Tartalomjegyzék. I. Bevezetés és célkitűzések 3. II. Irodalmi áttekintés 6. III. Anyag és módszer 48

Tartalomjegyzék I. Bevezetés és célkitűzések

3

II. Irodalmi áttekintés

6

II. 1. A mikorrhiza-kapcsolatok általános jellemzése és típusai

6

II. 2. A mikorrhiza-kapcsolatok evolúciója

8

II. 3. Ektomikorrhiza-képző növény- és gombacsoportok

11

II. 4. Az ektomikorrhizák kialakulása és funkciója

12

II. 5. Az ektomikorrhiza-közösségek ökológiai jellemzői

14

II. 6. Az ektomikorrhiza-közösségek vizsgálatának módszerei

18

II. 6.1. Morfológiai-anatómiai vizsgálati módszerek II. 6.2. Molekuláris taxonómiai módszerek II. 6.3. A molekuláris módszerek ökológiai alkalmazásának általános korlátai II. 6.4. A kladisztika módszerei II. 7. A disszertáció szempontjából fontos gombacsoportok ektomikorrhiza-kapcsolatai II. 7.1. A tömlősgombák (Ascomycota) csoportjának képviselői II. 7.2. A Genea és a Humaria nemzetségek ektomikorrhizái II. 7.3. A Pachyphloeus nemzetség ektomikorrhizái II. 7.4. A tomentelloid ektomikorrhizák II. 7.5. A Lactarius-nemzetség ektomikorrhiza-kapcsolatairól

III. Anyag és módszer III. 1. A mintaterületek bemutatása III. 1.1. Az „Őserdő” erdőrezervátum III. 1.2. További mintaterületek

18 23 32 33 38 38 39 40 41 44 48 48 48 48

III. 2. A mintavétel és feldolgozás

49

III. 2.1 Az abundancia becslése

50

III. 3. Morfológiai-anatómiai vizsgálatok III. 3.1. Fénymikroszkópos módszerek III. 3.2. Hisztokémiai reakciók III. 3.3. Transzmissziós elektronmikroszkópia

50 50 51 51

III. 4. Morfometriai vizsgálatok

52

III. 5. A minták hosszú távú megőrzése

52

III.6. Herbáriumi minták, termőtestek

53

1

III.7. Molekuláris módszerek III.7.1. Mintavétel, DNS-kinyerés III.7.2. Polimeráz láncreakció (PCR) III.7.3. Szekvenálás

54 54 54 55

III. 8. Filogenetikai analízis

56

IV. Eredmények és értékelésük

58

IV. 1. A Humaria és Genea nemzetségek ektomikorrhizái IV. 1.1. Az ektomikorrhizák közös morfológiai és anatómiai bélyegei IV. 1.2. Filogenetikai kapcsolatok IV. 1.3. Morfometriai analízis IV. 1.4. Értékelés

59 59 61 64 67

IV. 2. A Pachyphloeus-Amylascus leszármazási vonal rokonsági körébe tartozó fajok ektomikorrhizái

71

IV. 2.1. A P-Mt 1. ektomikorrhiza részletes morfológiai-anatómiai jellemzése IV. 2.2. A három ektomikorrhiza-morfotípus közti különbségek IV. 2.3. Filogenetikai kapcsolatok IV. 2.4. Értékelés

71 73 74 77

IV. 3. A területen talált tomentelloid ektomikorrhizák

79

IV. 4. A terület ektomikorrhiza-közösségének további, azonosított komponensei

84

IV. 4.1. Clavulina-ektomikorrhizák IV. 4.2. Entoloma-ektomikorrhizák IV. 4.3. Inocybe-ektomikorrhizák IV. 4.4. Sebacina-ektomikorrhizák IV. 4.5. Tricholoma-ektomikorrhizák IV. 4.6. Tuber-ektomikorrhiza

85 86 91 94 96 98

IV. 5. Az idegen hifával kolonizált Lactarius ektomikorrhiza jellemzése

99

IV. 5.1. Az ektomikorrhiza részletes morfológiai-anatómiai jellemzése IV. 5.2. Filogenetikai kapcsolatok IV. 5.3. Az intracelluláris kolonizáló hifák jellemzése IV. 5.4. Értékelés

99 103 103 106

IV. 6. A mintaterület ektomikorrhiza-közösségének összehasonlító értékelése

110

V. Összefoglalás

113

VI. Summary

114

VII. Köszönetnyilvánítás

115

VIII. Felhasznált irodalom

116

IX. Függelék 2

I. Bevezetés és célkitűzések Az ektomikorrhiza-kapcsolatok intenzív kutatása csak a múlt század második felében indult meg annak ellenére, hogy létük már a 19. század második fele óta ismert (Frank és Trappe 2005). Az első időszakban a különböző ektomikorrhizák adott gomba- és növényfaj kapcsolatára jellemző morfológiájának és anatómiájának leírása, összegyűjtése zajlott. Miután a leggyakoribb ektomikorrhizák anatómiája ismertté vált, megkezdődhetett a típusok előfordulásának feltárása, a különböző természetes és mesterséges ökoszisztémák ektomikorrhiza-közösségeinek vizsgálata. Igen korán igazolttá vált, hogy az ektomikorrhizák szinte minden klimatikus öv erdeinek fő állományalkotó fafajaival együtt élnek, és nélkülözhetetlen szerepet töltenek be az életközösségekben. Bár az egyedi kapcsolatok élettani alapját a mikorrhizapartnerek közt zajló kölcsönös anyagátadás teremti meg (Smith és Read 1997), az ektomikorrhizák szerepe közösségi szinten ennél sokkal szerteágazóbb: mind a növénnyel, mind a gombával kölcsönhatásban álló egyéb populációk ökológiai viszonyait befolyásolja (van der Putten és mts. 2001), és egy közös élettani egységgé kapcsolja össze az életközösségek gombákkal mutualizmusban élő tagjait (Selosse és mts. 2006). Az ektomikorrhiza-közösségek szerepének feltárásával hamarosan azok gyakorlati felhasználására is sor került. A mezőgazdaság mellett elsősorban a természetközeli erdőgazdálkodás számára nyújtott alkalmazási lehetőséget kell kiemelni (Martin és mts. 2005): mikorrhiza oltóanyagok felhasználásával és mesterségesen, faiskolákban mikorrhizált facsemetékkel hatékonyabban erdősíthetők olyan területek is, ahol a telepítés nem hatékony vagy a természetes növényzet megtelepedésére nincs lehetőség (Núñez és mts. 2006). A környezetvédelemben az ektomikorrhizáknak kettős szerepét említhetjük meg: egyrészt mint indikátorok, az erdőközösségek természetes állapotát, szennyezettségét jelzik, másrészt a biológiai szennyezés-mentesítés (bioremediáció) napjainkban kialakulóban levő területén is felmerül az ektomikorrhizás növények hatékony alkalmazásának lehetősége (Khan és mts. 2000, Tamponnet és mts. 2008). Az ektomikorrhizák erdőkben játszott szabályozó szerepének feltárásához, valamint a mesterséges mikorrhizarendszerek sikeres felhasználáshoz azonban szükséges a természetes közösségek diverzitásának és működésének feltárására, melyben ugrásszerű előrelépést hozott az utóbbi években a molekuláris ökológiai módszerek fejlődése. Ezek segítségével már nagy mennyiségű ektomikorrhiza viszonylag pontosan határozható meg – akár faji szinten is. A

3

közösségek fajösszetételét leghatékonyabban a korábbi morfológiai-anatómiai és a molekuláris megközelítési módok ötvözésével lehet feltárni (Horton és Bruns 2001), ami azonban feltételezi egyes, korábban leírt ektomikorrhizák gombapartnereinek pontos meghatározottságát. Az első – sokszor vitatható – fajmeghatározási módszerek miatt ez azonban nincs így, ami felhívja a figyelmet egyes korábbi ektomikorrhiza-leírások felülvizsgálatának igényére. A nemzetközi kutatások nyomán, az 1990-es évektől megindult a hazai élőhelyek ektomikorrhiza-közösségeinek vizsgálata is. Néhány specifikus faji kapcsolat jellemzésére irányuló munka mellett (Jakucs és Agerer 1999, Jakucs és mts. 1999, Kovács és Jakucs 2001) egyes alföldi növénytársulások mikorrhizáinak átfogó értékelésére is sor került (Jakucs 2002a, Kovács és Bagi 2001, Kovács és Szigetvári 2002). Az ELTE Növényszervezettani Tanszékén egy OTKA-pályázat keretében 2002-től megindult a Bükki Nemzeti Park területén fekvő, termőtesteken alapuló vizsgálatoknak köszönhetően (Siller 1986, 2004) mikológiai szempontból már ismert, erdészeti szempontból hosszab ideje érintetlen „Őserdő” rezervátumterületének vizsgálata is, melyhez doktori munkám is kapcsolódik. Közép-európai, éghajlatát tekintve szárazabb (kontinentális) bükkös állományokból ezidáig nem szerepel adat a nemzetközi irodalomban. Mivel azonban gyakoriságuk miatt a bükkösök a lombos erdők övének egyik kiemelkedően fontos társulás-csoportját jelentik, több szerző is vizsgálta egyéb európai területek bükkös állományainak ektomikorrhiza-közösségeit, ami már lehetőséget adhat az összetétel összehasonlítására. A disszertáció témája a terület ektomikorrhiza-közösségének morfológia-anatómia és DNS-alapú módszerekkel történő minél alaposabb vizsgálata volt. Ennek során négy fő célt tűztem ki. I. A meghatározott mikorrhizák közül kiemeltem a legfontosabb, kevéssé ismert, de a területen gyakori tömlős és bazídiumos ektomikorrhiza-típusokat (Genea, Humaria, Pachyphloeus,

Tomentella),

amelyeknek

részletes

mikroszkópos

anatómiai

és

molekuláris taxonómiai vizsgálatát is elvégeztem, mellyel a következő, konkrét kérdésekre kerestem a választ: a) Az említett nemzetségeket mely fajok képviselik az ektomikorrhiza-közösségben? b) A nemzetségek képviselői milyen filogenetikai kapcsolatban állnak egymással?

4

c) Melyek azok a konkrét morfológiai-anatómiai bélyegeik, melyek alapján a mintaterületen talált típusok elkülöníthetők egymástól valamint a nemzetség egyéb

hazai,

illetve

az

irodalomban

szereplő,

korábban

már

leírt

ektomikorrhizáitól? II. A molekuláris alapon sikeresen meghatározott, kisebb gyakoriságban előforduló ektomikorrhiza-típusokról

rövid

morfológiai-anatómiai

jellemzést

készítettem,

vizsgáltam filogenetikai kapcsolataikat, és összehasonlítottam azokat a nemzetségek korábban leírt ektomikorrhizáival. III. A mintaterület egyik domináns Lactarius-ektomikorrhizája esetében, amelynek rendszeresen tapasztaltuk idegen hifákkal történő másodlagos kolonizációját, az alábbi kérdésekre kerestem a választ: a) Milyen morfológiai-anatómiai bélyegek jellemzik az ektomikorrhizát, és milyen anatómiai hasonlóságokat és különbségeket mutat a filogenetikailag rokon gombafajok ektomikorrhizáival? b) Mely fajhoz tartozik az ektomikorrhiza mikobiontája a mintaterületen talált termőtestekből származó, illetve molekuláris adatbázisokban szereplő szekvenciák filogenetikai analízise alapján? c) Milyen fény- és elektronmikroszkóppal megfigyelhető bélyegek jellemzik az ektomikorrhizával borított gyökérszakaszok növényi sejtjeit másodlagosan kolonizáló idegen hifákat? d) Mutat-e hasonlóságot a megfigyelt kolonizáció anatómiája korábban Lactariusektomikorrhizákban leírt idegen hifákkal? IV. Az eddig rendelkezésünkre álló adatok alapján összefoglaló képet szerettem volna adni a bükki “Őserdő” ektomikorrhiza-közösségének faji összetételéről és gyakorisági viszonyairól, összehasonlítva egyéb hazai lombos erdők illetve az irodalomból ismert bükkösök hasonló vizsgálatainak eredményeivel.

5

II. Irodalmi áttekintés II. 1. A mikorrhiza-kapcsolatok általános jellemzése és típusai A biotróf életmódot folytató, azaz a de Bary-féle általános „szimbiózis”-fogalomnak megfelelően (De Bary 1879) más élőlényekkel tartósan együtt élő gombáknak számos típusa létezik: vannak köztük gazdaszervezetek károsítása révén tápanyagokhoz jutó paraziták, más szervezetekkel szemben ellenanyagot termelő antibionták, valamint a partnerségből kölcsönösen előnyöket élvező mutualisták (Hudson 1986, Carlile és Watkinson 1994). Ez utóbbi kategóriába tartoznak a mikorrhizák is. Theodor Hartig már 1840-ben közölt leírásokat növényi gyökérsejteket körülvevő fonalhálózatról ill. a gyökeret borító szövedékről, melyek gomba-eredetét Bruchmann állapította meg 1874-ben (Trappe 2005). Ezt követően többen is leírtak hasonló struktúrákat (Boudier – 1876, Reess – 1880, Gibelli – 1883), de csak a kapcsolatnak a mikorrhiza („gomba-gyökér”) nevet adó, Albert Bernhard Frank (1839-1900) állapította meg e szimbiotikus kapcsolat mutualista jellegét (Frank és Trappe 2005). A mikorrhiza fogalmát napjainkig számos szerző, különböző szempontok szerint definiálta (Read 1999a, 2002, Brundrett 2004). Smith és Read (1997) definíciója ötvözi az eredeti, kölcsönös tápanyag-átadást hangsúlyozó (Frank és Trappe 2005) meghatározásokat a strukturális-funkcionális megközelítésűekkel, mikor a mikorrhizát „egy olyan szimbiózisnak” nevezi, „melyben egy gombának a mikorrhizán kívüli micéliuma a talajból származó tápanyagokkal lát el egy növényi gyökeret”. Később ezt a meghatározást Read (1999a, b) több szempontból is kiterjesztette ill. pontosította, hangsúlyozva a kapcsolat kétoldalúságát ill. a kapcsolat előnyeit: „a mikorrhiza egy olyan struktúra, melyet a gomba valamint a növény anyagfelvevő szerve alkot, s melynek segítségével a partnerek kölcsönösen növelik egymás fitneszét”. Brundrett (2004) még átfogóbban definiálta a mikorrhizákat annak érdekében, hogy a fogalomba a mutualista asszociációk mellett beleférjenek egyes speciális mikorrhiza-típusok is. Meghatározása szerint a mikorrhizák „módosult növényi szervek (gyökerek vagy egyéb anyagfelvevő képletek) és (…) gombák között, pontosan összehangolt egyedfejlődési folyamatok eredményeképpen kialakult szoros, szimbiotikus kapcsolatok, melyek legalább az egyik fél számára nélkülözhetetlenek, és elsődleges céljuk a tápanyagátadás” (Brundrett 2004).

6

A mikorrhizák tipizálása a részt vevő növénypartner (fotobionta) rendszertani helyzete, a mikorrhiza anatómiai jellemzői és/vagy a kapcsolat minősége alapján történhet. Külön kategóriát képviselnek azok a gomba-növény kapcsolatok, melyeket mohák vagy harasztok telepes testszerveződési szinten álló gametofitonjai hoznak létre (Duckett és Read 1995, Ligrone 1988, Schüßler 2000, Wang és Qiu 2006). Ezeket nevezzük „mikothallusz”-nak vagy – a rhizómákkal kialakított kapcsolatokat („mikorhizóma”) is magába foglalóan – „paramikorrhizának” (Strullu-Derrien és Strullu 2007). A hajtásos növények gyökerei kialakította mikorrhizát Strullu-Derrien és Strullu (2007) – ebben a megközelítésben – „eumikorrhizának” nevezi. A gyökerekkel képzett mikorrhizák elsődleges felosztása a gombahifák és a növényi szövetek egymáshoz viszonyított térbeli helyzetén alapszik. Már Frank (Frank és Trappe 2005) is megkülönböztette a gombaköpeny nélküli „endotróf” mikorrhizákat az „ektotróf” mikorrhizáktól. E felosztás ma is létezik: amennyiben a gombafonalak behatolnak a növényi sejtek belsejébe is „endomikorrhizáról”, míg ha azok – elsősorban – a sejtek között futnak „ektomikorrhizáról”) beszélünk (Smith és Read 1997). A két csoport között átmenetet képviseli az ektendomikorrhizák csoportja (Yu és mts. 2001). Valamennyi mikorrhiza-típus közül a legelterjedtebb (Wang és Qui 2006), a zárvatermők kb. 67%-a által létrehozott (Trappe 1987) kapcsolat a „vezikuláris-arbuszkuláris mikorrhiza” (VAM). Ezt a legősibb mikorrhizatípust a Glomeromycota törzs képviselői hozzák létre (Schüßler és mts. 2001, Brundrett 2002). Többszörösen elágazó, anyagátadási felszínként („interface”) szolgáló „arbuszkulum”-ok és/vagy hólyagszerűen kitágult, elsősorban raktározó funkciójú vezikulumok jellemzik, gombaköpenyt nem képez (Smith és Read 1997). Elterjedtségének, ökológiai és gazdasági jelentősége miatt igen intenzíven kutatott mikorrhiza-típus (Koide és Mosse 2004). Az ektomikorrhizák esetében a gombafonalak – általában – nem hatolnak be a növénysejtek belsejébe, hanem csak körülveszik azokat a mikorrhizatípus jellegzetes anyagátadási felületét, a Hartig-hálót kialakítva (Smith és Read 1997). A gyökér felszínén a hifák egy összefüggő bevonatot, ún. gombaköpenyt hoznak létre, melyből kiágazó képletek haladnak a talaj részecskéi között. Szűk

növénycsoportban

elterjedt,

s

általában

ennek

megfelelően

kevesebb

gombanemzetséget is érintő, meghatározott anatómiai bélyegekkel jellemezhető további mikorrhiza-típusok az erikoid (Straker 1996), az arbutoid, a monotropoid (Smith és Read 1997, Taylor és Bruns 1997) és az orchid mikorrhizák (Rasmussen 2002, Dearnaley 2007). A mikorrhizákat tipizálhatjuk a miko- és fotobionta között kialakuló ökológiai kölcsönhatás minősége alapján is. Mivel a partnerek lehetséges előnye a kapcsolatban több 7

különböző tényező eredőjeként alakul ki, nagyon finom átmenetek lehetségesek a partnerek között kialakuló kapcsolat minőségének tekintetében a parazitizmus – mutualizmus kontinuum mentén (Johnson és mts. 1997, Brundrett 2004, Egger és Hibbett 2004). A spektrum egyik végpontját – amit a folyamatos átmenet miatt nem tekinthetünk mikorrhizának – a növény számára közömbös, annak szöveteiben élő endofitonok alkotják. E kategória legismertebb képviselői a sokszor mikorrhizaként is említett, anatómiai jellemzőik alapján „sötét szeptált endofitonok” névre („dark septate endophytes”, azaz „DSE”-gombák) keresztelt gombák csoportja (Jumpponen 2001, Sieber 2007, Newsham és mts. 2009). A másik szélső állapotot az antagonista (allelopatikus) kapcsolatok jelentik, amikor az egyik növényfajjal mikorrhizakapcsolatban élő gomba más, nem-gazda növények túlélési esélyeit csökkenti (Brundrett 2004). Az endofitikus és az antagonista együttélések között átmeneti sávban

helyezkednek

el

a

tényleges

mikorrhiza-kapcsolatok,

melyeket

tovább

csoportosíthatunk kiegyensúlyozott ill. kizsákmányoló kapcsolatokra (Brundrett 2004). Ez utóbbiakra példaként a klorofill-mentes, ún. miko-heterotróf növényeket említhetjük (Taylor és mts. 2002, Young és mts. 2002), melyek kizárólag gomba-partnerük révén jutnak tápanyagokhoz, vagy a tápanyagaikat nagyobb részt a gombától kapó, ám partnerüknek kevesebb szénhidrátot adó ún. mixotrófok (Selosse és mts. 2006). Természetesen a kapcsolat minősége sokszor a kialakulást követően is megváltozhat (pl. a környezetben hozzáférhető tápanyagok függvényében Johnson és mts. 1997, Egger és Hibbett 2004), ezért pontosan besorolni az egyes mikorrhiza-kapcsolatokat ebbe a kategória-rendszerbe csak élettani vizsgálatok alapján lehet (Brundrett 2004). II. 2. A mikorrhiza-kapcsolatok evolúciója A

mikorrhiza-kapcsolatoknak,

napjaink

ökoszisztémáiban

betöltött

funkcionális

szerepéhez hasonlóan, a növényvilág evolúciójában is kiemelkedő jelentősége volt. Már 1975-ben, Pirozynski és Malloch (1975) felvetette, később igazolást is nyert, hogy a kapcsolat kialakulása megelőzte a valódi gyökerek kialakulását (Berbee és Taylor 2007), tehát a szárazföldi élettér meghódítása során a növények már a kezdetektől fogva a gombákra támaszkodtak (Blackwell 2000). Az elmélet közvetett bizonyítékai a növények szárazföldre lépésének időszakából előkerült fosszilis VAM-spórák (Kindston és Lang 1921, Pirozynski és Dalpé 1989, Redecker és mts. 2000), valamint a VAM-képző gombák megjelenésének időszakát az első edényes növények kialakulását megelőző időszakra datáló, a molekuláris óra hipotézisén alapuló vizsgálatok voltak (Simon és mts. 1993, Wilkinson 2001). Később 8

közvetlen bizonyítékként a skóciai Rhynie-flórában kerültek elő 400 millió éves mikorrhizaleletek az alsó devonból (Boullard és Lemoigne 1971, Remy és mts. 1994, Taylor és mts. 1995, Taylor és mts. 2004, Taylor és Krings 2005, Krings és mts. 2007.) A növényvilág evolúciója során a VAM-képző növényekből alakultak ki az egyéb mikorrhizákat képző növénycsoportok (Selosse és Le Tacon 1998). Először feltehetőleg egyes VAM-képző növényekben átmeneti, másodlagos szimbiózis-formaként jelent meg az ektomikorrhiza, majd ezekből a taxonokból alakultak ki a tisztán ektomikorrhizás nemzetségek (Brundrett 2002). Ezt igazolhatja az a tény, hogy ma is előfordulnak olyan növénycsoportok, melyek mindkét mikorrhizatípus kialakítására képesek (pl. Salix, Causarina – Khan 1993, Tsuga, Pseudotsuga – Cazares és Smith 1996, Uapaca – Moyersoen és Fitter 1998, Eucalyptus – Chen és mts. 2000). A molekuláris óra elemzések alapján a középidő vége tűnik az ektomikorrhizák megjelenése legvalószínűbb dátumának (Smith és Read 1997, Cairney 2000, Berbee és Taylor 1993), bár egyes feltételezések szerint már korábban is megjelenhettek hasonló mikorrhizát kialakító tömlősgomba nemzetségek (Selosse és Le Tacon 1998). A legkorábbi fosszilis ektomikorrhiza-leletek az eocén időszakából kerültek elő: Belgiumban 55 millió éves Glyptostroboxylon tenerum (Cupressaceae, Pinophyta) gyökeréről (Fairon-Demaret és mts. 2003). Brit Kolumbiában 50 millió éves (Pinus spp. – LePage és mts. 1997) ektomikorrhizákat találtak. A Dipterocarpaceae család egyik ektomikorrhiza-képző taxonjának (Pakaraimaea dipterocarpacea) elterjedését vizsgálva Moyersoen (2006) az ektomikorrhiza-kapcsolatok kialakulását ennél jóval korábbra, kb. 135 millió évvel ezelőttre teszi, elméletét azonban fenntartásokkal fogadták (Alexander 2006). Az ektomikorrhiza-képzés képessége mind a gombák, mind pedig a növények körében polifiletikusan jelent meg a törzsfejlődés folyamán. Legalább egyszer kialakult a járomspórás gombák körében (Zygomycota ill. az újabb rendszerekben Mucoromycotina – Hibbet és mts. 2007), és több külön ágon megjelent mind az Ascomycota (Gargas és mts. 1995), mind a Basidiomycota (Malloch, 1987, Bruns és mts. 1998) törzsekben. Az ektomikorrhiza-képző csoportok polifiletikussága elméletileg a jelleg egyszeri megjelenésével és többszöri elvesztésével is magyarázható lenne, ez azonban ellentmond a közvetlen evolúciós bizonyítékoknak (Bruns és Shefferson 2004, Weiss és mts. 2004). A bonyolult anatómiai képletek többszöri evolúciós kialakulása mindazonáltal hasonlóan meglepő feltételezés (Bruns és Shefferson 2004). Az ellentmondás leginkább úgy oldható fel, ha néhány, párhuzamos evolúciós folyamat mellett a képesség többszöri elvesztését feltételezzük, ahogyan azt Hibbett és mts. (2000) karakter-polaritás vizsgálatainak eredményei is 9

alátámasztják. Az elmúlt években a több különböző génszakasz molekuláris vizsgálata alapján konstruált törzsfákat áttekintve (Hibbett és Thorn 2001, Larsson és mts. 2004, Lutzoni és mts. 2004) látható, hogy az Ascomycota törzsnek legalább négy különböző csoportjában, míg a bazídiumos gombák között nyolc nagy kládban (Sebacinoid, Gomphoid-Phalloid, Cantharelloid, Thelephoroid, Athelioid, Boletoid, Russuloid, Agaricoid kládok) fordulnak elő ektomikorrhiza-képző fajok (Agerer 2006). Matheny és mts. (2006) csak az Agaricoid kládon (Agaricales) belül 11 különböző kialakulást feltételeznek, bár jelzik azt is, hogy a következtetéseik alapjául szolgáló törzsfák topológiája más külcsoport választása ill. más taxon-készlet esetén megváltozhat. Az említett törzsfák tanulmányozásával az is látható, hogy az ektomikorrhiza kialakítására képes gombafajok szaprotróf, lignocellulóz bontására képes csoportok közé ékelődve helyezkednek el, azaz feltehetően azokból fejlődtek ki (l. pl. Matheny és mts. 2006). Ez összhangban van azokkal az eredményekkel, melyek szerint több ektomikorrhizás gombafajban még ma is megtalálhatók a növényi polimerek bontására képes enzimrendszerek (Smith és Read 1997, Read és Perez-Moreno 2003). A szaprotróf életmód ismételt megjelenésére is vannak példák az ektomikorrhiza-képző gombacsoportokon belül (pl. a szimbiotikus kapcsolatban élő Gomphus, Ramaria és Clavariadelphus nemzetségekkel rokon, szabadon élő, szaprotróf Lentaria genus esetében) (Hibbett és mts. 2000). A zárvatermők körében Fitter és Moyersoen (1996) ill. a növénytörzs 18S riboszomális alegységének genetikai vizsgálatán alapuló törzsfáján (Soltis és mts. 2000), Bruns és Shefferson (2004) 12 különböző leszármazási vonalon találunk ektomikorrhiza-képző taxonokat, míg Wang és Qiu (2006) a hozzáférhető mikorrhizákra vonatkozó irodalmak összegzésével és az Angiopserm Phylogeny Group (APG) hivatalos honlapján (Stevens 2004) 2004-ben szereplő törzsfa felhasználásával az előbbinél jóval több ektomikorrhizás növényi leszármazási vonalat tudtak azonosítani. A többi mikorrhiza-típus és a nem mikorrhizás növénycsoportok egyaránt a már említett kapcsolatokból alakulhattak ki a földtörténet későbbi időszakaiban (Allen 1991, Brundrett 2002): az arbutoid, erikoid és monotropodi mikorrhizák az ektomikorrhiza-kapcsolatokból, míg az orchid mikorrhiza feltehetőleg a VA-mikorrhizákból (Brundrett 2002). Ezen mikorrhizák esetében több csoport esetében megfigyelhető a gazdanövény–mikobionta kapcsolatok specifitását megerősítő koevolúciós folyamatok megindulása (l. pl. az orchidmikorrhizák esetében Shefferson és mts. 2007). Több olyan áttekintő munka áll rendelkezésünkre, ami a mikorrhiza-kapcsolatban élő növényeket és azok igazolt (vagy feltételezett) mikorrhiza-típusait foglalja össze (Trappe 10

1987, Harley és Harley 1987a,b, Wang és Qiu 2006). Ezekből egyértelműen kiderül, hogy a növények túlnyomó többsége VA-mikorrhizát alkot, ami minden bizonnyal a kapcsolat ősi eredetével és a VAM-gombák széles gazdakörével (Hoeksema 1999) magyarázható. II. 3. Ektomikorrhiza-képző növény- és gombacsoportok Ektomikorrhizás kapcsolatban az edényes növényfajoknak mindössze 4-5%-a él (Brundrett 2002). Ezek közé tartoznak azonban a Föld legfontosabb erdőalkotó fafajai: a tajgaerdőket alkotó fenyőfélék (Pinaceae), az északi félteke mérsékelt övi lomberdeinek legfontosabb fáit magába foglaló bükkfafélék (Fagaceae), a déli félteke szubtrópusi és mérsékelt övi tájainak fáit tartalmazó mirtuszfélék (Myrtaceae) valamint a trópusi övben erdőalkotó Dipterocarpaceae családok (Wang és Qui 2006). E taxonokon kívül egyéb, fás szárú fajokat is tartalmazó családokban is előfordul ez a fajta szimbiózis (pl.: nyírfafélék (Betulaceae), fűzfafélék (Salicaceae) és hársfélék (Tiliaceae)) (Smith és Read 1997). Bár döntően fatermetű növények szerepelnek a fotobionták között, félcserjék, törpecserjék is előfordulnak körükben, mint pl. a magcsákó (Dryas octopetala, Rosaceae – Haselwandter és Read, 1980; Michelsen és mts. 1996), a napvirág (Helianthemum spp. – Kovács és Jakucs 2001, Erős-Honti és mts. 2008) vagy szuhar (Cistus spp.) fajok (Comandini és mts. 2006). Mindemellett lágyszárú ektomikorrhiza-képző fajokat is ismerünk: Polygonum viviparum (Polygonaceae), Koebresia myosuroides (Cyperaceae) (Michelsen és mts. 1996, Muhlmann és mts. 2008a, b). Az is gyakran megfigyelhető, hogy egy ektomikorrhiza-képzésre hajlamos fotobionta egy másik gombapartnerrel más típusú mikorrhizát alkot, ami a természetes növényközösségekben létrejövő közösségi micélium-hálózat („common mycelial network”, CMN) kialakulásának az egyik alapja (Selosse és mts. 2006). Azt is megfigyelték, hogy egyes növényfajok fiatal egyedei (pl. Salix spp., Helianthemum chamaecistus, Eucalyptus spp.) fiatalon VA, míg idősebb korban ektomikorrhizát képeznek (Read és mts. 1977, Vajna és Jakucs 2003). A gombapartnerek köre jóval szélesebb: az ektomikorrhiza kialakítására képes gombafajok számát 5-6000-re becsülik (Molina és mts. 1992). Az igazoltan ektomikorrhizaképző gombacsoportok és mikorrhizáik áttekintését adják De Román és mts. (2005) ill. Agerer (2006). A fajok többsége (kb. 80%) a bazídiumos gombák (Basidiomycota) köréből kerül ki (pl. a galambgombafélék (Russulaceae), a tinórufélék (Boletaceae) vagy a szemölcsgombafélék (Thelephoraceae) családjai). Az aszkuszos gombák (Ascomycota) között sokáig jóval alacsonyabb volt az ismert ektomikorrhizák száma (Maia és mts. 1996), de 11

napjainkban folyamatosan bővül az ismert ektomikorrhiza-képző tömlősgombák köre is (Tedersoo és mts. 2006a). Találunk ektomikorrhizás járomspórás gombarendet is (Zygomycota – pl. Endogonales – Fassi és mts. 1969, Wu és Lin 1997), sőt a Glomeromycota törzs egyik fajáról is feltételezték, hogy ektomikorrhiza kialakítására képes (Glomus tubiforme – Warcup 1985). Az ektomikorrhiza-képző gombacsoportok között szűk, közepes és tág gazdasepcificitású fajokkal egyaránt találkozunk (Brundrett 2002). Vannak olyan fajok, melyek természetes körülmények között csak egy adott gazdával élnek együtt (pl. a sárga gyűrűstinóru (Suillus grevillei) csak a vörösfenyővel (Larix decidua) alkot ektomikorrhizát), de léteznek tág gazdaspektrumú gombák is (pl. a tömlősgombákhoz tartozó Cenococcum geophilum) (Cairney és Chambers 1999, De Román és mts. 2005). II. 4. Az ektomikorrhizák kialakulása és funkciója Az ektomikorrhizák kialakulása több lépcsőben lezajló, összetett folyamat, melynek általános lépéseit ellenőrzött in vitro modell-rendszerekkel végzett vizsgálatok alapján írták le (pl. Eucalyptus globulus és Pisolithus tinctorius közt – Martin és mts. 1995; Quercus robur és Paxillus involutus ill. Piloderma croceum közt – Herrmann és mts. 1998). A gombafonalak először a fiatal oldalgyökerek csúcsi zónája alatt laza szövedéket hoznak létre. A hifák és a gyökerek közeledése közben, az ún. „preszimbiotikus szakaszban”, mind a gyökér (Martin és mts. 2001, Krüger és mts. 2004), mind a gombahifák (Martin és mts. 1995, 2001) olyan anyagokat adnak le, melyek meghatározott genetikai programot indítanak el a szimbiotikus partner szervezetében (Podila és mts. 2002). A kapcsolatteremtés kulcsfontosságú vegyületei elsősorban hormonhatású anyagok (auxin – Slankins 1973, Gea és mts. 1994, Gay és mts. 1994, Barker és mts. 1998, Barker és Tagu 2000, Herrmann és mts. 2004; abszcizinsav, etilén, citokininek – Gogala 1991). A szoros, szövettani kapcsolat kialakulásához a gombának le kell győznie a növény természetes védekezési reakcióit is, amit a védekezésért felelős gének kifejeződését leállító vegyületek leadásával ér el (Martin és mts. 2001, 2007). A kölcsönös jelátadási folyamatok eredményeként mindkét félben szerkezeti és funkcionális változások kezdődnek (Horan és mts. 1988, Smith és Read 1997, Herrmann és mts. 1998, Martin és Tagu 1999), melyek végül az ektomikorrhizákra jellemző struktúrák kialakulását eredményezik. A gyökerek növekedése lelassul, majd leáll, a gyökérszőrök képzése megszűnik, a gyökérsüveg szétesik (Chilvers 1968b, Gilroy és Jones 2000), és megváltozik a gyökér elágazási rendszere is. A gyökércsúcsok gyakran megduzzadnak (Smith 12

és Read 1997). A mikobionta az érintkezésre speciális szerkezeti elemek képzésével válaszol. Ezek alapvetően három különböző képletet alkotnak (1. ábra): a gyökeret körülvevő, álszövetes felépítésű köpenyt; a köpenyből befelé növő, a gyökér bőrszöveti és kérgi sejtjeit körülvevő Hartig-hálót, mely az ektomikorrhiza anyagátadási folyamatainak speciális felépítésű és működésű színtere („interface”) (Smith és Smith 1990, Bonfante 2001); valamint a köpenyből kifelé növekvő kiágazó hifák rendszerét, ami a talaj távolabbi régióival és a termőtestekkel teremti meg a kapcsolatot (Martin és Tagu 1999).

1. ábra. Az ektomikorrhizák alapvető szerkezeti elemei. Ke: kiágazó elemek, K: gombaköpeny, Hh: Hartig-hálóval körülvett kéregsejtek. (Kh: központi henger, R: rizomorfa)

A mikorrhizák mutualista jellegének alapvetően a partnerek közti anyagátadás az alapja. A fikobionta a fotoszintézis során termelt szénhidrátokból ad át a gombapartnernek. Ezt C14izotóppal jelölt CO2 kimutatásával is igazolták (Rosling és mts. 2004). A szénhidrát-átadást a interface-en található módosult növényi monoszacharid-transzporterek megjelenése szolgálja (Grunze és mts. 2004, Nehls és mts. 2001). A gomba elsősorban trehalóz felhalmozása révén (López és mts. 2007, Wiemken 2007) fejti ki szén-nyelő-hatását a növényre, melynek segítségével a növényi produkciónak akár több, mint 20%-át is átveheti a növénytől (Hobbie 2006). A szénhidrát-szívóerő mértékét elsősorban a talaj hozzáférhető szervetlen N-tartalma szabja meg (Wallenda és Kottke 1998, Buscot és mts. 2000). A gombapartner elsősorban vizet és ásványi anyagokat (szervetlen nitrogént, foszfort és egyéb ionokat) ad át a növénynek (Chalot és mts. 1991, Cairney és Chambers 1997, Javelle és mts. 1999, Pfeffer és mts. 2001, 13

He és mts. 2003, Lum és Hirsch 2003, Bucher 2007, Allen 2007). Emellett lehetővé teszi a növény számára fel nem vehető formában jelen levő ionok mobilizálását a talajból (Landeweert és mts. 2001). Extracelluláris bontóenzimeiknek köszönhetően az organikus szubsztrátumok anyagát (fehérjék, szerves foszforvegyületek, lignocellulóz) is hozzáférhetővé teszi (Smith és Read 1997, Read és Perez-Moreno 2003), ami érthető is az ektomikorrhizák már említett evolúciós eredetük tükrében (Hibbett és mts. 2000, Brundrett 2002). Az anyagátadás mellett számos más előnyökkel is jár e kapcsolat. Segíti a növényt a különféle stresszhatások leküzdésében (pl. szárazságstressz – Lehto 1992, Davies és mts. 1996, Morte és mts. 2000, di Pietro és mts. 2007, nehézfémstressz – Kraigher és mts. 1996, Leyval és mts. 1997, Khan és mts. 2000, Ott és mts. 2002, Krupa és Pitrowska-Seget 2003, hidegstressz – Tibbett és mts. 2002), de a gomba jelenléte közvetlenül, vagy közvetve, a növénypartner ellenállását fokozva a kórokozókkal szemben is védelmet nyújthat (Marx 1972, Pozo és Azcón-Aguilar 2007). II. 5. Az ektomikorrhiza-közösségek ökológiai jellemzői Egy terület ektomikorrhiza-közösségén az ott előforduló összes ektomikorrhiza együttesét értjük. Az ektomikorrhizák és az élőhelyen előforduló termőtestek faji összetételének kapcsolatát vizsgálva kiderült, hogy míg vannak olyan gombafajok, melyek igen sok termőtestet, de kevés mikorrhizát képeznek egy területen (pl. a pókhálósgomba (Cortinarius) fajok), addig több olyan nemzetség van (pl. Thelephora, Tomentella), amik sokkal gyakoribbak a mikorrhizák, mint a sporokarpiumok között (Gardes és Bruns 1996, Dahlberg és mts. 1997). Az ektomikorrhizák körében végzett ökológiai munkák egyik fő konklúziója e közösségek igen nagy diverzitása volt (Dahlberg 2001), aminek hátterében számos tényező állhat (forrás-felosztás, zavarás, fajok közti versengés, egyéb faj-faj kapcsolatok) (Bruns 1995). A faji összetételnek mind térbeli, mind időbeli változékonyságát többen vizsgálták. A térbeli eloszlást tanulmányozó munkák eredményét áttekintő munkákban (Newton és Haigh 1998, Horton és Bruns 2001, Allen és mts. 2003) szereplő rang-abundancia görbékből, valamint az egyes mintaterületeken a megtalált fajszámot a mintaszám függvényében ábrázoló grafikonokról leolvasható, hogy a vizsgált élőhelyeken néhány gyakran előforduló faj mellett nagy számban találhatók kisebb abundanciában megjelenő gombafajok (Horton és Bruns 2001). A micéliumra is kiterjedő ökológiai vizsgálatokból kiderült, hogy az ektomikorrhizák előfordulása nem követi hűen a talajban kimutatható hifaszövedék jelenlétét 14

sem (Genney és mts. 2006, Kjøller 2006), ami a mikorrhizaképzés időszakosságán túl az ektomikorrhizák különböző forrás-kihasználási típusaival (Agerer 2001) is magyarázható. A különböző mintaszámmal dolgozó munkák áttekintése azt mutatja, hogy – hasonlóan a termőtest-alapú vizsgálatokhoz (Pál-Fám 2002) – a mintaszám növelésével újabb és újabb fajok kerülnek elő, és csak ritkán sikerült elérni a mintaszám-fajszám görbe telítési szakaszát (Horton és Bruns 2001). Mindebből arra lehet következtetni, hogy az ektomikorrhizák elterjedése foltszerű, és a mintában megfigyelhető fajösszetétel erősen függ a mintavétel helyétől. Minimális térbeli eltérés a talajmintában megfigyelhető abundancia-viszonyok jelentős megváltozását okozhatja. A mikorrhiza-közösségek ökológiai jelentőségét több különböző szinten közelíthetjük meg (Johnson és mts. 2006). Az egyed szintjén a mutualizmus alapját jelentő, korábban már tárgyalt élettani kapcsolatokat kell kiemelni, melyek egyfajta „biológiai üzletként” működnek: mindkét fél számára elegendő haszonnal kell járniuk ahhoz, hogy a kapcsolat fennmaradjon (Schwartz és Hoeksema 1998). Hasonló alapelvekkel magyarázhatjuk a populáció szintű gomba-növény kapcsolatot is, de ebben az esetben már a teljes populáció túlélése a cél, így a közvetett előnyök (általános fitnesz-növelés, akár egyes egyedi kapcsolatok kárára is) jelentősége megnő (Johnson és mts. 2006). A gomba- és növényközösségek kapcsolatát alapvetőn az ökológiai funkcióknak a teljes életközösségen belüli felosztása, és egymást kiegészítő, egymással feedback-jellegű kapcsolatban álló szerepe teremti meg (Bever és mts. 1997). A botanikában már korábban megjelent funkcionalizmus (Mucina 1997) a mikorrhiza-kutatásban is kibontakozóban van: a fajok eloszlása mellett a szerzők funkcionális csoportok megalkotásával keresik a választ a nagy diverzitás magyarázatára (Dahlberg 2001, Allen és mts. 2003, Courty és mts. 2005, Buée és mts. 2007). Ezen vizsgálatok szerint nagy fajgazdagság jelentősége feltehetően az egyes ökológiai funkciókat ellátó csoportok redundanciájában rejlik. Emellett még ismeretlen funkciók feltárása felé is nyitott az út, melyhez az ökofiziológiai irányvonalak nyújthatnak segítséget (Buscot és mts. 2000). A faji sokféleség egyik következménye a közösségen belül kialakuló sokféle kapcsolat lehetősége. Egy gomba micéliuma egyszerre több növénnyel is alkothat mikorrhizát (Dickie és mts. 2004, Lian és mts. 2006), egy-egy növény gyökerén egyszerre több gombafaj is kialakíthat (akár különböző típusú) mikorrhizát, sőt a mikorrhizaképző gomba-egyedek micéliumai anasztomózisok révén is kapcsolatba kerülhetnek egymással (Jakobsen 2004). Ezáltal az életközösségekben több növény hifák által összekapcsolt hálózata jöhet létre; ez a „közösségi micélium-hálózat” („common myceial network”, azaz CMN) (Selosse és mts. 15

2006), illetve ennek erdei ökosziszémákban megjelenő változata, a „wood-wide web” (Wiemken és Boller 2002, Giovanetti és mts. 2006, Whitfield 2007). Mivel a CMN tagjai között fellépő anyagátadást élettani kísérletek is alátámasztják (Simard és mts. 1997, McKendrick és mts. 2000a, Jakobsen 2004), az összekapcsolt növényegyedeket nem tekinthetjük fiziológiailag különálló egységeknek. A CMN kialakulásának következményei igen sokrétűek. Kimutatták már pozitív hatását a növényközösség tagjainak együttélésére (azaz a CMN növényi diverzitást növelő szerepét) (Hart és mts. 2003), míg egyes elméletek szerint bizonyos trópusi esőerdőkben éppen a közös ektomikorrhiza-rendszer tartja fenn a faállomány homogenitását (McGuire 2007). Az anyagátadásnak köszönhetően (Selosse és mts. 2006) lehetővé teszi az idősebb egyedek dajka- („nursing”-)szerepét a kedvezőtlenebb helyzetű (pl. árnyékban növekvő) magoncok felett (Wiemken és Boller 2002, Nara 2006). A kialakult hálózat egy további jelentősége, hogy a gomba szénhidrátigényét így egyszerre több fikobionta fedezheti (Jones és mts. 2003). Az anyagtranszport következményeképpen a CMN megváltoztatja a növények közti populációs kapcsolatok minőségét is (Selosse és mts. 2006). A CMN speciális növény-növény kapcsolatok kialakulását is lehetővé teszi: klorofillt nem vagy kisebb mennyiségben tartalmazó (tehát intenzív fotoszintézisre képtelen) növények gombafonalakon

keresztül

más,

általában

ektomikorrhizás

fajok

rovására

fedezik

szervesanyag-igényüket. Ezeket a növényeket mikoheterotrófoknak nevezzük (Taylor és mts. 2002, Leake 2004), melyeknek polifiletikus (Leake 1994) csoportjába pl. a fenyőspárga fajok (pl. Monotropa uniflora – Young és mts. 2002) és számos orchidea-nemzetség tartozik (McKendrick és mts. 2000a,b, Taylor és Bruns 1997). Az ektomikorrhizás gombák a növények mellett egyéb élőlénycsoportokkal is kapcsolatban állnak, szerepük tehát sokkal többrétű az egyszerű gomba-növény kapcsolatnál. Elsősorban a mikorrhizaszféra baktériumközösségével állnak kölcsönhatásban a talaj mikrokörnyezetének, pH-jának megváltoztatása vagy a tápanyagokért folyó versengés révén (Johansson és mts. 2004, de Boer és mts. 2005). A mikorrhiza-képző gombákra hatással levő baktériumok közül kiemelendő két csoport: a mikorrhiza kialakulását segítő baktériumok („mycorrhization helper bacteria”) (Lehr és mts. 2007, Bending 2007) és a már kialakult mikorrhiza-kapcsolat működését segítő baktériumok („mycorrhiza helper bacteria”) (FreyKlett és mts. 2007). A baktériumokon túl egyéb talajlakó állatok (pl. televényférgek) életfolyamatait is befolyásolhatják az ektomikorrhizák (Liiri és mts. 2007), és döntő befolyásuk lehet a talajfelszín feletti és alatti táplálékhálózatok egyéb tagjaira, valamint az

16

általuk meghatározott ökológiai folyamatokra is (van der Putten és mts. 2001, Coleman 2008). Az ektomikorrhiza-közösségek jelentőségét feltáró ökológiai megközelítések következő szintjét az ökoszisztémák jelentik. Az ökoszisztémák – mint a környezetükkel állandó kölcsönhatásban álló, azt alakító populáció-együttesek – szintjén a legfontosabb általános mikorrhiza-funkció a talajképzés (Johnson és mts. 2006). A folyamatban a gombahifák egyrészt mint a talajszerkezetet tömörítő, aggregátumokat képző képletek (Rillig és Mummey 2006, Moreno-Espindola és mts. 2007), másrészt mint a tápanyag-mobilizálásban részt vevő, a biológiai mállást elősegítő szervezetek (Landeweert és mts. 2001, Hoffland és mts. 2004, van Hees és mts. 2006, Winkelmann 2007) jelentősek. Napjainkra a mikológiának külön területe („geomikológia”) foglalkozik a gombahifák geológiai folyamatokra gyakorolt hatásaival (Burford és mts. 2003). A talajképzés biológiai folyamataiban ill. az ökoszisztéma anyagforgalmában betöltött szerepük kapcsán kiemelendő az ektomikorrhiza-képző gombák szerepe az elemek biogeokémiai ciklusaiban is. Lebontó képességük és a mikorrhizakapcsolat lényege miatt elsősorban a szén (Perez-Moreno és Read 2000, Millard és mts. 2007), míg nitrogén-megkötő ill. -asszimilációs képességük miatt a nitrogén körforgásában (Ekbald és Huss-Daxell 1995, Wallenda és Kottke 1998, Lindahl és mts. 2006, Paul és mts. 2007) meghatározó a jelentőségük. A molekuláris ökológiai vizsgálatoknak köszönhetően századunkban egyre több erdőtípus ektomikorrhiza-közösségének összetétele vált ismertté. Tűlevelű erdők közösségei mellett (Gehring és mts. 1998, Lilleskov és mts. 2002, Kraigher és mts. 2007, Grebenc és Kraigher 2007), tűlevelű és lomberdei fajok elegyes állományainak (Ishida és mts. 2007) és tűlevelű erdőkből bükkösbe vezető transzekt mentén megfigyelhető közösségeknek (Rumberger és mts. 2004) a fajösszetételét is vizsgálták. A lomberdők övének fő erdőalkotói közül a tölgyesek mellett (Mosca és mts. 2007, Gebhardt és mts. 2007) elsősorban a bükkösök ektomikorrhiza-közösségeit vizsgálták. Kjøller (2006) bükkerdei közösség ektomikorrhizái mellett a micélium formájában jelen levő fajok elterjedését is vizsgálta mintaterületén, míg Buée és mts. (2005) egy teljes éven keresztül figyelték az egyes fajok ektomikorrhizáinak évszakhoz kötődő előfordulásait. A legtöbb, bükkösöket célzó vizsgálat különböző globális környezetvédelmi problémákhoz köthető abiotikus

környezeti

változások

(megnövekvő

CO2-szint,

nitrogén-műtrágyázás,

megemelkedő talajközeli ózon, taposás, szárazodás) hatását vizsgálta a mikorrhiza közösségben (Wiemken és mts. 2001a,b, Shi és mts. 2002, Waltert és mts. 2002, Grebenc és Kraigher 2007, Haberer és mts. 2007, Kraigher és mts. 2007). 17

Az ektomikorrhizák ökológiai jelentőségét összefoglalva elmondhatjuk, hogy az egyedi gomba-növény kapcsolatok kölcsönös előnyein túl meg kell ismernünk a közösségi szintű jelenségeket is. Az ehhez vezető útat kezdeti szakaszát a közösségek összetételének minél részletesebb megismerése jelenti.

II. 6. Az ektomikorrhiza-közösségek vizsgálatának módszerei II. 6.1. Morfológiai-anatómiai vizsgálati módszerek Egy terület ektomikorrhiza-közösségének szerkezeti diverzitására irányuló vizsgálatok a közösség faji összetételét és a fajok gyakorisági viszonyait igyekeznek kideríteni. Egy élőhely mikorrhizás gombafajai meghatározásának legegyszerűbb módja az ektomikorrhiza-képző fajok termőtesteinek számbavétele és azonosítása. E módszer előnye, hogy szakértők a legtöbb fajt nagy bizonyossággal viszonylag gyorsan képesek azonosítani (Egger 1995) és így nagy terület fajkészlete is aránylag könnyen vizsgálható (Dahlberg és mts. 1997). Hátránya azonban, hogy több olyan gyakori ektomikorrhizás gombafaj van, mely nem hoz létre sporokarpiumot (pl. Cenococcum geophilum), vagy ivaros szaporítóképlete nehezen észrevehető (pl. a corticioid vagy a tomentelloid termőtestek) (Dahlberg és mts. 1997, Horton és Bruns 2001). A termőtestképzés fiziológiai feltételei miatt (Gardes és Bruns 1996) ráadásul egy élőhely mikobiótájának nem minden tagja képez egy adott időben termőtestet és még az egyes fajok sporokarpium-képzése is periodikus. Ha mindehhez hozzávesszük azt a tényt, hogy a gyorsan beinduló autolitikus folyamatok miatt a legtöbb gombafaj termőteste rövid élettartamú (Jakucs 1999), elmondható, hogy egy gombaközösséget sporokarpium-vizsgálatok segítségével csak több éven át folytatott, évente többször megismételt mintavételezéssel lehet – és akkor is hiányosan - megismerni (Pál-Fám 2002, Siller és Maglóczky 2002). A termőtestvizsgálatok további hátránya, hogy az ektomikorrhizák – mint anatómiai képletek – abundancia-viszonyairól nem szolgáltat információt. Több szerző eredményei ugyanis azt mutatják, hogy a sporokarpiumok dominancia-viszonyai nem tükrözik az ektomikorrhizaként megjelenő fajok előfordulási gyakoriságát a gyökereken (Gardes és Bruns 1996, Dahlberg és mts. 1997). A területen található termőtestek meghatározása mellett az ektomikorrhizák morfológiája (sztereomikroszkóppal megfigyelhető tulajdonságainak összessége) és fénymikroszkópos 18

anatómiája is részletesen tanulmányozható, és felhasználható a fajok azonosításához (Agerer 1991, Agerer 1987-). Ennek elsődleges oka, hogy e jellemzőket a két partner együttesen határozza meg: az elágazási rendszert és részben a Hartig-háló szerkezetét elsősorban a fotobionta, a köpeny és a kiágazó elemek struktúráját a gombapartner szabja meg (Smith és Read 1997). Ráadásul a mikorrhizák kevésbé efemer képletek, mint a termőtestek, ezért a segítségükkel megállapított fajösszetétel kevésbé függ a mintavétel időpontjától, mint a termőtestek esetében (Kåren és mts. 1997). Kellő tapasztalattal tehát ektomikorrhiza-anatómiai vizsgálatokkal is gyorsan elvégezhető a fajmeghatározás (Dahlberg 2001). Tisztában kell lennünk azonban azzal is, hogy laboratóriumi tenyészetekben és bizonyos környezeti körülmények megváltozásának hatására (pl. műtrágya-bemosódásos területeken) egy adott mikorrhiza anatómiája (és akár morfológiája is) megváltozhat (Agerer 1991, Egger 1995, Buscot és mts. 2000). Ugyanakkor több olyan rokon faj van, melyek mikorrhizáinak anatómiája nagyon hasonló, amit az okoz, hogy a faji elkülönülés korábban jelentkezik genetikai szinten, mint az anatómiai bélyegekben (Sakakibara és mts. 2002). A 20. század első felében kevesen foglalkoztak ektomikorrhiza-anatómiával (Agerer 1996a). A 30’-as évekig csak néhány szerző (pl. Mangin, Melin és Peyronel) közölt részletes leírást. 1956-ban azonban úttörő jellegű áttekintés született Dominik tollából, melyben morfológiai alapon (a keresztmetszetek alapján) már összehasonlító rendszerben tárgyalta az ektomikorrhizákat: a köpenyszerkezet alapján altípusokat, ezeken belül a szín alapján „nemzetségeket” különített el. A 60’-as években a Torino-csoport tagjai (Ceruti, Bussetti, Fassi, De Vecchi, Fontana és Centrella) az ektomikorrhizák metszeteinek vizsgálata mellett már a különböző kiágazó képletek (hifák, rizomorfák, cisztídiumok) anatómiáját is tanulmányozták. A köpenyszerkezet vizsgálata (Gibelli és Frank óta először) Chilvers 1968-as munkájában jelenik meg ismét, ő a lazább szerkezetű köpenyt – mai elnevezéssel plektenchima – prozenchimának, a kompaktabb szerveződésű (pszeudoparenchimatikus) típust szinenchimának nevezte (Chilvers 1968a). (Egyes munkák még napjainkban is ezt az elnevezést használják – pl.: Fujimura és mts. 2005) Chilvers (1968a) a köpenyszerkezet mellett a rhizomorfákat és a cisztídiumokat is tipizálta. A 60’-70’-es években Zak folytatott részletes vizsgálatokat: mikorrhiza- és rhizomorfa-metszetek mellett „köpeny-kaparékokat” is tanulmányozott, valamint a mikorrhizáról gombatenyészeteket is izolált, és ez alapján próbálta meghatározni a mikobiontákat. A megfigyelt bélyegeket 1973-as cikkében foglalta össze (Zak 1973), melyben a rhizomorfák szerkezete alapján egyes fajok rendszertani helyzetének megváltoztatására is javaslatot tett. 19

Az 1980’-as évek második felétől egyre több ektomikorrhizának a korábbbiaknál részletesebb leírása született meg (Agerer 1987-). Ingleby és mts. (1990), Haug és Pritsch (1992) és Goodman és mts. (1996-98) már különböző típusok morfológiai-anatómiai leírásait összefoglaló munkákat közöltek. A múlt század utolsó évtizedének elejére az ektomikorrhizajellemzés standardizált módszertanát is kidolgozták (Agerer 1991), megalapítottak egy külön az ektomikorrhizák leírására szolgáló folyóiratot (Descriptions of Ectomycorrhizae, Agerer és mts. 1996-) és megjelentettek számos képes kiadványt (Colour Atlas of Ectomycorrhizae, DEEMY CD-ROM – Agerer (1987-), Agerer és Rambold 1998, 2004-2005). Az egységes elvek szerint leírt ektomikorrhizák számának gyarapodása már lehetővé tette az egyes típusok pontosabb azonosítását is, bár a mikroszkópos módszerek (részletesen l. az Anyag és módszer c. fejezetben) időigényesebbek és bizonyos fokú szakmai tapasztalatot követelnek. Az említett bemutató művek tartalmazzák az ektomikorrhiza-morfológia és -anatómia fontosabb bélyegeit, azok lehetséges típusait. Az anatómiai bélyegek közül Agerer (2006) elsődlegesen négyet tekint a meghatározás szempontjából informatívnak: (1) a gombaköpeny külső rétegének szerkezetét, (2) a rhizomorfák struktúráját, (3) a cisztídiumok alakját és (4) a kiágazó hifák szerkezetét. Emellett megállapítja azt is, hogy további két morfológiai karakter (a hisztokémiai reakciók (5) és az ektomikorrhiza színe (6)) is segíti az identifikálást (a bélyegek az említésük sorrendjében egyre kevésbé jelzik biztosan a faji hovatartozást– Agerer 2006). A disszertáció morfológiai és anatómiai vonatkozású eredményeinek értelmezését megkönnyítendő, az alábbiakban röviden ismertetem az ektomikorrhizák jellemzésére szolgáló alapfogalmakat. Az áttekintéshez Agerer összefoglaló munkáit vettem alapul (Agerer 1991, 1996a, 2006). Az egyes bélyegek tárgyalásánál eltekintek attól, hogy minden egyes pontnál ezeket a munkákat mondatonként hivatkozzam. A mikorrhiza habitusán (morfológiáján) a gombaköpennyel borított gyökérvég sztereomikroszkóppal megfigyelhető általános megjelenését értjük. Jellemző, hogy vannak-e elágazások a mikorrhizán, és ha igen, azok milyen rendszert követnek. Ez lehet főtengelyes (monopodiális) vagy villás (dichotomikus). A főtengelyesen belül megkülönböztetjük a tér több irányába álló oldalágakkal rendelkező piramidális, illetve az oldalágakat egy síkban növesztő, tollszerű (pinnátus) rendszereket. Ha a dichotomikusan elágazó mikorrhiza oldalágai igen rövidek, koralloid mikorrhizáról beszélünk. Az elágazási rend teljesen szabálytalan szerkezetű is lehet. Fontos bélyeg az elágazás rendje, ami lehet egyszeres vagy többszörös. Az említettek mellett rögzítendők még a gombaköpennyel borított gyökérvég fontosabb méretei (a főtengely és az oldalágak hossza, átmérője stb.) és a színe. Jellemző 20

lehet a mikorrhiza felszíne: sima, tüskés vagy a kiágazó hifáktól vattás, gyapjas, boríthatják kristályok, talajszemcsék. A

gombaköpeny

interferenciakontraszt

rétegeinek

(külső,

(Nomarski-DIC)

középső,

mikroszkóppal

belső)

szerkezete

vizsgálható

differenciál-

(2.

