Oligonukleotid kimérák szintézise, termikus és enzimatikus stabilitása
Ph.D. értekezés
Készítette: Bajor Zoltán
Témavezető: Prof. Dr. Ötvös László
Magyar Tudományos Akadémia Kémiai Kutatóközpont Kémiai Intézet 2004
Tartalomjegyzék 1. Bevezetés .............................................................................................................2 2. Irodalmi áttekintés................................................................................................3 2.1.
Antiszenz oligonukleotidok (AON-ek) .................................................3
2.2.
Oligonukleotid „prodrugok” .................................................................7
2.3.
Peptid nukleinsavak (PNS-ek) és PNS-DNS kimérák ..........................8
3. Saját eredmények ...............................................................................................11 3.1.
P-tio-P-oxo (PS-PO) oligonukleotid kimérák mint potenciális „prodrugok” ......................................................................11
3.1.1.
AZT és 5-fluor-2’-dezoxiuridin (FdU) tartalmú PS-PO trinukleotidok szintézise és enzimatikus stabilitása ................11
3.1.2.
5’-PS-AON-PO-(FdU)n-3’ kimérák szintézise és tumorgátló hatása..16
3.2.
PNS-DNS kimérák szintézise, termikus és enzimatikus stabilitása....18
3.2.1.
PNS-DNS dimer szintonok előállítása és beépítése T20-, T12- ill. (TdA)10- analóg kimérákba .................................................................18
3.2.2.
A szintetizált kimérák duplexeinek termikus stabilitása .....................23
3.2.3.
T20- és T12- analóg kimérák enzimatikus stabilitása ...........................27
3.2.3.1. A 3’-végen módosított analogonok hidrolízise kígyóméreg-foszfodiészterázzal..........................................................27 3.2.3.2. Az 5’-végen módosított származékok hidrolízise borjúlép-foszfodiészterázzal ...............................................................29 4. Kísérleti rész.......................................................................................................31 5. Összefoglalás .....................................................................................................32 6. Rövidítések.........................................................................................................34 7. Köszönetnyilvánítás ...........................................................................................35 8. Irodalomjegyzék.................................................................................................36 9. Függelék (I.-VI.) ................................................................................................41
1
1. Bevezetés Az antiszenz oligonukleotidok (AON-ek) kutatásának területén az utóbbi években egyre nagyobb jelentőségre tesznek szert az oligonukleotid kimérák. Az oligonukleotid kimérák részlegesen módosított gerincű oligonukleotid származékok, amelyek cukor-foszfát gerincének egy részét más típusú gerinc helyettesíti. A kimérák mind a természetes, mind pedig a teljesen módosított gerincű oligonukleotidoknál
előnyösebb
biofizikai
és
biokémiai
tulajdonságokkal
rendelkeznek, így antiszenz kemoterapeutikumként való felhasználásuk kecsegtető jövőt ígér. Dolgozatom egyrészt tiofoszfodiészter-foszfodiészter gerincű (PS-PO) trimer és nagyobb tagszámú oligodezoxinukleotid (ODNS) kimérák, másrészt peptid nukleinsav
(PNS)-foszfodiészter
gerincű
ODNS
kimérák
szintézisével
és
tulajdonságaik vizsgálatával foglalkozik. A klinikai vizsgálatok különböző fázisaiban lévő legtöbb AON, vagy homogén tiofoszfodiészter internukleozid kötésű (PS) származék vagy tiofoszfátnormálfoszfát (PS-PO) kiméra, amelyek elsősorban potenciális antivirális vagy tumorellenes szerek. Erre alapozva célul tűztük ki egy tiofoszfodiészter gerincű (PS) AON és 3’-terminálisához foszfodiészter kötéssel (PO) kapcsolt, növekvő számú 5fluor-2’-dezoxiuridin (FdU) egységeket tartalmazó, kiméráinak szintézisét valamint sejtproliferációra kifejtett hatásuk tanulmányozását. Az említett kimérák a tumorsejtben várhatóan kettős hatással rendelkeznek mivel az 5’-terminális tiofoszfát szekvencia antiszenz módon hat, a nukleázok hatására felszabaduló fluordezoxiuridin-5’-monofoszfát (FdUMP) pedig hagyományos módon, enzim (timidilát szintáz) inhibíció útján fejti ki hatását. Különböző 3’-láncvégi egységek (timidin, FdU és 3’-azido-3’-dezoxitimidin) 3’-exonukleáz stabilitásának vizsgálatára P1-tioP2-oxo trinukleotidokkal előzetes enzimatikus hidrolízis vizsgálatokat végeztünk. A PNS-DNS kimérák várhatóan egyesítik magukban a PNS és DNS előnyös tulajdonságait. A PNS gerinc nagyon stabil duplexeket képez oligonukleotidokkal, másrészt mind a proteázokkal mind a nukleázokkal szemben teljesen rezisztens. A DNS szakaszok biztosítják a kizárólag antiparalell duplexek kialakulását, a jobb vízoldékonyságot és sejtbejutási készséget valamint az RNáz H indukciót. Munkánk során olyan PNS-DNS kimérák szintézisét és tulajdonságaik vizsgálatát tűztük ki
2
célul, amelyekbe a PNS egységek beépítése standard szilárd fázisú DNS szintézis protokoll alkalmazásával is megvalósítható. E célból oldatban dimer szintonokat állítottunk elő, amelyek 5’-terminálisát PNS, 3’-terminálisát DNS monomer alkotta. A PNS bázis timin, 5-propinil-uracil vagy 5-(1-hexin-1-il)-uracil, míg a DNS bázis timin
volt.
A
bázisban
helyettesített
származékok
vizsgálatát
oligodezoxinukleotidokon szerzett korábbi tapasztalatok indokolták, miszerint a pirimidin bázisok 5-alkinil helyettesítése, a szomszédos bázisok közötti vertikális kölcsönhatás, az ún. tapadás (stacking) erősödése következtében növeli a duplexstabilitást [1]. Az említett homo-timidin analóg blokkokon kívül olyan dimer szintont is készítettünk, amelyben a PNS bázis timin, míg a DNS bázis adenin volt. E szintonok felhasználásával az önduplexképző PNS-DNS kimérák abszolút és relatív termikus stabilitását kívántuk tanulmányozni.
2. Irodalmi áttekintés 2.1. Antiszenz oligonukleotidok (AON-ek) A különböző kórokozók génexpresszióját a transzláció stádiumában gátló AON-ek 1978-as felfedezésüket [2] követően igen hamar az érdeklődés középpontjába kerültek és egyre nagyobb gyakorlati jelentőséggel rendelkeznek elsősorban a vírusellenes szerek és a rákkemoterápia területén. Hatásmechanizmusukban alapvető különbség van a hagyományos gyógyszerek és az AON-ek között. A napjainkban alkalmazott gyógyszerek jelentős része specifikusan közvetlenül a fehérjéhez kötődve befolyásolja annak működését. Az antiszenz oligonukleotidok ezzel szemben a fehérjét kódoló mRNS-sel hibridizálva a transzlációt gátolják (lásd 1. ábra). Jelenleg világszerte ~40 AON molekula van a klinikai próbák különböző stádiumában [3]. Az első antiszenz gyógyszert, a HIV fertőzöttek körében gyakori HCMV-retinitis kezelésére kifejlesztett, 21-mer tiofoszfátot a Fomivirsent 1998-ban törzskönyvezték az USA-ban [4]. Az ideális AON-el szemben támasztott követelmények a következők: 1. Stabil duplex képzése a cél mRNS szakasszal. 2. Rezisztencia a különböző nukleázokkal szemben. 3. Megfelelő penetrációs készség. 4. Lehetőleg indukáljon ribonukleáz H (RNáz H) aktivitást. 3
5. A hatásos koncentrációban ne legyen toxikus. 6. Reális áron előállítható legyen standard DNS szintézis protokoll alkalmazásával [5]. mRNS
Fehérje
mRNS
Fehérje
DNS
DNS Transzkripció
Transzkripció
Transzláció
Transzláció
Antiszenz oligonukleotid
Fehérjeszintézis
A fehérjeszintézis antiszenz gátlása
1. ábra Az antiszenz oligonukleotidok hatásmechanizmusa Az RNáz H az antiszenz hatás elérésében jelentős szerepet játszó, az mRNS:DNS hibridek RNS szálát hidrolizáló enzim. Az mRNS ezáltal használhatatlanná válik és az AON a duplexből felszabadulva egy további mRNS molekulával képes hibridizálni. A foszfodiészter kötéseket tartalmazó oligonukleotidok in vivo a nukleázok hatására gyorsan elbomlanak, így terápiás célra nem alkalmazhatók, ezért az enzimatikus stabilitás növelése érdekében sokféle módosított származékot állítottak elő. Számos módosítás, amely nukleázokkal szemben rezisztenssé teszi az AON-t, az RNáz H működését is gátolja. Mivel a nukleázok támadáspontja a foszfodiészter internukleozid kötés ezért először ezen a molekularészen próbáltak ki néhány módosítást így pl. a tiofoszfát [6], ditiofoszfát [7], foszforamidát [8], metilfoszfonát [9], és foszfotriészter [10] gerincmódosításokat. Ezek közül gyakorlati szempontból a tiofoszfátok a legjelentősebbek [11, 12]. Előnyös tulajdonságaik: jelentős enzimatikus stabilitás, RNáz H aktíváló képesség, gazdaságos előállítás szilárd fázisú szintézissel és alacsony toxicitás. Kedvezőtlen tulajdonságaik: a csökkent duplex stabilitás (∆Tm/módosítás = -0.8 °C), és nem specifikus kötődésük fehérjékhez. Előnyös tulajdonságaiknak köszönhetően a legtöbb antiszenz oligonukleotid, amely a klinikai vizsgálatok különböző szakaszaiban van, vagy homogén tiofoszfodiészter kötésű származék vagy foszfodiészter-tiofoszfodiészter kiméra. Az említett gerincmódosított
származékokon
kívül
számos
szénhidrát
részen
módosított
4
oligonukleotidot is előállítottak, így például a természetes β-anomereket αanomerekkel helyettesítve az enzimatikus stabilitás növekedését tapasztalták kígyóméreg és borjúlép foszfodiészterázzal szemben [13]. Az ún. második generációs AON-ek 2’-O-alkil-ribóz egységeket tartalmaznak [14]. Az alkillánc hosszának növelésével nő a nukleáz rezisztencia viszont csökken a duplex termikus stabilitása. A 2’-OMe-ribóz beépítése ~ +2 °C/módosítás mértékben növeli az AON:RNS duplexek Tm pontját, viszont a szükséges nukleáz rezisztencia biztosításához PS internukleozid kötéssel kell kombinálni. Ugyanakkor a 2’-O-(2metoxietil)-ribóz helyettesítés önmagában is képes a PS oligókkal azonos mértékű rezisztenciát biztosítani a kb. ugyanilyen Tm növelő hatás megtartása mellett. A 2’O-(3-aminopropil)-ribóz módosítás beépítésével a nukleáz rezisztencia ~6-8szorosára nő a PS oligókhoz viszonyítva miközben még mérsékelt duplexstabilizáló hatás (∆Tm/módosítás = +1 °C) is mutatkozik. Az említett 2’-O-alkil-ribo-AON:RNS duplexek RNS szálát az RNáz H nem hasítja ezért ezen egységeket általában csak a szekvencia végeire építik be középen egy RNáz H indukáló PS ablakot hagyva. Az így kapott kimérák, az ún. gapmerek, fejlesztése jelenleg az antiszenz technológia egyik legigéretesebb irányvonala [15]. Molekula modellezési számítások vezettek az LNA (locked nucleic acid; 2’-O, 4’-C-metilén-ribonukleotid) előállításához [16]. Ez a módosítás C2’-exo-C3’-endo konformációban rögzíti a furanóz gyűrűt [17]. Az LNA monomerek, más módosításoktól eltérően, a lánc tetszőleges helyére, tetszőleges számban beépíthetők és az így kapott kimérák nagyon stabil duplexeket képeznek DNS-el és RNS-el (∆Tm/módosítás = +5- +8 °C). Az LNA rezisztens a nukleázokkal szemben, nem toxikus, jó a vízoldhatósága, azonban csak gyenge RNáz H indukciót vált ki és az LNA monomerek szintézise soklépéses, alacsony hozamú [18]. Az említett tulajdonságok tanulmányozása céljából számos bázis módosított származékot is előállítottak [19, 20]. A pirimidin nukleozidokban a bázis 5-ös helyzetű szénatomja több szempontból is alkalmas a szubsztitúcióra. Az ebbe a helyzetbe beépített csoport a nagy árokban helyezkedik el és a kialakuló elektrosztatikus, polarizációs valamint hidrofób kölcsönhatások stabilizálhatják, vagy destabilizálhatják a duplex szerkezetét. A megfelelő szubsztituens kiválasztásakor fontos szempont, hogy ne gátolja a bázispárok kialakulását, ne fejtsen ki sztérikus gátlást vagyis a duplex szerkezetet ne befolyásolja kedvezőtlenül. A pirimidin
