 Királis állófázisú gázkromatográfia (GC) A minták GC elemzését Thermo Finnigan Focus GC (Thermo Fischer Scientific, Waltham, Massachusets, USA) és Varian GC (Varian Inc., Palo Alto, California, USA) FID detektorral ellátott készülékekkel végeztem. A vizsgált enantiomerek elválasztására két típusú királis kolonnát használtam: Supelco Beta DexTM 120 FS oszlopot (30 m × 0,25 mm × 0,25 µm) és Chrompack Chirasil-L-Val oszlopot (20 m × 0,25 mm × 0,25 µm ). A vivőgáz minden

esetben 140 kPa nyomású hélium (99,99 %) vagy nitrogén (99,99 %) volt. Az alkalmazott hőmérséklet program vegyületenként változott.

2.1.4.1.1 4-Fenilazetidin-2-on

Supelco Beta DexTM 120 FS oszlopon (vivőgáz: hélium), a kezdeti 1 perces 120 °C-os izoterm szakaszt követően 160 °C-ra emelkedett (30 °C/min) a kemence hőmérséklet, majd 10 perces izoterm szakasz következett, ezután a második lépcső (10 °C/min) végén elérve a 180 °C-os véghőmérsékletet egy 17 perces izoterm szakasszal fejeződött be a program. A teljes futási idő 31,33 perc volt (retenciós idők (perc): (R)-LAK: 27,29; (S)-LAK: 28,83). 43

2.1.4.1.2 Fenilalanin

A Phe enantiomerek, Chrompack Chirasil-L-Val oszlopon (vivőgáz: nitrogén) kétlépéses

származékképzés

((i)

diazometánnal

(CH2N2,

(ii)

ecetsavanhidriddel

4-dimetilaminopiridin és piridin jelenlétében) után elválaszthatók voltak. A 10 perces 100 °Cos kezdeti izoterm szakaszt egy 150 °C-ra történő hőmérséklet-emelés (10 °C/min) követte. A teljes futási idő 25 perc volt (retenciós idők (perc): (R)-Phe: 23,16; (S)-Phe: 23,65). A minták jelentős részét a Szegedi Tudományegyetem Gyógyszerkémia Intézetében elemezték.

2.1.4.1.3 Transz-2-hidroxiciklohexánkarbonitril

és

transz-2-acetoxiciklohexánkarbonitril

(CCHAc)

Supelco Beta DexTM 120 FS oszlopon a 13,5 perces 130 °C-os kezdeti izoterm szakasz után felfűtéssel (10 °C/min) értem el a 180 °C-os véghőmérsékletet, amelyet további 1 percen át tartottam. A teljes futási idő 19,5 perc volt (retenciós idők (perc): CCHAc: 16,73, (1R,2S)CCH: 17,94 (1S,2R)-CCH: 18,07) (a CCHAc-ot NaHCO3-os metanolízissel kvantitatíve deacileztem)).

2.1.4.1.4 Transz-1,2-ciklohexándiol,

transz-1-acetoxiciklohexán-2-ol

és

transz-1,2-

diacetoxiciklohexán

Supelco Beta DexTM 120 FS oszlopon (vivőgáz: hélium) a kezdeti 0,5 perces 80 °C-os izoterm szakaszt követően hőmérséklet növeléssel (3 °C/min) elértem a 115 °C-ot, ezután 1 perces izoterm szakasz következett, majd további hőmérséklet-emeléssel (25 °C/min) elértem a végső 200 °C-os hőmérsékletet, amelyet további 2 percig tartottam. A teljes futási idő 18,57 perc volt (retenciós idők (perc): (1S,2S)-CHD: 16,91, (1R,2R)-CHD: 17,00, (1S,2S)-CHDAc: 17,10, (1R,2R)-CHDAc: 17,16, (1S,2S)-CHDAc2: 17,49, (1R,2R)-CHDAc2: 17,55).

2.1.4.1.5 1-Feniletanol, (1-feniletil)-acetát (PEAc)

A rutin eljárás során Supelco Beta DexTM 120 FS oszlopon (vivőgáz: hélium) 1 perces 70 °C-os kezdeti izoterm szakaszt követően 180 °C-ig felfűtöttem (20 °C/min), majd 2 perces hőmérséklettartás követte. Amennyiben a melléktermékek keletkezését is figyelemmel akartam kísérni, a 180 °C-os izoterm szakasz után felfűtéssel (25 °C/min) elértem a 200 °C-ot és további 4 percig tartottam. A teljes futási idő 13,30 perc volt (retenciós idők (perc): RPEAc: 6,53, S-PEAc: 6,66, R-PE: 7,28, S-PE: 7,35, melléktermékek (feniletiléter dimer diasztereomerek): (R,S)-PE2: 12,24, (S,S)-PE2: 12,66). 44

A melléktermékek azonosítását GC-MS módszerrel végeztem Dr. Vida László segítségével. A GC-MS készülékben Zebron ZB-5m (30 m × 0,25 mm × 0,25 µm) kolonnán a kemence hőmérséklete a következőképpen lett beállítva: 2 perces 45 °C-os kezdeti izoterm szakaszt követően felfűtéssel (10 °C/min) elértük a 300 °C-ot, majd további felfűtéssel (25 °C/min) a 350 °C-os véghőmérsékletet. A teljes futási idő 29,5 perc volt (retenciós idők (perc): PE: 9,33, PEAc: 11,42, melléktermékek (feniletiléter dimer diasztereomerek): (S,S)PE2: 17,10, (R,S)-PE2: 17,32). Az MS spektrum alapján a termékek szerkezetét a Lucy Version 3.10 szoftver a Nistasci adatbázisból határozta meg.

2.1.4.2 NMR A preparált enantiomertiszta vegyületek (oldószer: deuterokloroform (CDCl3)) NMR spektrumát Bruker DRX 500 (1H : 20 ppm spektrumszélesség (sweep width) 20 ppm, pulzusszög 30 °, repetíciós idő 4,6 s, digitális felbontás 0,3 Hz/pont;

13

C: 270 pp

spektrumszélesség, pulzusszög 30 °, repetíciós idő 2,8 s, digitális felbontás 0,6 Hz/pont) készülékkel vette fel Dr. Szőllősy Áron.

2.1.4.3 Optikai forgatóképesség mérés A preparált enantiomertiszta minták optikai forgatóképességét Perkin-Elemer 241 polariméterrel határoztam meg, a Na D-vonalára (λ=589 nm) vonatkoztatva.

2.1.4.4 Víztartalom mérés A vásárolt CAL-B enzimkészítmény víztartalmát Karl-Fischer titrálással mértem meg analóg pontenciometriás módszerrel.

2.1.4.5 Opálosodási pont mérés Az egyes vegyületek oldhatósági profilját scCO2-ban egy változtatható térfogatú nyomásálló cellában (New Ways of Analytics Messgeräte GmbH, Lörrach, BadenWürttemberg,

Germany)

különböző

ismert

bemérési

koncentrációknál

különböző

hőmérsékleten mért opálosodási nyomások alapján határoztam meg.

45

Számítási módszerek

2.1.5

Az alábbiakban bemutatom a kísérleti munkám során a számításaimhoz használt összefüggéseket. A konverziót 23. egyenlet [51] segítségével számítottam: X =

cs0 − cst

(23)

c s0

, ahol cs0 és cst a szubsztrát kiindulási és t reakció idő utáni koncentrációja M-ban, amelyet kalibrációra alapozva a GC kromatogramok csúcsterületeiből számítottam. A hozamot a 24. egyenlettel definiáltam: Yp =

cp

(24)

c pelm

, ahol cp a termék vegyület adott enantiomerének a ténylegesen keletkezett koncentrációja, c pelm az a termék koncentráció, amely elméletileg keletkezhetne az adott enantiomerből. Az enantiomertisztaság számításához a 14. egyenletet [50] használtam: ee =

c( + ) − c( − ) c ( + ) + c( − )

, ahol c(+) a (+) irányba forgató enantiomer koncentrációja, c(-) a (-) irányba forgató enantiomer koncentrációja. Alapvetően az enzimes reakciók reverzibilisek, azonban ha acilező szerből enolészterek maradnak vissza, mint vinil-acetát esetén, belőlük szerves oldószerben (és szuperkritikus közegben is, kivéve a víz) CAL-B katalízis esetén instabil enolok szabadulnak fel, melyek tautomerizációval ketonná vagy aldehiddé alakulnak, így irreverzibilissé válik a reakció

[200]

. A kísérleteim során vinil-acetátot használtam acilezőszerként és a

vízkoncentráció minden esetben kisebb volt, mint 0,983 mg/ml, így a reakciók jó közelítéssel tekinthetők irreverzibilisnek ezért az enantioszelektivitás meghatározásához az 1.2.4.4.2 fejezetben ismertetett számítási módszerek közül a 16, 17 és 18. összefüggésekkel

[51, 52]

dolgoztam. Mivel E > 200 esetén már kismértékű eltérés is jelentős változást okoz E értékében, ezért pontos számszerű értéket csak 200-nál kisebb E értéknél adtam meg.

E A (X , ee p ) =

ln(1 − (1 − X ) ⋅ (1 + ee p )) ln(1 − (1 − X ) ⋅ (1 − ee p ))

, ahol X a konverzió, eep pedig a termék enantiomertisztasága. 46

EB (ees , ee p ) =

ln((1 − ees ) /(1 + ees / ee p )) ln((1 + ees ) /(1 + ees / eep ))

, ahol X a konverzió, eep a termék enantiomertisztasága.

EC ( X , ees ) =

ln((1 − X ) ⋅ (1 − ees )) ln((1 − X ) ⋅ (1 + ees ))

, ahol X a konverzió, ees a szubsztrát enantiomertisztasága. A kezdeti reakciósebesség (r0) meghatározásához szükség van a lefutási görbék ábrázolására. Ehhez egylépéses reakciók esetén mindössze az átalakult szubsztrát vagy a keletkezett termék koncentrációját kell követni az reakció idő függvényében. Azonban többlépéses reakcióknál az enzim egy szubsztrát molekulát több lépésben, vagyis többször alakít át, így az átalakítási lépések számával korrigálni kell az átalakított szubsztrát mennyiséget. A helyes leíráshoz az enzim és a szubsztrát közötti kapcsolódások számát a reakció kezdetétől a t időpillanatig ne-s(t)-vel (mmol) definiáltam, amely egy egylépéses reakció esetében megegyezik a keletkezett termék mennyiségével, természetesen figyelembe véve a sztöchiometriai együtthatókat, többlépéses konszekutív reakciónál azonban az átalakítási lépések számával is súlyozni kell a keletkezett termék mennyiségét. Általános esetben, tehát egylépéses enantioszelektív reakciónál, ahol a reakcióegyenlet s1,0 + s2,0 → s1 + s2 + p1 + p2 (s1,0 és s2,0, a kiindulási enantiomer pár s1 és s2 a visszamaradt enantiomerpár valamint p1 és p2 a keletkezett termék enantiomerek) alakú, ne-s(t)-t az alábbi egyenlettel határoztam meg:

ne−s (t ) = ∑i=1 n pi 2

(25)

, ahol n p i az i-edik keletkezett termékek anyagmennyisége (mmol-ban megadva). Egy kétlépéses konszekutív reakció esetén, ahol a reakcióegyenlet s1,0 + s2,0 → s1 + s2 + p1 + p2 → s1 + s2 + p1 + p2 + q1 + q2 (s1,0 és s2,0, a kiindulási enantiomer pár, s1 és s2 a visszamaradt szubsztrát enantiomerpár, p1 és p2 az első lépésben keletkezett termék enantiomerek, q1 és q2 a második lépésben keletkezett termék enantiomerek) alakú, ne-s(t)-t a következőképpen határoztam meg:

ne−s (t ) = ∑i =1 n pi + 2 ⋅ ∑i=1 nqi 2

2

(26)

, ahol n p i és n qi az első illetve a második reakciólépés során keletkezett termékek anyagmennyisége (mmol-ban megadva). Ezt koncentrációként (ce-s(t), mmol/dm3-ben vagyis mM-ban) megadva a reaktor térfogatára (Vre) vonatkoztatva a 27. egyenlet írja le: 47

c e − s (t ) =

n e − s (t ) Vre

(27)

A szakaszos reaktorban végzett kísérletekből kapott ce-s(t) értéket a reakció idő (tr, percben megadva) függvényében ábrázolva Statistica 10.0 program segítségével illesztett görbe

egyenletéből

(28.

egyenlet)

meghatározható

az

adott

bemérési

szubsztrát

koncentrációhoz (cs (mM)) tartozó reakciósebességi állandóval arányos együtthatóval (κ (1/min)). ce−s (t ) = ce−s (t = ∞) ⋅ (1 − e −κ ⋅t )

(28)

A görbe kezdeti meredekségét a t = 0 pontban vett első deriváltja adja:

ce−s (t ) = ce−s (t = ∞) ⋅ κ = r0 dt t =0

(29)

Az r0-t (mM/min) cs0 (mely a vizsgált esetekben az oldhatósága által nem limitált szubsztrát, a VA volt (cVA)) függvényében ábrázolva a Statistica 10.0 programmal MichaelisMenten típusú görbét illesztettem, amelynek egyenletéből (30. egyenlet) leolvastam a maximális kezdeti reakciósebességet ((rmax (mM/min)).

r0 =

rmax ⋅ cVA K M + cVA

(30)

, ahol KM a Michaelis-konstans. A TON meghatározását a szakaszos és a folyamatos rendszer esetében különbözőképpen végeztem. A 1.2.4.4.2 fejezetben ismertetett lehetőségek közül számításaim során a szakaszos rendszer esetén Uludag-Demirer definícióját Liese

[49]

[48]

vettem alapul, míg folyamatos rendszerben

egyenlete alapján számoltam. Azonban, mivel mértékegység alapján és értelmezés

alapján a TOF felelt meg a szakaszos esetben kiszámított TON-nek, ezért a jó összehasonlíthatóság érdekében az alábbiak szerint számolt eredményeket vetettem össze. Szakaszos üzemben a TON-t a 31. egyenlettel számítottam:

TON =

rmax c e0

(31)

Folyamatos üzemben a TOF-t a 13. egyenletnek megfelelően a 32. egyenlettel határoztam meg: TOF =

n& e − s me

(32)

48

, ahol n&e − s az átlagos látszólagos ne-s áram, tr az a reakció idő, ahol a rendszer állandósult állapotban van. A szakaszos reaktorban a produktivitást a 33. egyenlettel [201] számoltam:

∑

l

Prodsz =

i =1

n pi

(33)

me ⋅ (teq + t holt )

, ahol n pi az i-edik keletkezett termék mennyisége µmol-ban, me a bemért enzim mennyisége g-ban megadva, teq az egyensúlyi idő (ahol X(t) a 99 %-a a végső konverziónak és tholt a szakaszos művelet holtideje percben (takarítás, betöltés, stb. ideje; ~ 120 perc).

A folyamatos reaktorban a produktivitást a 34. egyenlet [201] szerint határoztam meg:

∑

l

Prodf =

i =1

n pi

(34)

me ⋅ ∑ t r

, ahol me a reaktor oszlopba betöltött enzim mennyisége g-ban, tr az állandósult állapotra vonatkozó reakció idő.

2.2 2.2.1

Eredmények értékelése A 4-fenilazetidin-2-on gyűrűnyitási reakciója Doktori munkám során egy β-laktám típusú vegyület, 4-fenilazetidin-2-on CAL-B

katalizált kinetikus reszolválását vizsgáltam. Az enzim a laktámgyűrű felnyitásával és víz addícióval képzi az aminosavat, a Phe-t (18. ábra). Az így keletkezett mindkét termék, különösen enantiomertiszta formában, fontos gyógyszeripari alapanyag, ezért a hőmérséklet és nyomás hatásvizsgálatán, és a működési paraméterek optimálásán kívül, egymástól és az enzimtől történő elválasztásuk is fontos cél volt.

O

O NH

CAL-B

R

H2O

(±)-LAK

O

OH NH2

+

HN

(R)-Phe

S

(S)-LAK

18. ábra A (±)-LAK CAL-B katalizált enantioszelektív gyűrűnyitási reakciója

49

Szakaszos üzemű kinetikus reszolválás vizsgálatához bemértem a 16. ábrán látható reaktorba a (±)-LAK-ot (0,05 g, 0,34 mmol), a CAL-B-t (0,05 g) és amennyiben szükséges volt a desztillált vizet (3 µl, 0,17 mmol (0,5 mólarány (MR))). A kívánt hőmérsékletre termosztált reaktort (40-80 °C) egyszer desztillált CO2-dal feltöltöttem a megfelelő nyomásra (9-21 MPa), majd a reakcióelegyet kevertettem (200 1/min). Egy tipikus kísérlet 22 órán át tartott, amennyiben a reakció időbeli lefutását vizsgáltam, végeztem hosszabb és rövidebb idejű (5-120 h) kísérleteket is. A nyomásmentesítést követően a reaktorban maradt termékszubsztrát-enzim keveréket 3 × 5 ml kloroformmal mostam, majd leszűrtem, így a kapott kloroformos oldat tartalmazta az (S)-LAK-ot. A szűrőben maradt enzimtől az (R)-Phe-t 2 × 10 ml meleg (~ 60 °C) desztillált vizes mosással választottam el. Előkísérletként 10 MPa nyomáson és 60 °C-on tanulmányoztam a gyűrűnyitási reakció időbeli lefutását (19. ábra). Az elméletileg lehetséges maximális konverziót elegendően megközelítő 49,9 %-os konverziót (eeLAK > 99,8 %) 120 h után értem el.

50 45 40

X (%)

35 30 25 20 15 10 5 0 0

22

44

66

88

110

tr (h) 19. ábra A LAK gyűrűnyitási reakciójának időbeli lefutása 0,5 MR H2O, 60 °C

A reakció kezdeti szakaszában (~ 30 h) a lefutási görbe jól közelíthető egyenessel, mivel a bemért LAK szubsztrátot az oldhatóságához (≥ 0,40 mg/ml) képest feleslegben (~ 1,7 mg/ml) mértem be, ezért ebben a tartományban a CO2-os fázis telítve van a szubsztráttal, így állandó a szubsztrát és az enzim koncentráció (aktivitásvesztést nem tapasztaltam). A reakciósebesség ezért állandó. A továbbiakban a mérések során a lineáris 50

szakaszra eső 22 órát választottam reakcióidőnek és az ezalatt az idő alatt kapott X és ee értékeket hasonlítottam össze. Vizsgáltam a keverés szükségességét, ellenőrző kísérletet végeztem keverés nélkül, minden más körülményt változatlanul hagyva. Az eredmény a vártnak megfelelő lett, keverés nélküli esetben a reakció jelentősen lelassult, mivel az enzim felületéről nem valósult meg tökéletesen az anyagtranszport, a szubsztrát molekulák oda, illetve a termék molekulák elszállítása (20. ábra). A keverési sebesség beállítása úgy történt, hogy a keverési Reynoldsszám (Re) a turbulens tartományban legyen, vagyis Re > 10000, azonban ne haladja meg jelentősen, mert az enzimek érzékenyek a nyírásra. Mindkét szempontot figyelembe véve keverési sebességnek 200 1/min-t választottam.

33

35 30

X (%)

25 20 15 10

9

5 0 keverés nélkül

keveréssel

20. ábra A keverés hatása a konverzióra 0,5 MR H2O, 10 MPa, 60 °C, 22 h után

A nyomás és a hőmérséklet nem pusztán a reagensek oldhatóságát és az enzim és a reagensek közötti anyagtranszportot befolyásolja, hanem az enzim aktivitását is, amely jelentősen függ a konformációváltozás révén a két említett paramétertől. Az enzim konformáció változását a vizsgált paraméterek közül a reakciósebesség (ebben az esetben adott idő alatt elért konverzió), valamint az enantioszelektivitás

[53]

jellemzi. Az

enantioszelektivitás és X szempontjából az optimális nyomás – hőmérséklet pár megtalálásához Box-Behnken típusú 32-os teljes kísérletterv (9; 15; 21 MPa, 50; 60; 70 °C) alapján végeztem a méréseket, a centrum pontban 3 ismétléssel.

51

40 35 30 25

X (% )

< 32 < 27 < 22 < 17 < 12 <7

20 15 10 5

70

65

20

18

60

T

16

) (°C 55

14

12

MP P(

a)

50

10

21. ábra A nyomás és hőmérséklet hatása a konverzióra 32-os kísérletterv alapján 0,5 MR H2O, 22 h után

A legjobb eredményt 15 MPa, 70 °C beállítások mellett értem el (X = 38 %, eePhe > 98 %). A kapott mérési pontok statisztikai kiértékelését a Statistica 10.0 szoftver

segítségével végeztem, szignifikáns hatása (0,05 szignifikancia szinten) a P lineáris és négyzetes, valamint a T lineáris tagjának volt, míg a paraméterek közötti kölcsönhatások (P × T, P2 × T, P × T2 és P2 × T2) elhanyagolhatóak voltak. A centrum pontban végzett három ismétlés szórása: R2=0,984 volt. A kiértékelés alapján illesztett felület egyenlete a következő:

X ( P, T ) = −70,4 + 3,72 ⋅ P − 0,134 ⋅ P 2 + 1,15 ⋅ T

(35)

, ahol P MPa-ban, T °C-ban és X %-ban van megadva. Az illesztett felületen (21. ábra) jól látható, hogy a vizsgált tartományban csak a nyomás esetében kaptam maximumot – a felület egyenletének (35. egyenlet) P szerinti első parciális deriváltjából meghatározva – 14 MPa-on, függetlenül a hőmérséklettől. A hőmérséklet növekedésével a konverzió folyamatosan nőtt, azonban az optimális értéke a vizsgált tartományon kívülre esik.

52

40 15 MPa

30

X (%)

9 MPa

20

21 MPa

10

0 30

40

50

60

70

80

90

T (°C) 22. ábra A hőmérséklet részletes hatása a konverzióra 0,5 MR H2O, 22 h után

Mivel a CAL-B enzim tág hőmérséklet tartományban aktív, ezért az optimális hőmérséklet meghatározásához további (alacsonyabb és magasabb) hőmérsékleteken is végeztem méréseket (40; 80 °C) és azt tapasztaltam, hogy az enzim számára minden vizsgált nyomáson ~ 70 °C az optimális, magasabb hőmérsékleten, 80 °C-on kisebb konverzió értéket kaptam (22. ábra). Ez az eredmény eltér az atmoszférikus nyomáson diizopropil-éterben végzett kísérletek eredményeitől, mivel itt 80 °C-on nagyobb enzimaktivitást kaptam, mint 70 °C-on. A kapott optimum pont hőmérséklete más CAL-B enzimmel scCO2-ban és hagyományos oldószerben végzett észterezési és acilezési reakció optimumához (55-60 °C) képest [202-205] valamivel magasabb, míg scCO2 esetén az optimális nyomás közel azonos [202, 203, 204, 205]

(15 MPa)

[204]

volt. A keletkezett Phe enantiomertisztasága minden körülmények között ≥

98 %. A reakció E-értéke a nyomásalatti illetve az atmoszférikus kísérletek esetében közel ugyanolyan eredményt adott, tehát az enzim szelektivitása ennél a reakciónál meglehetősen hasonló mindkét reakcióközegben. A reakcióelegy teljes konverzió elérésekor az enantiomertiszta terméket és szubsztrátot, a rögzített enzimet valamint a CO2-ot tartalmazza. Szerves oldószerben és vízben végzett szintézisekkel ellentétben a scCO2-os technológia alkalmas lehet a további feldolgozási lépésekre is. Nagynyomású fázisegyensúlymérő cellában scCO2-ban az opálosodási pontot mérve a LAK oldhatósága (O) > 0,40 mg/ml, míg az (R)-Phe-é < 0,015 mg/ml a vizsgált hőmérséklet és nyomás tartomány bármely pontjában. Mivel a két vegyület oldhatósága között több, mint egy nagyságrendi különbség van, ezért megfelelő módszerrel szelektíven a szubsztrát és a termék elválaszthatók egymástól és az enzimtől, majd az oldószertől is. 53

A vizsgált reakció optimális működési paraméterek (14 MPa, 70 °C) mellett, 120 h után érte el az elméletileg lehetséges maximális konverziót elegendően megközelítő 49,95 %-os értéket, ahol már a LAK enantiomertisztasága is 99 % fölötti volt. A reakció teljes lejátszódását követően, a reaktor nyomásmenetesítése nélkül, a szakaszos üzemmódból a műveleti paraméterek változtatása nélkül folyamatos kevert tartályreaktor üzemmódba váltottam, vagyis állandó térfogatáramú CO2 átáramoltatásával mostam a reaktort. A LAK jó oldhatóságának köszönhetően szelektíven kioldódott, a CO2 a nyomásmentesítéssel gázként távozott a rendszerből, míg a reaktorban visszamaradt az enzim és a Phe, ami meleg vízzel jól leoldható, majd szűréssel eltávolítható az enzimről. Ez a megoldás tisztán környezetbarát oldószerek

alkalmazásával

eredményezi

az

egymástól

elválasztott

enantiomertiszta

szubsztrátot és terméket, az enzimet és az oldószert. Ipari alkalmazás esetén az enzim újra felhasználható, a CO2 pedig tisztítás után recirkuláltatható. Mivel a reakcióhoz vízre, mint nukleofil donorra szükség volt, ezért további hozzáadott víz hatását nem vizsgáltam. Egy látszólagos TON-t számítottam a maximum pontban (15 MPa, 70 °C), amely ezen a hőmérsékleten és nyomáson az elérhető maximum, mivel a szubsztrát telítésben volt jelen a CO2-ban. A különböző reakcióidő után mért ne-s (t) értékeket a reakcióidő függvényében ábrázoltam, majd az illesztett görbe egyenletéből (28. és 29. egyenlet alapján) meghatároztam r0-t, amit ebben az esetben látszólagos rmax-nak vettem és ebből számítottam a 31. egyenlet segítségével TON-t, amelyre 0,0041 mmol átalakított szubsztrát · g enzim-1 · min-1 értéket kaptam.