ábra).

A

köpenyszerkezet alapvetően kétféle lehet: plektenchimatikus (más néven prozenchimatikus), melynek sejtjei megnyúltak, benne a hifás szerveződés még felismerhető, valamint, pszeudoparenchimatikus (vagy szinenchimatikus), melyben a hifák korlátolt növekedésűek, izodiametrikus alakot vesznek fel (a név is a növényi parenchimára emlékeztető szerkezetből ered). A plektenchimatikus köpenyeken belül különböző altípusokat különítenek el a hifák lefutása (rendezetlen, sűrűn elágazó - hálózatos, gyűrűszerűen futó kötegekkel rendelkező vagy csillagszerűen rendeződő), valamint a köpenyfelszínen található képletek alapján (cisztídiumok, gömb alakú sejtek, zselatinszerű mátrix) (2/A-G, J ábra). Megkülönböztetünk egy átmeneti típust is (2/H ábra), melyben a szabálytalan alakú és irányultságú hifák már a pszeudoparenchimatikus szerkezet felé mutatnak. A pszeudoparenchimatikus köpenyeket az alkotó sejtek alakja (szögletes-anguláris vagy hullámos falú-epidermoid) és a felszíni képletek alapján (gömb alakú vagy ellaposodott sejtek csoportjai, a felszínen futó hifahálózat) osztályozhatjuk tovább (2/K-P ábra). Annak is jelentősége van, ha a köpenyt alkotó sejtek illetve hifák valamilyen anyagot (granulumokat, olajcseppeket vagy tejnedvet) tartalmaznak. Természetesen a gombaköpeny kvantitatív jellemzői is fontosak a jellemzés során.

2. ábra. Köpenytípusok. A plektenchimatikus (balra, A-I) és a pszeudoparenchimatikus (fent, KP) köpeny morfológiai típusai. (Agerer 1991 nyomán)

21

A gombaköpenyből eredő kiágazó képletek kapcsán a kiágazó hifákról, az ezek összefonódásával létrejövő rhizomorfákról valamint a köpenyből induló, de korlátolt növekedésű cisztídiumokról kell szót ejteni. A kiágazó hifák esetében a szeptáltság (primer ill. szekunder szeptumok megléte, távolsága, csatok jelenléte, jellemzői), a hifafal vastagsága valamint az anasztomózisok szerkezete a legfontosabb bélyeg. A rhizomorfák esetében elsősorban

azok

szerkezeti

összetettsége

a

megfigyelendő: a laza hifakötegektől egészen a jól struktúrált, vastag, sokszor másodlagosan feloldódott szeptumú, gyors szállításra módosult edényszerű hifákat tartalmazó

rhizomorfákig

több

átmeneti

típus

elkülöníthető. A cisztídiumok esetében gyakoriságuk és méretük mellett változatos alakjuk (pl. palack formájú, 3. ábra. A cisztidiumok típusai. (Agerer 1991 nyomán)

gömbös, retorta alakú vagy akár hosszú, árszerű) a legfontosabb megkülönböztető bélyeg (3. ábra). A

kiágazó elemek (elsősorban hifák, rhizomorfák) megléte szorosan összefügg a mikorrhizát alkotó gomba táplálékfelvételi módjával; ez alapján Agerer (2001) különböző tápanyag„kihasználási típusokba” („exploration types”) sorolta az ektomikorrhizákat. Az ektomikorrhizákhoz néha egyéb anatómiai képletek is kapcsolódhatnak: ilyenek a hosszabb, kedvezőtlen időszak átvészelésére szolgáló klamidospórák vagy a hifák tömött szövedéke alkotta kitartóképletek, a szkleróciumok. Ezek jelenléte, szerkezete szintén fontos bélyeg a mikobionta meghatározásában. Sok információt hordoz az ektomikorrhiza hosszmetszeti képe is. (A keresztmetszet a gyökér hossztengelye mentén megfigyelhető, mikorrhiza-fejlettség szerinti tagolódás miatt kevésbé informatív.) Feljegyzendő, hogy a Hartig-háló hány sejtsor mélységéig hatol be a gyökér szöveteibe: amennyiben csak egy sejtsort vesz körül, megfigyelhető-e a belső periklinális falak mentén is (periepidermális Hartig-háló), vagy csak az antiklinális falakon (paraepidermális Hartig-háló). Jellemző a Hartig-hálóval körülvett sejtek alakja is: radiális vagy tangenciális irányban megnyúltabb-e a sejt. A kortikális sejteket övező hifák keresztmetszeti képe is karakterisztikus bélyeg: ezek elhelyezkedhetnek egy vagy több sorban a sejtek körül, néha egy-egy ponton megnagyobbodva betüremkedhetnek a kérgi sejtekbe is, hausztórium-szerű képleteket hozva létre. Az ektomikorrhiza-morfológia pontos ismerete elengedhetetlen az egyes faj-faj kapcsolatok azonosításához, egy életközösség mikorrhizáinak megismeréséhez. Emellett azonban – azon bélyegek alapján, amiket a gombapartner határoz meg – egyes szerzők az 22

ektomikorrhizák anatómiáját a gombák érintett csoportjai evolúciós kapcsolatainak, filogenetikai rendszerének felderítésében is nélkülözhetetlennek vélik. Agerer (1999) áttekintést ad az egyes gombacsoportokban megfigyelhető fontosabb ektomikorrhizabélyegekről, és egy, a mikorrhiza-anatómián alapuló természetes osztályozási rendszer kidolgozására is javaslatot tesz. Szintén ebben a munkájában fogalmazza meg az egyes bélyegek (köpenystruktúra, rhizomorfák szerkezete) leszármazási kapcsolatainak egy lehetséges elméletét. A meghatározásra egy további lehetőséget nyújt, ha a mikorrhizáról izolálni tudjuk a mikobiontát, és a telep morfológiai tulajdonságainak, valamint meghatározott kémiai reagensekkel adott reakciók eredményeinek a felhasználásával azonosítjuk azt (Hutchison 1990, Egger 1995). Ennek azonban több hátránya is van: az izolátumok esetében is megfigyelhetők fajon belüli eltérések az egyes törzsek között, a szimbionta gombák nagy része csak nehezen tenyészthető steril kultúrában, mivel fenntartásukhoz szükségesek a partnertől származó tápanyagok, hormonok és vitaminok (Debaud és mts. 1999), ráadásul az izolálási ill. tenyésztési módszerek is jelentősen befolyásolhatják az azonosítás eredményeit (Brundrett és mts. 1999, Tabacchioni és mts. 2000). II. 6.2. Molekuláris taxonómiai módszerek Mivel a morfológiai karakterek esetében nagy fenotípusos változatosság figyelhető meg akár egy adott gomba-növény kapcsolat esetében is (Izzo és mts. 2005a), a morfotipizáláson alapuló vizsgálatok többnyire túlbecsülik egy-egy közösség EM-diverzitását (Burke és mts. 2005). Ez a magyarázata annak, hogy a technológiák fejlődésével a kemotaxonómiai bélyegek alkalmazása előtérbe került a fajmeghatározásban. „Kemotaxonómia” alatt – tág értelmezésben – az összes kémiai vegyület összehasonlító elemzését értjük (Frisvad és mts. 2008). Az ebben az értelemben vet “kemotaxonómiai alapú” módszerek áttekintését, és alkalmazásukat az ektomikorrhiza-közösségek vizsgálatában az 1. táblázatban foglalom össze. A gombaközösségek biokémiai alapú vizsglatai (Guarro és mts. 1999) jelenthetik különböző egyszerűbb kémiai vegyületek (pl. lipidek: FAME- ill. PLFA-analízis – Zelles 1999; glomalin – Treseder és Turner 2007), ill. biopolimermolekulák vizsgálatát. Vannak olyan módszerek is, melyek a közösségeknek nem strukturális, hanem funkcionális

23

diverzitását képesek felmérni (pl. az élettani-profilt feltáró SCSU- vagy CLPP-vizsgálatok – Garland és Mills 1991, Classen és mts. 2003). A DNS-alapú metódusok alkalmazásának lehetőségeit számos összefoglaló cikk ismerteti, mind általános mikrobiális ökológiai (Olive és Bean 1999, Tiedje és mts. 1999, Ranjard és mts. 2000, Pénzes és mts. 2002, Forney és mts. 2004, Kirk és mts. 2004), molekuláris epidemiológiai (Traub és mts. 2005), mind pedig mikológiai vonatkozásban (Bridge 2002, Kennedy és Clipson 2003, Anderson és Cairney 2004, Mitchell és Zuccaro 2006, Bärlocher 2007), sőt kimondottan a mikorrhiza-kutatás területén is (Martin 2007). Ezeknek a molekuláris módszereknek az alapvető célja, hogy különböző objektumokból származó DNS-minták hasonlóságára következtessenek, tehát legtöbbjüket eredetileg mint molekuláris taxonómiai markereket fejlesztették ki. Mivel azonban a mikrobiális közösségek összehasonlítása is alapulhat a belőlük kinyert DNS-molekulák egybevetésén, legtöbbjük – kis módosításokkal – alkalmazható az ökológiai diverzitás tanulmányozására. Ebben az esetben a talajmintákból kinyert teljes DNS-készletet vizsgáljuk illetve hasonlítjuk össze egymással (Kirk és mts. 2004). A DNS-alapú azonosítás során a kinyert, megtisztított örökítő anyagot vizsgáljuk olyan módszerrel, aminek eredményét (pl. gélképen megfigyelhető sávmintázatot, kromatogramot) a DNS nukleotid-sorrendje határozza meg. A meghatározáskor a különböző egyedek vizsgálatából származó eredményeket vetjük össze. A módszerek mindegyikéhez nagy mennyiségű, tiszta DNS-re van szükség, amit különböző DNS-izolálási módszerekkel érhetünk el (Raeder és Broda 1985, Gardes és Bruns 1993). A kinyert DNS-t a technikák egy részében közvetlenül használhatjuk a további lépések során (teljes közösségi DNS-analízis), máskor (a közösségi DNS egy részletére irányuló vizsgálatok) a kapott DNS-elegy egyes részeit fel kell szaporítanunk (Ranjard és mts. 2000, Kirk és mts. 2004). Az előbbi csoportba tartozik a GC-tartalom becslése (Torsvik és mts. 1990, Holben és Harris 1995), a DNSmegolvasztást követő reasszociációs kinetika vizsgálata, a DNS-hibridizációs vizsgálatok (Torsvik és mts. 1990, Cho és Tiedje 2001, Tiedje és mts. 1999, Bridge 2002) valamint a mikrochip-felületen végzett DNS-hibridizáció (DNS-microarray - Gentry és mts. 2006, Ye és mts. 2001). Ezek a módszerek az ektomikorrhiza-közösségek tanulmányozására nehezebben alkalmazhatók, mivel egyrészt nagy mennyiségű, tiszta DNS-t igényelnek (Ranjard és mts. 2000), másfelől pedig a mintában (talajban) levő összes hifa örökítő anyagát egyenrangúan kezelik (azaz nem derül ki, hogy a mintába került gombafaj kialakít-e ektomikorrhizát a gazdanövényen). Egyes előre kiválasztott DNS-szakaszok felszaporításában a módszertani áttörést a polimeráz-láncreakció (polymerase chain reaction, PCR) technológiájának 24

kifejlesztése (Saiki és mts. 1985, Mullis és Faloona 1987) hozta meg. E módszer lényege, hogy egy termostabil polimeráz enzim (a hőforrásokban élő Thermus aquaticus baktérium ún. Taq-polimeráza) segítségével in vitro felszaporíthatjuk a genom egy kiválasztott szakaszát. (A múlt század végén az előre kiválasztott génszakaszok felszaporítására egyéb módszereket is kidolgoztak (pl. NASBA, LCR, vagy a szál-áthelyeződésen alapuló replikáció – Monis és mts. 2005), ezek mégsem váltak széles körben alkalmazottá.) A PCR alkalmazása – az esetek többségében – előzetes ismereteket igényel a felszaporítandó génszakaszról, mivel a DNS-polimerizáció megindításához szükségünk van a kiválasztott génszakaszt két oldalról közrefogó szekvencia-részletekhez specifikusan kötődő, komplementer nukleotid-sorrendű primerpárra is. Megfelelő primerpárt kiválasztva azonban elméletileg az örökítő anyag bármely régióját megsokszorozhatjuk. A PCR előnye, hogy nagyon kevés kiindulási DNS-ből kísérletes körülmények között is előállíthatunk akkora mennyiséget, mellyel már elvégezhetők az azonosításhoz szükséges vizsgálatok. A DNS-alapú fajmeghatározási módszerek alkalmas célszekvenciáinak fontos ismérve a nagy fajok közötti (interspecifikus) és kis fajon belüli (intraspecifikus) változékonyság (Egger 1995). Ennek a két kritériumnak eleget tesznek a riboszómákat alkotó RNS-molekulák (rRNS-ek) génjei (rDNS). Ezek a gének a genomban tandem ismétlődő formában, nagy kópiaszámban fordulnak elő, így igen kevés örökítő anyagot tartalmazó mintából kiindulva is nagy valószínűséggel állítható elő a további vizsgálatokhoz szükséges DNS-mennyiség (Debaud és mts. 1999). A genomban levő kópiákat molekuláris mechanizmusok („molecular drive”, „concerted evolution”) homogenizáják, így azok szekvenciája többnyire azonos (Egger 1995). A PCR-alapú vizsgálatok értékelésénél azonban figyelembe kell vennünk, hogy több gombacsoport esetében tapasztaltak egy-egy genomon belüli rDNS-változékonyságot (O’Donnell és Cigelnik 1997, Thompson és mts. 1999). Nagy kópiaszáma mellett az rDNS további előnye, hogy több, különböző sebességgel evolválódó szakaszt tartalmaz, így különböző rendszertani szinteken teszi lehetővé az azonosítást (Debaud és mts. 1999, Buscot és mts. 2000). A DNS-kifejeződés tekintetében mRNS-formába átíródó szakaszokból és az ezeket elválasztó nem átíródó elemekből („nontranscribet spacer” = NTS, vagy gének közti szakasz: „intergenic spacer”= IGS 1 és 2) áll (4. ábra). Az átíródó szakaszt, melyről egyetlen mRNS készül, az rRNS-eket kódoló szakaszok (18S rDNS, 5,8S rDNS, 28S rDNS) valamint átíródó, de az mRNS érése során kivágódó szakaszok („internal transcribed spacer” = ITS 1 és 2) alkotják. Az NTS szakasz belsejében, ellentétes leolvasási irányultságban helyezkedhet el a legkisebb rRNS, az 5S rDNS génje. A 18S rDNS 3’-végét, az ITS1-et, az 5,8S rDNS-t, az ITS2-t és a 28S rDNS 5’-végét magába 25

foglaló szakaszt hagyományosan ITS-régió névvel illetik, IGS-nek pedig a 28S rDNS 3’ végétől a 18S rDNS 5’-végéig tartó, az IGS1 és -2 mellett az 5S rDNS-t is tartalmazó szakaszt nevezik (Buscot és mts. 2000).

4. ábra. A riboszomális gének szerkezete és a munka során használt gombaspecifikus primerek bekötési helyei. Rövidítéseket l. a szövegben; a primerek dőlt betűvel szedve. (Buscot és mts. 2000, Egger 1995 nyomán)

Az átíródó, kódoló szakaszok szekvenciája a legkonzervatívabb (Horton és Bruns 2001). Ennek oka, hogy termékük a riboszómában stabilizáló illetve ribozimfunkciót lát el, ezért a mutációk nagyobb valószínűséggel okoznának káros működésváltozást. A bakteriális vizsgálatokban elsősorban a kis riboszóma-alegység rRNS-génjét (16S rDNS) alkalmazzák, mivel körükben az azonosításhoz elegendő ennek a szakasznak a változékonysága is. Az ismert mikrobiális 16S rRNS-géneket molekuláris adatbázisokban foglalják össze (“Ribosomal Database Project-II”: Maidak és mts. 2001, Cole és mts. 2003). A mikorrhizagombák meghatározásához, mivel sok esetben közeli rendszertani csoportok összehasonlítását igénylik, ez a génszakasz (az eukarióta kis alegység RNS génje: 18S rDNS) nem, vagy csak egyes csoportokon belül (pl. VAM-gombák esetében) alkalmazható (Anderson és Cairney 2004). A nem kifejeződő szakaszok (IGS, ITS) evolúciós rátája sokkal nagyobb, így ezek már egymáshoz rendszertanilag sokkal közelebb álló csoportok (nemzetségek, fajok, bizonyos esetekben populációk, törzsek) megkülönböztetésére is alkalmazhatók. A riboszomális génkomplex konzervatív régióinak megvan az a további előnye, hogy segítségükkel megtervezhetők azok a primerek, melyek biztosan a génkomplexen belül kötnek a DNS-hez, ezáltal annak felszaporítására alkalmasak (Debaud és mts. 1999). Azoknak a szekvenciáknak a felderítése is fontos lehet, melyek a nagyobb taxonokon belül állandók, de variábilisak ezen taxonok között, segítségükkel ugyanis csak a taxon képviselőinek DNS-ét felszaporító, ún. taxon-specifikus primerek tervezhetők (Weising és mts. 1995). Ez különösen előnyös abban az esetben, ha kevert, tehát több különböző egyedből származó DNS-t tartalmazó mintát szeretnénk megvizsgálni. 26

Ektomikorrhizák esetében a kinyert, növényi és gomba eredetű DNS-t egyaránt tartalmazó minták vizsgálata gombákra specifikus primerek használatát igényli. Ezek közül a riboszomális génkomplex különböző szakaszaihoz kötő párokat elsőként White és mts. (1990) valamint Gardes és mts. (1991) terveztek ill. teszteltek sikerrel, majd Gardes és Bruns (1993) fejlesztettek tovább (4. ábra). A nukleáris riboszomális génkomplex tagjai mellett kifejlesztettek a mitokondriális rDNS in vitro felszaporítására alkalmas primereket is (Gardes és Bruns 1996, Horton és Bruns 2001). Az alkalmazható primerek listáját a legfontosabb gomba-specifikus primereket összefoglaló cikkek mellett (pl. Henrion és mts. (1992), Egger (1995), Anderson és Cairney (2004), Mitchell és Zuccaro 2006) egyes nagyobb molekuláris mikológiai

laboratóriumok

honlapjain

is

megtalálhatjuk

(http://mollie.berkeley.edu/

wbruns/primers.html; http://www.biology.duke.edu/fungi/mycolab/primers.htm). A gomba-primerek taxonspecifitását és taxon-torzítását (azt a jellemzőjüket, hogy kevert mintában nem egyforma hatékonysággal sokszorozzák fel a különböző taxonok DNSszakaszait), többen tesztelték (Borneman és Hartin 2000, Anderson és mts. 2003, Kirk és mts. 2004). Bár több szerző is kimutatta, hogy a leggyakrabban alkalmazott primerek képesek elkülöníteni a gomba-DNS-t a növényi DNS-től (Gardes és Bruns 1993, Dahlberg és mts. 1997), vannak olyan mikorrhizás növényfajok (pl. a Monotropaceae családban), melyek DNS-ét felszaporítja az ITS1-ITS4 primerpár (Horton és Bruns 2001). A közösségi vizsgálatok esetében, amikor a talajmintából az összes gombahifa DNS-ét egyszerre kell kivonni, problémát jelenthet az is, ha az alkalmazott primerek nem egyforma intenzitással kötődnek a különféle taxonok DNS-éhez. A felszaporított DNS-szakaszokban rejlő információt számos különböző módszerrel vizsgálhatjuk (1. táblázat). A legegyszerűbb esetben a szakasz hosszának hasonlóságából következtetünk a taxonok hasonlóságára, illetve az egy-egy mintaként kinyert DNSkeverékből felszaporítható DNS-szakaszok hosszpolimorfizmusa alapján következtetünk a kiindulási minták taxon-összetételének hasonlóságára (RISA ill. ARISA módszerek). A DNS-szakaszok hosszának vizsgálata során a beékelődések (inszerciók) és kiesések (deléciók) evolúciós eseményeit használjuk ki. A nukleinsav-szekvenciát vizsgáló molekuláris 5. ábra. Az RFLP módszer.

technikák egy további, széles körben alkalmazott

típusa már egyes, a nukleotidsorrendet érintő szubsztitúciós változások kimutatására is 27

alkalmas: az „RFLP”-módszer során bakteriális eredetű, a DNS-t adott szekvenciájú helyeken hasító ún. restrikciós enzimekkel feldaraboljuk a minta-DNS-t, gélelektroforetikus eljárással elválasztjuk egymástól a különböző hosszúságú DNS-fragmenseket, majd a kapott gélkép sávmintázatából következtethetünk (5. ábra) a DNS-szekvenciák hasonlóságára (Henrion és mts. 1992, Weising és mts. 1995, Dowling és mts. 1996). A PCR-rel kiegészített RFLP (PCR-RFLP) technikát, illetve annak egy speciális típusát, az ARDRA-t rendszeresen alkalmazzák mikorrhiza-közösségek tagjaiból származó DNSmolekulák elkülönítésében (Liu és mts. 1997, Kirk és mts. 2004). A minták faji azonosítására is van mód, ha rendelkezésünkre állnak korábban azonosított taxonokból nyert DNSszakaszok adott enzimekkel készített hasításának eredményei (Kåren és Nylund 1997, Kåren és mts. 1997, Horton és Bruns 2001, Sakakibara és mts. 2002). A különféle hosszúságú DNSfragmensek összevetését különböző szoftverek segítik (pl.: FragMatch – Saari és mts. 2007). Bár az RFLP egy viszonylag könnyen, gyorsan és olcsón kivitelezhető meghatározási technika (Martin 2007), a genetikai változékonyságnak csak bizonyos komponenseit vizsgálja. Előfordul, hogy egy fajon belül (többnyire különböző földrajzi környezetből izolált törzsek esetében) többféle sávmintázat is megjelenik (Kåren és mts. 1997), vagy több különböző (többnyire egy nemzetséghez tartozó) faj azonos képet mutat (Gardes és mts. 1991, Henrion és mts. 1992, Gardes és Bruns 1996, Sakakibara és mts. 2002). Hebeloma mesophaeum esetében a dikariotikus hifák két különböző magjában a homológ kromoszómákon mutattak ki eltérést az ITS-régiókban (l. Buscot és mts. 2000). Az azonos sávmintázatot adó, különböző fajhoz tartozó gombák problémájának egy lehetséges megoldása az, ha többféle endonukleázzal történt emésztés eredményét is összehasonlítják. A múlt század végén ugrásszerűen megindult a teljes DNS-szakaszban rejlő nukleotidszekvencia információját kihasználó módszerek fejlesztése. Ezek között vannak a korábbi módszerek továbbfejlesztései (pl. a mikorhiza közösségekre is használt T-RFLP módszer – Johnson és mts. 2004, Mummey és mts. 2005, Aldrich-Wolfe 2007, Curlevski és mts. 2009, Genney és mts. 2006), mások új alapelvként az egy- ill. kétszálú DNS-molekula nukleotidsorrendjétől függő konformációját használják ki az összevetések során (SSCP, DGGE ill. TGGE vizsgálatok – Orita és mts. 1989, Muyzer 1999). A hossz-polimorfizmus vizsgálatok egy speciális alcsoportját jelenti a genomban ismétlődő szatellit-DNS-ek (Olive és Bean 1999, Féral 2002), azon belül is a mikro- ill. miniszatellitek analízise (Debrauwere és mts. 1997, Féral 2002, Dutech és mts. 2007). Ezek elsősorban faj alatti rendszertani kategóriák elkülönítését teszik lehetővé, és populációs vizsgálatokra alkalmasak. 28

Szintén a faj alatti kategóriák elkülönítését teszik lehetővé az önkényesen megválasztott (szekvencia-független) primerekkel végzett DNS-ujjlenyomat vizsgálati módszerek (RAPD, DAF, AP-PCR), melyeket összefoglalóan MAAP-módszereknek („multiple arbitrary amplicon profiling”, vagyis „önkényesen felszaporított DNS-szakaszok hosszpolimorfizmusvizsgálata” – Weising és mts. 1995) nevezünk. Az itt felsorolt módszerek bemutatását is az 1. táblázat tartalmazza. Az eddig számba vett PCR-alapú technikák egyik része (PCR-RFLP, DGGE/TGGE, SSCP, T-RFLP) nem használta ki a felsokszorozott DNS-szakaszokban rejlő teljes genetikai információt a közösségek tagjainak összehasonlítása, azonosítása során, a másik részük pedig a megfelelő sztenderdek hiánya miatt (MAAP) nem alkalmas arra, hogy pontos képet adjon a vizsgált közösség fajösszetételéről. A faji szintű meghatározást leghatékonyabban az szolgálja, ha a vizsgált génszakasz(ok) teljes nukleotid-szekvenciáját vetjük össze már ismert, és azonosított fajok génszekvenciáival. Ehhez azonban biztosítani kell, hogy a későbbi molekuláris vizsgálatokban a közösség különböző fajaiból származó DNS-molekulái külön kezelhetők legyenek. Ennek az egyik lehetősége, ha a DNS kinyerése előtt különválasztjuk a mintaterületről származó különböző anatómiai típusú mikorrhizákat. A másik lehetőség, ha maga a szétválasztás is a molekuláris munkálatok részét képezi. Ennek leggyakrabban alkalmazott módja a közösségből kinyert teljes DNS klónozása, majd a kapott klónkönyvtár tagjainak szekvenálása (Martin és mts. 2007). Ez a módszer a leginkább idő- és költségigényes, még akkor is, ha korábban már ismertetett módszerekkel (pl. RFLPanalízissel) a hasonló klónok közös taxonómiai egységekbe vonhatók össze, ezáltal csökkentve a vizsgálandó klónok számát (Anderson és Cairney 2004). A klónozáson alapuló közösségi DNS vizsgálatnak egy további buktatója lehet, hogy a teljes DNS-állomány közös felszaporítása viszonylag könnyen eredményezheti különböző egyedek DNS-szakaszainak „összeolvadását”, azaz kiméra-szekvenciák keletkezését (Richards és Bass 2005, Martin 2007), melyek torzíthatják a közösségről tett megállapításokat (l. pl. Jumpponen 2003). Ezeket a kiméra-szekvenciákat utólag – megfelelő szoftver segítségével – ki kell keresni. A fent említett negatívumok ellenére, amennyiben a megfelelő költség-fedezet ill. munkaerő rendelkezésre áll, ezt a módszert tekinthetjük a legmegbízhatóbbnak (Forney és mts. 2004). A szekvenciák faji szintű azonosításhoz – néhány korábban már említett technikához hasonlóan – referenciákra vagy adatbázisokra van szükség. Ilyen szekvencia-adatbázisok ez esetben

is

a

nukleáris

és

a

mitokondriális

riboszomális

génkomplex

29

1. táblázat. A tág értelemben vett kemotaxonómiai módszerek áttekintése. A módszer neve zsírsav-metil-észter analízis („Fatty Acid Methyl Esther”, „FAME”) foszfatid-zsírsav profil vizsgálat („Phospholipid Fatty Acid”, „PLFA”) „önmagában hasznosítható szénforrás” – analízis („single carbon source utilisation”, „SCSU”-analízis) „közösségi szintű élettani profil” vizsgálat („community-level physiological profiling”, „CLPP”) az rDNS géneket elválasztó szakaszának hosszpolimorfizmus vizsgálata („rRNA intergenic spacer analysis”, „RISA”) automatizált „RISA” („ARISA”) restrikciós enzimekkel végzett hasítás eredményeképpen kapott DNS-szakaszok hosszpolimorfizmusának vizsgálata („restriction fragment length polymorfism”, „RFLP”) felsokszorozott riboszomális gének RFLP-analízise” („amplified ribosomal DNS restriction analysis”, ARDRA) a primerbekötési helyet tartalmazó DNS-szakaszok hossz-polimorfizmusának vizsgálata ( „terminal restriction fragment length polymorphism”, T-RFLP)

A módszer rövid leírása

A módszer hivatkozása

A módszer alkalmazása EM-közösségekre

A mintából kinyert össz-lipidtartalom kromatográfiás elválasztásával, megfelelő sztenderdek segítségével következtetünk annak összetételére. Megfelelő lipid-komponensek egyes rendszertani csoportok jelenlétére utalhatnak.

Nylund és Wallander (1992), Zelles (1999), Klamer és Bååth (2004), Graham és mts. (1995)

(VA-közösségekre alkalmazták)

Egyetlen szénforrásként különböző vegyületeket tartalmazó táptalajokon tenyésztik a vizsgált taxont vagy a közösségből származó teljes izolátumot, s megfelelő indikációs technikával kideríthető, hogy az adott közösség vagy taxon mely szénforrások hasznosítására képes.

Graham és Mills (1991)

(VA-közösségekre alkalmazták)

Különböző, leadott exoenzimek kimutatásán alapuló módszer, melynek segítségével megmondható, hogy a vizsgált taxon vagy teljes közösség milyen szubsztrátok bontására képes.

Classen és mts. (2003)

Courty és mts.(2005)

Az rDNS valamely gyorsan evolválódó, gének közti szakaszát felszaporítjuk, majd agaróz gélen vizsgáljuk ill. összevetjük ezek hosszát.

Ranjard és mts. (2001)

Gardes és mts. (1991), Henrion és mts. (1992)

A RISA fluoreszcensen jelölt primerrel végzet, megfelelő érzékelőrendszer segítségével automatizálttá tett változata.

Fisher és Triplett (1999)

A DNS-t mikroorganizmusokból nyert, a DNS adott szekvenciájú szakaszait felismerő és hasító ún. restrikciós enzimekkel hasítjuk, majd a keletkező DNS-darabok számát és hosszát vizsgáljuk agaróz gélen. (Amennyiben nem a teljes genomot, hanem annak csak egy felsokszorozott részletét vizsgáljuk, PCR-RFLP módszerről beszélünk.)

Henrion és mts. (1992), Weising és mts. (1995), Dowling és mts. (1996)

A riboszomális gének PCR-RFLP-analízise. Közösségek összevetésére alkalmas módszer. A PCR során alkalmazott egyik primert (többnyire fluoreszcens festékkel) megjelölik, aminek következtében az egyik végükön jelölt DNS-darabok keletkeznek. Ezt követően restrikciós enzimekkel hasítják a terméket, majd csak a kimutatható (azaz a jelölt) DNS-szakaszok hosszát vizsgálják, ami így a DNS nukleotidszekvenciájától függ. Mivel ez a módszer mindig több taxonból származó DNS-keverékből indul ki, az eredmény a taxon-összetételre jellemző hossz-polimorfizmus kép.

Liu és mts. (1997)

Liu és mts. (1997)

Kåren és mts. (1997), Gardes és mts. (1991), Henrion és mts. (1992), Gardes és Bruns (1996), Sakakibara és mts. (2002)

Burke és mts. (2005) , Dickie és FitzJohn (2007), Genney és mts. (2006)

30

egyszálú DNS konformációs polimorfizmus-vizsgálata („single-strand conformation polymorphism”, SSCP-analízis) hőmérsékleti gradiensben végzett gél-elektroforézis („temperaturegradient gel electrophoresis”, TGGE) denaturáló vegyület gradiense mellett végzett gél-elektroforézis („denaturating gradient gel electrophoresis”, DGGE) mikroszatellit-analízis

A denaturálással egyszálúvá tesszük a vizsgálandó DNS-molekulákat, melyek így a nukleotidsorrendjüktől függő konformációt veszik fel (a bázispárosodás miatt). Az elválasztásra szolgáló gélben a különböző konformációjú DNS-fonalak különbözős sebességgel mozognak. A kétszálú DNS-molekulákat hőmérsékleti olyan gélben választjuk szét egymástól, melyben hőmérsékleti gradienst alakítunk ki. A nukleotid-sorrendtől függően a DNS-szálak a gél különböző pontjain denaturálódni kezdenek, s vesznek fel a szekvencia meghatározta konformációt. Ezért különböző sebességgel mozognak a gélben. Az alapelv a TGGE-módszerhez hasonló, ebben az esetben a DNS-molekulák denaturálódását valamilyen kémiai, a DNS-szerkezet megváltozását kiváltó vegyület (pl. urea, formamid) koncentráció-gradiense okozza. Néhány bázisból álló szekvencia-részletek tandem ismétlődésével létrejövő ún. „szatellit”szekvenciák hossz-polimorfizmusának vizsgálata. A szatellit hosszát az ismétlődések száma adja meg.

véletlenszerűen felszaporított DNS-szakaszok hosszpolimorfizmus-vizsgálata („random amplified polymorphic DNA”, RAPD) önkényesen megválasztott primerekkel végzett PCR („arbitrarily primed PCR”, APPCR) DNS- felszaporítással végzett ujjlenyomat-vizsgálat („DNA amplification fingerprinting”, DAF)

A felszaporítandó DNS-re vonatkozó szekvencia-információ nélkül, önkényesen megválasztott pimerrel (ált. egyfélével!) végzünk PCR-t. A primerbekötési helyektől függ, hogy hány s milyen hosszúságú DNS-szakaszokat eredményez a PCR. (A három módszer a választott primer hosszában, a reakciókörülményeiben és az elválasztástechnikai módszerben különbözik egymástól.)

szekvenálás

A vizsgált DNS-szakasz teljes nukleotidsorrendjét mehatározzuk.

Orita és mts. (1989)

Hortal és mts. (2006)

Muyzer és mts. (1993), Muyzer (1999), Gelsomino és mts. (1999), Schmalenberger és Tebbe (2003)

Pennanen és mts. (2005)

Debrauwere és mts. (1997), Féral (2002)

Williams és mts. (1990)

Longato és Bonfante (1997), Anderson és mts. (1998), Dunham és mts. (2003), Hortal és mts. (2006) Lanfranco és mts. (1993), Doudrick és mts. (1995), Anderson és mts. (1998), Gomes és mts. (2000), Chen és mts. (2007)

Welsh és McClelland (1990)

Pinkas és mts. (2000)

Caetano-Anollés és mts. (1991)

(VA-közösségekre alkalmazták)

Hillis és mts. (1996)

Pl.: Tedersoo és mts. (2006a,b), Kraigher és mts. (2007)

31

tagjairól állnak rendelkezésünkre. Ezeket a világhálón is elérhető, rohamosan bővülő molekuláris adatbázisokban (GenBank, EMBL) találhatjuk meg, melyek között kimondottan gomba-szekvenciákat összegyűjtő adatbázisokat is találunk (UNITE – Köljalg és mts. 2005, Bruns és mts. 2008). Az összegyűjtött szekvenciák között azonban még napjainkban is igen változó az egyes nemzetségek, családok reprezentáltsága, számos olyan nemzetség van, melyből nincs, vagy csak kevés szekvencia hozzáférhető. A különböző génszakaszok különböző szintű azonosítást tesznek lehetővé: az IGS ill. részben az ITS-szakaszok közeli rokon fajok vagy faj alatti kategóriák elkülönítését, az rRNSgének ill. fehérjék génjeinek feloldása a fajok szintjétől a családok, vagy akár törzsekig terjed (Bridge 2002). Az eddig említett módszerek segítségével a mikróba-közösségek minőségi összetételére következtethetünk. Az EM-kutatásában azonban léteznek az abundancia-becslést segítő metódusok is. Ezek egy része anatómiai (hifahossz-becslés) illetve kemotaxonómiai bélyegek mennyiségi vizsgálatán alapszik (pl. egyes lipidkomponensek, ergoszterol mérésén). Landeweert és mts. (2003a,b) igazolták, hogy DNS-alapú módszerekkel is hatékony biomassza-becslés végezhető: klónozás esetén az egy fajhoz tartozó klónok számából, DGGEvizsgálatok esetében az egyes DNS-sávok intenzitásából, illetve real-time PCR vizsgálatok eredményeiből (Higuchi és mts. 1992, 1993). II. 6.3. A molekuláris módszerek ökológiai alkalmazásának általános korlátai A DNS-alapú. EM-közösségeket vizsgáló molekuláris módszereknek számos közös korlátjuk van (l. pl. Forney és mts. 2004, Richard és Bass 2005), melyeket mindenképpen szem előtt kell tartanunk alkalmazásuk esetén. A kiméra-szekvenciákról és az egyeden belüli gén-variabilitásról (paralóg gének előfordulásáról) már korábban volt szó. A DNS-kinyerés módszere azonban már önmagában kérdésessé teheti, hogy a kapott DNS-keverék vajon minden taxont a talajban előforduló arányban tartalmaz-e: a túlságosan enyhe feltárási módszerek ugyanis egyes taxonok sejtjeiből nem szabadítják fel a DNS-t, míg az agresszívebb metódusok roncsolhatják a DNS-molekulákat (Kirk és mts. 2004). Az ektomikorrhizák esetében további probléma lehet az is, hogy a közösség-összehasonlító módszerek (l. alább) a talajban található összes hifát vizsgálják, függetlenül azok élet-stratégiájától (Landeweert és mts. 2005). Ez azonban a legtöbb módszer esetében utólag módosítható (kereshetők pl. csak az ektomikorrhiza-képző fajok). Landeweert és mts. (2005) igazolták, hogy a közösség32

vizsgáló módszerek eredményei jól korrelálnak az egyes ektomikorrhiza-morfotípusok elkülönítésén alapuló vizsgálatokkal. A problémára megoldást nyújt, ha az ektomikorrhizaközösség vizsgálatát morfotipizálással, majd szekvenciaanalízissel végezzük. További problémát jelenthet, hogy a kidolgozásukkor egyes taxonokra univerzálisnak tervezett primerek a valóságban nem működnek hatékonyan a csoport minden tagja esetében (Forney és mts. 2004). Egyes rendszertani csoportokban az is előfordul, hogy a nagy variabilitású génszakaszok (pl. ITS), a fajon – vagy akár egyeden belül is – nagyfokú variabilitást mutat (Richards és Bass 2005). A szekvenciák azonosítása során tudatában kell lennünk, hogy a meghatározáshoz a molekuláris adatbázisokból referenciaként kigyűjtött szekvenciák jelentős része ellenőrizetlen, bizonytalanul meghatározott példányokból származik (Bruns és Shefferson 2004, Forney és mts. 2004). Több esetben konfliktusban áll egymással a morfológiai és a molekuláris vizsgálatok eredménye. Ennek egyik lehetséges oka, hogy bizonyos csoportokban kevés az elválasztást segítő karakter, vagy pedig ezek nagyon változatosak. Igen gyakran a konvergens evolúció során kialakult hasonló fenotípusos bélyegek (analóg bélyegek, homopláziák) is félrevezetők lehetnek. Több nemzetségben megfigyelték kriptikus (szibling) fajok jelenlétét is, tehát olyan fajokat, melyek esetében a reproduktív izoláció már megtörtént, de ezt még nem követte az alaktani bélyegek szétválása (Buscot és mts. 2000). A két módszer előnyeit egyesítendő több szerző szerint az tekinthető egy lehetséges megoldásnak, ha a morfológiai feldolgozást kiegészítik a molekuláris munkák (Kåren és mts. 1997, Carbone és mts. 1999, Horton és Bruns 2001, Sakakibara és mts. 2002). A megfelelő tapasztalattal végzett, kellően – de nem túlságosan – részletes morfológián alapuló csoportosítás lecsökkenti a további munkákba bevonandó minták számát anélkül, hogy nagyon megnövelné a teljes vizsgálat idejét. Az alaktani bélyegek alapján kialakított csoportokból ezt követően már néhány mikorrhiza DNS-ének vizsgálatával eldönthető, hogy a csoport tagjai egyetlen fajhoz tartoznak-e, vagy pedig több különböző gomba mikorrhizáinak a keverékével van dolgunk, ami további vizsgálatot igényel. A molekuláris módszerek segíthetik e mellett a morfológiai alapon nem meghatározható fajok azonosítását is. II. 6.4. A kladisztika módszerei Amennyiben szekvencia-alapú meghatározást végzünk, a kiválasztott génszakasz(ok) nukleotid-sorrendjének meghatározását követően ismert referenciákhoz kell hasonlítanunk a DNS-szekvenciákat. A molekuláris adatbázisokból megfelelő algoritmusok segítségével (pl. 33

BLAST – Altschuhl és mts. 1990, GalaxieBlast – Nilsson és mts. 2004) kereshetjük ki a vizsgált DNS-hez leginkább hasonló szekvenciákat. Bár ezek a módszerek már önmagukban is lehetőséget nyújtanak a hasonlóság mértékének vizsgálatára, mégsem lehetünk biztosak abban, hogy rendszertani értelemben is a legközelebbi taxonból származó szekvenciát adják eredményül (ráadásul az adatbázisokban szereplő szekvenciák eredete is bizonytalan lehet). A probléma úgy oldható meg leghatékonyabban, ha a hasonlónak bizonyult szekvenciákra – a vizsgált DNS-szakaszok bevonásával – kladisztikai elemzést végzünk, s ennek eredményéből következtetünk a meghatározandó faj rendszertani kapcsolataira. A kladisztika a rendszerezés történetének napjainkban is élő irányzata, ami a Darwint követő években megjelent filogenetikai rendszereknek és az 1960-as években kibontakozott numerikus taxonómiának az alapelveit egyesíti magában (Podani 2003). Célja – ennek megfelelően – minél több karakter objektív módszerekkel történő feldolgozása révén egy olyan rendszer előállítása, ami tükrözi az evolúciós leszármazási viszonyokat. A kladisztikai alapfogalmak tárgyalása nélkül (ezek összefoglalását l. pl. Hillis és mts. 1996, Felsenstein 2004 munkáiban) az alábbiakban röviden áttekintem lehetséges megközelítési módokat. Az

elemzések

első

lépéseként

a

vizsgált

taxonokra

jellemző

tulajdonságok

összerendezésével elkészítjük az adatmátrixot. Amennyiben fehérjék vagy nukleinsavak monomerjeinek sorrendjében rejlő információt használunk a kladisztikai rekonstrukcióhoz, akkor a polimermolekula adott pozícióiban levő monomerek tekintendők a karaktereknek. Az adott pozícióban (mint karakterben) bekövetkező evolúciós változás alapvetően három féle lehet: a monomer lecserélődhet egy másikra (szubsztitúció), beépülhetnek (inszerciók) vagy kieshetnek (deléciók) monomerek a teljes molekulából. A háromféle evolúciós esemény felderítésére szolgálnak a külöböző illesztési módszerek (l. részletesen Hillis és mts. 1996). Ennek megfelelően makromolekulák esetében az adatmátrixban az egyes pozíciókban („karakterek”) nem csak a monomer típusa szerepelhet, hanem hiátus („gap”) is. Az elkészült adatmátrixból a filogenetikai kapcsolatokra alapvetően kétféleképpen következtethetünk (Swofford és mts. 1996). Az opimalitási kritériumon alapuló módszerek esetében először meg kell adnunk egy olyan szempontot, mely alapján megítélhetjük egy adott törzsfa „jóságát”, majd valamilyen módon meg kell találnunk az(oka)t a törzsfá(ka)t, amely(ek) a felállított kritériumnak leginkább megfelel(nek) a kiindulási adatmátrix tükrében. A másik lehetőség, hogy algoritmikus módszereket alkalmazunk, melyek segítségével egyetlen, az algoritmus definiálta törzsfához jutunk el. Az optimalitási kritérium szempontjából meg kell különböztetnünk az eredeti adatmátrixot feldolgozó karakteralapú módszereket a távolságalapú módszerektől. Ez 34

utóbbiak a kiindulási mátrixból különbözőségi indexek alkalmazásával távolságmátrixot állítanak elő, s ezt használják a rendszertani kapcsolatok tisztázására. A karakteralapú kladisztikus módszerek egyik típusa a maximális takarékosság („maximum parsimony”) elvén nyugszik (Swofford és mts. 1996, Podani 2003). Ennek értelmében az a legjobb törzsfa, ami a legkevesebb karakterváltozással képes magyarázni az adatmátrixban megjelenő karakter-állapotokat. A törzsfa hossza ekkor a benne megfigyelhető karakterátalakulások

száma.

Ekkor

tehát

lényegében

a

karakterek

evolúciójának

rekonstruálása a célunk. Kiemelt feladatuk e módszereknek a közös evolúciós eredettel magyarázható

azonosságok,

a

karakterhomológiák

megkülönböztetése

a

karakterhomopláziáktól. A karakterek azonossága homoplázia esetén nem indokolható a közös filogenetikai múlttal. A karakteralapú taxonómiai módszerek egy másik típusa az invariánsok módszere (eredetileg: evolúciós parszimónia módszere – Lake 1987). E módszerrel egyszerre csak négy szekvencia kölcsönös viszonya vizsgálható, mégpedig az egyes nukleotid-pozíciókban előforduló tranzíciók (pirimidin→pirimidin vagy purin→purin átalkulások) és transzverziók (purin↔pirimidin átalakulások) alapján. Az algoritmus során az említett átalakulásokon alapuló pontozási rendszer segítségével határozható meg az adatmátrix által leginkább támogatott topológia. A karakteralapú módszerek harmadik típusa a legnagyobb valószínűségi érték („maximum likelihood”) módszer (Huelsenbeck és Crandall 1997). Alkalmazásához először egy evolúciós modellt kell kiválasztani, ami a nukleotidtípusok aránya valamint az egymásba alakulásuk valószínűsége alapján felállított átmeneti mátrix segítségével, Markov-folyamattal képes leírni az egyes nukleotid-pozíciók megváltozási valószínűségét az egyes evolúciós időpontokban (Swofford és mts. 1996). A szubsztitúciós modelleknek többféle változatuk is létezik, a különbség köztük az, hogy hány paramétert becsülnek a rendelkezésre álló adatmátrix alapján (Bos és Posada 2005). A maximum likelihood metódus azt a törzsfatopológiát keresi meg, ami a kiválasztott evolúciós modell mellett a legnagyobb valószínűséggel magyarázza az adatmátrixban megfigyelhető állapotokat. A legjobb törzsfát valószínűségi elven kereső legnagyobb valószínűség módszerével rokonítható

a

Bayes-statisztikán

alapuló

filogenetikai

rekonstrukció

módszere

(Huelsenbeck és mts. 2001, 2002). Ennek során nem rögzítjük fixen az evolúciós modellt, hanem

a

rekonstrukcióhoz

alkalmazott

paraméterek

helytállóságát

vizsgáljuk

az

adatmátrixban megfigyelhető állapotok segítségével. A tesztelt paraméterekkel készített törzsfák segítségével módosítjuk a paramétereket, majd újabb elemzést készítünk. Ezt 35

ciklikusan ismételjük mindaddig, míg a folyamatosan finomított paraméterek valószínűsége tovább már jelentősen nem változik. A vizsgálat ebben az esetben is a Markov-láncú Monte Carlo szimuláción ill. annak finomított változatain alapul (Huelsenbeck 2000, Altekar és mts. 2002). A távolságalapú módszerek legfontosabb megoldandó problémája, hogy az adatmátrixot úgy transzformálják távolságmátrixszá, hogy az abban szereplő értékek a lehető legjobban közelítsék a taxonok közti evolúciós távolságokat. Ehhez azonban tisztában kell lenni azzal is, hogy az egyes karakterek (pl. nukleotidpozíciók) esetében (még akkor is, ha többszörös változás történt a filogenezis során) a jelenlegi helyzetben csak annyit tapasztalunk, hogy nem egyezik a két karakterállapot. Ezt a tényt a legtöbb transzformációs metódus figyelembe veszi (Swofford és mts. 1996). A törzsfák felépítése során ezután az a cél, hogy a távolságmátrixban szereplő távolságértékeknek megfelelő legyen a taxonok távolsága a fában (patrisztikus távolság) (Felsenstein 1983). E két érték a legtöbb esetben nem egyezik meg, ezért meg kell keresnünk a legoptimálisabb törzsfát. Ennek több alternatív módja lehet (Cavalli-Sforza és Edwards 1967, Fitch és Margoliash 1967, Saitou és Nei 1987) Az előre megállapított optimalitási kritérium alapján kereső módszerek mellett szót kell ejtenünk az algoritmikus eljárásokról is. Természetesen ezek is magukban foglalnak (még ha csak implicit módon is) egy olyan kritériumot, ami a keresés alapjául szolgál, azonban az egyetlen végső törzsfát maga az algoritmus jelöli ki. Előnyük, hogy igen gyorsan elvégezhetők, viszont az optimalitási kritérium esetükben kisebb jelentőségű éppen az algoritmikus meghatározottság miatt. Az algoritmikus törzsfakészítő eljárások közül igen elterjedt hierarchikus, agglomeratív metódus a szomszéd-összevonó (neighbor-joining) módszer (Saitou és Nei 1987). Ennek során közvetetten, távolságmátrix előzetes előállítása után konstruálunk filogenetikai fát. Ebben az esetben azonban nemcsak a kiszámított távolságértékeket vesszük figyelembe, hanem egy adott taxonpárnál azok távolságát korrigáljuk a többi taxontól való távolságukkal. Ennek megfelelően a kiválasztott taxonokat egymáshoz „ közelebb” levőnek tekintjük akkor, ha távol vannak a többitől. A tárgyalt módszerek elsődlegesen gyökértelen fákat építenek fel. A legközelebbi közös ős csatlakozási helyét a vizsgált taxonok kapcsolatrendszeréhez utólag kell megállapítani. Erre több különböző lehetőségünk van (l. pl. Felsenstein 2004). A legelterjedtebb, elsőként a parszimónia-elven alapú módszerre kidolgozott lehetőség az, ha kiválasztunk egy, a vizsgált taxonokhoz rendszertanilag közeli, pleziomorf helyzetű (ősibb tulajdonságokkal rendelkező) külcsoportot („outgroup”), és azt a pontot tekintjük a törzsfa gyökerének, ahol ez a taxon 36

csatlakozik a törzsfához (Watrous és Wheeler 1981). A karakteralapú módszerek esetében a külcsoport tulajdonságai a bélyegek pleziomorf (ősi) és apomorf (leszármaztatott) állapotának meghatározása szempontjából is lényegesek (Swofford és mts. 1996). A különböző eljárásokkal előállított kladogramok esetében elmondható, hogy a kapott eredmény nagymértékben függ a kiválasztott bélyegektől (mintavételi hiba – attól függően pl., hogy mely génszakaszt, genomrészletet vizsgáljuk) valamint attól, hogy milyen taxonok szerepelnek az elemzésben. Az előbbi probléma a statisztikai megbízhatóság, az utóbbi a kladogram-stabilitás kérdését veti fel. A statisztikai megbízhatóság becslésére Felsenstein a bootstrap elnevezésű statisztikai módszert dolgozta át (Felsenstein 1985). Ennek értelmében a filogenetikai elemzést megismételjük egy azonos elemszámú adatmátrixszal, ahol azonban az egyes karaktereket az eredeti karakterkészletből ismételt, véletlen visszatevéses módszerrel választjuk ki. A szignifikancia-értékeket az alapján számítjuk ki, hogy az egyes kládok a vizsgálat során kapott fák hány százalékában szerepeltek. Mivel a kladogramok egyetlen genomrészlet (többnyire egy-egy gén) szekvenciája alapján készülnek, a törzsfából valójában csak az adott gén evolúciójára következtethetünk. Ez csak optimális esetben szolgáltat információt a fajok leszármazási kapcsolatairól (Moritz és Hillis 1996). Annak érdekében, hogy minél nagyobb legyen az átfedés a fán feltüntetett és a taxonok valós filogenetikai kapcsolatai között, manapság egyre gyakoribb a több génszakasz (általában egy nem-átíródó, egy átíródó, de nem kódoló és egy géntermékkel is rendelkező gén) együttes kladisztikai elemzése. A kladogramok stabilitásának becslésére Lanyon dolgozta ki a jackknife módszert (Lanyon 1985). Ennek során a vizsgálatokat úgy ismételjük meg, hogy a taxonok egy részét kihagyjuk az elemzésből, majd megvizsgáljuk, hogy az eképpen kapott fák mekkora hányadában szerepeltek az egyes kládok. Az egyes törzsfakészítő eljárások kiválasztásánál mérlegelni kell azok előnyeit és hátrányait. Mivel az egyes módszerek megítélése igen vitatott mind az algoritmuson vs. optimalizációs kritériumon nyugvó, mind pedig a karakteralapú vs. távolságalapú metódusok szembeállítása kapcsán, az tűnik járható útnak, ha több, különböző módszerrel konstruálunk fákat, és megvizsgáljuk azok statisztikai megbízhatóságát. A kapott eredményeket összevetjük egymással, és ennek tükrében vonjuk le következtetéseinket, mint ahogyan azt Duncan és mts. (1980) is javasolták.

