Kitozán filmek térhálósítása ionos és nemionos molekulákkal Térhálósított kitozán filmek vizsgálata
Készítette: Jáksó Ágnes Témavezető: Dr. Hórvölgyi Zoltán Konzulens: Dr. Kabai Jánosné 2010. december
Budapesti Műszaki és Gazdaságtudományi Egyetem Vegyészmérnöki és Biomérnöki Kar Fizikai Kémia és Anyagtudományi Tanszék Kolloidkémia Csoport
1.1.1.1 Tartalomjegyzék 2
Bevezetés ....................................................................................................................... 4
3
Irodalmi áttekintés ......................................................................................................... 4
4
3.1
Hidrogélek ............................................................................................................... 4
3.2
A kitozán ................................................................................................................. 5
3.3
Térhálósítás ............................................................................................................. 6
3.3.1
Térhálósítás ionos mechanizmussal ................................................................ 6
3.3.2
Térhálósítás kovalens kötés létrehozásával .................................................. 12
Kísérleti rész ................................................................................................................. 15 4.1
5
Anyagok és vizsgálati eszközök ............................................................................. 15
4.1.1
A kísérletekhez felhasznált anyagok.............................................................. 15
4.1.2
A kísérletek során alkalmazott vizsgálati eszközök ....................................... 15
4.2
Kitozán filmek előállítása ...................................................................................... 15
4.3
Filmek térhálósítása .............................................................................................. 16
4.3.1
Térhálósítás trinátrium-citráttal .................................................................... 16
4.3.2
Térhálósítás pentanátrium-tripolifoszfáttal (TPP) ......................................... 16
4.3.3
Térhálósítás glutáraldehiddel (GA) ................................................................ 16
4.4
Térhálósítás kinetikájának vizsgálata .................................................................... 17
4.5
Térhálósított filmek duzzadási vizsgálata ............................................................. 17
Kísérleti eredmények, értékelés................................................................................... 19 5.1
Ionos térhálósítószerrel preparált filmek ............................................................. 19
5.1.1
Nátrium-citráttal térhálósított filmek ........................................................... 19
5.1.2
Nátrium-tripolifoszfáttal térhálósított filmek ............................................... 23
5.1.3
Térhálósítás kinetikájának vizsgálata ............................................................ 25
5.2
Kovalens kötéssel térhálósított filmek.................................................................. 26 2
6
5.2.1
Térhálósítás glutáraldehidben, bemártással ................................................. 26
5.2.2
Térhálósítás glutáraldehiddel, filmképzés előtt ............................................ 26
Morfológiai vizsgálatok ................................................................................................ 29 6.1
Glutáraldehiddel térhálósított filmek vizsgálata .................................................. 29
6.2
Ionos molekulával térhálósított filmek vizsgálata ................................................ 30
7
Összefoglalás ................................................................................................................ 32
8
Irodalomjegyzék ........................................................................................................... 35
3
2 Bevezetés A gyógyszeripari kutatások területén napjainkban nagy figyelem irányul a már meglévő gyógyszerek
formulázására.
A
különböző
típusú
hatóanyag-szállító
rendszerek
kidolgozásánál a legfőbb törekvés az, hogy a hatóanyag-leadás sebessége és helye a terápiás célt a lehető legjobban szolgálja. Ilyen kívánalom lehet az, hogy a hatóanyagleadás konstans sebességgel (szabályozott leadás), a beadás után közvetlenül (azonnali leadás), bizonyos idő elteltével (késleltetett leadás), vagy csak igen lassan (elnyújtott leadás) történjen. A leadás sebességét és helyét a hordozó rendszer szabályozza. A megfelelő hordozó kifejlesztésére alkalmas lehet egy biodegradábilis polimer kolloid mátrix rendszer (hidrogél), melynek tulajdonságait a térhálósítással kedvezően befolyásolhatjuk. Kísérleteimhez kitozán polimert használtam, a térhálósítást ionos és nemionos molekulákkal valósítottam meg. Kutatásom célja az volt, hogy rendszeres munka során megismerjem a térhálósítás körülményeinek, a térhálósító anyag fajtájának, a térhálósító és a duzzasztó közeg pHjának hatását az általam előállított kitozán filmek duzzadására. A kitozán duzzadási viselkedése egyik fő tényezője a gyógyszerhordozóként való alkalmazhatóságnak.
3 Irodalmi áttekintés 3.1 Hidrogélek Egyes polimerek megfelelő körülmények között képesek vizet felvenni, melynek során hidrogéllé alakulnak. A különleges szerkezet vázát fizikai vagy kémiai térháló által összetartott polimerláncok alkotják, az ezek közötti teret pedig víz tölti ki. A vázszerkezet visszatartja a vizet, a víz pedig nem engedi összeesni a vázat. Kedvező tulajdonságaik lehetővé teszik alkalmazásukat a gyógyászatban.
4
3.2 A kitozán A kitin és a kitozán (1. ábra) a cellulóztól egyetlen funkciós csoportjukban térnek el. A kitozán olyan természetes poliszacharid, melyet a bogarak, rákfélék stb. páncéljában előforduló kitinből állítanak elő dezacetilezéssel. A dezacetilezés sosem teljes, mértéke hatással van a kitozán tulajdonságaira, ugyanúgy, mint az átlagos molekulatömeg.
1. ábra: A cellulóz, a kitin és a kitozán szerkezete [1]
A
kitozán
biokompatibilis,
biodegradábilis,
nem
toxikus,
és
jó
adszorpciós
tulajdonságokkal rendelkezik, ezért kiválóan alkalmas funkcionális anyagok előállítására. Híg savakban, például ecetsavban és hangyasavban könnyen oldódik. Az aminok jellegzetes reakcióit mutatja, ezek közül a legfontosabbak az N-acilezés és a Schiff-bázis képzés. Alkalmazása rendkívül széles körű. Kelátképző tulajdonsága miatt képes megkötni a mérgező nehézfémeket, például a higanyt, a nikkelt és a kadmiumot, ez lehetővé teszi használatát a szennyvíztisztításban.