2.2.2

A transz-2-hidroxiciklohexánkarbonitril acilezési reakciója Az előző 2.2.1. fejezetben a víz hatását, mint enzimaktivitást és enantiomertisztaságot

befolyásoló tényezőt nem vizsgáltam, mivel a reakcióhoz szükséges reagens volt. A CCH vegyület esetében a rac-CCH CAL-B katalizált kinetikus reszolválását végeztem szakaszos reaktorban, VA, mint acil donor jelenlétében (23. ábra). Mivel a vízkoncentráció az enzimek számára fontos paraméter, ennél a vegyületnél a későbbiekben ennek vizsgálatára is kitérek. O

CN *

OH *

H2C

O

CN CH3

R

CN OH

S

CAL-B

transz-(±)-CCH

+

S

CH3

O R O

(1R,2S)-CCH

(1S,2R)-CCH

23. ábra A (±)-CCH CAL-B katalizált kinetikus reszolválása

A reakció hőmérsékletének kiválasztásakor figyelembe vettem, hogy az elvégzett előkísérletek alapján ez egy gyors reakció, valamint más hasonló szerkezetű, 2-es helyzetben 54

szubsztituált transz-ciklohexanol vegyület esetében CAL-B enzimmel szerves oldószerben kapott eredményeket, amely szerint a konverzió és az enantioszelektivitás szempontjából ~ 45 °C az optimális üzemeltetési hőmérséklet

[206]

. A nyomást 10 MPa-nak választottam,

mivel a kifejezetten nagy reakciósebesség és az előkísérletek során ezen a nyomáson tapasztalt kitűnő enantioszelektivitás miatt nem láttam indokoltnak a nagyobb nyomás alkalmazását. A VA arányát a racém szubsztrátra vonatkoztatva 0,5-10 MR között változtattam, és vizsgáltam a konverzióra és a visszamaradt szubsztrát és a keletkezett termék enantiomertisztaságára gyakorolt hatást. A 16. ábrán látható szakaszos reaktorba a CAL-B-t (0,018 g) és a (±)-CCH-t (0,018 g, 0,144 mmol) 1:1 tömegarányban mértem be minden kísérletnél. Az 50 %-os konverzó eléréséhez szükséges minimális VA arány meghatározásához a VA mennyiségét 0,5-10 MRban (6,65-135 µl, 0,072-1,44 mmol) adagoltam be. Minden reakciót 45 °C hőmérsékleten és 10 MPa nyomáson 4 órán át végeztem (keverési sebesség: 200 1/min) egyszer desztillált CO2ban. Minden 30 perc után a reaktort állandó hőmérsékleten és nyomáson 0,4 g CO2-dal (tömegáram: ~ 0,30 g/min) mostam állandó nyomáson. 50

X (%)

40

30 10 MR 5,0 MR 2,0 MR 1,5 MR 1,0 MR 0,5 MR

20

X(t) = X(t = ∞) · (1-e-κt)

10

0 0

30

60

90

120 150 tr (min)

180

210

240

24. ábra A VA arány hatása a konverzió időbeli lefutására 10 MPa, 45 °C-on, hozzáadott víz nélkül

A reakció lefutása minden esetben egy kezdeti gyors felfutási szakaszt követően idővel egy adott X∞ érték felé tartott, előbbit a kezdeti reakciósebesség utóbbit a végső konverzió jellemzi, mindkét paraméter a VA arány növelésével nőtt (24. ábra). A sztöchiometriailag szükséges 0,5 MR arányú acilezőszer mellett a végső konverzió nem érte el a 30 %-ot. Az 5 MR fölötti további acilezőszer arány növelés már nem eredményez jelentős változást a 55

vizsgált paraméterekben. A teljes konverzió eléréséhez minimálisan szükséges VA mennyisége 2 MR volt. A

keletkezett

acetát

enantiomertisztasága

10 MPa,

45 °C-on

minden

szubsztrát/acilezőszer arány mellett 98 % fölötti volt, míg a kiindulási szubsztrát eeCCH értéke a reakció előrehaladásának mértékétől függött, a reakció teljes lejátszódása esetén eeCCH > 99,8 %-os értéket kaptam (4. táblázat).

56

4. táblázat A VA arány hatása az enzimaktivitást és az enantioszelektivitást jellemző paraméterekre

P

T

VA

κa

X∞a

r0

teq

ees

eep

Eb

Prodsz

(MPa)

(°C)

(MR)

(1/min)

(-)

(mM/min)

(min)

(%)

(%)

(-)

(µmol (1S,2R)-CCH · g enzim-1 ·min-1)

10

45

0,5

0,0274

0,294

0,039

170

41,2

>98

~ 150

7,8

10

45

1

0,0249

0,460

0,056

185

83,0

>98

>200

12,2

10

45

1,5

0,0286

0,494

0,069

160

96,0

>98

>>200

13,7

10

45

2

0,0287

0,501

0,070

160

>99,8

>98

>>200

14,2

10

45

5

0,0491

0,503

0,142

100

>99,8

>98

>>200

18,7

10

45

10

0,0487

0,504

0,145

95

>99,8

>98

>>200

19,0

a

A 24. ábrán látható illesztett görbék egyenletéből meghatározott konstans, amely arányos a reakciósebességi állandóval.

b

EA és EB szerint számolva, EC szerint minden esetben >>200.

57

A kapott r0 értékeket a VA koncentráció függvényében ábrázoltam (25. ábra), az

rmax

illesztett görbe egyenletéből kaptam a rmax=0,19 mM/min és a KM=12,30 mM értékeket.

0,20

r0 (mM/min)

0,15

0,10

r0 = 0,05

0,19 ⋅ cVA 12,30 + cVA

0,00 0

10

20 KM

30

40

50

cVA (mM)

25. ábra A CCH kinetikus reszolválásának Michaelis-Menten görbéje 10 MPa, 45 °C-on, hozzáadott víz nélkül

KM és rmax pontosabb meghatározásához a Michaelis-Meneten görbe linearizálása után

az egyenesek paramétereiből kapott konstansokat 5. táblázatban foglaltam össze. 5. táblázat Enzimkinetikai konstansok (KM és rmax) értékei grafikus úton illetve linearizálással

Michaelis-Menten Lineweaver-Burk Hanes-Langmuir Eadie-Hofstee

KM (mM) 12,30 6,6 5,16 9,44

rmax (mM/min) 0,19 0,14 0,09 0,15

A TON értékének kiszámításához a Lineweaver-Burk- és az Eadie-Hofstee-féle linearizálásból kapott rmax értékek átlagát vettem, rmax-ból (0,145 mM · min-1)

a bemért

enzim mennyiség (0,018 g) és a reaktortérfogat (30 ml) ismeretében a 31. egyenlettel számolva 0,24 mmol átalakított szubsztrát · g enzim-1 · min-1 értéket kaptam TON-re. 58

A továbbiakban 23-os kísérlettervet készítettem a vízkoncentráció (0,007; 0,983 mg/ml) – hőmérséklet (40; 70 °C) – nyomás (10; 20 MPa) hatásainak feltérképezésére a centrumpontban (0,483 mg/ml, 55 °C, 15 MPa) három ismétléssel. A vízkoncentráció tartományának beállításához a legkisebb szintet az enzim saját víztartalma (we = 1,16 m/m %) adta, amit Karl-Fischer titrálással határoztam meg, míg a felső szintet a víz ebben a hőmérséklet és nyomás tartományban vett telítési koncentrációja adta, amelyet a Phase Equilibra szoftver segítségével határoztam meg irodalmi adatok alapján

[207, 208]

. A víz

koncentrációját a kis értékek miatt, a pontosság érdekében vízaktivitásként kellene megadni, azonban a kiszámításához szükséges adatok (fugacitás, aktivitás koefficiens) nem álltak rendelkezésemre, ezért egyszerűsítésképpen koncentrációként alkalmaztam. A reakció biztonságos teljes lejátszódása miatt 2,5 MR VA-ot alkalmaztam, így elkerülhető volt az esetleges acilezőszer hiány okozta konverzió csökkenés, és csak a három vizsgált paraméter befolyásolta a reakció kimenetelét. A kísérleteket a 2.1.2 fejezetben részletesen bemutatott szakaszos reaktorban végeztem, azonban a vízhatás pontos vizsgálatához a teljesen vízmentes körülmények biztosítása végett kiegészítettem a rendszert. A reaktor elé a CO2 bevezető ágra beépítettem egy szilikagéllel töltött oszlopot (26. ábra (3)), amely biztosította, hogy a CO2 vízmentesen lépjen a reaktorba, a benne található víz megkötésével. A (±)-CCH (0,018 g, 0,144 mmol) és a CAL-B (0,018 g) bemérése változatlan volt, a kísérletterv mérései során a VA-ot 2,5 MR-ban alkalmaztam. A vizsgált paramétereket a fent megállapított tartományokban változtattam. A reakciókat 4 órán át kevertettem (200 1/min), azonban a mintavételek számát a korábbi kísérletekhez képest lecsökkentettem a rendszer zavarásának minimalizálása érdekében. A kihagyott mérési pontokat a korábbi kísérletek pontjaira illesztett görbék alapján választottam, így a mintavételeket 30, 90, 150 és 240 percnél végeztem a már ismertetett módszerrel. 2

3

P T

4

T

1

26. ábra A CCH vízhatás vizsgálatának vázlatos elrendezése 1.

CO2 puffertartály, 2. nagynyomású szivattyú, 3. szilikagéllel töltött oszlop, 4. mintaszedő

59

Mivel a három faktor közül a víznek olyan jelentős hatása volt, hogy nem csupán mennyiségi, hanem minőségi változást is okozott, vagyis nem folyamatos változást eredményezett, ezért a kísérletsorozatban kapott eredmények nem értékelhetők ki kísérlettervként. A hatások ábrázolását legszemléletesebben a mérési pontok 3 dimenziós ábrázolásával lehet megvalósítani (27. ábra). cvíz (g/ml)

0,983

T ( °C)

3 ismétlés

0,488 70 55 40 0,007 10

15

20

P (MPa)

27. ábra A víz – nyomás – hőmérséklet hatás vizsgálata 23-os kísérlettervvel 2,5 MR VA arány

-el jelöltem a mérési pontot, ha a X < 10 %, ezeknél a reakcióknál olyan hamar megáll az

átalakulás, hogy szinte az első mérési pontban (30 perc után) eléri a végső konverzió értéket,

-el jelöltem a

mérési pontot, ha X > 10 % és a lefutása jól jellemezhető a korábban ismertetett exponenciális függvénnyel, el jelöltem a mérést, ha X > 10 % és az X – t görbe lefutása szigorúan monoton növekedő, de nem áll be egy adott értékre,

-el jelöltem azt a mérési pontot, amelynél X > 20 %, azonban az acilezéssel egyidejűen egy visszaalakulási folyamat is megfigyelhető, vagyis a konverzió görbe visszahajlik.

Megállapítható, hogy a reakciók lejátszódására a nyomásnak minőségi változást előidéző hatása nincsen. Még értékelhető, tehát 10 % feletti konverzió értéket kaptam a hozzáadott víz nélküli (tehát a kocka alsó lapjának sarokpontjaiban) valamint a magasabb hőmérsékleten, 70 °C-on végzett méréseknél, addig a középpontban, 15 MPa, 55 °C-on az enzim nem mutat jelentős aktivitást (szórás < 1 %), ezért feltételezhető, hogy a víz és a hőmérséklet két egymással ellentétes hatást gyakorol a rendszerre. Egyfelől a víz hozzáadás csökkenti az enzim aktivitását, másfelől a hőmérséklet növelése ebben a tartományban egyértelműen növeli azt, mind kisebb (0,007 mg/ml), mind nagyobb (0,983 mg/ml) vízkoncentráció mellett. A 70 °C-on kapott eredmények azt mutatják, hogy a magasabb hőmérsékletnek itt már erősebb aktivitás növelő hatása van, mint amennyire lecsökken a nagyobb vízkoncentráció miatt. A hozzáadott víz nélküli kísérleteknél 70 °C-on korábban nem tapasztalt lefutást észleltem. Ezeknél a reakcióknál, feltételezhetően a hőmérséklethatás 60

következtében az enzim veszít a szelektivitásából és nagy kezdeti reakciósebességgel mindkét enantiomert elkezdi átalakítani, majd szimultán megkezdődik egy fokozatos visszaalakulás is, vagyis ilyen körülmények között az enzim a reverz reakciót is katalizálja, a reakció egyensúlya eltolódik, máshol áll be. Azoknál a kísérleteknél, ahol a konverzió nem éri el a 10 %-ot, olyan nagy a hibalehetőség, hogy nem lehet egyértelmű következtetéseket levonni. A vízhatás pontosabb megértéséhez a kísérletterv mérési pontjait összevetettem a korábbi kísérlet sorozat egyes méréseivel, illetve kiegészítő és ellenőrző mérések eredményeivel. A 6. táblázatból egyértelműen látszik, hogy nagy mennyiségű víz hozzáadása csökkenti mind az enzim aktivitását, amely alacsony konverzió értékekhez vezet, mind pedig az enantioszelektivitását. 6. táblázat A víz hatása az enzimaktivitásra és az enantioszelektivitásra A szürke cellák jelölik a kísérletterv pontjait, míg a további eredmények kiegészítő illetve korábbi mérések eredményei. Ahol eep és ezáltal E meghatározása nagyon bizonytalan volt a túl kicsi konverzió miatt, ott „-”-al jelöltem az érték helyét.

P (MPa) 20 20 10 10 10 10 10 10 10 15 15 15 15 10 10 20 20

T (°C) 70 40 70 40 45 45 45 45 45 70 55 55 55 70 40 70 40

VA (MR) 2,5 2,5 2,5 2,5 2 2 2 10 10 2 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5

cvíz (mg/ml) 0,007 0,007 0,007 0,007 0,018 0,040 0,048 0,040 0,082 0,049 0,483 0,483 0,483 0,983 0,983 0,983 0,983

X30 (%) 30,7 10,8 58,3 16,1 40,0 35,1 28,3 42,3 39,4 39,5 4,3 4,2 4,1 7,2 4,5 8,4 3,9

X240 (%) 24,9 11,1 44,3 30,3 48,6 49,3 > 49,9 > 49,9 > 49,9 49,5 5,4 4,4 4,3 11,5 5,1 18,2 3,2

ees (%) 33,0 12,5 62,2 43,4 92,0 91,7 99,8 99,8 99,8 97,4 9,0 5,4 5,0 12,5 3,8 23,4 23,4

eep (%) > 98 > 98 > 98 > 98 > 98 > 98 > 98 > 98 > 98 > 93 96 > 98 -

E (-) > 100 > 100 > 100 > 100 > 200 > 200 >> 200 >> 200 >> 200 > 100 ~ 60 > 100 -

A 6. táblázatban ha a kezdeti reakciósebességre jellemző 30 perc után, tehát az első mintavétel során elért konverziót (X30) értékeljük, akkor megfigyelhető, hogy azonos körülmények között a hőmérséklet növekedése a kezdeti reakciósebességet jelentősen javítja. A másik szembeötlő hatást a víz hozzáadása váltja ki, a 6. táblázat alsó harmadában, 0,483 és 61

0,983 mg/ml-es vízkoncentráció mellett a kezdeti reakciósebesség minden körülmény között töredéke, mint vízhozzáadása nélkül. Az is megfigyelhető a 10 MPa, 45 °C-on végzett méréseknél, hogy a kezdeti reakciósebesség érzékenyen reagál kis mértékű víztöbblet jelenlétére is, a vízkoncentráció növekedésével csökken a kezdeti reakciósebesség, még akkor is ha a végső egyensúly beállását nem befolyásolja. A nyomás változásnak látható hatása csak a hozzáadott víz nélkül végzett kísérletek esetében van, ebben az esetben az alacsonyabb nyomás kedvez a nagyobb reakciósebességnek, míg más esetben nincs, vagy nem állapítható meg a hatása. A reakciók lejátszódásának mértékét a 240 perc után elért konverzió értékkel (X240) jellemeztem, mivel az előző kísérletsorozatban a reakció ebben az időpontban már minden esetben elérte az egyensúlyt. 2 MR VA arány fölött az egyensúlyi konverzióra nézve elhanyagolható változást okoz az acilezőszer mennyisége, tehát közel azonos hőmérséklet és nyomás beállítások mellett a reakció lejátszódása mindössze a víz mennyiségétől függ. A CAL-B enzim laktámgyűrűnyitási reakciójánál tapasztalt optimális működési paraméterek mellett, 2 MR VA arány mellett egyszer desztillált CO2-dal kapott eredmények alapján azt tapasztaltam, hogy magasabb hőmérsékleten és nagyobb nyomáson ugyan az enzimaktivitás nő, X30 értéke közel másfélszeres, mint ugyanekkora VA arány és cvíz mellett 10 MPa, 45 °Con kapott érték, azonban az enzim enantioszelektivitása kis mértékben lecsökkent (eeCCHAc ~ 93 %). Ebből is jól látható, hogy adott enzimhez tartozik egy jól körülírható optimális hőmérséklet és nyomás tartomány, azonban a pontos optimum pont reakciónként változik. A 6. táblázatból egyértelműen látszik, hogy a reakció pusztán az enzim által tárolt vízmennyiség mellett nem játszódik le végig, kell egy minimális többlet vízkoncentráció a teljes konverzió eléréséhez, amely közelítőleg ~ 0,04 - 0,05 mg/ml. A 10 MR VA aránnyal végzett kísérleteknél látszik, hogy ~ 0,04 - 0,1 mg/ml vízkoncentráció tartományban nincs jelentős hatása a vízmennyiség növelésének a reakció lefutására nézve, azonban a kezdeti reakciósebesség a vízkoncentráció növelésével csökken. A kísérletterv középpontjában alkalmazott 0,483 mg/ml túl nagy vízkoncentráció, amely a scCO2-os fázisba beoldódva, feltehetően a pH eltolódás okozta enzim konformáció változásnak köszönhetően lecsökkenti az enzim aktivitását. A reakciósebesség csökkenést az is okozhatja, ha a hozzáadott víz adszorbeálódik az enzimkészítmény felületén és így a szubsztrát diffúziója az enzim aktív helyéhez és a termék eltávolítása onnan gátolt. Az elvégzett mérések alapján kijelenthető, hogy a CAL-B enzimnek egy szűk optimális vízkoncentráció tartománya van, amelynek alsó határa ~ 0,04 - 0,05 mg/ml felső határa ezekből az adatokból nem meghatározható, mindössze azt mondhatjuk, hogy 0,08 mg/ml-nél nagyobb, de kisebb, mint 0,483, ami egy igen tág becslés. A szubsztrát ee értékei (ees) a konverziónak megfelelően változnak, míg a termék ee értéke (eep) jó mutatója lehet ez enzim enantioszelektivitás változására. Mivel a CCHAc az 62

alkalmazott kolonnán nem vált el, ezért eep-t a CCHAc és a CCH enantiomerek koncentrációinak segítségével (36. egyenlet) határoztam meg. Mellékreakciót nem detektáltam, ezért feltételeztem, hogy a kiindulási racém CCH mennyiség megegyezik a mindenkori CCHAc (cCCHAc) és CCH enantiomerek (cCCH(+), cCCH(-)) összmennyiségével, ezt koncentrációban az egyik enantiomerre felírva a 36. egyenlettel: cCCH ( + / − )0 =

cCCH ( + ) + cCCH ( − ) cCCHAc

(36)

2

Mivel racém CCH-ból indultunk ki, ezért: cCCH ( + )0 = cCCH ( − )0

(37)

A visszamaradt CCH enantiomer koncentrációkkal kiszámítható a t reakció idő alatt keletkezett CCHAc enantiomerek koncentrációja külön-külön, majd meghatározható a CCHAc enantiomertisztasága, vagyis eep (38. egyenlet): ee p =

(c (c

) ( ) + (c

CCH ( + )0

− cCCH ( + )t − cCCH ( − )0 − cCCH ( − )t

CCH ( + ) 0

− cCCH ( + )t

CCH ( − ) 0

− cCCH ( − )t

) c = ) −c

CCH ( − )t CCH ( − )t

− cCCH ( + )t − cCCH ( + )t

(38)

Ez a számítási módszer alapvetően viszonylag nagy hibával terhelt, azonban ellenőrzésképpen

végeztem

preparatív

előállítás

során

pontos

enantiomertisztaság

meghatározást. A preparatív előállítást követően szilikagéles oszlopkromatográfiával (EtOAc:n-hexán 1:3) elválasztottam a keletkezett CCHAc terméket és a visszamaradt CCH-t. A

kapott

ismeretlen

enantiomertisztaságú

észtert

metanolban

nátrium-bikarbonát

hozzáadásával spontán metanolízis során hidrolizáltam alkohollá, majd az így kapott, a CCHAc-tal megegyező enantiomertisztaságú, alkoholt már elemezni tudtam a korábbi GC módszerrel. Az így kapott mérési eredmények jó egyezést (± 0,7 %) mutattak a 38. egyenlet alapján számított értékekkel, így ezt az egyszerűbb módszert alkalmaztam a rutin mérések során. A 10 % alatti konverzió értéknél az eep számítása nagy bizonytalansággal járna, ezért ezekben az esetekben nem határoztam meg. Ami biztosan megállapítható, az az, hogy kis vízkoncentráció mellett (cvíz < 0,483 mg/ml) az enzim enantioszelektivitása nem változik, míg az E érték (16. és 17. egyenlet) alapján is az optimális vízkoncentráció tartomány a korábban megállapítottnak megfelel. A víz hatásáról megállapítottam, hogy az enzim csak szűk vízkoncentráció tartományban őrzi meg enantioszelektivitását és aktivitását. A kapott eredmények alapján egyértelmű optimum tartomány nem határozható meg a vízkoncentrációjára nézve. Technológiai szempontból a hozzáadott víz nélkül egyszer desztillált CO2-dal elért 63

vízkoncentráció, a bemérési hibák elkerülésével, nagy biztonsággal állandó vízkoncentrációt biztosít a rendszerben. Ez a vízkoncentráció az enzim optimális tartományába esik. Az enzim saját, illetve az egyszer desztillált CO2-dal kapott vízkoncentráció (~ 0,04-0,05 mg/ml) biztosításával akár méretnöveléssel is, jól és viszonylag egyszerűen megvalósítható rendszert kaphatunk. A kapott eredmény közel áll más enzimes mérések során kapott értékekhez, Dijkstra és munkatársai

[209]

például keresztkötött CAL-B-vel katalizált PE acilezési reakciót vizsgálták

folyamatos rendszerben 13 másodperces tartózkodási idővel, 9 MPa nyomáson, 40 °C hőmérsékleten scCO2-ban 0,05 – 2 mg/ml vízkoncentráció tartományban, valamint szilikagéllel leszárított CO2-dal. A legnagyobb enzimaktivitást a minimális, vagyis 0,05 mg/ml hozzáadott vízmennyiség mellett érték el, további vízmennyiség hatására az enzim aktivitása folyamatosan csökkent. A leszárított CO2-dal az enzim csak minimális aktivitást mutatott. Azonban a vízkoncentráció optimumát jobban megközelítettem, mivel a kérdéses vízkoncentráció tartományban (< 0,25 mg/ml) még korábban nem vizsgálták a víz hatását részletesen.

2.2.3

A transz-1,2-ciklohexándiol konszekutív acilezési reakciója A 2.2.2. fejezetben bemutatott reakciót szakaszos rendszerben végeztem, míg CHD

esetén a célom a szakaszos rendszer optimalizálása, majd ez alapján a folyamatos reaktor megtervezése és az optimális átlagos tartózkodási idő meghatározása volt. Míg a szakaszos üzemben hagyományos oldószerekben már tanulmányozták a CHD acilezési reakcióját, addig a folyamatos kinetikus reszolválást eddig még egyáltalán nem vizsgálták. A CHD acilezése során a vegyület két hidroxil-csoportjának köszönhetően mono- és diacetát termék keletkezhet. A reakciót megfelelő enantioszelektivitású enzimmel végezve enantiomertiszta termékek keletkezhetnek. CAL-B enzimmel katalizálva a vizsgált kétlépéses konszekutív acilezési reakció (28. ábra) során a kIIS reakciósebességi állandóval jellemzett második acilezési lépés elhanyagolható mértékben játszódik le (az alkalmazott analitikai módszereknek megfelelő jel/zaj arány mellett az (1S,2S)-CHDAc2 jelenléte ugyan kimutatható, azonban eeCHDAc > 99,9 %).

64

O

O OH S

OH

kIS

S

S

OH S

VA, CAL-B (1S,2S)-CHD

S

kIIS

(1S,2S)-CHDAC2 O

R

kIR

R

R

OH R

kIIR

R

O

(1R,2R)-CHDAc

CH3

R

VA, CAL-B

VA, CAL-B (1R,2R)-CHD

CH3

O

CH3

O

CH3 O

O

OH

O S

VA, CAL-B (1S,2S)-CHDAc

OH

CH3

O

CH3

O

O (1R,2R)-CHDAC2

28. ábra A CHD kétlépéses CAL-B katalizált konszekutív acilezése Ahol kIS, kIR, kIIS és kIIR a reakciósebességi állandók.

A nyomás alatti szakaszos reakciókat a 16. ábrán látható tartályreaktorban végeztem. A reaktorba bemértem 0,02 CAL-B enzimet és 0,01 g (0,085 mmol) (±)-CHD-t, valamint a racém szubsztrátra nézve 2-10 MR mennyiségű VA-ot (15,67-78,35 µl, 0,17-0,85 mmol). A reaktort 45 °C hőmérsékletre termosztáltam, majd egyszer desztillált CO2-dal 10 MPa nyomásra töltöttem. Állandó működési paraméterek mellett 5 órán át kevertettem (200 1/min). Minden 30 perc után a reaktort 0,4 g CO2-dal (tömegáram: ~ 0,40 g/min) mostam állandó nyomáson. Az atmoszférikus ellenőrző kísérleteket duplafalú termosztált üveg autoklávban végeztem 30 ml hexánban. Az előmelegített (45 °C) hexánba bemértem 0,02 g CAL-B enzimet és 0,01 g (0,085 mmol) (±)-CHD-t, valamint a szubsztrátra nézve 2-10 MR mennyiségű VA-ot. A reakcióelegyet 11 órán át kevertettem (200 1/min) és 30 percenként 100 µl mintát vettem. A szakaszos kísérletek során vizsgáltam az acilezőszer mennyiségének (2-30 MR) hatását és a teljes konverzió eléréséhez szükséges minimális acilezőszer arányt. A scCO2-os kísérleteknél, különösen a folyamatos rendszer esetén az alkalmazott műveleti paraméterek biztonságos és stabil működést eredményeznek, a CO2 már megbízhatóan a szuperkritikus tartományban van, valamint az enzim számára is megfelelő a korábbi kísérletek alapján. A bemért (±)-CHD minden esetben a scCO2-ban való oldhatóságánál (0,08 m/m %) kisebb mennyiségben volt jelen a rendszerben, vagyis már a reakció kezdetén teljesen feloldódott. Az elméletileg maximális konverziót elegendően megközelítő 99,9 %-os konverzió eléréséhez minimum 10 MR VA szükséges, azonban, ahogy a korábbi vegyületnél is tapasztaltam, adott VA arány fölött egyre csökken a jelentősége az acilezőszer mennyiség további növelésének (7. táblázat). Mivel a konverziót a kiindulási anyagra számítottam (23. 65

egyenlet) és a reakció két lépésből áll, pusztán a konverzió nem ad elég információt a reakció lefutását illetően. Mivel a második lépés teljesen enantioszelektív, ezért a reakció lejátszódását akkor tekinthetjük teljesnek, amikor a keletkezett gyorsabban reagáló (1R,2R)CHDAc-ból (1R,2R)-CHDAc2 lesz, vagyis eeCCHAc is eléri a 99,9 %-nál nagyobb értéket. A kezdeti reakciósebesség és a produktivitás a VA arány növekedésével folyamatosan nő, azonban míg kisebb VA arány mellett ez a növekedés intenzívebb, addig nagyobb VA arány (6 MR fölött) mellett már kevésbé jelentősen változik (7. táblázat). 7. táblázat A VA arány hatása a reakció lefutást és az enantioszelektivitást jellemző paraméterekre scCO2-ban 10 MPa nyomáson és 45 °C hőmérsékleten, 300 perc után

VA (MR)

X (%)

r0 (mM/min)

eeCHDAc (%)

2 4 6 10a 20 30

82,2 95,1 98,5 >99,9 >99,9 >99,9

0,043 0,045 0,060 0,070 0,074 0,077

20,0 60,2 95,0 >99,9 >99,9 >99,9

a

Prodsz (µmol (1R,2R)-CHD és (1S,2S)-CHD · g enzim-1 · min-1) 5,25 8,02 8,77 9,21 9,16 9,44

3 ismétlés ( szórás < 1 %) átlagából kapott pontok ábrázolásából

A két enantiomer reakciólépéseinek sebességei a 39-44. differenciálegyenletekkel írhatók le a 28. ábra alapján (a c koncentrációk az idő függvényei): dc (1 S , 2 S ) −CHD dt

= r(1 S , 2 S ) −CHD = − k IS ⋅ c (1 S , 2 S ) − CHD ⋅ cVA

dc (1S , 2 S ) −CHDAc dt dc (1S , 2 S ) −CHDAc2 dt dc (1R , 2 R ) −CHD dt

= r(1S , 2 S ) −CHDAc2 = k IIS ⋅ c (1S , 2 S ) −CHDAc ⋅ cVA

= r(1R , 2 R ) −CHD = − k IR ⋅ c (1R , 2 R )−CHD ⋅ cVA

dc (1R , 2 R ) −CHDAc dt dc (1R , 2 R ) −CHDAc2 dt

= r(1S , 2 S )−CHDAc = k IS ⋅ c (1S , 2 S ) −CHD ⋅ cVA − k IIS ⋅ r(1S , 2 S )−CHDAc ⋅ cVA