37

II. 7. A disszertáció szempontjából fontos gombacsoportok ektomikorrhiza-kapcsolatai

A disszertáció irodalmi bevezetőjének ebben a részében a disszertáció eredményeinek középpontjában szereplő gombacsoportok ektomikorrhiza-kapcsolatairól rendelkezésünkre álló információkat foglalom össze.

II. 7.1. A tömlősgombák (Ascomycota) csoportjának képviselői Annak ellenére, hogy a Frank a 19. században éppen tömlősgombák kialakította kapcsolatok vizsgálatával alkotta meg elméletét a mikorrhizákról (Frank és Trappe 2005), a törzs mint ektomikorrhiza-képző csoport jelentőségét egészen a 20. század végéig alulértékelték. (Ez alól a megállapítás alól csak a kiemelkedő gasztronómiai ill. gazdasági jelentőséggel rendelkező szarvasgombák (Tuber, Terfezia stb.) nemzetségei jelentenek kivételt (Kovács és Jakucs 2006). Egyszerű szerkezetű ektomikorrhizáik miatt az a vélemény vált meghatározóvá, hogy az aszkuszos gombák feltehetőleg kevesebb előnyt biztosíthatnak a növénypartner számára, mint az bazidiumos gombák összetettebb felépítésű ektomikorrhizái (Egger 2006). Maia és mts. (1996) feltételezett ill. igazolt ektomikorrhiza-kapcsolatokat áttekintő munkája kevesebb, mint száz olyan tömlősgomba-ektomikorrhizát említ, melyekben nem szarvasgomba a mikobionta. Agerer (2006) összegzése szerint az Ascomycota törzsnek mindössze 11 nemzetsége igazoltan, további 49 pedig csak feltehetően ektomikorrhiza-képző. De Román és mts. (2006) 1244 ektomikorrhiza-leírást számba vevő cikkükben összesen 200 (16,1%) tömlősgomba-ektomikorrhizát említenek (707 bazídiumos és 337 ismeretlen mikobiontával kialakított mellett). Ebből 123 ektomikorrhizát a Tuber nemzetség fajai alakítottak, tehát mindösszesen 77 (6,2%) a nem-szarvasgomba ektomikorrhizák száma a vizsgált leírások között (De Román és mts. 2006). Jelentős változást jelentettek Tedersoo és mts. eredményei (2006a): Észtország és Dánia erdeiben végzett, molekuláris módszerekkel történő meghatározáson nyugvó vizsgálataikkal 33 további tömlősgombafaj ektomikorrhizáját mutatták ki. Bár publikációjukban ők is részletesen dokumentálták a megfigyelt ektomikorrhizák anatómiai bélyegeit (Tedersoo és mts. 2006a), és az utóbbi időben néhány nemzetség ektomikorrhizáinak részletesebb leírása is megszületett (Fujimura és mts. 2005, Smith és mts. 2006), még mindig igen alacsony azon

38

tömlősgomba-csoportok száma, melyek ektomikorrhizáit részletes morfológiai-anatómiai és molekuláris taxonómiai módszerekkel egyaránt tanulmányozták.

II. 7.2. A Genea és a Humaria nemzetségek ektomikorrhizái A Humaria és a Genea nemzetségek a Pyronemataceae (Ascomycetes) család gyakori ektomikorrhiza-képző csoportjai (Tedersoo és mts. 2006a, Perry és mts. 2007). Ennek ellenére e taxonok képviselői közül napjainkig csak a Humaria hemisphaerica (Wigg.: Fr.) Fuckel (Ingleby és mts. 1990), a Genea hispidula Berk. & Br. (Brand 1991) és a G. verrucosa Vitt. (Jakucs és mts. 1998) fajok ektomikorrhizáinak részletes leírása szerepel az irodalomban. A Pezizales rend ektomikorrhiza-képző csoportjait vizsgáló munkájukban Tedersoo és mts. (2006a) megemlítik a Genea- és a Humaria- ektomikorrhizák anatómiai hasonlóságát, melyek ráadásul

sok

szempontból

emlékeztetnek

az

ún.

E-törzsek

(“E-strain

fungi”)

ektomikorrhizáira is. Az “E-törzs” elnevezéssel Laiho és Mikola (1964) jellegzetes, hasonló anatómiájú mikorrhizát kialakító gombákat jelölt, melyek a gazdanövénytől függően mind ekto-, mind ektendomikorrhiza kialakítására képesek (Wilcox 1983, Yu és mts. 2001). E gombák robusztus, szeptált, vastag falú, gyakran szemölcsösen mintázott, sárgás vagy barnás árnyalatú hifáit rendszeresen találták különböző élőhelyek rhizoszférájában (Kovács és Szigetvári 2002, Jakucs 2002a, Yu és mts. 2001). A Humaria nemzetséget is az “E-törzsek” között tartják számon, olyan további csoportokkal együtt, mint a Wilcoxina, Tricharina, Trichophaea és a Sphaerosporella fajok (Danielson 1982, 1984a, Egger 1996, Yu és mts. 2001). Tedersoo és mts. (2006a) riboszomális génkomplex vizsgálatával szerzett eredményei igazolták a hipogéikus termőtestet képező Genea, az epigéikus apotéciummal rendelkező Humaria és számos más, az “E-törzsek” közé tartozó gombafaj közeli rokonságát. Ezt a tapasztalatot alátámasztják Hansen és Pfister (2006), valamint Perry és mts. (2007) eredményei is. Humaria fajok előfordulását tűlevelű (Brandrud és Timmermann 1998, Boxman és mts. 1998, Fay és Mitchell 1999, Izzo és mts. 2005b, Rudawska és mts. 2006, Tedersoo és mts. 2006a) és lomberdőkben egyaránt igazolták. A lombhullató fajok közül különböző tölgy fajok (Salerni és mts. 2001, Mosca és mts. 2007, Richard és mts. 2004, Tedersoo és mts. 2006a), nyír (Fay és Mitchell 1999), mogyoró (Sesli 1998, Tedersoo és mts. 2006a) valamint hárs és bükk (Tedersoo és mts. 2006a) alatt találták meg termőtesteit vagy mikorrhizáit. Az eddigi eredmények alapján a nemzetség feltehetőleg igen jól alkalmazkodott a szélsőséges

39

környezeti körülményekhez, mivel ektomikorrhizáit említik meddőhányókon végzett erdőrekonstrukció (Fay és Mitchell 1999) és megnövekedett nitrogéntartalmú talajok ektomikorrhiza-közösségeiben is (Brandrud és Timmermann 1998, Boxman és mts. 1998).

A Genea fajok ektomikorrhizáit szinte kizárólag lomberdőkben találták meg. Brand (1991) a G. hispidula-ektomikorrhiza leírását bükk, Jakucs és mts. (1998) a G. verrucosa ektomikorrhizájának jellemzését tölgy fajok gyökereiről származó minták alapján készítették. A nemzetség előfordulását további szerzők is igazolták bükkösök (Rumberger és mts. 2004, Zeleznik és mts. 2007), különböző fajösszetételű tölgyesek (Valentine és mts. 2004, Mosca és mts. 2007), a Dipterocarpaceae családba tartozó Shorea fajok erdeinek (Lee és mts. 1997, Ingleby és mts. 1998), valamint különböző elegyes erdőknek (Izzo és mts. 2005b, Tedersoo és mts. 2006b, Smith és mts. 2006) a rhizoszférájából.

II. 7.3. A Pachyphloeus nemzetség ektomikorrhizái

A Pachyphloeus nemzetség a Pezizaceae család (Pezizales) egész világon elterjedt, hipogéikus termőtestet képező csoportja. Bár a nemzetséget korábban a Terfeziaceae családba sorolták (Eriksson és Hawksworth 1993), az első, Pachyphloeus fajt is magába foglaló molekuláris elemzések kimutatták, hogy a család tagjai valójában a Pezizaceae családba tagozódnak be (Percudani és mts. 1999). Dissing és Pfister (1981) a Pachyphloeus és Scabropezia nemzetségek anatómiai hasonlóságai alapján már az 1980-as évek elején felvetette, hogy a földalatti (hipogéikus) termőtesteket fejlesztő csoport feltehetően epigéikus taxonokkal áll közelebbi rokonságban. A 21. század fordulóján és első éveiben született molekuláris taxonómiai vizsgálatok megerősítették ezt a korai feltevést, és igazolták, hogy a Pachyphloeus-fajok legközelebbi rokonai a hipogéikus Amylascus, az epigéikus Scabropezia, sőt a csak mitospórákkal szaporodó Glischroderma nemzetségek (Norman és Egger 1999, Hansen és mts. 2001, 2005, Hansen és Pfister 2006, Læssøe és Hansen 2007). A Pachyphloeus nemzetségen belül négy leszármazási vonalat különítettek el Healy és mts. (2009), melyek közül három egy-egy konkrét fajnak felel meg (P. melanoxanthus, P. maronius, P. carneus), a negyediket több különböző faj alkotja. A Pachyphloeus-Scabropezia leszármazási vonal ektomikorrhiza-képzésének lehetőségét Hansen és mts. (2001) illetve Agerer (2006) is felvetette. Ennek megfelelően, különböző, napjainkban

leírt

Pachyphloeus-fajokat

első

említésükkor

eleve

“feltehetően

ektomikorrhizás”-ként jellemeztek (Fogel és States 2002, Frank és mts. 2006). Mindennek 40

ellenére napjainkig nem született az ektomikorrhiza-kutatásban elismert részletes jellemzés (Agerer 1991) a nemzetség egyetlen ektomikorrhizájáról sem. Tedersoo és mts. (2006a) szerteágazó eredményei igazolták először minden kétséget kizáróan a Pachyploeus és a Glischroderma fajok ektomikorrhiza-képző képességét. A két nemzetség mikorrhizáit bükkösökből és egy többféle lombhullató faj dominálta fás kaszáló területén gyűjtötték be (Tedersoo és mts. 2006a, b). Pachyphloeus termőtesteket találtak tölgyes (Cázares és mts. 1992, Fogel és States 2002, Frank és mts. 2006), erdei fenyves (Pinus spp.) (Fogel és States 2002) és duglászfenyves (Pseudotsuga menziesii) (Colgan és Trappe 2004) erdőkben is.

II. 7.4. A tomentelloid ektomikorrhizák

A Tomentella nemzetség a gombarendszertan történetében többször revideált Thelephorales rend (Basidiomycota) tagja. A Thelephorales rend kategóriáját Corner alkotta meg (1968), első részletes leírását Stalpers (1993) adta. A Corner-féle taxon a korábbi rendszerekben az Aphyllophorales rendbe sorolt több nemzetséget olvasztott egybe (Donk 1964). A változatos termőtesttel rendelkező (reszupinátus, felemelkedő, legyezőszerű, tölcséres, kalapos) fajok apomorfiája a pigmentált, mintázott, nem amiloid bazidiospóra, melynek nagy apikulusza van; a spórák alakja szabálytalan vagy lebenyes, és a mintázat kialakításában a teljes fal részt vesz (Stalpers 1993). Napjaink molekuláris alapú gombarendszereiben a korábbi Thelephorales rend külön monofiletikus csoportot, az ún. Thelephoroid kládot alkotja (Hibbett és Thorn 2001, Larsson és mts. 2004, Lutzoni és mts. 2004, Binder és mts. 2005, Hibbett és mts. 2007), ami a taplóféléket magába foglaló Polyporoid klád testvércsoportja (Matheny és mts. 2006). A nemzetség földrajzi elterjedtségére egyrészt a termőtestekre irányuló vizsgálatokból következtethetünk. Ennek alapján lényegében az egész Földön elterjedt csoportról beszélhetünk, melynek sporokarpiumait elsősorban Eurázsia mérsékelt övi régiójában (Köljalg 1996, Köljalg és mts. 2000) és Észak-Amerikában (Larsen 1974) találták, de India trópusi területein (Thind és Rattan 1971, Riviére és mts. 2007), Koreában (Jung 1994, Lee és Jung 2006), a Kanári-szigeteken (Larsen 1994) és Nyugat-Afrikában (Yorou és Agerer 2007, 2008) is gyűjtötték azokat. Mivel a Tomentella fajok reszupinátus bazidiomatái szorosan a szubsztrátumra, korhadó faanyagra, sziklákra tapadnak, ezért a termőtesteken alapuló gombaközösségi vizsgálatokban alulreprezentáltak (Köljalg és mts. 2000). A nemzetség ektomikorrhizáit azonban további élőhelyeken is megtalálták: Dél-Amerikában (Haug és mts. 41

2005, Barroetavena és mts. 2006, Becerra és mts. 2005), Afrikában (Yorou és mts. 2007) a Seychelle-szigeteken (Tedersoo és mts. 2007a) és Ausztráliában (Agerer és Bougher 2001a,b, Tedersoo és mts. 2008). 2. táblázat. A tomentelloid ektomikorrhizák előfordulása különböző gazdanövényeken és életközösségekben. Gazdanövény Hivatkozás Wurzburger és mts. (2001), Burke és mts. (2005), Pinus sp. Douglas és mts. (2005), Nieto és Carbone (2009) Picea sp. Haug (2002), Baier és mts. (2006) Cline és mts. (2005), Barroetavena és mts. (2006), Pseudotsuga sp. Hibbett és mts. (2005) elegyes tűlevelű erdő Douglas és mts. (2005) Fagus sylvatica Brand (1991), Buée és mts. (2005) Alnus glutinosa Pritsch és mts. (2000), Becerra és mts. (2005) Walker és mts. (2005), Lancellotti és mts. (2007), Quercus sp. Courty és mts. (2008), Moser és mts. (2009) Lithocarpus densiflorus Bergemann és Garbelotto (2006) Salix herbacea, S. polaris Clemmensen és Michelsen (2006), Muhlmann és Peinter (2008b) Polygonum viviparum Muhlmann és mts. (2008) Kobresia myosuroides Muhlmann és Peinter (2008a) Bidartondo és mts. (2000), Selosse és mts. (2002b), Orchidaceae McCormick és mts. (2004), Julou és mts. (2005) Bidartondo és mts. (2004), Bidartondo és Bruns (2001), Ericaceae Julou és mts. (2005) Monotropaceae Jun és mts. (2005) Pyrolaceae Tedersoo és mts. (2007b), Vincenot és mts. (2008)

A Tomentella fajok széles gazdaspektrumú ektomikorrhiza-képzők: elsősorban fatermetű nyitva- és zárvatermő fajok mikobiontái, ugyanakkor arkto-alpin elterjedésű törpecserjékkel, sőt lágyszárú fajokkal (Polygonum viviparum, Kobresia myosuroides) is kialakítanak ektomikorrhizát. Emellett az Orchidaceae, Ericaceae, Monotropaceae és Pyrolaceae családok tagjaival különböző típusú endomikorrhizát hoznak létre. A nemzetség gazdanövényeinek áttekintését a 2. táblázat tartalmazza. Különböző növényfajokat összekapcsoló micéliumaiknak köszönhetően a Tomentella fajok fontos szerepet töltenek be a közösségi micélium hálózatokban (CMN) is. Ennek példái a korábban már említett, mikoheterotróf orchideákkal kialakított kapcsolatok is (Taylor és Bruns 1997, McKendrick és mts. 2000a,b, Taylor és mts. 2002). A Tomentella nemzetség ektomikorrhizái gyakori előfordulásuknak köszönhetően, rendszeresen szerepelnek molekuláris ökológiai vizsgálatokban. Több mint 70 DNS-alapú munka tanúsítja jelenlétüket különböző ektomikorrhiza-közösségekben (Jakucs és Erős-Honti 2008). Ennek tükrében nem meglepő, hogy a Ryberg és mts. (2009) kifejlesztette, a GenBank molekuláris adatbázist kéthetente szűrő webes szolgáltatás szerint a legtöbb azonosított (ill.

42

azonosítatlan, de hasonlósága miatt ide tartozó) szekvenciával reprezentált ektomikorrhizaképző gombanemzetség a Tomentella. Mindennek ellenére részletes morfológiai-anatómiai jellemzés csak kevés Tomentella faj ektomikorrhizájáról szerepel az irodalomban. Köljalg és mts. (2000, 2001) meghatározása szerint a tomentelloid ektomikorrhizákat a többi barnán pigmentált falú hifákkal rendelkező mikorrhizától az alábbi bélyegek valamelyikének (vagy többnek) a megléte különbözteti meg: csatos szeptumok, cisztídiumok, KOH-dal adott kékeszöld színreakció. A nemzetség ektomikorrhizáinak színe egyes esetekben lehet sárga, halványsárga is (Agerer és Bougher 2001a, Jakucs és mts. 1997, Jakucs és Agerer 1999). A köpeny szerkezete többnyire pszeudoparenchimatikus, anguláris sejtekkel (Jakucs és Erős-Honti 2008), amin egyes fajok esetében gömb alakú sejtek csoportjai (Jakucs és mts. 2005a) vagy elhalt, pikkelyszerűen leváló sejtcsoportok (Palfner és Agerer 1996) találhatók. A gombaköpenyből többnyire erősen differenciálódott rhizomorfák és/vagy változatos megjelenésű cisztídiumok erednek (Raidl és Müller 1996, Jakucs és mts. 1997). 3. táblázat. Az azonosított ill. azonosítatlan tomentelloid ektomikorrhizák összefoglalása. Mikorrhiza Tomentella brunneorufa Larsen Tomentella ferruginea (Pers.) Pat. Tomentella galzinii Bourdot (sub nom Quercirhiza fibulocystidiata) Tomentella pilosa (Burt) Bourdot & Galzin Tomentella stuposa (Link) Stalpers Tomentella sublilacina (Ellis & Holw.) Wakef. (sub nom T. albomarginata) Tomentella subtestacea Bourdot & Galzin Fagirhiza fusca Fagirhiza lanata Fagirhiza pallida Fagirhiza setifera Fagirhiza spinulosa Quercirhiza ateracusrugosa Quercirhiza atrata Quercirhiza auraterocystidiata Quercirhiza cumulosa Quercirhiza flavocystidiata Quercirhiza squamosa Quercirhiza stellata Quercirhiza tomentellocystidiata Quercirhiza tomentelloflexuosa Quercirhiza tomentellofuniculosa Piceirhiza cornuta Piceirhiza nigra Piceirhiza obscura

Gazdanövény

A leírás hivatkozása

Eucalyptus sp. Fagus sylvatica Quercus sp., Populus alba, Fagus sylvatica Populus alba Quercus cerris, Picea abies, Populus alba

Agerer és Bougher (2001a) Raidl és Müller (1996)

Pinus sylvestris

Agerer (1996b)

Populus alba Fagus sylvatica Fagus sylvatica Fagus sylvatica Fagus sylvatica Fagus sylvatica Quercus suber Quercus robur Quercus suber Quercus ilex Quercus suber Quercus robur Quercus ilex Quercus suber Quercus suber Quercus suber Piecea abies Picea abies Picea abies

Jakucs és Agerer (2001) Brand (1991) Brand (1991) Brand (1991) Brand (1991) Brand (1991) Azul és mts. (2006a) Uhl (1988) Azul és mts. (2006b) De Román és mts. (2002a) Azul és mts. (2006c) Palfner és Agerer (1996) De Román és mts. (2002b) Azul és mts. (2006d) Azul és mts. (2006e) Azul és mts. ( 2006f) Montecchio és Agerer (1997) Gronbach (1988) Gronbach (1988)

Jakucs és mts. (1997) Jakucs és Agerer (1999) Jakucs és mts. (2005a)

43

A fentiek tükrében a tomentelloid ektomikorrhizákra általában az a jellemző, hogy a következő tulajdonságok közül több mint hárommal rendelkeznek (Jakucs és Erős-Honti 2008): ─ barnás-fekete vagy barna szín; ─ csatos hifák; ─ anguláris szerkezetű külső köpeny; ─ csillag alakban rendeződő sejtek a külső köpenyrétegben; ─ hifákból vagy szögletes-háromszögletű ill. szarv-alakú sejtekből szerveződő hálózat a köpeny külső felszínén; ─ gömb alakú sejtek csoportjai a köpenyfelszínen; ─ bilaterális, nóduszokból elágazó rhizomorfák, melyeket kívülről keskeny, csatos, gazdagon elágazó, kanyargós lefutású hifák vékony rétege borít; ─ csatos cisztídiumok. Napjainkig a nemzetség hét azonosított fajának ektomikorrhizáját, és 18, faji szinten nem azonosított mikobionta ektomikorrhizáját jellemezték részletesen (Jakucs és Erős-Honti 2008), ezeket a 3. táblázat foglalja össze.

II. 7.5. A Lactarius-nemzetség ektomikorrhiza-kapcsolatairól

A

tejelőgombák

(Lactarius)

nemzetsége

a

bazídiumus

gombák

törzsének

(Basidiomycota) Russuloid kládjába tartozik (Hibbett és Thorn 2001, Miller és mts. 2006, Hibbett és mts. 2007). Korábbi értelmezés szerint a genusz a galambgombákkal (Russula) együtt a Russulaceae családot alkotja (Kirk és mts. 2001). A Lactarius nemzetségen belül a termőtest morfológiája (cisztídium- és bazídiumszerkezet, spórák) alapján több alnemzetség különíthető el (Lactifluus, Lactariopsis, Plinthogalus, Russularia, Piperites és Lactarius), melyek szekciókra oszthatók tovább (Heilmann-Clausen és mts. 1998), melyek a molekuláris taxonómiai munkák tükrében is fenntartatóknak bizonyultak (Eberhardt 2000). A nemzetséget elkülönítő legfontosabb bélyeg a tejhifák (laticiferek) jelenléte mind a termőtestben, mind pedig a mikorrhizában. Ezek megsértésekor, a felszakadó tejcsövekből tejnedv (latex) kerül a külvilágba. A tejcsövek jelenléte is igazolja azt az utóbbi időben molekuláris vizsgálatok eredményeivel is alátámasztott tényt, hogy a többségében föld feletti (epigéikus) termőtestekkel rendelkező Lactarius rokonsághoz tartoznak olyan fajok is, melyek 44

a föld alatt hozzák létre sporokarpiumaikat. Ilyen fajokat találunk a Zelleromyces és Arcangeliella genuszokban, melyeket tehát lényegében megváltozott termőtestű Lactariusoknak kell tekintenünk (Egli és mts. 2001, Miller és mts. 2001). A nemzetség minden tagját obligát ektomikorrhiza-képzőnek tartják (Hutchison 1999), melyek közül egyes fajokról az is igazolt, hogy a mikorrhiza-közösségek igen gyakori tagjai (Horton és Bruns 2001). Különböző fajösszetételű lomboserdőkben (pl. bükkön – Brand 1991, Grebenc és Kraigher 2007, égeren – Miller és Koo 1991, Pritsch és mts. 1997a, tölgyön – Courty és mts. 2007, Uapaca bojeri-n (Euphorbiaceae) – Ramanankierana és mts. 2007) éppúgy megtaláljuk ektomikorrhizáikat, mint tűlevelű erdőkben (Kernaghan és mts. 1997, Bradbury és mts. 1998, Karlinski és mts. 2007). Az erdei ökoszisztémákon kívül olyan élőhelyek növényeinek gyökerein is előfordulnak mikorrhizáik, mint a gleccserek visszahúzódása nyomán megtelepülő párnanövények (pl. Salix phylicifolia– Jumpponen és mts. 2002), a meszes karsztvegetációkban élő magcsákó (Dryas octopetala – Harrington és Mitchell 2002) vagy a Mediterráneumban a száraz és félszáraz élőhelyekre igen korán betelepülő szuharfajok (Cistus spp. – Nuytinck és mts. 2004, Comandini és mts. 2006). A trópusi ill. szubtrópusi területek vegetációiból leírt tejelőgomba-fajok esetében is sokszor igazolt, vagy feltételezhető az ektomikorrhizás életmód (Verbeken 1998, Henkel és mts. 2000, Miller és mts. 2000, Montoya és Bandala 2008, Verbeken és mts. 2008). A Lactarius-ektomikorrhizákkal a természetes erdőszukcesszió előrehaladott állapotában találkozunk, ezért ún. késői stádiumú fajoknak tekintjük azokat (Visser 1995). Ennek következtében

kiterjedt

ektomikorrhiza-rendszereiket

elsősorban

idős,

bolygatatlan

erdőállományokban találhatjuk meg. Ez alátámasztható azzal a kísérletes megfigyeléssel is, hogy állandó körülmények között a nemzetség egy tagja (L. rufus) igen erős kompetítornak bizonyult mind más ektomikorrhiza-képző, mind pedig szaprotróf gombákkal szemben (Shaw és mts. 1995). Courty és mts. (2007) azt is igazolták, hogy a L. quietus ektomikorrhizája megfelelő körülmények között az elhalt szerves anyag bontására képes exoenzimeket ad le környezetébe, azaz tápanyagigényét a szaprotróf életmódra jellemző táplálkozási móddal egészítheti ki. A késői megjelenés egy további oka lehet a Lactarius-fajok erős gazdaspecifitása is (Tyler 1992, Hutchison 1999). A tejelőgombák mikorrhizáit globális környezetvédelmi problémák hosszú távú hatásait modellező kísérletben is vizsgálták. Lactarius fajok abundanciájának emelkedését tapasztalta Grebenc és Kraigher (2007) mesterséges ózon-szennyezésnek kitett idős bükkösben. Malcolm és mts. (2008) egy Lactarius (cf. pubescens) fajnak a megemelkedett hőmérséklethez történő hatékony, anyagcsere-változáson alapuló alkalmazkodását bizonyították. Krupa és Kozdroj 45

(2007) vizsgálatainak eredményei igazolták, hogy a L. rufus ektomikorrhizája és az azzal együtt élő baktérium-közösség védi a gazdanövényt a környezet nehézfém-ionjainak károsító hatásától. A nemzetségnek több részletesen leírt, morfológiailag és anatómiailag jellemzett ektomikorrhizája ismert. Ezek részletes áttekintését adja Hutchison (1999) és Eberhardt (2000). A mikorrhizák anatómiája ebben a nemzetségben is igen jól követi a rendszertani tagozódást: az egyes alnemzetségekbe tartozó fajok mikorrhizája többnyire hasonló szerkezetű (Eberhardt 2000). Igaz ez a hasonlóság a hipogéikus termőtestet képző, ektomikorrhizás fajra, az Arcangeliella borziana-ra is, mely mind ektomikorrhiza-anatómiája, mind pedig a molekuláris eredmények alapján a Russularia alnemzetségbe tartozik (Peter és mts. 2001). Nagy gazdaspecifitásuk miatt a nemzetség tagjai sokáig csak ritkán szerepeltek mesterséges (in vitro) mikorrhizálási kísérletekben (Hutchison 1999). Napjainkra azonban már több faj esetében sikerült megállapítani azokat az optimális körülményeket, melyek alkalmazásával bevonhatók a mesterséges mikorrhizálási kísérletekbe (Guerin-Laguette és mts. 2000, Baum és Makeschin 2000, Parlade és mts. 2004). Ezen eredményeknek számos további lehetséges alkalmazása van. Egyrészt az erdősítések során a természetes életközösségekben gyakori fajokkal (mint pl. a tejelőgombák) mikorrhizált, ezáltal életképesebbé tett csemetékkel fokozni lehet a telepítések sikerét, másfelől pedig – tekintve, hogy a tejelőgombák körében több ehető faj van (pl. a rizike (L. deliciosus)) – kontrollált körülmények között megoldható lenne mikorrhizás gombafajok termesztése. A Lactariusmikorrhizák valószínűleg sikeresen vonhatók be az erdősítési törekvésekbe, mivel több esetben már sikeresen megvalósult fajaikkal az ipari méretű mikorrhizálás is (Robin és mts. 1998a,b, Lanbo és mts. 1998). A mesterséges körülmények között történő termőtestképzés képességét is igazolták már a tejelőgombák esetében (Guerin-Laguette és mts. 2000, Yamada és mts. 2001a,b, Parlade és mts. 2004), de ezzel párhuzamosan az erdei ökoszisztémákat jellemző paraméterek alapján olyan predikciós modell is készült, mely segítségével előrejelezhető a várható termőtesthozam (Bonet és mts. 2008). A tejelőgombák ektomikorrhizáit jellemző szerzők több esetben figyelték meg egyéb fajokhoz tartozó hifák másodlagos megjelenését a mikorrhizás gyökér belsejében. A nemzetség ektomikorrhizáinak szinte közös jellemzője, hogy gyakran található bennük idegen kolonizáló hifa. Amiet és Egli (1991) Picea abies és L. scrobiculatus mikorrhizájában, Brand (1991) a bükk (Fagus sylvatica) több különböző gombafajjal képzett mikorrhizájából írta le egy másik gomba jelenlétét. Az utóbbi esetben a szerzőnek sikerült kitenyésztenie, majd 46

meghatároznia a kéregsejtekben felbukkanó gombát, ami a Leucoscypha leucotricha csészegombafajnak bizonyult. Pillukat és Wanner (1996) egy parazita tömlősgomba (Hypomyces lateritius) megjelenését mutatta ki L. salmonicolor mikorrhizáiban. Ebben az esetben azonban a másodlagosan megjelenő hifák a növényi sejtekben nem, csak a köpenyben fordultak elő.

47

III. Anyag és módszer III. 1. A mintaterületek bemutatása III. 1.1. Az „Őserdő” erdőrezervátum A disszertáció központi mintaterülete a Bükk-fennsíkon, a Bükki Nemzeti Park területén helyezkedik el. Átlagos tengerszint feletti magassága 830-900 m, felszínén a tipikus felszíni karsztformák figyelhetők meg (Sándor 1983). Az évi átlagos középhőmérséklet 6,1°C, az évi átlagos csapadékmennyiség 880-900 mm (Ódor és mts. 2003). A terület talaja mészkő alapkőzeten kialakult, helyenként podzolosodó barna erdőtalaj (Siller 2004), mely erősen kilúgozódik (pH-ja saját vizsgálatok alapján 5,1-5,2 körüli). A területet borító montán bükkös állomány (Aconito-Fagetum) közel 100 éve nem áll erdészeti kezelés alatt, mára regenerálódtak természetes erdőfejlődési folyamatai. A terület 1942-ben került védelem alá, majd a múlt század végén az egyik elsőként kijelölt hazai erdőrezervátum lett. Az 59,3 ha kiterjedésű magterületet 316 hektárnyi pufferzóna veszi körül (Bartha és Esztó 2002). A magterületen a lombkoronaszintben a bükk (Fagus sylvatica) dominanciája mellett csak szálanként találhatók elegyfák (Acer pseudoplatanus, A. platanoides, Fraxinus excelsior). A legidősebb bükkfák 180-200 évesek. A cserjeszintben az újulat mellett henye boroszlán (Daphne mezereum), varjútövis (Rhamnus catarthica), gyepűrózsa (Rosa canina) és fekete bodza (Sambucus nigra) fordul elő. A viszonylag fajszegény gyepszintben a tipikus bükkös-fajok dominálnak (Galium odoratum, Impatiens noli-tangere, Oxalis acetosella, Glechoma hederacea, Hordelymus europæus) (Kárász és Suba 1982, Ódor és mts. 2003). A rezervátum területén a holt fa össztömege 164 m3/ha, a lábon álló holt fa átlagos mellmagassági átmérője 66 cm (Ódor és mts. 2003). III. 1.2. További mintaterületek

A központi mintaterületről gyűjtött ektomikorrhizákat néhány esetben további hazai élőhelyekről gyűjtött mintákkal hasonlítottuk össze. Az alábbiakban ezek rövid jellemzése következik.

48

Püspökladány (Hortobágyi Nemzeti Park) A terület az Alföld középső részén (Hortobágyi Nemzeti Park), Püspökladány közelében, 85-90 m tengerszint feletti magasságban fekszik. Az átlagos évi csapadékmennyiség 525 mm. A terület szolonyec talaján kétféle erdő található: egy fiatalabb, 30-50 éves, kőrissel (Fraxinus spp.) elegyes, kocsányos tölgyek (Quercus robur) alkotta állomány, cserjeszintjében fagyallal (Ligustrum vulgare), valamint egy 70 éves cserestölgyes (Quercus cerris), melynek cserjeszintjében kökényt (Prunus spinosa) és rózsafajok (Rosa spp.) fordulnak elő. Őrség (Őrségi Nemzeti Park) Az Őrségi Nemzeti Parkban, Csörötnek közelében fekvő terület átlagos tengerszint feletti magassága 250-350 m, átlagos évi csapadékmennyisége 800 mm, az évi átlagos középhőmérséklet 9,1°C (Marosi és Somogyi 1990). Az üledékes (lösszel kevert kavics) alapkőzeten kialakult tápanyagszegény talaj felső rétege savanyú kémhatású (pH 4,5-4,7, Szodfridt 1969). A területet borító erdő fő állományalkotó fafaja a bükk (Fagus sylvatica), elegyfaként kocsánytalan tölgy (Quercus petraea), gyertyán (Carpinus betulus) és erdei fenyő (Pinus sylvestris) fordul elő. A cserjeszintet a lombkoronaszint fiatal egyedei alkotják, a gyepszint mezofil ill. acidofil fajokat tartalmaz (Tímár és mts. 2002). III. 2. A mintavétel és -feldolgozás

A bükki Őserdő területén mintáinkat 2002 és 2008 között gyűjtöttük a rezervátum magterületének valamint védőzónájának különböző szukcessziós stádiumban levő területeiről, évente lehetőség szerint két alkalommal (tavasszal és ősszel). Egy mintagyűjtés során három 20 cm élhosszúságú talajkockát ástunk ki, véletlenszerűen kiválasztott helyekről, az erdőfejlődés különböző stádiumaiban levő állományrészletekből: egyet a magterület összeroppanási fázisban levő (sok idős valamint nagy mennyiségű lábon álló és fekvő holt fát tartalmazó) területéről, egyet optimális fázisban levő (középkorú) állományrészletből, egyet pedig a védőzóna felújulási fázisban levő (fiatalos) részéből. (Az erdőfejlődési fázisok lehatárolását Siller 2004 alapján végeztük.) A talajminták kiásása során ügyeltünk arra, hogy homogén fafaj-összetételű területekről gyűjtsük azokat. A minták az avartól megtisztított talaj felső rétegét tartalmazták.

49

A kiásott talaj- és gyökérminták feldolgozása Agerer (1991) módszere szerint történt. A talajkockákat a további vizsgálatokig 4 °C-on tartottuk. (A tárolás minden esetben legfeljebb két hétig tartott, hogy a száradás okozta morfológiai-anatómiai elváltozásokat elkerüljük.) A növények gyökerei közül csapvízzel, szűrő felett kimostuk a talajt, a gyökereket pedig a továbbiakban már víz alatt tartottuk. Az ektomikorrhizák jellemzését megelőzően először OLYMPUS® SZX9 típusú sztereomikroszkóp (SM) alatt különválasztottuk a talajmintákban található különböző morfológiai típusokba (morfotípusokba) sorolható ektomikorrhizákat, melyeket a további vizsgálatok során már elkülönítve, különböző mintaszámokkal (HU-számok) jelölve kezeltünk.

III. 2.1 Az abundancia becslése A feldolgozásra került talajmintákban az egyes ektomikorrhiza-típusok gyakoriságát Gardes és Bruns (1996) szemikvantitatív módszerével végeztük el, melyet Jakucs (2002a) alapján kissé módosítottunk: az egyes morfotípusokhoz tartozó mikorrhizavégeknek az összes mikorrhizált gyökérvéghez viszonyított arányát becsültük. Az alábbi négy abundancia-kategóriát állítottuk fel: A – minor komponens: a mikorrhizált gyökérvégek kevesebb, mint 10 %-át teszi ki; B – minor-kodomináns: a mikorrhizált gyökérvégek 10-50 %-át teszi ki; C – major-kodomináns: a mikorrhizált gyökérvégek 50-90 %-át teszi ki; D – domináns: a mikorrhizált gyökérvégek több, mint 90 %-át teszi ki.

III.3. Morfológiai-anatómiai vizsgálatok III.3.1. Fénymikroszkópos módszerek

Az alaktani vizsgálatok keretében először sztereomikroszkóppal tanulmányoztuk a mikorrhiza-rendszerek morfológiáját. Ezt követően egy bonctű segítségével lehántottuk a gombaköpenyt a gyökérről (köpenypreparátumot készítettünk) és OLYMPUS® BX51 típusú fénymikroszkóp

felhasználásával,

differenciál-interferenciakontraszt

(Nomarski-DIC)

módban jellemeztük a köpenyrétegek és a kiágazó képletek anatómiáját. Egyes ektomikorrhizák jellemzéshez félvékony metszeteket is vizsgáltunk. Egyfelől fagyasztómikrotómmal 10 μm vastagságú preparátumokat készítettünk, melyeket anilinkékkel 50

festettünk meg a világos látóterű fénymikroszkópos vizsgálatokhoz. Emellett Historesin műgyantába (LEICA) történő beágyazással vékonyabb, 1μm vastagságú, metszeteket is készítettünk. A beágyazás előtt részleges víztelenítést végeztünk 50-96% etanol koncentrációsorozattal. (Mivel a beágyazó oldat is tartalmaz 6-8%-nyi vizet, nem kellett a teljesen vízmentes állapot elérésére törekednünk.) A beágyazást a gyártó utasításai szerint végeztük el (7022 31731 LEICA HISTORESIN Embedding Kit). A levegőtől elzárt környezetben polimerizálódó műgyantába ágyazott mintákból hossz- és keresztmetszetet készítettünk. Ezeket festés nélkül, OLYMPUS® BX51 típusú fénymikroszkóppal, fázis-kontraszt funkcióban (PhC) vizsgáltuk. A megfigyelt mikroszkópos jellemzőket digitális felvételekkel (OLYMPUS® C-4040 ZOOM típusú fényképezőgéppel) és rajztükör segítségével készített mikroszkópi rajzokkal dokumentáltuk.

III. 3.2. Hisztokémiai reakciók

Az idegen hifval kolonizált Lactarius ektomikorrhiza vizsgálata során hisztokémiai reakciókat is végeztünk, melyek során a Függelékben felsorolt reagenseket használtuk (Agerer 1991). III.3.3. Transzmissziós elektronmikroszkópia A mintaelőkészítést megelőzően háromszori, foszfát-pufferrel (0,07 M, pH=7,2) történő átmosással a fixáláshoz használt glutáraldehidet eltávolítottuk a mintából. Először 1%-os OsO4-oldattal utófixálást végeztünk 2 órán át. (A felesleges ozmium-tetroxidot szintén pufferes

átmosással

távolítottuk

el).

A

víztelenítést

25%-tól

kezdődő

etanol-

koncentrációsorozattal végeztük 15 percig tartó lépésekben; végezetül a minta abszolút etanolba került. Az etanolt ezt követően propilén-oxidra cseréltük. A beágyazás Durcupan műgyantába történt (SPI Supplies®), a gyártó utasításainak megfelelően. A polimerizáltatást három napon át végeztük, 60 °C-os termosztátban. A metszést követően (Ultracut E® típusú mikrotóm, Reichert-Jung) a gridre felvett metszeteket uranil-acetáttal és ólom-citráttal kontrasztosítottuk. A metszeteket H-7100 TEM (Hitachi) típusú, 75 kV gyorsítófeszültségű transzelektronmikroszkóppal (TEM) vizsgáltuk.

51

III. 4. Morfometriai vizsgálatok A Humaria és a Genea mikorrhizák esetében morfometriai analízis is végeztünk néhány előre kiválasztott anatómiai bélyegre vonatkozóan. Ehhez az Image-Pro® Plus szoftver 5.1 verzióját (Media Cybernetics, Inc.) használtuk. A vizsgált ektomikorrhizák esetében véletlenszerűen kiválasztottunk 2-3 mikorrhizált gyökérvéget, melyek köpenypreparátumain a következő paramétereket mértük: 1. a külső köpenyréteg sejtjeinek sejtfalvastagsága; 2. a külső köpenyréteg anguláris sejtjeinek legnagyobb átmérője („hossz”); 3. a külső köpenyréteg anguláris sejtjeinek legkisebb átmérője („szélesség”); 4. a

külső

köpenyréteg

anguláris

sejtjei

hosszának

és

szélességének

aránya

(„izodiametrikusság”); 5. a kiágazó hifák köpenyhez közel eső (proximális) részének átmérője; 6. a kiágazó hifák köpenytől távol eső (disztális) részének átmérője; 7. a kiágazó hifák köpenyhez közel eső (proximális) részén mérhető sejtfalvastagság; 8. a kiágazó hifák köpenytől távol eső (disztális) részén mérhető sejtfalvastagság; 9. a kiágazó hifákat borító szemölcsök átmérője; 10. a kiágazó hifák szeptumainak távolsága. (A kiágazó hifákra vonatkozó adatokat csak abban az esetben mértük, ha a statisztikai értékeléshez elegendő mennyiségű hifát találtunk az ektomikorrhizán.) A morfometriai összehasonlító vizsgálatokba azt a törzsgyűjteményi Genea verrucosa fajként meghatározott ektomikorrhizát is bevontuk (Magyar Természettudományi Múzeum, BP 92140), melyről a faj ektomikorrhizájának első morfológiai-anatómiai leírása jelent meg az irodalomban (Jakucs és mts. 1998). Ezen a mintán is a fenti adatokat mértük. A mért adatokat először ANOVA-val értékeltük, ami szignifikáns különbségeket mutatott ki minden egyes paraméter esetében. Ezt követően a mért paraméterek esetében Welchteszttel (d-teszttel, Welch 1947) vetettük össze az egyes mintákat. III. 5. A minták hosszú távú megőrzése

Későbbi fénymikroszkópos vizsgálatok elvégzésére néhány mikorrhizált gyökérvéget FEA-oldatban (Agerer 1991) fixáltunk. Az elektronmikroszkópos vizsgálatokhoz glutáraldehidben tároltuk a mintákat. A DNS-alapú vizsgálatokhoz e mellett három, idegen hifáktól

52

megtisztított, egyazon mikorrhiza-rendszerhez tartozó gyökércsúcsot Gardes és mts. (1991) szerint elkészített CTAB-pufferbe helyeztünk. Mintáinkból néhány ektomikorrhizált FEA-oldatban fixált gyökérvéget a Magyar Természettudományi Múzeum ektomikorrhiza-gyűjteményében helyeztünk el. 4. táblázat. Az azonosításhoz felhasznált herbáriumi minták adatai. (*: magángyűjteményben) Herbáriumi azonosító

Szerv

Gyűjtés helye

Gyűjtés ideje

Leg/Det

BP 53878

termőtest

Uzsapuszta

1973.10.04.

Tóth S.

BP 46092

termőtest

Kabhegy (Bakony Mts.)

1968.09.11.

Tóth S.

BP 45991

termőtest

Miklóspálhegy

1968.09.27.

Tóth S.

BP 53028

termőtest

Hárskút

1967.10.27.

Tóth S./ Szemere L.

BP 77249

termőtest

Cuha-hegy (Zirc)

1981.09.26.

Tóth S.

–*

termőtest

Őrség – Szalafő

2004.06.27.

Siller I.

–*

termőtest

Kisterenye (Heves, Borsod Hills)

2004.06.12.

Miskolc-Görömböly

1996.09.27.

Nagykovácsi Törökmező Bátorliget Szépvölgy Bátorliget Szépvölgy Esp., Barcelona, Llicá de Munt Esp. Burgos: Nava de Roa Esp. Gerona: Les Planes Esp. Segovia: La Pinilla Esp. Valladolid: Valdestillas

1996.01.10. 1996.08.28 2004.10.01. 1999. 2004.10.01. 1999.09.05.

THU 457 THU 458 THU 459 THU 460 THU 461 THU 462

ektomiko rrhiza termőtest termőtest termőtest termőtest termőtest termőtest

MA -Fungi 28301

termőtest

MA -Fungi 47178

termőtest

MA -Fungi 29806

termőtest

MA -Fungi 39512

termőtest

MA -Fungi 2843

termőtest

MA -Fungi 37503

termőtest

Esp. Cordoba: Catalán, Luque

1993.04.10.

MA -Fungi 54491

termőtest

Esp. Valladolid: Castromonte, La Espina

1998.05.13.

MA -Fungi 39514

termőtest

MA -Fungi 47910

termőtest

BP 92140

Esp. Valladolid: Penafiel Esp. Valladolid: Castromonte

1988.02.26.

Dima B., Németh M. Jakucs E., Bratek Z. Lukács Z. Lukács Z. Sági Á. Lukács Z. Sági Á. Lukács Z. J. Trappe & M. Castellano

Taxon H. hemisphaerica (Wigg.: Fr.) Fuckel H. hemisphaerica (Wigg.: Fr.) Fuckel H. hemisphaerica (Wigg.: Fr.) Fuckel H. rutilans (Fr.) Sacc. H. hemisphaerica (Wigg.: Fr.) Fuckel H. hemisphaerica (Wigg.: Fr.) Fuckel H. hemisphaerica (Wigg.: Fr.) Fuckel Genea verrucosa Vitt. + Quercus sp. G. hispidula G. hispidula G. verrucosa G. verrucosa G. klotzschii G. klotzschii G. klotzschii Berk. & Br. G. hispidula Berk. & Br. Ex Tul. & C. Tul.

1999.03.06.

F. García

1991.06.15.

J. M. Vidal

G. lespiaultii Corda

F. García, det.: F.D. Calonge E. Méndez, det. I. Arroyo B. Moreno & J. Gómez, det. F.D. Calonge A. García Blanco, M. Sanz Carazo & J.B. Del Val, det. A. García Blanco F. García, det. J.M. Vidal A. García, det. F.D. Calonge

G. phaerica Tul. & Ch. Tul. G. klotzschii Berk. & Br. G. sphaerica f. lobulata Moreno-Arroyo, Gómez & Calonge

1996.09.29. 1981.06.26.

1997.03.25. 1999.05.07.

G. sphaerica Tul. & C. Tul.

G.thaxterii Gilkey G. verrucosa Vittad.

III. 6. Herbáriumi minták, termőtestek Az ektomikorrhizák mikobiontáinak faji azonosítása céljából a Humaria-Genea leszármazási vonal esetében herbáriumi termőtesteket is bevontunk a molekuláris taxonómiai vizsgálatokba.

Ugyanezen

csoport

morfometriai

analízisét

kiterjesztettük

arra

a

53

törzsgyűjteményi ektomikorrhizára is, melyről a Genea verrucosa Vitt. ektomikorrhiza részletes morfológiai-anatómiai leírása is elkészült (Jakucs és mts. 1998). A herbáriumi minták adatait a 4. táblázat tartalmazza. III. 7. Molekuláris módszerek III. 7.1. Mintavétel, DNS-kinyerés A DNS kinyerése és felerősítése során Gardes és munkatársai eljárását követtük (Gardes és mts. 1991), kisebb módosításokkal (Kovács és mts. 2001, Jakucs és mts. 2005a). A DNS kinyerését minden esetben olyan összefüggő ektomikorrhiza-rendszerekből származó mikorrhizákból végeztük, melyek más végeit morfológiai-anatómiai szempontból is megvizsgáltuk. A DNS kivonása során a következő, általános metódust vettük alapul. Az idegen hifáktól megtisztított

mikorrhizavégeket

CTAB-pufferben

steril

kvarchomokkal

gondosan

eldörzsöltük, majd alapos összekeverést követően 45 percen át 60 °C-on inkubáltuk. Ezt követően a csövekhez a fehérjék denaturálásának teljessé tétele érdekében 400 μl kloroformot adtunk,

s

gondosan

összeráztuk

tartalmukat.

10

percen

át,

12.000

percenkénti

fordulatszámmal (rpm) végzett centrifugálás után (JOUAN MR 18.22, 6 cm-es sugár) megismételtük az extrakciót, majd a DNS-t legalább egy éjszakán át -20 °C-on kicsapattuk. A kicsapott DNS-t 30 percen át tartó 13.000 rpm fordulatszámú centrifugálással ülepítettük, majd kétszer átmostuk hűtött, 80 %-os etanollal. A tisztított DNS-t 40 μl steril, ultratiszta vízben oldottuk fel, majd a további vizsgálatokig -20 °C-on tároltunk. A Humaria ill. Genea ektomikorrhizák vizsgálata során a fehérje-kicsapást nem kloroformmal, hanem kloroform:izoamilalkohol 24:1 arányú elegyével végeztük. A herbáriumi termőtestmintákat a kinyerés előtt legalább 24 órán át CTAB-pufferben áztattuk. Ez utóbbi esetben az inkubálás alacsonyabb hőmérsékleten (50 °C), hosszabb ideig (90 perc) zajlott. III. 7.2. Polimeráz láncreakció (PCR) A filogenetikai vizsgálatokba vont génszakaszok felerősítését (amplifikálását) polimeráz láncreakcióval (PCR) végeztük el, Gardes és Bruns (1993) metódusa szerint. A PCR-hoz a használt primereket l. a 5. táblázatban.

54

A PCR-elegy összetételét a Függelék tartalmazza. A DNS-kivonat optimális mennyiségét minden egyes minta esetében előzetes vizsgálatokkal határoztuk meg, többnyire az 50-100x higítás bizonyult megfelelőnek (bár egyes esetekben ennél lényegesen nagyobb hígításra volt szükség feltehetően a kivonatban levő, nem eltávolítható, a PCR-t gátló másodlagos anyagcseretermékek jelenléte miatt). Az amplifikáció körülményei A különböző génszakaszok felerősítésének reakció-körülményeit minden esetben korábban már vizsgált, optimális mennyiségű DNS-t tartalmazó kivonatok segítségével állítottuk be. Az alkalmazott primereket és hőmérsékleti programokat az 5. táblázat foglalja össze. 5. táblázat. Az egyes génszakaszok felerősítésének reakciókörülményei. A primerek megnevezésénél zárójelben feltüntettük azok hivatkozásait is. A génszakaszok megnevezése alatti bal oldali oszlopokban a hőmérsékleti program egyes lépéseinek hőmérsékleti értékét ill. időtartamát, a jobb oldali oszlopban a megfelelő lépés ismétléseinek számát tűntettük fel.

ITS

28 S rRNS génjének 5’-végi szakasza

18 S rRNS génjének 5’-végi szakasza

ITS1f (Gardes és Bruns, 1993) ITS4 (White és mts., 1990)

LROR (Rehner and Samuels, 1994) LR5 (Vilgalys és Hester, 1990)

NS1 (White és mts., 1990) NS4 (White és mts., 1990)

vizsgált génszakasz primerek

5’→3’ 3’→5’ kezdeti denaturáció

hőmérsékleti program

95°C, 5’

denaturáció

95°C, 1’

primer-bekötés

55°C, 20”

lánchosszabbítás

72°C, 2’

végső lánchosszabbítás

72°C, 14’

1x

94°C, 2’

36x

56°C, 45”

1x

94°C, 2’

35x

56°C, 45”

94°C, 1’

94°C, 1’

72°C, 2’ 1x

1x 35x

72°C, 2’

72°C, 10’

1x

72°C, 14’

1x

A reakció sikerességét 1%-os agaróz gélben végzett elektroforézis segítségével vizsgáltuk, etídium-bromidos festés mellett, UV-detektálással.

III. 7.3. Szekvenálás A direkt szekvenálást megelőzően a nagy mennyiségben felszaporított DNS-termékeket PCR Clean Up-M kit (Viogene) segítségével tisztítottuk (követve a termékleírásban szereplő instrukciókat). A ciklikus szekvenálási reakciót az ABI PRISM 3.1 BigDye Terminator Kit (Applied

Biosystems)

felhasználásával

végeztük,

a

gyártó

utasításai

szerint.

