SZUPERKRITIKUS FLUID KROMATOGRÁFIA KROMATOGRÁFIÁS ELVÁLASZTÁSI TECHNIKÁK

2.2.45. Szuperkritikus fluid kromatográfia

2.2.45. SZUPERKRITIKUS FLUID KROMATOGRÁFIA

Ph. Hg. VIII. – Ph. Eur. 4, 4.1 és 4.2

VIZSGÁLAT

A szuperkritikus fluid kromatográfia (SFC) olyan kromatográfiás elválasztási módszer, melyben a mozgófázis szuperkritikus vagy szubkritikus állapotú fluidum. Az oszlopban található állófázis vagy kis méretű, szilárd szemcsékből áll, mint a folyadékkromatográfiában is használt szilikagél, porózus grafit és kémiailag módosított állófázisok, vagy kapilláris oszlopok esetében lehet térhálós folyadékfilm, mely egyenletes filmbevonatot képez a oszlop falán. A szuperkritikus fluid kromatográfiás elválasztás főleg adszorpciós és megoszlásos folyamatokon alapul.

Elkészítjük a vizsgálati és az összehasonlító oldatot/okat. Az oldatok szilárd szemcséket nem tartalmazhatnak. A rendszer alkalmasságának értékeléséhez szükséges kritériumokat a Kromatográfiás elválasztási technikák (2.2.46) fejezet írja elő. Ugyancsak ez a fejezet írja elő, hogy a rendszeralkalmassági kritériumok teljesítéséhez a kromatográfiás rendszer paramétereinek milyen mértékű változtatása engedhető meg.

KÉSZÜLÉK

2.2.46. KROMATOGRÁFIÁS ELVÁLASZTÁSI TECHNIKÁK

A készülék rendszerint hűtött pumparendszerből, injekA kromatográfiás elválasztási technikák soklépéses elvátorból, termosztátban elhelyezett kromatográfiás oszlopból, lasztási módszerek, melyeknél a minta komponensei két fádetektorból, nyomásszabályzóból és adatgyűjtő egységből zis, az álló- és a mozgófázis között oszlanak meg. Az állófázis (vagy integrátorból, illetve rekorderből) áll. lehet szilárd vagy folyadék, mely utóbbit szilárd vagy géles hordozóra viszik fel. Az állófázis lehet oszlopba töltve, lemezPumparendszer re kenve vagy filmként szétterítve stb. A mozgófázis lehet A mozgófázis egyenletes áramlási sebességének biztosí- gáz vagy folyadék, vagy szuperkritikus fluid halmazállapotú. tása érdekében pumparendszerre van szükség. A nyomásin- Az elválasztás adszorpciós, megoszlásos, ioncserés stb. folyagadozást csökkenteni kell, például úgy, hogy a nyomás alá matokon vagy a molekulák közti egyéb fizikai-kémiai kühelyezett oldószert pulzáláscsökkentő egységen áramoltat- lönbségeken, mint például a méret, a tömeg vagy a térfogat juk keresztül. A csöveknek és a csatlakozásoknak ki kell bír- stb. különbözőségén alapul. niuk a pumparendszer által létrehozott nyomást. E fejezet a közös kromatográfiás jellemzők és az általáA mikroprocesszorral szabályzott rendszerek az előre nosan használható rendszeralkalmassági követelmények demeghatározott program szerint képesek pontosan továbbí- finícióit és kiszámításuk módját tartalmazza. Az elválasztátani a mozgófázist mind állandó, mind változó eluensössze- sok elvét, a készülékek és a vizsgálatok leírását a következő tétel esetén. A gradiens elúcióhoz endelkezésre állnak olyan általános fejezetek tartalmazzák: pumparendszerek is, melyek több oldószertartályból képesek az oldószerek szállítására. Az oldószerek keverése a pumPapírkromatográfia (2.2.26) pa(ák) kis- és nagynyomású oldalán is megoldható. Vékonyréteg-kromatográfia (2.2.27) Gázkromatográfia (2.2.28) Injektorok Folyadékkromatográfia (2.2.29) Szelep segítségével közvetlenül injektálhatunk a oszlop Méretkizárásos kromatográfia (2.2.30) elejére. Szuperkritikus fluid kromatográfia (2.2.45) Állófázisok Az SFC-ben alkalmazható oszlopba töltött állófázisokat DEFINÍCIÓK részben a Folyadékkromatográfia (2.2.29.) című fejezet (töltött oszlopok), részben a Gázkromatográfia (2.2.28) cíA cikkelyben foglalt határértékek megállapításához az mű fejezet (kapilláris oszlopok) írja le. A kapilláris oszlopok alábbi definíciókat vették figyelembe. belső átmérője (#) legfeljebb 100 µm lehet. Mozgófázisok A mozgófázis rendszerint szén-dioxid, amely poláris módosítót, mint például metanolt, 2-propanolt vagy acetonitrilt is tartalmazhat. Az előírt mozgófázis összetétele, nyomása (sűrűsége), hőmérséklete és áramlási sebessége vagy az egész kromatográfiás eljárás során állandó (izokratikus, izodenz, izotermikus elúció), vagy egy adott program szerint változhat (a módosító mennyisége, a nyomás (sűrűség), a hőmérséklet vagy az áramlási sebesség szerinti gradiens elúció). Detektorok A legelterjedtebben alkalmazott detektorok az ultraibolya/látható (UV/Vis) spektrofotométerek és a lángionizációs detektorok. Ezenkívül alkalmazhatók fényszóráson alapuló detektorok, infravörös abszorpciós spektrofotométerek, hővezetőképességi detektorok, illetve egyéb detektortípusok is.