= r(1R , 2 R ) −CHDAc = k IR ⋅ c (1R , 2 R )−CHD ⋅ cVA − k IIR ⋅ r(1R , 2 R )−CHDAc ⋅ cVA = r(1R , 2 R ) −CHDAc2 = k IIR ⋅ c (1R , 2 R ) −CHDAc ⋅ cVA

(39)

(40)

(41) (42)

(43) (44)

A két kiindulási enantiomer az (1S,2S)-CHD és az (1R,2R)-CHD fogyása egyszerű másodrendű kinetika szerint írható fel a 39. és a 42. egyenletekkel. A monoacetát enantiomerek koncentrációja (c(1S,2S)-CHDAc és c(1R,2R)-CHDAc) szintén másodrendű kinetika 66

szerint változik a 40. és 43. egyenleteknek megfelelően. Az (1S,2S)-CHDAc enantiomer csak nagyon kis mértékben alakul tovább, tehát a második acilezési lépés reakciósebességi állandója kIIS elhanyagolhatóan kicsi (az enantiomertisztaság értékből számítható), így a 40. egyenlet egyszerűsíthető mindössze az első tagra. Az (1R,2R) enantiomer esetén mindkét acilezési lépés nagy sebességgel játszódik le, az (1R,2R)-CHDAc közti termékből kIIR > 0 reakciósebességi állandóval képződik a diacetát a 44. egyenletnek megfelelően. A differenciál-egyenletrendszer megoldásához rendelkezésemre áll 5 egyenlet, így a 3 ismeretlent, kIS, kIR, és kIIR reakciósebességi állandókat nagy biztonsággal meg lehet határozni. Az egyes vegyületeknek a mérési pontokban kapott koncentrációit az idő függvényében ábrázoltam. A k értékek kiszámításához szükséges időszerinti első deriváltat az illesztett görbék egyenleteinek deriválásával, valamint amennyiben a modell nem illeszkedett jól, a mérési pontokból számított

∆c ∆t

hányadosokkal határoztam meg. Az (1S,2S)-CHD

enantiomerek fogyása jól jellemezhető egy c (1S , 2 S ) − CHD = b ⋅ (1 − e − a ⋅t ) alakú exponenciális r

görbével, hasonlóan az (1R,2R)-CHD enatiomeré is. Az (1S,2S)-CHDAc keletkezése, mivel a második

reakciólépés

nagyon

lassú,

így

ennek

elhanyagolásával

élve,

egy

c (1S , 2 S ) − CHDAc = b ⋅ e − a ⋅t r alakú görbével megadható. Az (1R,2R)-CHDAc koncentráció lefutása

legjobban egy hatodfokú polinommal közelíthető. Az (1R,2R)-CHDAc2 keletkezése a kezdeti szakaszban legjobban egy c (1R , 2 R ) − CHDAc = b ⋅ t r g /( d g + t r g ) alakú szigmoid, míg a későbbi 2

szakaszában egy c (1 R , 2 R ) −CHD = b ⋅ (1 − e

− a ⋅t r

) alakú exponenciális görbével jellemezhető. Jól

illeszkedő modell esetén a kezdeti meredekséggel, vagyis a tr=0 pontban vett meredekséggel számoltam, amennyiben lehetőség volt rá. A reakció kezdeti szakaszában az alábbi feltételezésekkel éltem: c (1S , 2 S ) −CHD0 ≅ c (1R , 2 R ) −CHD0 c(1R , 2 R )−CHDAc 2 ≅ 0

cVA ≅ cVA 0 Egyéb esetben a reackió első 4 mérési pontjából számított differencia hányados segítségével két mérési pont reakcióidejének középértékéhez (így a 15, 45, 75 és 105 perchez tartozó értékekkel) határoztam meg a hozzá tartozó koncentráció középértékeket. Az egyes módszerekkel kiszámított deriváltakat és a megfelelő koncentrációkat visszahelyettesítettem a 39.-44. egyenletekbe és meghatároztam az egyes reakciólépések k értékeit. A két oldószerben, a többféle módon kapott egyes k értékek átlagát vettem (szórás < 1 %), a végső értékeket a 8. táblázatban tüntettem fel:

67

8. táblázat

A CHD kétlépéses acilezésének rekaciósebességi állandói 45 °C hőmérsékleten

P Oldószer

MPa 10 atm.

scCO2 hexán

kIS 1 mM ⋅ min 7,09·10-4 5,93·10-4

kIIS 1 mM ⋅ min ~0 ~0

kIR 1 mM ⋅ min 1,16·10-3 5,47·10-4

kIIR 1 mM ⋅ min 1,32·10-3 4,58·10-4

A k értékekből megállapítható, a reakció gyorsabb scCO2-ban, mint hexánban, mivel a vonatkozó k értékek minden esetben nagyobbak. Az első acilezési lépésben is mérsékelt enantioszelektivitást mutat az enzim mindkét oldószerben. Míg scCO2-ban az (1R,2R)-CHD ~ 1,7-szer gyorsabban reagál, mint a (1S,2S) antipód, addig hexánban éppen fordítva, az (1S,2S)-CHDAc keletkezése preferált. ScCO2-ban az (1R,2R) enantiomer esetén a második acilezési lépés reakciósebességi állandója nagyobb, mint a monoacetát képzésé, míg hexánban a két lépés sebessége között nincs számottevő különbség, de a diacetát képzés a lassabb folyamat. Tehát a CAL-B enzim scCO2-ban parallel – vagyis mindkét reakciólépésnél ugyanazon irányultságú enantiomer átalakítása preferál –, hexánban pedig anti-parallel – azaz egyik reakciólépésnél az egyik, másik reakciólépésnél a másik enantiomer a kedvezményezett – szelektivitást mutat. 1S,2S 100%

80%

eeCHDAc (%)

60%

40%

20% 30 MR VA 20 MR VA 10 MR VA 6 MR VA 4 MR VA 2 MR VA

0%

-20% 0

1R,2R

50

100

150

200

250

300

350

t (min)

29. ábra A VA arány hatása a CHDAc enantiomertisztaságára Szakaszos reaktorban, scCO2-ban, 10 MPa, 45 °C, 1:1 enzim : szubsztrát tömegarány mellett. A görbéket nem illesztettem, mindössze a jobb szemléltetést szolgálják. A 10 MR VA esetén a hibahatárok a 3 ismétlés szórását szemléltetik.

A scCO2-ban kapott eeCCHAc görbékből (29. ábrán) is látszik alacsonyabb VA arány mellett, hogy a reakció kezdeti szakaszán az (1R,2R)-CHDAc feleslegben van az (1S,2S) 68

enantiomerhez képest. Megállapítható, hogy az első acilezési lépés közepes mértékben, míg az (1R,2R) diacetát képzés az analitikai vizsgálatok alapján mindvégig teljesen enantioszelektív. A SeKiRe nevű

[210]

, konszekutív enzimes reakciók leírására alkalmas szoftver

segítségével és a kiszámított scCO2-ban kapott k értékek megadásával modelleztem az egyes reakciólépések koncentrációlefutását (relatív koncentráció (crel), amit az adott vegyület koncentrációjának és a teljes koncentráció hányadosából számítottam) a konverzió függvényében. A szoftver által illesztett görbéket a saját mérési eredményeimmel összevetve

crel (-)

a 30., 31. és 32. ábrán mutatom be:

(1S,2S)-CHD (1S,2S)-CHD szimuláció (1R,2R)-CHD (1R,2R)-CHD szimuláció

0,5 0,45 0,4 0,35 0,3 0,25 0,2 0,15 0,1 0,05 0 0

20

40

60 X (%)

80

100

30. ábra A szubsztrát enantiomerek ((1S,2S) és (1R,2R)-CHD) koncentrációjának modellezése

crel (-)

ScCO2, minden VA mólarány esetén, 45 °C, 10 MPa

0,5 0,45 0,4 0,35 0,3 0,25 0,2 0,15 0,1 0,05 0

(1S,2S)-CHDAc (1S,2S)-CHDAc szimuláció (1R,2R)-CHDAc (1R,2R)-CHDAc szimuláció

0

20

40

60 X (%)

80

100

31. ábra A monoacetát enantiomerek ((1S,2S) és (1R,2R)-CHDAc) koncentrációjának modellezése ScCO2, minden VA mólarány esetén, 45 °C, 10 MPa

69

crel (-)

0,5 0,45 0,4 0,35 0,3 0,25 0,2 0,15 0,1 0,05 0

(1R,2R)-CHDAc2 (1R,2R)-CHDAc2 szimuláció

0

20

40

60 X (%)

80

100

32. ábra A (1R,2R)-CHDAc2 koncentrációjának modellezése ScCO2, minden VA mólarány esetén, 45 °C, 10 MPa

Mindhárom ábrán (30-32. ábra) jól látható, hogy a mérési pontok jól korrelálnak a modellező program által illesztett görbékkel, tehát ez azt bizonyítja, hogy a számítás helyes volt. Az ce-s – t reakciókinetikai görbékből meghatározott, a 7. táblázatban megadott r0 értékeket a VA mM-ban megadott koncentrációjának függvényében ábrázoltam, és a Michaelis-Menten görbe egyenlete alapján, illetve a linearizálást követően az egyenesek tengelymetszetéből és meredekségéből meghatároztam rmax-ot és KM-et, a kapott értékeket a 9. táblázatban foglaltam össze. 9. táblázat Enzimkinetikai konstansok (KM és rmax) értékei grafikus úton illetve linearizálással (scCO2, 45 °C, 10 MPa)

KM

rmax

(mM)

(mM/min)

Michaelis-Menten

4,97

0,080

Lineweaver-Burk

4,72

0,079

Hanes-Langmuir

5,64

0,081

Eadie-Hofstee

4,79

0,079

A TON kiszámításához a linearizálással kapott pontosabb rmax értékek átlagát vettem, tehát rmax = 0,079 mM/min. A reaktor térfogat és a bemért enzimmennyiség ismeretében a 31. egyenlet szerint azt kaptam, hogy a TON 0,125 mmol átalakított szubsztrát · g enzim-1 · 70

min-1. Ez a TON jelentősen kisebb, kb. fele, mint a CCH vegyület esetében kapott (0,24 mmol átalakított szubsztrát · g enzim-1 · min-1). A TON adott enzimre jellemző tulajdonság, azonban reakciónként (szubsztrátonként) változik, így különböző vegyületek átalakítására nézve más és más lehet, akár nagyságrendileg is. A CCH és a CHD molekulák méretben és szerkezetileg hasonlóak és a reakciókörülmények is azonosak voltak, így a különbség főbb oka másban keresendő. A tapasztalt eltérés feltételezhetően annak köszönhető, hogy a kiindulási szubsztrát, tehát a CHD kisebb koncentrációban (2,8 mM) lett bemérve, mint a CCH (4,8 mM), és mivel nem ezekre a vegyületekre vizsgáltuk a koncentráció változásának a hatását, hanem az acilezőszerre, ezért a CHD az enzim számára lehet, hogy nem telítési koncentrációban volt jelen. Ezenkívül a számolási módszer feltételezi, hogy a két acilezési lépés közel azonos sebességű és ez is okozhat kismértékű hibát. Ismert, hogy az azonos cégtől, de különböző időben, különböző sarzsból rendelt enzimek pontos fehérje összetétele bizonyos határok között változhat, ezért elképzelhető, hogy ez is okozza az eltérést. A vizsgált CHD acilezési reakció megfelelő VA arány mellett gyors lejátszódással elérhető a teljes konverzió, ezenkívül a CHD az opálosodási pont mérés eredményei alapján megfelelő oldhatósággal rendelkezik scCO2-ban (~ 0,08 m/m %, 10 MPa, 45 °C), ezért a nagyobb produktivitás eléréséhez szükséges folyamatos kinetikus reszolválás ennél a reakciónál jól megvalósíthatónak tűnt. A szakaszos üzemben kapott TON értéket felhasználva, azonos hőmérséklethez és nyomáshoz becsültem a folyamatos rendszer üzemeltetéséhez szükséges átlagos tartózkodási időt. Feltételezve, hogy TON = TOF és a kívánt móláram, n&e−s = 0,025 mmol·min-1 a szükséges enzimmennyiség a 45. egyenlettel számítható:

me =

n& e − s = TOF

mmol enzim - szubsztrát kapcsolódás min = 0,2 g enzim mmol átalakított szubsztrát 0,125 g enzim ⋅ min

0,025

(45)

Az enzim látszólagos sűrűsége (mérési eredmények alapján) 0,39 g·ml-1 és a fajlagos hézagtérfogata 0,42, így a hasznos reaktortérfogatra 0,215 ml adódik. A (±)-CHD oldhatósága (OCHD) scCO2-ban 10 MPa nyomáson és 45 °C hőmérsékleten 0,00689 mmol (±)-CHD/g CO2 (mind statikus, mind dinamikus mérések alapján). Az időegység alatti kívánt enzim-szubsztrát kapcsolódási szám biztosításához 0,0166 mmol CHD/min móláramú CHD kell, mivel egy diacetát termék keletkezéséhez, ugyan csak egy CHD molekula szükséges, azonban két átalakítási lépéssel kétszer kapcsolódik az enzimhez. A CO2 tömegáram igényt a 46. egyenlet szerint határoztam meg:

71

m& CO2

mmol kioldandó CHD &nCHD 0,0166 g g min = = = 2,42 = 0,0403 mmol CHD OCHD min s 0,00689 g CO 2

(46)

A minimális átlagos tartózkodási időt (ttart), elhanyagolva a VA térfogatáramát (minden esetben < 2 %), a tiszta CO2 sűrűségével számolva az alábbi 47. összefüggéssel becsültem:

t tart =

V re ⋅ ρ CO2 m& CO2

=

0,215 ml ⋅ 0,493 g 0,0403 s

g ml = 5,34 s

(47)

A reakciókat a 33. ábrán látható folyamatos reaktorban végeztem, amelynek működését részletesen ismertettem a 2.1.3 fejezetben.

33. ábra Folyamatos üzemű reaktor egyszerűsített vázlata 1. CO2 puffertartály, 2. nagynyomású szivattyú, 3. szubsztrát extraktor oszlop, 4. szubsztrát, 5. HPLC pumpa, 6. enzimreaktor oszlop előmelegítő csőkígyó, 7. minta szedő, 8. termosztált vízfürdő

A (±)-CHD-t (~ 0,8-0,9 g) betöltöttem az extraktor oszlopba (3) és 0,2 g CAL-B-t pedig a reaktor oszlopba (6). A VA (4) mennyisége a szubsztrátra vonatkoztatva 10-30 MR-nak megfelelő tartományban változott. Az átlagos tartózkodási időt 3-12 s közötti értékre állítottam be a CO2 (egyszer desztillált) térfogatáramának változtatásával. A reakciót 10 MPa nyomáson és 45 °C hőmérsékleten 100 percen át végeztem, a mintaszedőt 10 percenként cseréltem.

72

A ttart hatását vizsgáltam a CHDAc enantiomertisztaságára, amely a folyamatos rendszer

50

100 ee

Prod.

80

40 30

60

20

40

10

20

0

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

eeCHDAc (%)

Prod. (µmol (1R,2R)-3 és (1S,2S)-2 · g enzim-1 · min-1)

esetében is a legjellemzőbb mutató a reakció lefutására és a produktivitásra nézve (34. ábra).

0

12

ttart (s) 34. ábra A tartózkodási idő hatása a produktivitásra és enantioszelektivitásra Folyamatos reaktorban, 10 MPa, 45 °C, 10-30 MR VA arány mellett, állandósult állapotban. Az görbéket nem illesztettem, mindössze a jobb szemléltetést szolgálják.

A CO2 térfogatáramának növelésével (átlagos tartózkodási idő csökkenésével), az adott idő alatt kioldott diol mennyisége arányosan nő, a CO2-os oldat koncentrációja állandó, a telítési koncentráció. Bármely időpillanatban az enzimes oszlopban tartózkodó CHD mennyisége

gyakorlatilag

állandó,

tehát

az

enzim:

szubsztrát

arány

változatlan

(∆(me/ms) < ± 10 %) maradt, így az enzimágy rendelkezésére álló idő az átlagos tartózkodási idő csökkenésével csökkent. Amennyiben a ttart-t túl kicsi, vagyis nagy a CO2 térfogatáram, a szubsztrát teljes átalakítására rövidebb idő áll rendelkezésre. Ez a hatás okozza a 34. ábrán látható, eeCHDAc csökkenését ttart < 6 s esetén, míg nagyobb ttart értéknél nem volt jelentősebb befolyása (eeCHDAc > 97 %). A produktivitás vizsgálatánál szintén ez a hatás eredményezi az átlagos tartózkodási időfüggést, valamint szerepet kap a nagyobb CO2 térfogatáram következtében kialakuló nagyobb CHD móláram is. Míg 12 s-től 4,5 s-ig a produktivitás a növekvő szubsztrát móláramnak és a rövidebb rendelkezésre álló szubsztrát átalakítási időnek köszönhetően folyamatosan növekszik (ttart ~ 4,5 s, Prod. ~ 52,1 µmol termék · g enzim-1 · min-1), addig ~ 4,5 s-nél kisebb átlagos tartózkodási idő esetén hirtelen csökkenés figyelhető meg, mivel a második acilezési lépés nem megy végbe teljesen, vagyis az első lépésben keletkezett nagyobb mennyiségű (1R,2R)-CHDAc nem képes maradéktalanul átalakulni (1R,2R)-CHDAc2-tá. Mindkét paramétert, az eeCHDAc és a produktivitást is figyelembe véve a 73

folyamatos rendszer optimális átlagos tartózkodási ideje ~ 5 s, ahol közel maximális produktivitással (~ 50 µmol termék · g enzim-1 · min-1) eeCHDAc > 96 % tisztaságú CHDAc és eeCHDAc2 > 99,9 % tisztaságú CHDAc2 termékek állíthatók elő (34. ábra). A folyamatos rendszerben alkalmazott HPLC készülék nem tette lehetővé a kis léptékű változtatást, ezért a VA aránya 10-30 MR között mozgott az egyes mérések során. Mivel a szakaszos kísérletek során azt tapasztaltam, hogy 10 MR VA arány fölött a további VA arány növelésnek csak csekély hatása van a produktivitásra, és a folyamatos kísérleteknél nem vizsgáltam külön az alkalmazott VA arány hatását, ezért csak látszólagos, vagyis az optimális átlagos tartózkodási idő helyén számított TOF-ot határoztam meg a 32. egyenlet segítségével. A kapott 0,097 mmol átalakított szubsztrát · g enzim-1 · min-1 kisebb, de közel azonos a szakaszos kísérletek esetén kapott 0,125 mmol átalakított szubsztrát termék · g enzim-1 · min-1 TON értékkel. A folyamatos rendszer maximális produktivitása ~ 6-szorosa a szakaszos üzemben elért maximumnak (7. táblázat).

2.2.4

Az 1-feniletanol észterképzési reakciója A korábbi 2.2.1., 2.2.2. és 2.2.3. fejezetekben kinetikus reszolválásokat mutattam be,

azonban az ezzel a technológiával elérhető 50 % elméleti maximális konverzió tovább növelhető elméletileg 100 %-ra a dinamikus-kinetikus reszolválás segítségével. A PE mintapéldáján keresztül vizsgáltam ennek a technológiának a hatékony megvalósíthatóságát. 2.2.4.1 Az (S)-1-feniletanol racemizálása szakaszos reaktorban A PE kinetikus reszolválását már számtalan közegben és módon megvalósították, az egyik legtöbbet tanulmányozott modellvegyület. ScCO2-ban is vizsgálták már szakaszos és folyamatos kinetikus reszolválását, azonban így csak maximálisan 50 %-os konverzió érhető el. A kémiai katalízissel kombinált biokatalízis, vagyis a dinamikus-kinetikus reszolválás megoldást jelenthet erre a problémára (36. ábra). Míg az enzim a gyorsabban reagáló enantiomert termékké alakítja, addig a visszamaradó lassabban reagáló enantiomert racemizálja a kémiai katalizátor. A PE esetében számos irodalmi hivatkozást találunk dinamikus-kinetikus reszolválásra

[148, [148, 211,211-215] 212, 213, 214, 215] ,

azonban melléktermékek képződése nélkül, jó

hozammal még nem sikerült megvalósítani. A megoldáshoz elengedhetetlen egy megfelelő enzim – katalizátor pár kiválasztása és az optimális működésükhöz szükséges körülmények beállítása. Ez sok esetben problémát jelent, mivel a kémiai katalizátorok legtöbbször csak magasabb hőmérséklet tartományban (80 °C felett) mutatnak aktivitást, míg az enzimek ilyen körülmények között történő alkalmazása általában részleges vagy teljes inaktiválódással és ebből következően aktivitás és enantioszelektivitás vesztéssel jár. 74

O H3C * OH

H3C

O H2C

O

*

CH3

CH3

+

lipáz

(±)-PE

H3C * O

OH

(S)-PE

(R)-PEAc

kémiai katalizátor 35. ábra A PE lipáz katalizált dinamikus kinetikus reszolválása

A racemizálási reakciókat szakaszos reaktorban (16. ábra) végeztem, bemértem 20100 µl közötti mennyiségű (S)-PE-t és a megfelelő mennyiségű katalizátort (ez függött attól, hogy a katalizátor szabad, vagy rögzített formában volt jelen, a katalizátor, és rögzített esetben, a hordozó típusától). A reakciókat 10 MPa nyomáson és 40-90 °C között változó hőmérsékleten 20 órán át végeztem (keverési sebesség: 200 1/min). Az irodalomban ismertetett különböző kémiai katalizátorokat teszteltem (S)-PE racemizálására (10. táblázat). A kísérleteket szakaszos reaktorban, az adott katalizátornak az irodalomban található működési optimumán végeztem, azonban, ha az adott beállítások nagyon távol esnek az enzim számára megfelelő hőmérséklet és nyomás tartománytól, a biokatalizátor működési határértékét állítottam be. A vizsgált kémiai racemizáló katalizátorokkal kapott eredményeket a 10. táblázatban foglaltam össze, az összehasonlításhoz három jellemzőt, a konverziót, a PE enantiomertisztaságát és a melléktermékek keletkezését figyeltem. A további vizsgálatokra az a katalizátor lehet alkalmas, amely jó konverzióval racemizál, vagyis a reakció végén az enantiomerkeverék összetétele közel racém és nem, vagy csak minimális mennyiségű melléktermék keletkezik. Közel egy tucat PE racemizálásával vagy kinetikus reszolválásával foglalkozó cikkből [211-219] mindössze kettőben tesznek említést melléktermék-képződésről, a feltételezések szerint leggyakrabban feniletiléter dimerek keletkeznek

[148, 214]

. Ezek közül egyetlen kutatócsoport, Wuyts és munkatársai végeztek

vizsgálatokat, arra vonatkozóan, hogy a bemért szubsztrát koncentráció befolyásolja a mellékreakciók kialakulását és azt találták, hogy csak 0,1 M-nál nagyobb kiindulási szubsztrát koncentráció esetén megy végbe dimerizáció. Ezzel szemben a méréseim során egy nagyságrenddel kisebb (0,0055 – 0,055 M) szubsztrát koncentrációt alkalmaztam, mégis az irodalommal ellentétben számos esetben tapasztaltam melléktermékképződést. A mintákat a királis GC mellett GC-MS módszerrel is analizáltam, az MS spektrumok alapján valószínűsíthető, hogy a keletkezett melléktermékek feniletiléter dimer diasztereomer vegyületek, ahogy azt az irodalom is alátámasztja. 75

10. táblázat A vizsgált katalizátorok

Katalizátor

Xa

eePEb

MTc

(%)

(%)

(%)

> 70 % > 70 % > 70 % > 70 % > 70 % > 70 %

n. d. n. d. n. d. n. d. n. d. n. d.

BASF Pd/G1-21 BASF Pd/K3-10 BASF Pd/R1-10 BASF Pd/R3-11 Pd/C Pd/C

fém fém fém fém fém fém

≤6% ≤6% ≤6% ≤6% ≤6% ≤6%

Pd

fém

KIPRu(II) KIPRu(II)+Na2CO3 KPRu(II)

fém fém fém

≤ 6 % > 70 % ≤ 5 % ≤ 6 % > 70 % n. d. > 10 % > 70 % > 25 % ≤ 6 % > 70 % n. d.

KPRu(II)+Na2CO3

fém

CoCl2 · 6H2O VOSO4 · xH2O VOSO4 · xH2O Benzénszulfonsav

P

T

t

(MPa) (°C) (h)

ms/mkat (g/g)

10 10 10 10 10 10

80 80 80 80 85 85

21 67 67 21 21 20

0,97 0,54 0,81 0,87 0,95 1,00

[216]

10

85

19

0,47

[216]

10 10 10

40 70 40

10 20 21

1,00 10,94 1,18

[211, 217]

[216] [216] [216] [216] [216]

[211, 217]

10

70

20

12,27

fém fém fém savas

≤ 6 % > 70 % ≤ 5 % ≤ 6 % > 70 % n. d. > 10 % < 55 % > 25 % ≤ 6 % < 30 % > 75 % > 10 % < 30 % > 75 %

10 10 10 10

80 40 80 40

20 2 69 70

1,05 0,31 0,94 1,99

[218]

Nafion NR-50

savas

> 35 % < 55 % ≤ 5 %

10

40

22

1,01

[214]

Nafion NR-50 (új)

savas

> 35 % < 30 % ≤ 5 %

10

80

68

0,99

[214]

Nafion SAC 13 Zeolit

savas savas

> 10 % < 30 % > 25 % ≤ 6 % > 70 % n. d.

10 10

40 40

12 7

0,09 0,99

[211,214]

Zeolit

savas

≤ 6 % > 70 % ≤ 5 %

10

45

23

0,61

[148, 215, 219]

Zeolit

savas

> 35 % < 30 % ≤ 5 %

10

80

17

0,27

[148, 215, 219]

Zeolit

savas

> 35 % < 30 % ≤ 5 %

10

80

99

0,33

[148, 215, 219]

Zeolit

savas

> 35 % < 30 % ≤ 5 %

10

80

25

0,39

[148, 215, 219]

Zeolit

savas

> 10 % < 30 % > 25 %

10

80

25

0,29

[148, 215, 219]

[212] [212] [213]

[148, 215, 219]

a

X értékeit a következő tartományokra osztottam: 0 ≤ X ≤ 6 % esetén ≤ 6 %, 7 < X < 35 % esetén > 10 %, X > 35 % esetén > 35 %. b eePE értékeit a következő tartományokra osztottam: 0 ≤ eePE < 30 % esetén < 30 %, 30 < eePE < 55 % esetén < 55 %, 55 < eePE < 70 % esetén < 70 %, eePE > 70 % esetén > 70 %. c

MT a keletkezett melléktermékek aránya:

MT =

cmelléktermék . cmelléktermék + ctermék

Amennyiben a kis konverzió miatt nem volt detektálható mennyiségű melléktermék n. d.-vel jelöltem. MT értékeit a következő tartományokra osztottam: 0 ≤ eePE ≤ 5 % esetén ≤ 5 %, 25 < eePE < 75 % esetén > 25 %, eePE > 75 % esetén > 75 %.