5
bázisok 5-propinil szubsztituciója a hármas kötések között kialakuló stacking kölcsönhatás révén jelentősen (+1.0 - +1.5 ºC ∆Tm/módosítás mértékben) javítja a duplexstabilitást [1, 21]. Ilyen szempontból a propinil csoport előnyösebb a hosszabb alkinil szubsztituenseknél, a 8-aza-7-deazapurinok 7-helyzetébe beépítve pedig még nagyobb duplexstabilizáló hatást eredményez mint a pirimidin bázisok 5-helyzetében [22], azonban az elöbbiek szintézise soklépéses és bonyolult. Egy 5-propinilpirimidin nukleotidokból álló heptanukleotid esetében a propinil csoportok között mind a hét bázisra kiterjedő stacking kölcsönhatást [23] és jó bázishiba (mismatch) felismerést [24] figyeltek meg. Foszforotioát antiszenz oligonukleotidokba timidin helyett 5-(1-propinil)-dU és 5-(1-hexin-1-il)-dU egységeket beépítve jelentősen jobb antivirális [25] és tumorellenes [26] hatás érhető el in vitro. Az 5-propinilpirimidinbázisok beépítése bár kis mértékben de a nukleáz rezisztenciát is növeli és az RNáz H indukáló képességet sem csökkenti. Humán szérumban a (dA-dU5propinil
)10 10-szer stabilabb mint a (dA-T)10 analogon [27]. A heteroaromás
szubsztituensek, amelyek a pirimidin gyűrűvel egy síkban helyezkednek el ugyancsak képesek növelni az egy láncon belüli szomszédos bázisok közötti stacking kölcsönhatást. Az uracil 5-(2-tiazolil) szubsztituciója a propinil csoporthoz hasonló mértékű duplexstabilitást eredményez [28]. Az 5-(5-metiltiazol-2-il) szubsztitució tovább növeli ezt a hatást, aminek a metil csoport hidrofób kölcsönhatása az oka [29]. Az előnyös bázismódosítások közül említést érdemel még a citozin helyettesítése fenoxazinnal [30], karbazollal [31] és fenotiazinnal [32]. Ezek a triciklusos pirimidin származékok szelektíven csak a guaninnal képeznek bázispárt. A fenoxazin és fenotiazin esetében egy módosított nukleozid különálló beépítése +2 ºC ∆Tm/módosítás, míg blokkban való beépítése +5 ºC ∆Tm/módosítás mértékű duplexstabilitás növekedést eredményez az 5-metil-2’-dezoxicitidinhez képest [32]. A termikus stabilitás tovább javítható a clamp technika alkalmazásával, oly módon, hogy a nukleobázisok szubsztituensei a nagy vagy kis árkon átnyúlva a komplementer nukleozid megfelelő csoportjával hidrogén híd kötést alakítanak ki [33]. A guanin bázis három Watson-Crick hidrogén híd kötést alakít ki a citozinnal, azonban rendelkezik még két elekron pár donorral az O6 és N7 atomokon így a fenoxazin G-clamp szubsztituensének ammonium csoportja és a O6 atom között egy további hidrogén híd kötés alakul ki, ami ugyancsak növeli a duplexstabilitást [34].
6
2.2 Oligonukleotid „prodrugok” A „prodrugok” olyan vegyületek, amelyek maguk farmakológiai hatással nem rendelkeznek és nem toxikusak, de in vivo körülmények között felszabadul belőlük a hatóanyag. Az oligonukleotid „prodrugok” egyik típusa az, amikor az oligonukleotidot felépítő monomer molekula az aktív hatóanyag, amely az oligomer enzimes hidrolízisének eredményeképpen szabadul fel a szervezetben. Ilyen „prodrug” például az 5-fluor-2’-dezoxiuridilát dekamer, (FdU)10, melyből a sejtben 3’exonukleázok hatására válik szabaddá a tumorellenes hatású 5-fluor-2’-dezoxiuridin 5’-monofoszfát (FdUMP). Maga az FdUMP tumorellenes gyógyszerként nem alkalmazható, mert a kisméretű, töltéssel rendelkező molekulák rosszul hatolnak át a sejtmembránon. Oligomer formában azonban az anyag sejtfelvétele jelentősen megnövekszik [35]. Az FdUMP tumorgátló hatását a timidilát szintáz enzim inhibícióján keresztül fejti ki. A timidilát szintáz a DNS de novo szintézisében fontos szerepet játszó dUMP→TMP átalakulást katalizáló enzim [36]. Az említett oligomer még a sejtmembránon áthatolni képes neutrális nukleozidnál az FdU-nál is jobb tumorellenes hatású. Például HT-29 sejtvonalon az (FdU)10 egy FdU egységre nézve 25-ször hatékonyabban gátolja a sejtproliferációt, mint az FdU [37]. Az FdU-t a szervezetben a timidin kináz alakítja át a hatékony FdUMP-vé, ezért timidin kináz hiányos sejtvonalon az kevésbé hatékony. Az oligonukleotid „prodrugok” másik típusa az oligonukleotid egyik terminálisához köti a farmakológiai hatással rendelkező molekulát. Ilyen „prodrugok”
például
az
interferon
stimuláló
2’-5’
diadenilsav
2’-foszfát
terminálisához észter kötéssel kapcsolt citosztatikus vagy antivirális hatású nukleozid analogonok. Feltételezték, hogy a példaként említett „prodrugok” biodegradációja a hatékony nukleozid 5’-monofoszfátot eredményezi [38]. Az AON „prodrugok” egyik típusa olyan oligodezoxinukleotid, amelynek valamelyik végéhez kovalens kötéssel valamilyen sejt penetrációt elősegítő hidrofób csoport, például polialkil, vagy koleszteril csoport, kapcsolódik [39]. A molekula sejtbe jutása után a hidrofób csoport lehasad s felszabadul a hatékony AON, amelynek felszabadulását elősegíti ha a lipofil csoport valamilyen biodegradábilis, például tetratimidilát, linkeren keresztül kapcsolódik hozzá [40].
7
Az AON „prodrugok” másik típusa olyan oligodezoxinukleotid, melynek egyik végéhez kémiai kötéssel hagyományos gyógyszermolekula kapcsolódik, azaz a „prodrug” mindkét része külön-külön terápiás hatással rendelkezik. Az AON rész az antiszenz elven, a hagyományos gyógyszermolekula közvetlenül a fehérjére hatva fejti ki hatását [41]. Természetesen szükséges, hogy a sejtben az antiszenz és a hagyományos gyógyszer közötti kötés elhasadjon. Az antiszenz „prodrugok” e típusának egy igen szellemesen továbbfejlesztett változata az AON-t két részre bontja. Az egyik antiszenz darabhoz csatlakozik a klasszikus gyógyszer molekula, míg a másikhoz egy katalizátor, mely elősegíti az AON és a gyógyszer molekula közötti kötés hasadását. A két AON rész hibridizációja az mRNS molekulával megfelelő közelségbe juttatja a gyógyszert és a katalizátort, majd a katalizátor kifejti hatását, amelynek eredményeképpen a gyógyszermolekula felszabadul. Az AON részeket úgy kell megtervezni, hogy a katalizátort kapcsoló rész erősen kötődjék a mRNS-hez, míg a gyógyszermolekulát tartalmazó rész kötődése gyengébb, reverzibilis legyen [42, 43].
2.3 Peptid nukleinsavak (PNS-ek) és PNS-DNS kimérák Az elsőként Nielsen és munkatársai által szintetizált peptid-nukleinsavak a természetes nukleinsavak cukor-foszfát gerince helyett N-(2-aminoetil)-glicin vázat tartalmaznak [44, 45]. A Watson-Crick bázispárok kialakításához nélkülözhetetlen természetes nukleobázisok egy metilénkarbonil linkeren keresztül kapcsolódnak a glicin nitrogénatomjához (2. ábra). A PNS:DNS és különösen a PNS:RNS duplexek stabilabbak mint a megfelelő DNS:DNS ill. DNS:RNS hasonmások [46]. A duplexstabilitás egyik oka, hogy a PNS nem tartalmaz negatív töltést. Ennek hiányában nem lép fel elektroszatikus taszítás a természetes nukleinsav lánc és a PNS gerinc között. A duplexstabilitás másik oka az amid csoport és a metilénkarbonil linker karbonil csoportja között kialakuló intramolekuláris hidrogén híd, amely kedvező helyzetben stabilizálja a PNS szerkezetét. A PNS gerinc kevésbé rugalmas mint a természetes cukorfoszfát gerinc [47] ezért a PNS:DNS ill. PNS:RNS duplexekben a nem komplementer bázispárok jobban destabilizálják a duplex szerkezetet mint a DNS:DNS vagy DNS:RNS hibridekben [48]. A PNS lánc
8
peptidkötései mind a proteázokkal mind a nukleázokkal szemben teljesen rezisztensek. B
B
O
-O
B
-O
O
O P
HO
O
O P
O
O
O
OH
O
DNS
B
B
B O
O O
O
N H2N
O O
N N H
N N H
OH
PNS 2. ábra A DNS és PNS oligomerek szerkezete Az említett előnyös tulajdonságok mellett a PNS oligomerek több, biológiai szempontból kedvezőtlen tulajdonsággal is rendelkeznek, így például kevésbé stabil paralell duplexeket is képeznek [49, 50], rosszul oldódnak vízben, könnyen képeznek aggregátumokat [49], csak kismértékben jutnak be a sejtbe [51, 52] és nem indukálnak RNáz H aktivitást [53]. Az említett hátrányos tulajdonságok részben kiküszöbölhetők PNS-DNS kimérák [49,54] alkalmazásával, amelyekben a DNS szakaszok beépítése biztosítja a kizárólag antiparalell duplexek kialakulását, ezenfelül jobb vízoldékonyságot és sejtbejutási készséget, továbbá RNáz H indukciót is biztosít. A foszfát ionok jelenléte miatt jelentős mértékben csökken az aggregátumok kialakulásának lehetősége is. Az egymástól elkülönülő homogén PNS és DNS blokkokat tartalmazó kimérák DNS duplexeinek termikus stabilitása jelentős mértékben függ a kiméra PNS/DNS
9
arányától [49, 50]. A PNS egységek arányának növelése növeli a kiméra:DNS duplex Tm pontját az azonos szekvenciáju DNS:DNS duplexéhez képest. A termikus stabilitás növekedése még jelentősebb kiméra:RNS duplexek esetén. A PNS egységek arányán kívül a duplexstabilitás a PNS egységeknek a kimérában elfoglalt helyzetétől is függ [55, 56]. A pszeudo-5’-PNS-DNS-3’ kiméra:DNS duplexek esetén a PNS-DNS kimérában a két blokkot összekapcsoló a PNS karboxi-csoportja és a terminális módosított nukleotid 5’-amino csoportja közötti merev savamid kötés csökkenti a duplexstabilitást. Ennek megfelelően már egy PNS egység DNS láncba építése is Tm pont csökkenést okoz, ami különösen jelentős ha a PNS egységet a lánc közepén helyezzük el [57, 58]. Ugyanakkor ennek 3’-vagy 5’- láncvégi helyzetű beépítése esetén csak kis mértékű Tm pont csökkenés figyelhető meg [58]. A PNSDNS kimérák enzimatikus stabilitását csak szérumban vizsgálták meg. Az e célból szintetizált modell kiméra két PNS egységet tartalmazott az 5’- és a 3’- végen, ami humán szérumban 25-ször stabilabb volt mint az azonos szekvenciáju pszeudo-5’PNS-DNS-3’ kiméra ill. a homogén DNS analogon [57]. Ugyanakkor az 5‘-DNSPNS-pszeudo-3’ kimérák 50-szer stabilabbak voltak borjú szérumban mint a referencia DNS hasonmások [59]. Az 5’- ill. 3’-végen lévő PNS blokkokat tartalmazó kimérák jelentősen eltérő enzimatikus stabilitásának valószínű oka, hogy in vivo főleg a 3’-exonukleázok felelősek a nukleinsavak lebontásáért, ugyanakkor nem
állnak
rendelkezésre
adatok
kimérák
izolált
enzimekkel
szembeni
rezisztenciájáról. A PNS sejtbejutása és a vízoldhatósága szintén javul DNS blokkok beépítésével. Az ilyen kimérák az azonos szekvenciájú DNS oligonukleotidokkal hasonló mennyiségben és sebességgel jutnak be a sejtekbe [49]. A PNS sejtbejutásának javítása jól penetráló ún. trójai peptidekkel alkotott konjugátumok alkalmazásával is megvalósítható [60], amelyek jelentősen növelik az antiszenz PNS-ek in vitro [61] és in vivo [62] aktivitását.