1

Kérjük, figyeljen az általános cikkelyekre vonatkozó tájékoztatásra (belső borító)


2.2.46. Kromatográfiás elválasztási technikák

Néhány készülék esetében bizonyos jellemzők, mint például a jel/zaj viszony számítása a gyártó által biztosított szoftverrel is megoldható. A felhasználó felelőssége annak biztosítása, hogy a szoftver által alkalmazott számítási módszerek összhangban legyenek az Európai Gyógyszerkönyv által megadott követelményekkel. Amennyiben ez nem teljesül, a szükséges módosításokat el kell végezni.

alkotják.ahol tR = retenciós idő (térfogat) vagy távolság, melyet az alapvonalon, az injektálási pont és a komponens csúcsmaximumából az alapvonalra bocsátott merőleges között mérünk, tM = holtidő (holttérfogat): az az idő (térfogat) vagy távolság, amelyet az alapvonalon, az injektálási pont és a vissza nem tartott komponens csúcsmaximumából az alapvonalra bocsátott merőleges között mérünk.

Kromato gram A kromatogram a detektorválasz vagy a oszlopról jövő eluensben (efluens) mért koncentráció, illetve más, a konMegoszlási hányados centrációval arányos mennyiség grafikus vagy más módon A méretkizárásos kromatográfiában a komponens elúciós történő megjelenítése, az idő, a térfogat vagy a távolság tulajdonsága egy adott oszlopon a megoszlási hányadossal függvényében. Ideális esetben kromatogramot az alapvona- (K0) is jellemezhető, melyet a következő összefüggéssel szálon egymást követő Gauss-görbe alakú csúcsok míthatunk:

KO =

tR − tM tt − t M

RETENCIÓS ADAT OK

tR = retenciós idő (térfogat) vagy távolság, melyet az Retenciós idő és térfogat alapvonalon, az injektálási pont és a komponens Az elúciós kromatográfiában a retenciós idő (tR) a csúcscsúcsmaximumából az alapvonalra bocsátott maximum helyzetének megadásával a kromatogramról közmerőleges között mérünk, vetlenül meghatározható. A retenciós időből a retenciós tértM (vagy t0) = holtidő (holttérfogat): az az idő (térfogat) vagy fogat (VR) az alábbi képlettel számítható. távolság, amelyet az alapvonalon, az injektálási pont és a vissza nem tartott komponens csúcsmaximuVR tR ~ v mából az alapvonalra bocsátott merőleges között mérünk. ahol tt = retenciós idő (térfogat) vagy távolság, melyet az alaptR = retenciós idő vagy távolság, melyet az alapvonalon, az vonalon, az injektálási pont és a töltet pórusaiba teljes injektálási pont és a komponens csúcsmaximumából mértékben bejutó komponens csúcsmaximumából az az alapvonalra bocsátott merőleges között mérünk, alapvonalra bocsátott merőleges között v= a mozgófázis áramlási sebessége. mérünk. Tömegmegoszlási arány A tömegmegoszlási arány (Dm), más néven kapacitásfaktor vagy retenciós faktor, illetve visszatartás (k') definíciója: Dm =

az anyag mennyisége az allófázisban az anyag mennyisége a mozgófázisban

= Kc ·

VS VM

Visszatartási faktor A planáris kromatográfiában használt visszatartási faktor RF (vagy más néven retenciós faktor (Rf)) a felvitel helyétől a folt közepéig mért távolság és a felvitel helyétől az oldószerfront által megtett távolság hányadosa.