76

A kapott eredményeket összesítve a három figyelt jellemző alapján minden katalizátort besoroltam, majd mind három mutató esetében külön-külön kiválasztottam a megfelelő értéket mutató (10. táblázat színes cellák) katalizátorokat. Az a katalizátor lehet eredményes a DKR során, amely mindhárom vizsgált paraméter szerint megfelel. Ha megnézzük a táblázatot, látható hogy a fém katalizátorok közül nem bizonyult alkalmasnak egyik sem, míg a savas katalizátorok közül a Nafion NR-50 és a Zeolit bíztatónak tűnt. A Pd katalizátor feltehetően azért sem volt hatékony a racemizálásra, mivel magasabb hőmérsékleten (100150 °C-on) alkalmazzák, azonban ez a hőmérséklet az enzim számára nem lenne megfelelő, ezért 80 °C-on végeztem a kísérleteket. 2.2.4.2 Az 1-feniletanol dinamikus-kinetikus reszolválása A DKR-hoz tehát a két kiválasztott savas katalizátort teszteltem PSC-I, PS-IM és CALB immobilizált lipáz enzimekkel kombinálva a 36. ábrán látható folyamatos üzemű reaktorban, amelynek működését már a 2.1.3 fejezetben részletesen ismertettem. Az irodalomban számos acilezőszerrel (VA, acetofenon, vinil-oktanát, vinil-proprionát) vizsgálták már ezt a reakciót. Kísérleteimhez a korábbi sikeresen lejátszódott reakciók alapján VA-ot választottam.

6 5

4 3

1 7 36. ábra Folyamatos üzemű reaktor vázlata PE dinamikus-kinetikus reszolválásához 1. CO2 puffertartály, 2. nagynyomású szivattyú, 3. szubsztrát + reagens, 4. HPLC pumpa, 5. enzimreaktor oszlop, 6. minta, 7. termosztált vízfürdő

A mérésekhez a reaktor oszlopba (5) 1:1:1 tömeg arányban betöltöttem a szűrő után az enzimet, a katalizátort, majd ismét az enzimet olyan formán, hogy a két szélén egyenlő mennyiségű enzim és közötte fizikálisan elkülönített katalizátor legyen, mivel az érintkezésük 77

az enzim aktivitásvesztését okozhatja [220, 221]. A szubsztrát tartóban (3) a VA és a PE térfogat aránya 1:1 volt. Ebben az összeállításban a legjobb elérhető eredmény 100 % PEAc ee és 75 % hozam. A reakciót 0,037 M-os szubsztrát koncentráció mellett 10 MPa nyomáson és 45 illetve 80 °C-on 210 percig végeztem, a CO2 (egyszer desztillált) térfogatárama 1 ml/min volt. A racemizálással szemben a DKR esetében a PE enantiomertisztasága helyett a keletkezett termék enantiomertisztasága érdekes, valamint a melléktermék képződés miatt a konverzió nem jó összehasonlító mutató, mivel itt csak a kiindulási anyagra vonatkoztatok, ezért inkább a PEAc-ra számított hozamokat figyeltem a reakció követésének érdekében. A cél

minél

jobb

hozammal

melléktermék

képződés

nélkül

a

lehető

legnagyobb

enantiomertisztaságú termék előállítása.

ee PEAc, Y, MT (%)

100% 90% 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0%

eePEAc Y MT

Naf NR-50/PSC-I zeolit/CAL-B

zeolit/PS-IM

37. ábra A PE dinamikus-kinetikus reszolválása különböző enzim – katalizátor párokkal 45°C (Naf NR-50), 80°C (zeolit)

A vizsgált katalizátorok közül a zeolittal kapott eredmények bizonyultak jobbnak minden tekintetben. A 37. ábrán megfigyelhető, hogy a zeolittal végzett kísérletek közül a CAL-B enzimmel elért eredmények közelítik a kívánt értékeket (eePEAc > 85 %, Y > 75 %, MT < 20 %). Ugyan a PS-IM enzimmel a termék enantioszelektivitása közel 100 %, azonban a hozam messze elmaradt a CAL-B enzimmel elérthez képest és a melléktermékek aránya is valamivel nagyobb, mint a CAL-B enzim esetén. Tehát mind három vizsgált paramétert (eePEAc, Y és MT) figyelembe véve a három katalizátor – enzim pár körül a zeolit – CAL-B pár volt a legeredményesebb, megközelítik az elméleti maximumot.

78

3

Összefoglalás PhD

munkám

során

négy vegyület

((4-fenilazetidin-2-on

(LAK)),

transz-2-

hidroxiciklohexánkarbolnitril (CCH), transz-1,2-ciklohexándiol (CHD), 1-feniletanol (PE)) különböző típusú reakcióját vizsgáltam az enzimes kinetikus és dinamikus kinetikus reszolválás módszereivel szakaszos, valamint folyamatos üzemű készülékekben. A nyomás, a hőmérséklet, a reagens koncentráció és a vízkoncentráció hatásait vizsgáltam az enzim aktivitására és enantioszelektivitására nézve. A LAK vegyület gyűrűnyitásos kinetikus reszolválása során a hőmérséklet és a nyomás hatását vizsgáltam és megállapítottam, hogy az enzimaktivitás ~14 MPa nyomáson és ~ 70 °C hőmérsékleten a legnagyobb. A reakció enantioszelektivitása a vizsgált körülmények között kitűnő (a termék fenilalanin (Phe) ee > 98 %). A termék Phe és a szubsztrát LAK között a scCO2-ban

több

mint

egy

nagyságrendnyi

oldhatóság

különbség

következtében

megvalósítható szuperkritikus extrakcióval a LAK szelektív kioldása. A CCH szakaszos kinetikus reszolválásakor az acilezőszer (vinil-acetát (VA)) arányának változtatásával meghatároztam a reakció teljes lejátszódásához minimálisan szükséges VA arányt és a látszólagos maximális „turnover numbert” 10 MPa nyomáson és 45 °C hőmérsékleten. A teljes konverzió eléréséhez minimálisan szükséges VA arány a 2-es mólarány volt. A hőmérséklet – nyomás – vízkoncentráció együttes vizsgálatakor megállapítottam, hogy az enzim optimális működési tartománya a vízkoncentráció tekintetében igen szűk, azonban az egyszer desztillált CO2 és az enzim által együttesen biztosított vízkoncentráció az optimális működési tartományába esik. A CHD kétlépéses konszekutív acilezési reakciója során meghatároztam az egyes reakciólépések reakciósebességi állandóit és megállapítottam, hogy az enzim az első és a második reakciólépés során is az (1R,2R) enantiomer acilezést preferálja. Mivel az (1S,2S) enantiomer esetén a második acilezési lépés elhanyagolható sebességgel játszódik le, ezért a reakció teljes lefutásakor (10-es vagy annál nagyobb alkalmazott VA arány mellett) enantiomertiszta (1S,2S) mono-, illetve (1R,2R) diacilezett termékeket kaptam. A szakaszos rendszerben kiszámított „turnover number”-t alapul véve egy folyamatos rendszert terveztem, amelyben optimalizáltam az átlagos tartózkodási időt és ~5 s-os tartózkodási időnél közel maximális enantiomertisztasággal (eeCHDAc > 97 %, eeCHDAc2 > 99,9 %) és produktivitással állítottam elő a kívánt acilezett származékokat. A

PE

dinamikus-kinetikus

reszolválásához

racemizálási

előkísérletek

alapján

kiválasztott két alkalmas savas katalizátort különböző lipázokkal kombináltam és a legjobb eredményt zeolit – CAL-B katalizátor – enzim párral értem el. Jó hozammal (75 %) és enantiomertisztasággal (> 85 %) állítottam elő az acetát terméket. 79

Általánosan összefoglalva a vizsgált paraméterek az enzimes rendszerre gyakorolt hatását megállapítható, hogy legtöbbször a hőmérséklet, a nyomás és a további paraméterek együttesen, egymással kölcsönhatásban adják meg az optimális beállítási értékeket. A hőmérséklet növelése adott értékig javítja az enzimaktivitást, azonban az optimális hőmérséklet (~70 °C) fölött mind az aktivitást, mind az enantioszelektivitást negatívan befolyásolhatja. A nyomás hatása kevéssé jelentős, azonban optimum pont itt is tapasztalható, ~14-15 MPa nyomáson. A vizsgált reakciók egyensúlyi reakciók és azt tapasztaltam, hogy nem minden esetben játszódnak le teljesen a sztöchiometrikusnak megfelelő reagens arány mellett, hanem ennél jóval nagyobb arány szükséges a reakció teljes lejátszódásához. Adott arány fölött már csökken a kezdeti reakciósebesség növelő hatás. Ezért fontos vegyületenként meghatározni a teljes konverzióhoz minimálisan szükséges reagens mennyiséget. A víz jelenléte alapvetően fontos minden enzim számára, azonban az optimális vízkoncentráció igen szűk tartományban mozog. Vízkoncentráció hatásának vizsgálata során azt tapasztaltam, hogy az enzim működéséhez szükséges az immobilizált enzimkészítményen kötött vízen kívül további hozzáadott víz jelenléte, azonban a túlzott mennyiségű víz jelentős aktivitás csökkenést okoz. A technológiai szempontból kedvező, egyszer desztillált CO2 által hordozott víz valamint az enzimkészítmény természetes víztartalma egy jól reprodukálható, állandó vízkoncentrációt biztosít a rendszerben, valamint ez a vízkoncentráció az enzim optimális működési tartományába esik, így ennek a beállításnak az alkalmazása indokolt lehet akár nagyobb méretben is. Technológiai szempontból a CO2 nem csak reakcióközegként, hanem a terméket és a szubsztrátot az enzimtől és egymástól elválasztó közegként is szerepet kaphat a vegyületek eltérő oldhatóságának köszönhetően. A szakaszos rendszerben elérhető produktivitás jelentősen növelhető a folyamatos technológia bevezetésével, azonban a kinetikus reszolválással maximálisan elérhető 50 %-os konverziót a dinamikus-kinetikus reszolválás segítségével lehet hatékonyan növelni.

80

4 [1]

Irodalomjegyzék Biot, J. B.: Phénomènes de polarisation successive, observés dans des fluides homogènes.

Bull. Soc. Philomath. Paris 1815, 1, 190-192. [2]

Pasteur, L.: Mémoire sur la relation qui peut exister entre la forme crystalline et la

composition chimique, et sur la cause de la polarization rotatoire. Compt. Rend. Acad. Sci.

1848, 26, 535-539. [3]

Kojić-Prodić, B., Štefanić Z.: Symmetry versus asymmetry in the molecules of life:

Homomeric protein assemblies. Symmetry 2010, 2, 884-906. [4]

Thompson, W. (Lord Kelvin): Baltimore lectures on molecular dynamics and the wave

theory of light. C. J. Clay and Sons, London, UK, 1904, pp. 618-619. [5]

Fischer, E.: Über die Configuration des Traubenzuckers und seiner Isomeren. II. Ber.

Dtsch. Chem. Ges. 1891, 24, 2683-2687. [6]

Cahn, R. S., Ingold, C. K., Prelog, V.: The specification of asymmetric configuration in

organic chemistry. Experientia 1956, 12, 81-94. [7]

Smith, S. W.: Chiral toxicology: It's the same thing…only different. Toxicol. Sci. 2009,

110, 4-30. [8]

Jamali, F., Mehvar, R., Pasutto, F. M.: Enantioselective aspects of drug action disposition:

therapeutic pitfalls. J. Pharm. Sci. 1989, 78, 695-715. [9]

Caldwell, J.: The importance of stereochemistry in drug action and disposition. J. Clin.

Pharmacol. 1992, 32, 925-929. [10]

Drayer, D. E.: Pharmacodynamic and pharmacokinetic differences between drug

enantiomers in humans: An overview. Clin. Pharmacol. Ther. 1986, 40, 125-133. [11]

Eichelbaum, M. Pharmacokinetic and pharmacodynamic consequences of stereoselective

drug metabolism in man. Biochem. Pharmacol. 1988, 37, 93-96. [12]

Kar, A.: Medicinal Chemistry. New Age International (P) Ltd., Delhi, India, 3. javított

kiadás, 2005, pp. 47-48. [13]

Leinz, W.: A short history of thalidomide embryopathy. Teratology 1988, 38, 203-215.

[14]

Shimazawa, R., Nagai, N., Toyoshima, S., Okuda, H.: Present state of new chiral drug

development and review in Japan. J. Health Sci. 2008, 54, 23-29. [15]

Announcement: FDA’s policy statement for the development of new stereoisomeric drugs.

Chirality 1992, 4, 338-340. 81

[16] [17]

Hutt, A. J., Tan, S. C.: Drug chirality and its clinical significance. Drugs 1996, 52, 1-12. Hutt, A. J., O’Grady, J.: Drug chirality: a consideration of the significance of the

stereochemistry of antimicrobial agents. J. Antimicrob. Chemother. 1996, 37, 7-32. [18]

Lien, E. J.: Chirality and drug targeting: pros and cons. J. Drug Targeting 1995, 2, 527-

532. [19]

Jacobsen, E. N., Pfaltz, A., Yamamoto, H.: Comprehensive Asymmetric Catalysis. 3.

kötet, Springer-Verlag, Berlin, Heidelberg, New York, NY, USA, 1999 [20]

Breuer, M., Ditrich, K., Habicher, T., Hauer, B., Kesseler, M., Stürmer, R., Zelinski, T.:

Industrial methods for the production of optically active intermediates. Angew. Chem. Int. Ed.

2004, 43, 788-824. [21]

Marchanda, P., Lefèbvrea, L., Querniarda, F., Cardinaëlb, P., Perezb, G., Couniouxc, J.-J.,

Coquerel, G.: Diastereomeric resolution rationalized by phase diagrams under the actual conditions of the experimental process. Tetrahedron: Asymmetry 2004, 15, 2455-2465. [22]

Seidel-Morgenstern, A., Kessler, L. C., Kaspereit, M.: New developments in simulated

moving bed chromatography (Review). Chem. Eng. Technol. 2008, 31, 826-837. [23]

Subramanian, G.: Chiral separaration techniques: A practical approach. Wiley-VCH Verlag

GmbH & Co., Winheim, Németország, 2007, 3. javított kiadás [24]

Xie, R., Chu, L. Y.,

Deng J. G.: Membranes and membrane processes for chiral

resolution. Chem. Soc. Rev. 2008, 37, 1243-1263. [25]

de Haan, A. B., Simandi, B.: Extraction Technology for the Separation of Optical Isomers.

Ion Exchange and Solvent Extraction. (Ion exchange and solvent extraction) 15. kötet, Marcel Dekker Inc., New York, NY, USA, 2001, pp. 255-294. [26]

Seyden-Penne J.: Chiral auxiliaries and ligands in asymmetric synthesis. John Wiley &

Sons Inc., New york, NY, USA, 1995, pp. 43-45. [27]

Blaser, H. U.: Enantioselective catalysis in fine chemicals production. Chem. Commun.

2003, 7, 293-296. [28]

Carey, J. S., Laffan, D., Thomson, C., Williams, M. T.: Analysis of the reactions used for

the preparation of drug candidate molecules. Org. Biomol. Chem. 2006, 4, 2337-2347. [29]

Kozma D., Ács M., Fogassy E.: Predictions of which diastereoisomeric salt precipitates

during an optical resolution via diastereoisomeric salt formation. Tetrahedron 1994, 50, 69076912. 82

[30]

Hirschfelder, J. O., Lightfoot, E. N., Howard, D. W.: Hydrodynamic method for separation

of solid bodies or crystals. US Patent 4010095, 1977 [31]

de Gennes, P. G.: Mechanical selection of chiral crystals, Europhys. Lett. 1999, 46, 827-

831. [32]

Faigl, F., Kovács, E., Mátravölgyi, B., Thurner, A.: Gyógyszerkémiai alapfolyamatok.

Typotex Kiadó, Budapest, Magyarország, 2011, pp. 122-123. [33]

Francotte, E. R., Richert, P.: Applications of simulated moving-bed chromatography to the

separation of the enantiomers of chiral drugs. J. Chromatogr. A 1997, 769, 101-107. [34]

Sekhon, B. S.: Enantioseparation of chiral drugs – An overview. Int. J. Pharm. Tech. Res.

2010, 2, 1584-1594. [35]

Matsuda, T., Tsuji, K., Kamitanaka, T., Harada, T., Nakamura, K., Ikariya, T.: Rate

enhancement of lipase-catalyzed reaction in supercritical carbon dioxide. Chem. Lett. 2005, 34, 1102-1103. [36]

Rogers, A., Gibon, Y.: Enzyme kinetics: Theory and practice. (Plant metabolic networks),

Springer Dordrecht Heildelberg London, New york, NY, USA, 2008, pp. 74-79. [37]

Poppe, L., Novák, L.: Selective biocatalysis: A synthetic approach. VCH Verlag GmbH &

Co., Weinheim, Németország, 1992, pp. 3-5. [38]

Michaelis, L., Menten, M.: Die kinetik der invertinwirkung. Biochem. Z. 1913, 49, 333-

369. [39]

Johnson, K. A., Goody, R. S.: The original Michaelis constant: Translation of the 1913

Michaelis−Menten paper, Biochem. 2011, 50, 8264-8269. [40]

Briggs, G., Haldane, J.: A note on the kinetics of enzyme action. Biochem. J. 1925, 19,

338-339. [41]

Sevella, B.: Biomérnöki műveletek és folyamatok. Typotex Kiadó, Budapest,

Magyarország, 2011, pp. 38-41. [42]

Carberry, J. J.: Chemical and Catalytic Reaction Engineering. McGraw-Hill Book Co.,

New York. NY, USA, 1976, pp. 364-366. [43]

Lineweaver, H., Burk, D.: The determination of enzyme dissociation constants. J. Am.

Chem. Soc. 1934, 56, 658-666. [44]

Eadie, G. S.: The inhibition of cholinesterase by physostigmine and prostigmine. J Biol

Chem. 1942, 146, 85-93. 83

[45]

Hofstee, B. H. J.: On the evaluation of the constants Vm and KM in enzyme reactions.

Science 1952, 116, 329-331. [46]

Parker, S. P.: McGraw-Hill Dictionary of Scientific and Technical Terms. McGraw-Hill

Professional, New York, NY, USA, 6. kiadás, 2002 [47]

Boy, M., Dominik, A., Voss, H.: Fast determination of biocatalyst process stability.

Process Biochem. 1999, 34, 535-547. [48]

Uludag-Demirer, S., Duran, J., Tanner, R. D.: Estimating the turnover number in enzyme

kinetic reactions using transient and stationary state data. Braz. J. Pharm. Sci. 2009, 45, 635642. [49]

Liese, A., Seelbach, K., Wandrey, C.: Industrial biotransformations. Wiley-VCH Verlag

GmbH & Co., Weinheim, Németország, 2. jav. kiadás, 2006, pp. 118-119. [50]

Moss, G. P.: Basic terminology of stereochemistry, Pure Appl. Chem. 1996, 68, 2193-

2222. [51]

Chen, C.-S., Fujimoto, Y., Girdaukas, G., Sih, C. J.: Quantitative analyses of biochemical

kinetic resolutions of enantiomers. J. Am. Chem. Soc. 1982, 104, 1294-1299. [52]

Rakels, J. L. L., Straathof, A. J. J., Heijnen, J. J.: A simple method to determine the

enantiomeric ratio in enantioselective biocatalysis. Enzyme Microb. Technol. 1993, 15, 10511056. [53]

Matsuda, T., Kanamaru, R., Watanabe, K., Kamitanaka, T., Haradaa, T., Nakamura, K.:

Control of enantioselectivity of lipase-catalyzed esterification in supercritical carbon dioxide by tuning the pressure and temperature. Tetrahedron: Asymmetry 2003, 14, 2087-2091. [54]

Chen, C.-S., Wu, S.-H., Girdaukas, G., Sih, C. J.: Quantitative analyses of biochemical

kinetic resolution of enantiomers. 2. Enzyme-cata1yzed esterifications in water-organic solvent biphasic systems. J. Am. Chem. Soc. 1987, 109, 2812-2817. [55]

Afonso, C., Tulman, E., Lu, Z., Oma, E., Kutish, G., Rock, D.: The genome of melanoplus

sanguinipes entomopoxvirus. J. Virol. 1999, 73, 533-552. [56]

Girod, A., Wobus, C., Zádori, Z., Ried, M., Leike, K., Tijssen, P., Kleinschmidt, J., Hallek

M.: The VP1 capsid protein of adeno-associated virus type 2 is carrying a phospholipase A2 domain required for virus infectivity. J. Gen. Virol. 2002, 83, 973-978. [57]

Derewenda, U., Swenson, L., Wei, Y., Green, R., Kobos, P. M., Joerger, R., Haas, M. J.,

Derewenda, Z. S.: Conformational lability of lipases observed in the absence of an oil-water

84

interface: crystallographic studies of enzymes from the fungi Humicola lanuginosa and Rhizopus delemar. J. Lipid Res. 1994, 35, 524-534. [58]

Schrag, J. D., Li, Y., Cygler, M., Lang, D., Burgdorf, T., Hecht, H.-J., Schmid, R.,

Schomburg, D., Rydel, T. J., Oliver, J. D., Strickland, L. C., Dunaway, C. M., Larson, S. B., Day, J., McPherson, A.: The open conformation of a Pseudomonas lipase. Structure 1997, 5, 187-202. [59]

Uppenberg, J., Ohrner, N., Norin, M., Hult, K., Kleywegt, G. J., Patkar, S., Waagen, V.,

Anthonsen, T., Jones, T. A.: Crystallographic and molecular-modeling studies of lipase B from Candida antarctica reveal a stereospecific pocket for secondary alcohols. Biochemistry

1995, 34, 16838-16851. [60]

Martinez, C., DeGeus, P., Lauwereys, M., Mattyhssens, G., Cambillau, C.: Fusarium

solani cutinase is a lipolytic enzyme with a catalytic serine accessible to solvent. Nature 1992, 356, 615-618. [61]

Anderson, E. M., Larsson, K. M., Kirk, O.: One biocatalyst – many applications – the use

of Candida antarctica B-lipase in organic synthesis. Biocatal. Biotransform. 1997, 16, 181204. [62]

Uppenberg, J., Hanse, M. T., Patkar, S., Jones, T. A.: The sequence, crystal structure

determination and refinement of two crystal forms of lipase B from Candida antarctica. Structure 1994, 2, 293-308. [63]

Bousquet-Dubouch, M.-P., Graber, M., Sousa, N., Lamare, S., Legoy, M.-D.: Alcoholysis

catalyzed by Candida antarctica lipase B in a gas/solid system obeys a ping pong bi bi mechanism with competitive inhibition by the alcohol substrate and water. Biochim. Biophys. Acta 2001, 1550, 90-99. [64]

Martinelle, M., Hult, K.: Kinetics of acyl transfer reactions in organic media catalysed by

Candida antarctica lipase B. Biochim. Biophys. Acta 1995, 1251, 191-197. [65]

Bisswanger, H.: Enzyme kinetics: Principles and methods. I, Weinheim, Germany, 2002,

pp. 115-117. [66]

Jegannathan, K. R., Abang, S., Poncelet, D., Chan, E. S., Ravindra P.: Production of

biodiesel using immobilized lipase – A critical review. Crit. Rev. Biotechnol. 2008, 28, 253264. [67]

Hwang, B. Y., Lee, H. B., Kim, Y. G., Kim, B. G.: Kinetic resolution of racemic alpha-

methyl-beta-propiothiolactone by lipase-catalyzed hydrolysis. Biotechnol. Progr. 2000, 16, 973-978. 85

[68]

Huang, S.-H., Tsai, S.-W.: Kinetic resolution of (R,S)-ethyl 2-hydroxyl-4-phenylbutyrate

via lipase-catalyzed hydrolysis and transesterification in isooctane. J. Mol. Catal. B: Enzym.

2004, 28, 65-69. [69]

Aribi-Zouioueche, L., Fiaud, J.-C.: Kinetic resolution of 1-acenaphthenol and 1-

acetoxynaphthene through lipase-catalyzed acylation and hydrolysis, Tetrahedron Lett. 2000, 41, 4085-4088. [70]

Henke, E., Schuster, S., Yang, H., Bornscheuer, U.E.: Lipase-catalyzed resolution of

ibuprofen. Monatsh. Chem. 2000, 131, 633-638. [71]

Sánchez, A., Ferrer, P., Serrano, A., Valero, F., Solà, C., Pernas, M., Rúa, M. L.,

Fernández-Lafuente, R., Guisán, J. M., Casa, R. M., Sinisterra, J. V., Sánchez-Montero, J. M.: A controlled fed-batch cultivation for the production of new crude lipases from Candida rugosa with improved properties in fine chemistry. J. Biotechnol. 1999, 69, 169-182. [72]

D' Antona, N., Lombardi, P., Nicolosi, G., Salvo, G.: Large scale preparation of

enantiopure S-ketoprofen by catalyzed kinetic resolution. Process Biochem. 2002, 38, 373377. [73]

Sánchez, A., De La Casa, R. M., Sinisterra, J. V., Valero, F., Sánchez-Monteros, J. M.:

Effect of fermentation conditions in the enzymatic activity and stereoselective of crude lipase from Candida rugosa. Appl. Biochem. Biotechnol. 1999, 80, 65-75. [74]

Capewell, A., Wendel, V., Bornscheuer, U., Meyer, H. H., Scheper, T.: Lipase-catalyzed

kinetic resolution of 3-hydroxy esters in organic solvents and supercritical carbon dioxide. Enzyme Microb. Technol. 1996, 19, 181-186. [75]

Parve, O., Vallikivi, I., Lahe, L., Metsala, A., Lille, U., Tougu, V., Vija, H., Pehk, T.:

Lipase-catalysed enantioselective hydrolysis of bicyclo 3.2.0 heptanol esters in supercritical carbon dioxide. Bioorg. Med. Chem. Lett. 1997, 7, 811-816. [76]

Ghanem, A., Aboul-Enein, H. Y.: Application of lipases in kinetic resolution of racemates.

Chirality 2005, 17, 1-15. [77]

Matsuda, T., Tsuji, K., Kamitanaka, T., Harada, T., Nakamura, K., Ikariya, T.: Rate

enhancement of lipase-catalyzed reaction in supercritical carbon dioxide. Chem. Lett. 2005, 34, 1102-1103. [78]

Kumar, I., Manju, K., Jolly, R. S.: A new biocatalyst for the preparation of

enantiomeically pure 2-arylpropionic acids. Tetrahedron: Asymmetry 2001, 12, 1431-1434. [79]

Steenkamp, L., Brady, D.: Screening of commercial enzymes for the enantioselective

hydrolysis of R,S-naproxen ester. Enzyme Microb. Technol. 2003, 32, 472-477. 86

[80]

Santaniello, E., Ferraboschi, P., Grisenti, P.: Lipaze-catalyzed transesterification in

organic solvents: Applications to the preparation of enantiomerically pure compounds. Enzyme Microb. Technol. 1993, 15, 367-382. [81]

Bhandarkar, S. V., Neau, S. H.: Lipase-catalyzed enantioselective esterification of

flurbiprofen with n-butanol, Electron. J. Biotechnol. 2000, 33, 1-7. [82]

Persson, B. A., Larsson, A. L. E., Le Ray, M., Backvall, J. E.: Ruthenium- and enzyme-

catalyzed dynamic kinetic resolution of secondary alcohols. J. Am. Chem. Soc. 1999, 121, 1645-1650. [83]

Schoffers, E., Golebiowski, A., Johnson, C. R.: Enantioselective synthesis through

enzymatic asymmetrization. Tetrahedron 1996, 52, 3769-3826. [84]

Pellissier, H.: Dynamic kinetic resolution. Tetrahedron 2003, 59, 8291-8327.

[85]

Koh, J. H., Jung, H. M., Kim, M. J., Park, J.: Enzymatic resolution of secondary alcohols

coupled with ruthenium-catalyzed racemization without hydrogen mediator. Tetrahedron Lett.

1999, 40, 6281-6284. [86]

Lee, D., Huh, E. A., Kim, M. J., Jung, H. M., Koh, J. H., Park, J.: Dynamic kinetic

resolution of allylic alcohols mediated by ruthenium- and lipase-based catalysts. Org. Lett.