10
3. Saját eredmények 3.1 P-tio-P-oxo (PS-PO) oligonukleotid kimérák mint potenciális „prodrugok” Annak tanulmányozására, hogy együtt alkalmazva egy AON-t egy tumorellenes hatású nukleoziddal jobb hatás érhető-e el, ha a két molekula egymáshoz nukleázok által hasítható kötéssel kapcsolódik PS-PO trimer és nagyobb tagszámú oligomer kimérákat szintetizáltunk és vizsgáltunk meg. A trimer PS-PO kimérákban a 3’láncvégi helyzetbe foszfodiészter kötéssel T, FdU vagy AZT nukleozidot kapcsoltunk.
Ezek
az
anyagok
enzimes
hidrolízis
vizsgálatokban
modell
vegyületekként szolgáltak. A nagyobb tagszámú oligomer PS-PO kimérákban egy tiofoszfodiészter kötésű oktadekamer AON 3’-terminálisához foszfodiészter kötéssel különböző számu FdU egységet kapcsoltunk. Ezeknek az anyagoknak tumorgátló hatását vizsgáltuk.
3.1.1. AZT és 5-fluor-2’-dezoxiuridin (FdU) tartalmú PS-PO trinukleotidok szintézise és enzimatikus stabilitása A 3’-végen AZT-t tartalmazó trinukleotidok hidrogén foszfonát módszerrel szilárd fázison csak 5’→3’ irányban szintetizálhatók [41], azonban oldatfázisban 3’→5’ irányban egyszerűbben és olcsóbban megvalósítható rövid oligomerek szintézise. Az 5’-O-(4,4’-dimetoxitritil)-N-acil-2’-dezoxinukleozid-3’-H-foszfonátokat az irodalomban leírt módon [63] állítottuk elő. Az 5’-védett 3’-szabad OH-t tartalmazó nukleozidokat
tris(1,2,4-triazolil)-foszfinnal
reagáltattuk,
majd
hidrolízis
és
szilikagél kromatográfiás tisztítás után jó termeléssel kaptuk a megfelelő 3’-Hfoszfonátokat (1, 2). A 3. ábrán látható módon a védett 2’-dezoxicitidin-3’-Hfoszfonátot (1) AZT-vel (3) ill. 3’-O-acetiltimidinnel (4) (TAc), a védett 2’dezoxiadenozin-3’-H-foszfonátot (2) pedig TAc-vel (4) kapcsoltuk pivaloil klorid mint aktíválószer jelelenlétében. A kapott H-foszfonát diészterek vizes jódoldatos oxidációja majd az 5’-DMT védőcsoportok savas metanolízise végül a szilikagél kromatográfiás tisztítások után a kívánt 5’-szabad dimereket (5, 6, 7) kaptuk.
11
HO DMTO
B2 O
B2 O
HO
Timin O
+
O O P H
a
b
O
c
O P OTimin
O
R
O
OR 1. B2 = N4-benzoil-citozin-1-il 2. B2 = N6-benzoil-adenin-9-il
5
a
5. B2 = N4-Benzoil-citozin-1-il, R = N3 6. B2 = N4-Benzoil-citozin-1-il, R = OAc 7. B2 = N6-Benzoil-adenin-9-il, R = N3
3. R = N3 4. R = OAc
d
c
e
N2-i.Bu-5'-DMT-dG-3'-H-foszfonát
HO
B1 O O
O P S6
a
d
c
e
O
B2 O
N2-i.Bu-5'-DMT-dG-3'-H-foszfonát O O P O-
7
a
d
c
Timin
O
e
O
5'-DMT-T-3'-H-foszfonát R a., Pivaloil klorid / piridin, 15 perc b., I2 / THF-piridin-H2O, N-Me-imidazol, 2 óra c., p-TsOH / MeOH-CHCl3, 20 perc d., S8 / piridin-CS2, 18 óra e., cc. NH4OH, 36 óra a.-e., 200C
8, 9 B1: guanin-9-il B2: citozin-1-il R : N3 (8), OH (9)
10 timin-1-il adenin-9-il N3
3. ábra GPSCPOAZT, GPSCPOT, TPSAPOAZT trimer kimérák (8, 9, 10) oldatfázisú szintézise
12
A CPOAZT (5) ill. CPOTAc (6) dimereket az előző kapcsolási lépéssel azonos körülmények között N2-i.Bu-5’-DMT-dG-3’-H-foszfonáttal, a dAPOAZT (7) dimert pedig 5’-DMT-T-3’-H-foszfonáttal reagáltattunk. A kapott H-foszfonát diészterek elemi kénnel történő tiooxidációját [64], majd az 5’-DMT védőcsoport savas metanolízisét, végül a nukleobázisok N-acil védőcsoportjainak ammonolízisét követően kaptuk a trimer nyerstermékeket (8, 9, 10), amelyeket ioncserés oszlopkromatográfiával DEAE-Sephadex A-25 tölteten tisztítottunk meg. A 3’-OH csoportot tartalmazó nukleozidok szilárd hordozóhoz köthetők, ezáltal standard foszforamidit [65] DNS szintézis protokoll alkalmazásával beépíthetők az oligomerek 3’-láncvégi helyzetébe (4. ábra). Az 5’-O-(4,4’dimetoxitritil)-5-fluor-2’-dezoxiuridin (11) szabad 3’-OH csoportját szukcinileztük majd a kapott szukcinátot (12) vízmentes diklórmetánban 2-etoxi-1-etoxikarbonil1,2-dihidrokinolin (EEDQ), mint kondenzálószer jelenlétében amidkötéssel a szilárd hordozóhoz (LCAA-CPG) kötöttük. A kapott immobilizált FdU és T monomerek 5’DMT-védőcsoportjának diklórecetsavas lehasítását követően, a szabad 5’-OH csoportot tetrazol katalizátor jelenlétében reagáltattuk a megfelelő védett nukleozid3’-foszforamiditekkel. A kapott dimer foszfit triésztereket vizes jódoldattal foszfát triészterekké (13, 14, 15) oxidáltuk. A következő kapcsolási lépést az előzővel azonos körülmények között hajtottuk végre, az ezt követő tiooxidációt pedig tetraetiltiurám diszulfiddal (TETD) végeztük [66]. A kapott PS-PO trimerek (16, 17, 18) bázis és foszfát védőcsoportjainak eltávolítását valamint a hordozóról történő lehasítást egy lépésben koncentrált ammónia oldattal hajtottuk végre. A végtermék kimérákat (19, 20, 21) RP-HPLC-vel tisztítottuk. Megvizsgáltuk, hogy a foszfodiészter kötéssel kapcsolt timidin analogonok (FdU, AZT) 3’-láncvégi beépítése hogyan befolyásolja a módosított trinukleotidok enzimatikus stabilitását 3’-exonukleázzal (kígyóméreg foszfodiészteráz) szemben a timidint tartalmazó referencia trimerekhez (9, 21) képest. A 3’-végen AZT, FdU vagy T nukleozidot tartalmazó, modell PS-PO trinukleotidok (GPSCPOX és TPSAPOX, ahol X= AZT (8, 10), FdU (19, 20) vagy T (9, 21)) hidrolízis félidő (t1/2) értékeit az 1. táblázatban foglaltuk össze. A kígyóméreg enzim az alkalmazott körülmények között valamennyi trinukleotidot szelektíven a normál foszfodiészter kötésnél hasította. Az enzimatikus hidrolízis termékei 5’-monofoszfátok (AZTMP, FdUMP, TMP) és tiofoszfát dimerek (GPSC vagy TPSA) voltak.
13
O
O F
HN N
O
F
HN O
DMTO O
N
DMTO
a
O O
OH
O
OH O 12
11
5'-DMT-Nu 2
Su
e
Nu1-3'-OSu-NH
d
c
b
5'-DMT-FdU-3'-OSu-NH-LCAA-CPG 5'-DMT-T-3'-OSu-NH
P O 13. Nu 2 = BzdC, Nu1 = FdU 14. Nu 2 = BzdA, Nu1 = FdU 15. Nu 2 = BzdA, Nu1 = T c d f 5'-DMT-Nu 3
Nu 2 Nu1-3'-OSu-NH P S P O
c
16. Nu 3 = i.BudG, Nu 2 = BzdC, Nu1 = FdU 17. Nu 3 = T, Nu 2 = BzdA, Nu1 = FdU 18. Nu 3 = T, Nu 2 = BzdA, Nu1 = T
g 5'-OH-Nu 3 P S
Nu 2 Nu1-3'-OH P O
19. Nu 3 = dG, Nu 2 = dC, Nu1 = FdU 20. Nu 3 = T, Nu 2 = dA, Nu1 = FdU 21. Nu 3 = T, Nu 2 = dA, Nu1 = T
a., Borostyánkõsav anhidrid, TEA, DMAP, CH2Cl2, 16 óra b., i. EEDQ, LCAA-CPG, CH 2Cl2, 48 óra, ii. Ac 2O, N-Me-imidazol, THF, 3 óra c., Cl2CHCOOH, CH 2Cl2 d., 5'-DMT-Nu-3'-CED, tetrazol, MeCN e., 0.05M I 2 / THF- piridin -víz f., 0.5 M TETD / MeCN g., 33% aq. NH3 a.-g., 200C
4. ábra GPSCPOFdU, TPSAPOFdU, TPSAPOT trimer kimérák (19, 20, 21) szilárdfázisú szintézise
14
A táblázat adataiból látható, hogy mindkét sorozaton belül a 3’-helyzetbe beépített timidin hasadt le a leggyorsabban. A felezési idők a következő sorrendben nőttek: 9<19<8 és 21<20<10, ami a 3’-terminális nukleozidok vonatkozásában a T
Trimer
t1/2 (perc)
8
GPSCPOAZT
39
10
TPSAPOAZT
185
19
GPSCPOFdU
31
20
TPSAPOFdU
123
9
GPSCPOT
17
21
TPSAPOT
33
A mért t1/2 értékekből látható, hogy a timidin 3’-OH csoportjának szubsztitúciója N3 csoporttal jobban növelte az enzimatikus stabilitást mint a timin 5-helyzetű CH3 csoportjának szubsztitúciója F atommal. Az enzimatikus hidrolízis sebessége a 3’helyzetű timidin analogonok mellett a normál foszfodiészter kötés kialakításában résztvevő szomszédos nukleozidtól is függött. A kimérák enzimatikus stabilitása abban az esetben ha a szomszédos (középső) nukleozid 2’-dezoxiadenozin (10, 20, 21) ~2-5 ször nagyobb volt mint a középen 2’-dezoxicitidint tartalmazó trimerek (8, 9, 19) esetében. Razzell vizsgálatai szerint a 3’-exonukleáz SV PDE enzim számára csak a 3’ láncvégi helyzetben 3’-OH-t tartalmazó oligomerek hasíthatók [67]. Megfigyeléseink szerint, későbbi irodalmi adatokkal [41] összhangban, az enzim bár lassabban de hidrolizálja
a
3’-láncvégi
helyzetben
3’-azido-3’-dezoxitimidint
tartalmazó
oligonukleotidokat is. A kapott eredmények alapján az enzimatikus stabilitás a 3’láncvégi nukleozid mellett a 3’-láncvégi szekvencia többi tagjától is függ.