Rf = ahol KC = egyensúlyi megoszlási hányados (más néven megoszlási állandó), VS = az állófázis térfogata, VM = a mozgófázis térfogata. Egy komponens tömegmegoszlási aránya (kapacitásfaktora) a kromatogramról a következő összefüggéssel határozható meg:

t −t Dm vagy k ' = R m tM

b a

ahol b= a vizsgált komponens által megtett út, a= az oldószerfront által megtett út.

KROMATOGRÁFIÁS ADATOK

A csúcsot definiálhatjuk a csúcs területével (A) vagy a csúcs magasságával (h) és a csúcs félértékszélességével (wh), illetve a csúcs magasságával és a csúcs két inflexiós pontja között mért szélességgel (wi).

Az Alapelvek (1) előírásait minden cikkelyre és egyéb szövegre alkalmazni kell

2


Gauss-görbe alakú csúcsok (normális eloszlás, lásd 2.2.46.-1. ábra) esetén az alábbi összefüggés érvényes: w h = 1,18w i


vagy izodenz körülmények között nyert kromatogramok alapján az alábbi összefüggés szerint – t R-t és w h-et azonos egységben (idő, térfogat vagy távolság) behelyettesítve számíthatjuk ki:

⎛t ⎞ N = 5,54 · ⎜⎜ R ⎟⎟ ⎝ wh ⎠

2

ahol t R = retenciós idő (térfogat) vagy távolság, melyet az alapvonalon, az injektálási pont és a komponens csúcsmaximumából az alapvonalra bocsátott merőleges között mérünk, w h =a csúcsmagasság felénél mért csúcsszélesség (félértékszélesség). 2.2.46.-1. ábra

Szimmetriafaktor Egy csúcs szimmetriafaktorát (As) (lásd 2.2.46.-2. ábra) az alábbi összefüggés alapján számíthatjuk ki:

A5 =

w0, 05 2d

A látszólagos elméleti tányérszám a komponenstől, az oszloptól és a retenciós időtől függően változik.

E L V Á L ASZ T ÁS I ADA T O K

Felbontás Két csúcs közötti felbontást (Rs ) az alábbi képlet alapján számíthatjuk ki:

RS =

W0,05 = a csúcsmagasság huszadánál mért csúcsszélesség, d = a csúcsmaximumból az alapvonalra bocsátott merőleges és a csúcs felszálló ága között, a magasság huszadánál mért távolság. Az 1,0 érték szimmetrikus (ideális) csúcsot jelez.

1,18 · (t R2 − t R1 ) wh1 + wh 2 t R2 > t R1

ahol t R1 és t R2 = retenciós idők vagy távolságok, melyeket az alapvonalon, az injektálási pont és a két szomszédos komponens csúcsmaximumából az alapvonalra bocsátott merőlegesek között mérünk, w h1 és w h2 = a csúcsmagasságok felénél mért csúcsszélességek (félértékszélességek). Az 1,5-nél nagyobb felbontás alapvonalon elváló csúcsokat jelent. A fent megadott összefüggés nem alapvonalon elváló csúcsok esetében nem feltétlenül alkalmazható. Planáris kromatogram kvantitatív kiértékelésénél a retenciós idők helyett a migrációs távolságokat vesszük alapul, és a felbontást a következőképpen számítjuk ki:

RS = 2.2.46. -2. ábra

Oszlopteljesítmény és látszólagos elméleti tányérszám Az oszlop teljesítményére (látszólagos hatékonyságára) jellemző látszólagos elméleti tányérszámot (N) az alkalmazott technikától függően izoterm, izokratikus

1,18 · a· (t F2 − t F 1 ) wh1 + wh 2

ahol R F1 és R F2 = a felvitel helyétől a foltok közepéig mért távolságok és a felvitel helyétől az oldószerfront által megtett távolság hányadosai (visszatartási faktorok), w h1 és w h2 = a csúcsmagasságok felénél mért csúcsszélességek (félértékszélességek), a = az oldószerfront migrációs távolsága.