5
A kedvező biológiai tulajdonságok miatt az orvostudomány is nagy érdeklődést mutat a kitozán iránt. A belőle készült szálak ellenállók az epével, a vizelettel és a szövetközi nedvekkel szemben, ami a korábban alkalmazott felszívódó varratokkal szemben előnyt jelent. Antibakteriális és gombaölő hatása miatt előszeretettel használják kozmetikumok, pl. testápolók, krémek, körömlakkok adalékolására. A protonált aminocsoport kötést létesít a mikroorganizmusok alkotóinak anionos csoportjával, ami meggátolja a szaporodásukat. A kitozán rendelkezik az eddig említetteken kívül minden olyan kedvező tulajdonsággal (optikai tisztaság, mechanikai stabilitás, nedvesedés stb.), ami lehetővé teszi, hogy kontaktlencséket készítsenek belőle. A kitozán zsírmegkötő hatása sem elhanyagolható: képes kötést létesíteni vele a gyomorban még mielőtt az megemésztődne, ezzel megakadályozza a felszívódását a béltraktusban. Az így megkötött zsírok természetes módon ürülnek ki a szervezetből. A pH-érzékeny hidrogélek alkalmazhatók szabályozott hatóanyag-leadó rendszerek mátrixaként. [1] A kutatások során úgy találták, hogy a hatóanyag-leadási tulajdonságokat jelentősen befolyásolta a kitozán dezacetilezési foka, a nagyobb mértékben dezacetilezett kitozán erősebben tudta megkötni a hatóanyagot. [2]
3.3 Térhálósítás A kitozán az aminocsoport reaktivitásának köszönhetően megfelelő körülmények között könnyen térhálósodik. 3.3.1 Térhálósítás ionos mechanizmussal Mivel a kitozán aminocsoportja savas, semleges és gyengén lúgos közegben protonálódik, ilyen körülmények között képes reverzibilis kötést létesíteni negatív töltésű molekulákkal, például nátrium-citráttal. (2. ábra)
6
2. ábra: Keresztkötésű kitozán polimer; +: a kitozán protonált aminocsoportjai; -: az anionos térhálósító anyag [3]
A kitozán hidrogélekben a keresztkötést kialakító molekula moláris tömege sokkal kisebb kell legyen, mint a kitozáné, így a polimerláncok közel kerülnek egymáshoz. Az ionos térhálósítószerek előnye a kovalens kötést létesítőkkel szemben, hogy maradványaik könnyen eltávolíthatók, ezzel jelentősen csökkentve a rendszer toxicitását. Fémionokkal (pl. Ca2+) kelát képződik, itt az összetartó erők nagyobbak, mint az anionos anyagokkal képzett elektrosztatikus kölcsönhatások esetén. Egyes esetekben a lánc hidroxilcsoportjai is részt vehetnek a keresztkötések kialakításában. [3] Térhálósítás során fontos szerepe van a közeg pH-jának. Mivel a kitozán 4-es pH-nál savasabb közegben feloldódik, pH=8-nál pedig szinte teljesen elveszíti a töltését, ezért a reakciót a köztes tartományban kell végezni.
7
3.3.1.1 Trinátrium-citrát (C) A trinátrium-citrát a háromértékű citromsav nátriummal alkotott sója. Biokompatibilis, az élelmiszeripar előszeretettel használja ízesítőszerként, savanyúságot szabályozó szerként és antioxidánsként. [4]
3. ábra: A citromsav szerkezete és disszociációs állandói
A 3. ábrán a citromsav kémiai képletét és a disszociációs egyensúlyi állandók logaritmusát tüntettem fel. A kitozán és a nátrium-citrát ionizációs fokának pH-függését a 4. ábra szemlélteti. A két görbe pH=6 közelében metszi egymást, ennek környezetében mindkét függvény meredeken csökken, vagyis maximális számú keresztkötés kialakításához célszerű a térhálósítást ~6-os pH-jú közegben végezni.
4. ábra: Nátrium-citrát és kitozán ionizációs fokának pH-függése [5]
A nátrium-citráttal térhálósított filmeket az eddigi kutatásokban riboflavin, teofillin és 5fluorouracil szabályozott leadására használták. [5]
8
3.3.1.2 Nátrium-tripolifoszfát (TPP) A nátrium-tripolifoszfát az ötértékű trifoszforsav (H5P3O10) nátriummal alkotott sója. Az élelmiszeriparban pufferként, stabilizátorként, valamint víz megkötésére alkalmazzák. Tengerből származó húsok (pl. halak) esetén használata korlátozott, mert megnöveli az élelmiszer víztartalmát, ami súlynövekedést okoz. [4] A háztartásban áztatószerként ill. vízlágyítóként alkalmazzák. Vizes oldatának lúgos kémhatása miatt eredményesen használható a zsíros anyagokkal szennyezett textíliák mosásánál. [6] A TPP a biokémiai folyamatokban nélkülözhetetlen szerepet tölt be. Az adenozinhoz kapcsolódva adenozin-5’-trifoszfátot (ATP) alkot, ami a sejten belüli energiaátvitel legkisebb egysége. Az energia a trifoszfát-csoport foszforatomjai közötti kötésben raktározódik el.
5. ábra: A trifoszforsav szerkezete
A trifoszforsav pKa értékei: pKa,1=1; pKa,2=2; pKa,3=2,79; pKa,4=6,47, pKa,5= 9,24. [7]
9
A térhálósítás közegének pH-ja akkor optimális, ha mindkét komponens (kitozán és TPP) megfelelően ionizált formában van jelen. A 6. ábra szerint ez a tartomány a TPP esetén is pH=6 környezetében található.