Az

elektroforetikus elválasztást a Szegedi Biológiai Kutatóintézet szolgáltató laboratóriumában 55

végeztettük el. A kiválasztott génszakaszok szekvenálását a PCR-hez használt primerekkel, mindkét irányban elvégeztük. Az elektroforegramokat a Staden programcsomag (Staden 2000) Pregap4 és Gap4 nevű programjaival értékeltük ki. A szerkesztést követően a publikációkban is közölt szekvenciákat a GenBank nyilvános szekvencia-adatbázisban is elhelyeztük, azonosító számaikat az Eredmények és értékelésük fejezet megfelelő részeinél tüntettük fel. III. 8. Filogenetikai analízis A filogenetikai vizsgálatokhoz a saját mintáink szekvenciáihoz hasonló szekvenciákat az interneten keresztül hozzáférhető nyilvános adatbázisokból kerestük ki; a GenBank-ből BLAST (Altschul és mts. 1990), az UNITE ektomikorrhiza-adatbázisból (Köljalg és mts. 2005) galaxieBLAST algoritmussal (Nilsson és mts. 2004). A szekvenciák illesztéséhez a ClustalX programot használtuk (Thompson és mts. 1997). Filogenetikai rekonstrukciókat Neighbor-joining (NJ), maximális parszimónia (MP), maximális valószínűség (maximum likelihood, ML) módszereivel és Bayes-i filogenetikával (Bayes-módszer) végeztünk. A NJ és az MP vizsgálatokat a PAUP* program 4.0 beta verziójával (Swofford 2003), a ML analízist a PhyML szoftverrel (Guindon and Gascuel 2003), a Bayes-módszer alapú rekonstrukciót a MrBayes 3.1.1. programmal (Huelsenbeck és Ronquist 2001, Ronquist és Huelsenbeck 2003) hajtottuk végre. A nukleotid-szubsztitúciós modellen alapuló analízisekben (NJ, ML, Bayes-módszer) az általános idő-reverzibilis modellt („general time reversible”, GTR) alkalmaztuk (Tavaré 1986). A MP vizsgálatnál a nukleotidpozíciókat rendezetlen, súlyozás nélküli karaktereknek tekintettük. Az inszerciós helyeket („gap”) ötödik karaktertípusként értelmeztük. A heurisztikus topológia-optimalizáló eljáráshoz a kiindulási fát lépésenkénti taxonhozzávétellel („stepwise addition”) állítottuk elő. Az optimális topológiát „metszés-újraegyesítés” („tree bissection and reconnection”, TBR) algoritmussal kerestük (a „steepest descent” funkciót ill. topológiai kényszereket nem használtuk, de a MULTrees opciót alkalmaztuk). A heurisztikus keresést 10.000-szer ismételtük meg. A ML-vizsgálatban az egyensúlyi bázis-gyakoriságokat optimalizáltuk, s négy különböző szubsztitúciós kategóriát különböztettünk meg. A változatlan (invariáns) nukleotid-pozíciók arányát megbecsültettük a programmal. A Bayes-módszer esetében figyelembe vettük a változatlan nukleotid-pozíciókat, melyekre vonatkozóan gamma-eloszlást feltételeztünk. A vizsgálatot a következő a priori 56

paraméterekkel indítottuk: azonos nukleotid-gyakoriságok, egységes alakparaméter, a változatlan nukleotid-pozíciók aránya is egységes (a topológiára és az ághosszakra nincsenek megszorítások). A Monta Carlo Markov-Chain (MCMC) szimulációt – elemzéstől függően – 500.000-2.000.000 generáción át futtattuk. Minden 100. generációt mintáztunk, a végső következtetést pedig a minták utolsó 25%-ából vontuk le. A törzsfákon kialakuló kládok statisztikai támogatottságát bootstrap analízissel (Felsenstein 1985) vizsgáltuk. Mivel a kiindulási adatmátrix mérete befolyásolta az egyes elemzési módszerek alkalmazhatóságát, nem alkalmazhattuk minden vizsgálat esetében ugyanazokat a paramétereket. Az egyes molekuláris elemzések alkalmával feltett kérdéseinknek megfelelően az is változott, hogy mely esetben hányféle elemzést végeztünk: abban az esetben, amikor csak a mikobionta azonosítása volt a cél, csak a Neighbor-joining ill. az attól alapvető elveiben különböző Bayes-elemzést végeztük el, amikor részletesebben érdekelt az egyes taxonok rendszertani helyzete, igyekeztünk többféle elemzést is végezni. Hogy az egyes EMcsoportok esetében milyen elemzéseket, és milyen paraméterekkel végeztünk, azt a Függelékben foglaltuk össze.

57

IV. Eredmények és értékelésük Az „Őserdő” területén 10 alkalommal gyűjtött 30 talajmintában összesen 325 ektomikorrhizát különítettünk el. Az egyes talajmintákból elkülönített mintákat meghatározott morfológiai-anatómiai csoportokra bontottuk. A csoportok elkülönítő bélyegeiként olyan jellemzőket választottunk ki, melyek rendszertanilag jól elhatárolható kategóriákat írnak körül. Ilyenek például a Lactarius nemzetségre jellemző tejhifák (laticiferek), a Russula nemzetségre jellemző palack alakú cisztídiumok vagy a tomentelloid ektomikorrhizákra jellemző, az Irodalmi áttekintés megfelelő fejezetében felsorolt bélyegek. 6. táblázat. A területen talált, azonosított ektomikorrhiza-típusok összefoglaló táblázata. A morfológiaianatómiai bélyegek alapján azonosított ektomikorrhizák oszlopában szereplő mintaszámok azokra az ektomikorrhiza-típusokra vonatkoznak, melyeket molekulárisan ezidáig nem azonosítottunk.

Nemzetség/család/csoport Tömlős Cenococcum Humaria/Genea Hymenoscyphus Pachyphloeus Tuber Terfeziaceae Pezizales Bazídiumos boletoid Byssocorticium Clavulina Entoloma Hebeloma Inocybe Laccaria Lactarius Russula Sebacina Tomentella Tricholoma Tylospora Összesen

Morfológiai-anatómiai azonosítással 27 ektomikorrhiza 14 ektomikorrhiza 3 ektomikorrhiza 3 ektomikorrhiza 4 ektomikorrhiza 3 ektomikorrhiza 93 ektomikorrhiza 11 ektomikorrhiza 2 ektomikorrhiza 4 ektomikorrhiza 53 ektomikorrhiza 6 ektomikorrhiza 17 ektomikorrhiza 120 ektomikorrhiza

DNS-alapú azonosítással 23 ektomikorrhiza 6 ektomikorrhiza 11 ektomikorrhiza 5 ektomikorrhiza1 1 ektomikorrhiza 1 ektomikorrhiza 43 ektomikorrhiza 2 ektomikorrhiza 3 ektomikorrhiza2 4 ektomikorrhiza 1 ektomikorrhiza3 8 ektomikorrhiza 2 ektomikorrhiza 5 ektomikorrhiza 15 ektomikorrhiza4 2 ektomikorrhiza 1 ektomikorrhiza 66 ektomikorrhiza

Összesen 50 ektomikorrhiza 14 ektomikorrhiza 8 ektomikorrhiza 3 ektomikorrhiza 15 ektomikorrhiza 8 ektomikorrhiza 1 ektomikorrhiza 1 ektomikorrhiza 136 ektomikorrhiza 11 ektomikorrhiza 2 ektomikorrhiza 2 ektomikorrhiza 3 ektomikorrhiza 4 ektomikorrhiza 4 ektomikorrhiza 1 ektomikorrhiza 61 ektomikorrhiza 8 ektomikorrhiza 5 ektomikorrhiza 32 ektomikorrhiza 2 ektomikorrhiza 1 ektomikorrhiza 186 ektomikorrhiza

(1: két minta azonosítását Kovács M. Gábor végezte; 2: egy minta azonosítását Seress Diána végezte; 3: a minta azonosítását Seress Diána végezte; 4: három minta azonosítását Kovács M. Gábor, egy mintáét Seress Diána végezte.)

58

A mintaterületen talált valamennyi típus részletes, összehasonlító morfológiai-anatómiai és molekuláris taxonómiai vizsgálata még folyamatban van. Mivel emellett az összes típus ismertetése túlmutatna a disszertáció keretein, ezért itt csak eddigi eredményeinket, néhány meghatározott csoport jellemzőit ill. összehasonlító értékelését ismertetem. Az összes, a mintaterületről gyűjtött és morfológiai-anatómiai vagy molekuláris alapon eddig meghatározott ektomikorrhiza adatait a 6. táblázatban foglalom össze. Ezek közül egyrészt tömlősgomba csoportok (a Genea-Humaria nemzetségek és az AmylascusScabropezia-Pachyphloeus leszármazási vonalak képviselőinek) és a mintterületen talált tomentelloid ektomikorrhizákat vizsgáltam. Emellett egy endogén hifakolonizációja miatt jellegzetes Lactarius ektomikorrhizát is részletesen jellemeztem. Végül néhány olyan ektomikorrhizát

is

részletesebben

tanulmányoztam,

melyek

anatómiája

nem

utalt

egyértelműen a mikobionta rendszertani hovatartozására, ám molekuláris alapon már sikerült azonosítani. A filogenetikai elemzések jellemző paramétereit és eredményeit a Függelékben található táblázatokban foglaltam össze. Az egyes ektomikorrhizák azonosításához molekuláris adatbázisokból letöltött szekvenciák jellemző adatait a Humaria, Tomentella, Lactarius, Clavulina, Entoloma, Inocybe, Sebacina, Tricholoma és Tuber nemzetségek esetében szintén a Függelék tartalmazza. IV. 1. A Humaria és Genea nemzetségek ektomikorrhizái

Munkánk során hazai lombos erdőkben 13 olyan ektomikorrhizát találtunk, melyek morfológiája és anatómiája a Genea ill. Humaria nemzetségek ektomikorrhizáira emlékeztet. Gyűjtési adataikat a 7. táblázat tartalmazza. Ezek a morfotípusok elsősorban minor vagy minor kodomináns alkotói az ektomikorrhiza-közösségnek, de becsült abundanciájuk egy bükkerdei és egy tölgyesből származó talajmintában is meghaladta a 90%-ot. IV. 1.1. Az ektomikorrhizák közös morfológiai és anatómiai bélyegei Morfológiai jellemzők A két nemzetség ektomikorrhizáinak kvalitatív morfológiai és anatómiai jellemzői döntően megegyeznek. A mikorrhizavégek monopodiális-piramidális elágazási rendszerűek, hosszuk változó: (1) 2-7 (12) mm. Az egyes végek hossza (0,3) 0,7-2 (3) mm, átmérője 0,159

0,5 (1) mm, színük gesztenyebarna vagy sötétbarna. A mikorrhizák felszíne sima vagy merev kiágazó hifáktól kissé gyapjas.

7. táblázat. A Humaria és Genea EM-minták gyűjtési adatai. Relatív gyakorisági kategóriák: A minor komponens (<10%), B minor kodomináns komponens (10-50%), C major kodomináns komponens (50-90%), D domináns komponens (>90%). A *-gal jelölt minták esetében vizsgáltuk az SSU-régiót is. Mintaszám

Herbáriumi azonosító

Mintaterület

A gyűjtés időpontja

Gazdanövény

Relatív gyakoriság

HU 121* HU 237* HU 278* HU 317* HU 371 HU 388 HU 535 HU 600 HU 602 HU 614 HU 674 HU 739 HU 652

BP97489 BP97490 BP97491 BP97492 BP97493 BP97494 BP97495 BP98698 BP98699 BP98700 BP98701

Püspökladány Püspökladány Püspökladány Bükk – Őserdő Bükk – Őserdő Bükk – Őserdő Bükk – Őserdő Őrség – Csörötnek Őrség – Csörötnek Őrség – Csörötnek Őrség – Csörötnek Bükk – Őserdő Bükk – Őserdő

1998.04.08 2000.04.24 2001.06.10 2002.11.01 2003.04.18 2002.10.21 2005.10.23 2006.09.16 2006.09.16 2006.09.16 2007.04.09. 2007.10.10. 2006.10.23.

Quercus cerris Q. robur Q. robur F. sylvatica F. sylvatica F. sylvatica F. sylvatica F. sylvatica F. sylvatica F. sylvatica F. sylvatica F. sylvatica F. sylvatica

D B B B A A D A A A A B A

GenBank azonosító (ITS) EU024873 EU024874 EU024875 EU024876 EU024877 EU024878 EU024879 EU024880 EU024881 EU024882 EU024883

A köpeny anatómiai jellemzői A külső köpenyréteg pszeudoparenchiamtikus-anguláris, egyes helyeken epidermoid felé mutat átmenetet (6. ábra, 1. tábla). A sárga színű sejtfalak vastagsága még egy-egy mintán belül is nagyon változó: (0,3) 0,6-1,8 (3,5) μm, a köpenyfelszín felé eső oldalon még jobban kiszélesedik (8-12 μm, 1. tábla/a). Néhol a szomszédos sejtek között anasztomózisokat is megfigyelhetünk. Egy 20 μm élhosszúságú négyzetben három-négy (néha hat-nyolc) sejt helyezkedik el. Az egyik mintában (BP 97492) a külső köpenyréteg néhány sejtjében citoplazmatikus granulumok láthatók. A középső és a belső köpenyrétegek (1. tábla/d) szerkezete pszeudoparenchimatikus-epidermoid, sejtjeik vékonyabb falúak (0,5-1 μm). Néha e köpenyrétegek megnyúlt sejtjei sorokba rendeződnek, ekkor a köpenyszerkezet a plektenchimatikus felé mutat átmenetet. A kiágazó elemek anatómiai jellemzői A kiágazó hifák a külső köpenyréteg sejtjeihez hasonló, vastag falú, hagymaszerűen kiszélesedő alapi sejttel erednek a köpenyből (6. ábra, 1. tábla/c). A hifák fiatalon színtelenek, hullámos lefutásúak és sima felszínűek, az idősebb (tehát a köpenyhez közelebb eső, proximális) részeken sárgásbarnák, egyenesebbek és szemölcsösen mintázottak. 60

Közvetlenül a köpeny közelében nem mintázottak. Átmérőjük (4) 5-7 (10) μm. A hifákat tagoló egyszerű szeptumok távolsága 70-80 μm a fiatalabb és (25) 30-60 (120) μm az idősebb, szemölcsös részeken. A köpeny közelében a hifafal vastagsága (2) 2,5-3 (3,5) μm, a disztális részeken (0,8) 1-2 (2,5) μm. Egyes helyeken sejtfal-betüremkedések láthatók a hifákon. Rhizmorfát nem találtunk. A köpenyben cisztídiumok sem fordulnak elő, de a kiágazó hifák alapi sejtjei a hifák kifejlődését megelőző stádiumban cisztídium-szerű megjelenést mutatnak.

6. ábra. A Humaria-EM külső köpenyrétege és kiágazó hifáinak eredése (a) valamint a hifák anatómiája (b). (Mikroszkópi rajzok)

A hosszmetszet anatómiai jellemzői A gombaköpeny vastagsága (23) 25-30 (40) μm. A paraepidermális Hartig-háló többnyire csak a kéreg legkülső sejtsorát veszi körül. (Csak néhány mintában tapasztaltuk azt, hogy a hifák két sejtsor mélységig hatoltak a kéregbe.) Az egyik minta (BP97493) kortikális sejtjeiben szeptált hifákat figyeltünk meg (1. tábla/e,f), de az intracelluláris kolonizáció általában nem jellemző ezekre az ektomikorrhizákra. IV. 1.2. Filogenetikai kapcsolatok A molekuláris taxonómiai vizsgálatok eredményeképpen négy ektomikorrhizából határoztuk meg a riboszomális kis alegységet alkotó rRNS (SSU) és mind a 13 minta esetében az ITS-régió szekvenciáját (7. táblázat). A részletes filogenetikai vizsgálatokat megelőzően a 61

Pyronemataceae család több képviselőjére kiterjedő analízist végeztünk, ami igazolta, hogy az EM-ból származó szekvenciák a Humaria és Genea fajokból származó, adatbázisból letöltött szekvenciákkal alkotnak közös kládot. NJ / MP

Wilcoxina mikolae (U62014)

ML / Bayes

Trichophaea hybrida (U53390) Genea verrucosa (termőtest, THU 460)

55/77/-

Genea klotzschii (termőtest, THU 461) Genea klotzschii (termőtest, MA28301) Genea hispidula (termőtest, MA47178) Genea hispidula (termőtest, THU 457)

64/63 60/0.90

Genea harknessii (DQ646526) Genea sphaerica (termőtest, MA54491)

85/78 91/0.96

Genea verrucosa (termőtest, MA47910) Genea sphaerica f. lobulata (termőtest, MA37503)

73/73 80/0.97

95/90

Genea klotzschii (termőtest, MA2843)

88/1.00

Genea thaxterii (termőtest, MA39514)

Humaria hemisphaerica (DQ646529) HU 317 (BP97492) 100/100

HU 121 (BP97489)

100/1.00

HU 278 (BP97491)

74/68/0.63 63/61 82/0.92

Humaria rutilans (termőtest, BP53028) HU 237 (BP97490)

Genea verrucosa (termőtest, THU 459) 56/69 51/-

Genea phaerica (termőtest, MA39512)

0.002

8. ábra. A Humaria-ektomikorrhizák mikobiontáinak filogenetikai helyzetét bemutató, a SSUszekvenciája alapján konstruált NJ-fa. Az egyes ágak felett balra a NJ-elemzéshez, jobbra a MP-elemzéshez tartozó bootstrap-értékek, az ágak alatt balra a ML-analízis bootstrap értékei, jobbra a Bayes-analízis során kapott posterior valószínűségi értékek szerepelnek. (A túl rövid ágak esetén a statisztikai értékeket egy vízszintes vonal fölött ill. alatt tüntettük fel, nyíllal jelölve, hogy mely elágazási pontokhoz tartoznak.) Pirossal jelöltük a mintaterületen gyűjtött ektomikorrhizákból származó szekvenciákat, vastag szedéssel kiemelve a herbáriumi termőtestekből nyert szekvencikat. A herbáriumi anyagok azonosító számait és a molekuláris adatbázisokból származó szekvenciák azonosító számait zárójelben adtuk meg. (Csak az 50% ill. 0,5 feletti statisztikai értékeit adtuk meg; a mérce 1000 bázispárra jutó 2 szubsztitúciónak megfelelő ághosszat jelöl.)

A

pontos

meghatározás

érdekében

herbáriumi

gyűjteményekben

elhelyezett

termőtestekből nyert szekvenciákat is bevontunk a részletes analízisekbe, melyek azonban már csak erre a két nemzetségre terjedtek ki. A herbáriumi adatokat az Anyag és módszer c. fejezet ide vonatkozó része (4. táblázat) tartalmazza. Herbáriumi termőtestekből 13 esetben határoztunk meg SSU-szekvenciákat (egyet hazai gyűjtésű Humaria-termőtestből, négyet Genea-termőtestekből, nyolcat pedig a madridi CSIC – Real Jardín Botánico herbáriuma Genea-aszkokarpiumaiból). ITS-szekvenciát hat hazai Humaria-termőtestből valamint három hazai és nyolc spanyol Genea-termőtestből nyertünk ki (4. táblázat). 62

Az átfogó elemzést követően háromféle adat-készletet vizsgáltunk részletesebben. A minták SSU-szekvenciáiat a két nemzetség esetében egy közös adatmátrixként elemeztük, külcsoportul egy Wilcoxina mikolae ill. egy Trichophaea hybrida szekvenciát választva. A két nemzetség ITS-szekvenciái mind saját előzetes vizsgálataink, mind korábbi molekuláris taxonómiai munkák (Tedersoo et al. 2006a) tanúsága szerint testvércsoportjai egymásnak. A részletes analízist a két nemzetség esetében külön-külön végeztük el úgy, hogy a Humariaszekvenciák esetében Genea, míg a Genea-minták vizsgálatához Humaria-szekvenciákat választottunk külcsoportul. Minden adatkészlet esetében elmondható, hogy a négy, különböző filogenetikai rekonstrukciós eljárás – a vizsgált mintákból származó szekvenciák rokonságait tekintve – hasonló eredményre vezetett, különbségek elsősorban az egyes kládok statisztikai támogatottságában mutatkoznak. A 13 minta közül tizenkettő (HU 121, HU 237, HU 278, HU 317, HU 371, HU 388, HU 535, HU 600, HU 602, HU 614, HU 674, HU 739) a Humaria nemzetség tagjai közé került az ITS-alapú törzsfákon. (Közös kládjuknak igen magas a statisztikai támogatottsága: az ML analízis esetében 75%, a többi esetben 95%-ot ill. 0.95-öt meghaladó érték). A nemzetségi hovatartozást megerősíti a riboszomális kis alegység rRNS-ének génje alapján felállított törzsfa is (7. ábra): a HU121, HU237, HU278, HU 317 minták szekvenicái egy adatbázisból származó Humaria hemisphaerica-szekvenciával, valamint egy herbáriumi Humariatemőtestből (H. rutilans) kinyert szekvenciával alkotnak közös, statisztikailag is támogatott kládot. Az ITS-alapú fákon a H. hemisphaerica fajon belül (8.ábra) a mikorrhizák négy jól elkülönülő, bár egymástól nem nagy távolságra levő csoportban helyezkednek el. Egy minta (HU 652) a Genea nemzetség képviselőiből származó, adatbázisból letöltött ill. herbáriumi termőtestekből nyert szekvenciákkal szerepel egy közös kládban a törzsfákon. (Mivel ebből az ektomikorrhizából SSU-szekvenciát nem tudtunk kinyerni, elemzéseink csak az ITS-régión alapulnak.) A részletes vizsgálatok során (9. ábra) az ektomikorrhiza szekvenciája egy G. verrucosa faj termőtestéből származó szekvenciával (AJ969624 – Tedersoo és mts. 2006a) alkot külön ágat (statisztikai támogatottsága minden elemzésben 100% ill. 1.00). A tágabb kapcsolatokat megvizsgálva azt láthatjuk, hogy ez a közös ág egy közös, statisztikailag is megalapozott csoportot alkot két G. klotzschii herbáriumi minta szekvenciájával, valamint egy bükkösből származó, faji szinten nem azonosított Genea ektomikorrhiza szekvenciájával (EU668246 – Bidartondo és Read 2008). 63

Genea harknessii (FJ235150) Genea gardneri (AY830857) Humaria hemisphaerica (EM, AJ968670) - Corylus

100/100 97/1.00

HU 121 (BP97489)

I. csoport

Humaria hemisphaerica (EU819470) 96/100 75/0.99

Humaria hemisphaerica (EU819506) Humaria hemisphaerica (EM, AJ968666) 53/68/1.00

Humaria hemisphaerica (termőtest, BP45991) Humaria hemisphaerica (termőtest, Siller) Azonosítatlan ektomikorrhiza (FJ147328) - Quercus Azonosítatlan ektomikorrhiza (FJ348377) - Quercus Azonosítatlan ektomikorrhiza (FJ348376) - Quercus Humaria hemisphaerica (termőtest, Dima&Németh)

70/70/1.00

II. csoport

HU 278 (BP97491)

73/65 70/1.00

Humaria hemisphaerica (termőtest, BP77249) HU 237 (BP97490)

91/99 82/0.90

Humaria hemisphaerica (termőtest, BP53878) Azonosítatlan ektomikorrhiza (EU668922) - Pyrola Humaria hemisphaerica (DQ200832)

63/-

Humaria hemisphaerica (EM, AJ969613) - Fagus

-/0.98

Azonosítatlan ektomikorrhiza (FJ403510) - Fagus Azonosítatlan ektomikorrhiza (EU668921) - Pyrola HU 388 (BP97494)

100/-/0.85

Humaria hemisphaerica (EM, EU819538) - Quercus HU 600 (BP98698)

III. csoport

HU 602 (BP98699) HU 614 (BP98700) Humaria hemisphaerica (EM, AJ968674) - Pinus 80/-

NJ / MP

-/0.61 60/-/0.87

ML / Bayes

HU 739 HU 317 (BP97492) HU 674 HU 371 (BP97493)

99/99 98/1.00

HU 535 (BP97495)

IV. csoport

Humaria hemisphaerica (termőtest, BP46092)

97/98 99/1.00 0.02

8. ábra. A Humaria-EM-k mikobiontáinak filogenetikai helyzetét bemutató, az ITS-régió szekvenciája alapján konstruált, Bayes-analízissel készült fa. Az egyes ágak felett balra a NJ-elemzéshez, jobbra a MP-elemzéshez tartozó bootstrap-értékek, az ágak alatt balra a ML-analízis bootstrap értékei, jobbra a Bayes-analízis során kapott posterior valószínűségi értékek szerepelnek. (A túl rövid ágak esetén a statisztikai értékeket egy vízszintes vonal fölött ill. alatt tüntettük fel, nyíllal jelölve, hogy mely elágazási pontokhoz tartoznak.) Pirossal jelöltük a mintaterületen gyűjtött ektomikorrhizákból származó szekvenciákat, vastag szedéssel kiemelve a herbáriumi termőtestekből nyert szekvencikat. A herbáriumi anyagok azonosító számait és a molekuláris adatbázisokból származó szekvenciák azonosító számait zárójelben adtuk meg. Az adatbázisokból származó ektomikorrhiza-szekvenciák esetében a gazdanövény nemzetségét is megadtuk. (Csak az 50% ill. 0,5 feletti statisztikai értékeit adtuk meg; a mérce 100 bázispárra jutó 2 szubsztitúciónak megfelelő ághosszat jelöl.)

IV. 1.3. Morfometriai analízis Nyolc minta esetében állt rendelkezésünkre annyi ektomikorrhiza, melyek alapján morfometriai analízist végezhettünk. Mivel a BP 98701 minta esetében túl kevés kiágazó hifa állt rendelkezésünkre a kellően megalapozott statisztikai vizsgálathoz, ezeket az adatokat 64

98/99 66/1.00

NJ / MP

93/96 88/1.00

ML / Bayes

Genea klotzschii (termőtest, MA28301)

99/88 69/-

Genea sp. (EU668246) Genea klotzschii (termőtest, THU 461) 100/100 HU 652 (BP98701) 100/1.00 Genea verrucosa (AJ969624)

100/100 100/1.00

Uncultured ectomycorrhiza (DQ206849) Uncultured ectomycorrhiza (DQ206855)

95/100 97/1.00

Genea balsleyi (DQ218302) Genea verrucosa (termőtest, THU 459)

96/94 99/1.00

97/97 99/100 Genea hispidula (termőtest, THU 457) 98/1.00 99/1.00 100/100 Genea phaerica (termőtest, MA39512) 100/1.00 Uncultured ectomycorrhiza (EU816611) 99/100 98/1.00

Uncultured ectomycorrhiza (AJ969434) Genea hispidula (AJ969622)

100/100 100/1.00

Uncultured ectomycorrhiza (AM159605) 100/Genea hispidula (AJ969623) 98/Genea hispidula (termőtest, MA47178) 100/100 Genea arenaria (DQ206841) 100/1.00 Genea arenaria (DQ206839) 99/100 97/1.00

51/50 84/1.00

Genea arenaria (DQ206844) Genea arenaria (DQ206838) Genea arenaria (DQ206856)

100/100 100/1.00 97/65

Genea verrucosa (termőtest, MA47910) Genea sphaerica (termőtest, MA54491) Genea sphaerica f. lobulata (termőtest, MA37503)

70/0.80

100/100 Genea gardnerii (DQ206850) 100/1.00 Genea gardneri (DQ249869)

Uncultured ectomycorrhiza (FJ348374) 99/100 100/1.00

Uncultured ectomycorrhiza (AY969007) 99/100 Genea harknessii (DQ218285) 93/1.00 Genea hark nessii (DQ218292) Uncultured mycorrhiza (EF661993) 99/-/1.00

100/100 100/0.99

Uncultured mycorrhiza (DQ206859.) Uncultured mycorrhiza (DQ206861)

100/100 100/1.00

99/99 84/0.97

Genea harknessii (DQ218300) Uncultured ectomycorrhiza (EF661989) Uncultured ectomycorrhiza (DQ206867.1)

100/100 100/1.00

Uncultured ectomycorrhiza (DQ206865) Genea harknessii (DQ218283) Uncultured mycorrhiza (DQ206857)

100/53 99/1.00

Uncultured ectomycorrhiza (DQ206853) 100/100 66/0.69

100/100 100/1.00

Genea harknessii (DQ218290) Genea sp. (AY920529) Genea klotzschii (termőtest, MA2843)

Genea thaxterii (termőtest, MA47910)

Humaria hemisphaerica (EU819470) Humaria hemisphaerica (EU819506) Humaria hemisphaerica (EU819538)

0.1

9. ábra. A Genea-EM mikobiontáinak rendszertani helyzetét bemutató, az ITS-régió szekvenciája alapján konstruált NJ-fa. Az egyes ágak felett balra a NJ-elemzéshez, jobbra a MP-elemzéshez tartozó bootstrap-értékek, az ágak alatt balra a ML-analízis bootstrap értékei, jobbra a Bayes-analízis során kapott posterior valószínűségi értékek szerepelnek. (A túl rövid ágak esetén a statisztikai értékeket egy vízszintes vonal fölött ill. alatt tüntettük fel, nyíllal jelölve, hogy mely elágazási pontokhoz tartoznak.) Pirossal jelöltük a mintaterületen gyűjtött ektomikorrhizából származó szekvenciákat, vastag szedéssel kiemelve a herbáriumi termőtestekből nyert szekvencikat. A herbáriumi anyagok azonosító számait és a GenBank-ből származó szekvenciák azonosító számait zárójelben adtuk meg. (Csak az 50% ill. 0,5 feletti statisztikai értékeit adtuk meg; a mérce 100 bázispárra jutó 10 szubsztitúciónak megfelelő ághosszat jelöl.) 65

kihagytuk az elemzésből. Az egyes minták esetében kapott leíró statisztikákat a Függelék tartalmazza. Mivel az előzetes ANOVA minden esetben szignifikáns különbözőséget mutatott ki a mért adatok közt, a páronkénti összehasonlításokat Welch-teszttel végeztük el. A Humaria mintákon mért adatok összevonásával létrehoztunk egy olyan adatbázist („ΣHumaria”), mely valamennyi, a Humaria-kládba sorolható minta adatait tartalmazta. Ezt vetettük

össze

az

„eredeti

Genea

ektomikorrhiza”

adataival,

mely

annak

a

törzsgyűjteményben elhelyezett Genea verrucosa ektomikorrhizának a mért adatait jelenti, melyről az eredeti leírás is született (Jakucs és mts. 1998). Az összehasonlításban szereplő harmadik adatkészletet az „igazolt Genea ektomikorrhiza” adatai jelentették, vagyis a molekuláris vizsgálatok alapján a Genea-kládba került ektomikorrhizának az adatai. 8. táblázat. A morfometriai összevetések eredménye. A táblázat egyes cellái a sor elején és az oszlop tetején jelzett adatkészletek statisztikai összehasonlításainak eredményeit tartalmazzák. A cellák azoknak a karaktereknek a sorszámait tartalmazzák, melyekre vonatkozóan a Welch-teszt szignifikáns különbséget mutatott ki (p=0,05). (A sorszámok jelentését l. az Anyag és módszer fejezetben – 52. oldal!)

ΣHumaria ΣHumaria

„Eredeti Genea EM” 1, 2, 3, 5, 6, 7, 9

„Eredeti Genea EM” „Igazolt Genea EM”

„Igazolt Genea EM” 1, 2, 3, 4 1, 2, 3, 4

Az összes mérhető és értékelhető karakter esetében (négy karakter) szignifikáns különbséget mutatott ki a statisztikai próba az „igazolt Genea EM” és mind a teljes Humariaadatkészlet (ΣHumaria), mind pedig az „eredeti Genea EM” között. Ezzel szemben három karakter esetében (az értékelhető karakterek 30%-ában) nem lehetett szignifikáns különbséget kimutatni a teljes Humaria-adatkészlet és az „eredeti Genea EM” között (ezek a külső köpenyréteg sejtjeinek „izodiametrikussága”, a kiágazó hifák távoli szakaszain mérhető sejtfalvastagság és a kiágazó hifák szeptumtávolsága voltak). A statisztikai összevetések eredményeit a 8. táblázat és a 10. ábra foglalja össze.

66

”Eredeti Genea ektomikorrhiza” 70% „ΣHumaria” (teljes Humaria-adatkészlet)

100% 100%

”Igazolt Genea ektomikorrhiza”

10. ábra. A morfometriai összevetések eredménye. A nyilakra írt százalékok mutatják, hogy az adtakészletek közt statisztikailag összehasonlítható karakterek hányad részében igazolt szignifikáns különbséget a Welch-teszt.

IV. 1.4. Értékelés Mindhárom mintaterületen rendszeresen találtunk olyan ektomikorrhizákat, melyek anatómiája hasonlít a Genea és Humaria nemzetségek irodalomban szereplő leírásaihoz. Hasonlóan Smith és mts. (2006) megfigyeléseihez, egyes hazai tölgyesekben gyűjtött talajminták nagy gyakoriságban tartalmazták azokat, de az üdébb bükkösben is tapasztaltuk nagy abundanciájukat. Az ITS-régió molekuláris filogenetikai vizsgálata igazolta, hogy 12 minta a Humaria, egy pedig a Genea nemzetségbe sorolható. Az előbbi következtetést megerősíti az SSU-régió vizsgálata is: az ITS-analízis során Humariaként azonosítható minták szekvenciái is ebbe a nemzetségbe tagozódtak be. A herbáriumi termőtestek és a molekuláris adatbázisokból letöltött szekvenciák segítségével az ektomikorrhizák mikobiontáinak faji hovatartozására is következtethetünk. Az ITS-fákon 12 Humaria- ektomikorrhiza a H. hemisphaerica faj szekvenciáival alkot közös kládokat, míg az SSU-vizsgálatba egy korábban H. rutilansként azonosított termőtest szekvenciája is bekerül (ebből a mintából sajnos ITS-szekvenciát nem tudtunk kinyerni). Az ITS-fák statisztikailag erősen támogatott eredményei alapján azonban az előbbi meghatározást tekinthetjük biztosnak. A H. rutilans minta bekerülése a közös kládba magyarázható akár a termőtest korábbi téves meghatározásával is, de a különbséget az is okozhatta, hogy az SSU-szekvenciák között lényegesen kisebb különbség van, mint az ITSszekvenciák közt. A Genea nemzetségbe tagozódó HU 652 jelzésű minta szekvenciájához legközelebb egy G. verrucosa termőtestből származó szekvencia került valamennyi törzsfán. A faji azonosságot azonban biztosan nem jelenthetjük ki ennek ellenére sem, mivel a törzsfákon 67

még az egyazon Genea fajokból nyert szekvenciák sem alkotnak sok esetben közös kládokat, ami a fajhatárok bizonytalanságára (valamint fajmeghatározási problémákra) utal a nemzetségen belül. (Ennek taxonómiai és termőtest-anatómiai értékelése meghaladná a dolgozat kereteit.) Az azonban kétségtelen, hogy a HU 652 EM mikobiontája a Genea nemzetség tagja. A vizsgált 13 EM egyes általános jellemzői (a világos sárga – sárgás barna pigmentáció, a vastag falú, szemölcsös kiágazó hifák) megegyeznek az E-törzsek képviselőinek ektomikorrhizáival (Danielson 1982, 1984a, Egger és Paden 1986, Scales és Peterson 1991a, b), és a korábban a Humaria (Ingleby és mts. 1990) vagy a Genea nemzetségek (Brand 1991, Jakucs és mts. 1998) képviselőiként azonosított mikobionták ektomikorrhizáival. A Wilcoxina (Scales és Peterson 1991a, b, Tedersoo és mts. 2006a) és egyéb E-törzs fajok ektomikorrhizáitól megkülönbözteti e mikorrhizákat az, hogy az idősebb mikorrhiza-részeket is mindig összefüggő és több rétegű gombaköpeny borítja. További különbség a szabályosan anguláris külső köpenyréteg is, mivel az E-törzsek (Danielson 1984a, Ingleby és mts. 1990, Scales és Peterson 1991a, b, Fujimura és mts. 2005) és a korábban Humaria-nak vélt ektomikorrhizák külső köpenyrétege plektenchimatikus, vagy plektenchimatikus-epidermoid átmenetet mutat. Összefoglalva tehát: a munkánk során molekuláris módszerekkel H. hemisphaericaként ill. egy Genea fajként meghatározott mikobionták ektomikorrhizáinak köpenyét vastag falú anguláris sejtek alkotják – hasonlóan Tedersoo és mts. leírásaihoz (2006a, b). Ez az anatómia nem egyezik az irodalomban szereplő H. hemisphaerica alkotta ektomikorrhiza leírásával (Ingleby és mts. 1990), ám nagyon hasonló a Genea nemzetség ektomikorrhizáihoz (Brand 1991, Jakucs és mts. 1998). Az

ektomikorrhizák

anatómiai

hasonlósága

feltehetőleg

apomorf

bélyege

a

testvércsoporti helyzetben levő két nemzetségnek. Agerer (2006) feltételezi, hogy a Pyronemetaceae családon belül a hipogéikus termőtest és a pszeudoparenchimatikus ektomikorrhiza-köpeny két párhuzamosan kialakult, levezetett bélyeg. Amennyiben elfogadjuk, hogy mindkét jelleg apomorf állapotot képvisel a családban, akkor – mivel a Humaria és a Genea nemzetségek tesvtvércsoportjai egymásnak – feltehetően először a pszeudoparenchimatikus köpenyszerkezet jelent meg az evolúció során, s csak ezt követte a termőtest hipogéikussá válása. A hipogéikus és epigéikus termőtesttel rendelkező, közeli rokonságban álló nemzetségek ektomikorrhizáinak anatómiai hasonlósága nem egyedi jelenség. A hipogéikus Arcangeliella 68

borziana (Egli és mts. 2001) ektomikorrhizája szinte teljesen megegyezik egyes filogenetikai értelemben igen közeli epigéikus Lactarius-fajok ektomikorrhizáival (Brand és Agerer 1986, Brand 1991). A Humaria és a Genea ektomikorrhizák kvalitatív morfológiai és anatómiai jellemzői az eddig összefoglaltak alapján teljesen megegyeznek. A mérhető paraméterek statisztikai értékelésével kvantitatív különbségeket igyekeztünk találni a molekuláris módszerekkel igazoltan Humaria-ektomikorrhizának bizonyult minták, az „igazolt Genea ektomikorrhiza” és az „eredeti Genea ektomikorrhiza” között. Valamennyi mért (ill. statisztikailag értékelhető) paraméter esetében szignifikáns különbséget találtunk az „igazolt Genea ektomikorrhiza” (BP98701) és mind az „eredeti Genea ektomikorrhiza” (BP92140), mind pedig az összes mért Humaria-ektomikorrhizákból képzett adatcsoport (ΣHumaria) közt. Ez alapján tehát elmondhatjuk, hogy morfometriai különbséget tudtunk kimutatni az igazoltan Genea ill. Humaria kialakította ektomikorrhizák között. Ezzel szemben azonban a teljes Humaria adatkészlet és az „eredeti Genea ektomikorrhiza” mért adatai között három értékelhető paraméter esetében sem mutattak ki szignifikáns különbséget statisztikai számításaink, ami megkérdőjelezi az eredetileg részletesen jellemzett EM mikobiontájának pontos faji meghatározását (ami egy G. verrucosa termőtest fizikai közelségén alapult – Jakucs és mts. 1998). Mindazonáltal a Humaria-minták mért adatainak tág intervallumai miatt (l. a Fügelék megfelelő táblázatát) egyértelműen azt sem jelenthetjük ki, hogy a korábban G. verrucosa-ként jellemzett ektomikorrhizát egy Humaria faj hozta volna létre. Eredményeink tükrében az irodalomban szereplő részletes ektomikorrhiza-leírások mind a Humaria, mind a Genea nemzetségek esetében kérdésessé válnak. Az Ingleby és mts. (1990) bemutatta H. hemisphaerica ektomikorrhizát valószínűleg egy másik gomba hozta létre. A mikorrhizát jellemző nem összefüggő, plektenchimatikus köpeny miatt nagy valószínűséggel egy Wilcoxina faj ektomikorrhizájáról készült a leírás, mivel ez utóbbi nemzetség éppen ilyen EM-kat képez (Scales és Peterson 1991b). Ezt a feltételezést erősítik Rudawska és mts. (2006) eredményei is. Vizsgálataik során lucfenyves telepítésekben megtalálták az Ingleby-féle Humaria-leírással egyező ektomikorrhizákat, azonban nem tapasztaltak molekuláris egyezést az ektomikorrhizákból és a szintén a területen fellelt Humaria-termőtestekből származó szekvenciák között (Rudawska és mts. 2006). Hasonló bizonytalanságra következtethetünk az irodalomban részletesen jellemzett Genea ektomikorrhizák mikobiontáinak (Brand 1991, Jakucs és mts. 1998) meghatározása 69

kapcsán is: egyikről sem dönthetjük el biztosan, hogy Genea vagy esetleg Humaria fajok mikorrhizái-e. Brand (1991) a meghatározást egy G. hispidula termőtest és az EM között levő hifakapcsolat végigkövetése révén végezte. Jakucs és mts. (1998) a Brand leírásához hasonló anatómia, és az ektomikorrhiza közelében talált G. verrucosa termőtest miatt vélték e faj mikorrhizájának mintájukat. Bár korábban mindkét módszer elfogadott volt a mikobionta meghatározására, mivel számos esetben kiderült pontatlansága, ma már nem tartják egyiket sem e célra megfelelőnek. Az irodalomban szereplő EM-leírások bizonytalansága miatt az összes olyan EMközösségekre irányuló vizsgálat eredményeit át kell gondolnunk, melyek ezeket a leírásokat használják az ektomikorrhizák meghatározására (Boxmann és mts. 1998, Brandrud és Timmermann 1998, Ingleby és mts. 1998, Fay és Mitchell 1999, Richard és mts. 2004, Rumberger és mts. 2004). A nemzetség jelenlétét egy adott élőhelyen csak azon vizsgálatokban vehetjük igazoltnak, ha az termőtestek begyűjtésén alapszik (Sesli 1998, Salerni és mts. 2001, Izzo és mts. 2005b), vagy a mikobiontát molekuláris módszerrel is meghatározták (Smith és mts. 2006, Tedersoo és mts. 2006a,b, Mosca és mts. 2007). Azoknak az eredményeknek egy részét is újra kell értékelnünk, melyekben a faji azonosítás a morfotipizálás és molekuláris azonosítás optimális kombinációján (Horton és Bruns 2001) alapszik. Ekkor előfordul ugyanis, hogy egyes mikorrhizákat a karakterisztikus bélyegek alapján egyértelműen Genea-ektomikorrhizaként azonosítanak, s nem is vonják be a további molekuláris vizsgálatokba. Mosca és mts. (2007) például egy kocsányos tölgyes ektomikorrhiza-közösségének vizsgálata során pusztán anatómiai bélyegek alapján a Geneamikorrhizákat a közösség tagjaiként említ, pedig munkájuk molekuláris eredményei csak a Humaria nemzetség jelenlétét igazolták a területen. A csoportra vonatkozóan kapott eredményeink jól tükrözik az igényt a molekuláris módszerek elterjedését megelőzően született ektomikorrhiza-leírások átvizsgálására, DNSalapú vizsgálatok fényében történő újra-értelmezésére.

70

IV. 2. A Pachyphloeus-Amylascus leszármazási vonal rokonsági körébe tartozó fajok ektomikorrhizái Összesen tíz olyan ektomikorrhizát találtunk, melyek morfológiája a Tedersoo és mts. (2006a) munkájában a Pachyphloeus-leszármazási vonal képviselői által kialakított ektomikorrhizákhoz

hasonló.

Ezek

minden

esetben

a

mikorrhiza-közösség

minor

komponensei voltak (9. táblázat). Mikroszkópos anatómiai bélyegeik alapján a tíz ektomikorrhizát három morfotípusba (P-Mt 1., P-Mt 2. és P-Mt 3.) soroltuk. A három típus alapvető jellegzetességei megegyeznek, csak kvantitatív tulajdonságaikban különböznek egymástól. Az alábbiakban először az P-Mt 1. típust részletes jellemzése következik, majd a három morfotípus közti konkrét különbségeket vesszük sorra. 9. táblázat. A Pachyphloeus-Amylascus leszármazási vonalhoz tartozó EM-minták gyűjtési adatai. Relatív gyakorisági kategóriák: A minor komponens (<10%), B minor kodomináns komponens (10-50%), C major kodomináns komponens (50-90%), D domináns komponens (>90%). Mintaszám P-Mt 1

P-Mt 2

P-Mt 3

HU 348 HU 638 HU 787 HU 311 HU 331 HU 340 HU 341 HU 373 HU 647 HU 552

Herbáriumi azonosító BP 99792 BP 99793 BP 99794 BP 99795 BP 99796 BP 99797 BP 99798 BP 99799 BP 99800 BP 99801

A gyűjtés időpontja 2003.04.18. 2006.10.23. 2007.10.10. 2002.05.01. 2002.11.01. 2002.11.01. 2002.11.01. 2003.04.18. 2006.10.23. 2005.10.23.

Relatív gyakoriság A A A B B D C A B A

GenBank azonosító ITS LSU FJ025874 FJ025863 FJ025868 FJ025857 FJ025875 FJ025865 FJ025870 FJ025859 FJ025871 FJ025860 FJ025872 FJ025861 FJ025873 FJ025862 FJ025867 FJ025866 FJ025869 FJ025858 – FJ025864

IV. 2.1. A P-Mt 1. ektomikorrhiza részletes morfológiai-anatómiai jellemzése A gazdagon elágazó, monopodiális-piramidális elágazásrendszerű mikorrhizák rövid, vaskos végei fehéres sárgák, okker vagy világosbarna színűek. A mikorrhizák felszíne fehér vagy barna, kanyargós kiágazó hifáktól sűrűn gyapjas. A pszeudoparenchimatikus köpeny szabályosan anguláris, kissé zselatinizált falú sejtekből áll, felszínét hifahálózat borítja. A belsőbb köpenyrétegek is anguláris szerkezetűek. A kiágazó hifák nem csatosak, sűrűn szeptáltak, színtelenek vagy barnák. Az átmérőjük nem állandó, a szeptumok közelében kissé befűzöttek.

71

Morfológiai jellemzők (11/a ábra) Az ektomikorrhiza-rendszerek sűrűk, gazdagon, monopodiálisan-piramidálisan elágazók. A főágak 4-5 mm hosszúak, átmérőjük 0,4 mm, egyenes vagy kissé hajlott lefutásúak. Az egyes végek hossza 1-2 mm, átmérője 0,2-0,3 mm, hengeresek vagy kissé megvastagodottak („bunkós”). A mikorrhiza színe fehéres sárga, okker és barna között változik, az idősebb részeken sötétbarna. Az ektomikorrhizák felszíne kanyargós, színtelen vagy barna kiágazó hifáktól sűrűn gyapjas. Rhizmorfák nincsenek. A köpeny anatómiai jellemzői Valamennyi köpenyréteg pszeudoparenchimatikus-anguláris szerkezetű (11. ábra, 2. tábla). A külső réteget sűrű, felszíni hifahálózat borítja (11/b ábra, 2. tábla), amit sűrűn szeptált, egyenlőtlen átmérőjű, a szeptumoknál kissé befűzött hifák alkotnak, melyek falvastagsága (0,2) 0,4-0,6 (0,8) μm. A kissé zselatinizált külső köpenyréteg (11/b, e ábra) nagyméretű, anguláris sejtkből áll, melyek a köpeny egyes helyein szabályos, sugárirányban futó sorokba rendeződnek. A sejtek fala és plazmája barna színű vagy színtelen. A sejtek felszíne finoman szemcsézett, s egyes sejtek lipidcseppeket tartalmaznak. A sejtfalvastagság (0,5) 0,6-1 (1,8) μm. Egy 20 μm élhosszúságú négyzetben 9-11 sejt található. A középső köpenyréteg szintén pszeudoparenchimatikus-anguláris szerkezetű, de sejtjei többnyire színtelenek, sima felszínűek, s faluk vékonyabb (0,5-0,6 μm). A belső köpenyréteg (11/d ábra) pszeudoparenchimatikus-anguláris, a sejtjei színtelenek vagy sárgásak, szemcsés felszínűek, sejtfaluk 0,5-0,8 μm vastag. Az ektomikorrhiza csúcsán a köpenyszerekezet a mikorrhiza többi részével megegyező. A kiágazó elemek anatómiai jellemzői A sűrűn szeptált kiágazó hifákon csatképletek nincsenek, átmérőjük egyenetlen, apikális végük kissé duzzadt (11/f ábra, 2. tábla). A hifák színtelenek vagy világos barnák, gazdagon elágazók. Az elágazások merőlegesek vagy Y-alakúak. A szeptumok távolsága 25-45 μm. A hifák sima felszínűek, egyes szakaszokon lipidcseppeket tartalmaznak, és szeptumos anasztomózisok is megfigyelhetők köztük. A mikorrhizákból kétféle anatómiájú hifa ágazik ki: az egyik típus finomabb, vékony falú, sokszor összeeső, hengeres, világos barna színű, a másik sokkal merevebb, vastag falú hifa színtelen, a szeptumok közti szakaszokon kissé duzzadt, a szeptumoknál befűzött. A két típus közt átmenetek vannak. A vékonyabb hifa

72

11. ábra. A Pachyphloeus – Mt 1. morfológiája és anatómiája. Az EM habitusa (a), a pszeudoparenchimatikus-anguláris szerkezetű külső köpenyréteg (b, e) és a belső köpeny szerkezete (d), a felszíni hifahálózat (b), a cisztídium-szerű rövid hifák (c) és a kiágazó hifák (f). A nyilak a szeptumoknál befűzött hifákra mutatnak (Jakucs Erzsébet mikroszkópi rajzai).

átmérője 3-5, a vastagabb típus 5-8 μm. A hifák sejtfalvastagsága (0,3) 0,4-0,6 (0,8) μm. A merevebb hifák sejtfala a csúcsi részeken jelentősen megvastagodhat (1-1,2 μm). Cisztídiumok nincsenek, csak cisztídium-szerű, rövid kiágazó hifák (11/c ábra). Rhizmorfák nincsenek. IV. 2.2. A három ektomikorrhiza-morfotípus közti különbségek A közös kvalitatív morfológiai és mikroszkópos anatómiai jellemzők ellenére a három morfotípus között különbségek vannak a pigmentációban, a felszíni hifahálózat szerkezetében és a sejtfalvastagság értékeiben (l. 10. táblázatot). A P-Mt 1. ektomikorrhizái sötétebb, barnább árnyalatúak a másik két morfotípusnál: a P-Mt 2. sárga vagy világos barna, a P-Mt 3. fehéres sárga színű. A P-Mt 1. és a P-Mt 2. köpenyét borító hifahálózat sűrűn szeptált, vaskos hifákból áll, míg a P-Mt 3. felszínén lazán kapcsolódó globuláris sejtek hálózata látható (2. tábla/b,e,h). A három morfotípus esetében mind a köpenyt alkotó sejtek, mind a hifahálózat, mind pedig a kiágazó hifák sejtfalainak vastagsága különböző (10. táblázat, 2. tábla). A P73

Mt 2. esetében a köpenysejtek és a felszíni hálózat hifáinak sejtfalai zselatinizáltabbak és jelentősen vastagabbak, mint a másik két morfotípusé, és ebben az esetben figyelhetők meg elsősorban a kiágazó hifák végein is a sejtfal-megvastagodások. 10. táblázat. A Pachyphloeus-Amylascus leszármazási vonalhoz tartozó három ektomikorrhizamorfotípus összehasonlítása.

Morfotípus

P-Mt 1. P-Mt 2. P-Mt 3.

A köpenysejtek színe

A sejtfal és a plazma világosbarna (vagy színtelen) Elsősorban színtelen (vagy a sejtfal világos barna) Színtelen

A külső köpenyréteg sejtjeinek falvastagsága (μm)

A felszíni hálózat falvastagsága (μm)

A kiágazó hifák falvastagsága (μm)

A felszíni hálózat hifáinak átmérője (μm)

A felszíni hálózat hifáinak szeptumtávols ága (μm)

(0,5) 0,6-1 (1,8)

(0,2) 0,4-0,6 (0,8)

(0,3) 0,4-0,6 (0,8)

(4) 5-8 (12)

(4) 10-15 (30)

(0,6) 1-1,5 (2)

(0,5) 0,8-1,2 (2)

0,6-0,8 (1,2)

(4) 6-8 (10)

(8) 15-20 (32)

0,6-0,8 (1)

0,6-0,8 (1,2)

0,6-0,8

(7) 12-14 (15)

(8) 12-16 (20)

IV. 2.3. Filogenetikai kapcsolatok Kilenc minta esetében tudtuk az ITS-régió és tíz minta esetében riboszomális nagy alegység rRNS génjének (LSU) szekvenciáját meghatározni. A részletes filogenetikai analízist megelőzően több, a Pezizales rendbe tartozó nemzetség képviselőinek szekvenciáit lefedő, átfogó elemzésekkel vizsgáltuk ektomikorrhiza-mintáink rendszertani hovatartozását. Minden esetben a Pachyphloeus-Scabropezia-Glishroderma-Amylascus leszármazási vonallal közös, statisztikailag is megerősített kládba tagozódtak be a szekvenciák. Az itt részletezett vizsgálatok ezért már csak ennek a rendszertani csoportnak a képviselőire terjednek ki. A különböző rekonstrukciós módszerekkel felépített ITS-alapú törzsfák topológiája megegyezik, csak az egyes kládok statisztikai támogatottsága különbözik (12. ábra). Valamennyi mikorrhizából származó szekvenica a Pachyphloeus nemzetség képviselőinek szekvenciái közé tagozódott. A 1. és a 2. morfotípushoz (P-Mt 1. és P-Mt 2.) tartozó ektomikorrhizák mikobiontái az anatómiai hasonlóságoknak megfelelően két különböző, statisztikailag erősen (85% feletti bootstrap- ill. posterior valószínűségi értékekkel) támogatott csoportban jelennek meg. A P-Mt 1 egy Quercus garryana erdőben talált termőtestből származó szekvenciával alkot közös, statisztikailag is támogatott kládot (AY920528 – a GenBank-leírás alapján Frank eddig nem publikált szekvenciája). A P-Mt 1 szekvenciák átlagos különbsége az AY920528 szekvenciától 14,3%. A P-Mt 2-hoz tartozó

74

Tirmania nivea (AF276668)

100/100 -/0.96

100/100 96/0.99

100/100 100/1.00

100/100 98/1.00

100/100 96/0.99

Peziza ellipsospora (AY830851) HU 348 (BP99792)

HU 638 (BP99793) Pachyphyloeus sp. (AY920528)

100/100 98/1.00

Pachyphyloeus austro-oregonensis (AY830854) Azonosítatla ektomikorrhiza (EF417801)

HU 341 (BP99798) HU 340 (BP99797) HU 373 (BP99799) HU 311 (BP99795)

100/100 85/0.90

1. morfotípus (P-Mt 1)

HU 787 (BP99794)

2. morfotípus (P-Mt 2)

HU 647 (BP99800)

NJ / MP

HU 331 (BP99796)

ML / Bayes

Pachyphyloeus sp. (EU427549)

100/100 98/1.00

Pachyphyloeus sp. (EU427551)

0.1

12. ábra. A Pachyphloeus-Amylascus leszármazási vonalhoz tartozó ektomikorrhizák mikobiontáinak filogenetikai helyzetét bemutató, az ITS-régió szekvenciája alapján konstruált, Bayes-analízissel készült fa. Az egyes ágak felett balra a NJ-elemzéshez, jobbra a MP-elemzéshez tartozó bootstrap-értékek, az ágak alatt balra a ML-analízis bootstrap értékei, jobbra a Bayes-analízis során kapott posterior valószínűségi értékek szerepelnek. (A túl rövid ágak esetén a statisztikai értékeket egy vízszintes vonal fölött ill. alatt tüntettük fel, nyíllal jelölve, hogy mely elágazási pontokhoz tartoznak.) Pirossal jelöltük a mintaterületen gyűjtött ektomikorrhizákból származó szekvenciákat. A GenBank-ből származó szekvenciák azonosító számait zárójelben adtuk meg. A kapcsos zárójelek az egyes morfotípusokhoz tartozó szekvenciákat foglalják egybe (részletesen l. a szövegben). (Csak az 50% ill. 0,5 feletti statisztikai értékeit adtuk meg; a mérce 100 bázispárra jutó 10 változásnak megfelelő ághosszat jelöl.)

szekvenciák Healy és mts. (2009) P. marronius termőtestekből nyert szekvenciáival csoportosulnak. Az utóbbi két szekvencia átlagos különbsége a P-Mt 2. képviselőinek szekvenciáitól 7,8%. A négy különböző módszerrel készített, LSU-szekvenciákon alapuló fákon a három morfotípus képviselőinek szekvenciái három különböző, statisztikailag jól támogatott csoportban jelennek meg. (13. ábra) Az első morfotípus (P-Mt 1.) két molekuláris adatbázisból származó P. cf. melanoxanthus termőtest szekvenciájával (Healy és mts. 2009 – herbáriumi azonosító számok: RH195, RH735) alkot közös csoportot. A szekvenciák átlagos különbsége a P-Mt 1. csoport tagjai, valamint a P. cf. melanoxanthus szekvenciák közt 2,86%.