Hegy–völgy arány (Peak-to-valley r a t io ) A hegy–völgy arány (p/v) abban az esetben alkalmazható rendszeralkalmassági követelményként a rokon vegyületek vizsgálata során, ha az alapvonalon történő elválasztás két csúcs között nem valósul meg (2.2.46.-3. ábra).

p/v =

Hp Hv

ahol Hp = a kisebbik csúcs magassága a meghosszabbított alapvonaltól számítva, Hv = a kisebbik és a nagyobbik csúcsot elválasztó görbeszakasz minimuma és a meghosszabbított alapvonal között mérhető távolság.

rG =

t R2 t R1

Ha nincs más előírás, a ckkelyben megadott relatív retenció a módosítatlan relatív retenciónak felel meg. Planáris kromatográfiában tR2 és tR1 helyett az RF2 és az RF1 visszatartási faktorokkal számolunk. A ME NNY ISÉ GI

M E GH ATÁR OZÁS PONTOSSÁGA

Jel/zaj viszony A jel/zaj viszony (S/N), mely hatással van a mennyiségi meghatározás pontosságára, az alábbi összefüggés szerint számítható:

S/N =

2.2.46.-3. ábra

2H h

ahol H= az előírt összehasonlító oldat kromatogramján a vonatkozó csúcs magassága (lásd 2.2.46.-4. ábra), melyet a csúcs maximuma és az extrapolált alapvonal között mérünk. Az alapvonal meghatározásához a detektorjelet a csúcs félértékszélességének húszszorosáig követjük. h= a háttérzaj sávszélessége a vak felvitelével vagy injektálásával nyert kromatogram azon részén mérve, ahol a csúcs az előírt összehasonlító oldat kromatogramján megjelenne. A sávszélesség meghatározásához a detektorjelet az előírt összehasonlító oldat kromatogramján kapott csúcs félértékszélességének hússzorosáig követjük, a csúcs elméleti megjelenési helye előtt és után – amennyiben lehetséges azonos ideig.

Relatív retenció A relatív retenciót (r) az alábbi összefüggés szerint becsülhetjük meg:

r=

t R2 − tM t R1 − t M

ahol tR2 = az érintett csúcs retenciós ideje, tR1 = a referenciacsúcs (általában a vizsgálandó anyag csúcsának) retenciós ideje, tM = holtidő (holttérfogat): az az idő vagy távolság, melyet az alapvonalon, az injektálási pont és a vissza nem tartott komponens csúcsmaximumából az alapvonalra bocsátott merőleges között mérünk. A módosítatlan (korrigálatlan) relatív retenciót (rG) az alábbi összefüggés szerint számítjuk:

2.2.46.-4. ábra

Ismételhetőség A válasz ismételhetőségét egy összehasonlító oldat egy-



mást követő injektálásával vagy felvitelével nyert mérési ményeket kell teljesíteni: eredmények százalékban kifejezett relatív szórásával (RSD%) – A főcsúcs szimmetriafaktora – ha a cikkely másképp nem jellemezzük, és az alábbi összefüggéssel számítjuk: rendelkezik – 0,8 és 1,5 között legyen. E követelmény általánosan érvényes mind a cikkelyben leírt tisztasági 2 yi − y vizsgálatokra, mind a tartalmi meghatározásokra. 100 RSD% = – Az előírt összehasonlító oldat ismételt injektálásaiból n −1 y számított relatív szórás nem haladhatja meg a 2.2.46.-1. ahol táblázatban a maximális megengedett relatív szórásra yi = az egyes mérési eredmények (csúcs alatti terület, csúcsmagasság, vagy – belső standard alkalmazása esetén – területarány), y= a mérési eredmények átlaga, n= a mérési eredmények száma.