6. ábra: Na-tripolifoszfát és kitozán ionizációs fokának pH-függése [7]
A TPP-vel térhálósított kitozán filmeket az eddigi kísérletek alapján a klórfeniramin-maleát és a guaifenezin szabályozott leadására találták alkalmasnak. [5] A TPP alkalmas térhálós kitozán gömbök létrehozására úgy, hogy a kitozán oldatot lassan a térhálósító oldatba csepegtetik. Azt tapasztalták, hogy az így előállított minták mechanikai szilárdsága nagyon gyenge, ami korlátozza a hatóanyag-hodozóként történő felhasználás lehetőségeit. [8]
10
3.3.1.3 Duzzadás A duzzadást legfőképpen a kitozán láncok közötti ionos kölcsönhatások befolyásolják. Minél nagyobb a kölcsönható ionok száma, annál nagyobb a térhálósűrűség.
A
térhálósűrűség növekedésével csökken a duzzadás mértéke és a pH-érzékenység, megnő a rendszer stabilitása, ami csökkent (lassított) hatóanyag-leadást eredményez. Az ionos kötéssel térhálósított kitozán hidrogélek nemcsak savas, hanem lúgos közegben is jelentős mennyiségű folyadék felvételére képesek. A pH csökkenésével az aminocsoportok protonálódnak, a térhálósítószerrel reverzibilis kötéseket képeznek, a szabadon maradó protonált aminocsoportok taszítják egymást, a láncok tehát eltávolodnak egymástól, az így keletkezett térrészbe pedig bejutnak a duzzasztó közeg molekulái (7. ábra). Túl savas közegben a protonálódás a teljes láncra kiterjed, végül pedig az egész kitozán molekula feloldódik, még a térhálósító anyag jelenlétében is. [3]
7. ábra: Ionosan térhálósított kitozán polimer duzzadási tulajdonságainak pH-függő viselkedése [3]
11
3.3.2 Térhálósítás kovalens kötés létrehozásával 3.3.2.1 Glutáraldehid (GA) A térháló létrehozásának másik lehetősége elsőrendű kémiai kötések létrehozása a polimerláncok és egy többfunkciós molekula között. A kitozán polimer önmaga is egy fizikai térhálóval összetartott rendszer. Ha van olyan aminocsoport, ami nem protonálódott (és mindig van ilyen), akkor annak hidrogénje a szemközti hidroxilcsoport oxigénjével hidrogénkötést létesít (8. ábra). Ennek a kölcsönhatásnak a valószínűsége a pH csökkenésével (-NH3+-csoportok számának növekedésével) együtt csökken.
8. ábra: H-kötésekkel térhálósodott kitozán molekulák [3]
Létrehozhatók hibrid rendszerek, amelyekben a kitozánhoz egy másik polimert (pl. zselatint) kevernek. A polimerláncok között az elsődleges (kovalens) kötések dominálnak, de pl. a kitozán-zselatin rendszerben erős másodrendű kötéseket is felfedeztek. A kitozánláncok közötti kapcsolat kiépíthető kismolsúlyú molekulák, pl. dialdehidek segítségével is. Az aldehidcsoportok a kitozán aminocsoportjával Schiff-bázist képeznek, végül iminkötés jön létre köztük (9. ábra). A reakció segédanyagok nélkül, vizes közegben is végbemegy, ami a biokompatibilitás szempontjából nagyon fontos. A dialdehidek azonban gyakran mérgezőek (pl. a glutáraldehid közepesen erős idegméreg), ezért a felhasználás előtt a szabad aldehidmaradékot alaposan ki kell mosni. Teljesen azonban lehetetlen, és ez egyelőre gátat szab az alkalmazásnak. 12
A kovalens keresztkötés állandó vázat biztosít (kémiai térháló), ami még lehetővé teszi a víz szabad diffúzióját a szerkezetbe, és javítja a mechanikai stabilitást is. Az így előállított rendszer tulajdonképpen porózus anyagként viselkedik, ennek köszönhetően a hatóanyag-hordozóként történő felhasználáskor a hatóanyag szabadon diffundál ki belőle. A térhálósodás fokára és a pórusméretre a duzzadási tulajdonságokból következtethetünk. A
kevéssé
térhálós rendszerek
szuperadszorbens
hidrogélként
viselkednek,
a
keresztkötések sűrűségének növekedésével csökken a duzzadási fok és a háló „pórusmérete”. A térhálósítószer koncentrációjának növelése csökkenti a kitozán és a vízmolekulák között létrejövő hidrogénkötés kialakulásának valószínűségét. Minél kisebb a térhálósűrűség, annál hosszabb a polimerláncok relaxációs ideje, ami lassított hatóanyag-leadást jelent. [3]
9. ábra: Térhálósítási reakció glutáraldehiddel [9]
13
A kísérleteimhez kiválasztott anyagokat (C,TPP,GA) gyakran használják a kitozán térhálósításához, de az irodalomban szereplő cikkekben leginkább a kitozán gyöngyök és nanorészecskék
preparációjához használt komponensként említik.
Ezekben a
munkákban a figyelem az előállított makro-, mini- és nanogyöngyök hatóanyag-leadó képessége felé irányul, kevesebb figyelmet fordítottak a térhálósítást befolyásoló paraméterek hatásának tanulmányozására.