75

Tirmania nivea (AF335177)

NJ / MP

Peziza ellipsospora (AF335139) Peziza limnaea (AF335147) HU 348 (BP99792) 99/100 100/1.00 HU 638 (BP99793)

64/99 73/1.00

ML / Bayes 1. morfotípus (P-Mt 1)

HU 787 (BP99794) Pachyphloeus melanoxanthus (RH195 IA)

88/98 65/0.99

Pachyphloeus cf. melanoxanthus (RH735 IA) Scabropezia flavovirens (AY500556) Scabropezia scabrosa (AF133173)

99/95 99/1.00

Pachyphloeus virescens (DQ191672) Pachyphloeus citrinus (JRWL2497 Italy) Azonosítatlan ektomikorrhiza (AJ893242)

96/77/0.98

Pachyphloeus virescens (RH279 IA)

-/93 -/0.79

Pachyphloeus thysellii (JT13182 WA)

93/92/-

Azonosítatlan ektomikorrhiza (AJ893241)

99/94 98/1.00 55/67/1.00

Azonosítatlan ektomikorrhiza (AJ969437) Glischroderma sp. (AF133160)

Pachyphloeus cf. citrinus (DQ191673) Pachyphloeus cf. carneus (RH201 A) Pachyphloeus cf. carneus (RH572 IA) Pachyphloeus cf. carneus (RH756 IA) Pachyphloeus cf. carneus (RH525 IA)

53/57

Pachyphloeus cf .carneus (RH518 IA)

75/0.94

Pachyphloeus citrinus (AY500544)

55/63

Pachyphloeus cf. carneus (AY500)

Pachyphloeus cf. carneus (JT12818 CA)

84/0.96

Pachyphloeus tessalatus (JT11019) Pachyphloeus cf. carneus (RH725 IA)

74/63/1.00

Pachyphloeus cf. carneus (RH800 IA) Pachyphloeus cf. carneus (RH12 IA) Pachyphloeus melanoxanthus (MM1860 Italy) HU 340 (BP99797) HU 331 (BP99796)

88/95

HU 647 (BP99800)

83/1.00 94/91 88/0.84

HU 373 (BP99799)

99/98 97/1.00

2. morfotípus (P-Mt 2)

HU 311 (BP99795) HU 341 (BP99798) Pachyphloeus maroninus (JT32454 Mexico) Pachyphloeus maroninus (RH299 IA)

92/92 66/1.00

Pachyphloeus sp. (EU427550) Pachyphloeus maroninus (JT3757 Mexico)

88/84 70/0.88

Pachyphloeus maroninus (RH286 IA) Amylascus tasmanicus (AF335113) Azonosítatlan ektomikorrhiza (AJ969438) 100/100/1.00 HU 552 (BP99801) 3. morfotípus (P-Mt 1) Pachyella.clypeata (RH91805 IA)

0.02

13. ábra. A Pachyphloeus-Amylascus leszármazási vonalhoz tartozó ektomikorrhizák mikobiontáinak filogenetikai helyzetét bemutató, az LSU-régió szekvenciája alapján konstruált NJ-fa. Az egyes ágak felett balra a NJ-elemzéshez, jobbra a MP-elemzéshez tartozó bootstrap-értékek, az ágak alatt balra a ML-analízis bootstrap értékei, jobbra a Bayes-analízis során kapott posterior valószínűségi értékek szerepelnek. (A túl rövid ágak esetén a statisztikai értékeket egy vízszintes vonal fölött ill. alatt tüntettük fel, nyíllal jelölve, hogy mely elágazási pontokhoz tartoznak.) Pirossal jelöltük a mintaterületen gyűjtött ektomikorrhizákból származó szekvenciákat, a vastaggal szedett szekvenciákat Healy és mts. bocsátották rendelkezésünkre az elemzéshez (publikálva: Healy és mts. 2009). A GenBank-ből származó szekvenciák azonosító számait zárójelben adtuk meg. A kapcsos zárójelek az egyes morfotípusokhoz tartozó szekvenciákat foglalják egybe (részletesen l. a szövegben). (Csak az 50% ill. 0,5 feletti statisztikai értékeit adtuk meg; a mérce 100 bázispárra jutó 2 szubsztitúciónak megfelelő ághosszat jelöl.) 76

A P-Mt 2. szekvenciái egy különálló, magas statisztikai támogatottsággal rendelkező csoportot alkotnak, melyhez legközelebb szintén egy P. melanoxanthus szekvenciája áll (MM1860), szintén Healy és mts. (2009) vizsgálataiból. E szekvencia átlagos különbsége a PMt 2. csoport képviselőitől 0,74%. Filogenetikai értelemben szintén közeli helyzetben áll Healy és mts. (2009) elemzésének P. maronius- ill. P. carneus-kládja, valamint két, jelen elemzésben szintén a P. carneus-kládba tagozódó, molekuláris adatbázisból származó P. citrinus termőtest szekvenciája (DQ191673 – Tedersoo és mts. 2006a, AY500544 – Hansen és mts. 2005). A P. maronius-klád átlagos eltérése P-Mt 2 morfotípus képviselőitől 2,25%, a P. carneus-kládé 2,23%. A harmadik morfotípust képviselő HU 552 (BP99801) mikorrhizából származó szekvencia – a MP elven készült fa kivételével – egy bükkről származó, azonosítatlan ektomikorrhiza mikobiontájának szekvenciájával (AJ969438 – Tedersoo és mts. 2006a) alkot egy külön ágat a törzsfákon, ami a teljes Amylascus-Scabropezia-GlischrodermaPachyphloeus leszármazási vonal testvércsoportja. A két szekvencia közti különbség 3,33%. A MP-fán a P-Mt 3. szekvenciája a leszármazási vonal összes többi képviselője (köztük az AJ969438 jelzésű szekvencia) alkotta csoporton kívül helyezkedik el. IV. 2.4. Értékelés A „Őserdő” területén rendszeresen találtunk a molekuláris vizsgálatok eredményei alapján a Pachyphloeus-Amylascus leszármazási vonalba tartozóként határozható ektomikorrhizákat, ezért feltételezzük, hogy azok állandó tagjai a terület ektomikorrhiza-közösségének. Ez megfelel a korábbi irodalmi forrásoknak, melyek szerint a nemzetség elsősorban a lombhullató erdőkhöz kötődik (Cázares és mts. 1992, Fogel és States 2002, Frank és mts. 2006, Tedersoo és mts. 2006a,b, Healy és mts. 2009). Tedersoo és mts. (2006a) megfigyeléseihez hasonlóan mi is csak kis gyakoriságban találtuk a csoport ektomikorrhizáit. Ők azonban elsősorban az erdők ill. fás kaszálók nyílt területein találták meg e mikorrhizatípust, amiből arra következtettek, hogy a nemzetség ruderális életmenetet mutat (Tedersoo és mts. 2006a). Mi az erdő zárt, idősebb területeiről gyűjtöttük mintáinkat, ezért megfigyeléseink nem erősítik meg az említett szerzők következtetéseit. Az ITS és az LSU régiók molekuláris elemzése alapján a minták három, egymástól jól elkülönülő, magas statisztikai támogatottságú csoportban helyezkednek el, melyek megfelelnek az anatómiai különbségek alapján lehatárolt három morfotípusnak. Kettő ezek 77

közül (P-Mt 1., P-Mt 2.) a Pachyphloeus nemzetség részét képezi a törzsfákon. A P-Mt 1. csoport képviselői Healy és mts. (2009) munkájának P. cf. melanoxanthus-kládjával állnak közeli rokonságban. Bár a nagyfokú hasonlóság és a közös csoport magas statisztikai támogatottsága miatt nagyon valószínű a szekvenciák faji egyezése, mégsem tekinthetjük a PMt 1.-ba tartozó EM-k mikobiontáit faji szinten meghatározottnak, mivel Healy és mts. (2009) eredményeik értékelésekor hangsúlyozzák, hogy a fajmeghatározást csak a termőtest morfológiai és anatómiai bélyegei támasztják alá, molekuláris eredményeik ellentmondanak annak. A P-Mt 2. képviselőinek szekvenciái egy másik, P. melanoxanthus-ként azonosított termőtesttel állnak szoros rokonságban (Healy és mts. 2009), ugyanakkor filogenetikai értelemben igen közel vannak mind a P. maronius-, mind a P. carneus-kládhoz. (Az utóbbi klád részét képezi két, a GenBank-ben P. citrinus-ként azonosított szekvencia is, melynek faji meghatározottságát Healy és mts. (2009) kétségbe vonják.) Részletes morfológiai-anatómiai összevetést ennek a P. melanoxanthus-termőtestnek az esetében nem közölnek a szerzők, mégis nagy valószínűséggel a P-Mt 2 mikorrhizák mikobiontái ehhez a fajhoz tartoznak. A harmadik morfotípus (P-Mt 3.) képviselőjéről csak annyit állíthatunk biztosan a filogenetikai

elemzéseink

alapján,

hogy

az

Amylascus-Scabropezia-Glischroderma-

Pachyphloeus leszármazási vonal testvércsoportja. A hozzáférhető adatok nem teszik lehetővé még a nemzetség szintű azonosítást sem. Legszorosabb rokonságban egy Kjøller által bükkről gyűjtött ektomikorrhiza szekvenciájával áll (Tedersoo et al. 2006a). A tárgyalt leszármazási csoportból Tedersoo és mts. (2006a) két, a P. virescens fajjal közös kládba tartozó ektomikorrhizáról, valamint a mitospórás Glischroderma nemzetség ektomikorrhizájáról ektomikorrhiza

közölnek

hasonlít

a

morfológiai-anatómiai mi

morfotípusainkhoz

jellemzőket.

A

P.

virescens

pszeudoparenchimatikus-anguláris

szerkezetű külső és középső köpenyrétegeiben, azonban mi egy esetben sem figyeltünk meg plektenchimatikus belső réteget. Az általunk leírt ektomikorrhizák felületén minden esetben hifahálózat helyezkedik el, és a köpenyből kétféle kiágazó hifa ered, mely jellemzőkről Tedersoo és mts. (2006a) nem tesznek említést. Annak ellenére, hogy a leírt két mikorrhiza mikobiontái között kisebb filogenetikai távolság volt a P. virescens ektomikorrhizák esetében, mint amit mi tapasztaltunk a három morfotípus között, Tedersoo és mts. (2006a) sokkal nagyobb anatómiai eltéréseket találtak a mintáik közt. Az LSU-alapú törzsfán látható, hogy a P. virescens faj képviselői egy olyan csoportba tartoznak (Healy és mts. (2009) „4. klád”-ja), melyben viszonylag közel egymáshoz több, aszkusz-szerkezetében eltérő faj tartozik, ami 78

alapján feltételezhető a csoport nagyobb evolúciós sebessége a nemzetség egyéb tagjaihoz képest. Ez magyarázhatja az ide tartozó, egymással közeli rokonságban álló mikobionták ektomikorrhizái között megfigyelhető jelentősebb eltérést, de ennek kijelentése több, a kládba tartozó faj mikorrhizájának részletes morfológiai-anatómiai vizsgálatát igényli. Egy-egy leszármazási vonal ektomikorrhizáinak nagyfokú anatómiai hasonlósága nem egyedülálló a tömlősgombák körében. A Humaria és Genea nemzetségek e dolgozatban is tárgyalt ektomikorrhizáinak hasonlósága mellett az egymástól filogenetikailag elkülönülő fehér szarvasgomba-fajok ektomikorrhizáinak jellemző anatómiai bélyegei is megegyeznek (Kovács és Jakucs 2006). IV.3. A területen talált tomentelloid ektomikorrhizák

Mintaterületünkön hat tomentelloid bélyegeket mutató ektomikorrhiza-morfotípust találtunk, melyekről a molekuláris elemzéseink is igazolták, hogy a Tomentella nemzetség tagjai (11. táblázat). A molekuláris adatbázisok – a többi ektomikorrhiza-képző nemzetséghez képest – kiemelkedően sok meghatározott ill. azonosítatlan mintából származó, de a nemzetséghez tartozó szekvenciát tartalmaznak (Ryberg és mts. 2009). Mivel e szekvenciák értékelése nem feladata a disszertációnak, ebben az esetben elsősorban más mintaterületeken gyűjtött, hazai ektomikorrhizákból nyert szekvenciákkal, valamint az adatbázisban szereplő fajok néhány reprezentatív szekvenciájával végeztük el az elemzést. (A „reprezentatív” szekvenciák kiválasztása előzetes filogenetikai elemzések alapján történt. Ennek során az összes, meghatározottnak vélt szekvenciát felhasználva végeztünk filogenetikai rekonstrukciót, s kerestük különböző forrásokból származó, egy fajhoz tartozónak határozott szekvenciák közös kládjait. A végső elemzésbe azokat a szekvenciákat emeltük be, melyek az ilyen „közös” csoportokból származtak). A filogenetikai elemésekbe bevontuk egyéb hazai élőhelyek tomentelloid ektomikorrhizáit is (Jakucs és mts. 2005b). Azadatbázisokból letöltött szekvenciák jellemzőit, valamint az egyéb hazai élőhelyekről származó tomentelloid mikorrhizák gyűjtési adatati a Függelék taralmazza. A többi filogenetikai elemzéshez képest különbség, hogy ebben az esetben gyökértelen fákat konstruáltunk. Ennek az volt az oka, hogy a legközelebbi biztos helyzetű, külcsoportként választható taxonok is olyan távolságban voltak a nemzetség képviselőinek szekvenciáitól, ami nagyon lerontotta az elemzéseink feloldóképességét a Tomentella 79

csoporton belül. Az elemzés eredményeként kapot törzsfák eredményeinek összefoglalását a 14. ábra mutatja. 11. táblázat. A tomentelloid morfotípusok gyűjtési adatai. Relatív gyakorisági kategóriák: A minor komponens (<10%), B minor kodomináns komponens (10-50%), C major kodomináns komponens (50-90%), D domináns komponens (>90%), n.a.: nincs adat. Mintaszám

Lelőhely

Gyűjtés időpontja

Gyakoriság

HU 315

Őserdő

2002.11.01.

A

HU 359

Őserdő

2003.04.18.

C

HU 401

Őserdő

2003.10.21.

B

HU 425

Őserdő

2004.10.14.

B

HU 444

Őserdő

2004.10.14.

B

HU 447

Őserdő

2004.10.14.

A

HU 465

Őserdő

2005.05.19.

B

HU 481

Őserdő

2005.05.19.

A

HU 536

Őserdő

2005.10.23.

A

HU 543

Őserdő

2005.10.23.

A

A különböző módszerekkel végzett filogenetikai rekonstrukciók eredményei ugyanazokat a szekvencia-csoportokat eredményezték a hazai ektomikorrhiza-minták esetében, alapvetően azonos rokonsági kapcsolatokkal. Az ektomikorrhizák mikobiontáinak szekvencia-csoportjai jól korrelálnak a morfológiai-anatómiai bélyegekkel. Ez alapján 15 morfotípust különítettünk el, melyek közül hatnak a képviselőjét találtuk meg az „Őserdő” területén is. A morfotípusok morfológiai és anatómiai bélyegeit a 12. táblázatban foglaltuk össze. A mintaterületen megtalálható hat morfotípus közül kettőnek a mikobiontáját faji szinten is meghatározottnak tekinthetjük (T-Mt 10.: T. stuposa, T-Mt 12.: T. ramosissima), egyet pedig – a nagyobb filogenetikai távolságok, ill. a közeli, ismert szekvenciákkal alkotott csoportjaik alacsony statisztikai támogatottsága miatt – feltételesen meghatározottnak (T-Mt 13.: T. cf. sublilacina). Három morfotípust mikobiontájának faji azonosságáról nem állíthatunk biztosat, meghatározásukhoz további, meghatározott mintákból származó szekvenciákra van szükség. A T. stuposa és T. cf. stuposa morfotípusok anatómiája alapvetően megegyezik, mégis a mikorrhizák színe, a köpenyt alkotó sejtek falvastagsága és a rhizmorfák differenciáltsága

80

12. táblázat. A tomentelloid ektomikorrhiza-morfotípusok morfológiai és anatómiai bélyegei. Szürke háttérrel az „Őserdőben” talált morfotípusok jellemzőit emeltük ki. Köpenyszerkezet Külső réteg Belső réteg

Morfotípus (azonosított faj)

Az EM színe

T – Mt 3. (azonosítatlan)

barnás

Ps (anguláris)

T – Mt 5. (azonosítatlan)

barnás

Ps (anguláris)

T – Mt 10. (T. stuposa)

barnás

T – Mt 11. (azonosítatlan)

sárgás

T – Mt 12. (T. ramosissima)

barnás

T – Mt 13. (T. cf. sublilacina)

barnás

T – Mt 1. (T. galzinii)

sárgás

T – Mt 2. (T. subtestacea)

sárgás

T – Mt 4. (T. ferruginea)

barnás

T – Mt 6. (T. pilosa)

sárgás

T – Mt 7. (azonosítatlan)

barnás

T – Mt 8. (T. cf. bryophila)

barnás

T – Mt 9. (T. cf. stuposa)

barnás

T – Mt 14. (azonosítatlan)

sárgás

T – Mt 15. (azonosítatlan)

barnás

Kiágazó hifák

Rhizomorfák

Cisztídiumok

Egyedi jellemzők

Pl

csatos

+ (A)

-

az anguláris köpenyréteg sejtjei csillag alakban rendeződnek

Pl

csatos

+ (C)

-

csillag alakban rendeződő sejtek, vastag rhizomorfák

Pl

csatos

+ (A)

-

Pl

csatos

-

+

Pl

csatos

-

+

Pl

csatos

-

+

sűrű, háromszögletű sejtekből álló hálózat a köpenyfelszínen

Pl

csatos

+ (A)

+

vastag falú, csatos cisztidiumok

Pl

csatos

+ (C)

+

csatos cisztidiumok, kék pigmenttel

Pl

ritkán csatos

+ (B,C)

(+)

epidermoid középső köpenyréteg

Pl

csatos

+ (C)

+

vékony falú, csatos cisztidiumok

Ps (anguláris)

Pl

nem csatos

-

-

Ps (anguláris)

Pl

csatos

-

+

Pl

csatos

+ (A)

-

gömbsejtek csoportjai a köpenyfelszínen

Pl

csatos

-

-

sűrűn borítják a kiágazó hifák

Pl

csatos

-

-

gömbsejtek csoportja a vastag sejtfalú sejtekből álló köpeny felszínén

Ps (anguláris, gömbsejtekkel) Ps (anguláris, epidermoid) Ps (anguláris) Ps (anguláris, hifahálózattal, epidermoid) Ps (anguláris) Ps (anguláris, hifahálózattal) Ps anguláris, hifahálózattal) Ps (anguláris, hifahálózattal)

Ps (anguláris, gömbsejtekkel) Ps (anguláris, hifahálózattal, epidermoid) Ps (anguláris, gömbsejtekkel)

kék pigmentszemcsék és gömbsejtek a köpenyfelszínen vastag falú, keskeny, hajlott, csat nélküli cisztidiumok vastag falú, barna, csat nélküli cisztidiumok

csillag-alakú pikkelyek a köpenyfelszín, kék pigmenttel egyenes, vastag kiágazó hifák, kifejezett talpsejttel

81

62/87 72/0.95

NJ /

T. terrestris (AF272901) T. terrestris (AF272911)

ML / Bayes

T. badia (AF272937)

96/100 99/1.00

T. atramentaria (AF272904) T. cf. coerulea (AY010274)

-/-/1.00

T. coerulea (AF272934)

84/92 T. viridula (AF 272914) -/63 68/0.96 -/0.81 99/99 T. galzinii (AJ 421255) 57/76 94/1.00 BP92154 (AJ421251) Q 61/0.99 T. subtestacea (AJ 421256) 100/100 75/100/1.00 BP92153 (AJ421250) P 67/1.00

T - Mt 1.: T. galzinii T -Mt 2.: T. subtestacea

T. lapidum (AF272941)

87/71/0.86 97/94/1.00

61/52/0.53

T - Mt 8.: T. cf. bryophila

BP96986 (AY874379) P T. bryophila (AF272940) T. subclavigera (AF272939) T. subclavigera (AY010275) T. fusco-cinerea (AF272942) BP96975 (AY874389) P

100/86 100/1.00

BP96976 (AY874388) P BP96984 (AY874387) P

T. botryoides (AF272912)

BP97487 (AY874385) P

-/59 -/0.77

97/88 95/1.00

98/88 93/0.95

T. punicea (AF272943)

79/83 87/0.99

-/-/0.79

-/-

T - Mt 4.: T. ferruginea

97/- BP96977 (AY874386) P 99/1.00 T. ferruginea (AF272909)

-/-/1.00

-/0.88

T - Mt 7.: nem meghatározott

BP97486 (AY874390) P

98/85 85/0.99

100/96 91/82 100/1.00 97/1.00

BP92148 (AJ421252) P

T - Mt 6.: T. pilosa

T. pilosa (AF272925)

T. atroarenicolor (AJ421254)

68/69 53/0.69

T. umbrinospora (AF272920)

T - Mt 5.: nem meghatározott

HU359

99/99 100/1.00 -/-/0.77

-/-/0.61

BP96972 (AY635169) P BP96981 (AY635175) P

T - Mt 9.: T- cf. stuposa

BP96971 (AY635168) Q

T. stuposa (AF272902) HU 481

81/90/0.99 74/64/1.00

100/100 95/1.00

-/-/0.67

98/89 -/1.00

74/1.00

T - Mt 3.: nem meghatározott

HU 543 HU 465

-/-/0.66

67/-

HU 401

100/100 100/1.00

RA12939

67/72 64/0.54

T - Mt 10.: T. stuposa

T. stuposa (AF272944) T. stuposa (AY010277) T. cinerascens (AF272915)

T. lateritia (AF272926) T. lilacinogrisea (AF272910)

-/-

T. cinerascens (U83483)

-/0.56 100/100 100/100 98/1.00

100/1.00

100/100/1.00

100/100 100/1.00

T. ramosissima (U83480) HU 536

T - Mt 11.: nem meghatározott

H U444 HU 315 T. ellisii (AF272913) HU 194

100/100 BP96982 (AY874384) Q 100/1.00 BP96983 (AY874383) Q 99/84/0.97 99/97/1.00

T - Mt 12.: T. ramosissima

HU 447

T - Mt 14.: nem meghatározott T - Mt 15.: nem meghatározott

HU 425 BP96988 (AY874382) Q BP96989 (AY874381) Q

T - Mt 13.: T. cf. sublilacina

BP96988 (AY874382) Q T. sublilacina (AY010278)

0.05

82

14. ábra. (Előző oldal) A tomentelloid ektomikorrhizák mikobiontáinak rendszertani helyzetét bemutató, Bayes-analízissel készített törzsfa. Az egyes ágak felett balra a NJ-elemzéshez, jobbra a MPelemzéshez tartozó bootstrap-értékek, az ágak alatt balra a ML-analízis bootstrap értékei, jobbra a Bayesanalízis során kapott posterior valószínűségi értékek szerepelnek. (A túl rövid ágak esetén a statisztikai értékeket egy vízszintes vonal fölött ill. alatt tüntettük fel, nyíllal jelölve, hogy mely elágazási pontokhoz tartoznak.) Pirossal jelöltük a mintaterületen gyűjtött ektomikorrhizákból származó szekvenciákat, zölddel az egyéb, hazánk területéről származó ektomikorrhizák szekvenciáit. A függőleges sávok mellett a morfotípusokat tüntettük fel, ezek magyarázatát l. a szövegben (ill. a 12. táblázatban)! A GenBankből származó szekvenciák esetében az azonosító számokat zárójelben adtuk meg. (Csak az 50% ill. 0,5 feletti statisztikai értékeit adtuk meg; a mérce 100 bázispárra jutó 5 szubsztitúciónak megfelelő ághosszat jelöl.)

különbözi köztük, amit magyarázhat akár a különböző gazdanövény, vagy a földrajzi izoláltság is (Jakucs és mts. 2005a). A T. sublilacina (syn. T. albomarginata) ektomikorrhizáit korábban elsősorban tűlevelű erdőkben találták (Gardes és Bruns 1996, Kranabetter és Wylie 1998, Jonsson és mts. 1999, Köljalg és mts. 2000), és a szinonim faj ektomikorrhizájának részletes leírása is Pinus sylvestris gyökeréről gyűjtött mintáról származik (Agerer 1996a, b). Ezért hazai lomberdei (tölgyes ill. bükkös) előfordulásainak kimutatása új eredménynek tekinthető. A T. ramosissima fajnak ektomikorrhizájáját ezidáig részletesen nem írták le. Az azonosítatlan ektomikorrhizák közül a T-Mt 3. ill. T-Mt 5. egy ismert Tomentella fajjal sem alkotnak közös csoportot. Közös jellemzőjük, hogy köpenyük külső, anguláris szerkezetű rétegében a sejtek csillag alakban rendeződnek. (A T-Mt 5. ektomikorrhiza részletes morfológiai-anatómiai jellemzését Jakucs és mts. 2008 ismertetik.) Hasonló szerveződést egy részletesen leírt, azonosított Tomentella ektomikorrhiza esetében sem láthatunk, de megjelenik az azonosítatlan mikobiontájú, tomentelloid “Fagirhiza setifera” (Brand 1991), “Quercirhiza atrata” (Uhl 1988), “Quercirhiza tomentellocystidiata” (Azul és mts. 2006d) és “Quercirhiza stellata” (De Román és mts. 2002b) ektomikorrhizákon. Ezen a négy ektomikorrhizán azonban leíróik nem figyeltek meg rhizomorfákat. A T-Mt 3. ill. a TMt 5. morfotípusok egymástól rhizomorfáik szerkezetében különböznek: a T-Mt 3. esetében a T. galzinii (Jakucs és mts. 1997) ill. T. stuposa (Jakucs és mts. 2005a) fajok ektomikorrhizáihoz hasonló differenciálatlan, míg a T-Mt 5. esetében a T. pilosa (Jakucs és Agerer 1999) vagy T. ferruginea (Raidl 1998, Raidl és Müller 1996) ektomikorrhizához hasonlóan kanyargós marginális hifákat hordozó, differenciált rhizomorfákat figyelhetünk meg. A T-Mt 11. morfotípus sárga színű ektomikorrhizáinak morfológiája a T. galzinii ill. a T. pilosa mikorrhizákra hasonlít, ám míg azoknak jellegzetesen csatos cisztídiumaik vannak (ún. „fibulocisztídiumok”), a T-Mt. 11. cisztídiumai csat nélküliek, hosszúak, ívesen hajlottak. 83

Különbség továbbá a minták közt, hogy a T-Mt. 11. esetében epidermoid felé mutat átmenetet a külső köpenyréteg, ami egy Tomentella-ként azonosított ektomikorrhiza esetében sem figyelhető meg. Hasonló szerkezetet a „Fagirhiza pallida” (Brand 1991) ill. „Piceirhiza cornuta” (Montecchio és Agerer 1997) mikorrhizáin láthatunk. Az előbbi mikorrhiza végei azonban világosabbak, fehéresek, az utóbbira pedig a külső köpenyrétegen futó hifahálózat jelenléte is jellemző, amit viszont mi nem tapasztaltunk. A 14. morfotípus (T-Mt 14.) karakterisztikus jellemzője az anguláris külső köpenyrétegen található

hifahálózat.

Hasonló

köpenyszerkezetet

a

részletesen

leírt

tomentelloid

ektomikorrhizák körében csak a T. ferruginea (Raidl 1998, Raidl és Müller 1996) és T. sublilacina (Agerer 1996a, b) fajok esetében találunk. A T. ferruginea ektomikorrhizáknak azonban a külső köpenyrétegén pikkelyszerűen feltorlódó, elhalt sejtcsoportok találhatók, és differenciált rhizomorfájuk is van, a T. sublilacina mikorrhizáinak felszíne pedig zselatinizált, rhizomorfájuk differenciálatlan. A T-Mt 14. mikorrhiza esetében egyik felszíni jellemzőt sem tapasztaltuk, s rhizomorfákat sem figyeltünk meg. IV. 4. A terület ektomikorrhiza-közösségének további, azonosított komponensei Mintaterületünkön többféle kisebb gyakoriságban előforduló ektomikorrhizát találtunk. Ezek közül 17-nek a molekuláris alapon történő meghatározását és morfológiai-anatómiai vizsgálatát is elvégeztük. A molekuláris azonosítást minden esetben bővebb, több nemzetségre kiterjedő elemzéssel kezdtük, majd a legközelebbi nemzetség ill. leszármazási vonal meghatározását követően szűkítettük az elemzésekben szereplő taxonok körét. A disszertáció már a leszűkített elemzések eredményeit és értékelését tartalmazza. A molekuláris taxonómiai meghatározás alapján a 16 ektomikorrhizát 13 különböző gombafaj hozta létre. A molekuláris módszerekkel is azonosított ektomikorrhizák gyűjtési adatait valamint a mikobionták feltételezhető nemzetségi hovatartozását a 13. táblázatban foglaltuk össze. Az egyes ektomikorrhizák morfológiai és anatómiai jellemzőit vizsgáltuk és dokumentáltuk. Ezek közül az Agerer (2006 – l. bevezető) által rendszertani értelemben legfontosabbnak tartott bélyegeket az 14. táblázatban tekintjük át. Az azonosításhoz végzett filogenetikai rekonstrukciók eredményeit a Függelék tartalmazza.

84

13. táblázat. Az Őserdő EM-közössége DNS-alapon azonosított képviselőinek gyűjtési adatai és a mikobionták feltételezhető nemzetségi hovatartozása. Relatív gyakorisági kategóriák: A minor komponens (<10%), B minor kodomináns komponens (10-50%), C major kodomináns komponens (50-90%), D domináns komponens (>90%). Mintaszám

Határozott nemzetség

Gyűjtés időpontja

HU 349 HU 627 HU 339 HU 345 HU 301 HU 325 HU 355 HU 374 HU 334 HU 351 HU 353 HU 622 HU 639 HU 309 HU 310 HU 485

Clavulina – Mt 1. Clavulina – Mt 2.

2003.04.18. 2006.10.23. 2002.11.01. 2003.04.18. 2002.05.01. 2002.11.01. 2003.04.18. 2003.04.18. 2002.11.02. 2003.04.18. 2003.04.18. 2006.10.23. 2006.10.23. 2002.05.01. 2002.05.01. 2005.05.19.

Entoloma – Mt Inocybe – Mt 1. Inocybe – Mt 2. Inocybe – Mt 3. Inocybe – Mt 4. Sebacina – Mt 1. Sebacina – Mt 2. Sebacina – Mt 3. Tricholoma – Mt 1. Tricholoma – Mt 2. Tuber – Mt

Relatív gyakoriság a talajmintában A B A A A A A A A A A A A A A A

IV. 4.1. Clavulina-ektomikorrhizák Két ektomikorrhiza mikobiontája a molekuláris eredmények alapján a Clavulina nemzetségbe tartozik, bár szekvenciáik a törzsfákon két külön ágon helyezkednek el a nemzetségen belül (Függelék). Az egyik morfotípust (Clavulina – Mt 2.) nagyobb gyakoriságban találtuk talajmintájában. A két mintát alapvetően azonos morfológiai (világos szín, sima felszín, rövid végek) és anatómiai bélyegek (plektenchimatikus ill. átmeneti szerkezetű köpeny, fénytörő cseppek a köpenysejtekben) jellemzik (14. táblázat, 3. tábla/ad), de kiágazó hifákat csak a HU 627 minta (Clavulina – Mt 2.) esetében találtunk. A HU 349 minta (Clavulina – Mt 1.) szekvenciája a teljes Clavulina-csoport testvércsoportjaként jelenik meg, de előzetes elemzéseink igazolták a nemzetséghez tartozását. Ez a szekvencia a Bayes-elemzésben egy Clavulina monodiminutiva termőtestből származó szekvenciával (DQ056365) alkot közös, statisztikailag támogatott ágat (posterior valószínűségi értéke: 0.88). A másik minta (HU 627) mindkét elemzésben egy Pseudotsuga menziesii-ről

származó,

azonosítatlan

ektomikorrhizából

származó

szekvenciához

(EU645631) áll legközelebb, s águk egy másik azonosítatlan, Quercus wislizeni-ről izolált ektomikorrhiza

(EF417811)

és

két,

Clavulina

cristata-ként

azonosított

termőtest

szekvenciáival (EF559274, DQ974710) alkot statisztikailag is támogatott kládot. (A molekuláris adatbázisokból letöltött szekvenciák adatait a Függelék tartalmazza.) 85

A Basidiomycota törzs Cantharelloid kládjába tartozó (Larsson és mts. 2004, Larsson 2007, Matheny és mts. 2007) nemzetség ektomikorrhizáinak jelenlétét molekuláris vizsgálatokkal elsősorban lomberdőkben (tölgyesekben: Buée és mts. 2007, Morris et al. 2008, Mosca és mts. 2007a, Smith és mts. 2007b, Rineau és Garbaye 2009, és bükkösben: Buée és mts. 2005, Rineau és Garbaye 2009) igazolták, aminek megfelel felbukkanásuk a mintaterületen. Emellett megtalálták mikorrhizáikat tűlevelű erdőkben (Jones és mts. 2008), lombelegyes fenyvesekben (Tedersoo és mts. 2003), és városi területek hársfáinak gyökerein is (Timonen és Kauppinen 2008). Clavulina fajok Arctostaphylos uva-ursi-val képzett arbutoid mikorrhizáját is dokumentálták már (Krapata és mts. 2007). A nemzetség termőtesteit megtalálták guayanai Dicymbe-erdőkben (Henkel és mts. 2002, 2005), eukaliptusz-állományokban (Glen és mts. 2001a,b) és letörpült füzek (Salix herbacea, S. repens) állományiban is (Watling 2005), ami valószínűsíti e fajokkal képzett ektomikorrhizáit is. Az irodalomban részletes anatómiai leírás egy Clavulina faj ektomikorrhizájáról sem szerepel. Morfológiai jellemzést három faj (C. cristata – Buée és mts. 2005, C. cinerea – Mosca és mts. 2007a, C. coralloides – Tedersoo és mts. 2003) esetében közölnek a szerzők. Az általunk megfigyelt ektomikorrhizák világos színe és sima felszíne hasonlít az irodalomban szereplő leírásokhoz, de a végek a mi esetünkben nem voltak kanyargósak és színük sem ibolyás árnyalatú, mint a C. coralloides-nél (Tedersoo és mts. 2003), de a C. cinerea-ra jellemző rózsás színárnyalatot és pinnátus elágazási rendszert sem tapasztaltunk (Mosca és mts. 2007a). Anatómiai összevetésre csak a C. cinerea ektomikorrhiza leírása (Mosca és mts. 2007a) alkalmas: ez megfelel a HU 627 mintán dokumentáltaknak. Molekuláris eredményeink tükrében a HU 627 minta (Clavulina – Mt 2.) mikobiontája nagy valószínűséggel C. cristata-ként azonosítható, amit megerősít bükkerdei előfordulása és a mikorrhiza morfológiája is (Buée és mts. 2005). A másik mintáról (HU 349, Clavulina – Mt 1.) nemzetségi hovatartozásán túl pontosabbat nem mondhatunk. IV. 4.2. Entoloma-ektomikorrhizák Két minta (HU 339, HU 345) szekvenciái az Entoloma nemzetség tagjaival alkottak közös csoportot a molekuláris vizsgálatokban. Ezek szekvenciái együtt, nagyon közel jelennek meg a törzsfákon, és a mikorrhizák morfológiája és anatómiája is alapvetően azonos,

86

ezért bizonyosan egy faj képviselőinek tekinthetjük, ezért közös morfotípusként (Entoloma – Mt) jellemezzük őket. A filogenetikai fákon (Függelék) a két minta szekvenciáihoz legközelebb egy azonosítatlan, hibrid Populus faj gyökereiről származó ektomikorrhiza szekvenciája áll (AJ510276).

Testvércsoportjukat

két

Entoloma

sinuatum

termőtestből

(DQ486700,

AJ966745), egy Fagus sylvatica-ról származó, azonosítatlan ektomikorrhizából (AJ938003), egy E. caeruleopolitum (EU784211) és egy E. rhodopolium termőtestből (AB301602) nyert szekvencia alkotja. A nemzetség ektomikorrhizáit molekuláris alapon viszonylag ritkán detektálták közösségi vizsgálatokban, amit alátámaszt az is, hogy elemzésünk során egyáltalán nem találtunk olyan, az Entoloma nemzetségbe tagozódó, publikált szekvenciát, ami ektomikorrhizából származott volna. Bergemann és Garbelotto (2006) cserzőtölgy (Lithocarpus densiflorus) állományban vizsgálta a talajban élő ektomikorrhiza-képző gombaközösség micéliumait, és itt mutattak ki Entoloma-szekvenciát. Ezenkívül hibrid nyár (Populus tremula x tremuloides) gyökerekről (Kaldorf és mts. 2004), valamint anatómiai vizsgálatokkal Salix fajok (Agerer 1997, 1998), Carpinus betulus (Montecchio és mts. 2006) és Rosa gyökereiről (Agerer és Waller 1993a) mutatták ki a nemzetség mikorrhizáit. Az általunk megfigyelt ektomikorrhiza-morfológia (világos, fehéres színű végek, 3. tábla/e-g)

és

anatómia

(plektenchimatikus

köpenyrétegek,

csatos

kiágazó

hifák,

differenciálatlan rizomorfa) megfelel a csoport általános jellemzőinek (Agerer 2006). Sajnos, a legtöbb faj (E. sericeum, E. erophilum, E. clypeatum, E. rhodopolyum) ektomikorrhizajellemzése nem elég részletes az anatómiai összehasonlításhoz (Agerer 1997). Az E. sericeum és az E. sinuatum (Agerer 1997, 1998) Salix fajokkal ill. E. nitidum Carpinus betulus-szal (Montecchio

és

mts.

2006)

alkotott

ektomikorrhizáinak

anatómiai

bélyegei

(plektenchimatikus köpenyrétegek, differenciálatlan, laza, csatos hifákból álló rizomorfák) megegyeznek az Őserdőben talált Entoloma – Mt. jellemzőivel (és egymástól sem megkülönböztethetők), bár mi nem figyeltünk meg a köpenyben hosszú sorokba rendeződő hifákat.

87

14. táblázat. Az ektomikorrhiza-közösség azonosított, kisebb gyakoriságban jelen levő tagjainak morfológiai és anatómiai bélyegei.

Mintaszám

HU 349

HU 627

Határozott nemzetség

Clavulina – Mt 1.

Clavulina – Mt 2.

HU 339 Entoloma – Mt HU 345

HU 301

Inocybe – Mt 1.

Morfológia

Ritkán elágazó, fehéres színű vagy okkeres, sima felszínű végek.

Alig elágazó, fehéres színű, rövid, sima felszínű végek. Monopodiálispiramidális elágazási rendszerű, fehér végek, átlátszó, vékony köpennyel és laza szerkezetű rhizomorfával. Fehér, vékony köpenyű végek, csillogó, szálas rhizomorfával. Monopodiálispiramidális, kékes szürke, fehéres, ritkán barnás árnyalatú, kevéssé elágazó végek. Felszínük sima, néhol kissé vattás; a köpeny hosszan borítja a gyökereket.

Anatómia Köpeny Minden réteg plektenchimatikus, néhol a plektenchimatikus és az epidermoid között mutat átmenetet; a hifák átmérője 5-8 μm, egyes hifatagokban fénytörő cseppek láthatók. Sűrűn plektenchimatikus köpenyrétegek, tele fénytörő cseppekkel; a hifák átmérője a külső rétegben 6-10 μm, befelé haladva egyre kisebb (4-6 μm), a legbelső rétegben már az epidermoid felé mutat átmenetet. A hifafal vastagsága: 0,2-0,4 μm. Csatos hifákból szerveződő plektenchimatikus köpenyrétegek; a hifák átmérője a belső rétegek felé haladva nő (kívül: 4-6 μm, belül 6-10 μm). Csatos hifákból álló plektenchimatikus köpeny (néhol kissé az epidermoid-anguláris felé mutat átmenetet). Igen apró hifákból álló (átmérő: 1-2 μm) szabályosan plektenchimatikus köpenyrétegek, néhol az epidermoid felé mutatnak átmenetet (3-6 μm hosszú sejtekkel). A köpenyt keskeny, kanyargós hifákból szerveződő hifahálózat borítja. A belső rétegekben nagyobb a hifák átmérője. A hifahálózat hifái néhol elemelkednek a köpenytől.

Cisztídiumok

Kiágazó hifák

Rhizomorfa

-

-

-

-

2-4 μm átmérőjű, csatos hifák.

-

-

2-4 μm átmérőjű, csatos hifák.

Csatos hifákból szerveződő, differenciálatlan.

-

-

Csatos hifákból szerveződő, differenciálatlan.

Hosszú, egyenes, vastag falú, merev cisztídiumok.

Vastag (0,8-1 μm), fénytörő falú, kanyargós hifák, átmérőjük 2,5-3 μm; a hifahálózatból erednek.

-

88

HU 325 (nem fotózható)

Inocybe – Mt 2.

HU 355

Inocybe – Mt 3.

HU 374

HU 334

Zselatinizált falú, pszeudoparenchimatikusepidermoid külső köpenyréteg. A belső rétegek plektenchimatikusak. Nagyon keskeny hifákból szerveződő plektenchima (mint a HU 301 esetében), csat nélküli hifákból szerveződő felszíni hálózattal.

L. a hifák lerását!

Csat nélküli, erősen fénytörő falú, egyenes, rövid, cisztídium-szerű hifák.

-

-

-

-

-

Inocybe – Mt 4.

Monopodiálispiramidális, viaszfehér, kissé bunkósan megduzzadt végek.

Plektenchimatikus szerkezetű köpeny, felszínén hifahálózattal (a HU 355-höz hasonló).

-

A sűrűn szeptált hifák vastag fala egyes szakaszokon szemölcsösen mintázott, néhol anasztomózisok is láthatók.

Sebacina – Mt 1.

Monopodiálispiramidális, fehéresokker színű, kihegyesedő végek.

A külső réteg plektenchimatikus, szerkezete néhol az epidermoid felé mutat átmenetez. A külső réteg hifáinak átmérője nagyobb (4-6 μm), belül: 2-3 μm. A belső rétegben a hifák igen vékony falúak (0,1-0,2 μm).

Nagyon kis átmérőjű (11,5 μm), merev, íves lefutású, hifaszerű cisztídiumok. Faluk nagyon vastag (0,4-0,6 μm).

-

-

-

-

HU 351 Sebacina – Mt 2.

HU 353

Monopodiálispiramidális, viaszfehér, hegyes végek. Felszínük sima v. kissé bolyhos. Monopodiálispiramidális, viaszfehér, szinte átlátszó, rövid végek.

Monopodiálispiramidális, világosokker színű, sűrűn vattás, talajszemcsékkel borított végek.

Kis átmérőjű (1-2 μm) hifákból szerveződő plektenchimatikus és epidermoid között átmenetet mutató köpeny. A sejtek vékony falúak. A talajszemcsék sűrűn beborítják.

-

A HU 334 minta cisztídiumaihoz hasonlók, de már jóval hosszabbak (láthatóan azokkal homológok). Átmérőjük 1,5-2,5 μm. Vastag falúak, íves lefutásúak, merevek. Az elágazásoknál kiszélesednek.

Fehéres sárga, egyenes, hegyes végek.

Helyenként csillag alakban rendeződő hifákat is tartalmazó, plektenchimatikus köpeny. A külső réteg az epidermoid felé mutat átmenetet.

-

Vékony, sárgás színű, vastag falú, csat nélküli, ívesen lefutó hifák.

89

HU 622

HU 639

HU 309

HU 310

HU 648

Sebacina – Mt 2.

Monopodiálispiramidális, sárgásvilágos okker színű, fehéren hifapamacsos végek.

Nagyon keskeny (1 μm átmérőjű) hifákból álló, sűrű plektenchima, mely az epidermoid felé mutat átmenetet.

Sebacina – Mt 3.

Dúsan monopodiálispiramidálisan elágazó rendszerek. Színük sárga, a végek fehéren vattás.

Sárga-sárgásbarna, zselatinizált falú plektenchimatikus köpeny, a belső rétegekben örvényszerűen futó hifákkal. A hifák átmérője 2-2,5 μm. A külső réteg szerkezete az epidermoid felé mutat átmenet, a hifák átmérője itt kisebb (1.5-2 μm).

Tricholoma – Mt 1.

Monopodiálispiramidális elágazási rendszerű, fehér, áttetsző, görbült végek, számos szálas fonalból szerveződő rhizomorfával.

Zselatinizált falú, plektenchimatikus köpeny, melybe rengeteg talajszemcse és kristály rakódik. A középső réteg hifái nagyobb átmérőjűek, kanyargósak, bennük színtelen granulumok láthatók.

-

Sűrűn álló, vékony, csat nélküli hifák, derékszögű elágazásokkal.

-

-

Keskeny, vastag falú, csat nélküli hifák. Átmérőjük 2,5-4 μm; faluk vastagabb, mint a másik két sebacinoid morfotípus esetében.

-

-

Tömegesen megjelenő, csatos hifák, átmérőjük 2,5-4,5 μm; néhol Yalakban elágaznak, az oldalágak párhuzamosan futnak tovább.

A kiágazó hifákhoz hasonló, csatos hifákból szerveződő, differenciálatlan rhizomorfák, belsejükben párhuzamosan, egyenesen futó hifákkal. Csatos hifákból szerveződő, differenciálatlan rhizomorfák. A hifák helyenként lilán pigmentált (plazmájuk is). A rhizomorfák az EM-n kívül is nagyon gyakoriak a talajmintában.

-

Tricholoma – Mt 2.

Monopodiálispiramidális, fehéresen ezüstös, lilás árnyalatú végek; lilás árnyalatú, zászló-szerűen eredő, laza szerkezetű rhizomorfák tömegével.

Plektenchimatikus-epidermoid átmeneti szerkezetű köpeny, egyes rétegekben, körkörösen rendeződő hifákkal.

-

A kiágazó hifák köpenyhez közeli szakaszai csat nélküliek, távolabb csatosak. Egyes csatok közepén lyuk van. A hifák átmérője 4,5-6 μm. Rövid hídanasztomózisok és egyes helyeken lila pigmentáltság is megfigyelhető.

Tuber – Mt.

Monopodiálispiramidális, halványsárga, cisztídiumoktól finoman tüskés végek.

A külső rétegben vastag (0,6-1,2 μm), a belsőben vékonyabb (0,2-0,4 μm) falú sejtekből álló pszeudoparenchimatikusepidermoid köpeny.

Tömegesen megjelenő, egyenes, csat nélküli, ár alakú cisztídiumok; a végük gömb alakban végződik.

-

90

Az anatómiai hasonlóságokkal párhuzamosan molekuláris vizsgálataink eredményei is azt igazolják, hogy az Entoloma – Mt. mikobiontái az E. sinuatum rokonsági körébe tartoznak. A közös kládot azonban csak a NJ elemzés esetében támogatja magas statisztikai érték, és az ektomikorrhizaából nyert szekvenciák filogenetikai távolsága az E. sinuatum-étól is igen nagy, így nem azonosíthatjuk a mintákat ezzel a fajjal. Ezzel szemben az biztosnak látszik, hogy az általunk talált ektomikorrhizákat kialakító gomba azonos a Kaldorf és mts. (2004) vizsgálataiban „EM-22” morfotípusként jellemzett mikorrhizával. Ezt alátámasztja mintáink és a publikációban szereplő leírások azonossága is, ám a mikobionta faji szintű meghatározását sajnos mindez nem tesz lehetővé. IV. 4.3. Inocybe-ektomikorrhizák A mintaterületről négy olyan mintát gyűjtöttünk, melyek mikobiontái az Inocybe nemzetség tagjának bizonyultak (HU 301, HU 325, HU355 és HU 374). Mivel a négy minta szekvenciái a törzsfákon távol helyezkednek el, a mikorrhizákat nagy valószínűséggel négy különböző faj hozta létre a gyökereken, ezért négy külön morfotípusként tárgyaljuk őket. Mind a négy ektomikorrhiza világos színű, fehéres, monopodiálisan-piramidálisan elágazó, felszíne sima. A HU 301 és HU 325 ektomikorrhizák felszíne a kiágazó hifáktól kissé bolyhos ill. vattás, a másik kettőé sima. A külső köpenyréteg szerkezete aprósejtes, epidermoid (HU 325), plektenchimatikus (HU 355, HU 374) vagy a kettő közötti átmeneti szerkezetet mutat (HU 301); minden esetben nagyon apró, keskeny hifákból szerveződik. Az egyik minta esetében (HU 325) a hifák fala zselatinizált. Három ektomikorrhiza esetében a köpeny felszínén (HU 301, HU 355, HU 374) hifahálózat található. A belső köpenyrétegek minden esetben plektenchimatikusak. A HU 301 és HU 325 ektomikorrhizák felszínéről vastag, fénytörő falú, csat nélküli kiágazó hifák erednek, melyek lefutása az előbbi minta esetében kanyargós, a HU 325 minta esetében egyenes. Mindkét mintán előfordulnak rövidebb, egyenes, cisztídium-szerű hifák is. Egyéb kiágazó elemet nem találtunk. (A mikorrhizák anatómiáját a 4. tábla a-e felvételei mutatják be.) Bár az ektomikorrhizák anatómiája (köpenyszerkezet) alapvetően megfelel a nemzetségre jellemző általános bélyegeknek (Agerer 2006), a mikorrhizák színe nem barnás, a kiágazó hifák az általunk talált mintákon nem csatosak, és szeptumaik sem sűrűn elhelyezkedők. A molekuláris elemzések tükrében (Függelék) a négy ektomikorrhiza mikobiontája négy különböző faj. A HU 301 mintából nyert szekvencia egy azonosítatlan Inocybe (AM882987) 91

és egy I. glabripes (AM882902) termőtestből valamint egy azonosítatlan ektomikorrhizából származó (EU816645) szekvenciával alkot közös, statisztikailag is megerősített csoportot. A HU 325 minta szekvenciája négy I. petiginosa termőtestből származó (AM882707, AM882708, AJ889956, AM113952) és két azonosítatlan ektomikorrhizából ill. talajból izolált micéliumból származó (AM159586, AM161520) szekvenciával alkot közös kládot, melyhez a Bayes-analízis alapján filogenetikailag igen közel áll egy I. jacobi termőtestből származó (AM882710) szekvencia is. Azok a szekvenciák, melyek esetében ez kideríthető volt, mind bükkösökből származó mintákból származtak. A HU 355 ektomikorrhiza mikobiontája elemzéseink alapján három azonosítatlan ektomikorrhiza (AJ534897, AJ534923, EU816656) és egy I. fuscidula-ként meghatározott termőtest szekvenciájával (AM882935) alkot közös csoportot, melyhez közel áll egy azonosítatlan ektomikorrhiza mikorrhizájából nyert szekvencia (AB218093) is. Az azonosítatlan ektomikorrhizák hárs ill. tölgy gyökereiről származtak. A HU 374 minta két szekvenciával alkot statisztikailag kellően támogatott csoportot: egy I. asterospora-ként meghatározott termőtestből (AM882722) és egy azonosítatlan ektomikorrhizából származó (FM993253) szekvenciával. Inocybe-ektomikorrhizákat lomberdei életközösségekben (Brearley 2006, Hrynkiewicz és mts. 2008, Kjøller 2006, Krapata és mts. 2008, Tedersoo és mts. 2003, 2006b, Timonen és Kauppinen 2008) és tűlevelű erdőkben (Carfrae és mts. 2006, Douglas és mts. 2005, Jones és mts. 2008) egyaránt azonosítottak molekuláris módszerekkel. Emellett kimutatták jelenlétüket az alhavasi ill. sarki párnanövényzet képviselőinek állományaiban (Väre és mts. 1992, Watling 2005) és mixotróf orchideák gyökerein (Leake 2005), de termőtesteiket megtalálták eukaliptusz erdőkben (Glen és mts. 2001a,b) és Arctostaphylos uva-ursi állományaiban is (Krpata és mts. 2007). A nemzetség igen elterjedt ektomikorrhiza-képző csoport. Annak ellenére, hogy kilenc különböző faj ektomikorrhizájának részletes leírása ismert (Agerer 2006), sokáig kevés élőhely molekuláris alapú ektomikorrhiza-közösségi vizsgálata mutatta ki jelenlétüket. Ennek az oka Tedersoo és mts. (2006b) szerint feltehetően az igen változatos anatómiai bélyegek, a variábilis ITS-régió valamint az a tény, hogy kevés pontosan meghatározott Inocybe faj szekvenciája volt hozzáférhető a molekuláris adatbázisokban. Hasonló következtésekre jutottak Ryberg és mts. is (2008), akik azt is megállapították, hogy az adatbázisokban szereplő Inocybe-szekvenciák egy jelentős része rosszul meghatározott termőtestekből származik. Az általunk talált ektomikorrhizák morfológiája és anatómiája megfelel a nemzetségre jellemző általános bélyegeknek (csat nélküli hifákból szerveződő, plektenchimatikus köpeny, 92

rizomorfák hiánya – Agerer 2006), de a kiágazó hifákon a karakterisztikus, nagyméretű csatokat egyik esetben sem tapasztaltuk (egy mintán kiágazó hifákat sem találtunk). Az Inocybe nemzetség ektomikorrhizái – alnemzetségi tagozódásuknak megfelelően – morfológiai-anatómiai alapon két csoportra oszthatók (Beenken és mts. 1996a). Az Inocybe subg. Inocybe csoport tagjait a világos (színtelen), csat nélküli hifákból álló plektenchimatikus köpeny, a rhizomorfák hiánya és csatos kiágazó hifák jellemeznek: I. appendiculata (gazda: Picea abies – Beenken és mts. 1996a), I. obscurobadia (gazda: P. abies – Beenken és mts. 1996b, Beenken 1996a), I. lacera (gazda: Betula pendula – Ingleby és mts. 1990, Populus tremuloides – Cripps 1997a), I. petiginosa (gazda: P. sitchensis – Ingleby és mts. 1990). A később leírt EM-k közül hasonló bélyegekkel jellemezhető az I. avellana Shorea leprosula-ról (Dipterocarpaceae) leírt mikorrhizája (Ingleby 1999). A másik ektomikorrhiza-alakkör a nemzetségen belül az Inocybe subg. Mallocybe csoport tagjaira jellemző: a köpeny sárga színű, plektenchimatikus szerkezetét erősen hajlott, kanyargós hifák alkotják, melyek sűrűn zselatinizált mátrixba ágyazódnak, a kiágazó hifák átmérője nagyobb, faluk vastagabb, mint az előző csoport esetében (Beenken és mts. 1996a). Ide tartozik az I. fuscomarginata Salix fajokkal ill. Populus nigra-val képzett ektomikorrhizája (Beenken és mts. 1996c, Beenken 1996b) és az I. terrigena Pinus sylvestris gyökeréről leírt ektomikorrhizája (Beenken és mts. 1996d, Beenken 1996c). A bélyegek tekintetében átmenetet képvisel a hazánkból leírt I. heimii mikorrhizája (gazda: Fumana procumbens – Magyar és mts. 1999, Jakucs 2002b). A mintaterületen gyűjtött Inocybe morfotípusok jellemzőik alapján egyik alakkörbe sem sorolhatók be egyértelműen. Világos köpenyük az Inocybe subg. Inocybe alakkörben megfigyelhetőhöz hasonló, ám a kiágazó hifák igen vastag, fénytörő falúak (bár nem pigmentáltak – szemben subg. Mallocybe képviselőinek esetében megfigyelhetővel). A második típus (HU 325) esetében a külső köpenyréteg sejtjeinek fala zselatinizált, talajszemcsék ragadtak bele, ami szintén a Mallocybe csoport ektomikorrhizáinak bélyege. Az is különbség az irodalomban szereplő leírásokkal szemben, hogy mi több esetben a köpeny felszínén különálló hifahálózatot is megfigyeltünk (hasonlóan pl. az I. avellana ektomikorrhizájához – Ingleby 1999). Ez talán megfeleltethető a plektenchimatikus köpenyű fajok külső, nagyobb hifaközti állománnyal rendelkező rétegének – ez látszik pl. az I. appendiculata (Beenken és mts. 1996a) vagy az I. obscurobadia (Beenken és mts. 1996b) ektomikorrhizáirólkészült mikroszkópi rajzokon is – de ezt a hifaszövedéket a szerzők minden esetben külső köpenyrétegként határozzák meg.