∑(

)

Az összehasonlító oldat egymást követő injektálásaira vonatkozó maximális megengedett relatív szórást (RSDmax) adott hatóanyagtartalom követelmény esetén az alábbi összefüggés szerint számítjuk:

RSDmax =

KB n t 90%,n −1

ahol K

= konstans (=0,349), a K =

0,6 t 90%,5 · 2 6 0,6

kifejezésből számítva, ahol

2

a 6 injektálás és

B=1,0 esetén szükséges RSD érték B

= az egyedi cikkely „Definíció” pontjában a hatóanyag-tartalomra megadott felső határ és 100% különbsége, n = az összehasonlító oldat ismételt t90%, n–1 = injektálásainak száma (3 < n < 6), a Student-féle t faktor, 90%-os valószínűségi szinten (két oldali) és n– 1 szabadságfok esetén. RENDSZERALKALMASSÁG

A rendszeralkalmassági vizsgálat a módszer szerves része, segítségével győződhetünk meg a kromatográfiás rendszer megfelelő hatékonyságáról. Az oszlop hatékonyságának megállapítására alkalmazott paraméterek rendszerint a látszólagos hatékonyság, a tömegmegoszlási hányados, a felbontás, a relatív retenció és a szimmetria faktor. A kromatográfiás viselkedést többek között a következő tényezők befolyásolhatják: a mozgófázis összetétele, ionerőssége, hőmérséklete, látszólagos pH -ja és áramlási sebessége, az oszlop hossza, a hőmérséklet és a nyomás, és az állófázis tulajdonságai, úgy, mint porozitás, szemcseméret, szemcsetípus, fajlagos felület és a fordított fázisú töltetek esetében a kémiai módosítás mértéke az utókezeléssel (end capping) vagy a széntartalommal stb. kifejezve. Az alkalmazott készülék egyes részeinek alkalmasaknak kell lenniük a tisztasági vizsgálatban vagy a tartalmi meghatározás során megkövetelt pontosság elérésére. Ha a cikkely másképp nem rendelkezik, az alábbi követel-



2.2.46.-1. táblázat – Ismételhetőségi követelmények Az egyes injektálások száma 3

B(%)

4

5

6

Maximális megengedett relatív szórás

2,0

0,41

0,59

0,73

0,85

2,5

0,52

0,74

0,92

1,06

3,0

0,62

0,89

1,10

1,27

megadott értékeket. Ez a követelmény csak a tartalmi meghatározásokra érvényes és a rokon vegyületek vizsgálatára nem vonatkozik. – A csúcsra vonatkozó kimutatási határ (amely az S/N = 3-hoz tartozó anyagmennyiség) legyen kisebb, mint a rokon vegyületek vizsgálata során előírt értékelési (elhanyagolási) határ. – A csúcsra vonatkozó mennyiségi meghatározás határa (amely az S/N =10-hez tartozó anyagmennyiség) legyen ugyanakkora vagy kisebb, mint a rokon vegyületek vizsgálata során előírt értékelési (elhanyagolási) határ.

A KROMATOGRÁFIÁS KÖRÜLMÉNYEK MÓDOSÍTHATÓSÁGA

Az alábbiakban tájékoztatásul közöljük, hogy a rendszeralkalmassági követelmények teljesíthetősége érdekében milyen mértékben módosíthatók a kromatográfiás vizsgálatok különböző paraméterei anélkül, hogy a módosítás a módszert alapvetően megváltoztatná. Az előírt kromatográfiás körülményeket a cikkely kidolgozása során validálták. A tisztasági vizsgálathoz vagy a tartalmi meghatározáshoz tartozó rendszeralkalmassági vizsgálatokkal győződhetünk meg arról, hogy az elválasztás hatékonysága kielégíti-e a követelményeket. Mivel a kereskedelemben igen sokféle, kromatográfiás tulajdonságaiban különböző, ugyanakkor csak általánosságban jellemzett állófázis kapható, az előírt rendszeralkalmassági követelmények biztosítására – szükség esetén – a kromatográfiás körülményeket kismértékben módosítani kell. Különösen a fordított fázisú folyadékkromatográfiás módszereknél fordulhat elő az, hogy az egyes paraméterek módosítása sem eredményez minden esetben kielégítő kromatográfiás meghatározást. Ilyen esetben szükségessé válhat az oszlop cseréje egy másik, ugyanolyan típusú (pl. oktadecilszililezett), oszlopra, amely már a megfelelő kromatográfiás viselkedést mutatja. A kritikus paramétereknek a rendszeralkalmasság biztosítása érdekében történő módosíthatóságát a cikkely egyértelműen meghatározza. Több paraméter módosítása, a rendszer hatékonyságára gyakorolt esetleges kumulatív hatás miatt, kerülendő.