2000, 2, 2377-2379. [87]

Liang, J., Ruble, J. C., Fu, G. C.: Dynamic kinetic resolution catalyzed by a planar-chiral

derivative of DMAP: Enantioselective synthesis of protected α-amino acids from racemic azlactones. J. Org. Chem. 1998, 63, 3154-3155. [88]

Riermeier, T. H., Gross, P., Monsees, A., Hoff, M., Trauthwein, H.: Dynamic kinetic

resolution of secondary alcohols with a readily available ruthenium-based racemization catalyst. Tetrahedron Lett. 2005, 46, 3403-3406. [89]

Pamies, O., Backvall, J. E.: Combination of enzymes and metal catalysts. A powerful

approach in asymmetric catalysis. Chem. Rev. 2003, 103, 3247-3261. [90]

Turner, N. J.: Controlling Chirality. Curr. Opin. Biotechnol. 2003, 14, 401-406.

[91]

Parvulescu, A., De Vros, D., Jacobs, P.: Efficient dynamic kinetic resolution of secondary

amines with Pd on alkaline earth salts and a lipase. Chem. Comm. 2005, 14, 5307-5309. [92]

Cagniard de la Tour, C.: Exposé de quelques résultats obtenus par l'action combinée de la

chaleur et de la compression sur certains liquides , tels que l'eau , l'alcool , l'éther sulfurique et l'essence de pétrole rectifiée. Ann. Chim. Phys. 1822, 22, 127-132.

87

[93]

Lee, C. T., Psathas, Jr., P. A., Johnston, K. P.: Water-in-carbon dioxide emulsions:

formation and stability. Langmuir 1999, 15, 6781-6791. [94]

Barry, J. J. A., Silva, M. M. C. G., Popov, V. K., Shakesheff, K. M., Howdle, S. M.:

Supercritical carbon dioxide: putting the fizz into biomaterials. Philos. Trans. R. Soc. A 2006, 364, 249-261. [95]

Ting, S. S. T., Macnaughton, S. J., Tomasko, D. L., Foster, N. R.: Solubility of naproxen

in supercritical carbon-dioxide with and without cosolvents. Ind. Eng. Chem. Res. 1993, 32, 1471-1481. [96]

Zosel, K.: Separation with supercritical gases: practical applications. Angew. Chem. Int.

Ed. 1978, 17, 702-709. [97]

Roy, B. C., Hoshino, M., Ueno, H., Sasaki, M., Goto, M.: Supercritical carbon dioxide

extraction of the volatiles from the peel of japanese citrus fruits. J. Essent. Oil Res. 2007, 7, 92-96. [98]

J. M. DeSimone, J. M., Romack, T., McClain, J. B., DeYoung, J., Lienhart, R. B.,

Huggins, K.: Method for carbon dioxide dry cleaning with integrated distribution. US Patent 6,248,136, 2001 [99]

White, A., Burns, D., Christensen, T. W.: Effective terminal sterilization using

supercritical carbon dioxide. J. Biotechnol. 2006, 123, 504-515. [100]

Yeo, S.-D., Kiran, E.: Formation of polymer particles with supercritical fluids: A review.

J. Supercrit. Fluids 2005, 34, 287-308. [101]

Chen, C. S., Sih, C. J.: General aspects and optimization of enantioselective biocatalysis

in organic solvents. The use of lipases. Angew. Chem. Int. Ed. 1989, 28, 695-707. [102]

Dordick, J. S.: Designing enzymes for use in organic solvents. Biotechnol. Progr. 1992,

8, 259-267. [103]

Knez, Ž.: Enzymatic reactions in dense gases. J. Supercrit. Fluids 2009, 47, 357-372.

[104]

Randolph, T. W., Blanch, H. W., Prausnitz, J. M., Wilke, C. R.: Enzymatic catalysis in a

supercritical fluid. Biotechnol. Lett. 1985, 7, 325-328. [105]

Hammond, D. A., Karel, M., Klibanov, A. M., Krukonis, V. J.: Enzymatic-reactions in

supercritical gases. Appl. Biochem. Biotechnol. 1985, 11, 393-400. [106]

Marty, A., Combes, D., Condoret, J. S.: Continuous reaction-separation process for

enzymatic esterification in supercritical carbon dioxide. Biotechnol. Bioeng. 1994, 43, 497504. 88

[107]

Gamse, T., Kracker-Semler, G., Marr, R.: Reactions in supercritical carbon dioxide

efficient product fractionation following enzymatic aroma synthesis. (Proceedings of the Sixth International Symposium on Supercritical Fluids), 2. kötet, 2003, p. 1435. [108]

Gießauf, A., Magor, W., Steinberger, D. J., Marr, R.: A study of hydrolases stability in

supercritical carbon dioxide (SC-CO2). Enzyme Microb. Technol. 1999, 24, 577-583. [109]

Csajági, Cs., Szatzker, G., Tőke, E. R., Ürge, L., Darvas, F., Poppe, L.: Enantiomer

selective acylation of racemic alcohols by lipases in continuous-flow bioreactors. Tetrahedron: Asymmetry 2008, 19, 237-246. [110]

Nagesha, G. K., Manohar, B., Sankar, K. U.: Enzymatic esterification of free fatty acids

of hydrolyzed soy deodorizer distillate in supercritical carbon dioxide. J. Supercrit. Fluids

2004, 32, 137-145. [111]

Habulin, M., Primozic, M., Knez, Ž.: Stability of proteinase form Carica papaya latex in

dense gases. J. Supercrit. Fluids 2005, 33, 27-34. [112]

Ishikawa, H., Shimoda, M., Yonekura, A., Osajima, Y.: Inactivation of enzymes and

decomposition of alpha-helix structure by supercritical carbon dioxide microbubble method. J. Agric. Food Chem. 1996, 44, 2646-2649. [113]

Matsuda, T., Harada, T., Nakamura, K., Ikariya, T.: Asymmetric synthesis using

hydrolytic enzymes in supercritical carbon dioxide. Tetrahedron: Asymmetry 2005, 16, 909915. [114]

Randolph, T. W., Blanch, H. W., Clark, D. S.: Biocatalysis in supercritical fluids.

(Biocatalysis for industry), Plenum Press, New York, NY, USA, 1991, p. 219-237. [115]

Compton, D. L., King, J. W.: Lipase-catalyzed synthesis of triolein-based sunscreens in

supercritical CO2. J. Am. Oil Chem. Soc. 2001, 78, 43-47. [116]

Nakamura, K.: Biochemical reactions in supercritical fluids. Trends Biotechnol. 1990, 8,

288-292. [117]

Pasta, P., Mazzola, G., Carrea, G., Riva, S.: Subtilisin-catalyzed transesterification in

supercritical carbon dioxide. Biotechnol. Lett. 1989, 2, 643-648. [118]

Kamat, S., Critchley, G., Beckman, E. J., Russell, A. J.: Biocatalytic synthesis of

acrylates in organic solvents and supercritical fluids: III. Does carbon dioxide covalently modify enzymes? Biotechnol. Bioeng. 1995, 46, 610-620.

89

[119]

Yoon, S.-H., Miyawaki, O., Park, K.-H., Nakamura, K.: Transesterification between

triolein and ethylbehenate by immobilized lipase in supercritical carbon dioxide. J. Ferment. Bioeng. 1996, 82, 334-340. [120]

Steytler, D. C., Moulson, P. S., Reynolds, J. Biotransformation in near-critical carbon

dioxide. Enzyme Microb. Technol. 1991, 13, 221-226. [121]

Cernia, E., Palocci, C., Gasparrini, F., Misiti, D.: Pseudomonas lipase catalytic activity in

supercritical carbon dioxide. Chem. Biochem. Eng. 1994, 8, 1-4. [122]

Habulin, M., Krmelj, V., Knez, Ž.: Synthesis of oleic acid esters catalyzed by

immobilized lipase. J. Agric. Food Chem. 1996, 44, 338-342. [123]

Rezaei, K., Temelli, F., Jenab, E.: Effects of pressure and temperature on enzymatic

reactions in supercritical fluids, Biotechnol. Adv. 2007, 25, 272-280. [124]

Kamat, S. V., Beckman, E. J., Russell, A. J.: Enzyme activity in supercritical fluids. Crit.

Rev. Biotechnol. 1995, 15, 41-71. [125]

Dumont, T., Barth, D., Cohier, C., Branlant, G., Perrut, M.: Enzymatic reaction kinetic:

Cornparison in an organic solvent and in supercritical carbon dioxide. Biotechnol. Bioeng.

1992, 39, 329-333. [126]

Clifford, T., Bade, K.: Chemical reactions in supercritical fluids. Chem. Ind. 1996, 12,

449-452. [127]

Careri, G., Giansanti, A., Gratton, E.: Lysozyme film hydration events: an IR and

gravimetric study. Biopolymers 1979, 18, 1187-1203. [128]

Rupley, J. A., Careri, G.: Protein hydration and function. Adv. Protein Chem. 1991, 41,

37-72. [129]

Gupta, M. N.: Enzyme function in organic solvents. FEBS J. 1992, 203, 25-32.

[130]

Klibanov, A. M.: Enzymatic catalysis in anhydrous organic solvents. Trends Biochem.

Sci. 1989, 14, 141-144. [131]

Valivety, R. H., Halling, P. J., Macrae, A. R.: Rhizomucor miehei lipase remains highly

active at water activity below 0.0001. FEBS Lett. 1992, 301, 258-260. [132]

Zaks, A., Klibanov, A. M.: Enzymatic catalysis in organic media at 100 degrees C.

Science 1984, 224, 1249-1251. [133]

Primožič, M., Habulin, M., Knez, Ž.: Modeling of kinetics for the enzymatic hydrolysis

of sunflower oil in a high-pressure reactors. J. Am. Oil Chem. Soc. 2005, 82, 543-547. 90

[134]

Primožič, M., Habulin, M., Knez, Ž.: Thermodynamic properties of the enzymatic

hydrolysis of sunflower oil in high-pressure reactors. J. Am. Oil Chem. Soc. 2003, 80, 785788. [135]

Sovová, H., Zarevúcka, M.: Lipase-catalyzed hydrolysis of blackcurrant oil in

supercritical carbon dioxide. Chem. Eng. Sci. 2003, 58, 2339-2350. [136]

Zarevúcka, M., Vacek, M., Wimmer, Z., Stránský, K., Koutek, B., Demnerová, K.:

Enzymic transformations of blackcurrant oil: enrichment with γ-linolenic acid and α-linolenic acid. Chem. Listy 2003, 97, 206-213. [137]

Bártlová, M., Bernášek, P., Sýkora, J., Sovová, H.: HPLC in reversed phase mode: tool

for investigation of kinetics of blackcurrant seed oil lipolysis in supercritical carbon dioxide. J. Chromatogr. B 2006, 839, 80-84. [138]

Hampson, J.W., Foglia, T. A.: Effect of moisture content on immobilized lipase-catalyzed

triacylglycerol hydrolysis under supercritical carbon dioxide flow in a tubular fixed-bed reactor. J. Am. Oil Chem. Soc. 1999, 76, 777-781. [139]

Rezaei, K., Temelli, F.: Lipase-catalyzed hydrolysis of canola oil in supercritical carbon

dioxide. J. Am. Oil Chem. Soc. 2000, 77, 903-909. [140]

Khaled, N., Montet, D., Pina, M., Graille, J.: Fructose oleate synthesis in a fixed catalyst

bed reactor. Biotechnol. Lett. 1991, 13, 167-172. [141]

Petzelbauer, I., Kuhn, B., Splechtna, B., Kulbe, K. D., Nidetzky, B.: Development of an

ultrahightemperature process for the enzymatic hydrolysis of lactose IV. Immobilization of two thermostable β-glycosidases and optimization of packed bed reactor for lactose conversion. Biotechnol. Bioeng. 2002, 77, 619-631. [142]

Xi, W. W., Xu, J. H.: Preparation of enantiopure (S)-ketoprofen by immobilized Candida

rugosa lipase in packed bed reactor, Process Biochem. 2005, 40, 2161-2166. [143]

Romero, M. D., Calvo, L., Alba, C., Habulin, M., Primožič, M., Knez, Ž.: Enzymatic

synthesis of isoamyl acetate with immobilized Candida antarctica lipase in supercritical carbon dioxide. J. Supercrit. Fluids 2005, 33, 77-84. [144]

Lozano, P., Víllora, G., Gómez, D., Gayo, A. B., Sánchez-Conesa, J. A., Rubio, M.,

Iborra, J. L.: Membrane reactor with immobilized Candida antarctica lipase B for ester synthesis in supercritical carbon dioxide. J. Supercrit. Fluids 2004, 29, 121-128.

91

[145]

Olsen, T., Kerton, F., Marriott, R., Grogan, G.: Biocatalytic esterification of lavandulol in

supercritical carbon dioxide using acetic acid as the acyl donor. Enzyme Microb. Technol.

2006, 39, 621-625. [146]

Michor, H., Marr, R., Gamse, T., Shilling, T., Klingsbichel, E., Schwab, H.: Enzymatic

catalysis in supercritical carbon dioxide: comparison of different lipases and a novel esterase. Biotechnol. Lett. 1996, 18, 79-84. [147]

Almeida, M. C., Ruivo, R., Maia, C., Freire, L., de Sampaio, T. C., Barreiros, S.:

Novozym 435 activity in compressed gases. Water activity and temperature effects. Enzyme Microb. Technol. 1998, 22, 494-499. [148]

Overmeyer, A., Schrader-Lippelt, S., Kasche, V., Brunner, G.: Lipase-catalysed kinetic

resolution of racemates at temperatures from 40 °C to 160 °C in supercritical CO2. Biotechnol. Lett. 1999, 21, 65-69. [149]

Kumar, R., Madras, G., Modak, J.: Enzymatic synthesis of ethyl palmitate in supercritical

carbon dioxide. Ind. Eng. Chem. Res. 2004, 43, 1568-1573. [150]

Dublanchet, A.-C., Ducrot, P., Andrianjara, C., O’Gara, M., Morales, R., Compère, D.,

Denis, A., Blais, S., Cluzeau, P., Courté, K., Hamon, J., Moreau, F., Prunet, M.-L., Tertre, A.: Structure-based design and synthesis of novel non-zinc chelating MMP-12 inhibitors, Bioorg. Med. Chem. Lett. 2005, 15, 3787-3790. [151]

Ruf, S., Neudert, G., Gürtler, S., Grünert, R., Bednarski, P. J., Otto, H.-H.: β-Lactam

Derivatives as Potential Anticancer Compounds. Monatsh. Chem. 2008, 139, 847-857. [152]

Clader, J. W. J.: The discovery of ezetimibe: a view from outside the receptor. Med.

Chem. 2004, 47, 1-9. [153]

Li, X.-G., Kanerva, L. T.: Chemoenzymatic preparation of fluorine-substituted β-lactam

enantiomers exploiting Burkholderia cepacia lipase. Tetrahedron: Asymmetry 2007, 18, 2468-2472. [154]

Nagai, H., Shiozawa, T., Achiwa, K., Terao, Y.: Convenient syntheses of optically active

β-lactams by enzymatic resolution. Chem. Pharm. Bull. 1993, 41, 1933-1938. [155]

Nagai, H., Shiozawa, T., Achiwa, K., Terao, Y.: Facile enzymatic preparation of

enantiomeric β-lactams. Chem. Pharm. Bull. 1992, 40, 2227-2229. [156]

Forró, E., Paál, T., Tasnádi, G., Fülöp, F.: A new route to enantiopure β-aryl-substituted

β-amino acids and 4-aryl-substituted β-lactams through lipase-catalyzed enantioselective ring cleavage of β-lactams, Adv. Synth. Catal. 2006, 348, 917-923. 92

[157]

Forró, E., Fülöp, F.: Synthesis of 4-aryl-substituted β-lactam enantiomers by enzyme-

catalysed kinetic resolution. Tetrahedron: Asymmetry 2001, 12, 2351-2358. [158]

Vaidyanathan, R., Hesmondhalgh, L., Hu, S.: Chemoenzymatic synth androgen receptor

antagonist. Org. Process Res. Dev. 2007, 11, 903-906. [159]

Bernáth, G., Fülöp, F., Huber, I.: Eljárás cisz- vagy transz-2-(amino-metil)-1-

cikloalkanolok előállítására, HU 202 478 B, 1989 [160]

Hu L.-Y., Du, D., Hoffman, J., Smith, Y., Fedij, V., Kostlan, C., Johnson, T. R., Huang,

Y., Kesten, S., Harter, W., Yue, W. S., Li, J. J., Barvian, N., Mitchell, L., Lei, H. J., Lefker, B., Carroll, M., Dettling, D., Krieger-Burke, T., Samas, B., Yalamanchili, R., Lapham, K., Pocalyko, D., Sliskovic, D., Ciotti, S., Stoller, B., Hena, M. A., Ding, Q., Maiti, S. N., Stiera, M., Welgusa, H.: (1R,2S)-4-(2-Cyano-cyclohexyl-oxy)-2-trifluoromethylbenzonitrile, a potent androgen receptor antagonist for stimulating hair growth and reducing sebum production. Bioorg. Med. Chem. Lett. 2007, 17, 5983-5988. [161]

Hoenig, H., Seufer-Wasserthal, P.: A general method for separation of enantiomeric

trans-2-substituted cyclohexanols. Synthesis, 1990, 12, 1137-1140. [162]

Forró, E., Lundell, K., Fülöp, F., Kanerva, L. T.: Preparation of the stereoisomers of 2-

cyano-cycloalkanols by lipase-catalysed acylation. Tetrahedron: Asymmetry 1997, 8, 30953199. [163]

Lourenço, N. M. T., Monteiro, C. M., Afonso, C. A. M.: Ionic acylating agents for the

enzymatic resolution of sec-alcohols in ionic liquids. Eur. J. Org. Chem. 2010, 36, 69386943. [164]

Sakai, K., Suemune, H.: Application of chiral cyclic diols to asymmetric synthesis.

Tetrahedron: Asymmetry 1993, 4, 2109-2118. [165]

Kato, K., Suemune, H., Sakai, K.: New type of asymmetric double Michael reaction

induced by chiral ccetal. Tetrahedron Lett. 1993, 34, 4979-4980. [166]

Orovecz, O., Kovács, P., Kolonits, P., Párkányi, L., Szabó, É., Novák, L.: Rearrangement

of allyl aryl ethers; Part V: Reaction of 2,5-dialkoxyhydroquinone with cycloalkanediols. Synthesis 2002, 2002, 2711-2716. [167]

Tanaka, M., Oba, M., Tamai, K., Suemune, H.: Asymmetric Synthesis of α,α-

Disubstituted α-Amino Acids Using (S,S)-Cyclohexane-1,2-diol as a Chiryl Auxiliary. J. Org. Chem. 2001, 66, 2667-2673.

93

[168]

Groaning, M. D., Rowe, B.J., Spilling, C.D.: New homochiral cyclic diol ligands for

titanium alkoxide catalyzed phosphonylation of aldehydes. Tetrahedron Lett. 1998, 39, 54855488. [169]

Tiecco, M., Testaferri, L., Marini, F., Sternativo, S., Sani, C., Bagnoli, L., Temperini, A.:

Synthesis of enantiomerically pure 1,4-dioxanes from alkenes promoted by organoselenium reagents. Tethrahedron: Asymmetry 2003, 14, 1095-1102. [170]

Wojaczyńska, E., Skaržewski, J.: Novel C2-symmetric chiral ligands: enantioselective

transformation of cyclic 1,2-diols into 1,2-bis(phenylsulfenyl) and 1,2-bis(phenylselenyl) derivatives. Tetrahedron: Asymmetry 2008, 19, 593-597. [171]

Kawai, K., Imuta, M., Ziffer, H.: Microbially mediated enantioselective hydrolysis of

racemic acetates. Tetrahedron Lett. 1981, 22, 2527-2530. [172]

Crout, D. H. G., Gaudet, V. S. B., Laumen, K., Schneider, M. P.: Enzymatic hydrolysis of

(+/−)-trans-1,2-diacetoxycycloalkanes – a facile route to optically active cycloalkane-1,2diols. J. Chem. Soc., Chem. Commun. 1986, 10, 808-810. [173]

Laumen, K., Breitgoff, D., Seemayer, R., Schneider, M. P.: Enantiomerically pure

cyclohexanols and cyclohexane-1,2-diol derivatives — chiral auxiliaries and substitutes for (−)-8-phenylmenthol — a facile enzymatic route. J. Chem. Soc., Chem. Commun. 1989, 3, 148-150. [174]

Seemayer, R., Schneider, M. P.: Enzymatic preparation of optically pure trans-1,2-

cycloalkanediols. J. Chem. Soc., Chem. Commun. 1991, 1, 49-50. [175]

Caron, G., Kazlauskas, R. J.: An optimized sequential kinetic resolution of trans-1,2-

cyclohexanediol. J. Org. Chem. 1991, 56, 7251-7256. [176]

Naemura, K., Fukuda, R., Konishi, M., Hirose, K., Tobe, Y.: LipaseYS-catalysed

acylation of alcohols: a predictive active site model for lipase YS to identify which enantiomer of a primary or a secondary alcohol reacts faster in this acylation. J. Chem. Soc., Perkin Trans. 1 1994, 10, 1253-1256. [177]

Naemura, K., Fukuda, R., Murata, M., Konishi, M., Hirose, K., Tobe, Y.: Lipase-

catalyzed enantioselective acylation of alcohols: A predictive active site model for lipase YS to identify which enantiomer of an alcohol reacts faster in this acylation. Tetrahedron: Asymmetry 1995, 6, 2385-2394. [178]

Naemura, K., Murata, M., Tanaka, R., Yano, M., Hirose, K., Tobe, Y.: Enantioselective

acylation of alcohols catalyzed by lipase QL from Alcaligenes sp.: A predictive active site 94

model for lipase QL to identify the faster reacting enantiomer of an alcohol in this acylation. Tetrahedron: Asymmetry 1996, 7, 1581-1584. [179]

Bortolini, O., Casanova, E., Fantin, G., Medici, A., Poli, S., Hanau, S.: Kinetic resolution

of vic-diols by Bacillus stearothermophilus diacetyl reductase. Tetrahedron: Asymmetry 1998, 9, 647-651. [180]

Bódai, V., Orovecz, O., Szakács, G., Novák, L., Poppe, L.: Kinetic resolution of trans-2-

acetoxycycloalkan-1-ols by lipase-catalysed enantiomerically selective acylation. Tetrahedron Asymmetry 2003, 14, 2605-2612. [181]

Detry, J., Rosenbaum, T., Lütz, S., Hahn, D., Jaeger, K.-E., Müller, M., Eggert, T.:

Biocatalytic production of enantiopure cyclohexane-trans-1,2-diol using extracellular lipases from Bacillus subtilis. Appl. Microbiol. Biotechnol. 2006, 72, 1107-1116. [182]

Suginaka, K., Hayashi, Y., Yamamoto, Y.: Highly selective resolution of secondary

alcohols and acetoacetates with lipases and diketene in organic media. Tetrahedron: Asymmetry 1996, 7, 1153-1158. [183]

Ivanov, A. E., Schneider, M. P.: Methods for the immobilization of lipases and their use

for ester synthesis. J. Mol. Catal. B: Enzym. 1997, 3, 303-309. [184]

Bui, V. P., Hansen, T. V., Stenstrom, Y., Ribbons, D. W., Hudlicky, T.: Toluene

dioxygenase-mediated oxidation of aromatic substrates with remote chiral centers. J. Chem. Soc., Perkin Trans. 1 2000, 11, 1669-1672. [185]

Bui, V. P., Hansen, T. V., Stenstrom, Y., Hudlicky, T., Ribbons, D.W.: A study of

substrate specificity of toluene dioxygenase in processing aromatic compounds containing benzylic and/or remote chiral centers. New J. Chem. 2001, 25, 116-124. [186]

Inoue, K., Makino, Y., Itoh, N.: Production of (R)-chiral alcohols by a hydrogen-transfer

bioreduction

with

NADH-dependent

Leifsonia

alcohol

dehydrogenase

(LSADH).

Tetrahedron: Asymmetry 2005, 16, 2539-2549. [187]

Persson, B. A., Larsson, A. L. E., Ray, M. L., Backvall, J. E.: Ruthenium- and enzyme-

catalyzed dynamic kinetic resolution of secondary alcohols. J. Am. Chem. Soc. 1999, 121, 1645-1650. [188]

Yamada, M., Ichikawa, T., Yamano, T., Kikumoto, F., Nishikimi, Y., Tamura, N.,

Kitazaki, T.: Optically active cyclohexene derivative as a new antisepsis agent: An efficient synthesis

of

ethyl

(6R)-6-[N-(2-chloro-4-fluorophenyl)-sulfamoyl]cyclohex-1-ene-1-

carboxylate (TAK-242). Chem. Pharm. Bull. 2006, 54, 58-62. 95

[189]

Takeuchi, Y., Asahina, M., Nagata, K., Koizumi, T.: Chemistry of novel compounds with

multifunctional carbon structure. II: The first example of optically active multifunctional carbon compounds. J. Chem. Soc., Perkin Trans. 1 1987, 10, 2203-2207. [190]

Rosen, T., Heathcock, C. H.: Synthetic and biological studies of compactin and related

compounds. 4. Total synthesis of (+)-compactin. J. Am. Chem. Soc. 1985, 107, 3731-3733. [191]

Niwa, H., Okamoto, O., Yamada, K.: Total synthesis of optically active monocrotaline, a

carcinogenic pyrrolizidine alkaloid having an 11-membered dilactone. Tetrahedron Lett.

1988, 29, 5139-5142. [192]

Ley, S. V., Parra, M., Redgrave, A. J., Sternfeld, F.: Microbial oxidation in synthesis.

Tetrahedron 1990, 46, 4995-5026. [193]

JECFA, http://www.fao.org/ag/agn/jecfa-flav/details.html?flavId=3984. letöltve 2012.

február [194]

Berglund, P.: Controlling lipase enantioselectivity for organic synthesis. Biomol. Eng.

2001, 18, 13-22. [195]

Chua, L. S., Sarmidi, M. R.: Immobilised lipase-catalysed resolution of (R,S)-1-

phenylethanol in recirculated packed bed reactor. J. Mol. Catal. B: Enzym. 2004, 28, 111-119. [196]

Frings, K., Koch, M., Hartmeier, W.: Kinetic resolution of 1-phenylethanol with high

enantioselectivity with native and immobilized lipase in organic solvents, Enzyme Microb. Technol. 1999, 25, 303-309. [197]

Habulin, M., Knez, Ž.: Optimization of (R,S)-1-phenylethanol kinetic resolution over

Candida antarctica lipase B in ionic liquids, J. Mol. Catal. B: Enzym. 2009, 58, 24-28. [198]

Schöfer, S. H., Kaftzik, N., Wasserscheid, P., Kragl, U.: Enzyme catalysis in ionic

liquids:

lipase

catalysed

kinetic

resolution

of

1-phenylethanol

with

improved

enantioselectivity, Chem. Commun. 2001, 5, 425-426. [199]

Suan, C. L., Kai, C. K., Tin, L. C., Sarmidi, M.-R., Aziz, R. A., Seng, T. B.: Kinetic and

reactor modelling of lipases catalyzed (R,S)-1-phenylethanol resolution. Iran. J. Energy Environ. 2010, 1, 234-245. [200]

Rotticci, D.: Understanding and engineering the enantioselectivity of Candida antarctica

lipase B towards sec-alcohols. Ph.D. értekezés, 2000, ISBN: 91-7170-550-3 [201]

Bay, M., Dominik, A., Voss, H.: Fast determination of biocatalyst process stability.

Process Biochem. 1999, 34, 535-547.