93

Összefoglalásul elmondhatjuk, hogy bár a molekuláris eredmények alapján a négy morfotípusból három meghatározottnak vehető (Inocybe – Mt 1.: I. asterospora, Inocybe – Mt 2.: I. petiginosa, Inocybe – Mt 4.: I. fuscidula), ezt megerősíteni az ektomikorrhizaanatómia alapján nem tudjuk. Az I. asterospora és I. fuscidula fajoknak ektomikorrhizáját ugyanis eddig nem írták le, az I. petiginosa ektomikorrhizája pedig eltér az általunk megfigyelttől: Ingleby és mts. leírása (1990) zselatinizált mátrixot nem említ a köpenyen, a kiágzó hifák azonban az Inocybe – Mt 2. esetében csatosak. Megjegyzendő mindazonáltal, hogy a Bayes-analízis nem erősíti meg ennek a morfotípusnak az I. petiginosa-val való azonosságát, statisztikailag csak az I. petiginosa-val és I. jacobi-val együtt alkotott közös kládjának létjogosultságát támogatja. A morfológiai-anatómiai bélyegek látszólagos ellentmondásának oka az eredeti I. petiginosa leírásban (Ingleby és mts. 1990) szereplő ektomikorrhiza mikobiontájának téves meghatározása is lehet, mint ahogy az a Humaria hemisphaerica ektomikorrhizájának esetében is kiderült (l. a disszertáció megfelelő fejezetét). A harmadik minta (HU 355) mikobiontáját molekuláris eredményeink alapján – az alacsony statisztikai támogatottság és a nagy filogenetikai távolságok miatt – nem tekinthetjük meghatározottnak. IV. 4.4. Sebacina-ektomikorrhizák A mintaterületen öt olyan ektomikorrhizát találtunk (HU 334, HU 351, HU 353, HU 622, HU 639), melyek a molekuláris vizsgálatok eredményei alapján a Sebacina nemzetség képviselői. Az öt minta szekvenciái három csoportba különülnek a törzsfákon (Függelék), ami alapján feltételezhetjük, hogy az öt ektomikorrhizát három különböző faj hozta létre (Sebacina – Mt 1.: HU 334, Sebacina – Mt 2.: HU 351, HU 353, HU 622, Sebacina – Mt 3.: HU 639). A három ektomikorrhiza-típus morfológiája igen hasonló: elágazásrendszerük monopodiális-piramidális, színük világos, sárgás árnyalatú, a HU 639 minta esetében kissé sötétebb; a HU 334 minta kivételével felszínük kiágazó hifáktól többé-kevésbé vattás/gyapjas. Rizomorfáik nincsenek, és a kiágazó képletek vastag, fénytörő falúak, csat nélküliek. A köpeny szerkezete az összes minta esetében plektenchimatikus (5. tábla), a három morfotípus esetében azonban különbözik a köpenyt alkotó hifák átmérője: a Sebacina – Mt 1. esetében nagyobb, mint a másik két esetben. Mindhárom morfotípus külső köpenyrétege az epidermoid felé mutathat átmenetet; ez a jellemző elsősorban a Sebacina – Mt 2. esetében kifejezett. A HU 351 minta esetében (Sebacina – Mt 1.) a köpenyből vastag falú, ívesen futó cisztídiumok 94

erednek, melyek a másik két morfotípus esetében már korlátlan növekedésűek: valódi kiágazó hifák. Ezeknek a hifáknak az átmérője a Sebacina – Mt 3. esetében jelentősen nagyobb, mint a másik két esetben, és sejtfaluk is vastagabb. Az első morfotípus szekvenciája két, azonosítatlan sebacionoid izolátum szekvenciájával alkot közös csoportot (EU668267, EF619766). A Sebacina – Mt 2. szekvenciái három, lombhullató fajról származó azonosítatlan ektomikorrhiza (AY825519, AB218064, AF509964), ill. egy azonosítatlan orchid mikorrhiza szekvenciájával (AY452676) helyezkednek el egy közös kládban. A kládban szereplő egyik mikorrhiza (AF509964) szerepel Urban és mts. (2003) munkájában is, azonban a törzsfán látható távolság, ill. a már említett filogenetikai rekonstrukciós bizonytalanság miatt a morfotípus mikobiontájának azonossága ezzel a mikorrhizával megkérdőjelezhető. A harmadik morfotípus képviselője négy, különböző fajok gyökereiről gyűjtött ektomikorrhiza mikobiontájának (EU816650, EF417824, AB218113, AY452681) valamint két, Neottia nidus-avis gyökeréből izolált endogén gomba szekvenciájával (AF440656, AF440651) csoportosul. Az Agaricomycetes osztály alapi csoportjai közé tartozó fragmobazídiumos Sebacina nemzetség (Weiss és Oberwinkler 2001, Hibbett 2006, Hibbett és mts. 2007) változatos ökológiai szereppel bír, mely szerepek között – az utóbbi évek eredményei alapján – több különböző

mikorrhiza-típus

kialakítása

is

megemlíthető

(Weiss

és

mts.

2004).

Ektomikorrhizát képeznek számos természetes életközösségben (Selosse és mts. 2002a, Glen és mts. 2002, Urban és mts. 2003, Weiss és mts. 2004, Richard és mts. 2005, Smith és mts. 2007b, Morris és mts. 2008) és in vitro szintetikus rendszerekben (Warcup 1988), de orchideák (Selosse és mts. 2002b, Taylor és mts. 2003, Weiss és mts. 2004), arbutoid fajok (Arbutus unedo – Richard és mts. 2005) és a Pyrolaceae család képviselőinek (Othilia secunda – Zimmer és mts. 2007) gyökereivel is együtt élnek a – molekuláris meghatározás tanúsága szerint – Sebacina-fajok hifái. Az ektomikorrhizák gazdanövényei között Dryas octopetala (Weiss és mts. 2004), F. sylvatica, Coryllus avellana, Carpinus betulus, Tilia cordata (Selosse és mts. 2002, Urban és mts. 2003), Quercus fajok (Richard és mts. 2005, Morris és mts. 2008), Eucalyptus spp. (Glen és mts. 2002), Pseudotsuga menziesii (Dučić és mts. 2009) és Picea abies (Urban és mts. 2003) szerepelnek. A három morfotípus morfológiája és anatómiája egyaránt megfelel az általános „sebacionoid” ektomikorrhiza-jellemzőknek (Urban és mts. 2003, Agerer 2006), bár a Selosse és mts. (2002a) megfigyelte ektomikorrhizák sötétebb színűek. Az Urban és mts. (2003) 95

munkájában részletesen bemutatot két sebacinoid ektomikorrhiza közül az egyik esetében („Tiliaerhiza sebacinoides”) cisztídiumokat is találunk, hasonlóan az azonosítatlan mikobionta képezte „Quercirhiza dendrohyphidiomorpha” Quercus suber-rel alkotott ektomikorrhizájához (Azul és mts. 2006g).

E két ektomikorrhiza köpenyéből azonban

kiágazó hifák erednek, melyeket mi a cisztídiumos Sebacina – Mt 1. esetében nem tapasztaltunk. Selosse és mts. (2002a) ellenben csak kiágazó hifákról írnak. A kiágazó hifák (ill. cisztídiumok) átmérője a mi mintánkban jó elkülönítő bélyege a három morfotípusnak. A hifák átmérője a Sebacina – Mt 1. ill. Sebacina – Mt 2. esetében a „Q. dendrohyphidiomorpha” (Azul és mts. 2006g) kiágazó elemeiéhez hasonlóan kisebb, míg a harmadik morfotípusé a „T. sebacinoides”-ével összemérhető (Urban és mts. 2003). Megjegyzendő ugyanakkor, hogy Urban és mts. (2003) változatos, 1 és 4 μm közti értékeket említenek egy-egy mintán belül is. A kétféle filogenetikai elemzés ebben az esetben nem adta ugyanazt az eredményt. A Sebacina – Mt 1. rokonsági köre megegyezik, de a Sebacina – Mt 3. szekvenciáját valamint a 2. morfotípus egyik szekvenciája a NJ-elemzésben az összes többi szekvencia testvércsoportja. Ez magyarázható a túl közeli rokonsággal (ami torzítja a távolság alapú, algoritmikus NJ módszer eredményét), de a csoportra jellemző tisztázatlan nemzetségi ill. faji kapcsolatokkal is. Az előbbi indokból kifolyólag mi a karakter-alapú, valószínűségi alapon számító Bayes-elemzés eredményét tekintjük ebben az esetben mérvadónak, mindamellett, hogy az értékelésnél egyik morfotípus mikobiontáját sem tekintjük meghatározottnak. Összefoglalásul elmondható, hogy három, molekulárisan elkülöníthető mikobionta kialakította sebacionoid ektomikorrhizát találtunk a területen, melyek között morfológiai és anatómiai különbségek vannak (ám az elkülönítő tulajdonságok igazolásához további mintákra lenne szükség). Kellő számú azonosított szekvencia hiányában pontos faji meghatározást nem tehetünk. IV. 4.5. Tricholoma-ektomikorrhizák Két olyan ektomikorrhizát gyűjtöttünk (HU 309, HU 310) a mintaterületen, melyek mikobiontája Tricholoma fajnak bizonyult a molekuláris elemzések alapján. A két minta szekvenciája távol helyezkedik el a törzsfákon, morfológiájuk ill. anatómiájuk is ennek megfelelően különbözik (Tricholoma – Mt 1., Tricholoma – Mt 2.).

96

A mikorrhizák monopodiális-piramidális elágazási rendszerűek, világos színűek, a HU 310 minta esetében lilás színárnyalattal. A köpenyből mindkét minta esetében laza szerkezetű rhizomorfák erednek. A köpeny szerkezete alapvetően plektenchimatikus, ám az első morfotípusnál a sejtek fala zselatinizált, a mikorrhiza felszínére sok talajszemcse rakódik. A Tricholoma – Mt 2. esetében a köpeny szerkezete az epidermoid felé mutat átmenetet. Mindkét mintán találunk kiágazó elemeket: csatos hifákat és rhizomorfákat. A hifák szerkezete alapvetően megegyezik, de átmérőjük a HU 310 minta (Tricholoma – Mt 2.) esetében jóval nagyobb, és csatokat ezen a mintán csak a köpenytől távoli hifaszakaszokon találunk, a köpenyhez közel egyszerű szeptumok vannak. A rizomorfák mindkét esetben laza szerkezetűek, differenciálatlanok, a Tricholoma – Mt 2. esetében jellemző a lila pigmentanyagok megjelenése a hifák belsejében (a kiágazó hifákban is). (A mikorrhizák anatómiáját a 6. tábla mutatja be.) A molekuláris elemzések során (Függelék) az első Tricholoma morfotípus (HU 309) három T. lascivum termőtestből (EU186279, EU186280, EU186281) és egy F. sylvatica-ról származó azonosítatlan ektomikorrhizából származó szekvenciával (FJ403516) alkot statisztikailag is támogatott kládot. A HU 310 minta szekvenciája T. bufonium-ként (AY462029) ill. T. sulphureum-ként azonosított (AY462036, AY462032, AY462038, AY462035) termőtestekből származó szekvenciákkal tagozódik egy csoportba. A magas statisztikai támogatottsági (bootstrap és posterior valószínűségi) értékek valamint a kis filogenetikai távolság indokolják, hogy a HU 309 minta mikobiontáját T. lascivum-ként, a HU 310 mikobiontáját pedig a T. sulphureum fajcsoport tagjaként azonosítsuk. A széles elterjedésű nemzetség monotropoid (Bidartondo és Bruns 2002) és arbutoid mikorrhizák

(Krpata

és

mts.

2007)

mellett

elsősorban

ektomikorrhizákat

képez.

Mikorrhizáikat molekuláris módszerekkel kimutatták lombos erdők (Lee és mts. 1997, Tedersoo és mts. 2006b, Glen és mts. 2008, Hrynkiewicz és mts. 2008, Krpata és mts. 2008) és tűlevelű erdők (Yamada és mts. 2001b, Burke és mts. 2005, Douglas és mts. 2005, Jones és mts. 2008, Dučić és mts. 2009, Kjøller és Clemmensen 2009) ektomikorrhiza-közösségeiből is. A nemzetség számos fajának ektomikorrhizájáról részletes leírás is szerepel az irodalomban (De Román és mts. 2005, Agerer 2006). A nemzetség ismert ektomikorrhizáinak mind morfológiai (világos végek, számos szálas, zászlósan eredő rizomorfa), mind anatómiai bélyegei (plektenchimatikus köpeny, hiányzó cisztídiumok) alapvetően azonosak (Agerer 2006), az egyes típusok nehezen különböztethetők meg egymástól (Danielson 1984b, Brand

97

1991, Agerer és Waller 1993b, Cripps 1997b, Yamada és mts. 2001b, Comandini és mts. 2004). A mintaterületen talált Tricholoma ektomikorrhizák is mutatják az általános „tricholomatoid” bélyegeket, ám a kiágazó hifák az általunk vizsgált mikorrhizák esetében csatos szeptumokkal rendelkeznek, amit csak egyes típusok esetében említenek a szerzők (pl. T. sulphureum, T. bufonium – Commandini és mts. 2004, T. portentosum, T. saponaceaum – Yamada és mts. 2001b). A nemzetség ektomikorrhizáira – a nagyon hasonló köpenyszerkezet mellett – változatos rhizomorfák jellemzők (Agerer 2006). Az „Őserdőben” talált mintákon megfigyelt differenciálatlan rhizomorfák jellemzik a T. sciodes (Brand 1991) vagy a T. sulphureum (Agerer 1987) ektomikorrhizáit. A molekuláris elemzések alapján a Tricholoma – Mt 1. mikobiontája a T. lascivum fajnak bizonyult, melynek nem szerepel ektomikorrhizája az irodalomban. Megjegyzendő azonban, hogy az ektomikorrhiza-mintából nyert szekvencia ezidáig nem publikált szekvenciákkal alkot közös kládot, ami miatt a pontos faji meghatározás további – a mintaterületen gyűjtött termőtestekkel együtt történő – vizsgálatokat igényel. Ennek a morfotípusnak a többi Tricholoma-ektomikorrhizától megkülönböztető tulajdonsága a zselatinizált, talajszemcséket tapasztó külső köpeny és a csatos kiágazó hifák együttese. A másik morfotípus mikobiontája a T. sulphureum – T. bufonium fajcsoport tagja. E két faj összeolvasztásának igényét részletes termőtest- és ektomikorrhiza-anatómiai ill. molekuláris vizsgálatok alapján már Comandini és mts. (2004) is megfogalmazták. A munkájukban szereplő ektomikorrhiza-leírás jellemzői megfelelnek az általunk megfigyelt bélyegeknek, ám a mi esetünkben megfigyelt lila pigmentáltságot nem említik a szerzők. IV. 4.6. Tuber-ektomikorrhiza Egy ektomikorrhiza mikobiontájának szekvenciája (HU 648) a tömlősgombák közé tartozó Tuber fehér szarvasgomba nemzetség képviselőinek szekvenciái közé tagozódott. A nemzetség előfordulása a mintaterületen már korábban igazolást nyert: Kovács és Jakucs (2006) különböző hazai lomberdőkből származó összehasonlító anatómiai és molekuláris vizsgálataiban a T. puberulum fajcsoportba tartozó ektomikorrhizákat azonosítottak az „Őserdőből”. A nemzetség több képviselőjének ektomikorrhizája részletesen ismert: Tuber albidum (Zambonelli és mts. 1993), T. borchii (Rauscher és mts. 1996), T. maculatum

98

(Zambonelli és mts. 1999), T. puberulum (Blaschke 1987, 1988), Tuber rufum (Rauscher és mts. 1995). A disszertációban szereplő minta szekvenciája a korábban is a mintaterületen gyűjtött ektomikorrhizák szekvenciáival alkot közös, statisztikailag is támogatott csoportot. Ennek megfelelően az ektomikorrhiza anatómiája is a csoportra jellemző (4. tábla/f-h): az epidermoid köpenyből sűrűn álló, palack alakú cisztídiumok erednek, melyek merevek, egyenes falúak, szeptáltak. Az elsőként Picea abies-ről leírt T. puberulum ektomikorrhizáját (Blaschke 1987, 1988) hazánkban ezidáig csak a Bükkben, F. sylvatica gyökerén találtuk meg, és a mintaterületről más faj képviselőjének mikorrhizája nem került elő. Az újonnan gyűjtött ektomikorrhiza szekvenciája T. puberulum-ként azonosított termőtestek szekvenciái (Halász és mts. 2005, Tedersoo és mts. 2006a) mellett egy Franciaországban, szintén bükk gyökeréről gyűjtött ektomikorrhiza szekvenciájával (Buée és mts. 2005) került közös csoportba (Függelék).

IV. 5. Az idegen hifával kolonizált Lactarius ektomikorrhiza jellemzése Az endogén hifákkal kolonizált, azonos morfológiájú és anatómiájú Lactarius ektomikorrhizákat rendszeresen találtuk a mintaterületen, többnyire kiugróan magas gyakoriságban. Sok esetben ez volt a talajminták domináns ektomikorrhizája. E mikorrhizatípus esetében azt is vizsgáltuk, hogy milyen talajmélységig fordul elő. A mintaterület talajából 60 cm mélségig vett talajminták vizsgálatából kiderült, hogy ez a morfotípus 40-60 cm mélységben is megtalálható. A mikobionta meghatározásához a mintaterületről gyűjtött L. subdulcis termőtestekből is nyertünk szekvenciákat. (A termőtestek meghatározását Siller Irén végezte.) Az ektomikorrhiza- ill. termőtestminták gyűjtési adatait az 15. táblázat tartalmazza. IV. 5.1. Az ektomikorrhiza részletes morfológiai-anatómiai jellemzése Morfológiai jellemzők Az feltűnően robusztus ektomikorrhiza igen gyakori volt a talajmintákban. Nagy tömegű monopodiális-piramidális (néhol fésűs) elágazási rendszereket alkot, színe narancssárga, sárgás-okker színű, az idősebb részeken sötétebb, barnásfekete, a felszíne sima (15/d ábra, 7. tábla/a,b). A végek többnyire gazdagon elágazók (idősebb végeken negyedrendű elágazások is megfigyelhetők). A köpennyel borított rendszerek átlagos hossza 6-22 mm, ám találtunk 99

extrém méretű, 57 mm hosszú mikorrhizarendszert is. Az oldalágak hossza 2-3 mm. A főtengely átmérője 0,5-1 (1,3) mm, az el nem ágazó végeké 0,3-0,7 mm. A mikorrhizaágak lefutása egyenes, vagy enyhén hajlott, néha kissé kanyargós. Sztereomikroszkóppal is láthatók a mikorrhizaköpeny külső rétegének nagy anguláris sejtjei. A középső rétegben futó tejcsövek áttűnnek a köpenyen; sérülés hatására belőlük átlátszó, vízszerű tejnedv távozik, melynek színe állás során sem változik meg. Ritkán rhizomorfák is megfigyelhető,k ezek eredése nem meghatározott, de többnyire az oldalágak eredési helyén lépnek ki a gombaköpenyből. A kiágazó hifák ritkák, csat nélküliek, cisztídiumok, szkleróciumok nem láthatók. A mikorrhizákon rendszeresen találhatók a köpenyt áttörő, erősen fénytörő, vastag falú idegen hifák.

15. táblázat. A Lactarius EM-minták ill. L. subdulcis termőtestek gyűjtési adatai. Relatív gyakorisági kategóriák: A minor komponens (<10%), B minor kodomináns komponens (10-50%), C major kodomináns komponens (50-90%), D domináns komponens (>90%). Mintaszám HU 328 HU 343 HU 372 HU 396 HU 437 HU 476 HU 478 HU 625 HU 646 THU 376 THU 377 THU 378 THU 379

A gyűjtés időpontja 2002.11.01. 2003.04.18. 2003.04.18. 2003.10.21. 2004.10.14. 2005.05.19. 2005.05.19. 2006.10.23. 2006.10.23. 2003.10.21. 2003.10.21. 2003.10.21. 2003.10.21.

Relatív gyakoriság B B B A C D B B C -

A köpeny anatómiai jellemzői A mikorrhizaköpeny külső rétege pszeudoparenchimatikus szerkezetű, anguláris sejtekkel (15/d ábra, 7.tábla/c). A sejtek többé-kevésbé izodiametrikusak, méretük 8-12 x 15-20 μm. Egy 20 μm élhosszúságú négyzetben 3-5 darabot lehet megszámlálni belőlük. A mikorrhiza csúcsának környékén a sejtek kisebb méretűek, számuk 4-8 a 20 μm élhosszúságú négyzet területén. A sejtfalak simák, benövések nem tapasztalhatók, sárgás-sárgásbarna színűek, vastagságuk 0,8-1 μm. A köpeny külső felszínére néhol talajszemcsék tapadnak. Extracelluláris, zselatinszerű mátrix, felszíni hifahálózat nem figyelhető meg; tejcsövek (laticiferek) ebben a rétegben nincsenek. 100

A középső köpenyréteg plektenchimatikus szerveződésű, a hifák benne rendezetlen lefutásúak (15/c ábra, 7. tábla/d). A hifák átmérője 3-5 μm. A hifák szeptáltak, a szeptumokon csatok nem láthatók. A szeptumok távolsága (10) 20-30 μm. A hifák fala 0,30,4 μm vastagságú. A köpenyben egyenlőtlen átmérőjű, kanyargós lefutású tejcsövek láthatók, bennük – frissen készített preparátumokon – a tejnedv-cseppek is láthatók. A tejcsövek gyakran elágaznak, átmérőjük (5) 6-8 (10) μm, bennük a szeptumok távolsága 5570 μm. A belső köpenyréteg szerkezete (7. tábla/e) a középsőhöz hasonló, plektenchimatikus, rendezetlen lefutású hifákkal, tejcsövekkel, bár ebben a rétegben többnyire csak hifakaréjokat lehet megfigyelni. Különbség, hogy mind a hifák, mind a tejcsövek keskenyebbek; az előbbiek átmérője ebben a rétegben 3-4 μm, az utóbbiaké 5-6 μm. A néhol talajszemcsékkel borított rhizomorfák határvonala egyenletes, nem tapasztalhatók hifakiágazások, maga a rhizomorfa ritkán ágazik el. A kialakító hifák fala vékony (0,2 μm), a hifák 1,5-2 μm átmérőjűek. A szeptumok nem csatosak, távolságuk 50-60 μm. A szeptumok előtt több esetben könyökszerű kiemelkedéseket lehet megfigyelni. Anasztomózisokat nem észleltünk. (A rhizomrofák szerkezetét az 15/e-f ábra és 7. tábla/f felvétele mutatják.) A hossz- és keresztmetszet anatómiai jellemzői (8. tábla) A köpeny vastagsága az ektomikorrhiza csúcsi régiójában 20-25 μm, az idősebb részeken 3545 μm. A metszeteken két jól elkülöníthető réteget lehet megfigyelni: a külső, anguláris, tejcsöveket nem tartalmazó, és a belső, plektenchimatikus, tejcsövekkel átjárt réteget. (Ez megfelel a köpenypreparátumokon látottaknak). A két réteg vastagsága közel egyforma, átlagosan 20-20 μm. A Hartig-háló a gyökérkortex két sejtsorát veszi körül, a külső sejteket minden oldalon (periepidermális Hartig-háló), a belső sejtsornak csak a külső, periklináris és az antiklináris falai mentén (paraepidermális Hartig-háló) találunk hifákat. A hifák a kéregsejtek körül fácskaszerűen elágaznak, ún. palmettás Hartig-hálót hozva létre. Az egyes lebenyek szélessége 2 μm. A hifák a növényi sejtekbe nem domborodnak be, hausztóriumokat nem hoznak létre. Hisztokémiai reakciók A reagensek közül FeSO4-, guajakol-, KOH- és tejsavoldattal valamint Melzer-reagenssel a mikorrhiza nem mutatott pozitív reakciót. A szulfo-vanillin a tejcsövek tartalmát sötétkékre színezte. 101

c

a

b

d

e

f

g 15. ábra. A mikorrhizáról készült mikroszkópi rajzok. A mikorrhiza habitusa (d), a külső (a) és a belső (c) köpenyrétegek szerkezete és a köpenyfelszín (b). A rhizmorfa szerveződése (e-f) és eredése (II/e). (A nyilak a rhizomorfát alkotó hifák könyökszerű kiemelkedéseire mutatnak.)

102

IV. 5.2. Filogenetikai kapcsolatok A különböző rekonstrukciós módszerekkel kapott törzsfák topológiája (16. ábra) megegyezett, csak az azokon kialakult kládok statisztikai támogatottsága tért el egymástól. Az előzetes, teljes Lactarius nemzetségre kiterjedő vizsgálatainkból kiderült, hogy a vizsgált ektomikorrhizákból nyert szekvenciák minden esetben a Russularia szekció képviselőivel alkotnak közös, statisztikailag is megerősített csoportot. Az itt bemutatott (és elemzett) törzsfákon ezért már csak ennek az alnemzetségnek a képviselői szerepelnek, s a törzsfák gyökereztetéséhez a közeli, pleziomorf helyzetű Plinthogali szekció (Nuytinck és Verbeken 2007) három képviselőjének (L. pterosporus, L. fuliginosus, L. lignyotus) szekvenciáját használtuk. Mind az ektomikorrhizából, mind a mintaterületen gyűjtött termőtestekből nyert ITSszekvenciák közös csoportot alkotnak a molekuláris adatbázisokból letöltött, azonosított L. subdulcis, valamint négy azonosítatlan ektomikorrhizából származó szekvenciákkal. Amennyiben ezekről kideríthető volt, a termőtestek ill. ektomikorrhizák is bükkösökből származtak (Nygren és mts. 2007, Nuytinck és mts. 2003, Kjøller 2006, Buée és mts. 2005). A szekvenciák közös kládjába kerül egy L. hepaticus-ból származó szekvencia is. (Az adatbázisból származó szekvenciák adatait a Függelék tartalmazza.) A kládon belül két főbb leszármazási vonal különíthető el, viszonylag alacsony statisztikai támogatottsággal. IV.5.3. Az intracelluláris kolonizáló hifák jellemzése A mikorrhizatípus minden felbukkanásakor a gyökér kortikális sejtjeit intracellulárisan kolonizáló hifák jelenlétét tapasztaltuk. A kolonizáló hifákat az ektomikorrhizából készült félvékony hossz- és keresztmetszeteken több szakaszon is megtaláltuk, függetlenül attól, hogy a mikorrhiza fiatalabb vagy idősebb részeiből készültek a preparátumok. Az idegen hifák a mikorrhiza csúcsi régiójának kellő nagyítás mellett végzett sztereomikroszkópos vizsgálatakor is megfigyelhetők (7. tábla/b). A köpenyből készült preparátumok egyes részein is rendszeresen látszanak a vastag, fénytörő falú hifák. Egyes területeken az is látható, amint éppen áttörik a külső réteget (17/a ábra, 9. tábla/a). A köpenyt elhagyó hifák kanyargós lefutásúak, átmérőjük 10-18 (20) μm, faluk 0,8-1 μm vastag (17. ábra, 9. tábla/b). A hifákat faluknál vékonyabb (0,4-0,5 μm), csat nélküli szeptunok tagolják. Ezek átlagos távolsága 70-150 (200) μm. 103

95/99

Azonosítatlan ektomikorrhiza (DQ377385)

—

NJ /

Azonosítatlan ek tomikorrhiza (FJ188351)

78/83

Lactarius hepaticus (AF096989)

—

Bayes

HU 478 HU 476 Azonosítatlan ektomikorrhiza (AM161524) Lactarius subdulcis (AJ889963) THU 378

55/—

Lactarius subdulcis (EU346875) Azonosítatlan ektomikorrhiza (AY299216) Lactarius subdulcis (AY331016) HU 396 HU 328 Lactarius subdulcis (DQ658874) THU 376 Lactarius subdulcis (AJ889966)

65/52 —

HU 646 HU 437 HU 625 Lactarius subdulcis (AM087257) Lactarius subdulcis (AJ889964) HU 372 THU 379 Lactarius subdulcis (AJ889965) THU 377

-/0.55

HU 343 Lactarius badiosanguineus (AY606943) Zelleromyces hispanicus (AJ555567)

59/-

91/89

0.67

1.00

-/91

53/-

—

—

91/90 1.00

Lactarius fulvissimus (EF493297) Lactarius cf. fulvissimus (AF204678) Lactarius subsericatus (AF140261)

Lactarius fulvissimus (AF204679) Arcangeliella borziana (AF373599)

99/100 1.00

100/100 1.00 -/87 — 61/92 0.73 79/89 0.98

Lactarius rufus (DQ658875) Lactarius decipiens (AJ549961)

99/100 Lactarius theiogalus (AF349716) 1.00 Lactarius tabidus (AY606956)

Lactarius luculentus (DQ384582) Lactarius substriatus (DQ974746) 99/100 Lactarius mitissimus (EF493295) 1.00 Lactarius aurantiacus (AJ555565)

Lactarius imperceptus (EU819485) Lactarius lignyotus (AY606949) Lactarius pterosporus (AY331013) Lactarius fuliginosus (AY606947)

0.02

16. ábra. Az idegen hifákkal kolonizált Lactarius ektomikorrhizák mikobiontáinak filogenetikai helyzetét bemutató, Bayes-analízissel készült törzsfa. Az egyes ágak felett balra a NJ-elemzéshez, jobbra a MPelemzéshez tartozó bootstrap-értékek, az ágak alatt a Bayes-analízis során kapott posterior valószínűségi értékek szerepelnek. (A túl rövid ágak esetén a statisztikai értékeket egy vízszintes vonal fölött ill. alatt tüntettük fel, nyíllal jelölve, hogy mely elágazási pontokhoz tartoznak.) Pirossal jelöltük a mintaterületen gyűjtött ektomikorrhizákból származó szekvenciákat, vastaggal szedtük a mintaterületről gyűjtött, L. subdulcisként azonosított termőtestekből nyert szekvenciákat. A molekuláris adatbázisokból származó szekvenciák esetében az azonosító számokat zárójelben adtuk meg. (Csak az 50% ill. 0,5 feletti statisztikai értékeit adtuk 104 meg; a mérce 100 bázispárra jutó 20 szubsztitúciónak megfelelő ághosszat jelöl.)

A félvékony kereszt- és hosszmetszeti preparátumok tanúsága szerint (9. tábla/c-f) intracelluláris kolonizáció mind a Hartighálóval körbevett, mind pedig az azok rétegén belül elhelyezkedő kéregsejtekben megfigyelhető. Több esetben az is látszik, amint a hifák egy-egy sejt falát áttörve

penetrálják

metszeteken

két,

a

szomszédos

különböző

sejtet.

morfológiájú

A hifa

figyelhető meg. Az egyik nagyobb átmérőjű, vastagabb falú (I. típusú hifa), mely a mért adatok (sejtfalvastagság, átmérő) tükrében feltehetően a köpenypreparátumokban és a sztereomikroszkópos felvételeken is látható hifákkal egyezik meg. Ez a 17. ábra. Az idegen hifáról készült mikroszkópi rajz. A köpeny áttörése (a), a hifa jellemző képe (b) és növekvő vége (c).

hifatípus hullámosan lefutva húzódik keresztül a kéregsejteken, de kanyarulatos szerkezetet, azokon

belül elágazásokat nem mutat. A másik típusú hifa (II. típusú hifa) kisebb átmérőjű (8-10 μm), fala is vékonyabb (0,2-0,4 μm). A hifák szeptáltak, a szeptumokon csatot nem lehet megfigyelni. A penetrált sejtekben többszörösen feltekeredik, elágazik, nagy felületű képleteket hozva létre. A kétféle szerkezetű hifa előfordulási gyakoriságában térbeli elkülönülés nem mutatkozik, mindkettő egészen az endodermiszig képes kolonizálni a gyökérkortex sejtjeit. A mikorrhizából készült transz-elektronmikroszkópos felvételeken (10. tábla) is megkülönböztethető a két hifatípus. A Hartig-hálóval körbevett, kolonizálatlan és az intracelluláris hifákat is tartalmazó kortex-sejtek között nincs látható különbség, egyes sejtekben azonban elektrondenz felhalmozódás tapasztalható a hifák környékén. A hifák sejteken belüli helyzete nem meghatározott, a növény sejtfalához simuló hifák és a sejt belsejében elhelyezkedők egyaránt vannak. Nagyobb nagyításnál a hifák belsejében, sejtfaluk mentén felismerhető a sejtmembránra jellemző unit-membrán struktúra, ami a hifák élő voltára utal. Némely I. típusú hifákon belül kisebb átmérőjű, vékonyabb falú intrahifális hifákat találunk (10. tábla/d).

105

IV. 5.4. Értékelés Az ektomikorrhiza anatómiája és a mikobionta rendszertani helyzete A mintavételezések során a területről nagy gyakoriságban került elő, több helyről is a tejelőgomba-faj ektomikorrhizája. A mintaterületen található erdőállomány korának és bolygatottságának tükrében (idős egyedeket is tartalmazó, fokozottan védett, erdőhasználatból kivont bükkös) ez összevág azokkal a megfigyelésekkel, melyek szerint a Lactarius-fajok ektomikorrhizái a szukcesszió késői stádiumában jelennek meg nagy gyakoriságban a földalatti gombaközösségben (Visser 1995, Hutchison 1999). A faj elterjedtségére jellemző az is, hogy a talaj mélyebb rétegeiben is előfordul. Ez hasonló ahhoz, amit a közeli rokon L. utilis esetében figyeltek meg Rosling és munkatársai (2003) egy olyan vizsgálatban, melynek során a talaj organikus horizont alatt fekvő rétegeinek mikorrhiza-közösségét is tanulmányozták. Ennek során a Lactarius-fajt a talaj alsóbb rétegeiben, 20-35 cm mélységben is megtalálták (szemben más fajokkal). A filogenetikai elemzéseink igazolják, hogy az ektomikorrhiza mikobiontája a tejelőgombák (Lactarius) nemzetségének Russularia alnemzetségébe tartozó L. subdulcis fajjal azonos. Az ektomikorrhiza morfológiája és anatómiája is megerősíti az alnemzetségi hovatartozását. A Lactarius genus Russularia alnemzetségének mikorrhizájára jellemző köpenystruktúrát (pszeudoparenchimatikus, anguláris külső réteg és tejcsöveket tartalmazó, plektenchimatikus belső réteg) éppúgy megfigyelhetjük az általunk leírt mikorrhizánál, mint a szintén általánosan előforduló rhizomorfákat (Eberhardt 2000). Brand és Agerer (1986) leírása a L. subdulcis bükkel alkotott mikorrhizájáról számos ponton egyezik a mi megfigyeléseinkkel: a hasonló morfológia mellett az anguláris szerkezetű külső, plektenchimatikus középső és belső köpenyrétegek valamint a köpenyből kiágazó, néhol könyökszerű kiemelkedésekkel rendelkező hifákból szerveződő rhizomorfák jelenléte is közös bélyeg. Brand és Agerer (1986) megfigyelései szerint azonban az ektomikorrhiza felszínén hifahálózat található, rhizomorfáit pedig kanyargós marginális hifák fedik, melyet mi nem figyeltük meg. A L. subdulcis ektomikorrhizájáról később Prévost és Pargney (1995) is közöl leírást, ez azonban pásztázó ill. traszmissziós elektronmikroszkópos megfigyeléseken alapul, és dokumentációjukon az említett bélyegek nem figyelhetők meg. A hazai ektomikorrhizákból nyert szekvenciák két kládba csoportosulásának, és a kládok viszonylag nagyobb távolságának megfelelő anatómiai különbségeket nem láttunk. Egyéb Lactariusfajok esetében is tapasztalták már azonos anatómia kialakulását egy-egy nagyobb 106

intraspecifikus genetikai távolságokkal jellemezhető faj egyedeinek mikorrhizái közt (pl. a L. deliciosus és a L. sanguifluus fajok esetében Guerin-Laguett és mts. 1996, ill. Marin és mts. 1996). Molekuláris eredményeink alapján elmondhatjuk, hogy a L. subdulcis esetében nagy intraspecifikus genetikai variabilitást és fajon belüli ektomikorrhiza-anatómiai variabilitást is megfigyelhetünk.

A

törzsfákon

szereplő,

a

hazai

ektomikorrhizákból

származó

szekvenciákkal közös csoportba került L. subdulcis-szekvenciákhoz tartozó publikációk nem tartalmaznak részletes anatómiai leírásokat az ektomikorrhizákról. Ezért az anatómiai és a filogenetikai variabilitás kapcsolatának vizsgálata tágabb földrajzi környezetre kiterjedő mintavételt és összehasonlító anatómiai elemzést igényel. A változékonyság ténye akár különböző anatómiai bélyegekkel rendelkező faj alatti kategóriák kialakulására, földrajzi területhez kötődő specializálódásra vagy akár fenotipusos varianciára is utalhat. A mintaterületünkön talált ektomikorrhizák a Russularia alnemzetség L. subdulcistól különböző fajainak ektomikorrhizáitól konkrét morfológiai ill. anatómiai bélyegekben térnek el. A hipogéikus termőtestet fejlesztő Arcangeliella borziana Picea abies-szel létrehozott ektomikorrhizájára (Peter és mts. 2001) a rövid mikorrhizavégek és felszíni hifahálózat jellemző (az alnemzetség általános bélyegei mellett), melyek nem felelnek meg az általunk adott leírásnak. A L. mitissimus Picea abies-szel, mesterséges körülmények között kialakított mikorrhizájától (Weiss 1991) az általunk talált mikorrhizát az különbözteti meg, hogy a külső köpenyréteget a L. mitissimus esetében epidermoid, hullámos falú sejtek alkotják, valamint az, hogy itt az egyenes lefutású hifákból szerveződő rhizomorfákat kanyargós, kisebb átmérőjű marginális hifák rétege borítja. A L. subsericatus Abies alba-n kialakított ektomikorrhizájának bélyegei szinte teljesen megegyeznek (Eberhardt és mts. 2000) az „Őserdőben” talált mikorrhiza jellemzőivel: a külső köpenyréteget anguláris sejtek alkotják, a középső és belső rétegek plektenchimatikus szerkezetűek, a köpenyfelszínen nincsen hifahálózat. A sejtek, a hifák és a köpenyrétegek jellemző méretei is igen hasonlók az általunk mért adatokhoz. Különbség azonban a L. subsericatus esetében, hogy az anguláris sejtrétegben néhol kerekded sejtek jelennek meg, a plektenchimatikus rétegben pedig néhol gyűrű alakban rendeződnek a gombafonalak. Szintén eltérés, hogy ez utóbbi faj mikorrhizáján leírói nem figyeltek meg rhizomorfákat. A L. hepaticus és L. theiogalus fajok ektomikorrhizáiról nem találtunk részletes jellemzést az irodalomban. Bükkről származnak Brand leírásai a L. rubrocinctus és a L. camphoratus ektomikorrhizáiról (Brand 1991) is. Mindkettőre jellemző az alnemzetségben általános 107

anguláris szerkezetű külső és plektenchimatikus belső köpenyréteg mellett a rhizomorfák jelenléte. A L. rubrocinctus esetében azonban a külső köpenyréteget az általunk mértnél nagyobb sejtek alkotják, melyek közül több még tejnedv-cseppeket is tartalmaz; a rhizomorfákban is jelez tejnedvet tartalmazó hifákat a szerző (Brand 1991). Mi ilyen jellemzőkkel nem találkoztunk. A másik faj mikorrhizájának külső köpenyrétegét még az előbbinél is nagyobb sejtek alkotják (egy 20 μm élhosszúságú négyzetben mindössze 3 sejt van). Mindkét ektomikorrhiza-típusra jellemző az említett különbségek mellett a felszínen futó hifahálózat is, melynek elemei több helyütt elemelkednek a köpenytől, cisztídium-szerű képleteket hozva létre (Brand 1991). A L. subdulcis és L. rubrocinctus fajok ektomikorrhizáihoz hasonló morfológiát mutat a L. ichoratus Abies alba-n létrehozott mikorrhizája (Comandini és Pacioni 1998). Ebben az esetben a felszíni hifahálózat mellett két további különbség is van az általunk talált mikorrhizához képest: a L. ichoratus esetében KOH hatására sárgára színeződő, fehér tejnedvet említenek a szerzők (szemben az általunk tapasztalt vízszerű, színét nem változtató tejnedvvel), rhizomorfák jelenlétét azonban nem tapasztalták. Az alnemzetségbe tartozó L. omphaliformis és L. obscuratus enyves égerrel alkotott mikorrhizái a külső köpenyrétegre jellemző pszeudoparenchimatikus – plektenchimatikus átmeneti szerkezet (Pritsch és mts. 1997a) miatt térnek el a vizsgált mikorrhizától. Érdekesség, hogy e két faj ektomikorrhizái valamennyi minőségi és mérhető morfológiai és anatómiai bélyegükben megegyeznek, az ITS-régió PCR-RFLP-vizsgálatával egyértelműen elkülönülnek egymástól az ektomikorrhizák mikobiontái (Pritsch és mts. 1997b), a két faj ektomikorrhizáinak anatómiai egyezése tehát a mi esetünkben megfigyelhetővel ellentétes jelenség. Az idegen hifakolonizáció A begyűjtött ektomikorrhiza-mintákban minden esetben megfigyeltük a gyökér kéregsejtjeiben az idegen kolonizáló gomba hifáinak jelenlétét. Ez a partnerek igen szoros kapcsolatára utal. A hifák morfológiája alapján (nagy hifaátmérő, vastag, fénymikroszkópban erősen fénytörő sejtfal, a csatok hiánya) a kolonizáló gomba nagy valószínűséggel a tömlősgombák törzsének (Ascomycota) képviselője. A kétféle (I. és II. típusú) intracelluláris hifa lehet egy fajnak két különböző morfológiájú, különböző funkciók ellátására módosult megjelenése (terjedést szolgáló, vastag, mechanikai védelmet nyújtó fallal rendelkező I. típusú hifák és vékonyabb falú, nagy felülettel rendelkező, anyagátadó funckiójú II. típusú 108

hifák), de az is előfordulhat, hogy két különböző gombafaj hifái kolonizálják egyszerre a kéregsejteket. Ektomikorrhizákon belül, a mikorrhizát alkotó gombától eltérő fajhoz tartozó hifák jelenlétét sok esetben megfigyelték már. A gombaköpenybe sokszor nőnek bele idegen hifák, de az is előfordul, hogy egy mikorrhiza belsejében egy másik, szintén mikorrhiza-alkotó gomba hifáit figyelhetjük meg, sok esetben még a gombaköpennyel körülvett kéreg belsejében is – pl. a Rhizopogon nemzetség ektomikorrhizáinak belsejében Chroogomphus nyálkásgomba-fajok hifáit találhatjuk, akár a Hartig-hálóval körülvett sejtek belsejében is (Agerer 1990). A Lactarius nemzetség mikorrhizáinak több szerző említi másodlagos kolonizációját. Amiet és Egli (1991) L. scrobiculatus Picea abies-szel képzett ektomikorrhizájában figyelt meg hifákat a gombaköpennyel borított gyökérszakasz kéregsejtjeiben. Ezek azonban többnyire csak különálló sejtek, vagy rövid hifák voltak, s méretük sem egyezik az általunk jellemzett hifák adataival. Egy tömlősgomba-faj, a Leucoscypha leucotricha hifáinak megjelenéséről ír Brand (1991) különböző Lactarius-fajok ektomikorrhizáinak vizsgálata során. A L. subdulcis, L. rubrocinctus és kisebb gyakoriságban a L. fuliginosus (és a szintén a családba tartozó Russula ochroleuca) bükkel alkotott mikorrhizáiból mutatta ki a másodlagosan kolonizáló gombafajt. A kapcsolat morfológiája azonban eltér az általunk megfigyelttől. Brand (1991) a kolonizált mikorrhiza-végek erőteljes duzzadását figyelte meg, amit mi nem tapasztaltunk; a kortikális kéregsejtekből pedig a vastag, fő hifaágról leágazó hausztóriumokat írt le. Ilyen képleteket metszeteinken mi nem találtunk. A kapcsolatról közölt képek alapján (Brand 1992) meggyőződhettünk róla, hogy ez sem egyezik az általunk tapasztaltakkal: a Leucoscypha leucotricha köpenyben haladó hifái igen sűrűn elágaznak és szeptumaiknál kissé befűzöttek, míg az Őserdőből származó mikorrhizákat kolonizáló gomba hifái nem elágazók, átmérőjük egyenletes. Pargney és Prévost (1996) szintén a L. subdulcis ektomikorrhizáinak Hartig-hálóval körülvett növénysejtek másodlagos kolonizációját figyelte meg. Elektronmikroszkópos dokumentációik az általunk megfigyelthez nagyon hasonló megjelenésű hifák jelenlétére utalnak, melyről a szerzők feltételezik, hogy egy tömlősgomba fonalai (Pargney és Prévost, 1996). Képeiken azonban csak egyféle megjelenésű hifák láthatók, és intrahifális hifákat sem lehet megfigyelni (Pargney és Prévost 1996).

109

Pillukat és Wanner (1996) egy erős gazdaspecificitást mutató, általában termőtesteken élősködő parazita tömlősgomba, a Hypomyces lateritius hifáit találták meg L. salmonicolor mikorrhizáiban. A másodlagos fertőzés nyomán a mikorrhiza morfológiája megváltozott: kúpalakú végek jöttek létre, az oldalágak átmérője megnövekedett. Ezen kívül az ektomikorrhiza felszínén a parazita gomba konídiumainak kialakulását is megfigyelték. Ehhez hasonló jellegzetességeket mi nem tapasztaltunk. A szerzők viszont a másodlagos Hypomyces-fertőzés jellemzésekor a növényi sejtek kolonizációját nem említik. A szakirodalmi adatok alapján tehát a Lactarius-ektomikorrhiza idegen hifával történt kolonizációja nem meglepő. Az általunk leírt morfológiát azonban eddig még senki nem írta le, tehát feltehetően egy olyan faj másodlagos megjelenését tapasztaltuk, melynek hasonló viselkedéséről, tejelőgombák mikorrhizáinak esetében még nincsenek adatok. Az anatómiai vizsgálatok az együttélés minőségéről csak feltételes információt szolgáltatnak. A kéregsejtek belsejében hurkokat kialakító hifák alakja nagy valószínűséggel a gomba

és

a

felületnövekedés

növényi

sejtek

között

miatt

jöhetett

létre,

lejátszódó hasonlóan

transzportfolyamatokat az

ugyan

ilyen

célt

elősegítő szolgáló

arbuszkulumokhoz a vezikuláris-arbuszkuláris mikorrhizák esetében, vagy az orchidmikorrhizákra jellemző hifa-coilokhoz (Smith és Read 1997). A kapcsolat minőségéről azonban nem állíthatunk biztosat. Bár sem a fény-, sem pedig az elektronmikroszkópos képeken nem találtunk a növényi sejtek pusztulására utaló jeleket, mégsem tudjuk megmondani, hogy a parazitizmus – mutualizmus skála mely szakaszára helyezhető a leírt kapcsolat. IV. 6. A mintaterület ektomikorrhiza-közösségének összehasonlító értékelése A terület ektomikorrhiza-közösségének áttekintő értéklésénél tudatában kell lennünk annak, hogy a közösség összetételének meghatározása még mindig folyamatban van (az összes elkülönített mikorrhizának valamivel több, mint felét határoztuk meg morfológiaianatómiai vagy molekuláris alapon). Mivel a talajmintavétel gyakorisága miatt mintavételi módszerünket nem tekinthetjük reprezentatívnak, ezért csak a megtalált és azonosított fajok jelenlétét tekinthetjük információ értékűnek, a taxonok hiánya nem jelenti, hogy ne lehetnének tagjai a közösségnek. A rendszeres mintavétel miatt azonban úgy gondoljuk, hogy az egyes karakterisztikus, egyértelműen azonosítható (ill. azonosított) típusok illetve nemzetségek talajmintákban tapasztalt arányaiból már levonhatunk következtetéseket (6. 110

táblázat). „Egyértelműen azonosítható” típusnak tekinthetjük ebből a szempontból a Lactarius nemzetséget (a tejhifák köpenybeli jelenléte miatt), a tomentelloid mikorrhizák csoportját, a Russula ill. Tuber nemzetségeket jellegzetes cisztídiumaik miatt, a Cenococcum geophilum, a Hymenoscyphus, a boletoid valamint a Byssocorticium és Hebeloma nemzetségek mikorrhizáit karakterisztikus anatómiájuk miatt. Emellett az értékelésbe bevonhatjuk a molekulárisan azonosított, a disszertációban részletesen vizsgált csoportokat (Humaria-Genea, Pachyphloeus leszármazási vonalak tagjait), melyek anatómiáját – a meghatározást követően – egyértelműen fel tudtuk ismerni a szétválogatott ektomikorrhizák között. A terület ektomikorrhiza-közösségének meghatározó tagjai a világos színű (Lactarius, Russula, Hebeloma, boletoid típusok) mikorrhizák. Ezek mellett szubdominánsak a Tomentella nemzetség és a Cenococcum geophilum faj sötét színű mikorrhizái. Az említetteken túl számos, kis gyakoriságban megtalált képviselő jelenléte jellemzi a közösséget (6. táblázat). Ez a gombákra (ill. ektomikorrhizákra) jellemző foltos előfordulást tükrözi (Horton és Bruns 2001, Allen és mts. 2003). Az azonosított fajok 26% tömlős gomba volt. A mintaterület mikobiótájának termőtest-alapú vizsgálataiban – a szaprotróf és lignikol fajok mellett – az ektomikorrhizás fajok aránya igen alacsony (0,8 % ill. 7,4% - Siller 1986, 2004). Ezzel szemben a talajmintákban a gyökérvégeknek minden esetben közel 100%-os kolonizáltságát tapasztaltuk, tehát az ektomikorrhiza-közösség közvetlen vizsgálata jelentősen hozzájárul a terület mikobiótájának megismeréséhez. Nem meglepő módon a hipogéikus termőtestet (Genea, Pachyphloeus, Tuber), valamint nehezen

észrevehető

termőtesteket

képző

ektomikorrhizás

nemzetségek

(Sebacina,

Tomentella) nem, vagy alulreprezentáltak a terület termőtest-alapú fajkészletében (Siller 2004). A tejelőgombák ektomikorrhiza-közösségre jellemző nagy gyakorisága a termőtestek körében nem figyelhető meg (Siller 2004). A gyökérvégeken kis gyakoriságban jelen levő nemzetségek előfordulnak a termőtestek körében is (Entoloma, Hebeloma, Humaria, Inocybe, Russula, Tricholoma). A hazai, alföldi, homokon kialakult lomberdők ektomikorrhiza-közösségeivel (Jakucs 2002) összevetve a legszembetűnőbb különbség a sötét színű (elősorban a tomentelloid) típusok alacsonyabb aránya és a tejelőgombák magasabb előfordulása. Ez utalhat a sötét morfotípusok hatékonyabb alkalmazkodására a szárazabb élőhelyekhez (Jakucs és mts. 2005b), melynek oka talán a sötét köpenypigmentációban kereshető (Pigott 1982).