15
3.1.2. 5’-PS-AON-PO-(FdU)n-3’ kimérák szintézise és tumorgátló hatása Biológiai vizsgálatok céljából szilárd fázisú standard foszforamidit DNS szintézissel előállítottunk egy tiofoszfát antiszenz oligonukleotidot (22) és a 3’-végéhez foszfodiészter kötéssel kapcsolódó 1, 3 ill. 6 FdU-t tartalmazó kimérákat (23, 24, 25). Korábbi irodalmi adatok szerint egyértelmű korreláció van a mátrix metalloproteázok (MMP) családjába tartozó humán kollagenáz IV enzim aktivitása és a tumor áttétek kialakulása között. Az említett enzimnek két formája van: az MMP-9 (M = 92 kDa) és az MMP-2 (M = 72 kDa), amelyek többek között móltömegükben is különböznek egymástól. Mindkét izoenzim katalizálja a bazális membránfehérjék lebontását, ami a tumor metasztázisok kialakulásának első lépése. Miután mindkét izoenzim mRNS szekvenciája ismert az irodalomból, így a megfelelő hozzáférhető és konzervatív szakaszok blokkolása komplementer szekvenciájú, antiszenz oligonukleotidokkal egy új stratégia alapja lehet a metasztázis gátló szerek kutatásában. Az általunk szintetizált AON-ek biológiai aktivitását Prof. Dr. Jeney András és munkatársai végezték a SOTE I. sz. Pathológiai és Kísérleti Rákkutató Intézetben. A humán kollagenáz IV aktivitást HT-1080, humán fibroszarkóma sejtvonalon tanulmányozták, amelyben mindkét forma jelentős mennyiségben termelődik és jól kimutatható. A megfelelő optimális körülmények között fenntartott HT-1080 tenyészethez az MMP-9 mRNS 329-346 közötti szakaszát célzó, 18-mer AON-t (22) adtak (szekvencia: 5’-CTG GGC AGA TTC CAA ACC-3’). Ez már 9×10-7 M koncentrációban 50%-ban gátolta az MMP-9 génexpresszióját míg 16 µg/ml = 2.8×10-6 M koncentráció mellett gyakorlatilag már nem volt kimutatható a szóban forgó izoenzim képződése. Ugyanakkor a 22 AON a másik izoenzim (MMP-2) bioszintézisét nem gátolta mivel még a legnagyobb (30 µg/ml) 22 AON koncentráció esetében is csak ~10%-os MMP-2 koncentrációcsökkenés volt kimutatható a kezeletlen kontrollhoz képest. Mindez egyértelműen igazolja, hogy a potenciális tumorellenes szernek tekinthető 22 szekvencia-specifikus módon gátolja a megcélzott 92 kDa humán kollagenáz IV bioszintézisét.
16
Az AON (22) és a kimérák (23, 24, 25) sejtproliferáció gátló hatását is a már említett HT-1080 fibroszarkóma sejtvonalon vizsgáltuk (2. táblázat). Az AON a vizsgált 15µM-os
koncentrációban
hatástalan
volt.
A
kimerák
azonban
kb.
egy
nagyságrenddel aktívabbak (IC50= 0.46-2.38 µM) voltak mint az FdU (IC50 = 9.35 µM). 2. táblázat Az FdU az MMP-9 AON és az AON-(FdU)n-3’ kimérák hatása a sejtproliferációra HT-1080 fibroszarkóma sejttenyészetben Szám
Vegyület
IC50
FdU 22
AONa
23
AONP=O-FdU-3’
24 25
Relatív hatékonyság
(µM)
FdU-ra nézveb
AONP=O-FdU-3’-ra nézvec
9.35
1.00
-
-
-
>15.00 2.38
3.93
1.00
P=O
0.56
5.56
1.42
P=O
0.46
3.39
0.86
AON
AON
-(FdU)3-3’ -(FdU)6-3’
a
AON tiofoszfát szekvencia: P=S 5’-CTG GGC AGA TTC CAA ACC-3’
b
IC50(FdU) / n × IC50(AONP=O-(FdU)n-3’)
c
IC50(AONP=O-FdU-3’) / n × IC50(AONP=O-(FdU)n-3’)
A kimérák relatív hatékonysága nem korrelált a beépített FdU egységek számával. Bár a legkisebb IC50 értékkel a hat FdU egységet tartalmazó kiméra (25) rendelkezett, azonban mind az egy FdU egységre mind az egy FdU-t tartalmazó kimérára (23) számított relatív hatékonyság szempontjából is az AON-P=O(FdU)3-3’ analogon (24) volt a legjobb. A kimérák jobb hatásának két oka lehet, egyrészt jobb sejtpenetrációs képességük másrészt az aktív forma (FdUMP) gyorsabb nukleáz-katalizált felszabadulása a kimérákból a timidin kináz-katalizált FdU→FdUMP reakció sebességéhez viszonyítva.
17
3.2. PNS-DNS kimérák szintézise, termikus és enzimatikus stabilitása A szilárd-fázisú peptid- ill. oligonukleotid-szintézis különböző oldószereket ill. reagenseket igényel ezért a két kapcsolási ciklus váltakozó alkalmazása hagyományos DNS szintetizátor segítségével komoly akadályokba ütközne. Ezt elkerülendő a módosított PNS és DNS egységek közötti amidkötéseket oldatfázisban alakítottuk ki. Az így kapott vegyes dimerek nukleozidrészén lévő szabad 3’-OH foszfitilezése ill. szukcinilezése révén a szilárd-fázisú oligonukleotid szintézisben felhasználható reaktív származékokhoz jutottunk [58]. Ezek beépítésével a kívánt kimérák
egyszerűen,
a
standard
DNS
szintézis
protokoll
alkalmazásával
szintetizálhatók. Irodalmi adatok [68] szerint a vizsgált PNS módosítások közül, mind a kapcsolási hozam mind pedig a kész 5’-DNS-PNS-pszeudo-3’ kiméra termikus stabilitása szempontjából a legjobb, ha a PNS gerinc pszeudo-5’-terminális csoportja és a DNS 3’-terminális OH-ja között foszfodiészter kötéseket alakítunk ki. Ezért az általunk szintetizált kimérákban az eredeti N-(2-aminoetil)-glicin PNS gerincet egységesen N-(2-hidroxietil)-glicinnel helyettesítettük. A különböző számú és helyzetű dimer egységet tartalmazó kimérák és a velük komplementer szekvenciák duplexeinek termikus stabilitását Tm pontjukkal jellemeztük. Ezen a hőmérsékleten a duplex 50%-a disszociál egyszálú oligomerekre. A 3’- és 5’-láncvégi helyzetben különböző számú PNS-DNS dimer szintont tartalmazó kimérák esetében az enzimatikus stabilitást is tanulmányoztuk exo- és endonukleázok jelenlétében.
3.2.1. PNS-DNS dimer szintonok előállítása és beépítése T20-, T12- ill. (TdA)10- analóg kimérákba. A PNS-DNS dimer egységek szintézisét a 5. 6. és 7. ábra szemlélteti. A bevezetésben említett 5-alkinil-uracil PNS monomerek szintézisénél 5-jód-uracilból (26) indultunk ki, amelynek Pd-katalizált kapcsolása propinnal ill. 1-hexinnel viszonylag jó hozammal szolgáltatta az 5-propinil- és 5-hexinil-uracilt (27 és 28). Az alkinil-uracilok valamint a timin brómecetsavas karboximetilezésével a kívánt N1karboximetil származékokhoz (29, 30 és 31) jutottunk. Ezek kapcsolása az N-(2-
18
O
O I
HN O
a
C
HN
R
C
O
b
O
N H
O
26.
27. R=Me 28. R=n.Bu
R'
HN
N H
N COOH
29. R'=1-propinil 30. R'=1-hexin-1-il 31. R'=Me c
O HN O
O
O
Me
R'
HN N
e
d
N
O
O
H2N O
O N
DMTO
HO
38.