96

[202]

Wu, H., Zong, M., Chen, X.: Efficiently enhancing regioselective acylation of 5-

azacytidine catalysed by Candida antarctica lipase B with co-solvent mixtures as the reaction media. Biotechnol. Appl. Biochem. 2009, 53, 201-207. [203]

Xia, Y. M., Fang, Y., Zhang, K. C., Shi, G. Y., Brown, J. J.: Enzymatic synthesis of

partial glycerol caprate in solvent-free media. J. Mol. Catal. B: Enzym. 2003, 23, 3-8. [204]

Hernandez, C. E., Chen, H.-H., Chang, C.-I., Huang, T.-C.: Direct lipase-catalyzed

lipophilization of chlorogenic acid from coffee pulp in supercritical carbon dioxide. Ind. Crops Prod. 2009, 30, 359-365. [205]

Habulin, M., Sabeder, S., Sampedro, M. A., Knez, Ž.: Enzymatic synthesis of citronellol

laurate in organic media and in supercritical carbon dioxide. Biochem. Eng. J. 2008, 42, 6-12. [206]

Tomin, A., Hornyánszky, G., Kupai, K., Dorkó, Zs., Ürge, L., Darvas, F., Poppe, L.:

Lipase-catalyzed kinetic resolution of 2-methylene-substituated cycloalkanols in batch and continuous-flow modes. Process Biochem. 2010, 45, 859-865. [207]

Tassaing, T., Oparin, R., Danten, Y., Besnard, M.: Water-carbon dioxide mixtures at high

temperatures and pressures as studied by infrared and Raman spectroscopies. (14th International Conference on the Properties of Water and Steam in Kyoto), 2004, pp. 166-175. [208]

Vorholz, J., Harismiadis, V. I., Rumpf, B., Panagiotopoulos, A. Z., Maurer, G.: Vapor +

liquid equilibrium of water, carbon dioxide, and the binary system water + carbon dioxide from molecular. Fluid Phase Equilib. 2000, 170, 203-234. [209]

Dijkstra, Z. J., Weyten, H., Willems, L., Keurentjes, J. T. F.: The effect of water

concentration on the activity and stability of CLECs in supercritical CO2 in continuous operation. J. Mol. Catal. B: Enzym. 2006, 39, 112-116. [210]

Kroutil, W., Kleewein, A., Faber, K.: A computer program for analysis, simulation and

optimization of asymmetric catalytic processes proceeding through two consecutive steps. Type 1: asymmetrization-kinetic resolutions. Tetrahedron: Asymmetry 1997, 8, 3263-3274. [211]

Benaissi, K., Poliakoff, M., Thomas, N. R.: Dynamic kinetic resolution of rac-1-

phenylethanol in supercritical carbon dioxide. Green Chem. 2009, 11, 617-622. [212]

Wuyts, S., Wahlen, J., Jacobs, P. A., De Vos, D. E.: Heterogeneous vanadium catalysts

for racemization and chemoenzymatic dynamic kinetic resolution of benzylic alcohols. Green Chem. 2007, 9, 1104-1108. [213]

Lozano, P., De Diego, T., Larnicol, M., Vaultier, M., Iborra, J. L.: Chemoenzymatic

dynamic

kinetic

resolution

of

rac-1-phenylethanol

in

ionic

liquids

and

ionic

liquids/supercritical carbon dioxide systems. Biotechnol. Lett. 2006, 28, 1559-1565. 97

[214]

Wuyts, S., De Temmerman, K., De Vos, D. E., Jacobs, P. A.: Acid zeolites as alcohol

racemization catalysts: screening and application in biphasic dynamic kinetic resolution. Chem. Eur. J. 2005, 11, 386-397. [215]

Zhu, Y. Z., Fow, K. L., Chuah, G. K., Jaenicke, S.: Dynamic kinetic resolution of

secondary alcohols combining enzyme-catalyzed transesterification and zeolite-catalyzed racemization. Chem. Eur. J. 2007, 13, 541-547. [216]

Burgener, M., Mallat, T., Baiker, A.: Palladium-catalysed dehydrogenation of 1-

phenylethanol in dense carbon dioxide. J. Mol. Catal. A: Chem. 2005, 225, 21-25. [217]

Csjernyik, G., Bogár, K., Backvall, J.-E.: New efficient ruthenium catalysts for

racemization of alcohols at room temperature. Tetrahedron Lett. 2004, 45, 6799-6802. [218]

He, J., Wu, T., Jiang, T., Zhou, X., Hu, B., Han, B.: Aerobic oxidation of secondary

alcohols to ketones catalyzed by cobalt(II)/ZnO in poly(ethylene glycol)/CO2 system. Catal. Commun. 2008, 9, 2239-2243. [219]

Costa, L. F. A., Lemos, F., Ribeiro, F. R., Cabral, J. M. S.: Zeolite screening for the

racemization of 1-phenylethanol. Catal. Today 2008, 133, 625-631. [220]

Westerbeek A., Szymański W., Feringa B. L., Janssen D. B.: Dynamic kinetic resolution

process employing haloalkane dehalogenase. ACS Catal. 2011, 1, 1654-1660. [221]

Xin J.-Y., Li S.-B., Xu Y., Chui J.-R., Xia C.-G.: Dynamic enzymatic resolution of

Naproxen methyl ester in a membrane bioreactor. J. Chem. Technol. Biotechnol. 2001, 76, 579-585.

98

5

Függelék

5.1 5.1.1

Optimum receptek Enantiomertiszta (S)-4-fenilazetidin-2-on és (R)-β-fenilalanin előállítása szakaszos reaktorban A szakaszos reaktorba (16. ábra) bemértem a (±)-LAK-ot (0,05 g, 0,34 mmol), a

desztillált vizet (3 µl, 0,17 mmol) és a CAL-B-t (0,05 g). A reakcióelegyet 70 °C hőmérsékleten és 14 MPa nyomáson 120 órán át kevertettem (200 1/min) egyszer desztillált CO2-ban. A teljes konverzió elérését követően (X > 49,95%) állandó működési paraméterek (hőmérséklet, nyomás és keverés) mellett ~ 0,45 g/min tömegáramú CO2-dal mostam a reaktort, a szedőben felfogtam az enantiomertiszta (S)-LAK-ot. A reaktorban visszamaradt enzimet és (R)-Phe-t nyomásmentesítés után szűréssel és 2 × 10 ml meleg (~ 60 °C) desztillált vizes mosással elválasztottam. Az oldószereket vákuum bepárlással eltávolítottam. (S)-LAK (hozam: 51 %: 12,8 mg, 0,086 mmol fehér tűs kristály; [α ]D : −65,5 (c 0,084; 25

[α ]25D :−139 (c 0,19; EtOH)), eeLAK > 99,8 %, (R)-Phe (hozam: 74 %: 18,5 mg, 25 0,126 mmol fehér porszerű kristály; [α ]D : +26 (c 0,29; H2O)), eePhe > 98 %. EtOH) lit.

5.1.2

[F1]

Enantiomertiszta (1R,2S)-hidroxiciklohexánkarbonitril és (1S,2R)-acetoxiciklohexánkarbonitril előállítása szakaszos reaktorban A szakaszos reaktorba (16. ábra) bemértem a CAL-B-t (0,05 g), a (±)-CCH-t (0,1 g, 0,8

mmol) és a VA-ot (190 µl, 2 mmol). A reakció elegyet 45 °C hőmérsékleten és 10 MPa nyomáson 18 órán át kevertettem (200 1/min) egyszer desztillált CO2-ban. A teljes konverzió elérését követően (X > 49,95 %) nyomásmentesítés után a reaktorból kimosott és az enzimtől szűréssel

elválasztott

termék-szubsztrát

elegyet

szilkagéles

oszlopkormatográfiával

választottam el, 2:1 hexán:etil-acetát eluens alkalmazásával, majd a kapott oldatokat bepároltam. (1R,2S)-CCH (hozam: 91 %: 45,6 mg, 0,364 mmol fehér kristály; 1H-NMR (CDCl3, 500,13 MHz) δ 1,14 – 1,39 (m, 3H), 1,58 (m, 1H, H-6ax), 1,72 (m, 1H, H-4eq), 1,79 (m, 1H, H-5eq), 2,04 (m, 1H, H-6eq), 2,12 (m, 1H, H-3eq), 2,43 (ddd, J = 10,7; 9,4; 4.4 Hz, 1H, H-2ax), 2,96 (br, 1H, OH), 3,73 (ddd J = 9,4; 9,4; 4,4 Hz, 1H, H-1ax);

13

C-NMR (CDCl3, 125,75

MHz) δ 23,6 (C-5), 24,1 (C-4), 28,3 (C-3), 33,7 (C-6), 37,6 (C-2), 70,7 (C-1) 121,6 (CN)). (1S,2R)-CCHAc (hozam: 68 %: 45,4 mg, 0,272 mmol átlátszó olaj; 1H-NMR (CDCl3, 500,13

[F1]

Park, S., Forró, E., Grewal, H., Fülöp, F., Kazlauskas, R. J.: Molecular basis for the enantioselective ring opening of β-lactams catalyzed by Candida antarctica lipase B. Adv. Synth. Catal. 2003, 345, 986-995.

99

MHz) δ 1,22 – 1,49 (m, 3H), 1,61 – 1,81 (m, 3H), 1,99 – 2,19 (overlapped, m, 2H), 2,11 (overlapped, s, 3H, CH3), 2,66 (ddd, J = 9,4; 9,4; 3,8 Hz, 1H, H-2ax), 4,88 (ddd J = 9,4; 9,4; 3,8 Hz, 1H, H-1ax);

13

C-NMR (CDCl3, 125,75 MHz) δ 21,1 (CH3), 23,0 (C-5), 23,7 (C-4),

28,1 (C-3), 30,5 (C-6), 33,9 (C-2), 71,6 (C-1), 120,1 (CN), 170,0 (CO)).

5.1.3

Enantiomertiszta (1S,2S)-1-acetoxiciklohexán-2-ol és (1R,2R)-1,2-diacetoxiciklohexán előállítása szakaszos reaktorban A szakaszos reaktorba (16. ábra) bemértem a CAL-B enzimet (0,02 g) és a (±)-CHD-t

(0,01 g, 0,085 mmol), valamint a szubsztrátra nézve 10 MR mennyiségű VA-ot (78,35 µl, 0,85 mmol). A reakcióelegyet 45 °C hőmérsékleten és 10 MPa nyomáson 5 órán át kevertettem 200 1/min-es sebességgel egyszer desztillált CO2-ban. (1S,2S)-CHDAc (eeCHDAc > 99,9 %). (1R,2R)-CHDAc2 (eeCHDAc2 > 99,9 %).

5.1.4

Enantiomertiszta (1S,2S)-1-acetoxiciklohexán-2-ol és (1R,2R)-1,2-diacetoxiciklohexán előállítása folyamatos reaktorban A folyamatos reaktor (33. ábra) (7) oszlopába 1,33 g (±)-CHD-t és a (9) oszlopába 0, 20

g CAL-B-t töltöttem be. A VA-ot 30 MR-ban tápláltam be a (18) tárolóból. A reakciót 45 °C hőmérsékleten és 10 MPa nyomáson 12 s átlagos tartózkodási időt állítottam és 28 órán át végeztem egyszer desztillált CO2-ban. A (1S,2S)-CHDAc és (1R,2R)-1,2-CHDAc2 tartalmazó mintákat bepárlás után szilikagéles kromatográfiás oszlopon 2:1 hexán:etil-acetát eluenssel szétválasztottam, majd ismét bepároltam. (1S,2S)-CHDAc (292 mg, 1,848 mmol, 63 %, fehér tűs kristály; eeCHDAc > 99,9 %,

[α ]22D : +44,25 (c 1,0; CHCl3), 1H-NMR (CDCl3, 500,13 MHz) δ 1,21 – 1,40 ppm (m, 4H) H3ax, H-4ax, H-5ax, H-6ax, 1,66 – 1,75 ppm (m, 2H) H-4eq, H-5eq, 1,98 – 2,07 ppm ( m, 2H) ) H3eq, H-6eq, 2,09 (s, 3H) CH3, 2,79 (broad s, 1H) OH, 3,55 (ddd, 1H, J: 10,7; 9,4; 4,4 Hz) H-2ax, 4,57 ppm (ddd J: 9,4; 9,4; 5,0 Hz, 1H) H-1ax; 13C-NMR (CDCl3, 125,75 MHz) δ (ppm) 21,5 (CH3), 23,9 (C-4), 24,0 (C-5), 30,1 (C-3), 33,2 (C-6), 72,9 (C-2), 78,4 (C-1), 171,6 (CO). (1R,2R)-CHDAc2 (418 mg, 2,090 mmol, 72 %, színtelen olaj; eeCHDAc2 > 99,9 %, [α ]D : 22

−13,64 (c 1,0; CHCl3), 1H-NMR (CDCl3, 500,13 MHz) δ 1,26 – 1,47 ppm (m, 4H) H-3ax, 4-

Hax, H-5ax, H-6ax, 1,65 – 1,79 ppm (m, 2H) H-4eq, H-5eq, 2,00 – 2,06 (m, 2H, overlapped) H3eq, H-6eq, 2,02 (s, 6H, overlapped) CH3 , 4,80 (m, 2H) H-1ax, H-2ax;

13

C-NMR (CDCl3,

125,75 MHz) δ (ppm) 21,3 (CH3), 23,6 (C-4, C-5), 30,3 (C-3,C-6), 73,9 (C-1,C-2) 170,6 (CO).

100

5.1.5

Enantiomertiszta (S)-1-feniletanol előállítása dinamikus-kinetikus reszolválással A folyamatos üzemű készülék (36. ábra) reaktor oszlopába (5) 0,1 g CAL-B-t, 0,1 g

zeolit katalizátort majd ismét 0,1 g CAL-B-t töltöttem egymástól fizikailag elkülönítve. A VA:PE térfogat aránya 1:1 volt. A reakciót 10 MPa nyomáson és 80 °C-on végeztem 210 percig és 0,037 M-os szubsztrát koncentráció mellett, a CO2 térfogatárama 1 ml/min volt. A termék és a szubsztrát enantiomertisztasága: eePE > 99,9 %, eePEAc > 89 %. A GC-MS elemzés eredményei a 38-41. ábrákon láthatók.

H3C

*

OH

PE

38. ábra PE MS spektruma

101

O CH3

H3C * O

PEAc

39. ábra PEAc MS spektruma

CH3 * O

CH3 *

(S,S)-PE2

40. ábra (S,S)-PE2 MS spektruma

102

CH3 CH3 * * O

(R,S)-PE2

41. ábra (R,S)-PE2 MS spektruma

103

5.2

Az értekezés témájában megjelent fontosabb publikációk Utczás M., Molnár P., Székely E., Máthé E., Verhoef H. J., Korporaal R., Vries de J.,

Visser T. J., Simándi B.: Fehérjék stabilitásának vizsgálata szuperkritikus szén-dioxid - víz rendszerben. Olaj Szappan Kozmetika 2009;58:108-111. Utczás M., Székely E., Tasnádi G., Monek É., Vida L., Forró E., Fülöp F., Simándi B.: Kinetic resolution of 4-phenyl-2-azetidinone in supercritical carbon dioxide. J. Suprecrit. Fluids 2011;55: 1019-1022. Utczás M., Székely E., Forró E., Szőllősy Á., Fülöp F., Simándi B.: Enzymatic resolution of trans-2-hydroxycyclohexanecarbonitrile in supercritical carbon dioxide. Tetrahedron Lett. 2011;52: 3916-3918. Székely E., Utczás M., Simándi B.: Kinetic resolution in scCO2 - Design of continuous reactor based on results of batch experiments The Journal of Supercritical Fluids c. folyóiratban elfogadva (2012. november 26.). Utczás M., Székely E., Szeleczky Zs., Szőllősy Á., Simándi B.: Enzyme catalysed kinetic resolution of trans-1,2-cyclohexanediol in supercritical carbon dioxide. Process Biochemistry c. folyóiratba beküldve.

104

Tetrahedron Letters 52 (2011) 3916–3918

Contents lists available at ScienceDirect

Tetrahedron Letters journal homepage: www.elsevier.com/locate/tetlet

Enzymatic resolution of trans-2-hydroxycyclohexanecarbonitrile in supercritical carbon dioxide } Forró b, Áron Szo }llo }sy c, Ferenc Fülöp b, Béla Simándi a Margita Utczás a, Edit Székely a,⇑, Eniko a

Department of Chemical and Environmental Process Engineering, Budapest University of Technology and Economics, H-1521 Budapest, Hungary Institute of Pharmaceutical Chemistry, University of Szeged, H-6720 Szeged, Hungary c Department of Inorganic and Analytical Chemistry, Budapest University of Technology and Economics, H-1521 Budapest, Hungary b

a r t i c l e

i n f o

Article history: Received 14 February 2011 Revised 5 May 2011 Accepted 20 May 2011 Available online 27 May 2011 Keywords: Supercritical carbon dioxide Lipase Kinetic resolution Enantioselective acylation Hydroxycyclohexanecarbonitrile

a b s t r a c t A novel, highly enantioselective (E  100) and environmentally benign method is presented for the kinetic resolution of trans-2-hydroxycyclohexanecarbonitrile in supercritical carbon dioxide. Using Candida antarctica Lipase B as a biocatalyst and vinyl acetate as an acyl donor, enantiomerically pure (1S,2R)-acetoxycyclohexanecarbonitrile and (1R,2S)-hydroxycyclohexanecarbonitrile were obtained in quantitative yields and excellent ee (98%) values. Ó 2011 Elsevier Ltd. All rights reserved.

Asymmetric biocatalysis might become one of the most important techniques for the preparation of enantiomerically pure pharmaceutical compounds.1–4 Chiral biocatalysts, especially lipases, are widely used for the kinetic resolution of different racemic alcohols via esterification and transesterification.5–8 The enantiomers of trans-2-hydroxycyclohexanecarbonitrile (1) are intermediates of an androgen receptor antagonist drug candidate.9 Enzymatic kinetic resolution of racemic 1 has already been investigated in organic solvents10 and ionic liquids.11 Using supercritical fluids, especially supercritical carbon dioxide (scCO2) is favorable in contrast with other non-aqueous solvents, due to its high added value in downstream processing, its environmental benefits, and easily tunable properties. Lipases preserve their activity in scCO2,12,13 while their reaction rates and (enantio)selectivity can be optimized via solvent pressure and temperature.14–16 In this Letter we report the enantioselective acylation of trans-(±)-1 with vinyl acetate (VA) catalyzed by immobilized Candida antarctica Lipase B (CAL-B) in scCO2, yielding (1S,2R)acetoxycyclohexanecarbonitrile (2) and leaving (1R,2S)-1 intact, as shown in Scheme 1. The effect of the amount of VA on the conversion (X) and enantiomeric excess (ee) was examined in detail. Compound (±)-1 was synthesized from 1,2-epoxycyclohexane with hydrogen cyanide [>99% (GC–MS)].17,18 CAL-B (purchased from Sigma–Aldrich) was produced by submerged fermentation ⇑ Corresponding author. Tel.: +36 1 4633096; fax: +36 1 463 3197. E-mail address: [email protected] (E. Székely). 0040-4039/$ - see front matter Ó 2011 Elsevier Ltd. All rights reserved. doi:10.1016/j.tetlet.2011.05.096

of a genetically modified Aspergillus oryzae microorganism and adsorbed on a macroporous resin. Analytical grade methanol and other solvents (Molar Chemicals) were used. CO2 (99.5%) was supplied by Linde Gas Ltd (Hungary) and used as a purified liquid after evaporation and condensation. For the acylation of (±)-1, a high pressure small-scale batch reactor (maximum operating pressure = 25 MPa and maximum operating temperature = 100 °C) was used; the equipment was described previously.19 CAL-B (0.018 g) and (±)-1 (0.018 g, 0.144 mmol) were added to the reactor and different amounts of VA (6.65–135 ll, 0.072–1.44 mmol) corresponding to 0.5–10 mol equiv (0.5–10 ME) were added. The reactor was heated to the desired temperature (T) and pressurized with CO2 to the desired pressure (P). At constant operating parameters the mixture was stirred with a magnetic stirrer (200 rpm) and the reaction time was 4 h. Every 30 min the reactor was purged with CO2 (mass flow rate: 0.30 g/min) for 5 min at constant pressure. Less than 10% of the whole reactor volume was changed during each sampling. The compounds dissolved in the CO2 leaving the reactor were precipitated and trapped in methanol by allowing the CO2 to expand to atmospheric pressure. The samples were analyzed by GC [Beta Dex™ 120 FS Supelco column (30 m  0.25 mm  0.25 lm), He 140 kPa, 130 °C for 13.5 min followed by 10 °C/min to 180 °C and held for 1 min] to determine the conversion and the ee value of the remaining alcohol (1R,2S)-1 and the produced acetate (1S,2R)-2 [quantitative deacylation of the ester by methanolysis with NaHCO3 at room temperature resulted in (1R,2S)-1]. The structure of the substrate and the product (1S,2R)-2 were confirmed by NMR spectroscopy

3917

M. Utczás et al. / Tetrahedron Letters 52 (2011) 3916–3918

Scheme 1. Enzymatic resolution of trans-(±)-1.

cð1R;2SÞÿ1 ÿ cð1S;2RÞÿ1 cð1R;2SÞÿ1 þ cð1S;2RÞÿ1 cð1S;2RÞÿ2 ÿ cð1R;2SÞÿ2 eeP ¼ cð1S;2RÞÿ2 þ cð1R;2SÞÿ2

eeS ¼

ð2Þ ð3Þ

Calculation of the enantioselectivity (E) is given in Eq. 420:

½EðeeS ; eeP ފ ¼

ln½ð1 ÿ eeS Þ=ð1 þ eeS =eeP ފ ln½ð1 þ eeS Þ=ð1 þ eeS =eeP ފ

ð4Þ

The fitted function of X over time (t) is shown in Eq. (5):

XðtÞ ¼ X 1
ð1 ÿ eÿat Þ

ð5Þ

where a is an apparent rate coefficient, X1 is the final conversion. The productivity was calculated using Eq. (6):

Productivity ¼

Figure 1. Effect of the amount of vinyl acetate on the conversion. Experiments were carried out at 10 MPa, 45 °C using 0.6 mg/mL of CAL-B, and 0.6 mg/mL of (±)-1. The general equation of the fitted curves is given in Eq. (5).

[1: 1H NMR (CDCl3, 500.13 MHz) d 1.14–1.39 (m, 3H), 1.58 (m, 1H, H-6ax), 1.72 (m, 1H, H-4eq), 1.79 (m, 1H, H-5eq), 2.04 (m, 1H, H-6eq), 2.12 (m, 1H, H-3eq), 2.43 (ddd, J = 10.7, 9.4, 4.4 Hz, 1H, H-2ax), 2.96 (br s, 1H, OH), 3.73 (ddd J = 9.4, 9.4, 4.4 Hz, 1H, H-1ax); 13C NMR (CDCl3, 125.75 MHz) d 23.6 (C-5), 24.1 (C-4), 28.3 (C-3), 33.7 (C-6), 37.6 (C-2), 70.7 (C-1) 121.6 (CN), 2: 1H NMR (CDCl3, 500.13 MHz) d 1.22–1.49 (m, 3H), 1.61–1.81 (m, 3H), 1.99–2.19 (overlapped, m, 2H), 2.11 (overlapped, s, 3H, CH3), 2.66 (ddd, J = 9.4, 9.4, 3.8 Hz, 1H, H-2ax), 4.88 (ddd J = 9.4, 9.4, 3.8 Hz, 1H, H1ax); 13C NMR (CDCl3, 125.75 MHz) d 21.1 (CH3), 23.0 (C-5), 23.7 (C-4), 28.1 (C-3), 30.5 (C-6), 33.9 (C-2), 71.6 (C-1), 120.1 (CN), 170.0 (CO)]. The fractional conversion (X) was calculated using Eq. (1):

X¼

cð1S;2RÞÿ2 þ cð1R;2SÞÿ2 cð1S;2RÞÿ1 þ cð1R;2SÞÿ1 þ cð1S;2RÞÿ2 þ cð1R;2SÞÿ2

ð1Þ

where c is the concentration of components in mol/dm3, determined from the GC peak areas by calibration. The ee values of the remaining substrate (eeS) and the produced acetate (eeP) were determined using Eqs. (2) and (3):

m2 menzyme
t eq

ð6Þ

where m2 and menzyme is the amount of product and enzyme in mg and teq is the reaction time when X(t) = 0.99 X1. Optimization of the acylation agent molar ratio (VA:substrate molar ratio, ME) was performed at 45 °C and 10 MPa in scCO2. The amount of VA was varied between 0.5 and 10 ME relative to the racemic substrate and its effects on X, eeS, eeP, and E were studied. The function given in Eq. (5) was fitted to the conversion curves (Fig. 1); fitted equation parameters are given in Table 1. At 0.5 ME, which is theoretically enough for 50% conversion, the reaction stopped at a low conversion value (29%) as shown in Figure 1. At 2 ME and above, the theoretically maximum conversion was achieved (eeS >99.8%, eeP >98%). At higher acylating agent/substrate ratios, the initial reaction rate and the productivity increased with the amount of VA, while the equilibrium was reached much faster (at 2 ME teq was 160 min and at 10 ME it was 95 min). We also investigated the kinetic resolution of trans-(±)-1 at 15 MPa, 70 °C, in the range of the optimal conditions of CAL-B in scCO2 reported earlier.19,21 The initial reaction rate (a
X1) and the productivity were significantly higher at 15 MPa, 70 °C, while the equilibrium conversion and the enantiomeric excess of (1R,2S)-1 were lower. A slight loss in enantioselectivity was also observed (eeP = 93% at 15 MPa, 70 °C, while eeP >98% at 10 MPa, 45 °C). In conclusion, we have demonstrated that the kinetic resolution of trans-(±)-1 works efficiently in scCO2 as the reaction medium, at

Table 1 Effect of the reaction conditions on the initial reaction rate

a

P [Mpa]

T [°C]

VA [ME]

aa [1/min]

X1a [ÿ]

a
X1a [1/min]

teq [min]

eeS [%]

eeP [%]

Produtivity [mg (1S,2R)-2/mg enzyme min]

10 10 10 10 10 10

45 45 45 45 45 45

0.5 1 1.5 2 5 10

0.0274 0.0249 0.0286 0.0287 0.0491 0.0487

0.294 0.460 0.494 0.501 0.503 0.504

0.0080 0.0115 0.0141 0.0144 0.0247 0.0251

170 185 160 160 100 95

41.2 83.0 96.0 >99.8 >99.9 >99.9

>98 >98 >98 >98 >98 >98

2.19 3.33 3.96 4.11 6.70 7.03

15

70

2

0.0535

0.492

0.0263

85

96.7

93

7.56

Determined from the equations of the fitted curves, Eq. (5). X1 is the equilibrium conversion, a is the reaction rate coefficient and a
X1 is proportional to the initial reaction rate.

3918

M. Utczás et al. / Tetrahedron Letters 52 (2011) 3916–3918

10 MPa pressure and at 45 °C with E  100. To obtain the theoretical maximum conversion and enantiopure substrate (1R,2S)-1 (ee >99.8%) and product (1S,2R)-2 (ee >98%), the minimal acyl donor/ substrate ratio required was 2 ME. Acknowledgments This research work was supported by the Hungarian Scientific Research Fund (OTKA 72861 and 71938), the Social Renewal Operational Programme (TÁMOP-4.2.1/B-09/1/KMR-2010-0002) and a } Forró. Bolyai Fellowship for Eniko References and notes 1. Patel, R. N.; Banerjee, A.; Pendri, Y. R.; Liang, J.; Chen, C.-P.; Mueller, R. Tetrahedron: Asymmetry 2006, 17, 175–178. 2. Nanduri, V. B.; Banerjee, A.; Howell, J.; Brzozowski, D.; Eiring, R.; Patel, R. N. J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 2000, 25, 171–175. 3. Patel, R. N.; Robison, R. S.; Szarka, L. J. Appl. Microbiol. Biotechnol. 1990, 34, 10– 14. 4. Morgan, B.; Zaks, A.; Dodds, D. R.; Liu, J.; Jain, R.; Megati, S.; Njoroge, F. G.; Girijavallabhan, V. M. J. Org. Chem. 2000, 65, 5451–5459. 5. Karadeniz, F.; Bayraktar, E.; Mehmetoglu, U. Artif. Cells Blood Substitutes, Immobilization Biotechnol. 2010, 38, 288–293.