14
4 Kísérleti rész 4.1 Anyagok és vizsgálati eszközök 4.1.1 A kísérletekhez felhasznált anyagok •
Kitozán (közepes mólsúlyú, 98% dezacetilezési fokú, 522 cps viszkozitású; Aldrich)
•
Ecetsav (100%; Merck)
•
Desztillált víz
•
Foszfát-puffer (0,1 M NaH2PO4 + 0,1 M Na2HPO4 , Merck)
•
Na-acetátos puffer (0,2 M Na-acetát + 0,2 M ecetsav (Merck))
•
Glutáraldehid (50%; Merck)
•
trinátrium-citrát (at., Reanal), a továbbiakban citrát, vagy nátrium-citrát
•
pentanátrium-tripolifoszfát (Reanal)
4.1.2 A kísérletek során alkalmazott vizsgálati eszközök •
Kézi pH-mérő készülék (ADWA A11)
•
Analitikai mérleg (Ohaus Explorer)
•
SEM (BAL TEC SCD 005 sputter coater; Philips XL30 FEG ESEM)
4.2 Kitozán filmek előállítása 1. A 100%-os ecetsavat 1%-ra hígítottam. 2. Az 1%-os ecetsav 250 ml-jében feloldottam 2,5 g kitozánt → 1 m/V%-os kitozán oldat. 3. 20 percig kevertettem mágneses keverőn, majd fóliával lefedve legalább 24 órán át állni hagytam. 4. A teljes oldódás után az oldat 20 ml-jét Petri-csészébe öntöttem, ügyelve arra, hogy buborékmentes legyen. 5. Szükség esetén az oldatot 2-3 percig ultrahangoztam, hogy a buborékok eltávozzanak. 6. A Petri-csészéket vízszintes felületre helyeztem, és minimum 2 napig szobahőmérsékleten (kb. 25 oC) szárítottam.
15
4.3 Filmek térhálósítása 4.3.1 Térhálósítás trinátrium-citráttal A kitozán filmet feldaraboltam, és analitikai mérlegen lemértem. Elkészítettem a térhálósítószer megfelelő koncentrációjú oldatát (1-10 m/V%), majd annak 30 ml-ébe belehelyeztem a mintát úgy, hogy az a minta teljes felületét nedvesítse. Az oldat pH-ját a kísérletek többségében pH=6-ra állítottam be 20%-os ecetsavval, a többi esetben a reakció 8 körüli pH-értéken játszódott le. A térhálósítást 45 percig végeztem, ezután a filmeket csipesszel kiszedtem, desztillált vízzel leöblítettem, végül papírvattával leitattam, és azonnal lemértem mérlegen. Száradás után a tömegmérést újból elvégeztem.
4.3.2 Térhálósítás pentanátrium-tripolifoszfáttal (TPP) A TPP-ből 1 m/V% és 3m/V%-os oldatot készítettem, majd a fent említett módszerrel előkészített mintát az előzőekhez hasonlóan belemártottam az így elkészített oldatok 30-30 ml-ébe. A pH-t itt is 20%-os ecetsavval állítottam be pH=6-ra. A térhálósítási időt 30 percnek választottam. Ennek letelte után a mintákat kiszedtem, leöblítettem, leitattam a felesleges vizet, végül lemértem a tömegét. A tömegmérést száradás után megismételtem.
4.3.3 Térhálósítás glutáraldehiddel (GA) 4.3.3.1 Térhálósítás filmképzés után Az 50%-os glutáraldehidből hígítással 0,1-5% közötti koncentrációjú oldatokat készítettem. A feldarabolt és lemért filmeket 30 ml oldatba helyeztem, és 48 órán át áztattam. Ezután kivettem, desztillált vízzel öblítettem, papírvattával leitattam, azonnal lemértem, majd száradás után ismét megmértem a tömegét. 4.3.3.2 Térhálósítás filmképzés előtt Az 1%-os kitozán oldat 20-20 ml-éhez rendre 1,3 ml, 1 ml, 0,8 ml 1%-os glutáraldehidoldatot adtam, majd 1 órán át mágneses keverőn kevertettem. Ezután az oldatokat Petricsészébe öntöttem, és szobahőmérsékleten pihentetve 2-3 nap alatt kiszárítottam. A
16
száraz filmekben így a kitozán:glutáraldehid tömegarány 15:1, 20:1, 25:1-nek adódott. A preparációhoz Feng et al. [10] receptjét vettem alapul.
4.4 Térhálósítás kinetikájának vizsgálata A
lemért,
száraz
filmeket
2%-os
citrát-oldatban,
illetve
3%-os
TPP-oldatban
térhálósítottam, gyengén savas (pH=6) közegben. Az egyes mintákat különböző időpontokban (15 perc, 30 perc, 45 perc, 60 perc, 90 perc után) vettem ki, analitikai mérlegen lemértem a (leitatás utáni) nedves tömeget, majd kiszárítás után megismételtem a tömegmérést. A térhálósítás közben felvett térhálósítószer mennyiségét a kezdeti tömegre vonatkoztatott tömegváltozással (%) jellemeztem, amit a következőképpen számítottam (1): ∆m(%) =
mvégső , száraz − m kez det i , száraz m kez det i , száraz
⋅ 100
(1)
4.5 Térhálósított filmek duzzadási vizsgálata A minták duzzasztását minden esetben 25 ml duzzasztószerben végeztem, 30 percen keresztül. Az emberi szövetek eltérő pH-jának modellezésére a filmek duzzadási tulajdonságait a 4 és 8 közé eső pH-tartományban vizsgáltam. Ehhez eltérő összetételű puffereket használtam (1.táblázat): 1. táblázat: A felhasznált pufferoldatok összetétele
100 ml puffer összetétele Puffer pH-ja
0,2 M Na-acetát törzsoldat (ml)
0,2 M Ecetsav törzsoldat (ml)
0,1 M NaH2PO4 törzsoldat (ml)
0,1 M Na2HPO4 törzsoldat (ml)
4
15,3
84,7
-
-
5
64,3
35,7
-
-
6
94,8
5,2
-
-
7,2
-
-
28,0
72,0
8
-
-
5,3
94,7
17
A filmet a pufferoldatba helyeztem, 30 perc múlva csipesszel kiszedtem, desztillált vízzel leöblítettem, a felesleges vizet leitattam, végül analitikai mérlegen azonnal lemértem. A mintákat újra kiszárítottam szobahőmérsékleten, és ismét lemértem a tömegüket szárazon. A duzzadás mértékét a duzzadásfokkal jellemeztem, amit a duzzasztás (és leitatás) utáni nedves tömeg és a kezdeti száraz tömeg hányadosaként határoztam meg.
