Szuperkritikus fluid kromatográfia (SFC) Fekete Jenő, Bobály Balázs
Az elválasztástechnika korszerű módszerei
Az alapok hasonlítanak a folyadékkromatográfiához - Lineáris, elúciós kromatográfia, mozgófázis, állófázis, hatékonyság, nyomásesés, követelmények, készülékfelépítés, stb… - Lényeges különbség: mozgófázis szuperkritikus/szubkritikus állapotban van
- Eltérések az anyagátadásban (mozgó- és állófázis közt) - Eltérések a készülék felépítésben
SFC jelentősége, helye a kromatográfiás módszerek LC között GC
Előnyök: ‐hőérzékeny vegyületek mérése ‐ionos/nagy molekulatömegű vegyületek mérése Hátrányok: ‐Nincs általános, nagy érzékenységű detektor ‐Kisebb kinetikai hatékonyság ↓ LC‐egyéb
Előnyök: ‐univerzális, érzékenyen, gyors FID detektor ‐Nagy kinetikai hatékonyság Hátrányok: ‐hőérzékeny vegyületek mérése ‐ionos/nagy molekulatömegű vegyületek mérése ↓ GC‐FID
SFC ‐mozgófázis jellege: gáz és folyadék között ‐nagy hatékonyság ‐hőérzékeny anyagok vizsgálata: ‐nem csoda módszer: ld. később
„One of the most interesting features of ultra high pressure gas chromatography would be convergence with classical liquid chromatography” Giddings, 1965
Szuper/szubkritikus állapot
GÁZ
FOLYADÉ K
SZUPER‐ KRITIKUS
Szuper/szubkritikus állapot Paraméter
gáz
szuperkritikus fluid
folyadék
diffúziós koefficiens [cm2/sec]
10‐1
10‐4 ÷ 10‐3
10‐5
sűrűség [g/cm3]
10‐3
0,3 ÷ 0,8
1
viszkozitás [poise]
10‐4
10‐4 ÷ 10‐3
10‐2
Szuper állapot:
-Folyadékhoz hasonló sűrűség (jó oldóképesség) -Gázhoz hasonló viszkozitás (diffúzivitás, kis áramlási ellenállás) -Diffúzivitás: gáz-folyadék között (hatékony anyagátadás, C-tag kisebb)
Mozgófázis
Túlnyomó többségben CO2 a mozgófázis: ‐Kedvező kritikus értékek ‐Hozzáférhetőség ‐Ár és biztonság
Mozgófázis -CO2 (apoláris, hexánhoz hasonló, alacsony Tc/Pc, „nem mérgező”, olcsó ) + DKM, MeOH, MeCN, iPr-OH, THF (poláris módosítók), ált. 2-40% -Növelik a mozgófázis eluenserősségét -Változtatják a szelektivitást -Növelik a minta oldhatóságát + Savak: hangyasav, TFA (0,1%) Bázisok: NH4OH, alifás aminok, pl. dietil-amin (0,1%) Szabad savas szilanol csoportok „maszkírozása” de: pH-t nehéz definiálni
Állófázis -Polárisan módosított szilika, vagy szilika (NP-LC) -Apolárisan módosított szilika (RP-LC, NARP-LC) Királis állófázisok (pl. szénhidrát alapú)
Mintaoldószer -általában n-C7, poláris módosító lehet
Szubkritikus állapot
CO2-MeOH elegy kritikus pontjai
-
Dolgozhatunk a szubkritikus tartományban is, de az elválasztás során lehetőleg ne történjen állapotváltozás!