6. Ramineli, C.; Comasseto, J. V.; Andrade, L. H.; Porto, A. L. M. Tetrahedron: Asymmetry 2004, 15, 3117–3122. 7. Jurcˆek, O.; Wimmerová, M.; Wimmer, Z. Coord. Chem. Rev. 2008, 252, 767–781. 8. Singh, M.; Singh, R. S.; Banerjee, U. C. Process Biochem. 2010, 45, 25–29. 9. Rajappa, V.; Lynsey, H.; Shanghui, H. Org. Process Res. Dev. 2007, 11, 903–906. 10. Forró, E.; Lundell, K.; Fülöp, F.; Kanerva, L. T. Tetrahedron: Asymmetry 1997, 8, 3095–3099. 11. Lourenço, N. M. T.; Monteiro, C. M.; Afonso, C. A. M. Eur. J. Org. Chem. 2010, 36, 6938–6943. 12. Wimmer, Z.; Zarevúcka, M. Int. J. Mol. Sci. 2010, 11, 233–253. 13. Overmeyer, A.; Schrader-Lippelt, S.; Kasche, V.; Brunner, G. Biotechnol. Lett. 1999, 21, 65–69. 14. Mori, T.; Kobayashi, A.; Okahata, Y. Chem. Lett. 1998, 9, 921–922. 15. Matsuda, T.; Watanabe, K.; Harada, T.; Nakamura, K. Catal. Today 2004, 96, 103–111. 16. Celia, E. C.; Cernia, E.; D’Acquarica, I.; Palocci, C.; Soro, S. J. Mol. Catal. B: Enzym. 1999, 6, 495–503. 17. Fülöp, F.; Huber, I.; Bernáth, G.; Hönig, H.; Seufer-Wasserthal, P. Synthesis 1991, 43–46. 18. Hönig, H.; Seufer-Wasserthal, P.; Fülöp, F. J. Chem. Soc., Perkin Trans. 1 1989, 2341–2345. 19. Utczás, M.; Székely, E.; Tasnádi, G.; Monek, É.; Vida, L.; Forró, E.; Fülöp, F.; Simándi, B. J. Supercrit. Fluids 2011, 55, 1019–1022. 20. Rakels, J. L. L.; Straathof, A. J. J.; Heijnen, J. J. Enzyme Microb. Technol. 1993, 15, 1051–1056. 21. Paljevac, M.; Knez, Z.; Habulin, M. Acta Chim. Slov. 2009, 56, 815–825.

J. of Supercritical Fluids 55 (2011) 1019–1022

Contents lists available at ScienceDirect

The Journal of Supercritical Fluids journal homepage: www.elsevier.com/locate/supflu

Kinetic resolution of 4-phenyl-2-azetidinone in supercritical carbon dioxide M. Utczás a , E. Székely a,∗ , G. Tasnádi b , É. Monek a , L. Vida a , E. Forró b , F. Fülöp b , B. Simándi a a b

Department of Chemical and Environmental Process Engineering, Budapest University of Technology and Economics, H-1521 Budapest, Hungary Institute of Pharmaceutical Chemistry, University of Szeged, H-6720 Szeged, Hungary

a r t i c l e

i n f o

Article history: Received 16 June 2010 Received in revised form 16 October 2010 Accepted 18 October 2010 Keywords: Supercritical carbon dioxide Lipase b-Lactam b-Amino acid Kinetic resolution

a b s t r a c t The lipase-catalysed kinetic resolution of rac-4-phenyl-2-azetidinone was investigated in supercritical carbon dioxide (scCO2 ). Water (0.5 mol equivalent) was used as nucleophilic donor. The effects of pressure and temperature were studied in a batch reactor (internal volume: 30 mL). The optimum pressure and temperature of the b-lactam ring-opening reaction proved to be 14 MPa and 70 ◦ C. Under optimum conditions, full conversion was achieved in 120 h. The resulting (R)-b-phenylalanine (ee ≥ 98%) and (S)4-phenyl-2-azetidinone (ee ≥ 99%) could be easily separated by scCO2 extraction of the (S)-b-lactam and subsequent washing of the enzyme with hot water to recover the amino acid. © 2010 Elsevier B.V. All rights reserved.

1. Introduction b-Amino acids and b-lactams are widely used in drug research. Some of them (e.g. cispentacin) exhibit antibacterial activity and they can be widely used in the synthesis of short peptides (e.g. bpeptides) and in heterocyclic and combinatorial chemistry [1–3]. Numerous derivatives of b-phenylalanine with promising anticancer [4], anti-inflammatory [5], antiviral [6] or analgesic [7] effects have been reported. Besides asymmetric synthetic routes [8–14], enzyme-catalysed processes have been developed for the preparation of bphenylalanine enantiomers through the transesterification of an N-protected ester in isobutanol [15], stereoselective degradation of a racemic amino acid [16], hydrolysis of a racemic b-amino ester [17,18], hydrolysis of a racemic N-acetylated b-amino acid [19,20] or an aminomutase-catalysed a,b-rearrangement [21] in aqueous medium. Enzymatic methods were recently reported for the preparation of enantiomers of b-phenylalanine in an organic medium through acylation of a N-hydroxymethylated b-lactam [22], ring opening of a b-lactam [23,24] or hydrolysis of a b-amino ester [25] with lipases. Enzymes, and especially lipases, can be stable in supercritical carbon dioxide (scCO2 ) [26–28], and the use of scCO2 has certain advantages over other non-aqueous media, e.g. increased mass transfer or solvent-free products obtained after the depressurization.

∗ Corresponding author. Tel.: +36 703925567. E-mail address: [email protected] (E. Székely). 0896-8446/$ – see front matter © 2010 Elsevier B.V. All rights reserved. doi:10.1016/j.supflu.2010.10.024

In this paper, we report the lipase-catalysed kinetic resolution of rac-4-phenyl-2-azetidinone (±)-1 in scCO2 . 2. Materials and methods 2.1. Materials The enzyme applied was a lipase B from Candida antarctica (CAL-B) (purchased from Sigma–Aldrich), produced by submerged fermentation of a genetically modified Aspergillus oryzae microorganism and adsorbed on a macroporous resin. The (±)-1 was prepared from styrene, by chlorosulfonyl isocyanate addition, according to a literature method [24]. Chloroform, methanol and other solvents (Molar Chemicals) were used in analytical grade. CO2 (99.5%) was supplied by Linde Gas Ltd. (Hungary). 2.2. Small-scale kinetic resolution of 4-phenyl-2-azetidinone in scCO2 A mixture of (±)-1 (0.05 g, 0.34 mmol) and CAL-B (0.05 g) was taken in a small-scale batch reactor (30 mL), and H2 O (3 ml, 0.17 mmol) was added. The reactor was compressed with CO2 and heated to the desired temperature followed by precise setting of the pressure. The mixture was mixed with a magnetic stirrer (200 rpm). After depressurization, the contents of the reactor were washed with chloroform (3× 5 mL) and filtered. Following evaporation of the chloroform from the filtrate, (S)1 was collected. The filtration residue (enzyme and product) was washed with hot distilled water (2× 10 mL), which dissolved the (R)-b-phenylalanine (R)-2. The reaction is outlined in

M. Utczás et al. / J. of Supercritical Fluids 55 (2011) 1019–1022

1020

The peak areas (A) were determined. No by-products were observed to be present (either by GC–MS or by the routine GC methods) and the enzymatic reaction afforded the (R)-2 selectively. Accordingly, the conversion (X) was calculated as in Eq. (1): X= Scheme 1. Reaction scheme of the enzymatic resolution of (±)-1.

Scheme 1 and the reaction and separation process are presented in Scheme 2. The samples were analysed by chiral GC. The purities of the products were checked with GC–MS. The absolute configurations were determined with a Perkin-Elmer 241 polarimeter and were confirmed by comparison of the [˛] values with the literature data. (±)-1 was also subjected to ring opening under atmospheric conditions for reference. (±)-1 (7.4 mg, 0.05 mmol) was dissolved in diisopropyl ether (1 mL), lipase (30 mg) and H2 O (0.9 mL, 0.05 mmol) were added, and the mixture was shaken in an incubator shaker at different temperatures (40–80 ◦ C) for 2 h.

(A(S)−1 − A(R)−1 )

(1)

2A(S)−1

The enantiomeric excess (ee) of the remaining substrate (eeS ) and of the product (eeP ) were determined as in Eqs. (2) and (3), respectively: eeS = eeP =

A(S)−1 − A(R)−1

(2)

A(S)−1 + A(R)−1 A(R)−2 − A(S)−2

(3)

A(R)−2 + A(S)−2

Enantioselectivity (E) [30] was calculated Eq. (4). E(eeS , eeP ) =

 

ln (1 − eeS )/(1 + eeS /eeP ) ln (1 + eeS )/(1 + eeS /eeP )

 

(4)

3. Results and discussion 2.3. Analytical and calculation methods 3.1. Effect of reaction time Samples were diluted to about 1 mg/mL in chloroform or methanol for GC analysis. Samples of 1 were analysed in split mode with a Thermo Finnigan Focus GC equipped with an FID detector. A Beta DexTM 120 FS Supelco column (30 m × 0.25 mm × 0.25 mm) was used. The injector was set at 250 ◦ C, and the carrier gas (He, 99.99%) pressure was 140 kPa. The injection volume was 1 ml. The split gas flow rate during the analysis was 50 ml/min. The initial oven temperature was 120 ◦ C for 1 min; an oven temperature ramp to 160 ◦ C was applied (temperature rise: 30 ◦ C/min), where it was held for 10 min, followed by a secondary temperature ramp (temperature rise 10 ◦ C/min) to the final temperature of 180 ◦ C, with a hold time of 17 min, for a total run time of 31.33 min (retention times (min): (R)-1: 27.29, (S)-1: 28.83). Samples of 2 were analysed with a Varian GC on a Chrompack Chirasil-L-Val column (20 m × 0.25 mm × 0.25 mm) after double derivatization [29] with (i) diazomethane (CH2 N2 ) [Caution! derivatization with CH2 N2 should be performed under a well-working hood]; (ii) acetic anhydride in the presence of 4-dimethylaminopyridine and pyridine. The injector was set at 250 ◦ C. The injection volume was 0.2 ml. The carrier gas (N2 , 99.99%) pressure was 140 kPa. The initial oven temperature was 100 ◦ C for 10 min, followed by a temperature ramp to 150 ◦ C (temperature rise 10 ◦ C/min), for a total run time of 25 min (retention times (min): (R)-2: 23.16 (antipode: 23.65).

In preliminary experiments in scCO2 , the kinetics of the lipasecatalysed enantioselective ring opening of (±)-1 was examined. The E values were higher than 100 in all experiments, mainly due to the high enantioselectivity of the enzyme, product enantioselectivities were always higher than 98%. At 60 ◦ C and 11 MPa 50% conversion (ee(s)-1 ≥ 99.8%) was attained (Fig. 1) at 120 h, which is the theoretical maximum. The initial reaction rate could be taken as linear because (±)-1 was used in excess (1.7 mg/mL) relative to its solubility in CO2 (∼0.40 mg/mL), and the solvent was saturated with the substrate during the first ∼30 h, the constant substrate concentration and constant enzyme activity (no activity loss) therefore resulting in a constant reaction rate. The water to substrate ratio was kept constant. Hence, a reaction time of 22 h was selected for clear observation of any changes in the reaction rate via determination of the conversion. 3.2. Pressure and temperature effects The pressure (P) and temperature (T) of the scCO2 can influence not only the dissolution of the substrates and product, but also the enzyme activity, due to the conformational changes induced. The effects might be evaluated by the X or the E values [31]. However, while E > 100 values was calculated in all experiments, X is suitable

Scheme 2. Experimental procedure of product separation. The enzyme is indicated with

.

M. Utczás et al. / J. of Supercritical Fluids 55 (2011) 1019–1022

Fig. 1. Reaction kinetics of ring cleavage of 1.67 mg/mL (±)-1 with 0.5 mol equivalent H2 O and 1.67 mg/mL CAL-B at 60 ◦ C and 11 MPa.

for the evaluation of the performance. P and T were optimized by a 32 Box-Behnken type experimental design. Three repetitions were performed at the centre point (15 MPa, 60 ◦ C), with upper and lower values of 21 MPa and 70 ◦ C, and 9 MPa and 50 ◦ C, respectively. Fig. 2 shows the fitted surface and the experimental points. The best conversion was achieved at 15 MPa and 70 ◦ C after 22 h (X = 38%, ee(R)-2 >98%). Statistical evaluation of the experimental data revealed that the linear and quadratic terms in P and the linear term in T were significant (at p = 0.05); the interaction parameters (P × T, P2 × T, P × T2 and P2 × T2 ) could be neglected. Eq. (5) shows the fitted equation of the response surface: X(P, T ) = −70.4 + 3.72P − 0.134P 2 + 1.15T

1021

Fig. 3. Effects of temperature on conversion (0.5 mol equivalent H2 O, 1.67 mg/mL CAL-B, 1.67 mg/mL (±)-1, after 22 h).

At all pressures, the optimum temperature was found to be close to 70 ◦ C. Contrarily, under atmospheric conditions the enzyme had a higher activity at 80 ◦ C than at 70 ◦ C (Table 1). In other esterification and acylation reactions in scCO2 and conventional organic media, the optimum temperature for CAL-B was at lower temperature values (55–60 ◦ C) [32–35], while the earlier reported optimum pressure of scCO2 (15 MPa) [34] is close to our optimum values (14 MPa). E values in experiments under pressure (E ≥ 100) are very close to E values of atmospheric reactions. Thus the selectivity of the enzyme is fairly the same in the two different reaction media.

(5)

By differentiation of model Eq. (3), the calculated optimum pressure is 14 MPa. On increase of the temperature within this range (50–70 ◦ C), the conversion continuously increased; thus, the temperature optimum cannot be calculated from the fitted function. To determine the temperature optimum of the ring cleavage of (±)-1 the effect of temperature was examined in detail (40–80 ◦ C) (Fig. 3).

3.3. Reaction with full conversion and separation of the products After 120 h under optimum conditions (70 ◦ C, 14 MPa), full conversion of (R)-1 (X > 49.95%) was achieved. However, besides its effects on enzyme activity, scCO2 as selective solvent offers great opportunities in product separations. An enzymatic reaction mixture generally consists of enzyme, product(s), substrate(s) and solvent(s). If the solvent in conventional reactions is water or an organic solvent, then in most cases all the components except the immobilized enzyme exhibit reasonable solubility, and thus their separation may be the key point as concerns applicability. Our reaction mixture contained (S)-1, (R)-2, CAL-B and CO2 . The solubilities of (S)-1 and (R)-2 in scCO2 were checked by cloud point measurements in a variable-volume view cell unit purchased from New Ways of Analytics. The solubility of (R)-2 was <0.015 mg/mL, while that of 1 was >0.40 mg/mL under any P, T conditions examined in the current work. The difference between the product and substrate solubilities was greater than one order of magnitude; thus, (S)-1 could be selectively extracted with scCO2 . When the reaction was completed, we shifted from batch operation to the continuous stirred tank reactor operation mode in the same reactor at constant pressure, temperature and mixing rate. The CO2 (mass flow rate: ∼0.45 g/min) was pumped to the bottom of the reactor while the outlet valve was located on the top. Table 1 Effect of temperature on the conversion and enantioselectivity of (±)-1 in diisopropyl ether after 2 ha .

Fig. 2. Conversion results of 32 design experiment (0.5 mol equivalent H2 O, 1.67 mg/mL CAL-B, 1.67 mg/mL (±)-1, after 22 h).

T (◦ C)

ee(S)-1 (%)

ee(R)-2 (%)

Conversion (%)

E

40 50 60 70 80

8 9 17 27 40

≥98 ≥98 ≥98 ≥98 ≥98

8 8 15 22 29

107 108 117 129 147

a

0.05 M substrate, 1 mL i-Pr2 O, 30 mg mL−1 CAL-B, 0.5 equivalent H2 O.

1022

M. Utczás et al. / J. of Supercritical Fluids 55 (2011) 1019–1022

The selectively dissolved (S)-1 (yield: 12.8 mg, 0.078 mmol {[˛]25 D : : −139 (c 0.19; EtOH)}) was −65.5 (c 0.084; EtOH) lit. [23] [˛]25 D collected in an atmospheric trap. (R)-2 (yield: 18.5 mg, 0.126 mmol {[˛]25 D : +26 (c 0.29; H2 O)}) remained in the reactor and was dissolved from the immobilized enzyme after depressurization of the reactor with hot distilled water (preserved activity of enzyme after depressurization: 70%). The 1 H NMR and 13 C NMR data on (S)-1 and (R)-2 are in accordance with those reported in the literature. 4. Conclusions The kinetic resolution of 4-phenyl-2-azetidinone (±)-1 was achieved by CAL-B-catalysed b-lactam ring-cleavage mechanism in scCO2 . In this reaction with H2 O (0.5 equivalent) as nucleophile at 14 MPa and 70 ◦ C, (S)-1 (ee > 99.8%) and (R)-2 (ee > 98%) were obtained in the theoretically maximum 50% conversion. The (S)-1 was selectively extracted by scCO2 , while (R)-2 was dissolved from the surface of the enzyme by hot water. A green reaction and enantioselective separation were successfully achieved through the use of enzyme, scCO2 and water with an E value ≫100. Acknowledgement This research work was supported financially by Hungarian Scientific Research Fund (OTKA 72861). References [1] E. Juaristi, V.A. Soloshonok, Enantioselective Synthesis of b-Amino Acids, 2nd ed., Wiley-VHC, New York, 2005. [2] F. Fülöp, The chemistry of 2-aminocycloalkanecarboxylic acids, Chemical Reviews 101 (2001) 2181–2204. [3] F. Fülöp, T.A. Martinek, G.K. Tóth, Application of alicyclic b-amino acids in peptide chemistry, Chemical Society Reviews 35 (2006) 323–334. [4] A.-C. Dublanchet, P. Ducrot, C. Andrianjara, M. O’Gara, R. Morales, D. Compère, A. Denis, S. Blais, P. Cluzeau, K. Courté, J. Hamon, F. Moreau, M.-L. Prunet, A. Tertre, Structure-based design and synthesis of novel non-zinc chelating MMP12 inhibitors, Bioorganic and Medicinal Chemistry Letter 15 (2005) 3787–3790. [5] D.C. D’Amico, T. Aya, J. Human, C. Fotsch, J.J. Chen, K. Biswas, B. Riahi, M.H. Norman, C.A. Willoughby, R. Hungate, P.J. Reider, G. Biddlecome, D. Lester-Zeiner, C. Van Staden, E. Johnson, A. Kamassah, L. Arik, J. Wang, V.N. Viswanadhan, R.D. Groneberg, J. Zhan, H. Suzuki, A. Toro, D.A. Mareska, D.E. Clarke, D.M. Harvey, L.E. Burgess, E.R. Laird, B. Askew, G. Ng, Identification of a nonpeptidic and conformationally restricted bradykinin B1 receptor antagonist with anti-inflammatory activity, Journal of Medicinal Chemistry 50 (2007) 607–610. [6] S. Yan, G. Larson, J.Z. Wu, T. Appleby, Y. Ding, R. Hamatake, Z. Hong, N. Yao, Novel thiazolones as HCV NS5B polymerase allosteric inhibitors: further designs, SAR, and X-ray complex structure, Bioorganic and Medicinal Chemistry Letter 17 (2007) 63–67. [7] G. Cardillo, L. Gentilucci, P. Melchiorre, S. Spampinato, Synthesis, binding activity of endomorphin-1 analogues containing b-amino acids, Bioorganic and Medicinal Chemistry Letter 10 (2000) 2755–2758. [8] C. Cimarelli, G. Palmieri, E. Volpini, An improved synthesis of enantiopure bamino acids, Synthetic Communications 31 (2001) 2943–2953. [9] A.V. Sivakumar, G.S. Babu, S.V. Bhat, Asymmetric synthesis of b-amino acids through application of chiral sulfoxide, Tetrahedron: Asymmetry 12 (2001) 1095–1099. [10] A.G. Wenzel, E.N. Jacobsen, Asymmetric catalytic Mannich reactions catalyzed by urea derivatives: Enantioselective synthesis of b-aryl-b-amino acids, J. American Chemical Society 124 (2002) 12964–12965. [11[] S.G. Davies, N.M. Garrido, D. Kruchinin, O. Ichihara, L.J. Kotchie, P.D. Price, A.J. Price Mortimer, A.J. Russel, A.D. Smith, Homochiral lithium amides for the asymmetric synthesis of b-amino acids, Tetrahedron: Asymmetry 17 (2006) 1793–1811. [12] S.G. Davies, A.W. Mulvaney, A.J. Russel, A.D. Smith, Parallel synthesis of homochiral b-amino acids, Tetrahedron: Asymmetry 18 (2007) 1554–1566. [13] B. de Lange, H.L.M. Elsenberg, Q.B. Broxterman, M. van der Slius, P.G.H. Uiterweerd, Process for the preparation of chiral amines, WO 069798, 2006.

[14] G.W. Muller, R.S. Chen, Methods of using and compositions comprising (+)3-(3,4-dimethoxyphenyl)-3-(1-oxo-1,3-dihydro-isoindol-2-yl)propionamide, WO 045597, 2004. [15] P. Flores-Sánchez, J. Escalante, E. Castillo, Enzymatic resolution of N-protectedb3 -amino methyl esters, using lipase B from Candida antarctica, Tetrahedron: Asymmetry 16 (2005) 629–634. [16] J Mano, J. Ogawa, S. Shimizu, Microbial production of optically active b-phenylalanine through stereoselective degradation of racemic bphenylalanine, Bioscience, Biotechnology, Biochemistry 70 (2006) 1941–1946. [17] S.J. Faulconbridge, K.E. Holt, L.G. Sevillano, C.J. Lock, P.D. Tiffin, N. Tremayne, S. Winter, Preparation of enantiomerically enriched aromatic b-amino acids via enzymatic resolution, Tetrahedron Letters 41 (2000) 2679–2681. [18] J. Ogawa, J. Mano, S. Shimizu, Microbial production of optically active b-phenylalanine ethyl ester through stereoselective hydrolysis of racemic bphenylalanine ethyl ester, Applied Microbiology and Biotechnology 70 (2006) 663–669. [19] V.A. Soloshonok, N.A. Fokina, A.V. Rybakova, I.P. Shishkina, S.V. Galushko, A.E. Sorochinsky, V.P. Kukhar, Biocatalytic approach to enantiomerically pure bamino acids, Tetrahedron: Asymmetry 6 (1995) 1601–1610. [20] H. Kawasaki, K. Koyama, S. Kurokawa, K. Watanabe, M. Nakazawa, K. Izawa, T. Nakamatsu, Production of (R)-3-amino-3-phenylpropionic acid and (S)-3-amino-3-phenylpropionic acid from (R,S)-N-acetyl-3-amino-3phenylpropionic acid using microorganisms having enantiomer-specific amidohydrolyzing activity, Bioscience, Biotechnology, Biochemistry 70 (2006) 99–106. [21] W. Mutatu, K.L. Klettke, C. Foster, K.D. Walker, Unusual mechanism for an aminomutase rearrangement: retention of configuration at the migration termini, Biochemistry 46 (2007) 9785–9794. [22] E. Forró, F. Fülöp, Synthesis of 4-aryl-substituted b-lactam enantiomers by enzyme-catalyzed kinetic resolution, Tetrahedron: Asymmetry 12 (2001) 2351–2358. [23] S. Park, E. Forró, H. Grewal, F. Fülöp, R.J. Kazlauskas, Molecular basis for the enantioselective ring opening of b-lactams catalyzed by Candida antarctica lipase B, Advanced Synthesis and Catalysis 345 (2003) 986–995. [24] E. Forró, T. Paál, G. Tasnádi, F. Fülöp, A new route to enantiopure baryl-substituted b-amino acids and 4-aryl-substituted b-lactams through lipase-catalyzed enantioselective ring cleavage of b-lactams, Advanced Synthesis and Catalysis 348 (2006) 917–923. [25] G. Tasnádi, E. Forró, F. Fülöp, An efficient new enzymatic method for the preparation of b-aryl-b-amino acid enantiomers, Tetrahedron: Asymmetry 19 (2008) 2072–2077. [26] A. Capewell, V. Wendel, U. Bornscheuer, H.H. Meyer, T. Scheper, Lipasecatalyzed kinetic resolution of 3-hydroxy esters in organic solvents and supercritical carbon dioxide, Enzyme and Microbial Technology 19 (1996) 181–184. [27] A. Overmeyer, S. Schrader-Lippelt, V. Kasche, G. Brunner, Lipase-catalysed kinetic resolution of racemates at temperatures from 40 ◦ C to 160 ◦ C in supercritical CO2 , Biotechnology Letters 21 (1999) 65–69. [28] I. Kmecz, B. Simándi, L. Poppe, Z. Juvancz, K. Renner, V. Bódai, E.R. ˝ Toke, Cs. Csajági, J. Sawinsky, Lipase-catalyzed enantioselective acylation of 3-benzyloxypropane-1,2-diol in supercritical carbon dioxide, Biochemical Engineering Journal 28 (2006) 275–280. [29] E. Forró, New gas chromatographic method for the enantioseparation of b-amino acids by a rapid double derivatization technique, Journal of Chromatography A 1216 (2009) 1025–1029. [30] Ch-S. Chen, Y. Fujimoto, G. Girdaukas, C.J. Sih, Quantitative analyses of biochemical kinetic resolutions of enantiomers, Journal of American Chemical Society 104 (1982) 7294–7299. [31] T. Matsuda, R. Kanamarua, K. Watanabea, T. Kamitanakaa, T. Haradaa, K. Nakamura, Control of enantioselectivity of lipase-catalyzed esterification in supercritical carbon dioxide by tuning the pressure and temperature, Tetrahedron: Asymmetry 14 (2003) 2087–2091. [32] H. Wu, M. Zong, X. Chen, Efficiently enhancing regioselective acylation of 5azacytidine catalysed by Candida antarctica lipase B with co-solvent mixtures as the reaction media, Biotechnology and Applied Biochemistry 53 (2009) 201–207. [33] Y.M. Xia, Y. Fang, K.C. Zhang, G.Y. Shi, J.J. Brown, Enzymatic synthesis of partial glycerol caprate in solvent-free media, J. Molecular Catalysis B-Enzymatic 23 (2003) 3–8. [34] C.E. Hernandez, H.-H. Chen, C.-I. Chang, T.-C. Huang, Direct lipase-catalyzed lipophilization of chlorogenic acid from coffee pulp in supercritical carbon dioxide, Industrial Crops and Products 30 (2009) 359–365. [35] M. Habulin, S. Sabeder, M.A. Sampedro, Z. Knez, Enzymatic synthesis of citronellol laurate in organic media and in supercritical carbon dioxide, Biochemical Engineering Journal 42 (2008) 6–12.