18
5 Kísérleti eredmények, értékelés 5.1 Ionos térhálósítószerrel preparált filmek 5.1.1 Nátrium-citráttal térhálósított filmek 5.1.1.1 Térhálósodás pH-függése Az első kísérletemben 1, 2, 5 és 10 m/V%-os citrát oldatban térhálósítottam a filmeket 45 percen keresztül. Két sorozatot mértem: az első sorozatban (C6) a citrát-oldat pH-ját ecetsavval pH~6 értékre állítottam be, a második sorozatban (C8) az citrát-oldat eredeti, 8-as pH-ján végeztem a térhálósítást. A térhálósítás közben felvett térhálósítószer mennyiségét a 4.4 fejezet (1) képlet szerint számítottam, majd megmértem a térhálósított filmek duzzadását 7,2 pH-jú pufferben. A mért adatokat a 2. és 3. táblázat tartalmazza. A közölt adatok átlagtól való eltérése 10% alatti.
2. táblázat: A C6-os sorozat mérési körülményei és a számított duzzadásfok és tömegváltozás
Citrát koncentrációja
Térhálósítás pH-ja
1% 2% 5% 10%
6,2 6,2 5,8 5,5
Duzzadásfok (pH=7,2) 3,47 2,95 3,72 3,07
Tömegváltozás (%) 19,5 14,6 24,9 25,2
3. táblázat: A C8-as sorozat mérési körülményei és a számított duzzadásfok és tömegváltozás
Citrát koncentrációja
Térhálósítás pH-ja
1% 2% 5% 10%
8,3 8,3 8,5 8,5
Duzzadásfok (pH=7,2) 4,19 3,49 3,79 2,99
19
Tömegváltozás (%) 0 4,0 10,5 23,6
4,4 C8 4,2
C6
Duzzadásfok
4 3,8 3,6 3,4 3,2 3 2,8 0%
2%
4%
6%
8%
10%
12%
Nátrium-citrát koncentrációja (m/V%)
10. ábra: Eltérő pH-n térhálósított filmek duzzadásának (pH=7,2 pufferben) függése a nátrium-citrát koncentrációjától
A 2.és 3. táblázat adatait a 10. és 11. ábra grafikonjain is bemutatom. A 10. ábrán látható, hogy a duzzadásfok a nátrium-citrát koncentrációjának függvényében olyan görbét ad, melynek lokális minimuma van. A koncentrációskálát két tartományra osztottam, 5%-nál kisebb illetve nagyobb koncentrációkra. Az 5% alatti koncentrációknál a C6-os görbe végig a C8-as alatt fut, ami igazolja az előzetes feltételezést, mely szerint pH=6-os közegben a kitozán és a citrát megfelelő ionizációs foka miatt sűrűbb térháló tud kialakulni, mint pH=8 körülmények között, ahol a kitozán már szinte teljesen semleges (4. ábra). 5% feletti koncentrációnál a duzzadásfok ismét lecsökkent, a C6 és C8-as minták duzzadása közel volt egymáshoz. 2%-os citrát koncentrációnál minimum alakult ki, ami arra utal, hogy ilyen körülmények között az ionos keresztkötések kialakulásának feltételei optimálisak. Nagyobb citrát koncentrációnál egyéb tényezők is befolyásolhatják a duzzadást, például a sókoncentráció növekedésével az elektrosztatikus erők leárnyékolódnak, ami a kitozán lánc és a negatív töltésű ionok közötti sókötést gyengíti, és ez a duzzadás növekedését idézheti elő.
20
30,0
Tömegváltozás (%)
25,0 20,0 C8 15,0 C6 10,0 5,0 0,0 0%
2%
4%
6%
8%
10%
12%
Citrát koncentráció (m/V%)
11. ábra: Különböző pH-n térhálósított filmek térhálósítás során bekövetkező tömegnövekedése
A 11. ábrán a filmek térhálósítás során bekövetkező tömegváltozását ábrázoltam a térhálósítószer koncentrációjának függvényében. Szembetűnő a görbék alakjának különbsége.
Látható
és
könnyen
értelmezhető,
hogy
a
térhálósítás
okozta
tömegnövekedés a C6 mintánál csaknem a teljes koncentráció tartományban jóval nagyobb, mint a C8 minták esetében, ahol a kitozán disszociációs foka kisebb, ami a citrátionok megkötődésének nem kedvez. A C6-os görbén 2%-os koncentrációnál jelentkező minimális tömegváltozás ellentmondani látszik az ugyanitt tapasztalt minimális duzzadásnak, hiszen azt várjuk, hogy nagyobb térhálósűrűség eléréséhez több térhálósítószernek kell beépülnie. A valóságban azonban a polimerbe bediffundáló ionoknak csak egy része létesít a láncok között ionos kötést, bizonyos hányada más, ezidáig nem tisztázott mechanizmussal kötődhet. Az az eredmény, hogy a 2% citrát koncentrációnál a C6 minta a legkisebb citrátfelvétel mellett (11. ábra) a legnagyobb térhálósítási fokot (legkisebb duzzadási fok) (10. ábra) éri el, összhangban van azzal a feltételezéssel, hogy a térhálósítási körülmények 2% citrát koncentrációnál optimálisak. Itt ugyanis a legkevesebb citrátmennyiséggel a legsűrűbb térháló valósulhat meg.