abszolút %-kal (százalékponttal) módosítható aszerint, hogy melyik a nagyobb. Például egy, a mozgófázisban/kifejlesztőszerben 10 % mennyiségben jelen lévő minor komponens esetében az összetétel 30 (relatív) %-os módosítása mennyiségének 7 és 13 % közti változtatását teszi lehetővé, míg a 2 abszolút %-os (azaz százalékpontos) módosítás a komponens mennyiségének 8 és 12 % közötti módosítását engedi meg, ezért ebben az esetben a relatív százalékos módosítás a nagyobb; egy, a mozgófázisban 5 % mennyiségben jelen lévő minor komponens esetében a 30 (relatív) %-os módosítás 3,5 – 6,5 % közti változtatást, míg a 2 abszolút %-os módosítás 3 – 7 % közti változtatást enged meg, tehát ebben az esetben az abszolút százalékos módosítás nagyobb. A többi komponens mennyisége ±10 százalékpontnál nagyobb mértékben nem változtatható. A kifejlesztőszer vizes komponensének pH -ja: ha a cikkely másképp nem rendelkezik, ±0,2 pH-egységgel, semleges kémhatású vizsgálandó anyag esetében ±1,0 pHegységgel módosítható. A kifejlesztőszer tompítóoldat-komponensének sókoncentrációja: ±10%-kal módosítható. A felvitt mennyiség: finom szemcseméretű réteg alkalmazása esetén az előírt térfogat 10 – 20%-ára csökkenthető. Az oldószerfront által megtett út nem lehet kevesebb, mint 50 nm, illetve nagy hatékonyságú lemezek esetén, mint 30 nm. Folyadékkromatográfia A mozgófázis összetétele: a minor oldószerkomponens mennyisége ±30%-kal, illetve ±2 százalékponttal módosítható aszerint, hogy melyik a nagyobb. A többi komponens mennyisége ±10 százalékpontnál nagyobb mértékben nem változtatható (lásd a fenti példát). A mozgófázis vizes komponensének pH -ja: ha a cikkely másképp nem rendelkezik, ±0,2 pH-egységgel, semleges kémhatású vizsgálandó anyag esetében ±1,0 pH-egységgel módosítható. A mozgófázis tompítóoldat -komponensének sókoncentrációja: ±10%-kal módosítható. Detektálási hullámhossz: nem módosítható. Állófázis: – az oszlop hossza: ±70%-kal, – az oszlop belső átmérője: ±25%-kal változtatható, – a szemcseméret: legfeljebb ±50%-kal csökkenthető, növelni nem lehet.

Áramlási sebesség: ±50%-kal módosítható. Amennyiben a cikkely jelzi a főcsúcs retenciós idejét, és az alkalmazott oszlop belső átmérője eltérő, az áramlási sebességet módosítani kell. Az áramlási sebesség nem csökkenthető, ha a cikkely megadja a látszólagos elméleti tányérszámot. Hőmérséklet: ±10 %-kal, de legfeljebb 60 ~C-ig módosítható. Injektált térfogat: csökkenthető, feltéve, hogy a detektálás és a meghatározandó csúcs(ok) ismételhetősége kielégítő. Gradiens elúció: az alkalmazott készülék felépítése Vékonyréteg- és papírkromatográfia A kifejlesztőszer összetétele: a minor szignifikánsan megváltoztathatja a módszerben leírt oldószerkomponens mennyisége ±30%-kal, illetve ±2 felbontást, retenciós időt és a relatív retenciós időket. Amennyiben ez a helyzet áll elő, annak feltehetően az az