R'
HN N
O
O C
+ O HNEt 3 -
HO
35. R'=Me 36. R'=1-propinil 37. R'=1-hexin-1-il
N
O C
Ot.Bu
32. R'=Me 33. R'=1-propinil 34. R'=1-hexin-1-il
f
O R'
HN O
Me
HN
N O
DMTO
O
N
O
N
O C
O N H HO
39. R'=Me 40. R'=1-propinil 41. R'=1-hexin-1-il
a, HC≡C-R, (Ph3P)2PdCl2, CuI, Et3N, DMF, 18 óra b, BrCH2-COOH, 1M NaOH, cc. HCl c, i. HO-(CH2)2-NH-CH2-COOt.Bu, TBTU, Et3N, DMF, 3 óra ii. EtOAc-os átkrist. d, i. DMT-Cl, piridin, 18 óra ii. SiO2 krom. e, i. dioxán-víz 4:1, 1M NaOH, pH=13, 3 óra ii. 1M NaHSO4 pH~5 iii. SiO2 krom. f, i. TBTU, Et3N, DMF, 2 óra, ii. SiO2 krom. 5. ábra A 3’-szabad oeg_tNHT, oeg_upNHT és oeg_uhNHT dimer szintonok előállítása 19
O R'
HN
O
N
O
O N
DMTO
Me
HN O
N
O C
O N H HO
39. R'=Me 40. R'=1-propinil 41. R'=1-hexin-1-il
b
O
O R'
HN O
O
N
N
O
R'
HN
Me
HN O
DMTO
a
O
N
N
O
O N H
DMTO
N
O
N
O C
O N H
O
O
C O (CH 2)2
Me
HN
O C
O
CEO
P
N
+
COO -HNEt 3
45. R'=Me 46. R'=1-propinil 47. R'=1-hexin-1-il
42. R'=Me 43. R'=1-propinil 44. R'=1-hexin-1-il
a, i. (i.Pr2N)2-P-OCE, DIPAT, CH2Cl2, 18 óra, ii. SiO2 krom. b, i. Borostyánkősav anhidrid, DMAP, Et3N, CH2Cl2, 18 óra ii. SiO2 krom. 6. ábra A dimerek 3’-O-P amiditjeinek és szukcinátjainak előállítása
20
hidroxietil)-glicin t.butil észterrel, a szilárd-fázisú peptidszintéziseknél alkalmazott körülmények között, etilacetátos átkristályosítások után, mindhárom esetben elfogadható hozammal (58-76%) szolgáltatta a megfelelő N-(2-hidroxietil)-N-[(5szubsztituált-uracil-1-il)acetil]-glicin t.butil észtereket (32, 33 és 34). A kapcsolt termékek dimetoxitritilezése, az észterek lúgos hidrolízise majd a reakcióelegyek óvatos (pH~5-ig) neutralizálása után jó termeléssel preparáltuk a hibrid dimerek szintéziséhez szükséges DMT-védett szabad karbonsav PNS egységeket (35, 36 és 37). Mivel ebben a stádiumban minden esetben szükséges volt a nyerstermékek szilikagél
oszlopkromatográfiás
tisztítása
1-2
%
trietilamint
tartalmazó
eluenselegyekkel, így az említett termékeket trietilammónium sók formájában izoláltuk. A 35, 36 és 37 kapcsolása 5’-amino-5’-dezoxitimidinnel (38) trietilamin mint savmegkötő és TBTU mint aktiválószer jelenlétében, 65-80%-os termeléssel szolgáltatta a 3’-szabad OH-t tartalmazó DMT-védett dimereket (39, 40 és 41). Ezekből
a
természetes
nukleozidok
3’-foszforamiditjei
és
3’-szukcinátjai
szintéziseinek mintájára, hasonló jó hozamokkal (80-92%) preparáltuk a dimerek 3’O-(2-cianoetil-N,N-diizopropil)-foszforamiditjeit (42, 43 és 44) valamint a szilárd hordozóhoz kötendő, 3’-terminális egységekként szolgáló 3’-O-szukcinátokat (45, 46 és 47) (lásd. 6. ábra). A szukcinátokat száraz diklórmetánban 2-etoxi-1etoxikarbonil-1,2-dihidrokinolin (EEDQ), mint kondenzálószer jelenlétében kötöttük a szilárd hordozóhoz (LCAA-CPG, részecskeméret: 500Å). A hordozó aktuális terhelését a savas közegben (3% Cl2CH-COOH/CH2Cl2) kvantitatíve lehasadó DMT kation abszorbanciájának mérése alapján határoztuk meg. Eszerint a derivatizált kontrollált pórusú üveghordozók (CPG-k) aktuális kapacitása 35 és 43 µmól/g között volt és a PNS rész bázisait összehasonlítva timin > 5-propinil-U >5-hexinil-U sorrendben csökkent. Az oeg_tNHdA dimer szintézisét a 7. ábra szemlélteti. A védett 5’-amino2’,5’-didezoxiadenozin
szintézisét
N6-Bz-5’-DMT-dA-ból
(48)
kiindulva
valósítottuk meg. A 48 szabad 3’-hidroxi-csoportjának t.butil-dimetilszilil kloriddal (TBDMSi-Cl) történő szililezése majd az 5’-DMT védőcsoport savkatalizált metanolízise után jó termeléssel izoláltuk az N6-benzoil-3’-t.butildimetilszilildezoxiadenozint (49). A szabad 5’-OH-t ezután 3 lépésben (p.toluolszulfonilezés, toziloxi→azid csere végül az azido-csoport katalitikus hidrogénezése) ~45%-os bruttó hozammal amino-csoporttá alakítottuk át. A kapott 5’-amino vegyületet (50)
21
NHBz
NHBz N N
DMTO
N
N N
HO
a
O
N
N
b
N
O
49
Me2SiO
HO
c
48
d e NHBz
O Me
HN O
N
N N
DMTO
N
H2N
O
N
O
+
COO -HNEt 3
N
Me2SiO
35
50 f g
O Me
HN O
N
N
N O N
DMTO
NHBz
N O C
N
O
N H HO
i
h 51
O
O Me
HN O
N
O O
DMTO
Me
HN
N
53
N O
O N H
O
ABz DMTO
O C O (CH 2)2 + COO -HNEt 3
O
N
O
N H CEO
O P
ABz
N
52
a, t.BuMe2SiCl, imidazol, DMF b, i. 1M p.TsOH/MeOH, CHCl3 ii. SiO2 krom. c, i. Ts-Cl, piridin, Et3N ii. SiO2 krom. d, NaN3, DMF SiO2 krom. e, H2-10%Pd/C EtOH 1atm. f, i. TBTU, Et3N, DMF ii. SiO2 krom. g, Bu4N+F-, THF ii. SiO2 krom. h, i. (i.Pr2N)2-P-OCE, DIPAT, CH2Cl2, 18 óra ii, SiO2 krom. i, Borostyánkősav anhidrid, DMAP, Et3N, CH2Cl2, 18 óra ii. SiO2 krom. 7. ábra Az oeg_tNHdA dimer szinton előállítása
22
ezután a már ismert körülmények (TBTU, Et3N, DMF) között az 5’-DMT-oeg_t PNS monomerrel (35) kapcsoltuk. A kapcsolást követő deszililezés majd a nyerstermék szilikagél oszlopkromatográfiás tisztítása után 75%-os termeléssel preparáltuk a szabad 3’-OH-t tartalmazó oeg_tNHdA dimert (51). A 51 foszfitilezésével ill. szukcinilezésével csaknem kvantitatív hozammal nyertük a megfelelő 3’foszforamiditet (52) ill. 3’-szukcinátot (53). Az 53 kapcsolása a szilárd hordozóhoz EEDQ
jelenlétében
40
µmól/g
kapacitású
oeg_tNHdA-Su-LCAA-CPG-t
eredményezett.
3.2.2. A szintetizált kimérák duplexeinek termikus stabilitása Az oeg_tNHT egységeket tartalmazó kimérák dA20-al képzett duplexeinek Tm pontjait az 3. táblázatban láthatjuk. Minden esetben feltüntettük a referencia T20:dA20 duplex (54) Tm pontjához viszonyított eltérést (∆Tm) is. A táblázat adatai szerint oeg_tNHT dimer blokkok beépítésével a duplexek termikus stabilitása csökken, de a ∆Tm jelentős mértékben függ a beépített PNS egységek számától és az oligomerekben elfoglalt helyétől is. Amennyiben egy oeg_tNHT egység a T20 3’végén (55) vagy utolsó előtti (56) helyzetben van, akkor ez csak viszonylag csekély de már kimutatható stabilitáscsökkenéshez vezet. Ha viszont a lánc közepén 3. táblázat T20 analóg PNS-DNS kiméra:dA20 duplexek Tm pontjai Szám
Oligomer
Tm (°C)
∆Tm (°C)
54
T20
57.4
0
55
T18-oeg_tNHT
54.7
-2.7
56
T17-oeg_tNHT-T
54.6
-2.8
NH
57
T9-oeg_t T-T9
48.3
-9.1
58
(oeg_tNHT-T7)2-oeg_tNHT
42.8
-14.6
59
(T3-oeg_tNHT)4
24.8
-32.6
60
(T2-oeg_tNHT)5
13.0
-44.4
61
(oeg_tNHT)5-T10
36.7
-20.7
62
T11
38.6
-18.8
23
helyezkedik el (57), akkor a duplex destabilizáló hatás (∆Tm= -9.1 °C) már jelentős. A 3’- és 5′-végre és középre beépített összesen három PNS egység (58) Tm csökkentő hatása megfelel a 55 és 57 ∆Tm értékei alapján vártnak. Ha viszont négy ill. öt oeg_tNHT blokkot izoláltan építünk be a T20-ba, (59 és 60) akkor ez kb. 8°C/módosítás mértékű Tm pont csökkenést eredményez, ami azt jelenti, hogy a 60 gyakorlatilag már nem képez duplexet. Abban az esetben viszont, ha öt oeg_tNHT dimert egymás mellé építünk be a T20 5’-végére (61), akkor egyértelműen látható, hogy a molekula kiméra fele egyáltalán nem képes bázispár képzésre, míg a 3’-végen lévő homogén T11 blokk, a referencia T11:dA20 duplex (62) Tm pontjának (38.6 °C) közelítőleg megfelelő, 11 szabályos T:A bázispárt képez. Korábbi vizsgálatok alapján [69] a DNS lánc közepén egy foszfodiészter→foszfamid csere, a módosított nukleozidtól függően, 1.0-2.4 ºC Tm pont csökkenést eredményez. Ezzel a kismértékű termikus stabilitást csökkentő hatással magyarázható az 61:dA20 duplexnek (Tm= 36.7 °C) a referencia T11:dA11-hez (Tm= 38.6 ºC) viszonyított valamivel alacsonyabb Tm értéke. Az 52 és 53 oeg_tNHdA dimer szintonok felhasználásával további 4 (TdA)10(63) analóg, ugyancsak 20-as tagszámú, PNS-DNS kimérát (64-67) szintetizáltunk. Az alternáló szekvenciából adódóan, az előző homo-timidin analogonoktól eltérően, ezek az oligomerek saját magukkal képeznek inter- vagy intramolekuláris duplexeket. A szóban forgó kimérák Tm és a referencia (TdA)10 önduplexhez viszonyított ∆Tm értékeit a 4. táblázatban foglaltuk össze. 4. táblázat Önduplex képző (TdA)10-analóg kimérák Tm pontjai Szám
Oligomer
63
(TdA)10
64
oeg_tNHdA-(TdA)8-oeg_tNHdA NH
NH
Tm (°C)
∆Tm (°C)
51.2
0
47.1
-4.1
65
(oeg_t dA-(TdA)3-oeg_t dA)2
45.5
-5.7
66
[oeg_tNHdA-(TdA)2]3-oeg_tNHdA
29.1
-22.1
67
(TdA-oeg_tNHdA)5
13.0
-38.2
24
Az 3. és 4. táblázatok adatait összehasonlítva szembetűnő különbség, hogy a 65 önduplexének Tm pontja mindössze 5.7 °C-kal alacsonyabb mint referencia (TdA)10– é annak ellenére, hogy a szekvencia összesen négy hibrid oeg_tNHdA egységet is tartalmaz közülük kettőt középen. Az ehhez legközelebb álló homo-T analóg, az 58 oligomer, esetében a ∆Tm = -14.6 °C, ami ∼2/3 részben a középen elhelyezkedő oeg_tNHT egységnek tulajdonítható. Valószínű, hogy a 65 esetében a középső két dimer egység azért nem csökkenti jelentősen a Tm pontot, mert az inter- és intramolekuláris önduplexek egyensúlyi elegyében az utóbbi a domináns. Az intramolekuláris duplexben a középen lévő négy nukleotid egység hajtűt képez és a hibridizációban csak a fennmaradó nyolc bázispár vesz részt így a középső négy nukleotid (a két oeg_tNHdA dimer) nem befolyásolja a Tm pontot. Ugyanakkor látható, hogy a szórtan beépített 4 ill. 5 oeg_tNHdA blokk (a 66 és 67 oligomerek) az önduplexek képződését is jelentős mértékben akadályozza és számottevő (22 ill. 38 °C-os) Tm pont csökkenést eredményez. A
bevezetésben
már
említettük
a
pirimidin
bázisok
5-alkinil-
szubsztitúciójának duplexstabilitást növelő hatását a DNS-ben [1]. Annak tanulmányozása céljából, hogy a szóban forgó alkinil (propinil és hexinil) szubsztitúciók a PNS részbe építve, hogyan befolyásolják a kiméra:dA20 duplexek termikus stabilitását a 43, 46 valamint a 44, 47 dimer szintonok beépítésével, összesen hat, a PNS részen 5-propinil- ill. 5-hexinil-uracilt tartalmazó, 20-as tagszámú kimérát (68-73) szintetizáltunk. Az 5. táblázatban található Tm adatok azt mutatják, hogy egy oeg_tNHT vagy oeg_uhNHT dimer egység beépítése a T20 középső helyzetébe (57, 69) kb. 9 ºC-os Tm pont csökkenést okoz a referencia T20:dA20 duplexhez (54) képest, ugyanakkor az oeg_upNHT dimer (68) azonos elhelyezése csak 7.6 ºC-os csökkenést okoz. A szintonok 3'-terminális beépítése (55, 70, 71) csak kismértékű stabilitás csökkenéshez vezet. A 68-hoz hasonlóan ebben a sorozatban is a PNS uracil bázisán 5-propinil szubsztituált analogonnál (70) találtuk a legkisebb Tm pont csökkenést (1.8 ºC). Abban az esteben ha 5 dimer blokkban egymás mellett helyezkedik el a T20 5'-végén (61, 72, 73) jelentős (15.8 - 20.7 ºC) a Tm pont csökkenés. A legkisebb destabilizáló hatást (∆Tm = -15.8 ºC) ebben az esetben is az öt oeg_upNHT dimert tartalmazó kiméránál (72) tapasztaltuk. Ezek szerint a PNS részen az uracil 5-metil csoportjának szubsztitúciója propinil csoporttal mindegyik esetben jól kimutatható mértékben növeli a duplexstabilitást.