111

Európai bükkösökre irányuló vizsgálatok közül az mieinkhez nagyon hasonló eredményt kaptak Kraigher és mts. (2007) egy szlovéniai, jegenyefenyővel (Abies alba) elegyes és Buée és mts. (2005) egy franciaországi bükkösben. Mindkét esetben a Lactarius és Russula nemzetségek és boletoid fajok (Xerocomus) dominanciáját figyelték meg a szerzők, miközben a tomentelloid ektomikorrhizák szubdomináns helyzetben fordultak elő. Mindkét munkában viszonylag nagy gyakoriságban voltak jelen a C. geophilum faj ektomikorrhizái. A kisebb abundanciával előforduló fajok közül – az Őserdőhöz hasonlóan – jelen voltak a Genea, Byssocorticium (Kraigher és mts. 2007), Clavulina, Inocybe és Tuber (Buée és mts. 2005) nemzetségek képviselői. Németországi bükkösökben a Lactarius és Russula nemzetségek dominanciája mellett a tomentelloidok alacsony gyakoriságát tapsztalták (Rumberger és mts. 2004, Grebenc és Kraigher 2007). Mindkét munka kimutatta viszonylag nagyobb mennyiségű C. geophilum ektomikorrhiza jelenlétét is (további, a hazai közösséggel átfedő fajok: Genea hispidula (morfológiai azonosítással), Tuber puberulum). A tomentelloidok alul-reprezentáltsága e mintákban összevág a csoport szárazság-adaptáltságával kapcsolatos feltevéseinkkel, illetve hazai előfordulási adataikkal. Ennek ellenére mégsem általánosíthatjuk a nemzetségre vonatkozó következtetéseinket, mert vannak csapadékosabb bükkös állományok (Dániában), melyek vizsgálatai éppen a Tomentella-ektomikorrhizák kiemelkedő dominanciáját igazolták a Lactarius-Russula csoport rovására (Kjøller 2006). Ez utóbbi vizsgálat kapcsán megemlítendő még a Sebacina, a Genea és Humaria és a Clavulina nemzetségek közös előfordulása, valamint az Inocybe fajok nagy gyakorisága (Kjøller 2006).

112

V. Összefoglalás Munkánk során a Bükki Nemzeti Park területén található „Őserdő” rezervátum montán bükkösének ektomikorrhiza-közösségét vizsgáltuk abból a célból, hogy 1. minél többet tudjunk meg az ektomikorrhizaképző gombaközösség faji összetételéről; 2. részletes jellemzést adjunk egyes kevéssé ismert, de a területen gyakori ektomikorrhiza-típusokról, különös tekintettel a tömlős mikorrhizákra, és összehasonlítsuk azokat egyéb hazai élőhelyekről származó, illetve az irodalomban közölt közeli rokon mikorrhiza-típusokkal; 3. átfogó képet kapjunk a terület ektomikorrhizáinak relatív gyakoriságáról, összehasonlítva más földrajzi területek bükköseire vonatkozó irodalmi adatokkal. A mikorrhizák meghatározására és jellemzésére mikroszkópos morfológiai-anatómiai módszereket (szteromikroszkópia, Nomarski-DIC és PhC fénymikroszkópia, hisztokémia, transzmissziós elektronmikroszkópia) valamint DNS-alapú filogenetikai módszereket (az rDNS- szekvenciaanalízise) alkalmaztunk. A mikorrhizák gyakoriságát a random módon vett talajmintákban a relatív abundancia becslésével végeztük. A 2002 és 2008 között tartó vizsgálatsorozatban 10 alkalommal, összesen 30 talajmintát dolgoztunk fel, melyekben 325 ektomikorrhizát különítettünk el. Ezek közül 186-ot határoztunk meg legalább nemzetség szintjén, ebből 66-ot molekuláris módszerek segítségével. Munkánk során tizenhárom, a Genea-Humaria (Pyronemataceae) csoportba tartozó ektomikorrhizát azonosítottunk molekuláris módszerekkel, és jellemeztük anatómiájukat. Részletesen leírtuk és dokumentáltuk a H. hemisphaerica ektomikorrhizáját. Összehasonlító vizsgálataink alapján az epigéikus Humaria és a hipogéikus Genea nemzetségek ektomikorrhizái közt nincsenek kvalitatív anatómiai, csak morfometriai különbségek. Eredményeink szerint az irodalomban eddig H. hemisphaerica-ként szereplő ektomikorrhiza leírása nem a nemzetség képviselőjének mikorrhizájáról készült, és a korábbi Genealeírások is megkérdőjelezhetők. A Pachyphloeus-Amylascus-Scabropezia (Pezizaceae) leszármazási vonalból három különböző faj (a P. melanoxanthus és két ismeretlen faj) ektomikorrhizáját különítettünk el és jellemeztük, amelyeket eddig még nem írtak le. A mintaterületen hat különböző Tomentella (Thelephoraceae) morfotípus összesen tíz ektomikorrhizáját azonosítottuk és vetettük össze egyéb hazai, ill. korábban leírt tomentelloid morfotípusokkal. A hat típusból kettőt egyértelműen (T. stuposa, T. ramosissima), és egyet feltételesen (T. cf. sublilacina) tudtunk meghatározni. A fentiek mellett a ritkábban előforduló ektomikorrhizák közül két Clavulina-, egy Entoloma-, négy Inocybe-, három Sebacina-, két Tricholoma- és egy Tuber-ektomikorrhiza-morfotípust jellemeztünk röviden, és vizsgáltuk filogenetikai kapcsolataikat. Az „Őserdő” területén rendszeresen megtaláltuk – a molekuláris módszerekkel – Lactarius subdulcis-ként azonosított faj ektomikorrhizáját, melyben minden esetben megfigyeltük a köpeny és a gyökérsejtek másodlagos kolonizációját egy idegen tömlősgomba hifájával. A hármas kapcsolatot részletesen jellemeztük fény- és elektronmikroszkópos módszerekkel egyaránt. A mintaterület ektomikorrhiza-közösségének összetételére jellemző, hogy más európai bükkösökhöz hasonlóan néhány nagy gyakoriságban jelen levő típus mellett számos kis abundanciájú típus alkotja. A világos színű (Lactarius, Russula ill. boletoid) fajok nagy aránya mellett szubdominánsak a sötét színű (pl. tomentelloid, Genea, Humaria) mikorrhizák. Ezzel szemben a hazai alföldi lomberdőkben a sötét típusok (főként a tomentelloidok) dominálnak. A disszertációban összefoglalt eredmények felhívják a figyelmet arra, hogy bár napjaink molekuláris ökológiai módszerei az ektomikorrhiza-közösségek összetételének vizsgálata során hatékony és gyors faji azonosítást tesznek lehetővé, még mindig számos ektomikorrhiza-kapcsolat anatómiáját nem vagy tévesen ismerjük. Fontos tehát hogy ezen kutatások során párhuzamosan alkalmazzuk a morfológiaianatómiai és a molekuláris megközelítési módokat.

113

VI. Summary Our work focused on the ectomycorrhizal (EM) community of the montane beech woodland of the „Őserdő” forest reserve (Bükk National Park, Hungary), in order to: 1. gain information on the species composition of the EM of the area; 2. give detailed characterization of the less-known, but frequent EM-morphotypes, with special interest on the ascomycetous EM, and to compare them to related types from other Hungarian communities or previously published descriptions; 3. to depict a general view of the species composition and abundance of the EM community of the area, in comparison with those of other beech forests located in different regions of Europe. The mycorrhizae were characterized and identified by microscopy (stereomicroscopy, Nomarski-DIC and phase-contrast microscopy, histochemical reactions, transmission electronmicroscopy), and DNA-based molecular taxonomic methods (phylogenetic analysis of different regions of the rDNA). The abundance of the morphotypes was visually estimated by a semiquantitative method. Between 2002 and 2008, 30 soil samples were collected from the study site at 10 sampling occasions. Altogether 325 EM were separated. 186 were identified at least on genus level, 66 of these by molecular analysis. During the survey, 13 EM formed by the genera Humaria and Genea were identified by molecular methods. We characterized their anatomy. The EM of H. hemisphaerica was described and documented in details. Our comparisons revealed no qualitative anatomical, only morphometric differences between the mycorrhizae of the hypogeous Genea and the epigeous Humaria genera. According to our results, the original description of the EM regarded as H. hemisphaerica must have been based on misidentification, and the identification of previously described Genea EM is also questionable. From the Pachyphloeus-Amylascus-Scabropezia (Pezizaceae) lineage, the EM of three different species (P. melanoxanthus and two unidentified species) were found in the study site. The EM forming ability of these species was not observed previously. Six different Tomentella (Thelephoraceae) EM morphotypes were collected from the “Őserdő”. These were compared to the tomentelloid EM of other regions of Hungary and also to those described in the literature. We managed to identify accurately two morphotypes (as T. stuposa and T. ramosissima), and another with ambiguity (as T. cf. sublilacina). In addition to the genera mentioned above, further, less frequent mycorrhizae of the community were characterized briefly: two morphotypes of Clavulina, another of Entoloma, four of Inocybe, three of Sebacina, two of Tricholoma and one of Tuber. The phylogenetic relations of the mycobionts were also examined. In the “Őserdő”, we regularly found the characteristic EM of a Lactarius species, which was later identified – by molecular taxonomic methods – as L. subdulcis. The cortical plant cells of this EM were always colonized by alien ascomycetous hyphae. We characterized this tripartite symbiosis in details by both light and electronmicroscopy. The basic characteristic of the EM community of the study site is that it consists of a few frequent and several less abundant EM morphotypes – similarly to other European beech forests. Beside the dominance of light coloured (Lactarius, Russula, boletoid) species, dark ones (Tomentella, Genea, Humaria etc.) are subdominant, in contrast with deciduous forests of the Great Hungarian Plain, where dark (mainly tometelloid) EM dominate the community. The results of the dissertation call the attention to the fact, that although the modern molecular methods enable rapid identification of the species composing the EM community of certain areas, the anatomy of several EM is not or falsely known, even today. Thus, it is important to amalgamate the microscopic and molecular taxonomic approaches in these surveys.

114

VII. Köszönetnyilvánítás Doktori munkám Dr. Böddi Béla professzor úr hozzájárulásával készülhetett el az ELTE Növényszervezettan Tanszékén, melyért köszönettel tartozom. Témavezetőmnek,

Dr.

Jakucs

Erzsébenek

kiemelt

köszönettel

tartozom

folyamatos

támogatásáért, türelméért és tanításáért. Hálás vagyok azért, hogy engedte saját ötleteim megvalósítását, miközben segített megakadályozni, hogy szerteágazó érdeklődésem a munka rovására menjen. Köszönöm Dr. Kovács Gábor segítségét a molekuláris munkák elméleti és gyakorlati területein. Hálás vagyok a mindennapi munkában nyújtott segítségéért is. Köszönöm, hogy mindig meghallgatta kérdéseimet, s hogy kritikai megjegyzéseivel folyamatosan javította munkáim eredményét, beleértve ebbe teljes dolgozatom átolvasását és javítását is. Köszönöm Dr. Keresztes Áronnak, hogy segítségemre volt az elektronmikroszkóposvizsglatokban. Hálás vagyok hallgatótársamnak, Balázs Tímeának, hogy mindig kész volt segíteni a labormunka során. Hálás vagyok Dr. Siller Irénnek a mintaterületre vonatkozó korábbi adatokért, s hogy rendelkezésemre bocsátotta herbáriumában levő termőtesteit. Köszönöm az irodalmazásban nyújtott segítségét is. Köszönöm Dima Bálintnak és Lukács Zoltánnak, hogy herbáriumi anyagaikat felhasználhattam a Genea- ill. Humaria-ektomikorrhizák azonosításához, és köszönöm a madridi CSIC – Real Jardín Botánico-nak is, hogy megkaphattam tőlük a gyűjtemény Genea-aszkokarpiumait. Hálás vagyok Rosanne Healynek és munkatársainak, hogy rendelkezésemre bocsátották a Pachyphloeus-fajok még publikálás alatt levő nukleotidszekvenciáit. Seress Diánának köszönöm, hogy felhasználhattam egyes, a mintaterületről gyűjtött ektomikorrhizák azonosításának eredményét. Köszönöm Dózsainé Kerekes Piroskának az egész munka folyamán nyújtott segítségét. Jónás Csillának köszönöm a metszetek elkészítésében, s Gergely Katalinnak az elektronmikroszkópos előkészítésben nyújtott segítségüket. Feleségemnek, Erős-Honti Julianának köszönöm, hogy amellett, hogy „hátországot” biztosított munkáimhoz, arra is volt ideje, hogy dolgozatomat átolvassa, és segítsen kiszűrni hibáit. A doktori munka és a dolgozat az ELTE Doktori Iskola mellett az OTKA (K6887) és a Deák Ferenc Ösztöndíj (99./2008) támogatásával valósult meg.

115

VIII. Felhasznált irodalom Agerer R (1987–): Colour Atlas of Ectomycorrhizae. Einhorn-Verlag Eduard Dietenberger, Schwäbisch Gmünd. Agerer R (1987): Tricholoma sulphureum. – In: Colour Atlas of Ectomycorrhizae (R. Agerer, ed.) Einhorn Verlag, Schwäbisch Gmünd. p. 9. Agerer R (1990): Studies on Ectomycorrhizae XXIV. Ectomycorrhizae of Chroogomphus helveticus and C. rutilus (Gomphidiaceae, Basidiomycetes) and their relationship to those of Suillus and Rhizopogon. Nova Hedw 50: 1–63. Agerer R (1991): Characterization of Ectomycorrhiza. – In: Norris, J.R., Read, D.J., Varma, A.K. (eds.): Techniques for Mycorrhizal Research. Vol. 23. Academic Press Ltd., San Dieago. pp. 25– 73. Agerer R (1996a): Characterization of ectomycorrhizae: a historical overview. Descr Ectomyc 1: 1–22. Agerer R (1996b) Ectomycorrhizae of Tomentella albomarginata (Thelephoraceae) on Scots pine. Mycorrhiza 6: 1–7. Agerer R (1997): Entoloma sinuatum (Bull.: Fr.) Kummer + Salix spec. Descr Ectomyc 2: 13–18. Agerer R (1998): Entoloma sinuatum. – In: Colour Atlas of Ectomycorrhizae (R. Agerer, ed.) Einhorn Verlag, Schwäbisch Gmünd. p. 117. Agerer R (1999): Anatomical Charcteristics of Identified Ectomycorrhizas: An Attempt Towards a Natural Classification. – In: Varma, A., Hock, B. (eds.): Mycorrhiza (2nd edn.) Springer-Verlag, Berlin, Heidelberg. pp. 633–682. Agerer R (2001): Exploration types of ectomycorrhizae. A proposal to classify ectomycorrhizal mycelial systems according to their patterns of differentiation and putative ecological importance. Mycorrhiza 11: 107–114. Agerer R (2006): Fungal relationships and structural identity of their ectomycorrhizae. Mycol Prog 5: 67–107. Agerer R, Bougher NL (2001a): Tomentella brunneorufa MJ Larsen + Eucalyptus spec. Descr Ectomyc 5: 205–212. Agerer R, Bougher NL (2001b): Tomentella subamyloidea sp. nov. and T. radiosa (Thelephoracee, Hymenomycetes, Basidiomycota) from Australia. Aust Syst Bot 14: 607–614. Agerer R, Rambold G (1998): DEEMY – a delta-based system characterization and DEtermination of EctoMYcorrhizae. CD-ROM, version 1.1. Institute for Systematic Botany, Section Mycology, University of München. Agerer R, Rambold G (2004–2005): DEEMY – an information system for characterization and DEtermination of EctoMYcorrhizae. www.deemy.de – München, Germany. Agerer R, Waller K (1993a): Mycorrhizae of Entoloma saepium: parasitism or symbiosis? Mycorrhiza 3: 145–154. Agerer R, Waller K (1993b): Tricholoma acerbum. – In: Colour Atlas of Ectomycorrhizae (R. Agerer, ed.) Einhorn Verlag, Schwäbisch Gmünd. p. 82. Agerer R, Danielson RM, Egli S, Ingleby K, Luoma D, Treu R (eds.) (1996-): Descriptions of Ectomycorrhizae. Einhorn-Verlag Eduard Dietenberger, Schwäbisch Gmünd. Aldrich-Wolfe L (2007): Distinct mycorrhizal communities on new and established hosts in a transitional tropical plant community. Ecology 88(3): 559–566.

116

Alexander IJ (2006): Ectomycorrhizas – out of Africa? New Phytol 172: 589–591. Allen MF (1991): The Ecology of Mycorrhizae. Cambridge University Press, Cambridge. Allen MF (2007): Mycorrhizal Fungi: Highways for Water and Nutrients in Arid Soils. Vadose Zone J 6: 291–297. Allen MF, Swenson W, Querejeta JI, Egerton-Warburton LM, Treseder KK (2003): Ecology of mycorrhizae: a conceptual framework for complex interactions among plants and fungi. Ann Rev Phytopathol 41: 271–303. Altekar G, Dwarkadas S, Huelsenbeck JP, Ronquist F (2002): Parallel Metropolis coupled Markov chain Monte Carlo for Bayesian phylogenetic inference. Bioinformatics 20(3): 407–415. Altschul SF, Gish W, Miller W, Myers EW, Lipman DJ (1990): Basic local alignment search tool. J Mol Biol 215: 403–410. Amiet R, Egli S (1991): Die Ektomykorrhiza des Grubigen Milchlings (Lactarius scrobiculatus (Scop.: Fr.) Fr.) an Fichte (Picea abies Karst.). Schweiz Z Forstwes 142: 53–60. Anderson IC, Cairney JWG (2004): Diversity and ecology of soil fungal communities: increased understanding through the application of molecular techniques. Environ Microbiol 6(8): 769–779. Anderson IC, Campbell CD, Prosser JI (2003): Potential bias of fungal 18S rDNA and internal transcribed spacer polymerase chain reaction primers for estimating fungal biodiversity in soil. Environ Microbiol 5(1): 36–47. Anderson IC, Chambers SM, Cairney JWG (1998): Use of molecular methods to estimate the size and distribution of mycelial individuals of the ectomycorrhizal basidiomycete Pisolithus tinctorius. Mycol Res 102(3): 295–300. Azul AM, Agerer R, Freitas H (2006a): “Quercirrhiza ateracusrugosa” + Quercus suber L. Descr Ectomyc 9: 75–79. Azul AM, Agerer R, Freitas H (2006g): "Quercirhiza dendrohyphidiomorpha" + Quercus suber L. Descr Ectomyc 9/10: 87-91. Azul AM, Agerer R, Freitas H (2006d): “Quercirrhiza tomentellocystidiata” + Quercus suber L. Descr Ectomyc 9: 115–119. Azul AM, Agerer R, Freitas H (2006e): “Quercirrhiza tomentelloflexuosa” + Quercus suber L. Descr Ectomyc 9: 121–126. Azul AM, Martín MP, Agerer R, Freitas H (2006b): “Quercirrhiza auraterocystidiata” + Quercus suber L. Descr Ectomyc 9: 81–86. Azul AM, Martín MP, Agerer R, Freitas H (2006c): “Quercirrhiza flavocystidiata” + Quercus suber L. Descr Ectomyc 9: 93–97. Azul AM, Martín MP, Agerer R, Freitas H (2006f): “Quercirrhiza tomentellofuniculosa” + Quercus suber” L. Descr Ectomyc 9: 127–134. Baier R, Ingenhaag J, Blaschke H, Göttlein A, Agerer R (2006): Vertical distribution of an ectomycorrhizal community in upper soil horizons of a young Norway spruce (Picea abies [L.] Karst.) stand of the Bavarian Limestone Alps. Mycorrhiza 16: 197–206. Barker SJ, Tagu D (2000): The roles of auxins ans cytokinins in mycorrhizal symboses. J Plant Growth Regul 19: 144–154. Barker SJ, Tagu D, Delp G (1998): Regulation of root and fungal morphogenesis in mycorrhizal symbioses. Plant Physiol 116: 1201–1207. Bärlocher F (2007): Molecular approaches applied to aquatic hyphomycete. Fungal Biology Reviews 21: 19–24.

117

Barroetavena C, Cazares E, Rajchenberg M (2006): Mycorrhizal fungi of Pseadotsuga menziesii, an introduced tree species in Central Patagonia (Argentina). Nova Hedw 83(1-2): 53–66. Bartha D, Esztó P (2002): Az erdőrezervátumok bemutatása az országos erdőállomány-adattár alapján. – In Horváth F, Borhidi A (szerk.): A hazai erdőrezervátum-kutatás. TermészetBÚVÁR Alapítvány K., Bp. pp. 60–82. Baum C, Makeschin F (2000): Effects of nitrogen and phosphorus fertilization on mycorrhizal formation of two poplar clones (Populus trichocarpa and P. tremula x tremuloides). J Pl Nutr Soil Sci 163: 491–497. Becerra A, Pritsch K, Arrigo N, Palma M, Bartoloni N (2005): Ectomycorrhizal colonization of Alnus acuminata Kunth in northwestern Argentina in relation to season and soil parameters. Ann For Sci 62(4): 325–332. Beenken L (1996b): Inocybe fuscomarginata. In: Colour Atlas of Ectomycorrhizae (R. Agerer, ed.) Einhorn Verlag, Schwäbisch Gmünd. p. 95. Beenken L. (1996a): Inocybe obscurobadia. – In: Colour Atlas of Ectomycorrhizae (R. Agerer, ed.) Einhorn Verlag, Schwäbisch Gmünd. p. 96. Beenken L (1996c): Inocybe terrigena. – In: Colour Atlas of Ectomycorrhizae (R. Agerer, ed.) Einhorn Verlag, Schwäbisch Gmünd. p. 97. Beenken L, Agerer R, Bahnweg G (1996a): Inocybe appendiculata Kühn. + Picea abies (L.) Karst. Descr Ectomyc 1: 35–40. Beenken L, Agerer R, Bahnweg G (1996b): Inocybe obscurobadia (J. Favre) Grund & D. E. Stuntz + Picea abies (L.) Karst. Descr Ectomyc 1: 47–52. Beenken L, Agerer R, Bahnweg G (1996c): Inocybe fuscomarginata Kühn. + Salix spec./Populus nigra L. Descr Ectomyc 1: 41–46. Beenken L, Agerer R, Bahnweg G (1996d): Inocybe terrigena (Fr.) Kuyper + Pinus sylvestris L. Descr Ectomyc 1: 53–58. Bending GD (2007): What are the mechanisms and specificity of mycorrhization helper bacteria? New Phytol 173: 710–713. Berbee ML, Taylor JW (1993): Dating the radiations of the true fungi. Can J Bot 71: 1114–1127. Berbee ML, Taylor JW (2007): Rhynie chert: a window into a lost world of complex plant-fungus interactions. New Phytol 174: 475–479. Bergemann SE, Garbelotto M (2006): High diversity of fungi recovered from the roots of mature tanoak (Lithocarpus densiflorus) in northern California. Can J Bot 84(9): 1380–1394. Bever JD, Westover K, Antonovics J. (1997): Incorporating the soil community into plant population dynamics: The utility of the feedback approach. J Ecol 85: 561–573. Bidartondo MI, Bruns TD (2001): Extreme specificity in epiparasitic Monotropoideae (Ericaceae): widespread phylogenetic and geographical structure. Mol Ecol 10: 2285–2295. Bidartondo MI, Bruns TD (2002): Fine-level mycorrhizal specificity in the Monotropoideae (Ericaceae): specificity for fungal species groups. Molec Ecol 11: 557–569. Bidartondo MI, Read DJ (2008): Fungal specificity bottlenecks during orchid germination and development. Mol Ecol 17(16): 3707–3716. Bidartondo MI, Burghardt B, Gebauer G, Bruns TD, Read DJ (2004): Changing partners in the dark: isotopic and molecular evidence of ectomycorrhizal liaisons between forest orchids and trees. Proc R Soc Lond B Biol Sci 271: 1799–1806.

118

Bidartondo MI, Kretzer AM, Pine EM, Bruns TD (2000): High root concentration and uneven ectomycorrhizal diversity near Sarcodes sanguinea (Ericaceae): a cheater that stimulates its victims? Am J Bot 87: 1783–1788. Binder M, Hibbett DS, Larsson K-H, Larsson E, Langer E, Langer G (2005): The phylogenetic distribution of resupinate forms across the major clades of mushroom-forming fungi (Homobasidiomycetes). Syst Biodivers 3: 113–157. Blackwell M (2000): Terrestrial life – Fungal from the Start? Science 289: 1884–1885. Blaschke H (1987): Vorkommen und Charakterisierung der Ektomykorrhizaassoziation Tuber puberulum mit Picea abies. Z Mykol 53: 283–288. Blaschke H (1988): Tuber puberulum. – In: Colour Atlas of Ectomycorrhizae (R. Agerer, ed.) Einhorn Verlag, Schwäbisch Gmünd. p. 22. Bonet JA, Pukkala T, Fischer CR, Palahi M, de Aragon JM, Colinas C (2008): Empirical models for predicting the production of wild mushrooms in Scots pine (Pinus sylvestris L.) forests in the Central Pyrenees. Ann For Sci 65(2): 206. Bonfante P (2001): At the interface between mycorrhizal fungi and plants: the structural organization of cell wall, plasma membrane and cytoskeleton. – In: Hock B (ed): The Mycota IX – Fungal asociations. Springer, Berlin Heidelberg new York, pp. 45–62. Borneman J, Hartin RJ (2000): PCR primers that amplify fungal rRNA genes from environmental samples. Appl Environ Microb 66(10): 4356–4360. Bos D, Posada D (2005): Using models of nucleotide evolution to build phylogenetic trees. Dev Comp Immunol 29: 211–227. Boudier E (1876): Du parasitisme probable de quelques espèces du genre Elaphomyces et de la recherché de ces Tubéracées. Bull Soc Bot Fr 23: 115–119. Boullard B, Lemoigne Y (1971): Les champignons endophytes du Rhynia gwynne-vaughanii K. & L. Étude morphologique et déductions sur leur biologie. Botaniste 54: 49–89. Boxman AW, Blanck K, Brandrud T-E, Emmett BA, Gundersen P, Hogervorst RF, Kjonaas OJ, Persson H, Timmermann V (1998): Vegetation and soil biota response to experimentally-changed nitrogen inputs in coniferous forest ecosystems of the NITREX project. Forest Ecol Manag 101: 65–79. Bradbury SM, Danielson RM, Visser S (1998): Ectomycorrhizas of regenerating stands of lodgepole pine (Pinus contorta). Can J Bot 76: 218–227. Brand F (1991): Ektomykorrhizen an Fagus sylvatica. Characterisierung und Identifizierung, ökologische Kennzeichnung und unsterile Kultivierung. Libri Botanici 2. IHW-Verlag. Brand F (1992): Mixed associations of fungi in ectomycorrhizal roots. – In: Read, D.J., Lewis, D.H., Fitter, A.H., Alexander, L.J. (eds.): Mycorrhizas in Ecosystems. CAB International: Wallingford, UK pp. 142–147. Brand F, Agerer R (1986): Studien an Ektomykorrhizen. VIII. Die Mykorrhizen von Lactarius subdulcis, Lactarius vellereus und Lactarius amethystina an Buche. Z Mykol 52: 287–320. Brandrud TE, Timmermann V (1998): Ectomycorrhizal fungi in the NITREX site at Gjårdsjön, Sweden; below and above-ground responses to experimentally-changed nitrogen inputs 19901995. Forest Ecol Manag 101: 207–214. Brearley FQ (2006): Differences in the growth and ectomycorrhizal community Dryobalanops lanceolata (Dipterocarpaceae) seedlings ultramafic and non-ultramafic soils. Soil Biol Biochem 38: 3407–3410. Bridge P (2002): The history and application of molecular mycology. Mycologist 16(3): 90–99. Brundrett MC (2002): Coevolution of roots and mycorrhizas of land plants. New Phytol 154: 275–304.

119

Brundrett MC (2004): Diversity and classification of mycorrhizal associations. Biol Rev 79: 473–495. Brundrett MC, Abbott LK, Jasper DA (1999): Glomalean mycorrhizal fungi from tropical Australia I. Comparison of the effectiveness and specificity of different isolation procedures. Mycorrhiza 8: 305–314. Bruns TD (1995): Thoughts on the processes that maintain local speciess diversity of ectomycorrhizal fungi. Plant Soil 170: 63–73. Bruns TD, Shefferson RP (2004): Evolutionary studies of ectomycorrhizal fungi: recent advances and future directions. Can J Bot 82: 1122–1132. Bruns TD, Arnold AE, Hughes KW (2008): Fungal networks made of humans: UNITE, FESIN, and frontiers in fungal ecology. New Phytol 177(3): 586–588. Bruns TD, Szaro TM, Gardes M, Cullings KW, Pan JJ, Taylor DL, Horton TR, Kretzer A, Garbelotto M, Li Y (1998): A sequence database for the identification of ectomycorrhizal basidiomycetes by phylogenetic analysis. Mol Ecol 7: 257–272. Bucher M (2007): Functional biology of plant phosphate uptake at root and mycorrhiza interfaces. New Phytol 173: 11–26. Buée M, Courty P-E, Mignot D, Garbaye J (2007): Soil niche effect on species diversity and catabolic activities in an ectomycorrhizal fungal community. Soil Biol Biochem 39: 1947–1955. Buée M, Vairelles D, Garbaye J (2005): Year-round monitoring of diversity and potential metabolic activity of the ectomycorrhizal community in a beech (Fagus silvatica) forest subjected to two thinning regimes. Mycorrhiza 15(4): 235–245. Burford EP, Kierans M, Gadd GM (2003): Geomycology: fungi in mineral substrata. Mycologist 17(3): 98–107. Burke DJ, Kendall J. Martin KJ, Paul T, Rygiewicz PT, Topa MA (2005): Ectomycorrhizal fungi identification in single and pooled root samples: terminal restriction fragment length polymorphism (TRFLP) and morphotyping compared. Soil Biol Biochem 37: 1683–1694. Buscot F, Munch JC, Charcosset JY, Gardes M, Nehls U, Hampp R (2000): Recent advances in exploring physiology and biodiversity of ectomycorrhizas highlight the functioning of these symbioses in ecosystems. FEMS Microbiol Rev 24: 601–614. Caetano-Anollés G, Bassam BJ, Gresshoff PM (1991): DNA amplification fingerprinting using very short arbitrary oligonucleotide primers. Biot/Technology 9: 553–557. Cairney JWG (2000): Evolution of mycorrhiza systems. Naturwissenschaften 87: 467–475. Cairney JWG, Chambers SM (1997): Interactions between Pisolithus tinctorius and its hosts: a review of current knowledge. Mycorrhiza 7: 117–131. Cairney JWG, Chambers SM (eds) (1999): Ectomycorrhizal fungi: key genera in profile. Springer: Berlin, Heidelberg, New York, Barcelona, Hong Kong, London, Milan, Paris, Singapore, Tokyo. Carbone I, Anderson JB, Kohn LM (1999): Patterns of descent in clonal lineages and their multilocus fingerprints are resolved with combined gene genealogies. Evolution 53(1): 11–21. Carfrae JA, Skene KR, Sheppard LJ, Ingleby K, Crossley A (2006): Effects of nitrogen with and without acidified sulphur on an ectomycorrhizal community in a Sitka spruce (Picea sitchensis Bong. Carr) forest. Environ Pollut 141(1): 131–138. Carlile MJ, Watkinson SC (1994): The Fungi. Academic Press Ltd., San Diego. Cavalli-Sforza LL, Edwards AWF (1967): Phylogenetic analysis: models and estimation procedures. Evolution 32: 550–570.

120

Cázares E, Smith JE (1996): Occurrence of vesicular–arbuscular mycorrhizae in Pseudotsuga menziesii and Tsuga heterophylla seedlings grown in Oregon Coast Range soils. Mycorrhiza 6: 65–67. Cázares E, García J, Castillo J, Trappe JM (1992): Hypogeous fungi from northern Mexico Mycologia 84(3): 341–359. Chalot M, Stewart GR, Brun A, Martin F, Botton B (1991): Ammonium assimilation by spruceHebeloma sp. mycorrhizas. New Phytol 119: 541–550. Chen L-H, Yan W, Xu Y (2007): Identification and preliminary analysis of the genetic diversity of Cenococcum geophilum Fr. Agr Sci China 6(8): 956–963. Chen YL, Dell B, Brundrett MC (2000): Effects of ectomycorrhizas and vesicular–arbuscular mycorrhizas, alone or in competition, on root colonization and growth of Eucalyptus globulus and E. urophylla. New Phytol 146: 545–556. Chilvers GA (1968a): Some distinctive types of eucalypt mycorrhiza. Aust J Bot 16: 49–70. Chilvers GA (1968b): Low-power electron microscopy of the root cap region of Eucalypt mycorrhizas. New Phytol 67: 663–665. Cho J-C-C, Tiedje JM (2001): Bacterial species determination from DNA-DNA hybridization by using genome fragments and DNA microarrays. Appl Environ Microb 67(8): 3677–3682. Classen AT, Boyle SI, Haskins KE, Overby ST, Hart SC (2003): Community-level physiological profiles of bacteria and fungi: plate type and incubation temperature influences on contrasting soils. FEMS Microbiol Ecol 44: 319–328. Clemmensen KE, Michelsen A (2006): Integrated long-term responses of an arctic-alpine willow and associated ectomycorrhizal fungi to an altered environment. Can J Bot 84(5): 831–843. Cline ET, Ammirati JF, Edmonds RL (2005): Does proximity to mature trees influence ectomycorrhizal fungus communities of Douglas-fir seedlings? New Phytol 166: 993–1009. Cole JR, Chai B, Marsh TL, Farris RJ, Wang Q, Kulam SA, Chandra S, McGarrell DM, Schmidt TM, Garrity GM, Tiedje JM (2003): The Ribosomal Database Project (RDP-II): previewing a new autoaligner that allows regular updates and the new prokaryotic taxonomy. Nucleic Acids Res 31(1): 442–443. Coleman DC (2008): From peds to paradoxes: Linkages between soil biota and their influences on ecological processes. Soil Biol Biochem 40: 271–289. Colgan W, Trappe JM (2004): NATS truffle and truffle-like fungi 10: Pachyphloeus thysellii sp. nov. (Peizaceae, Pezizomycotina). Mycotaxon 90(2): 281–284. Comandini O, Pacioni G (1998): Two new ectomycorrhizal types on silver fir (Abies alba): Lactarius britannicus and Tricholoma bufonium. ICOM II., Uppsala. Comandini O, Contu M, Rinaldi AC (2006): An overview of Cistus ectomycorrhizal fungi. Mycorrhiza 16: 381–395. Comandini O, Haug I, Rinaldi AC, Kuyper TW (2004): Uniting Tricholoma sulphureum and T. bufonium. Mycol Res 108: 1162–1171. Corner EJH (1968): A monograph of Thelephora (Basidiomycetes). Beih. Nova Hedw 27: 1–110. Courty PE, Breda N, Garbaye J (2007): Relation between oak tree phenology and the secretion of organic matter degrading enzymes by Lactarius quietus ectomycorrhizas before and during bud break. Soil Biol Biochem 39(7): 1655–1663. Courty PE, Franc A, Pierrat JC, Garbaye J (2008): Temporal changes in the ectomycorrhizal community in two soil horizons of a temperate oak forest. Appl Environ Microbiol 74(18): 5792– 5801.

121

Courty PE, Pritsch K, Schloter M, Hartmann A, Garbaye J (2005): Activity profiling of ectomycorrhiza communities in two forest soils using multiple enzymatic tests. New Phytol 167: 309–319. Cripps C. (1997a): Inocybe lacera (Fr.: Fr.) Kumm. + Populus tremuloides Michx. Descr Ectomyc 2: 19–23. Cripps C. (1997b): Tricholoma scalpturatum (Fr.) Quél. + Populus tremuloides Michx. Descr Ectomyc 2: 73-78 Curlevski NJA, Chambers SM, Anderson IC, Cairney JWG (2009): Identical genotypes of an ericoid mycorrhiza-forming fungus occur in roots of Epacris pulchella (Ericaceae) and Leptospermum polygalifolium (Myrtaceae) in an Australian sclerophyll forest. FEMS Microbiol Ecol 67(3): 411– 420. Dahlberg A (2001): Community ecology of ectomycorrhizal fungi: an advancing interdisciplinary field. New Phytol 150: 555–562. Dahlberg A, Jonsson L, Nylund J-E (1997): Species diversity and distribution of biomass above and below ground among ectomycorrhizal fungi in an old-growth Norway spruce forest in south Sweden. Can J Bot 75: 1323–1335. Danielson RM (1982): Taxonomic affinities and criteria for identification of the common ectendomycorrhizal symbiont of pines. Can J Bot 60: 7–18. Danielson RM (1984a): Ectomycorrhiza formation by the operculate discomycete Sphaerosphorella brunnea (Pezizales). Mycologia 76(3): 454–461. Danielson RM (1984b): Ectomycorrhizal associations in jack pine stands in northeastern Alberta. Can J Bot 62: 932–939. Davies FT, Svenson SE, Cole JC, Phavaphutanon L, Duray SA, Olalde-Portugal V, Meier CE, Bo SH (1996): Non-nutritional stress acclimation of mycorrhizal woody plants exposed to drought. Tree Physiol 16: 985–993. De Bary A (1879): Die Erscheinung der Symbiose. Tübner, Strassbourg. De Boer W, Folman LB, Summerbell RC, Boddy L (2005): Living in a fungal world: impact of fungi on soil bacterial niche development. FEMS Microb Rev 29: 795–811. De Román M, Agerer R, De Miguel A (2002a): “Quercirhiza cumulosa” + Quercus ilex L. subsp. ballota (Desf.) Samp. Descr Ectomyc 6: 13–18. De Román M, Agerer R, De Miguel A (2002b): “Quercirhiza stellata” + Quercus ilex L. ssp. ballota (Desf.) Samp. Descr Ectomyc 6: 19–24. De Román M, Claveria V, De Miguel AM (2005): A revision of the descriptions of ectomycorrhizas published since 1961. Mycol Res 109(10): 1063–1104. Dearnaley JDW (2007): Further advances in orchid mycorrhizal research. Mycorrhiza 17: 475–486. Debaud JC, Marmeisse R, Gay G (1999): Intraspecific Genetic Variation and Populations of Ectomycorrhizal Fungi. – In: Varma, A., Hock, B. (eds.): Mycorrhiza. (2nd edn.) Springer-Verlag, Berlin, Heidelberg. pp. 75–110. Debrauwere H, Gendrel CG, Lechat S, Dutreix M (1997): Differences and similarities between various tandem repeat sequences: Minisatellites and microsatellites. Biochimie 79: 577–586. Di Pietro M, Churin J-L, Garbaye J (2007): Differential ability of ectomycorrhizas to survive drying. Mycorrhiza 17: 547–550. Dickie IA, FitzJohn RG (2007): Using terminal restriction fragment length polymorphism (T-RFLP) to identify mycorrhizal fungi: a methods review. Mycorrhiza 17: 259–270.

122

Dickie IA, Guza RC, Krazewski SE, Reich PB (2004): Shared ectomycorrhizal fungi between a herbaceous perennial (Helianthemum bicknellii) and oak (Quercus) seedlings. New Phytol 164: 375–382. Dissing H, Pfister DH (1981): Scabropezia, a new genus of Pezizaceae (Pezizales). Nord J Bot 1:1021–108 Donk MA (1964): A conspectus of the families of the Aphyllophorales. Persoonia 3: 199–324. Doudrick RL, Raffle VL, Nelson CD, Furnier GR (1995): Genetic analysis of homokaryons from a basidiome of Laccaria bicolor using random amplified polymorphic DNA (RAPD) markers. Mycol Res 99(11): 13611–1366. Douglas RB, Parker TV, Cullings KW (2005): Belowground ectomycorrhizal community structure of mature lodgepole pine and mixed conifer stands in Yellowstone National Park. For Ecol Manag 208: 303–317. Dowling TE, Moritz C, Palmer JD, Rieseberg LH (1996): Nucleic Acids III.: Analysis of Fragments and Restriction Sites – In: Hillis, D.M., Moritz, C., Mable, B.K. (eds.): Molecular Systematics. Sinauer Associates Inc., Sunderland, Massachusetts. pp. 2491–320. Dučić T, Berthold D, Langenfeld-Heyser R, Beese F, Polle A (2009): Mycorrhizal communities in relation to biomass production and nutrient use efficiency in two varieties of Douglas fir (Pseudotsuga menziesii var. menziesii and var. glauca) in different forest soils. Soil Biol Biochem 41: 7421–753. Duckett JG, Read DJ (1995): Ericoid mycorrhizas and rhizoid–ascomycete associations in liverworts share the same mycobiont: isolation of the partners and resynthesis of the associations in vitro. New Phytol 129: 439–447. Duncan T, Phillips RB, Wagner WH (1980): A comparison of branching diagrams derived by various phenetic and cladistic methods. Syst Bot 5: 2641–293. Dunham SM, O'dell TE, Molina R (2003): Analysis of nrDNA sequences and microsatellite allele frequencies reveals a cryptic chanterelle species Cantharellus cascadensis sp. nov. from the American Pacific Northwest. Mycol Res 107(10): 11631–1177. Dutech C, Enjalbert J, Fournier E, Delmotte F, Barrès B, Carlier J, Tharreau D, Giraud T (2007): Challenges of microsatellite isolation in fungi. Fungal Genet Biol 44(10): 9331–949. Eberhardt U (2000): Molekulare Analysen zur Verwandtschaft der agaricoiden Russulaceen im Vergleich mit Mykorrhiza- und Fruchtkörpermerkmalen. Dissertation. Göttingen. Eberhardt U, Oberwinkler F, Verbeken A, Rinaldi AC, Pacioni G, Comandini O (2000): Lactarius ectomycorrhizae on Abies alba: morphological description, molecular characterization, and taxonomic remarks. Mycologia 92: 8601–873. Egger KN (1995): Molecular analysis of ectomycorrhizal fungal communities. Can J Bot 73 (S1): S14151–S1422. Egger KN (1996): Molecular systematics of E-strain mycorrhizal fungi: Wilcoxina and its relationship to Tricharina (Pezizales). Can J Bot 74: 773–779. Egger KN (2006): The surprising diversity of ascomycetous mycorrhizas. New Phytol 170: 4211–423. Egger KN, Hibbett DS (2004): The evolutionary implications of exploitation in mycorrhizas. Can J Bot 82(8): 11101–1121. Egger KN, Paden JW (1986): Biotrophic associations between lodgepole pine seedlings and post-fire ascomycetes (Pezizales) in monoxenic culture. Can J Bot 64: 27191–2725. Egli S, Ayer F, Peter M, Schneider B (2001): Arcangeliella borziana Cavara + Picea abies (L.) Karst. Descr Ectomyc 5: 91–14.

123

Ekblad A, Huss-Daxell K (1995): Nitrogen fixation by Alnus incana and nitrogen transfer from A. incana to Pinus sylvestris influenced by macronutrients and ectomycorrhiza. New Phytol 131: 4531–459 Eriksson OE, Hawksworth DL (1993): Outline of the Ascomycetes – 1993. Syst Ascom 12: 51–257. Erős-Honti Zs, Jakucs E, Kovács MG (2008): “Helianthemirhiza ochraceo-brunnescens” + Helianthemum canum (L.) Baumg. Descr Ectomyc 11/12: 711–75. Fairon-Demaret M, Steurbaut E, Damblon F, Dupuis C, Smith T, Gerrienne P (2003): The in situ Glyptostroboxylon forest of Hoegaarden (Belgium) at the Initial Eocene Thermal Maximum (55 Ma). Rev Paleontol Palynol 126: 103–129. Fassi B, Fontana A, Trappe JM (1969): Ectomycorrhizae formed by Endogone lactiflua with species of Pinus and Pseudotsuga. Mycologia 61: 412–414. Fay DA, Mitchell DT (1999): A preliminary study of the mycorrhizal associations of tree seedlings growing on mine spoil at Avoca, Co. Wicklow. Biol Environ 99B: 19–26. Felsenstein J (1983): Distance methods for inferring phylogenies: a justification. Evolution 38: 16–24. Felsenstein J (1985): Confidence limits on phylogenies: an approach using the bootstrap. Evolution 39: 783–791. Felsenstein J (2004): Inferring Phylogenies. Sinauer Associates, Sunderland, Mass. Féral J-P (2002): How useful are the genetic markers in attempts to understand and manage marine biodiversity? J Exp Mar Biol Ecol 268: 121–145. Fisher MM, Triplett EW (1999): Automated approach for ribosomal intergenic spacer analysis of microbial diversity and its application to freshwater bacterial communities. Appl Environ Microbiol 65: 4630–4636. Fitch WM, Margoliash E (1967): Construction of phylogenetic trees. Science 155: 279–284. Fitter AH, Moyersoen B (1996): Evolutionary trends in root-microbe symbioses. Phil Trans R Soc Lond 351: 1367–1375. Fogel R, States J (2002): Materials for a hypogeous mycoflora of the great basin and adjacent Cordilleras of the Western United States. VIII: Pachyphloeus lateritius sp. nov. and Cazia quericola sp. nov. (Ascomycota, Pezizales) Mycotaxon 81: 83–89. Forney LJ, Zhou X, Brown CJ (2004): Molecular microbial ecology: land of the one-eyed king. Curr Opin Microbiol 7: 210–220. Frank AB, Trappe JM (2005): On the nutritional dependence of certain trees on root symbiosis with belowground fungi (an English translation of A.B. Frank's classic paper of 1885). Mycorrhiza. 15(4): 267–75. Frank JL, Southworth D, Trappe JM (2006): NATS truffle and truffle-like fungi 14: Pachyphloeus austro-oregonensis, a new species from southern Oregon 98: 253–259. Frey-Klett P, Garbaye J, Tarkka M (2007): The mycorrhiza helper bacteria revisited. New Phytol 176: 22–36. Frisvad JC, Andersen B, Thrane U (2008): The use of secondary metabolite profiling in chemotaxonomy of filamentous fungi. Mycol Res 112: 231–240. Fujimura KE, Smith JE, Horton TR, Weber NS, Spatafora JW (2005): Pezizalean mycorrhizas and sporocarps in ponderosa pine (Pinus ponderosa) after prescribed fires in eastern Oregon, USA. Mycorrhiza 15: 79–86. Gardes M, Bruns TD (1993): ITS primers with enhanced specificity for basidiomycetes – application to the identification of mycorrhizae and rusts. Mol Ecol 2: 113–118.

124

Gardes M, Bruns TD (1996): Community structure of ectomycorrhizal fungi in a Pinus muricata forest: above- and below-ground views. Can J Bot 74: 1572–1583. Gardes M, White TJ, Fortin JA, Bruns TD, Taylor JW (1991): Identification of indigenous and introduced symbiotic fungi in ectomycorrhizae by amplification of nuclear and mitochondrial ribosomal DNA. Can J Bot 69: 180–190. Gargas A, Depriest PT, Grube M, Tehler A (1995): Multiple origins of lichen symbioses in fungi suggested by SSU rDNA phylogeny. Science 268: 1492–1495. Garland JL, Mills AL (1991): Classification and characterization of heterotrophic microbial communities on the basis of patterns of community-level sole-carbon-source utilization. Appl Environ Microb 57(8): 2351–2359. Gay G, Normand L, Marmeisse R, Sotta B, Debaud JC (1994): Auxin overproducer mutants of Hebeloma cylindrosporum Romagnesi have increased mycorrhizal activity. New Phytol 128: 645– 657. Gea L, Normand L, Vian B, Gay G (1994): Structural aspects of ectomycorrhiza of Pinus pinaster (Ait.) Sol. formed by an IAA-overproducer mutant of Hebeloma cylindrosporum Romagnési. New Phytol 128(4): 659–670. Gebhardt S, Neubert K, Wöllecke J, Münzenberger B, Hüttl RF (2007): Ectomycorrhiza communities of red oak (Quercus rubra L.) of different age in the Lusatian lignite mining district, East Germany. Mycorrhiza 17: 279–290. Gehring CA, Theimer TC, Whitman TG, Keim P (1998): Ectomycorrhizal fungal community structure of pinyon pined growing in two environmental extremes. Ecology 79(5): 1562–1572. Gelsomino A, Keijzer-Wolters AC, Cacco G, van Elsas JD (1999): Assessment of bacterial community structure in soil by polymerase chain reaction and denaturing gradient gel electrophoresis. J Microbiol Methods 38: 1–15. Genney DR, Anderson IC, Alexander IJ (2006): Fine-scale distribution of pine ectomycorrhizas and their extramatrical mycelium. New Phytol 170: 381–390. Gentry TJ, Wickham GS, Schadt CW, He Z, Zhou J (2006): Microarray applications in microbial ecology research. Microb Ecol 52: 159–175. Gibelli G (1883): Nuovi studii sulla malattia del castagno detta dell’inchiostro. Mem Accad Sci Ist Bologna 4: 287–314. Gilroy S, Jones DL (2000): Through form to function: root hair development and nutrient uptake. Trends Plant Sci 5: 56–60. Giovannetti M, Avio L, Fortuna P, Pellegrino E, Sbrana C, Strani P (2006): At the root of the wood wide web: self recognition and nonself incompatibility in mycorrhizal networks. Plant Signalling and Behaviour 1(1): 1–5. Glen M, Bougher NL, Colquhoun IJ, Vlahos S, Loneragan WA, O’Brien PA, Hardy GEStJ (2008): Ectomycorrhizal fungal communities of rehabilitated bauxite mines and adjacent, natural jarrah forest in Western Australia. Forest Ecol Manag 255: 214–225. Glen M, Tommerup IC, Bougher NL, O’Brien PA (2002): Are Sebacinaceae common and widespread ectomycorrhizal associates of Eucalyptus species in Australian forests? Mycorrhiza 12: 243–247. Glen M, Tommerup IC, Bougher NL, O'Brien PA (2001a): Interspecific and intraspecific variation of ectomycorrhizal fungi associated with Eucalyptus ecosystems as revealed by ribosomal DNA PCR-RFLP. Mycol Res 105(7): 843–858. Glen M, Tommerup IC, Bougher NL, O'Brien PA (2001b): Specificity, sensitivity and discrimination of primers for PCR-RFLP of larger basidiomycetes and their applicability to identification of ectomycorrhizal fungi in Eucalyptus forests and plantations. Mycol Res 105(2): 138–149.

125

Gogala N (1991): Regulation of mycorrhizal infection by hormonal factors produced by hosts and fungi. Experimentia 47: 331–339. Gomes EA, de Abreu LM, Borges AC, de Araújo EF (2000): ITS sequences and mitochondrial DNA polymorphism in Pisolithus isolates. Mycol Res 104(8): 911–918. Goodman DM, Durall DM, Trofymow JA, Berch SM (eds.) (1996-98): A Manual of Concise Descriptions of North American Ectomycorrhizae. Mycologue Publications and Canada-B.C. Forest Resource Development Agreement, Canadian Forest Service, Victoria, B.C. Graham JH, Hodge NC, Morton JB (1995): Fatty acid methyl ester profiles for characterization of Glomalean fungi and their endomycorrhizae. Appl Env Microbiol 61(1): 58–64. Grebenc T, Kraigher H (2007): Types of ectomycorrhiza of mature beech and spruce at ozonefumigated and control forest plots. Environ Monit Assess 128(1-3): 47–59. Gronbach E (1988): Characterisierung und Identifizierung von Ektomykorrhizen in einem Fichtenbestand mit Untersuchungen zur Merkmalsvariabilität in sauer beregneten Flächen. Bibl Mycol 125: 35–45. Grunze N, Willmann M, Nehls U (2004): The impact of ectomycorrhiza formation on monosaccharide transporter gene expression in poplar roots. New Phytol 164: 147–155. Guarro J, Gené J, Stchigel AM (1999): Developments in fungal taxonomy. Clinical Microbiol Rev 12: 454–500. Guerin-Laguette A, Montembault S, Brunel B, Mousain D (1996): Study of the diversity of the ribosomal DNA of ectomycorrhizal Lactarius species associated with pines, using PCR-RFLP analysis. ICOM I, Berkeley, California. Guerin-Laguette A, Plassard C, Mousain D (2000): Effects of experimental conditions on mycorrhizal relationships between Pinus sylvestris and Lactarius deliciosus and unprecedented fruit-body formation of the Saffron milk cap under controlled soilless conditions. Can J Microbiol 46: 790– 799. Guindon S, Gascuel O (2003): A simple, fast and accurate algorithm to estimate large phylogenies by maximum likelihood. Syst Biol 52(5): 696–704. Haberer K, Grebenc T, Alexou M, Gessler A, Kraigher H, Rennenberg H (2007): Effects of long-term free-air ozone fumigation on δ15N and total N in Fagus sylvatica and associated mycorrhizal fungi. Plant Biol 9: 242–252. Halász K, Bratek Z, Szegő D, Rudnóy S, Rácz I, Lasztity D, Trappe JM (2005): Tests of species concepts of the small, white, European group of Tuber spp. based on morphology and rDNA ITS sequences with special reference to Tuber rapaeodorum. Mycol Prog 4(4): 281–290. Hansen K, Læssøe T, Pfister DH (2001): Phylogenetics of the Pezizaceae, with an emphasis on Peziza. Mycologia 93: 958–990. Hansen K, LoBuglio KF, Pfister DH (2005) Evolutionary relationships of the cup-fungus genus Peziza and Pezizaceae inferred from multiple nuclear genes: RPB2, β-tublin, and LSU rDNA. Mol Phylogenet Evol 36: 1–23. Hansen K, Pfister DH (2006): Systematics of the Pezizomycetes — the operculate discomycetes. Mycologia 98(6): 1029–1040. Harley JL, Harley EL (1987a): A check-list of mycorrhiza in the British flora. New Phytol 105: 1–102. Harley JL, Harley EL (1987b): A check-list of mycorrhiza in the British flora – Addenda, Errata And Index New Phytol 107: 741–749. Harrington TJ, Mitchell DT (2002): Characterization of Dryas octopeteala ectomycorrhizas of limestone karst vegetation, western Ireland. Can J Bot 80: 970–982.