76


oka, hogy eluensek keveredési helye és az oszlop eleje – Detektor válasz. A detektor érzékenysége a mozgófázissal a detektorba belépő anyag koncentrációközötti térfogat (dwell volume) túlságosan nagy. vagy tömegegységére vonatkoztatott kimenő jel. A Gázkromatográfia relatív detektor válaszfaktor – amelyre gyakran csak Állófázis: válaszfaktorként hivatkozunk – a detektor érzékenységét egy standard anyagra vonatkoztatva fejezi ki. A – az oszlop hossza: ±70%-kal, korrekciós faktor a válaszfaktor reciproka. – az oszlop belső átmérője: ±50%-kal változtatható, – Külső standard módszer. A vizsgált komponens(ek) – a szemcseméret: legfeljebb ±50%-kal csökkenthető, koncentrációját a vizsgálati oldattal nyert válasz(ok) növelni nem lehet. [csúcs(ok)] és az összehasonlító oldattal nyert válasz(ok) – a filmvastagság: –50 és +100% között változtatható. [csúcs(ok)] összehasonlításával határozzuk meg. – Belső standard módszer. A vizsgálati és az Áramlási sebesség: ±50%-kal módosítható. összehasonlító oldathoz azonos mennyiségű, a Hőmérséklet: ±50%-kal módosítható. vizsgálandó anyagtól elváló anyagot adunk. A belső Injektált térfogat: csökkenthető, feltéve, hogy a standard a vizsgálandó anyaggal nem reagálhat; stabilnak detektálás és az ismételhetőség kielégítő. kell lennie, és nem tartalmazhat olyan szennyező anyagokat, melyek retenciós ideje hasonló a vizsgálandó Szuperkritikus fluid kromatográfia anyag retenciós idejéhez. A vizsgálandó anyag A mozgófázis összetétele: töltött oszlopok esetén a minor koncentrációját úgy határozzuk meg, hogy oldószerkomponens mennyisége ±30%-kal, illetve ±2 összehasonlítjuk a vizsgálati oldat esetén mért két csúcs százalékponttal módosítható aszerint, hogy melyik a na(a vizsgálandó anyagé és a belső standardé) területeinek gyobb. Kapilláris oszlopok esetében nem módosítható. vagy magasságainak arányát az összehasonlító oldat Detektálási hullámhossz: nem módosítható. esetén mért ugyanezen aránnyal. Állófázis: – Normalizációs eljárás. A vizsgálandó anyag egy vagy – az oszlop hossza: ±70 %-kal, több komponensének százalékos mennyiségét úgy – az oszlop belső átmérője: határozzuk meg, hogy területét/területüket a csúcsok ±25%-kal (töltött oszlopok esetén) összterületének százalékában fejezzük ki. Az összterület ±50%-kal (kapilláris oszlopok esetén) változtatható, kiszámításánál az oldószerből vagy a hozzáadott – a szemcseméret: legfeljebb 50%-kal csökkenthető, reagensekből eredő csúcsokat, és azokat, melyeknek a növelni nem lehet (töltött oszlopok). területe kisebb, mint a megadott értékelési (elhanyagolási) határ, nem vesszük figyelembe. Áramlási sebesség: ±50%-kal módosítható. – Kalibrációs eljárás. Meghatározzuk a mért vagy Hőmérséklet: ±10%-kal módosítható. számított jel (y) és az anyag mennyisége (koncentrációja, Injektált térfogat: csökkenthető, feltéve, hogy a tömege stb.; x) közötti összefüggést, és kiszámítjuk a detektálás és az ismételhetőség kielégítő. kalibrációs függvényt. Az analitikai eredményt úgy kapjuk meg, hogy az inverz függvény segítségével a mért vagy számított jelből kiszámítjuk az anyag mennyiségét. MENNYIS ÉGI MEGHATÁROZÁS

Az Alapelvek (1) előírásait minden cikkelyre és egyéb szövegre alkalmazni kell

76

2.2.47. Kapilláris elektroforézis


A tartalmi meghatározások és más mennyiségi ahol meghatározások esetén a cikkely a külső standard módszert, q = az oldott anyag effektív töltése, a belső standard módszert vagy a kalibrációs eljárást írja ~ = az elektrolitoldat viszkozitása, elő, a normalizációs eljárás általában nem használatos. A r = az oldott anyag Stokes-sugara, V = rokon vegyületek vizsgálata során általában vagy a külső az alkalmazott feszültség, L = a standard módszer (egy összehasonlító oldattal), vagy a kapilláris teljes hossza. normalizációs eljárás használatos. Mind a normalizációs eljárásnál, mind a külső standard módszer esetében, ha összehasonlításként a vizsgálati oldat valamely hígítása Ha egy tompítóoldattal töltött kapillárisban elektromos használatos, a rokon vegyületek válaszának hasonlónak kell erőteret hozunk létre, a kapilláris belsejében az oldószer lennie az anyagéhoz (a válaszfaktor 0,8 és 1,2 között van), ha áramlásba jön, melyet elektroozmotikus áramlásnak neveez nem teljesül, a cikkely megadja a korrekciós faktorokat. zünk. Az elektroozmotikus áramlás sebessége függ az Amikor a rokon vegyület vizsgálat a szennyezők elektroozmotikus mozgékonyságtól (µeo), mely a kapilláris összegzését, vagy egy adott szennyező mennyiségi belső falának töltéssűrűségétől és a tompítóoldat tulajdonsámeghatározását írja elő, nagyon fontos, hogy megfelelő gaitól függ. Az elektroozmotikus sebesség (veo) az alábbi küszöbértéket és megfelelő körülményeket állítsunk be a egyenlettel írható le: csúcsterületek integrálásához. Az ilyen vizsgálatokban az v E V értékelési (elhanyagolási) határ, azaz pl. az a területhatár, ~ ~ ~ ~ ~ ~~ mely alatt a csúcsokat nem vesszük figyelembe, (a fő csúcs ~ ~ ~ eo eo ~ ~ területének százalékában megadva) rendszerint 0,05%. Az ~ ~ adatgyűjtő-rendszeren beállított küszöbérték (threshold ahol L ~ limit) ne legyen nagyobb, mint az értékelési (elhanyagolási) ~ = a tompítóoldat dielektromos állandója, a kapilláris határ fele. A főcsúcstól nem teljes mértékben elváló csúcsok = felületének zéta-potenciálja. területének integrálására leginkább a völgytől völgyig (valleyto-valley) extrapolálás (tangenciális simítás) alkalmazható. A meghatározandó anyag elektroforetikus és elektroNem vesszük figyelembe a minta feloldására használt ozmotikus mozgékonysága az oldott anyag töltésétől (pozioldószer(ek) csúcsát/csúcsait sem. tív vagy negatív) függően azonos irányú és ellentétes irányú is lehet, ezért az oldott anyag sebessége (v): v vep ~