25
A 70 és 72-nél ez ~ +1 ºC/módosítás ∆Tm-nek felel meg, míg a 68-nál még ennél is nagyobb (∆Tm= +1.5 ºC) a stabilizáló hatás. Ennek oka, hogy a propinil csoport a pirimidin bázissal konjugált rendszert képez, amely a szomszédos bázisok között erősebb π-π stacking kölcsönhatást eredményez [70]. 5. táblázat 5-alkinil-uracil PNS egységeket tartalmazó kiméra:dA20 duplexek Tm pontjai Szám
Oligomer
Tm (°C)
∆Tm (°C)a
∆Tm (°C)b
54
T20
57.4
0
-
57
T9-oeg_tNHT-T9
48.3
-9.1
0
68
T9-oeg_upNHT-T9
49.8
-7.6
+1.5
NH
69
T9-oeg_uh T-T9
48.5
-8.9
+0.2
55
T18-oeg_tNHT
54.7
-2.7
0
70
T18-oeg_upNHT
55.6
-1.8
+0.9
71
T18-oeg_uhNHT
55.0
-2.4
+0.3
61
(oeg_tNHT)5-T10
36.7
-20.7
0
72
(oeg_upNHT)5-T10
41.6
-15.8
+4.9
73
(oeg_uhNHT)5-T10
37.9
-19.5
+1.2
a
A referencia T20:dA20 duplex Tm pontjához viszonyított ∆Tm értékek
b
Az analóg oeg_tNHT tartalmú kiméra:dA20 duplexek Tm pontjaihoz viszonyított ∆Tm
értékek A hexinil módosítás (69, 71, 73) mindhárom trióban jóval kisebb Tm pont emelkedést eredményez (∆Tm= +0.2, +0.3 ºC/ módosítás). Ennek oka az, hogy a hosszú oldallánc viszonylag nagy helyet foglal el a nagy árokban és a foszfát ionok körül elrontja a hidrátburok elrendeződését [71, 72]. A hármas kötés duplexstabilizáló és a hidrofób kölcsönhatás destabilizáló hatásainak eredője még mindíg pozitív és mindhárom
26
sorozatban, bár kismértékű de még kimutatható Tm pont növekedést okoz a megfelelő oeg_tNHT tartalmú analogonok Tm értékeihez viszonyítva.
3.2.3. T20- és T12- analóg kimérák enzimatikus stabilitása Amint azt a bevezetésben is említettük a peptid-nukleinsavak egyik legfontosabb előnyös tulajdonsága a hasító enzimekkel, a proteázokkal és nukleázokkal szembeni ellenállóképesség. A DNS-t hidrolitikusan hasító endo- és exonukleázok közül in vivo általában az utóbbiak aktivitása a meghatározó, így az általunk szintetizált PNSDNS dimer egységek láncvégi beépítése várhatóan jelentős mértékben növeli a kimérák enzimatikus stabilitását. A hidrolízis vizsgálatokat a kereskedelmi forgalomban lévő háromféle enzimmel, kígyóméreg foszfodiészterázzal (3’exonukleáz), borjúlép foszfodiészterázzal (5’-exonukleáz) és P1 nukleázzal (endonukleáz) végeztük.
3.2.3.1. A 3’-végen módosított analogonok hidrolízise kígyóméreg foszfodiészterázzal Annak kiderítésére, hogy a PNS uracil bázis szubsztituenseinek függvényében hogyan változik a hidrolízissebesség az 5-metil- és 5-alkinil-uracil PNS egységeket tartalmazó kimérákat (55, 70, 71) kígyóméreg foszfodiészterázzal hidrolizáltuk. Erre jellemző a hidrolízis félidő (t1/2), amelyet a 37 °C-on inkubált elegyből bizonyos időközönként vett minták HPLC analízisével határoztunk meg. Az említett kimérák és a referencia T20 t1/2 értékeit a 6. táblázatban foglaltuk össze. A szóban forgó egy dimer blokkot tartalmazó analogonok (55, 70, 71) a referencia T20-nál (54) 33-53 szor voltak stabilabbak. Korábbi tapasztalatokkal [27] összhangban a láncvégi PNS uracil bázis 5-alkinil szubsztituensei megnehezítették a szubsztrát kötődését az enzimhez, ennek eredményeként az (70, 71) kimérák stabilabbak voltak mint az oeg_tNHT dimert tartalmazó származék (55), vagyis az enzimatikus stabilitás növekszik az alkinil lánchossz növelésével. A propinil analóg (70) 1.3 szor a hexinil analóg (71) 1.6-szor nagyobb felezési idővel rendelkezett mint az 55.
27
6. táblázat A 3’-végen 5-alkinil-uracil PNS egységeket tartalmazó kimérák hidrolízise kígyóméreg foszfodiészterázzal Szám
t1/2 (perc)
Oligomer
1.3
Relatív stabilitás 1
54
T20
55
T18-oeg_tNHT
43
33
70
NH
T18-oeg_up T
58
45
71
T18-oeg_uhNHT
69
53
Annak tanulmányozása céljából, hogy több egymás melletti dimer beépítése hogyan befolyásolja a 3’-exonukleáz rezisztenciát 1, 2, ill. 3 egymást követő oeg_tNHT dimer egységet építettünk be az előzőeknél rövidebb T12 (74) 3'-végére (75, 76, 77). Az említett kimérák t1/2 értékeit a 7. táblázatban foglaltuk össze. 7. táblázat A 3’-végen oeg_tNHT dimer blokkokat tartalmazó T12-analóg kimérák hidrolízise kígyóméreg foszfodiészterázzal Szám
Oligomer
t1/2 (perc) 1.4
Relatív stabilitás 1
74
T12
75
T10-oeg_tNHT
69
50
76
T8-(oeg_tNHT)2
135
96
203
145
77
NH
T6-(oeg_t T)3
A 7. táblázat adatai szerint már egy oeg_tNHT egység láncvégi beépítése (75) is 50szeresére növelte a hidrolízis félidőt a referencia T12 t1/2 értékéhez viszonyítva. Két ilyen dimer blokk beépítése (76) 96-szoros, háromé (77) pedig már igen jelentős 145szörös stabilitás növekedést eredményez. A különböző számú dimer szintont tartalmazó kimérák 24 órás enzimatikus hidrolíziselegyéből vett minták HPLC kromatogrammjaiban egymástól eltérő retenciós időknél (tR = 11.6, 13.7 és 15.5 perc)
jelentek
meg
az
egyes
analogonok
kiméra
hidrolízistermékei.
A
kromatogrammokban megjelenő csúcsok retenciós ideje növekedett a beépített dimer blokkok számával, ami növekvő hosszúságú enzimatikusan stabil fragmensek jelenlétére utal. A jelenség azzal magyarázható, hogy az 1, 2 ill. 3 dimer blokkból
28
álló
kiméra
molekularészek
enzimrezisztensek,
vagyis
a
beépített
dimer
szintonokban található timidinek 3’-OH csoportja és a PNS gerinc N-(2hidroxietil)glicin OH csoportja közötti foszfodiészter kötés enzimatikusan stabil. Megfigyeléseink összhangban vannak különböző aciklusos nukleozidokat tartalmazó oligonukleotidok enzimatikus stabilitására vonatkozó korábbi eredményekkel [73, 74].
3.2.3.2. Az 5’-végen módosított származékok hidrolízise borjúlépfoszfodiészterázzal Az 5’-végen 5-szubsztituált-uracil PNS egységeket tartalmazó T20 analogonokat (61, 72, 73), valamint a referencia T20-at (54) borjúlép foszfodiészterázzal (5’exonukleáz) inkubáltuk. A hidrolízisek t1/2 értékei a 8. táblázatban láthatók. 8. táblázat Az 5’-végen 5 dimer blokkot tartalmazó T20-analóg kimérák hidrolízise borjúlép foszfodiészterázzal Szám
t1/2 (perc)
Oligomer
7.7
T20
54
Relatív stabilitás
NH
1.0
61
(oeg_t T)5-T10
45
5.8
72
(oeg_upNHT)5-T10
59
7.7
73
(oeg_uhNHT)5-T10
64
8.3
Az enzim kisebb fajlagos aktivitása miatt 250-szer nagyobb koncentráció (egység/ mL-ben kifejezve) szükséges az SV PDE enzimmel összemérhető hidrolízis sebesség eléréséhez. A táblázat adataiból látható, hogy a BS PDE hidrolízissel szemben még öt dimer egység beépítése is csak ~6-8-szoros stabilitásnövekedést eredményezett a referencia T20-hoz viszonyítva. Eszerint az 5’-végen módosított kimérák az alkalmazott 5’-exonukleázzal (BS PDE) szemben sokkal kevésbé voltak ellenállók mint a 3’-végen módosított analogonok a kígyóméreg foszfodiészterázzal szemben. Ennek valószínű magyarázata a két enzim jelentősen eltérő endonukleáz aktivitása lehet. A PNS uracil bázis 5-alkinil lánchosszának növelése a 3’-végen módosított kimérákhoz
(70
és
71)
hasonlóan
ez
esetben
is
rezisztencianövekedést 29
eredményezett. A propinil (72) és hexinil (73) analogonok 1.3- ill. 1.4-szer stabilabbak voltak mint az oeg_tNHT származék (61). Az előző részfejezetben vizsgált 3’-módosított T12 analogonokhoz hasonlóan blokkban 1, 2 ill. 3 oeg_tNHT dimer szintont építettünk be a T12 5’-végére (78, 79, 80) enzimatikus stabilitásuk vizsgálata céljából. A 9. táblázat t1/2 értékeiből látható, hogy a növekvő számú oeg_tNHT egységet tartalmazó kimérák rezisztenciája a beépített dimerek számával párhuzamosan nő, de stabilizáló hatásuk itt nem érvényesül olyan látványosan, mint a 3’-módosított kiméráknál (75, 76, 77) az SV PDE-vel szemben, bár a 80 t1/2 értéke már csaknem egy nagyságrenddel nagyobb, mint a T12-é. A különböző számú dimer szintont tartalmazó kimérák 24 órás enzimatikus hidrolíziselegyéből vett minták HPLC kromatogrammjaiban az egyes analogonok kiméra hidrolízistermékei ezúttal is egymástól eltérő retenciós időknél jelentek meg (tR = 18.0, 23.3 és 27.7 perc). A 3’-módosított analogonok 3’exonukleázos
hidrolíziseihez
hasonlóan,
a
kiméra
blokkok
a
borjúlép
foszfodiészteráz (5'-exonukleáz) hasítással szemben is rezisztensnek bizonyultak. 9. táblázat Az 5’-végen oeg_tNHT dimer blokkokat tartalmazó T12 analóg kimérák hidrolízise borjúlép foszfodiészterázzal Szám
Oligomer
t1/2 (perc)
Relatív stabilitás
74
T12
78
oeg_tNHT-T10
21
5.8
79
(oeg_tNHT)2-T8
23
6.4
80
NH
30
8.3
3.6
(oeg_t T)3-T6
1.0
Az endonukleázokkal szembeni rezisztencia tanulmányozására a leghosszabb PNSDNS dimer blokkot tartalmazó T6-(oeg_tNHT)3 (77) és a pszeudo-5'-(oeg_tNHT)3-T63' (80) kimérákat P1 nukleázzal inkubáltuk. A 24 órás minták HPLC kromatogrammjai alapján ez esetben is a megfelelő SV PDE és a BS PDE enzimreakciókban detektált végtermékekkel azonos hidrolízistermékek keletkeztek. Ezek szerint a már említett nem természetes foszfodiészter kötés a vizsgált exonukleázokon kívül endonukleázzal szemben is rezisztens.