21
A C8-as görbe monoton növekvő, ami a film belseje és az oldatok közötti koncentrációgradiens növekedése miatt lehetséges. Nagyobb citrát koncentrációknál a kitozán és az oldat közötti nagyobb koncentrácógradiens miatt több citrát diffundált a hidrogélbe, azonban ennek csak egy része lépett kölcsönhatásba a kitozánnal, a maradék szabadon maradt. 5.1.1.2 Duzzadásfok függése a pH-tól A második kísérletsorozatban azonos körülmények (25 oC; 2% citrát oldat; pH=6; 45 perc) között térhálósított filmeket duzzasztottam eltérő pH-jú pufferoldatokban. Az eredményeket a 2. táblázat és a 12. ábra mutatja. 2. táblázat: Citráttal térhálósított filmek duzzadásfoka különböző pH-jú duzzasztószerekben
Térhálósító közeg pH-ja
Duzzasztó közeg pH-ja
Duzzadásfok
6,1 ± 0,1
3,8 4,8 6,0 7,1 8,0
4,38 3,26 2,69 2,99 5,92
A mérési pontokat ábrázolva minimumos görbét kaptam, a legkisebb duzzadást pH=6-nál tapasztaltam, a legnagyobbat pedig pH=8-nál. 6-os pH esetén a kitozán és a citrát funkciós csoportjainak nagy része ionizált formában van jelen (4. ábra), ezért a köztük kialakított kölcsönhatások nem szűnnek meg, ettől eltérő pH esetén azonban, ahogy a reagálni képes funkciós csoportok száma csökken, a térhálósűrűség csökken, vagyis a duzzadásfok nő.
22
7 6
Duzzadásfok
5 4 3 2 1 0 3,6
4,6
5,6
6,6
7,6
8,6
pH 12. ábra: Nátrium-citráttal térhálósított filmek duzzadásfokának függése a duzzasztó közeg pH-jától
Különösen nagy ugrás volt tapasztalható 7,2-es és 8-as pH között, ami hatóanyaghordozóként történő felhasználáskor jól kihasználható.
5.1.2 Nátrium-tripolifoszfáttal térhálósított filmek A TPP-vel végzett kísérletem célja a TPP-koncentráció duzzadásra kifejtett hatásának vizsgálata volt. A filmeket 25oC-on térhálósítottam pH=6 közegben, 30 percen keresztül, majd a kiszáradt mintákat különböző pH-jú közegben duzzasztottam. Az eredményeket a 3. táblázatban foglaltam össze. 3. táblázat: TPP-vel térhálósított filmek duzzasztásához használt pufferek pH-ja és a számított duzzadásfokok
TPP koncentráció
Puffer pH-ja
duzzadásfok
1%
6,0 7,2 8,1
2,24 2,92 4,38
TPP koncentráció 3%
23
Puffer pH-ja duzzadásfok 6,0 7,2 8,1
2,37 3,15 4,98
A mért duzzadásfokokat a duzzasztó közeg pH-jának függvényében ábrázoltam (13.ábra), így két monoton növekvő, egymást nem metsző görbét kaptam.
5,5 5
Duzzadásfok
4,5 4 3,5 3
TPP1 TPP3
2,5 2 5,5
6,0
6,5
7,0
7,5
8,0
8,5
pH 13. ábra: 1%-os (TPP1), illetve 3%-os (TPP3) TPP-oldatban térhálósított filmek duzzadásának pH-függése
A 6. ábra alapján érthető, hogy a nagyobb pH-k tartományában a kitozán kisebb ionizációs foka miatt kisebb lesz térhálósűrűség, tehát nagyobb duzzadás mérhető. A TPP3-as görbe végig a TPP1-es felett fut. Az eredmények arra utalnak, hogy az ilyen körülmények között elérhető maximális térhálópont létrehozásához elegendő az 1%-os koncentráció is. Azt feltételezem, hogy 3%-os koncentrációnál a nagyobb duzzadás sztérikus hatások (pl. a kitozánhoz kapcsolódott TPP nem reagált, negatív töltésű csoportjainak taszításának) következménye.
24
5.1.3 Térhálósítás kinetikájának vizsgálata A térhálósítást térhálósítószerenként azonos körülmények között végeztem. A filmek tömegnövekedését az eltelt idő függvényében ábrázoltam.
30
Tömegnövekedés (%)
25 20 15 10
TPP3 C2
5 0 0
20
40
60
80
100
t (min) 14. ábra: A térhálósítás kinetikája 2%-os citráttal (C2) és 3%-os TPP-vel (TPP3)
A 14.ábrán látható, hogy a TPP-ben térhálósított filmek relatív tömegnövekedése nagyobb, mint a citráttal térhálósítottaké, illetve, hogy TPP-ben a maximális tömeg eléréséhez lényegesen kevesebb időre (30 percre) volt szükség, míg a citrát esetén még 60 perc után is nőtt néhány tized %-ot a tömeg, azonban ez már nem jelentős növekedés. A kinetikai vizsgálatok célja a megfelelő térhálósítási idő meghatározása volt. Ezt a nátrium-citráttal történő térhálósításhoz 45 percnek, TPP esetében pedig 30 percnek választottam.
25
5.2 Kovalens kötéssel térhálósított filmek 5.2.1 Térhálósítás glutáraldehidben, bemártással Kezdetben a glutáraldehiddel történő térhálósítást ugyanúgy próbáltam megvalósítani, mint az ionos molekulákkal, vagyis a kiszárított, lemért filmeket 2 órára a GA-oldatba áztattam. Azt tapasztaltam, hogy a filmek felpöndörödtek, besárgultak, és annyira ridegek és törékenyek lettek, hogy lehetetlen volt csipesszel megfogni őket anélkül, hogy eltörnének. A reakciót a 0,01% és 5% közötti koncentrációtartományban valósítottam meg. A kisebb koncentrációk felé haladva a mechanikai tulajdonságok javultak, azonban még a legkisebb koncentrációnál sem tudtam megbízható méréseket végezni (nem tudtam minden filmről ugyanannyira leitatni a vizet, mert összepöndörödtek, nem szerkezeti vizet zártak magukba, ezzel meghamisítva a mérést). A módszer sikertelensége miatt a továbbiakban más technikával végeztem a térhálósítást.