*Manuscript Click here to view linked References

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65

Kinetic enzymatic resolution in scCO2 - Design of continuous reactor based on batch experiments E. Székely*, M. Utczás, B. Simándi Department of Chemical and Environmental Process Engineering, Budapest University of Technology and Economics, H-1111 Budapest, Budafoki út 6-8., Hungary

Abstract We developed an efficient method for the lipase-catalyzed consecutive kinetic resolution of trans-1,2cyclohexanediol in scCO2 with vinyl-acetate as acetyl donor catalysed by a commercial immobilized Candida antarctica lipase B (CAL-B). The reaction was optimized in scCO2 in a batch reactor. The first acylation step is moderately enantioselective, preferring the formation of (1R,2R)-2-acetoxycyclohexane1-ol, while the second acylation step is fully enantioselective. Michaelis-Menten type reaction constants and turnover number values were calculated. A combined extractor – enzymatic packed-bed reactor unit was designed with a residence time of a few seconds (the time requirement of a batch reaction was several hours). The reactions were performed at 10 MPa and 45 °C. The mean residence time in the enzymatic reactor was varied from 2 to 13 s by changing the flow rate of the CO2. The implemented continuous reactor was optimized to achieve maximum productivity and enantiopure products. The optimum residence time in the reactor entirely confirmed the calculated operational parameters (calculated necessary residence time: 9.6 s, measured mean residence time for full conversion: 9 s). No loss of enzyme activity was observed after 28 hours at continuous operation.

Keywords: trans-1,2-cyclohexanediol, enantioselective acylation, kinetic resolution, continuous-flow operation, reactor design

*

Corresponding author. E-mail: [email protected] Phone: +3614633191 Fax: +3614633197

1. Introduction 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65

The production of single enantiomers still has an increasing importance in the pharmaceutical, food and health industries. Asymmetric chemical syntheses and conventional resolution methods are widely applied for preparing enantiopure compounds but biocatalysis also provides an alternative opportunity to prepare useful chiral compounds [1]. Biocatalysis offers advantages over chemical synthesis as enzyme-catalyzed reactions are usually highly enantioselective and regioselective. Meanwhile, the gas-like diffusivity and low viscosity of supercritical carbon dioxide (scCO2) reduces the mass transfer resistance between the reaction mixture and the active sites of the enzyme, thereby increasing reaction rates. Additionally, scCO2 is non-toxic, non-flammable, low cost, and most importantly with respect to technology, easy to separate from the reaction mixture. Enzymes, especially lipases are particularly suited to perform stereoselective reactions in scCO2 [2]. Although enzymes could be more expensive than, for example, a chiral auxiliary in chemical asymmetric synthesis, they have to be used only in catalytic amount. They usually have excellent enantioselectivity, thus applying enzymes in a kinetic resolution might yield products that have higher than 99% enantiomeric excesses. The natural reaction media of enzymes is water, in which the majority of nonconventional substrates is poorly soluble. Enzymes can catalyse reactions not only in organic solvents and ionic liquids, but in supercritical fluids as well. The advantages of using enzymes in supercritical fluids have been investigated mostly in batch reactors [3-5]. Among many supercritical fluids, supercritical carbon dioxide (scCO2) is the most suitable for enzymes due to its mild critical parameters. Its most important technological advantage is that after a simple depressurization, solvent-free products could be obtained thus simplifying the downstream processes. Generally the productivity could be 2-3 times higher in a continuous-flow system than in batch mode [6]. In scCO2, only a limited number of studies of enzyme catalysed reactions

have been performed (semi-) continuously, mainly in tubular and packed bed reactors [7-10]. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65

Lipases show good performance (i.e. high enantioselectivity and productivity) in scCO2 in continuous-flow reactors. Numerous methods for the chiral resolution of trans-1,2-cyclohexane-diol (1) were reported in literature. These include ester formation with O-acetyl mandelic acid [11], selective dispiroketal formation [12] or selective molecular complex formation with L-tartaric acid followed by supercritical fluid extraction [13]. Kinetic resolution of 1 was carried out via asymmetric benzoylation [14], monophenyl ester formation [15], or by enzymes in organic solvents via selective ester cleavage of trans-1-acetoxy-2-cyclohexanol (2) or trans-1,2diacetoxycyclohexane (3) using the Bacillus subtilis recombinant lipase [16] or lipase AK [17] in batch reactors while continuous-flow operation has not been studied yet. The main scopes of the enantiomers of 1 and their derivatives are applications as chiral auxiliaries, chiral building blocks or chiral intermediates for the synthesis of pharmaceuticals, agrochemicals, or crown ethers [18-23]. In this paper we report the first enzyme-catalysed kinetic resolution of (r)-1 in continuousflow operation. The reaction is performed in scCO2. However, the main aim of this paper is to demonstrate a new method to design high a through put continuous setup based on experimental results of batch experiments, which are generally more readily available in the literature. 2. Materials and methods 2.1. Materials Lipase B from Candida antarctica (CAL-B), produced by submerged fermentation of a genetically modified Aspergillus oryzae microorganism and adsorbed on a macroporous resin, was purchased from Sigma Aldrich (Budapest, Hungary). (r)-1 was purchased from Sigma Aldrich (Budapest, Hungary) in 96% claimed purity and was further purified with scCO2 prior

use (purity > 99.8%, GC-MS). Analytical grade methanol was purchased from Sigma Aldrich 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65

(Budapest, Hungary). Vinyl acetate (VA) was purchased from Molar Chemicals (Budapest, Hungary) and was freshly distilled before use. CO2 (99.5%) was supplied by Linde Gas (Répcelak, Hungary) and was further purified before use by distillation. 2.2. Batch experimental setup Batch reactions in scCO2 were performed in a 30 mL stainless steel autoclave (Pmax: 25 MPa, equipped with a rupture disc) [24]. Reactions were carried out at 10 ± 0.3 MPa and 45 ± 1 °C. CAL-B (0.02 g ± 0.0005) and (±)-1 (0.01 g, 0.085 mmol) were measured into the preheated reactor and then varied amounts of VA (15.67-235.05 µL, 0.17-2.55 mmol), corresponding to 2-30 molar ratio relative to (r)-1, were added. The reactor was immediately closed and then pressurized with CO2 to the desired pressure (P) and in the same time heated to the desired temperature (T). When the desired operating parameters were attained (in 2-3 min) a magnetic stirrer (200 rpm) was activated and the mixture was stirred for 5 hours. Every 30 minutes samples were taken; during sampling the batch operation was shifted to continuous stirred tank mode so the reactor was washed with 0.4 g CO2 (mass flow rate: ~ 0.5 g/min) at constant 10 MPa pressure. After depressurization, samples were collected in a liquid trap. 2.3. Preparative scale kinetic resolution of (±)-1 in continuous-flow reactor A combined extractor – packed-bed enzymatic reactor unit was developed (Fig. 1.). The cooled liquid CO2 was pumped through a preheater coil (6), before entering the extraction column of 15 mL inner volume. The scCO2 dissolved the (±)-1 from the extractor column (7). The homogenous solution of (±)-1 in scCO2 was mixed with VA in a static mixer (8) before entering the reactor column (9) of 0.3 mL inner volume filled with 250 mg immobilised CALB. Products were collected in a liquid trap after depressurization (12).

Fig. 1.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65

2.4. Analytical methods Samples were diluted to approximately 1 mg/mL in methanol for GC analysis. Samples were analysed in split mode (split flow 50 mL/min) with a Thermo Finnigan Focus GC (Egelsbach, Germany) equipped with a FID detector. A Beta DexTM 120 FS Supelco column (30 m x 0.25 mm x 0.25 µm) was used. The injector was set at 250 °C, and the carrier gas (He, 99.99%) pressure was 130 kPa. The injection volume was 1 µL. The initial oven temperature was 80 °C for 0.5 min; an oven temperature ramp to 115 °C was applied (temperature rise: 3 °C/min), where it was held for 1 min, followed by a secondary temperature ramp (temperature rise 25 °C/min) to the final temperature of 200 °C, with a hold time of 2 min, for a total run time of 18.57 min (retention times (min): (1S,2S)-1: 16.91, (1R,2R)-1: 17.00, (1S,2S)-2: 17.10, (1R,2R)-2: 17.16, (1S,2S)-3: 17.49, (1R,2R)-3: 17.55). NMR spectra were recorded on Bruker DRX 500 spectrometer (Bruker Corporation, Billerica, MA, USA). The absolute configurations were determined with a Perkin-Elmer 241 polarimeter (PerkinElmer,Waltham, MA, USA) and were confirmed by comparison of the [α] values with literature data. 2.5. Preparative scale kinetic resolution of (±)-1 in continuous-flow reactor For preparative scale kinetic resolution of (±)-1 the reaction was carried out in the continuousflow tubular reactor at 11.6 s average residence time (tres) for 28 h. During the total reaction time 679 mg (±)-1 was dissolved with scCO2 and transformed to (1S,2S)-2-acetoxycyclohexane-1-ol ((1S,2S)-2) and (1R,2R)-1,2-diacetoxycyclohexane ((1R,2R)-3). The residue was separated by column chromatography (silica gel, 2 : 1 hexane : ethyl acetate) to yield (1S,2S)-2 and (1R,2R)-3. (1S,2S)-2: yield: 292 mg, 63% as white crystal;

=+44.25 (c=1.0

in CHCl3), 1H NMR: (CDCl3, 500 MHz) 1.21 – 1.40 ppm (m, 4H) H-3ax, H-4ax, H-5ax, H-6ax, 1.66 -1.75 ppm (m, 2H) H-4eq, H-5eq, 1.98 -2.07 ppm ( m, 2H) H-3eq. H-6eq, 2.09 (s, 3H) CH3, 2.79 (broad s, 1H) OH, 3.55 (ddd, 1H, J: 10.7, 9.4, 4.4 Hz) H-2ax, 4.57 ppm (ddd J: 9.4, 9.4,

5.0 Hz, 1H) H-1ax; 13C NMR: (CDCl3, 125.75 MHz) (ppm) 21.5 (CH3), 23.9 (C-4), 24.0 (C1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65

5), 30.1 (C-3), 33.2 (C-6), 72.9 (C-2), 78.4 (C-1), 171.6 (CO). (1R,2R)-3: yield: 418 mg, 72% as colourless oil;

=-13.64 (c 1.0 in CHCl3), 1H NMR: (CDCl3, 500.13 MHz) 1.26 – 1.47

ppm (m, 4H) H-3ax, 4-Hax, H-5ax, H-6ax, 1.65-1.79 ppm (m, 2H) H-4eq. H-5eq, 2.00-2.06 (m, 2H, overlapped) H-3eq. H-6eq, 2.02 (s, 6H, overlapped) CH3, 4.80 (m, 2H) H-1ax, H-2ax;

13

C

NMR: CDCl3, 125.75 MHz) (ppm) 21.3 (CH3), 23.6 (C-4, C-5), 30.3 (C-3,C-6), 73.9 (C-1,C2) 170.6 (CO). 2.6. Calculation methods The enantiomeric excesses (ee) were determined according to Eq. 1:

ee

c  c c  c

(1)

where c*and c are the concentration values of the major and minor enantiomers, respectively. Concentrations were calculated from the GC peak areas based on calibration. Productivity is the sum of the two desired products, (1S,2S)-2 and (1R,2R)-3, over time and enzyme mass (Eq. 2) ܲ‫ ݀݋ݎ‬ൌ

൫௡ሺభೄǡమೄሻష૛ ା௡ሺభೃǡమೃሻష૜ ൯ ௠೐ ή௧ೝೠ೙

(2)

where n is the molar amount of products, me is the mass of the enzyme used (g), trun is the total runtime of the reaction in minutes including dead times. The variable ne-s (Eq. 3) describes the number of the enzyme catalyses, or by other words the number of formations of acylated enzyme intermediate according to the ping-pong-bi-bi mechanism [25]. At first, the active site of the enzyme is acylated. The acylated enzyme reacts with 1 to form product 2 and non-acylated enzyme. A new acylated enzyme is needed as a reaction partner to form product 3, thus the molar amount of 3 was weighted with two. ݊௘ି௦ ሺ‫ݐ‬ሻ ൌ ݊ሺଵௌǡଶௌሻି૛ ൅ ݊ሺଵோǡଶோሻି૛ ൅ ʹ ή ݊ሺଵோǡଶோሻି૜ At constant reactor volume (30 mL), ne-s(t) was given as concentration (ce-s) in mM.

(3)

The Michaelis-Menten curve is defined by Eq. 4, where rmax is the maximum value of the 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65

initial reaction rate, KM is the Michaelis-Menten constant. ‫ݎ‬଴ ൌ

௥೘ೌೣ ή௖ೇಲ

(4)

௄ಾ ା௖ೇಲ

The turnover number (TON) in batch mode was calculated with Eq. 5.: ܱܶܰ ൌ

௥೘ೌೣ ‫כ‬୚ ௠೐

(5)

where V is the volume of the reactor. The turnover frequency (TOF) in continuous mode was calculated for the time of steady-state operation (tst) with Eq. 6.:

TOF

nes me ˜ t st

(6)

3. Results and discussion The lipase catalysed kinetic resolution of (r)-1 via esterification with VA as an acyl donor is a consecutive reaction in two steps as shown in Scheme 1. In the first acylation step the two monoacetate enantiomers of 2 are produced, and in the second acylation step enantiomers of 2 are converted to enantiomers of 3. From a technological viewpoint the second acylation is completely enantioselective, the formation of (1S,2S)-3 is negligible. If the reaction rate coefficients of the monoacylation steps and of the diacylation step are close to equal, it is possible to describe the entire system by a single turnover number (TON) relevant for this enzymatic reaction. The calculation methods described here are only applicable if the reaction rate coefficients of the individual reaction steps not neglected are equal and the reaction can be regarded as irreversible. However, the assumptions offer straightforward technological calculations for design.

Scheme 1

3.1. Determination of TON by batch experiments 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65

In batch experiments the mass of enzyme was accurately kept constant (± 2 %). Fig. 2. shows ce-s(t) curves obtained by experiments at varied VA initial concentrations. VA and CO2 at 45 °C and 10 MPa are completely miscible [26] while the solubility of 1 is limited in carbon dioxide, and its initial concentration was kept constant at 2.9 mM. Eq. 7. was fitted to the points, and from the equations initial slope of the curve was calculated by the first derivate at t=0, giving the values of r0. The two fitted constants are ce-s,max and b. ce  s (t )

ce  s, max ˜ >1  exp  b ˜ t @

(7)

Fig. 2.

The maximal initial reaction rate (rmax) and the Michaelis constant (KM) were determined based on the Michaelis-Menten description of enzymatic processes. The values of r0 were plotted against the VA concentration and the Michaelis-Menten curve (Eq. 4) was fitted using Statistica 10.0 [27]. The generally applied linearization methods (Hans-Langmuir [28], Lineweaver-Burk [29-30] and Eadie-Hoffstee [31] plots) were also used. Table 1 summarizes the fitted rmax and KM values. TON was calculated as 0.12 mmol converted substrate·enzyme1

·min-1 by Eq. 5. using an average rmax value 0.08 mM·min-1.

Table 1

3.2. Design of a continuous flow reactor setup At high VA molar ratios the reaction has pseudo-first order kinetics, since the maximal amount of acylated enzyme intermediate is maintained during the whole reaction. In an ideal isothermal plug flow reactor the average residence time can be calculated by Eq. 8.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65

1  ln(1  X ) k

t res

(8)

where k is the reaction rate coefficient, and X is the required conversion. In this specific case the conversion is defined by Eq. 9. The maximal number of enzyme – substrate connections

n e  s , max time is , which could be estimated as 1.5 times the molar flow rate of (±)-1

over

because we neglect the formation of (1S,2S)-3. X (t )

n e  s ,max  n e  s (t ) n e  s ,max

1.5n 10  n e  s (t ) 1.5n 10

(9)

The desired conversion is 99%. The apparent reaction rate coefficient k can be calculated from TON (Eq. 10.). The mass of enzyme used in each experiment was selected to be 250 mg, which fits to a reactor volume of 0.3 mL. The estimated free volume of the reactor is 0.12 mL. The initial concentration of 1 equals its solubility in scCO2 at 10 MPa and 45 °C (~3.43 mmol/mL CO2).

k

rmax c1,0

TON ˜ me Vfree ˜ c1,0

0.48

1 s

(10)

Estimated average residence time in the reactor is 9.6 s (by Eq 8.). 3.3. Proof of concept In these continuous-flow reactions the enzyme activity was constant for at least 28 hours (this was the longest continuous operation in a single run during this study) without any loss of selectivity (Fig. 3.).

Fig. 3.

As the estimated average residence time in the continuous-flow experiments was 9.6 s, tres was controlled with the CO2 flow in the range of 2.9 – 11.6 s to study the effects of mean residence time in details. The effects of tres on X, ee2, and Prod are shown in Fig. 4. Values of

ee3 were always higher than 99.9%. Single data points are the average values of six to twenty 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65

samples within the steady-state operation of the continuous reactor and present individual experiments. For each analytical measurement the samples were collected for 10 minutes.

Fig. 4.

At higher average residence times (tres > 8.6 s) the ee2 > 99%, which means that this residence time was enough for full conversion. At lower tres values the second step of the consecutive reaction wasn’t completed, (1R,2R)-2 remained in effluent, thus ee2 decreased. Productivity has a maximum at ~ 5 s average residence time. The maximal productivity of the two desired products (1S,2S)-2 and (1R,2R)-3 in the continuous-flow operation was calculated as 52 µmol g enzyme-1·min-1·which is six times higher than in batch operation. TOF (Eq. 6) values for the studied reaction are increasing from 0.016 to 0.08 mmol enzyme – substrate connection g enzyme-1 min-1 with decreasing average residence time. Values of TOF are 10-67% of the maximal enzyme activity TON, which suggests that close to the inlet the overall reaction rate is limited by the enzyme activity, while further along the reactor the substrate concentration becomes limiting. 4. Conclusions The applicability of a relatively easy and straightforward calculation method for designing continuous enzymatic (supercritical) reactors based on experimental results of batch experiments is demonstrated in this work. The model reaction is a complicated consecutive enantioselective acylation of trans-1,2-cyclohexane-diol. Assumptions made during the calculation are in principle true for any single step highly (enantio)selective reaction, thus we believe in the general applicability of this method. While the batch experiments needed several hours of reaction time, the designed continuous reactor operates at mean residence

times of approximately 10 s yielding a productivity six times higher than that of the batch 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65

reactions. No loss of enzyme activity was observed after 28 hours of continuous operation and the chemical and enantiomeric purity of the isolated products were above 99.8%. Nomenclature and abbreviations ܿ

concentration

CAL-B

Candida antarctica lipase B

݁݁

enantiomeric excess

݇

reaction rate constant

݉

mass

‫ܴܯ‬

molar ratio

݊

molar amount

ܲ‫݀݋ݎ‬

productivity

r

reaction rate

‫ݐ‬

time

ܱܶ‫ܨ‬

turnover frequency

TON

turnover number

ܺ

conversion

ܸ

volume

Compounds ૚

trans-1,2-cyclohexanediol

૛

trans-2-acetoxy-cyclohexane-1-ol

3

trans-1,2-diacetoxycyclohexane

‫ܱܥ‬ଶ

carbon dioxide

ܸ‫ܣ‬

vinyl acetate

Indexes 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65

e

enzyme

e-s

enzyme – substrate connection

max

maximal

res

residence (time)

run

running (time)

st

steady-state

0

initial

Acknowledgements Measurement and evaluation of NMR spectra by Á. Szőllősy are greatly appreciated. We would like to thank Zs. Szeleczky for his contribution to the measurements. The research work was supported financially by the Hungarian Scientific Research Fund (OTKA 72861). M.U. acknowledges the stipend of the TÁMOP-4.2.1/B-09/1/KMR-2010-0002 project. References [1] R.N. Patel, Synthesis of chiral pharmaceutical intermediates by biocatalysis, Coordination Chemistry Reviews 252 (2008) 659-701. [2] T. Matsuda, K. Watanabe, T. Harada, K. Nakamura, Enzymatic reactions in supercritical CO2: carboxylation, asymmetric reduction and esterification, Catalysis Today 96 (2004) 103111. [3] A. Overmeyer, S. Schrader-Lippelt, V. Kasche, G. Brunner, Lipase-catalysed kinetic resolution of racemates at temperatures from 40 degrees C to 160 degrees C in supercritical CO2, Biotechnology Letters 21 (1999) 65-69.

[4] S. Šabeder, M. Habulin, Ž. Knez, Comparison of the esterification of fructose and palmitic 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65

acid in organic solvent and in supercritical carbon dioxide, Industrial Engineering Chemistry Research 44 (2005) 9631-9635. [5] Y. Tahmina, J. Tao, H. Buxing, Z. Jicheng, M. Xiumin, Transesterification reaction catalysed by Novozym 435 in supercritical carbon dioxide, J Molecular Catalalysis B 41 (2006) 27-31. [6] A. Tomin, G. Hornyánszky, K. Kupai, Zs. Dorkó, L. Ürge, F. Darvas, L.Poppe, Lipasecatalyzed kinetic resolution of 2-methylene-substituted cycloalkanols in batch and continuous-flow modes, Process Biochemistry 45 (2010) 859-865. [7] R. Goddard, J. Bosley, B. Al-Duri, Esterification of oleic acid and ethanol in plug flow (packed bed) reactor under supercritical conditions: Investigation of kinetics, J Supercritical Fluids 18 (2000) 121-130. [8] H. Sovova, M. Zarevucka, Lipase-catalysed hydrolysis of blackcurrant oil in supercritical carbon dioxide, Chemical Engineering Science 58 (2003) 2339-2350. [9] W.W. Xi, J.H. Xu, Preparation of enantiopure (S)-ketoprofen by immobilized Candida rugosa lipase in packed bed reactor, Process Biochemistry 40 (2005) 2161-2166. [10] H. Gunnlaugsdottir, B. Sivik, Lipase-catalyzed alcoholysis with supercritical carbon dioxide extraction 1: Influence of flow rate, J American Oil Chemist’s Society 74 (1997) 1483-1490. [11] A. Chatterjee, M. Sasikumar, N.N. Joshi, Preparation of enantiopure trans-1,2cyclohexanediol and trans-2-aminocyclohexanol, Synthetic Communication 37 (2007) 17271733. [12]

D.

Lainé,

M.

Fujita,

S.V.

Ley,

Preparation

and

use

of

chiral

2,2’-

bis(triisopropylsilyloxymethyl)bi(dihydropyran)s as new protecting and resolving agents for 1,2-diols, J Chemical Society Perkin Trans 1 (1999) 1639-1645.

[13] E. Székely, Gy. Bánsághi, P. Thorey, P. Molnár, J. Madarász, L. Vida, B. Simándi, 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65

Environmentally benign chiral resolution of trans-1,2-cyclohexanediol by two-step supercritical fluid extraction, Industrial Engineering Chemical Research 49 (2010) 9349-9354. [14] Y. Matsumura, T. Maki, S. Murakami, O. Onomura, Copper ion-induced activation and asymmetric benzoylation of 1,2-diols: kinetic chiral molecular recognition. J American Chemical Society 125 (2003) 2052-2053. [15] H. Brunner, U. Obermann, P.Wimmer, Enantioselective monophenylation of diols with Cu(OAc)2/Pyridinyloxazoline catalysts, Organometallics 8 (1989) 821-826. [16] J. Detry, T. Rosenbaum, S. Lütz, D. Hahn, K.E. Jaeger, M. Müller, T. Eggert, Biocatalytic production of enantiopure cyclohexane-trans-1,2-diol using extracellular lipases from Bacillus subtilis, Applied Microbiology and Biotechnology 72 (2006) 1107-1116. [17] V. Bódai, O. Orovecz, Gy. Szakács, L. Novák, L. Poppe, Kinetic resolution of trans-2acetoxycycloalkan-1-ols

by

lipase-catalysed

enantiomerically

selective

acylation,

Tetrahedron: Asymmetry 14 (2003) 2605-2612. [18] M. Tanaka, M. Oba, K. Tamai, H. Suemune, Asymmetric synthesis of α,α-disubstituted α-amino acids using (S,S)-cyclohexane-1,2-diol as a chiryl auxiliary, J Organic Chemistry 66 (2001) 2667-2673. [19] M.D. Groaning, B.J. Rowe, C.D. Spilling, New homochiral cyclic diol ligands for titanium alkoxide catalyzed phosphonylation of aldehydes, Tetrahedron Letters 39 (1998) 5485-5488. [20] M. Tiecco, L. Testaferri, F. Marini, S. Sternativo, C. Sani, L. Bagnoli, A. Temperini, Synthesis of enantiomerically pure 1,4-dioxanes from alkenes promoted by organoselenium reagents, Tetrahedron: Asymmetry 14 (2003) 1095-1102.

[21] E. Wojaczyńska, J. Skaržewski, Novel C2-symmetric chiral ligands: enantioselective 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65

transformation of cyclic 1,2-diols into 1,2-bis(phenylsulfenyl) and 1,2-bis(phenylselenyl) derivatives, Tetrahedron: Asymmetry 19 (2008) 593-597. [22] O. Orovecz, P. Kovács, P. Kolonits, L. Párkányi, É. Szabó, L. Novák, Rearrangement of allyl aryl ethers; Part V: Reaction of 2,5-dialkoxyhydroquinone with cycloalkanediols, Synthesis 18 (2002) 2711-2716. [23] K. Laumen, D. Breitgoff, R. Seemayer, M.P. Schneider, Enantiomerically pure cyclohexanols and cyclohexane-1,2-diol derivatives – chiral auxiliaries and substitutes for (−)-8-phenylmenthol – a facile enzymatic route, J Chemical Society Chemical Communications 3 (1989) 148-150.[24] M. Utczás, E. Székely, G. Tasnádi, É. Monek, L. Vida, E. Forró, F. Fülöp, B. Simándi, Kinetic resolution of 4-phenyl-2-azetidinone in supercritical carbon dioxide, J Supercritical Fluids 55 (2011) 1019-1023. [25] M. Martinelle, K. Hult, Kinetics of acyl transfer reactions in organic media catalysed by Candida antartica lipase B, Biochimica et Biophysica Acta 1251 (1995) 191-197. [26] S. Pepera, V. Haverkampb, R. Dohrn, Measurement of phase equilibria of the systems CO2 + styrene and CO2 + vinyl acetate using different experimental methods, J. Supercritical Fluids 55 (2010) 537-544. [27] www.statsoft.com [28] J.J. Carberry, Chemical and Catalytic Reaction Engineering, New York: McGraw-Hill, 1976. pp. 364-366. [29] H. Lineweaver, D. Burk, The determination of enzyme dissociation constants, J American Chemical Society 56 (1934) 658-666. [30] G.S. Eadie, The inhibition of cholinesterase by physostigmine and prostigmine, J Biological Chemistry 146 (1942) 85-93.

[31] B.H.J. Hofstee, On the evaluation of the constants Vm and KM in enzyme reactions, 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65

Science 116 (1952) 329-331.

Caption fig 1

Continuous-flow system 1. CO2 storage, 2. Jasco PU-2080-CO2 pump, 3. Valve, 4. Ball check valve, 5. Filter, 6. Preheater coil, 7. Substrate extractor column, 8. T-junction with static mixer, 9. Enzymatic reactor column, 10. Manometer, 11. Depressurization valve, 12. Sample trap, 13. Ball check valve, 14. Valve, 15. Manometer, 16. HPLC pump, 17. VA storage, 18. Temperature-controlled water bath

Figure(s) Click here to download high resolution image

Caption fig 2

The ce-s values as function of reaction time at batch reactions at 10 MPa and 45 °C at varied initial molar ratio (MR) of VA to 1. Error bars show the uncertainty of three repeated experiments at 10 MR. Lines are fitted curves according to Eq. 7.

Figure(s) Click here to download high resolution image

caption fig 3

Conversion and enantiomeric excess of the monoacetate product 2 against time of the experimental run. Experimental points are shown at the average time of sample collection. Reaction conditions: 10 MPa, 45 °C, 10 MR VA.

Figure(s)

100 90 80

X, ee2 (%)

70 60 50

X

40

ee2

30 20 10 0 0

5

10

15 trun (h)

20

25

30

caption fig 4

Effects of average residence time on ee2 and X. The reaction conditions were 10 MPa, 45 °C, 10 - 40 MR VA.

Figure(s)

100 X, ee2 (%), Prod (µmol/(g.s))

90 80 70 60 50

X

40

ee2

30

Prod

20 10 0 2

4

6

8 tres (s)

10

12