30
4. Kisérleti rész A kísérletek részletes leírását a függelékben található számozott közlemények tartalmazzák az alábbiak szerint: A 3.1.1. fejezetben az AZT és FdU tartalmú PS-PO trinukleotidok szintézisének és enzimatikus stabilitás vizsgálatának körülményei: függelék I, 85-91. A 3.2.1. fejezetben a PNS-DNS hibrid dimer szintonok előállítása és beépítése T20 analóg kimérákba: függelék VI, 1972-1980. A 3.2.2. fejezetben a szintetizált oeg_tNHT és oeg_tNHdA tartalmú kimérák (függelék III, 68) valamint az oeg_upNHT és oeg_uhNHT tartalmú kimérák (függelék VI, 1969) termikus stabilitás meghatározásának körülményei. A 3.2.3.1. fejezetben a 3’-végen módosított analogonok enzimatikus hidrolíziseinek körülményei: függelék VI, 1970 és függelék IV, 197. A 3.2.3.2. fejezetben az 5’-végen módosított analogonok enzimatikus hidrolíziseinek körülményei: függelék VI, 1971 és függelék IV, 198.
31
5. Összefoglalás Előzetes enzimatikus stabilitás vizsgálatok céljából oldatfázisban hidrogénfoszfonát módszerrel (GPSCPOAZT, GPSCPOT, TPSAPOAZT) és szilárdfázison foszforamidit módszerrel (GPSCPOFdU, TPSAPOFdU, TPSAPOT) három-három P1-tio-P2-oxo modell trinukleotidot
szintetizáltunk.
Az
említett
modellvegyületek
kígyóméreg
foszfodiészterázos (SV PDE) hidrolízise során azt találtuk, hogy mind a hat trimer szubsztrátja volt az enzimnek és a 3’- végen foszfodiészter kötéssel kapcsolt T, FdU és AZT gyorsabban hidrolizált mint a tiofoszfodiészter kötéssel kapcsolt dimer. A bázismódosítás (C5-Me→F csere) és különösen a cukormódosítás (3’-OH→3’-N3 csere)
növelte
az
enzimatikus
stabilitást.
alkalmazhatóságának
vizsgálatára
szilárd
A
fázison
modell
gyakorlatban
foszforamidit
való
módszerrel
előállítottunk egy 18-as tagszámú tiofoszfát antiszenz oligonukleotidot valamint 3’terminális helyzetben foszfodiészter kötésekkel kapcsolt 1, 3 és 6 FdU egységet tartalmazó származékait. Az antiszenz molekula szelektíven és hatásosan gátolta a humán kollagenáz IV MMP-9 izoenzim bioszintézisét, de a sejtproliferációt egyáltalán nem a vizsgált HT-1080 fibroszarkoma sejtvonalon. Ugyanakkor az említett PS-PO kimérák már egy nagyságrenddel kisebb koncentrációban is hatásosan gátolták a sejtproliferációt a referencia FdU-hoz képest. PNS-DNS kimérák biofizikai és biokémiai tulajdonságainak tanulmányozása céljából oldatfázisban négy PNS-DNS dimer szintont (oeg_tNHT, oeg_tNHdA, oeg_upNHT, oeg_uhNHT) állítottunk elő és standard szilárd fázisú foszforamidit DNS szintézis protokoll szerint mind láncvégi mind láncközi helyzetekbe beépítettük őket. Az oeg_tNHT és a PNS uracil bázisán 5-alkinil szubsztituált származékainak beépítésével T12- és T20- míg az oeg_tNHdA beépítésével alternáló szekvenciájú (TdA)10-analogonokat szintetizáltunk. A PNS-DNS egységek beépítése mind a T20 mind a (TdA)10 származékok esetében Tm pont csökkenést okozott a referencia T20:dA20 duplex ill. a (TdA)10 önduplex Tm pontjához képest, de a csökkenés jelentős mértékben függött a beépített dimer egységek számától és az oligomerekben elfoglalt helyétől is. Meglepő módon a lánc közepén két oeg_tNHdA dimer blokkot tartalmazó, alternáló szekvenciájú (TdA)10 analogon Tm pontja magasabb volt mint a középen csak egy oeg_tNHT egységet tartalmazó T20-analóg kiméráé. Ennek valószínű oka az lehet, hogy az inter és intramolekuláris önduplexek egyensúlyi elegyében az utóbbi
32
volt a domináns. Az intramolekuláris duplexben a középen lévő négy nukleotid egység hajtűt képezett és a hibridizációban csak a fennmaradó nyolc bázispár vett részt, így a középső négy nukleotid (a két oeg_tNHdA dimer) nem befolyásolta a Tm pontot. A PNS uracil bázisán az 5-metil csoport cseréje propinilre a beépítés helyétől függetlenül minden esetben növelte a duplexstabilitást. Az 5-hexinil-uracil PNS egységek beépítése esetén a hármas kötés stabilizáló és a hosszú alkinil lánc destabilizáló hatásának eredője egy kis pozitív ∆Tm érték volt. A dimer blokkok beépítése minden esetben növelte a stabilitást exonukleázokkal szemben. Az 5’végen módosított kimérák sokkal kevésbé voltak rezisztensek az 5’-exonukleáz (BS PDE) hasítással szemben mint a megfelelő 3’-módosított származékok a 3’exonukleáz (SV PDE) hidrolízissel szemben. Ennek valószínű magyarázata a BS PDE nagyobb endonukleáz aktivitása lehet. Az enzimatikus stabilitás mindkét exonukleázzal szemben nőtt a PNS uracil bázis 5-alkinil lánchosszának növelésével, mivel a nagyobb térkitöltésű szubsztituens valószínűleg jobban gátolta a szubsztrát kötődését az enzimekhez. Sem egy endonukleáz (P1 nukleáz) sem az exonukleázok (SV PDE és BS PDE) nem tudták hidrolizálni a timidin 3’-OH és a PNS gerinc N-(2hidroxietil)glicin
OH
csoportjai
közötti
nem
természetes
foszfodiészter
internukleozid kötéseket.
33
6. Rövidítések AON
antiszenz oligonukleotid
AZT
3’-azido-3’- dezoxitimidin
AZTMP
3’- azido -3’- dezoxitimidin-5’-monofoszfát
BS PDE
borjúlép foszfodiészteráz
CED
2-cianoetil-N,N-diizopropil-foszforamidit
DIPAT
diizopropilammonium tetrazolid
DMAP
4-dimetilamino-piridin
DMT
4,4’-dimetoxitrifenilmetil
EEDQ
2-etoxi-1-etoxikarbonil-1,2-dihidrokinolin
FdU
5-fluor-2’-dezoxiuridin
FdUMP
5-fluor-2’-dezoxiuridin-5’-monofoszfát
LCAA-CPG
hosszú láncú alkilamino-kontrollált pórusú üveg
NH
oeg_t dA
N-[(timin-1-il)acetil]-N-(2-hidroxietil)glicin-(2’, 5’didezoxiadenozin-5’-il)amid
oeg_tNHT
N-[(timin-1-il)acetil]-N-(2-hidroxietil)glicin-(5’dezoxitimidin-5’-il)amid
oeg_uhNHT
N-[(5-hexinil-uracil-1-il)acetil]-N-(2-hidroxietil)glicin-(5’dezoxitimidin-5’-il)amid
NH
oeg_up T
N-[(5-propinil-uracil-1-il)acetil]-N-(2-hidroxietil)glicin-(5’dezoxitimidin-5’-il)amid
PNS
peptid nukleinsav
p-TsOH
para-toluolszulfonsav
Su
szukcinil
SV PDE
kígyóméreg foszfodiészteráz
TBTU
O-(benzotriazol-1-il)-N,N,N’,N’-tetrametiluróniumtetrafluoroborát
TETD
tetraetiltiurám diszulfid
THF
tetrahidrofurán
34
7. Köszönetnyilvánítás Köszönöm az MTA Kémiai Kutatóközpont Igazgatóságának, hogy a Kémiai Intézetben lehetőséget kaptam kutatási tevékenységemre. Köszönetemet szeretném kifejezni témavezetőmnek Prof. Dr. Ötvös Lászlónak a témaválasztásért és munkám irányításáért. Köszönöm csoportvezetőm Dr. Sági Gyula munkám során nyújtott segítségét, és Prof. Dr. Tomasz Jenő hasznos tanácsait. Köszönöm Prof. Dr. Jeney Andrásnak és munkatársainak együttműködését és a biológiai vizsgálatok elvégzését. Köszönöm az MTA ösztöndíját és a Varga József Alapítvány doktori szigorlatomhoz nyújtott anyagi támogatását.
35
8. Irodalomjegyzék 1.
J. Sági, A. Szemző, K. Ébinger, A. Szabolcs, Gy. Sági, É. Ruff, L. Ötvös: Tetrahedron Lett. 1993, 34, 2191-2194.
2.
M.L. Stephenson, P.C. Zamecnik: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1978, 75, 1302-1306.
3.
S. Akhtar, S. Agrawal: Trends Pharmacol. Sci., 1997, 18, 12-18.
4.
C.M. Perry, J.A. Balfour: Drugs, 1999, 57, 375-380.
5.
M. McCoy: Chem. Eng. News , 2001, 79(39), 22-23.
6.
M. Matsukura, K. Shinozuka, G. Zon, H. Mitsuya, M. Reitz, J.S. Cohen, S. Broder: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1987, 84, 7706-7710.
7.
W.S. Marshall, M.H. Caruthers: Science, 1993, 259, 1564-1570.
8.
R.L. Letsinger, C.N. Singman, G. Histand, M. Salunkhe: J. Am. Chem. Soc., 1988, 110, 4470-4471.
9.
P.S. Miller, J. Yano, E. Yano, C. Carroll, K. Jayaraman, P.O.P. Ts’o: Biochemistry, 1979, 18, 5134-5143.
10.
P.S. Miller, K.N. Fang, N.S. Kondo, P.O.P. Ts’o: J. Am. Chem. Soc., 1971, 93, 6657-6665.
11.
S. Agrawal, M.P. Civeira, J. Goodchild, A.H. Thomton, P.S. Sarin, P.C. Zamecnik: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1988, 85, 7079-7083.
12.
F. Eckstein: Antisense Nucleic Acid Drug Dev., 2000, 10, 117-121.
13.
F. Morvan, B. Rayner, J.L. Imbach, S. Thenet, J.R. Bertrand, J. Paoletti, C. Malvy, C. Paoletti: Nucleic Acids Res., 1987, 15, 3421-3437.
14.
M. Manoharan: Biochim. Biophys. Acta, 1999, 1489, 117-130.
15.