5.2.2 Térhálósítás glutáraldehiddel, filmképzés előtt A továbbiakban a GA oldatot az ecetsavas kitozán oldathoz kevertem, ebből öntöttem filmet. A filmek ezúttal is besárgultak, de a korábbi módszerrel készült mintákhoz képest kiváló mechanikai tulajdonságokkal rendelkeztek, és ezek a későbbi duzzasztás során sem változtak meg jelentősen. Így tehát sikerült mérhetővé tennem a GA-del történő térhálósítás paramétereit. Ezen módszerrel előállított filmekben a térhálósodás filmképzéskor csak kis részben ment végbe, mert az ecetsavas közeg a kovalens keresztkötések létrejöttének nem kedvezett. A további térhálópontok akkor alakultak ki, amikor a filmet magasabb pH-jú duzzasztószerbe (pufferbe) helyeztem. A filmeket 4 és 8 közötti pH-tartományban duzzasztottam. A különböző pH-knál meghatározott duzzadásfokokat a glutáraldehid koncentrációjának függvényében a 15. ábrán ábrázoltam.
26
pH=3,8 7
pH=4,9 pH=5,8
6
Duzzadásfok
pH=7,2 5
pH=8,1
4 3 2 1 3,5%
4,0%
4,5%
5,0%
5,5%
6,0%
6,5%
7,0%
Glutáraldehid koncentrációja (m/V%)
15. ábra: A térhálósítószer koncentrációjának hatása a duzzadásra GA-del térhálósított filmeknél.
A nagyobb koncentrációk felé haladva a különböző pH-n tapasztalt duzzadásfokok közötti különbség fokozatosan csökkent. A legkisebb duzzadást minden koncentrációnál pH=8,1 közegben mértem. Ennek az az oka, hogy a polimerláncok közötti kovalens kötések létrejöttéhez protonálatlan aminocsoportokra van szükség, amiből magasabb pH-n van több. A mérések alapján azt is megállapítottam, hogy enyhén lúgos közegben a GA koncentrációjától már csak nagyon kis mértékben függ a térhálósűrűség.
27
A duzzadásfokot ábrázoltam a pH függvényében is (16. ábra). Itt még inkább látszik, amit az imént megállapítottam, vagyis, hogy kellően nagy koncentrációban alkalmazott GA-del olyan filmek hozhatók létre, melyek duzzadása a közeg pH-jától csak viszonylag kis mértékben függ.
Duzzadásfok
8 7
6,60%
6
4,70% 3,80%
5 4 3 2 1 3,5
4,5
5,5
6,5
7,5
8,5
pH
16. ábra: A duzzasztó közeg pH-jának hatása a duzzadásfokra különböző koncentrációjú GA-del térhálósított filmeknél
28
6 Morfológiai vizsgálatok 6.1 Glutáraldehiddel térhálósított filmek vizsgálata A következő felvételek (17. ábra, 18. ábra) pásztázó elektronmikroszkóppal készültek, a különböző módszerrel térhálósított filmek töretfelületét mutatják. Mivel a szabványos mintaelőkészítéshez nem álltak rendelkezésemre megfelelő eszközök, ezért a filmeket csipesz segítségével törtem el, így a felvételek magukban hordozzák a kismértékben eltérő mintaelőkészítés bizonytalanságát.
17. ábra: Glutáraldehiddel filmképzés után (a) és filmképzés előtt (b) térhálósított filmek keresztmetszetének SEM felvétele
29
A 17. ábrán a filmképzés után (a,), illetve filmképzés előtt (b,) glutáraldehiddel térhálósított kitozán filmek elektronmikroszkópos képe látható. A filmképzés után (bemártással) térhálósított mintán két, egymástól eltérő töretfelületű fázis figyelhető meg (1 és 2), míg a filmképzés előtt térhálósított mintán ilyen szerkezeti inhomogenitás nem látható. Feltételezésem szerint a töretfelület morfológiája egyértelműen függ az anyag szerkezetétől a vizsgált helyen, azaz a kissé különböző szerkezetű fázisok egymástól eltérően fognak szakadni vagy törni. Ebből arra következtettem, hogy a filmkészítés módszere jelentősen befolyásolhatja az anyagszerkezetet.
6.2 Ionos molekulával térhálósított filmek vizsgálata A kéregképződésről alkotott elméletet alátámasztani látszanak a filmek szakított, keresztmetszeti felületéről készített elektronmikroszkópos felvételek.
18. ábra: 3% TPP-vel (a) és 2% nátrium-citráttal (b) térhálósított filmek töretfelületének SEM felvételei.
30
A 18. ábrán a 3% TPP-vel (a,) és a 2% nátrium-citráttal (b,) térhálósított filmek töretfelülete látható. A 18. a, képen a 2-essel jelölt réteg homogénnek látszik, szerkezetében azonban eltér az 1-essel jelölttől. A 18. b, ábrán az 1-es és 2-es rétegek között szintén felfedezhető morfológiai különbség. Feltételezésem szerint a felülethez közeli illetve a tömbi szerkezet közötti különbség oka a bemártásos térhálósítási módszer közben fellépő kéregképződés. A bediffundáló térhálósítószer molekulái a felületközeli kitozán molekulákkal reakcióba lépnek, aminek hatására olyan (kevéssé porózus) kéreg keletkezik, amely a későbbiekben lassítja (vagy gátolja) a térhálósító anionok diffúzióját a film belsejébe.