Vizsgálható vegyületek - Oldható a mozgófázisban
- kémiai átalakulás nélkül -a detektálás megszabta koncentrációnak megfelelően -Apoláris karakterű anyagok (aril, alkil, stb.), amelyek tartalmazhatnak poláris csoportokat (-OH, -COOH, -NH2, -CN, stb.) -Nem vizsgálható: ionos vegyületek és fehérjék Ezek kicsapódnak a mozgófázisból
Leginkább a NP-LC-hoz hasonlítható, alkalmazható annak kiváltására Miért jó ez? -NP-LC-ben erős, H-hidas kölcsönhatások dominálnak Lassú az anyagátadás Széles csúcsok, kis hatékonyság Modern SFC: UHPSFC -kis viszkozitású mozgófázis: gyors anyagátadás, kis nyomásesés -2µm alatti porózus, vagy héjszerű töltetek -Max ~400 bar -UHPLC hatékonyság, rövidebb mérési idő -Preparatív kromatográfiás előnyök-könnyű az anyag kinyerése a frakciókból!
Stokes‐Einstein:
2 nagyságrenddel kisebb a fluidum viszkozitása szuperkritikus állapotban! A C‐tag extrém kicsi lesz!
UHPLC 3.5 µm UHPSFC 3.5 µm UHPLC 1.7 µm UHPSFC 1.7 µm UHPSFC ‐közel azonos hatékonyság (UHPLC) ‐nagyságrendekkel kisebb nyomásesés ‐ hatékonyabb anyagátadás ‐többszörösével csökkent mérési idő ‐de a mozgófázis sűrűsége (oldóképessége) erősen nyomásfüggő. Nagyobb nyomás kisebb visszatartást jelent! Optimálás?
~4x
Visszatartás nyomásfüggése (1bar≈14.5psi)
Hatékonyság növekedése
35.0 30.0
L L N= = H h ⋅ dp
25.0
⎛ d p2 ⎞ ⎟ C = f⎜ ⎜D ⎟ ⎝ m⎠
HPLC
u opt =
vopt ⋅ Dm dp
SFC
H (µm)
20.0 15.0 10.0
UHPLC
UHPSFC
5.0 0.0 0.00
2.00
4.00
6.00 8.00 u (mm/s)
10.00
12.00
14.00
NP-LC vs UHPSFC Enantiomerek elválasztása (normál fázisú királis LC) r/s‐sotolon
28 min mérési idő
1.8 min mérési idő
RP-LC vs UHPSFC Szteroidok elválasztása UHPSFC UHPLC
Itt is érvényesek az UHPLC szabályai: ‐kis kolonnán kívüli térfogat (VEC~σEC) ‐kis gradiens késleltetési térfogat ‐kis mintatérfogat (mintaoldószer!) ‐kis kolonnák érzékenyebben reagálnak a kolonnán kívüli térfogatra és Vinj‐ra 2 σ col H r = 100 × 2 2 σ col + σ ext
UHPLC: 50*2.1 mm min!
UHPSFC: 100*3 mm min!
A kolonna elején elért B%, amennyiben eltérő késleltetési térfogatú (dwell volume) keverővel ellátott gradiens készülékkel dolgozunk. Nagy térfogatú késleltetési térfogattal NINCS UHPSFC
B% 100
tg
t [perc]
Gradiens késleltetés Kolonnán kívüli térfogat
Nagynyomású szivattyúk
Eluenstartály
Mintaadagoló Összekötő vezeték Kolonna
Keverő
Detektor Adatgyűjtés
Kolonna térfogat
SFC Gradiens késleltetési térfogat (VD) Gradiens késleltetési idő
UHPLC
2270 µL
90 µL
68 sec
15 sec
UHPSFC 440 µL 12 sec
(F = 2.0 mL/min)
(F = 0.36 mL/min)
(F = 2.4 mL/min)
Kolonnán kívüli térfogat (Vext)
118 µL
13 µL
60 µL
Alkalmazható kolonna dimenziók
150 x 4.6 mm
50 x 2.1 mm
100 x 3.0 mm
(volume ~ 1750 µL)
(volume ~ 120 µL)
(volume ~ 460 µl)
Kolonnán kívüli zónaszélesedés Kolonnán kívüli térfogat
Nagynyomású szivattyúk
Mintaadagoló Összekötő vezeték Kolonna
Detektor
Eluenstartály
Keverő
Adatgyűjtés
Kolonna térfogat
~ 85 µL2 2 2 2 σ col + σ ext = σ total
2 = σ col