S. Agrawal, E.R. Kandimalla: Mol. Med. Today, 2000, 6, 72-81.
16.
S.K. Singh, P. Nielsen, A.A. Koshkin, J. Wengel: J. Chem. Soc. Chem. Commun, 1998, 455-456.
17.
A.A. Koshkin, S.K. Singh, P. Nielsen, V.K. Rajwanshi, R. Kumar, M. Meldgaard, C.E. Olsen, J. Wengel: Tetrahedron, 1998, 54, 3607-3630.
18.
C. Wahlestedt, P. Salmi, L. Good, J. Kela, T. Johnson, T. Hoekfelt, C. Broberger, F. Porreca, J. Lai, K. Ren, M. Ossipov, A. Koshkin, N. Jakobsen, J. Skouv, H. Oerum, M. Jacobsen, J. Wengel: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97, 5633-5638.
36
19.
I. Luyten, P. Herdewijn: Eur. J. Med. Chem., 1998, 33, 515-576.
20.
P. Sazani, A. Astriab-Fischer, R. Kole: Antisense Nucleic Acid Drug Dev., 2003, 13, 119-128.
21.
B.C. Froehler, S. Wadwani, T.J. Terhorst, S.R. Gerrard: Tetrahedron Lett., 1992, 33, 5307-5310.
22.
J. He, F. Seela: Nucleic Acids Res., 2002, 30, 5485-5496.
23.
T.W. Barnes III, D.H. Turner: J. Am. Chem. Soc., 2001, 123, 4107-4118.
24.
T.W. Barnes III, D.H. Turner: Biochemistry, 2001, 40, 12738-12745.
25.
R.W. Wagner, M.D. Matteucci, J.G. Lewis, A.J. Gutierrez, C. Moulds, B.C. Froehler: Science, 1993, 260, 1510-1513.
26.
L. Ötvös, J. Sági, Gy. Sági, A. Szemző, F.D. Tóth, A. Jeney: Nucleosides & Nucleotides, 1999, 18, 1665-1666.
27.
L. Ötvös, J. Sági, Gy. Sági, A. Szemző: Nucleosides & Nucleotides, 1999, 18, 1929-1933.
28.
A.J. Gutierrez, T.J. Terhorst, M.D. Matteucci, B.C. Froehler: J. Am. Chem. Soc., 1994, 116, 5540-5544.
29.
A.J. Gutierrez, B.C. Froehler: Tetrahedron Lett., 1996, 37, 3959-3962.
30.
N.A. Kurchavov, D.A. Stetsenko, N.V. Skaptsova, V.K. Potapov, E.D. Sverdlov: Nucleosides & Nucleotides, 1997, 16, 1837-1846.
31.
M.D. Matteucci, U. von Krosigk: Tetrahedron Lett., 1996, 37, 5057-5060.
32.
K.Y. Lin, R.J. Jones, M. Matteucci: J. Am. Chem. Soc., 1995, 117, 38733874.
33.
K.S. Ramasamy, M. Zounes, C. Gonzalez, S.M. Freier, E.A. Lesnik, L.L. Cummins, R.H. Griffey, B.P. Monia, P.D. Cook: Tetrahedron Lett., 1994, 35, 215-218.
34.
K.Y. Lin, M.D. Matteucci: J. Am. Chem. Soc., 1998, 120, 8531-8532.
35.
W.H. Gmeiner, P. Sahasrabudhe, R.T. Pon, J. Sonntag, S. Srinivasan, P.L. Iversen: Nucleosides & Nucleotides, 1995, 14, 243-253.
36.
C. Perigaud, G. Gosselin, J.L. Imbach: Nucleosides & Nucleotides, 1992, 11, 903-945.
37.
C. Liu, M. Willingham, J. Liu, W.H. Gmeiner: Int. J. Oncol., 2002, 21, 303308.
37
38.
P. Herdewijn, R. Charubala, E. De Clercq, W. Pfleiderer: Helv. Chim. Acta, 1989, 72, 1739-1748.
39.
N.N. Polushin, J.S. Cohen: Nucleic Acids Res., 1994, 22, 5492-5496.
40.
C. MacKellar, D. Graham, D.W. Will, S. Burgess, T. Brown: Nucleic Acids Res., 1992, 20, 3411-3417.
41.
D.S. Esipov, O.V. Esipova, V.G. Korobko: Nucleosides & Nucleotides, 1998, 17, 1697-1704.
42.
Z. Ma, J.S. Taylor: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97, 11159-11163.
43.
Z. Ma, J.S. Taylor: Bioorg. & Med. Chem., 2001, 9, 2501-2510.
44.
P.E. Nielsen, M. Egholm, R. H. Berg, O. Buchardt: Science, 1991, 254, 14971500.
45.
M. Egholm, O. Buchardt, P.E. Nielsen, R.H. Berg: J. Am. Chem. Soc., 1992, 114, 1895-1897.
46.
M. Egholm, O. Buchardt, L. Christensen, C. Behrens, S.M. Freier, D.A. Driver, R.H. Berg, S.K. Kim, B. Norden, P.E. Nielsen: Nature, 1993, 365, 566-568.
47.
C. Meier, J.W. Engels: Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 1992, 1008-1010.
48.
H. Ørum, P.E. Nielsen, M. Egholm, R.H. Berg, O. Buchardt, C. Stanley: Nucleic Acids Res., 1993, 21, 5332-5336.
49.
E. Uhlmann, D.W. Will, G. Breipohl, D. Langner, A. Ryte: Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 1996, 35, 2632-2635.
51.
V.V. Demidov, V.N. Potaman, M.D. Frank-Kemenetskii, M. Egholm, O. Buchard, S.H. Sonnichsen, P.E. Nielsen: Biochem. Pharmacol., 1994, 48, 1310-1313.
52.
T.L. Trapane, R.I. Hogrefe, M.A. Reynolds, L.S. Kan, P.O.P. Ts’O: Biochemistry, 1996, 35, 5495-5508.
53.
H. Knudsen, P.E. Nielsen: Nucleic Acids Res., 1996, 24, 494-500.
54.
E. Uhlmann, A. Peyman, G. Breipohl, D.W. Will: Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 1998, 37, 2796-2823.
50.
R.G. Kuimelis, A.C. vander Laan, R. Vinayak: Tetrahedron Lett., 1999, 40, 7671-7674.
55.
P.J. Finn, N.J. Gibson, R. Fallon, A. Hamilton, T. Brown: Nucleic Acids Res., 1996, 24, 3357-3363.
38
56.
C. Malchere, J. Verheijen, S. vander Laan, L. Bastide, J. van Boom, B. Lebeln, J. Robbins: Antisense Nucleic. Acid Drug Dev., 2000, 10, 463-468.
57.
F. Bergmann, W. Bannwarth, S. Tam: Tetrahedron Lett., 1995, 36, 68236826.
58.
D. Wenninger, H. Seliger: Nucleosides & Nucleotides, 1997, 16, 977-980.
59.
E. Uhlmann, D.W. Will, G. Breipohl, D. Langner, A. Ryte: Angew. Chem., 1996, 108, 2793-2797.
60.
D. Derossi, G. Chassaing, A. Prochiantz: Trends Cell Biol., 1998, 8, 84-87.
61.
C.G. Simmons, A.E. Pitts, L.D. Mayfield, J.W. Shay, D.R. Corey: Bioorg. & Med. Chem. Lett., 1997, 7, 3001-3006.
62.
M. Pooga, U. Soomets, M. Hallbirk, A. Valkna, S. Kaar, K. Rezaei, U. Kahl, J.X. Hao, X.J. Xu, Z. Wiesenfeld-Hallin, T. Hokfelt, T. Bartfai, U. Langel: Nat. Biotechnol., 1998, 16, 857-861.
63.
B.C. Froehler, P.G. Ng, M.D. Matteucci: Nucleic Acids Res., 1986, 14, 53995407.D.D.
64.
W.J. Stec, G.J. Zon, W. Egan, B. Stec: J. Am. Chem. Soc. 1984, 106, 60776079.
65.
S.L. Beaucage, In: Methods in Molecular Biology, Vol. 20., S. Agrawal ed., Humana Press, Totowa, New Jersey, p. 33-61, 1993.
66.
H. Vu, B.L. Hirschbein: Tetrahedron Lett. 1991, 32, 3005-3008.
67.
W. E. Razzell, In: Methods in Enzymology, Vol. VI.,Academic Press, New York, p. 236-258, 1963.
68.
B. Greiner, G. Breipohl, E. Uhlmann: Helv. Chim. Acta., 1999, 82, 21512159.
69.
F. Bergmann, W. Bannwarth, S. Tam: Tetrahedron Lett. 1995, 36, 68236826.
70.
B.C. Froehler, S. Wadwani, T.J. Terhost, S.R. Gerrard: Tetrahedron Lett. 1992, 33, 5307-5310.
71.
H. Venner, C. Zimmer, S. Schröder: Biochim. Biophys. Acta 1963, 76, 312326.
72.
J. Sági, S. Brahms, J. Brahms, L. Ötvös: Nucleic Acids Res. 1979, 6, 28392848.
39
73.
S.J. Maeshalko, B.I. Schweitzer, G.P. Beardsley: Biochemistry 1995, 34, 9235-9248.
74.
K. Augustyns, A. Van Aerschot, A. Van Schepdael, C. Urbanke, P. Herdewijn: Nucleic Acids Res. 1991, 19, 2587-2593.
40
9. Függelék: A disszertáció anyagát tartalmazó cikkek (I-VI) I.
L. Ötvös, Z. Bajor, F. Kraicsovits, Gy. Sági, Zs. Tegyey: Synthesis and Enzymatic
Characterization
of
P1-thio-P2-oxo
Trideoxynucleoside
Diphosphates Having AZT, FdU or dT at the 3’-Position. Nucleosides, Nucleotides & Nucleic Acids, 2002, 21(1), 79-92. II.
L. Ötvös, Z. Bajor, Gy. Sági, V. Adleff, J. Kralovánszky, B. Budai, F. Tímár, A. Jeney: Solid phase synthesis and antitumor activity of P-thio antisense oligonucleotides having oligo-2’-deoxy-5-fluorouridylates at the 3’-end. in Innovation and Perspectives in Solid Phase Synthesis and Combinatorial Libraries 2004. (R. Epton ed.) Mayflower Worldwide Ltd., Kingswinford, U.K. (közlés alatt).
III.
Gy. Sági, Zs. Tegyey, Z. Bajor, F. Kraicsovits, J. Tomasz and L. Ötvös: Synthesis, thermal and enzymatic stabilities of PNA-DNA chimeras containing new dimer building units. in Innovation and Perspectives in Solid Phase Synthesis & Combinatorial Libraries 2000. (R. Epton ed.) Mayflower Worldwide Ltd., Kingswinford, U.K., 2000, 67-70.
IV.
Z. Bajor, Gy. Sági and Zs. Tegyey: Solid phase synthesis, thermal stability and exonuclease resistance of various PNA-DNA chimeras. in Innovation and Perspectives in Solid Phase Synthesis and Combinatorial Libraries 2002. (R. Epton ed.) Mayflower Worldwide Ltd., Kingswinford, U.K., 2002, 195-198.
V.
Z. Bajor, Gy. Sági, Zs. Tegyey, L. Ötvös: Synthesis, Biophysical and Biochemical Properties of PNA-DNA Chimeras. Nucleosides, Nucleotides & Nucleic Acids, 2003, 22(5-8), 1215-1217.
VI.
Z. Bajor. Gy. Sági, Zs. Tegyey, F. Kraicsovits: PNA-DNA Chimeras Containing 5-Alkynyl-pyrimidine PNA Units. Synthesis, Binding Properties and Enzymatic Stability. Nucleosides, Nucleotides & Nucleic Acids, 2003, 22(10), 1963-1983.
41