31
7 Összefoglalás A szakdolgozatom témája térhálósított kitozán filmek előállítása és duzzadási tulajdonságainak vizsgálata. Kísérleti munkám célja az volt, hogy rendszeres vizsgálatok során megismerjem a térhálósító anyag fajtájának, a térhálósítás körülményeinek, a térhálósító és duzzasztó közeg pH-jának hatását a kitozán filmek duzzadására. A kitozán, amely aminocsoportot tartalmazó lineáris poliszacharid, egyik fontos felhasználási területe a gyógyszeripar, ahol hatóanyag-hordozóként használják. Ehhez olyan mátrixot kell létrehozni, amelyből a hatóanyag csak a célba juttatás után, és a megfelelő sebességgel diffundál ki. A szabályozott leadáshoz szükséges szerkezet a kitozán molekulák térhálósításával befolyásolható. A duzzadási viselkedés az egyik fő tényező a gyógyszerhordozóként való alkalmazásnál. A filmek térhálósításához három térhálósítószert választottam: két a polimer lánccal ionos kölcsönhatás kialakítására képes anyagot, trinátrium-citrátot (C) és a nátriumtripolifoszfátot (TPP), illetve kovalens kötéseket létrehozó glutáraldeidet (GA). Az ionos molekulák gyengén savas (pH=6) közegben képesek sűrű térháló létrehozására, a glutáraldehiddel való reakciónak az ennél lúgosabb közeg kedvez. A kutatásaim során közepes mólsúlyú kitozánból filmet öntöttem, majd a kiválasztott kismólsúlyú anyagokkal térhálósítottam. A térhálós filmeket duzzadási vizsgálatoknak vetettem alá, ehhez Na-acetát/ecetsav, illetve Na2HPO4/NaH2PO4 puffereket használtam. A citráttal térhálósított filmek duzzadása nagymértékben függött a duzzasztó közeg és a térhálósítószer oldatának pH-jától, illetve a citrátkoncentrációtól. Tapasztalataim szerint a kísérleti körülmények gyengén savas (pH=6) közegben 2% citrátkoncentrációnál voltak optimálisak. A TPP-vel való kísérletek folyamán megállapítottam, hogy a térhálósodás viszonylag gyorsan végbemegy, és az adott körülmények között kialakítható maximális térhálósűrűség eléréséhez elegendő az 1%-os koncentrációjú TPP oldat is. Az így előállított filmek felhasználása hasonló lehet, mint a citráttal előállított filmeké, mert a TPP-vel térhálósított filmek duzzadása is hasonló mértékben pH-függő.
32
A glutáraldehiddel térhálósított filmek esetén a tulajdonságokat már az előállítás módszere is meghatározza. A filmképzés után térhálósított minták a GA széles koncentráció tartományában kedvezőtlen mechanikai tulajdonságokat mutattak, ami lehetetlenné tette a pontos tömegmérést. Új preparációs módszert választottam, melynek során a kitozán-oldathoz filmképzés előtt kevertem hozzá a GA-et. A filmképzés előtt térhálósított filmek duzzadása megfelelően nagy glutáraldehid-koncentrációnál már csak viszonylag kis pH-függést mutatott, ami lehetővé teszi az elnyújtott hatóanyag-leadás megvalósítását
szinte
bármilyen
közegben.
Alkalmazhatóságukat
korlátozza
a
glutáraldehid toxicitása, amely azonban több tisztítási lépésen keresztül megszüntethető. A pásztázó elektronmikroszkópos morfológiai vizsgálatok azt mutatták, hogy az esetek többségében a térhálósítás során a filmek felületén kéreg képződik. Ez lassítja a térhálósodást. A térhálósítószer bevitelének módja meghatározza a szerkezet tulajdonságait: a filmképzés előtt megvalósított térhálósítás eredményeképpen homogén tömbi szerkezet alakult ki.
33
Köszönetnyilvánítás Köszöne[el tartozom témavezetőmnek, Dr. Hórvölgyi Zoltánnak és konzulensemnek, Dr. Kabai Jánosnének a szakmai irányításért, a rengeteg hasznos tanácsért, és nem utolsósorban kitartó türelmükért. Hálás vagyok Mártonné Pakai Mártának és a Kolloidkémia Csoport minden tagjának a sok segítségért és ötletért. Külön köszönöm Nagy Péternek és Májlinger Kornélnak, a BME-GÉK Anyagtudomány és Technológia Tanszék munkatársainak a SEM felvételek elkészítését. A dolgozathoz szükséges kutatást támogatta: Országos Tudományos Kutatási Alap (OTKA CK 78629) Nemzeti Fejlesztési Ügynökség (Társadalmi Megújulás Operatív Program, TÁMOP 4.2.1/B-09/1/KMR-2010-0002) Nemzeti Kutatási és Technológiai Hivatal (NKTH - A*STAR Kétoldalú TéT Pályázat, BIOSPONA).
34
8 Irodalomjegyzék 1. Kumar, Majeti N.V. Ravi. A review of chitin and chitosan applications. Reactive & Functional Polimers 46 (2000) 1-27. 2. Illum, Lisbeth. Chitosan and Its Use as a Pharmaceutical Excipient - Review. Pharmaceutical Research, Vol. 15. No. 9. 1998. 3. Berger, J. et al. Structure and interactions in covalently and ionically crosslinked chitosan hydrogels for biomedical applications. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics 57 (2004) 19-34. 4. http://www.food-info.net/. [Online] [Hivatkozva: 2010. december 11.] 5. Shu, X.Z. et al. Novel pH-sensitive citrate cross-linked chitosan film for drug controlled release International. Journal of Pharmaceutics 212 (2001) 19-28. 6. http://www.evmrt.hu. [Online] [Hivatkozva: 2010. december 11.] 7. X.Z. Shu, K.J. Zhu. The influence of multivalent phosphate structure on the properties of ionically cross-linked chitosan films for controlled drug release. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics 54 (2002) 235–243. 8. X.Z. Shu, K.J. Zhu. Controlled drug release properties of ionically cross-linked chitosan beads: the influence of anion structure. International Journal of Pharmaceutics 233 (2002) 217–225. 9. http://www.greenpharmacy.info. [Online] [Hivatkozva: 2010. december 12.] 10. Feng, Fang et al. In Vitro Biomineralization of Glutaraldehyde Crosslinked Chitosan Films. Journal of Wuhan University of Technology - Mater. Sci. Ed. (2005) Vol. 20. No. 2. 11. Kumar, Majeti N.V. Ravi. A review of chitin and chitosan applications. Reactive & Functional Polimers 46 (2000) 1-27. 12. Berger, J. et al. Structure and interactions in covalently and ionically crosslinked chitosan hydrogels for biomedical applications. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics 57 (2004) 19-34.
35
13. Shu, X.Z. et al. Novel pH-sensitive citrate cross-linked chitosan film for drug controlled release International. Journal of Pharmaceutics 212 (2001) 19-28.
36