2.2.47. KAPILLÁRIS ELEKTROFORÉZIS ÁLTALÁNOS ALAPELVEK A kapilláris elektroforézis fizikai vizsgálómódszer, amely elektrolitoldatban oldott töltött részecskék egyenáramú elektromos erőtér hatására bekövetkező, kapillárison belüli vándorlásán alapul. A vizsgált anyag vándorlási sebességét E erősségű elektromos erőtérben az anyag elektroforetikus mozgékonysága (mobilitása) és a tompítóoldat kapillárison belüli elektroozmotikus mozgékonysága szabja meg. Az oldott anyag elektroforetikus mozgékonysága (µep) az oldott anyag tulajdonságaitól (elektromos töltés, molekulaméret és alak) és a vándorlás közegéül szolgáló tompítóoldat tulajdonságaitól (az elektrolit típusa, az ionerősség, a pH, a viszkozitás és az adalékanyagok) függ. Az oldott anyag elektroforetikus sebessége (vep) – feltéve, hogy gömb alakú – az alábbi egyenlettel írható le: ~

v

E

___ q_ 6~

~

~ ep

76

ep ~

~

r~

~ ~ ~ ~ ~

V ~

~ ~

L

~

v

eo

Attól függően, hogy a sebességek iránya megegyező vagy ellentétes, a két mennyiség összegével vagy különbségével számolunk. Ha a körülmények olyanok, hogy az elektroozmotikus sebesség nagy az oldott anyagok elektroforetikus sebességéhez képest, negatív és pozitív töltésű részecskék egyidejűleg is elválaszthatók. Azt az időt (t), mely ahhoz szükséges, hogy az oldott anyag a kapillárisban az injektálás helyétől a detektálás helyéig (l, a kapilláris effektív hossza) vándoroljon, az alábbi egyenlettel adhatjuk meg: t

ll L v v ep ~

~ eo

~~

ep eo

~

V ~

Az elektroforézisben alkalmazott kvarckapillárisok többségének belső fala negatív töltésű, mely a katód felé irányuló elektroozmotikus áramlást hoz létre. Az oldott anyag vándorlási sebességének jó reprodukálhatóságához az elektroozmotikus áramlásnak analízisről analízisre állandónak kell lennie. Néhány alkalmazáshoz szükség lehet az elektroozmotikus áramlás csökkentésére vagy visszaszorítására. Ehhez vagy a kapilláris belső falát módosítják, vagy a tompítóoldat pH -ját változtatják meg. A minta kapillárisba juttatása után, a minta minden ionja a háttér elektrolitban, elektroforetikus mozgékonyságának megfelelően, különálló zónákban vándorol. A zónaszélesedés, azaz az oldott anyagok sávjainak kiszélesedése, több kü-


SZUPERKRITIKUS FLUID KROMATOGRÁFIA KROMATOGRÁFIÁS ELVÁLASZTÁSI TECHNIKÁK

Recommend Documents