(V × (1 + k )) V = 0 N col N col 2 r
2
σ
2 ext
= K inj
Vinj2
2 Vcell rc4 × lc × F 2 2 + K cell +τ F + 12 12 7.6 × Dm
Mintaadagoló
Detektor
Összekötő vezetékek
A készülék felépítése (UPC2)
különbségek egy UHPLC rendszerhez képest ‐Hűtött pumpafej a CO2 szállítására ‐Injektálás kiegészítő forgószelepen keresztül ‐Aktív előmelegítés (opcionális UHPLC‐ben) ‐Nyomásszabályozás az UV/DAD detektor után, CO2 kezelése
Hűtött pumpafej a CO2 szállítására
‐ A pumpa folyékony CO2‐ot szállít (merülőcsöves élelmiszeripari minőségű ($) CO2) ‐ a nyomás állandó értéke automatikus összenyomhatósági kompenzációval valósul meg ‐ a pumpa termosztált, így a nyomás és hőmérséklet jól kontrollált, a mozgófázis sűrűsége konstans és az áramlási sebesség állandó
Injektálás kiegészítő forgószelepen keresztül LC: ‐nincs fáziskülönbség a minta és a mozgófázis között ‐töltés alatt a mozgófázis nem jut a mintahurokba (nem diffundál bele) Minta betöltése (load) Injektálás (inject)
1
2
Minta betöltése (load)
Injektálás (inject)
SFC: ‐van fáziskülönbség a minta és a mozgófázis között ‐töltés alatt (néhány sec) a mozgófázis bediffundálhatna a mintahurokba (reprodukálhatóság csökkenése) ‐A segédszelep (1) töltés alatt atm. nyomáson tartja a 2‐es szelepet ‐Injektálás: először a 2‐es, majd az 1‐ es szelep fordul
Aktív előfűtés a szuper/szubkritikus állapot eléréséhez
Optikai detektor utáni nyomásszabályozás ‐ A detektorcellában nincs dekompresszió, így fázisátalakulás ‐ A nyomás állandó értéken tartható a mérés során, vagy fix háttérnyomás állítható be ‐ Fűtött modul: kompenzálja a dekompresszió során fellépő hőmérséklet csökkenést – megakadályozza a szilárd anyag kiválását
MS kapcsolás:
-”make up” oldószer adagolása az optikai cella után (vizes-szerves, ionizációt segítő puffer) -Hatékonyság romlás a CO2 dekompressziója miatt -5-10-szer jobb MS érzékenység UHPLC-hez viszonyítva (könnyebb deszolvatáció)
UHPSFC előnyök ‐ Zöldebb: a CO2 a levegőből kinyerhető oda is jut vissza (a hexán nem) ‐ Nem igényel nagy eluensmennyiséget: ~1 palack CO2 /hónap (kb. 20e Ft) ‐ Gyors mérési módszer ‐ Nagyon hatékony királis elválasztásokban (1/10 mérési idő vs. NP‐LC) ‐ Nagyon hatékony preparatív feladatokban (egyszerű izolálás: dekompresszió, esetleg minimális bepárlás)
UHPSFC hátrányok ‐ Zöldebb: a CO2 a levegőből kinyerhető oda is jut vissza biztonsági kockázat ‐ Nem igényel nagy eluensmennyiséget: ~1 palack CO2 /hónap (kb. 20e Ft) + szerves osz. ‐ Gyors mérési módszer, UHPLC is tudja ‐ Műszer bekerülési költsége relatíve magas (UHPSFC: ~30M, UHPLC: ~20M) ‐ Új paraméterek a módszerfejlesztésben (P) ‐ Kevesebb tapasztalat
Jövő: akceptálja‐e a technológiát a gyógyszeripar? ‐UHPSFC inkább normál fázis kiváltására célszerű, az LC mérések 80‐ 90% pedig RP… ‐Királis elválasztásokban nagyon nagy hatékonyság és sebbesség Igen: $ fejlesztésre, tapasztalat, rutin technika Nem: nincs fejlesztés, „kutató készülék”