126

Hart MM, Reader RJ, Klironomos JN (2003): Plant coexistence mediated by arbuscular mycorrhizal fungi. TREE 18(8): 418–423. Haselwandter K, Read DJ (1980): Fungal associations of roots of dominant and sub-dominant plants in high-alpine vegetation systems with special reference to mycorrhiza. Oecologia 45: 57–62. Haug I (2002): Identification of Picea-ectomycorrhizae by comparing DNA sequences. Mycol Prog 1: 167–178. Haug I, Pritsch K (1992): Ectomycorrhizal types of spruce (Picea abies (L.) Karst.) in the Black Forest. A microscopical atlas. Kernforschungszentrum Karlsruhe, PEF-Ber, pp 1–89. Haug I, Weiss M, Homeier J, Oberwinkler F, Kottke I (2005): Russulaceae and Thelephoraceae form ectomycorrhizas with members of the Nyctaginaceae (Caryophyllales) in the tropical mountain rain forest of southern Ecuador. New Phytol 165: 923–936. He X-H, Critchley C, Bledsoe C (2003): Nitrogen transfer within and between plants through common mycorrhizal networks (CMNs). Crit Rev Plant Sci 22(6): 531–567. Healy RA, Bonito G, Guevara G (2009): The truffle genus Pachyphloeus in the U.S. and Mexico: phylogenetic analysis and a new species. Mycotaxon 107: 61–71. Heilmann-Clausen J, Verbeken A, Vesterholt J (1998): The genus Lactarius. Fungi of Northern Europe. Swampetryk: Mundelstrup, DK. Henkel TW, Aime MC, Miller SI (2000): Systematics of pleurotoid Russulaceae from Guyana and Japan, with notes on their ectomycorrhizal status. Mycologia 92: 1119–1132. Henkel TW, Meszaros R, Aime MC és Kennedy A (2005): New Clavulina species from the Pakaraima Mountains of Guyana. Mycol Prog 4: 343–350. Henkel TW, Terborgh J és Vilgalys RJ (2002): Ectomycorrhizal fungi and their leguminous hosts in the Pakaraima Mountains of Guyana. Mycol Res 106(5): 515–531. Henrion B, Le Tacon F, Martin F (1992): Rapid identification of genetic variation of ectomycorrhizal fungi by amplification of ribosomal RNA genes. New Phytol 122: 289–298. Herrmann S, Munch J-C, Buscot F (1998): A gnotobiotic culture system with oak microcuttings to study specific effects of mycobionts on plant morphology before, and in the early phase of, ectomycorrhiza formation by Paxillus involutus and Piloderma croceum. New Phytol 138: 203– 212. Herrmann S, Oelmüller R, Buscot F (2004): Manipulation of the onset of ectomycorrhiza formation by indole-3-acetic acid, activated charcoal or relative humidity in the association between oak microcuttings and Piloderma croceum: influence on plant development and photosynthesis. J Plant Physiol 161: 509–517. Hibbett DS (2006): A phylogenetic overview of the Agaricomycotina. Mycologia 98(6): 917–925. Hibbett DS, Thorn RG (2001): Basidiomycota: Homobasidiomycetes. – In: McLaughlin DJ, McLaughlin EG, Lemke PA (eds): The Mycota VII, part B. Springer, Berlin Heidelberg new York, pp. 121–168. Hibbett DS, Binder M, Bischoff JF, Blackwell M, Cannon PF, Eriksson OE, Huhndorf S, James T, Kirk PM, Cking RL, Lumbsch HT, Lutzoni F, Matheny PB, Mclaughlin DJ, Powell MJ, Redhead S, Schoch CL, Spatafora JW, Stalpers JA, Vilgalys R, Aime MC, Aptroot A, Bauer R, Begerow D, Benny GL, Castlebury LA, Crous PW, Dai YC, Gams W, Geiser DM, Griffith GW, Gueidan C, Hawksworth DL, Hestmark G, Hosaka K, Humber RA, Hyde KD, Ironside JE, Köljalg U, Kurtzman CP, Larsson K-H, Lichtwardt R, Longcore J, Dlikowska JM, Miller A, Moncalvo J-M,

127

Mozley-Standridge S, Oberwinkler F, Parmasto E, Reeb V, Rogers JD, Roux C, Ryvarden L, Sampaio JP, Schüßler A, J Sugiyama J, Thorn RG, Tibell L, Untereiner WA, Walker C, Wang Z, Weir A, Weiss M, White MM, Winka K, Yao Y-J, Zhang N (2007): A higher-level phylogenetic classification of the fungi. Mycol Res 111: 509–547. Hibbett DS, Binder M, Bischoff JF, Blackwell M, Cannon PF, Eriksson OE et al (2005) Douglas-fir ectomycorrhizae in 40-and 400-year-old stands: mycobiont availability to late successional western hemlock. Mycorrhiza 15: 393–403. Hibbett, DS, Gilbert L-B, Donoghue MJ (2000): Evolutionary instability of ectomycorrhizal symbioses in basidiomycetes. Nature 407: 506–508. Higuchi R, Dollinger G, Walsh PS, Griffith R (1992): Simultaneous amplification and detection of specific DNA sequences. Biotechnology 10: 413–417. Higuchi R, Fockler C, Dollinger G, Watson R (1993): Kinetic PCR analysis: Real-time monitoring of DNA amplifi cation reactions. Biotechnology 11: 1026–1030. Hillis DM, Mable BK, Larson A, Davis SK, Zimmer EA (1996): Nucleic Acids IV: Sequencing and Cloning. – In: Hillis DM, Moritz C, Mable BK (eds.): Molecular Systematics. Sinauer Associates Inc., Sunderland, Massachusetts. pp. 321–381. Hobbie EA (2006): Carbon allocation to ectomycorrhizal fungi correlates with belowground allocation in culture studies. Ecology 87(3): 563–569. Hoeksema JD (1999): Investigating the disparity in host specificity between AM and EM fungi: lessons from theory and better-studied systems. OIKOS 84(2): 327–332. Hoffland E, Kuyper TW, Wallander H, Plassard C, Gorbushina AA, Haselwandter K, Holmström S, Landeweert R, Lundström US, Rosling A, Sen R, Smits MM, van Hees PAW, van Breemen N (2004): The role of fungi in weat. Front Ecol Environ 2(5): 258–264. Holben WE, Harris D (1995): DNA-based monitoring of total bacterial community structure in environmental samples. Mol Ecol 4: 627–631. Horan DP, Chilvers GA, Lapeyrie FF (1988): Time sequence of the infection process in eucalypt ectomycorrhizas. New Phytol 109: 451–458. Hortal S, Pera J, Galipienso L, Parladé J (2006): Molecular identification of the edible ectomycorrhizal fungus Lactarius deliciosus in the symbiotic and extraradical mycelium stages. J Biotech 126(2): 123–134. Horton TR, Bruns TD (2001): The molecular revolution in ectomycorrhizal ecology: peeking into the black-box. Mol Ecol 10: 1855–1871. Hrynkiewicz K, Haug I, Baum C (2008): Ectomycorrhizal community structure under willows at former ore mining sites. Eur J Soil Biol 44(1): 37–44. Hudson HJ (1986): Fungal Biology. Edward Arnold, Baltimore, Maryland. Huelsenbeck JP (2000): Likelihood-Based Inference of Phylogeny. Marine biological laboratory workshop on molecular evolution: Lectures. Huelsenbeck JP, Crandall KA (1997): Phylogenetic estimation and hypothesis testing using maximum likelihood. Annu Rev Ecol Syst 28: 437–466. Huelsenbeck JP, Larget B, Miller RE, Ronquist F (2002): Potential applications and pitfalls of Bayesian inference of phylogeny. Syst Biol 51(5): 673–688. Huelsenbeck JP, Ronquist F (2001): MrBAYES: Bayesian inference of phylogeny. Bioinformatics 17: 754–755.

128

Huelsenbeck JP, Ronquist F, Nielsen R, Bollback JP (2001): Bayesian inference of phylogeny and its impact on evolutionary biology. Science 294: 2310–2314. Hutchison LJ (1990): Studies on the systematics of ectomycorrhizal fungi in axenic culture. II. The enzymatic degradation of selected carbon and nitrogen compounds. Can J Bot 68: 1522–1530. Hutchison LJ (1999): Lactarius – In: Cairney JWG, Chambers SM (eds.): Ectomycorrhizal fungi: key genera in profile. Springer: Berlin, Heidelberg, New York, Barcelona, Hong Kong, London, Milan, Paris, Singapore, Tokyo. pp. 269–285. Ingleby K (1999): Inocybe avellana Horak + Shorea leprosula Miq. Descr Ectomyc 4: 55–60. Ingleby K, Mason PA, Last FT, Fleming LV (1990): Identification of Ectomycorrhizas. HMSO, London. Ingleby K, Munro RC, Noor M, Mason PA, Clearwater MJ (1998): Ectomycorrhizal populations and growth of Shorea parvifolia (Dipterocarpaceae) seedlings regenerating under three different forest canopies following logging. Forest Ecol Manag 111(2): 171–179. Ishida TA, Nara K, Hogetsu T (2007): Host effects on ectomycorrhizal fungal communities: insight from eight host species in mixed conifer–broadleaf forests. New Phytol 174: 430–440. Izzo A, Agbowo J, Bruns TD (2005a): Detection of plot-level changes in ectomycorrhizal communities across years in an old-growth mixed-conifer forest. New Phytol 166: 619–630. Izzo AD, Meyer M, Trappe JM, North M, Bruns TD (2005b): Hypogeous ectomycorrhizal fungal species on roots and in small mammal diet in a mixed-conifer forest. Forest Sci 51(3): 243–254. Jakobsen I (2004): Hyphal fusion to plant species connections – giant mycelia and community nutrient flow. New Phytol 164: 4–7. Jakucs E (1999): A mikológia alapjai. ELTE Eötvös Kiadó, Budapest. Jakucs E (2002a): Ectomycorrhizae of Populus alba L. in South Hungary. Phyton 42: 199–210. Jakucs E (2002b): Inocybe heimii. – In: Colour Atlas of Ectomycorrhizae (R. Agerer, ed.) Einhorn Verlag, Schwäbisch Gmünd. p. 146. Jakucs E, Agerer R (1999): Tomentella pilosa (Burt.) Bourdot & Galzin + Populus alba L. Descr Ectomyc 4: 121–126. Jakucs E, Agerer R (2001): Tomentella subtestacea Bourdot & Galzin + Populus alba L. Descr Ectomyc 5: 213–219. Jakucs E, Erős-Honti Zs (2008): Morphological-anatomical characterization and identification of Tomentella ectomycorrhizas. Mycorrhiza 18: 277–285. Jakucs E, Agerer R, Bratek Z (1997): “Quercirhiza fibulocystidiata” + Quercus spp. Descr Ectomyc 2: 67–72. Jakucs E, Bratek Z, Agerer R (1998): Genea verrucosa Vitt. + Quercus spec. Descr Ectomyc 3: 19–23. Jakucs E, Kovács GM, Agerer R, Romsics C, Erős Z (2005a): Morphological-anatomical characterization and molecular identification of Tomentella stuposa ectomycorrhizae and related anatomotypes. Mycorrhiza 15: 247–258. Jakucs E, Kovács GM, Szedlay G, Erős-Honti Z (2005b): Morphological and molecular diversity and abundance of tomentelloid ectomycorrhizae in broad-leaved forests of the Hungarian Plain. Mycorrhiza 15: 459–470. Jakucs E, Magyar L, Beenken L (1999): Hebeloma ammophilum Bohus + Fumana procumbens (Dun.) Gr. Godr. Descr Ectomyc 4: 49–54. Jakucs E, Ganyec Sz, Erős-Honti Zs (2008): “Fagirhiza asteromustrata” + Fagus sylvatica L. Descr Ectomyc 9/10: 31-35.

129

Javelle A, Chalot M, Söderström B, Botton B (1999): Ammonium and methylamine transport by the ectomycorrhizal fungus Paxillus involutus and ectomycorrhizas. FEMS Microbiol Ecol 30: 355– 366. Johansson JF, Paul LR, Finlay RD (2004): Microbial interactions in the mycorrhizosphere and their significance for sustainable agriculture. FEMS Microb Ecol 48: 1–13. Johnson D, Vandenkoornhuyse PJ, Leake JR, Gilbert L, Booth RE, Grime JP, Young JPW, Read DJ (2004): Plant communities affect arbuscular mycorrhizal fungal diversity and community composition in grassland microcosms. New Phytol 161(2): 503–515. Johnson NC, Graham J-H, Smith FA (1997): Functioning of mycorrhizal associations along the mutualism–parasitism continuum. New Phytol 135(4): 575–585. Johnson NC, Hoeksema JD, Bever JD, Chaudhary VB, Gehring C, Klironomos J, Koide R, Miller RM, Moore J, Moutoglis P, Schwartz M, Simard S, Swenson W, Umbanhowar J, Wilson G, Zabinski C (2006): From Lilliput to Brobdingnag: extending models of mycorrhizal function across scales. BioScience 56(11): 889–900. Jones MD, BD Twieg, DM Durall, SM Berch (2008): Location relative to a retention patch affects the ECM fungal community more than patch size in the first season after timber harvesting on Vancouver Island, British Columbia. Forest Ecol Manag 255: 1342–1352. Jones MD, Durall DM, Cairney JWG (2003): Ectomycorrhizal fungal communities in young forest stands regenerating after clearcut logging. New Phytol 157: 399–422. Jonsson T, Kokalj S, Finlay RD, Erland S (1999): Ectomycorrhizal community structure in a limed spruce forest. Mycol Res 103: 501–508. Julou T, Burghardt B, Gebauer G, Berveiller D, Damesin C, Selosse M-A (2005): Mixotrophy in orchids: insights from a comparative study of green individuals and nonphotosynthetic individuals of Cephalanthera damasonium. New Phytol 166: 639–653. Jumpponen A (2001): Dark septate endophytes – are they mycorrhizal? Mycorrhiza 11: 207–211. Jumpponen A (2003): Soil fungal community assembly in a primary successional glacier forefront ecosystem as inferred from rDNA sequence analysis. New Phytol 158: 569–578. Jumpponen A, Trappe JM, Cázares E (2002): Occurence of ectomycorrhizal fungi ont he forefront of retreating Lyman Glacier (Washington, USA) in relation to time since deglaciation. Mycorrhiza 12: 43–49. Jun Y, Tatsuya F, Hirokazu T (2005): Molecular identification of the mycorrhizal fungi of the epiparasitic plant Monotropastrum humile var. glaberrimum (Ericaceae). J Plant Res 118: 53–56. Jung HS (1994): Floral studies on Korean wood-rotting fungi II: on the flora of the Aphyllophorales (Basidiomycotina). Korean J Mycol 22: 62–99. Kaldorf M, Renker C, Fladung M, Buscot F (2004): Characterization and spatial distribution of ectomycorrhizas colonizing aspen clones released in an experimental field. Mycorrhiza 14(5): 295–306. Kárász I, Suba J (1982): A bükki „Őserdő” cönológiai és florisztikai viszonyai. Fol Hist-Nat Mus Matr 8: 85–91. Kåren O, Högberg N, Dahlberg A, Jonsson L, Nylund J-E (1997): Inter- and intraspecific variation in the ITS region of rDNA of ectomycorrhizal fungi in Fennoscandia as detected by endonuclease analysis. New Phytol 136: 313–325. Kåren O, Nylund J-E (1997): Effects of ammonium sulphate on the community structure and biomass of ectomycorrhizal fungi in a Norway spruce stand on southwestern Sweden. Can J Bot 75: 1628– 1642.

130

Karlinski L, Ravnskov S, Kieliszewska-Rokicka B, Larsen J (2007): Fatty acid composition of various ectomycorrhizal fungi and ectomycorrhizas of Norway spruce. Soil Biol Biochem 39(4): 854–866. Kennedy N, Clipson N (2003): Fingerprinting the fungal community. Mycologist 17(4): 158–164. Kernaghan G, Currah RS, Bayer RJ (1997): Russulaceous ectomycorrhizae of Abies lasiocarpa and Picea engelmannii. Can J Bot 75: 1843–1850. Khan AG (1993): Occurrence and importance of mycorrhizae in aquatic trees of New South Wales, Australia. Mycorrhiza 3: 31–38. Khan AG, Kuek C, Chaudhry TM, Khoo CS, Hayes WJ (2000): Role of plants, mycorrhizae and phytochelators in heavy metal contaminated land remediation. Chemosphere 41: 197–207. Kindston R, Lang WH (1921): On old red sandstone plants showing structure, from the Rhynie chert bed, Aberdeenshire. Trans R Soc Edinb 52(4): 855–901. Kirk JL, Beaudette LA, Hart M, Moutoglis P, Klironomos JN, Lee H, Trevorsa JT (2004): Methods of studying soil microbial diversity. J Microbiol Meth 58: 169–188. Kirk PM, Cannon PF, David JC, Stalpers J (2001): Ainsworth and Bisby’s Dictionary of the Fungi. 9th ed. CAB International, Wallingford, UK. Kjøller R (2006): Disproportionate abundance between ectomycorrhizal root tips and their associated mycelia. FEMS Microbiol Ecol 58: 214–224. Kjøller R, Clemmensen KE (2009): Belowground ectomycorrhizal fungal communities respond to liming in three southern Swedish coniferous forest stands. Forest Ecol Manag 257: 2217–2225. Klamer M, Bååth E (2004): Estimation of conversion factors for fungal biomass determination in compost using ergosterol and PLFA 18:2ω6,9. Soil Biol Biochem 36: 57–60. Koide RT, Mosse B (2004): A history of research on arbuscular mycorrhiza. Mycorrhiza 14: 145–163. Köljalg U (1996): Tomentella (Basidiomycota) and related genera in Temperate Eurasia. Synopsis Fungorum. Oslo, Fungiflora. Köljalg U, Dahlberg A, Taylor AFS, Larsson E, Hallenberg N, Stenlid J, Larsson K-H, Fransson PM, Karen O, Jonsson L (2000): Diversity and abundance of resupinate thelephoroid fungi as ectomycorrhizal symbionts in Swedish boreal forests. Mol Ecol 9: 1985–1996 Köljalg U, Jakucs E, Bóka K, Agerer R (2001): Three ectomycorrhizae with cystidia formed by different Tomentella species as revealed by rDNA IST sequences and anatomical characteristics. Folia Cryptogam Est 38: 27–39. Köljalg U, Larsson K-H, Abarenkov K, Nilsson RH, Alexander IJ, Eberhardt U, Erland S, Hoiland K, Kjoller R, Larsson E, Pennanen T, Sen R, Taylor AFS, Tedersoo L, Vralstad T, Ursing BM (2005): UNITE: a database providing web-based methods for the molecular identification of ectomycorrhizal fungi. New Phytol 166: 1063–1068. Kovács GM, Bagi I (2001): Mycorrhizal status of a mixed deciduous forest from the Great Hungarian Plain with special emphasis on the potential mycorrhizal partners of Terfezia terfezioides (Matt.) Trappe. Phyton – Annales Rei Botanicae 41: 161–168. Kovács GM, Jakucs E (2001): „Helianthemirhiza hirsuta” + Helianthemum ovatum (Viv.) Dun. Descr Ectomyc 5: 49–53. Kovács GM, Jakucs E (2006): Morphological and molecular comparison of white truffle ectomycorrhizae. Mycorrhiza 16(8): 567–574. Kovács GM, Rudnóy S, Vágvölgyi C, Lásztity D, Rácz I, Bratek Z (2001): Intraspecific invariability of the internal transcribed spacer region of rDNA of the truffle Terfezia terfezioides in Europe. Folia Microbiol 46: 423–426.

131

Kovács GM, Szigetvári Cs (2002): Mycorrhizae and other root-associated fungal structures of the plants of a sandy grassland on the Great Hungarian Plain. Phyton 42: 211–223. Kraigher H, Batič F, Agerer R (1996): Types of ectomycorrhizae and mycobioindication of forest site pollution. Phyton 36: 115–120. Kraigher H, Petkovšek SAS, Grebenc T, Simončič P (2007): Types of ectomycorrhiza as pollution stress indicators: case studies in slovenia. Environ Monit Assess 128: 31–45. Kranabetter JM, Wylie T (1998): Ectomycorrhizal community structure across forest openings on naturally regenerated western hemlock seedlings. Can J Bot 76: 189–196. Krings M, Taylor TN, Hass H, Kerp H, Dotzler N, Hermsen EJ (2007): Fungal endophytes in a 400million-yr-old land plant: infection pathways, spatial distribution, and host responses. New Phytol 174: 648–657. Krpata D, Mühlmann O, Kuhnert R, Ladurner H, Göbl F, Peintner U (2007): High diversity of ectomycorrhizal fungi associated with Arctostaphylos uva-ursi in subalpine and alpine zones: Potential inoculum for afforestation. Forest Ecol Manag 50(3): 167–175. Krpata D, Peintner U, Langer I, Fitz WJ, Schweiger P (2008): Ectomycorrhizal communities associated with Populus tremula growing on a heavy metal contaminated site. Mycol Res 112(9): 1069–79. Krüger A, Peskan T, Frettinger P, Herrmann S, Buscot F, Oelmüller R (2004): Identification of premycorrhiza related plant genes in the association between Quercus robur and Piloderma croceum. New Phytol 163: 149–157. Krupa P, Kozdroj J (2007): Ectomycorrhizal fungi and associated bacteria provide protection against heavy metals in inoculated pine (Pinus sylvestris L.) seedlings. Water Air Soil Poll 182(1-4): 83– 90. Krupa P, Pitrowska-Seget Z (2003): Positive aspects of interaction between plants and mycorrhizal fungi originating from soils polluted with cadmium. Pol J Environ Stud 12(6): 723–726. Læssøe T, Hansen K (2007): Truffle trouble: what happened to the Tuberales? Mycol Res 111(9): 1075–1099. Laiho O, Mikola P (1964): Studies on the effect of some eradicants on mycorrhizal development in forest nurseries. Act For Fenn 77: 1–33. Lake JA (1987): A rate-independent technique for analysis of nucleic acid sequences: evolutionary parsimony. Mol Biol Evol 4: 167–191. Lanbo S, Hampp D, Guttenberg M, Nehls U (1998): Mycorrhization and Stress Tolerance of Ecotypes of Beech (Fagus sylvatica L.) – First Results of the „Conventwald” Project. ICOM 2, Uppsala. Lancellotti E, Schiaffino A, Franceschini A, Marras F (2007): Study of the ectomycorrhizal community in a cork oak stand of Sardinia. Micologia Italiana 36(1): 89–98. Landeweert R, Hoffland E., Finlay RD, Kuyper TW, van Breemen N (2001): Linking plants to rocks: ectomycorrhizal fungi mobilize nutrients from minerals. TREE 16: 248–253. Landeweert R, Leeflang P, Kuyper TW, Hoffland E, Rosling A, Wernars K, Smit E (2003b): Molecular identification of ectomycorrhizal mycelium in soil horizons. Appl Environm Microbiol 69(1): 327–333. Landeweert R, Leeflang P, Smit E, Kuyper T (2005): Diversity of an ectomycorrhizal fungal community studied by a root tip and total soil DNA approach. Mycorrhiza 15: 1–6. Landeweert R, Veenman C, Kuyper TW, Fritze H, Wernars K, Smit E (2003a): Quantification of ectomycorrhizal mycelium in soil by real-time PCR compared to conventional quantification techniques. FEMS Microbiol Ecol 45: 283–292.

132

Lanfranco L, Wyss P, Marzachí C, Bonfante P (1993): DNA probes for identification of the ectomycorrhizal fungus Tuber magnatum Pico. FEMS Microbiol Lett 114(3): 245–251. Lanyon S (1985): Detecting internal inconsistencies in distance data. Syst Zool 34: 397–403. Larsen MJ (1974): A contribution to the taxonomy of the genus Tomentella. Mycol Mem 4: 1–145. Larsen MJ (1994): Tomentella oligofibula sp. nov. (Aphyllophorales, Thelephoraceae s. str.) from the Canary Islands. Mycotaxon 63: 1–8. Larsson K-H (2007): Re-thinking the classification of corticioid fungi. Mycol. Res. 111: 1040–1063. Larsson K-H, Larsson E, Köljalg U (2004): High phylogenetic diversity among corticioid honobasidiomycetes. Mycol Res 108: 983–1002. Leake JR (1994): The biology of myco-heterotrophic (’saprophytic’) plants. New Phytol 127: 171– 216. Leake JR (2004): Myco-heterotroph/epiparasitic plant interactions with ectomycorrhizal and arbuscular mycorrhizal fungi. Curr Opin Plant Biol 7: 422–428. Leake JR (2005): Plants parasitic on fungi: unearthing the fungi in myco-heterotrophs and debunking the ‘saprophytic’ plant myth. Mycologist 19(3): 113–122. Lee JS, Jung HS (2006): Taxonomic study on Korean Aphyllophorales (5) – on some unrecorded genera and species. Mycobiology 34(4): 166–175. Lee SL, Alexander IJ, Watling R (1997): Ectomycorrhizas and putative ectomycorrhizal fungi of Shorea leprosula Miq. (Dipterocarpaceae). Mycorrhiza 7: 63–81. Lehr NA, Schrey SD, Bauer R, Hampp R, Tarkka MT (2007): Suppression of plant defence response by a mycorrhiza helper bacterium. New Phytol 174: 892–903. Lehto T (1992): Mycorrhizas and drought resistance of Picea sitchensis (Bong.) Carr. New Phytol 122: 661–668. LePage BA, Currah RS, Stockey RA, Rothwell GW (1997): Fossil ectomycorrhizas from the Middle Eocene. Am J Bot 84: 410–412. Leyval C, Turnau K, Haselwandter K (1997): Effect of heavy metal pollution on mycorrhizal colonization and function: physiological, ecological and applied aspects. Mycorrhiza 7: 139–153. Lian C, Narimatsu M, Nara K, Hogetsu T (2006): Tricholoma matsutake in a natural Pinus densiflora forest: correspondence between above- and below-ground genets, association with multiple host trees and alteration of existing ectomycorrhizal communities. New Phytol 171: 825–836. Ligrone R (1988): Ultrastructure of a fungal endophyte in Phaeoceros laevis (L.) Prosk. (Anthoceratophyta). Bot Gaz 149: 92–100. Liiri M, Ilmarinen K, Setälä H (2007): Variable impacts of enchytraeid worms and ectomycorrhizal fungi on plant growth in raw humus soil treated with wood ash. Appl Soil Ecol 35: 174–183. Lilleskov EA, Fahey TJ, Horton TR, Lovett GM (2002): Belowground ectomycorrhizal fungal community change over a nitrogen deposition gradient in Alaska. Ecology 83(1): 104–115. Lindahl BD, Ihrmark K, Boberg J, Trumbore SE, Högberg P, Stenlid J, Finlay RD (2006): Spatial separation of litter decomposition and mycorrhizal nitrogen uptake in a boreal forest. New Phytol 173: 611–620. Liu W-T, Marsh TL, Cheng H, Forney LJ (1997): Characterization of microbial diversity by determining terminal restriction fragment length polymorphisms of genes encoding 16S rRNA. Appl Environ Microbiol 63: 4516–4522. Longato S, Bonfante P (1997): Molecular identification of mycorrhizal fungi by direct amplification of microsatellite regions. Mycol Res 101(4): 425–432.

133

López MF, Männer P, Willmann A, Hampp R, Nehls U (2007): Increased trehalose biosynthesis in Hartig net hyphae of ectomycorrhizas. New Phytol 174: 389–398. Lum MR, Hirsch AM (2003): Roots and their symbiotic microbes: strategies to obtain nitrogen and phosphorus in a nutrient-limiting environment. J Plant Growth Regul 21: 368–382. Lutzoni F, Kauff F, Cox CJ, McLaughlin D, Celio G, Dentinger B, Padamsee M, Hibbett D, James TY, Baloch E, Grube M, Reeb V, Hofstetter V, Schoch C, Arnold AE, Miadlikowska J, Spatafora J, Johnson D, Hambleton S, Crockett M, Shoemaker R, Sung G-H, Lücking R, Lumbsch T, O'Donnell K, Binder M, Diederich P, Ertz D, Gueidan C, Hansen K, Harris RC, Hosaka K, Lim Y-W, Matheny B, Nishida1 H, Pfister D, Rogers J, Rossman A, Schmitt I, Sipman H, Stone J, Sugiyama J, Yahr R, Vilgalys R (2004): Assembling the fungal tree of life: progress, classification, and evolution of subcellular traits. Am J Bot 91(10): 1446–1480. Maeta K, Ochi T, Tokimoto K, Shimomura N, Maekawa N, Kawaguchi N, Nakaya M, Kitamoto Y, Aimi T (2008): Rapid species identification of cooked poisonous mushrooms by using real-time PCR. Appl Environ Microbiol 74 (10): 3306–3309. Magyar L, Beenken L, Jakucs E (1999): Inocybe heimii Bon + Fumana procumbens (Dun.) Gr. Godr. Descr Ectomyc 4: 61–65. Maia LC, Yano AM, Kimbrough JW (1996): Species of Ascomycota forming ectomycorrhizae. Mycotaxon 57: 371–390. Maidak BL, Cole JR, Lilburn TG, Parker CT, Saxman PR, Farris RJ, Garrity GM, Olsen GJ, Schmidt TM, Tiedje JM (2001): The RDP-II (Ribosomal Database Project). Nucleic Acids Res 29: 173– 174. Malcolm GM, Lopez-Gutierrez JC, Koide RT, Eissenstat DM (2008): Acclimation to temperature and temperature sensitivity of metabolism by ectomycorrhizal fungi. Glob Change Biol 14(5): 1169– 1180. Malloch DW (1987): The evolution of mycorrhizae. Can J Plant Path 9: 398–402. Marin M, Pardo I, Ferrer S (1996): Detection of intraspecific variation of Lactarius deliciosus by PCR/RFLP. ICOM I, Berkeley, California. Marosi S, Somogyi S (1990): Magyarország kistájainak katasztere. MTA Földrajztudományi Kutató Intézet, Budapest. Martin F, Duplessis S, Ditengou F, Lagrange H, Voiblet C, Lapeyrie F (2001): Developmental cross talking in the ectomycorrhizal symbiosis: signals and communication genes. New Phytol 151: 145–154. Martin F, Kohler A, Duplessis S (2007): Living in harmony in the wood underground: ectomycorrhizal genomics. Curr Opin Plant Biol 10(2): 204–210. Martin F, Laurent P, De Carvalho D, Burgess T, Murphy P, Nehls U, Tagu D (1995): Fungal gene expression during ectomycorrhiza formation. Can J Bot 73(S): S541–S547. Martin F, Tagu D (1999): Developmental Biology of a Plant-fungus Symbiosis: the Ectomycorrhiza. – In: Varma A, Hock B (eds.): Mycorrhiza (2nd edn.) Springer-Verlag, Berlin, Heidelberg. pp. 51– 73. Martin KJ (2007): Introduction to molecular analysis of ectomycorrhizal communities. Soil Sci Soc Am J 71: 601–610. Martin TA, Dougherty PM, Topa MA, McKeand SE (2005): Strategies and case studies for incorporating ecophysiology into southern pine tree improvement programs. South J Appl For 29(2): 70–79. Marx DH (1972): Ectomycorrhizae as biological deterrents to pathogenic root infections. Ann Rev Phytopathol 10: 429–454.

134

Matheny PB, Curtis JM, Hofstetter V, Aime MC, Moncalvo J-M, Ge Z-W, Slot JC, Ammirati JF, Baroni TJ, Bougher NL, Hughes KW, Lodge DJ, Kerrigan RW, Seidl MT, Aanen DK, DeNitis M, Daniele GM, Desjardin DE, Kropp BR, Norvell LL, Parker A, Vellinga EC, Vilgalys R, Hibbett DS (2006): Major clades of Agaricales: a multilocus phylogenetic overview. Mycologia 98(6): 982–95. Matheny PB, Wang Z, Binder M, Curtis JM, Lim YW, Nilsson RH, Hughes KW, Hofstetter V, Ammirati JF, Schoch CL, Langer E, Langer G, McLaughlin DJ, Wilson AW, Frøslev T, Ge ZW, Kerrigan RW, Slot JC, Yang ZL, Baroni TJ, Fischer M, Hosaka K, Matsuura K, Seidl MT, Vauras J, Hibbett DS (2007): Contributions of rpb2 and tef1 to the phylogeny of mushrooms and allies (Basidiomycota, Fungi). Mol Phylogenet Evol 43(2): 430–451. McCormick MK, Whigham DF, O’Neill J (2004): Mycorrhizal diversity in photosynthetic terrestrial orchids. New Phytol 163: 425–438. McGuire KL (2007): Common ectomycorrhizal networks may maintain monodominance in a tropical rain forest. Ecology 88(3): 567–574. McKendrick SL, Leake JR, Read DJ (2000a): Symbiotic germination and development of mycoheterotrophic plants in nature: transfer of carbon from ectomycorrhizal Salix repens and Betula pendula to the orchid Corallorhiza trifida through shared hyphal connections. New Phytol 145: 539–548. McKendrick SL, Leake JR, Taylor DL, Read DJ (2000b): Symbiotic germination and development of myco-heterotrophic plants in nature: ontogeny of Corallorhiza trifida and characterization of its mycorrhizal fungi. New Phytol 145: 523–537. Michelsen A, Schmidt IK, Jonasson S, Quarmby C, Sleep D (1996): Leaf 15N abundance of subarctic plants provides field evidence that ericoid, ectomycorrhizal and non- and arbuscular mycorrhizal species access different sources of nitrogen. Oecologia 105: 53–63. Millard P, Sommerkorn M, Grelet G-A (2007): Environmental change and carbon limitation in trees: a biochemical, ecophysiological and ecosystem appraisal. New Phytol 175: 11–28. Miller OK, Lodge DJ, Baroni TJ (2000): New and interesting ectomycorrhizal fungi from Puerto Rico, Mona and Guana Islands. Mycologia 92: 558–570. Miller SL, Koo CD (1991): Characterization of red alder ectomycorrhizae: a preface to monitoring belowground ecological responses. Can J Bot 69: 516–531. Miller SL, Larsson E, Larsson K-H, Verbeken A, Nuytinck J (2006): Perspectives in the new Russulales. Mycologia 98(6): 960–970. Miller SL, McClean TM, Walker JF, Buyck B (2001): A molecular phylogeny of the Russulales including agaricoid, gasteroid and pleurotoid taxa. Mycologia 93: 344–354. Mitchell JI, Zuccaro A (2006): Sequences, the environment and fungi. Mycologist, 20(2): 62–74. Molina R, Massicotte H, Trappe JM (1992): Specificity phenomena in mycorrhizal symbiosis: community-ecological consequences and practical implications. – In: Allen MF (ed.): Mycorrhizal functioning. Chapman&Hall: London, UK. pp. 357–423. Monis PT, Giglio S, Keegan AR, Thompson RCA (2005): Emerging technologies for the detection and genetic characterization of protozoan parasites. Trends Parasitol 21(7): 340–346. Montecchio L, Agerer R (1997): Piceirhiza cornuta + Picea abies (L.) Karst. Descr Ectomyc 2: 31– 35. Montecchio L, Rossi S, Courty P-E, Garbaye J (2006): Entoloma nitidum Quél. + Carpinus betulus L. Descr Ectomyc 9/10: 33–38. Montoya L, Bandala VM (2008): A new species and new records of Lactarius (subgenus Russularia) in a subtropical cloud forest from eastern Mexico. Fungal Divers 29: 61–72.

135

Moreno-Espíndola IP, Rivera-Becerril F, Ferrara-Guerrero MdJ, León-González FD (2007): Role of root-hairs and hyphae in adhesion of sand particles. Soil Biol Biochem 39: 2520–2526. Moritz C, Hillis DM (1996): Molecular Systematics: Context and Controversies. – In: Hillis DM, Moritz C, Mable BK (eds.): Molecular Systematics. Sinauer Associates Inc.: Sunderland, Massachusetts. pp. 1–13. Morris M, Smith ME, Rizzo DM, Rejmánek M és Bledsoe CS (2008): Contrasting ectomycorrhizal fungal communities on the roots of co-occurring oaks (Quercus spp.) in a California woodland. New Phytol 178: 167–176. Morte A, Lovisolo C, Schubert A (2000): Effect of drought stress on growth and water relations of the mycorrhizal association Helianthemum almeriense – Terfezia claveryi. Mycorrhiza 10: 115–119 Mosca E, Montecchio L, Scattolin L, Garbaye J (2007a): Enzymatic activities of three ectomycorrhizal types of Quercus robur L. in relation to tree decline and thinning. Soil Biol Biochem 39(11): 2897–2904. Mosca E, Montecchio L, Sella L, Garbaye J (2007b): Short-term effect of removing tree competition on the ectomycorrhizal status of a declining pedunculate oak forest (Quercus robur L.). For Ecol Manag 244: 129–140. Moser AM, Frank JL, D'Allura JA, Southworth D (2009): Ectomycorrhizal communities of Quercus garryana are similar on serpentine and nonserpentine soils. Plant Soil 315(1–2): 185–194. Moyersoen B (2006): Pakaraimaea dipterocarpacea is ectomycorrhizal, indicating an ancient Gondwanaland origin for the ectomycorrhizal habit in Dipterocarpaceae. New Phytol 172: 753– 762. Moyersoen B, Fitter AH (1998): Presence of arbuscular mycorrhizas in typically ectomycorrhizal host species from Cameroon and New Zealand. Mycorrhiza 8: 247–253. Mucina L (1997): Classification of vegetation: Past, present and future. J Veg Sci 4: 429–439. Muhlmann O, Bacher M, Peintner U (2008): Polygonum viviparum mycobionts on an alpine primary successional glacier forefront. Mycorrhiza 18(2): 87–95. Muhlmann O, Peintner U (2008a): Ectomycorrhiza of Kobresia myosuroides at a primary successional glacier forefront. Mycorrhiza 18(6–7): 355–362. Muhlmann, O, Peintner, U (2008b): Mycobionts of Salix herbacea on a glacier forefront in the Austrian Alps. Mycorrhiza 18(4): 171–184. Mullis KB, Faloona FA (1987): Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerase-catalyzed chain reaction. Method Enzymol 155: 35–50. Mummey DL, Rillig MC, Holben WE (2005): Neighboring plant influences on arbuscular mycorrhizal fungal community composition as assessed by T-RFLP analysis. Plant Soil 271(1–2): 83–90. Muyzer G (1999): DGGE/TGGE a method for identifying genes from natural ecosystems. Curr Opin Microbiol 2: 317–322. Muyzer G, Waal ECD, Uitterlinden AG (1993): Profiling of complex microbial populations by denaturing gradient gel electrophoresis analysis of polymerase chain reaction-amplified genes coding for 16S rRNA. Appl Environ Microbiol 59: 695–700. Nara K (2006): Ectomycorrhizal networks and seedling establishment during early primary succession. New Phytol 169: 169–178. Nehls U, Mikolajewski S, Magel E, Hampp R (2001): Carbohydrate metabolism in ectomycorrhizas: gene expression, monosaccharide transport and metabolic control. New Phytol 150: 533–541. Newsham KK, Upson R, Read DJ (2009): Mycorrhizas and dark septate root endophytes in polar regions. Fungal Ecol 2: 10–20.

136

Newton AC, Haigh JM (1998): Diversity of ectomycorrhizal fungi in Britain: a test of the species-area relationship, and the role of host specificity. New Phytol 138: 619–627. Nieto P, Carbone S (2009): Characterization of juvenile maritime pine (Pinus pinaster Ait.) ectomycorrhizal fungal community using morphotyping, direct sequencing and fruitbodies sampling. Mycorrhiza 19(2): 91–98. Nilsson RH, Larsson K-H, Ursing BM (2004): Galaxie - CGI scripts for sequence identification through automated phylogenetic analysis. Bioinformatics 20: 1447–1452. Norman JE, Egger KN (1999): Molecular phylogenetic analysis of Peziza and related genera. Mycologia 91(5): 820–829. Núñez JAD, Serrano JS, Barreal JAR, González JASO (2006): The influence of mycorrhization with Tuber melanosporum in the afforestation of a Mediterranean site with Quercus ilex and Quercus faginea. For Ecol Manag 231: 226–233. Nuytinck J, Verbeken A (2007): Species delimitation and phylogenetic relationships in Lactarius section Deliciosi in Europe. Mycol Res 111: 1285–1297. Nuytinck J, Verbeken A, Delarue S, Walleyn R (2003): Systematics of European sequestrate lactarioid Russulaceae with spiny spore ornamentation. Belg J Bot 136(2): 145–153. Nuytinck J, Verbeken A, Rinaldi AC, Leonardi M, Pacioni G, Comandini O (2004): Characterization of Lactarius tesquorum ectomycorrhizae of Cistus sp. and molecular phylogeny of related European Lactarius taxa. Mycologia 96: 272–282. Nygren CM, Edqvist J, Elfstrand M, Heller G, Taylor AF (2007): Detection of extracellular protease activity in different species and genera of ectomycorrhizal fungi. Mycorrhiza 17(3): 241–248. Nylund J-E, Wallander H (1992): Ergosterol analysis as a means of quantifying mycorrhizal biomass. – In: Norris JR, Read DJ, Varma AK (eds.): Methods in Microbiology, vol. 24. Academic Press, London. pp. 77–88. O’Donnell K, Cigelnik E (1997): Two divergent intragenomic rDNA ITS2 types within a monophyletic lineage of the fungus fusarium are nonorthologous. Mol Phylogenet Evol 7(1): 103– 116. Ódor P, Heilmann-Clausen J, Christensen M, Aude E, van Doort K, Piltaver A, Siller I, Veerkamp M, Walleyn R, Standovár T, van Hees AFM (2003): Diversity and structure of dead wood inhabiting fungal and bryophyte communities in semi-natural beech forests in Europe. Biol Conserv 131(1): 58–71. Olive DM, Bean P (1999): Principles and applications of methods for DNA-based typing of microbial organisms. J Clin Microbiol 37(6): 1661–1669. Orita M, Iwahana H, Kanazawa H, Hayashi K, Sekiya T (1989): Detection of polymorphisms of human DNA by gel electrophoresis as single-strand conformation polymorphisms. Proc Natcl Acad Sci USA 86: 2766–2770. Ott T, Fritz E, Polle A, Schützendübel A (2002): Characterisation of antioxidative systems in the ectomycorrhiza-building basidiomycete Paxillus involutus (Bartsch) Fr. and its reaction to cadmium. FEMS Microbiol Ecol 42: 359–366. Pál-Fám F (2002): Nagygomba cönológiai módszerek. Irodalmi összefoglaló. Bot Közl 88(1–2): 145– 172. Palfner G, Agerer R (1996): “Quercirhiza squamosa” eine nichtidentifizierte Ektomykorrhiza an Quercus robur. Sendtnera 3: 137–145 Palmer JM, Lindner DL, Volk TJ (2008): Ectomycorrhizal characterization of an american chestnut (Castanea dentata) dominated community in Western Wisconsin. Mycorrhiza 19(1): 27–36.

137

Pargney JC, Prévost A (1996): Comparaison des ectomycorhizes naturelles entre le hêtre (Fagus sylvatica) et deux lactaires (Lactarius blennius var viridis et Lactarius subdulcis). II. Caractérisation cytochimique des interfaces. Ann Sci For 53: 991–1003. Parlade J, Pera J, Luque J (2004): Evaluation of mycelial inocula of edible Lactarius species for the production of Pinus pinaster and P. sylvestris mycorrhizal seedlings under greenhouse conditions. Mycorrhiza 14: 171–176. Parrent JL, Vilgalys R (2007): Biomass and compositional responses of ectomycorrhizal fungal hyphae to elevated CO2 and nitrogen fertilization. New Phytol 176(1): 164–174. Paul LR, Chapman BK, Chanway CP (2007): Nitrogen fixation associated with Suillus tomentosus tuberculate ectomycorrhizae on Pinus contorta var. latifolia. Ann Bot 99(6): 1101–1109 . Pennanen T, Heiskanen J, Korkama T (2005): Dynamics of ectomycorrhizal fungi and growth of Norway spruce seedlings after planting on a mounded forest clearcut. For Ecol Manag 213(1–3): 243–252. Pénzes Zs, Csanádi Gy, Kovács GM, Beer Zs (2002): Molecular markers in ecology. Tiscia 33: 9–30. Percudani R, Trevisi A, Zambonelli A, Ottonello S (1999): Molecular phylogeny of truffles (Pezizales: Terfeziaceae, Tuberaceae) derived from nuclear rDNA sequence analysis Mol Phylogenet Evol 13: 169–180. Perez-Moreno J, Read DJ (2000): Mobilization and transfer of nutrients from litter to tree seedlings via the vegetative mycelium of ectomycorrhizal plants. New Phytol 145: 301–309. Perry BA, Hansen K, Pfister DH (2007): A phylogenetic overview of the family Pyronemataceae (Ascomycota, Pezizales). Mycol Res 111: 549–571. Peter M, Büchler U, Ayer F, Egli S (2001): Ectomycorrhizas and molecular phylogeny of the hypogeous russuloid fungus Arcangeliella borziana. Mycol Res 105: 1231–1238. Pfeffer PE, Bago B, Shachar-Hill Y (2001): Exploring mycorrhizal function with NMR spectroscopy. New Phytol 150: 543–553. Pigott CD (1982): Survival of mycorrhiza formed by Cenococcum geophilum Fr. in dry soils. New Phytol 92: 513–517. Pillukat A, Wanner G (1996): The parasitic ascomycete Hypomyces lateritius on ectomycorrhizae of the basidiomycete Lactarius salmonicolor. ICOM I, Berkeley, California. Pinkas Y, Maimon M, Shabi E, Elisha S, Shmulewich Y, Freeman S (2000): Inoculation, isolation and identification of Tuber melanosporum from old and new oak hosts in Israel. Mycol Res 104(4): 472–477. Pirozynski KA, Dalpé Y (1989): Geological history of the Glomaceae with particular reference to mycorrhizal symbiosis. Symbiosis 7: 1–36. Pirozynski KA, Malloch DW (1975): The origin of land plants: a matter of mycotrophism. Biosystems 6: 153–164. Podani J (2003): A szárazföldi növények evolúciója és rendszertana. ELTE Eötvös Kiadó, Budapest. Podila GK, Zheng J, Balasubramanian S, Sundaram S, Hiremath S, Brand JH, Hymes MJ (2002): Fungal gene expression in early symbiotic interactions between Laccaria bicolor and red pine. Plant Soil 244: 117–128. Pozo MJ, Azcón-Aguilar C (2007): Unraveling mycorrhiza-induced resistance. Curr Opin Plant Biol 10: 393–398. Prévost A, Pargney JC (1995): Comparaison des ectomycorhizes naturelles entre le hêtre (Fagus sylvatica) et 2 lactaires (Lactarius blennius var viridis et Lactarius subdulcis). I. Caractéristiques morphologiques et cytologiques. Ann Sci For 52: 131–146.

138

Pritsch K, Boyle H, Munch JC, Buscot F (1997b): Characterization and identification of black alder ectomycorrhizas by PCR/RFLP anlyses of the rDNA internal transcribed spacer (ITS). New Phytol 137: 357–369. Pritsch K, Munch JC, Buscot F (1997a): Morphological and anatomical characterisation of black alder Alnus glutinosa (L.) Gaertn. Ectomycorrhizas. Mycorrhiza 7: 201–216. Pritsch K, Munch JC, Buscot F (2000): Identification and differentiation of mycorrhizal isolates of black alder by sequence analysis of the ITS region. Mycorrhiza 10: 87–93. Raeder U, Broda P (1985): Rapid preparation of DNA from filamentous fungi. Lett Appl Microbiol 1: 17–20. Raidl S (1998): Tomentella ferruginea. – In: Colour Atlas of Ectomycorrhizae (R. Agerer, ed.) Einhorn Verlag, Schwäbisch Gmünd. p. 137. Raidl S, Müller WR (1996): Tomentella ferruginea (Pers.) Pat. + Fagus sylvatica L. Descr Ectomyc 1: 161–166. Ramanankierana N, Ducousso M, Rakotoarimanga N, Prin Y, Thioulouse J, Randrianjohany E, Ramaroson L, Kisa M, Galiana A, Duponnois R (2007): Arbuscular mycorrhizas and ectomycorrhizas of Uapaca bojeri L. (Euphorbiaceae): sporophore diversity, patterns of root colonization, and effects on seedling growth and soil microbial catabolic diversity. Mycorrhiza 17(3): 195–208. Ranjard L, Poly F, Lata J-C, Mougel C, Thioulouse J, Nazaret S (2001): Characterization of bacterial and fungal soil communities by automated ribosomal intergenic spacer analysis fingerprints: biological and methodological variability. Appl Environ Microb 67(10): 4479–4487. Ranjard L, Poly F, Nazaret S (2000): Monitoring complex bacterial communities using cultureindependent molecular techniques: application to soil environment. Res Microbiol 151: 167–177. Rasmussen HN (2002): Recent developments in the study of orchid mycorrhiza. Plant Soil 244: 149– 163. Rauscher T, Agerer R, Chevalier G (1995): Ektomykorrhizen von Tuber melanosporum, Tuber mesentericum und Tuber rufum (Tuberales) an Corylus avellana. Nova Hedw 61: 281–322. Rauscher T, Müller WR, Chevalier G, Agerer R (1996): Tuber borchii. – In: Colour Atlas of Ectomycorrhizae (R. Agerer, ed.) Einhorn Verlag, Schwäbisch Gmünd. p. 113. Read DJ (1999a): Mycorrhiza – The state of art. – In: Varma A, Hock B (eds.): Mycorrhiza. (2nd edn.) Springer-Verlag, Berlin, Heidelberg. pp. 3–34. Read DJ (1999b): The ecophysiology of mycorrhizal symbioses with special reference to impacts upon plant fitness. – In: Press MC, Scholes JD, Barker MG (eds.): Physiological plant ecology. Blackwell Science, Oxford. Read DJ (2002): Towards ecological relevance – Progress and pitfalls in the path towards an understanding of mycorrhizal functions in nature. – In: Heijden MGA van der (ed.): Mycorrhizal ecology. Springer-Verlag, Berlin, Heidelberg, New York. pp. 3–29. Read DJ, Kianmehr H, Malibari A (1977): The biology of mycorrhiza in Helianthemum Mill. New Phytol 78: 305–312. Read DJ, Perez-Moreno J (2003): Mycorrhizas and nutrient cycling in ecosystems – a journey towards relevance? New Phytol 157: 475–492. Redecker D, Kodner R, Graham LE (2000): Glomalean fungi from the Ordovician. Science 289: 1920–1921. Reess M (1880): Über den Parasitismus von Elaphomyces granulatus. Bot Ztg 38: 729–733. Rehner SA, Samuels GJ (1994): Taxonomy and phylogeny of Gliocladium analysed from nuclear large subunit ribosomal DNA sequences. Mycol Res 98: 625–634.

139

Remy W, Taylor TN, Hass H, Kerp H (1994): Fourhundred-million-year-old vesicular arbuscular mycorrhizae. Proc Natl Acad Sci 91: 11841–11843. Richard F, Millot S, Gardes M, Selosse M-A (2005): Diversity and specificity of ectomycorrhizal fungi retrieved from an old-growth Mediterranean forest dominated by Quercus ilex. New Phytol 166: 1011–1023. Richard F, Moreau PA, Selosse MA, Gardes M (2004) Diversity and fruiting patterns of ectomycorrhizal and saprobic fungi in an old-growth Mediterranean forest dominated by Quercus ilex L. Can J Bot 82: 1711–1729 Richards TA, Bass D (2005): Molecular screening of free-living microbial eukaryotes: diversity and distribution using a meta-analysis. Curr Opin Microbiol 8: 240–252 Rillig MC, Mummey DL (2006): Mycorrhizas and soil structure. New Phytol 171: 41–53. Rineau F, Garbaye J (2009): Effects of liming on ectomycorrhizal community structure in relation to soil horizons and tree hosts. Fungal Ecoloy – még csak on-line elérhető változat (doi:10.1016/j.funeco.2009.01.006) Riviere T, Diedhiou AG, Diabate M, Senthilarasu G, Natarajan K, Verbeken A, Buyck B, Dreyfus B, Bena G, Ba AM (2007): Genetic diversity of ectomycorrhizal Basidiomycetes from African and Indian tropical rain forests. Mycorrhiza 17: 415–428. Robin B, Robin C, Robin M, Cammalletti P (1998b): Growing top-level mycorrhizal seedlings on a large-scale at ROBIN Nurseries. ICOM 2, Uppsala. Robin C, Robin B, Robin M (1998a): Some aspects of our experience with mass production of seedlings mycorrhizal with edible species. ICOM 2, Uppsala. Ronquist F, Huelsenbeck JP (2003): MrBAYES 3: Bayesian phylogenetic inference under mixed models. Bioinformatics 19: 1572–1574. Rosling A, Landeweert R, Lindahl BD, Larsson K-H, Kuyper TW, Taylor AFS, Finlay RD (2003): Vertical distribution of ectomycorrhizal fungal taxa in a podzol soil profile. New Phytol 159: 775– 783. Rosling A, Lindahl BD, Finlay RD (2004): Carbon allocation to ectomycorrhizal roots and mycelium colonising different mineral substrates. New Phytol 162: 795–802. Rudawska M, Leski T, Trocha LK, Gornowicz R (2006): Ectomycorrhizal status of Norway spruce seedlings from bare-root forest nurseries. Forest Ecol Manag 236: 375–384. Rumberger MD, Münzenberger B, Bens O, Ehrig F, Lentzsch P, Hüttl RF (2004): Changes in diversity and storage function of ectomycorrhiza and soil organoprofile dynamics after introduction of beech into Scots pine forests. Plant Soil 264: 111–126. Ryberg M, Kristiansson E, Sjokvist E, Nilsson RH (2009): An outlook on the fungal internal transcribed spacer sequences in GenBank and the introduction of a web-based tool for the exploration of fungal diversity. New Phytol 181: 471–477. Ryberg M, Nilsson RH, Kristiansson E, Töpel M, Jacobsson S, Larsson E (2008): Mining metadata from unidentified ITS sequences in GenBank: a case study in Inocybe (Basidiomycota). BMC Evol Biol 8:50–63. Saari TA, Saari SK, Campbell CD, Alexander IJ, Anderson IC (2007): FragMatch—a program for the analysis of DNA fragment data. Mycorrhiza 17: 133–136. Saiki RK, Scharf S, Faloona F, Mullis KB, Horn GT, Erlich HA, Arnheim N (1985): Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia. Science 230: 1350–1354. Saitou N, Nei M (1987): The neighbor-joining method: a new method for reconstructing phylogenetic trees. Mol Biol Evol 4: 406–425.

140

Sakakibara SM, Jones MD, Gillespie M, Hagerman SM, Forrest ME, Simard SW, Durall DM (2002): A comparison of ectomycorrhiza identification based on morphotyping and PCR-RFLP analysis. Mycol Res 106: 868–878. Salerni E, Laganà A, De Dominicis V (2001): Mycocoenological studies in deciduous oak woods of central-southern Tuscany (Italy). Cryptogamie Mycol 22(1): 35–55 Sándor (1983): Bükki Nemzeti Park. Kilátás a kövekről. Mezőgazdasági Kiadó, Budapest. Scales PF, Peterson RL (1991a): Structure and development of Pinus banksiana – Wilcoxina ectendomycorrhizae. Can J Bot 69: 2135–2148. Scales PF, Peterson RL (1991b): Structure of ectomycorrhizae formed by Wilcoxina mikolae var. mikolae with Picea mariana and Betula alleghaniensis. Can J Bot 69: 2149–2157. Schmalenberger A, Tebbe CC (2003): Bacterial diversity in maize rhizospheres: conclusions on the use of genetic profiles based on PCR-amplified partial small subunit rRNA genes in ecological studies. Mol Ecol 12: 251–262. Schüßler A (2000): Glomus claroideum forms and arbuscular mycorrhiza-like symbiosis with the hornwort Anthoceros punctatus. Mycorrhiza 10: 15–21. Schüßler A, Schwarzott D, Walker C (2001): A new fungal phylum, the Glomeromycota: phylogeny and evolution. Mycol Res 105(12): 1413–1421. Schwartz M, Hoeksema J (1998): Specialization and resource trade: Biological markets as a model of mutualisms. Ecology 79: 1029–1038. Selosse M-A, Bauer R, Moyersoen B (2002a): Basal hymenomycetes belonging to the Sebacinaceae are ectomycorrhizal on temperate deciduous trees. New Phytol 155: 183–195. Selosse M-A, Le Tacon F (1998): The land flora: a phototroph–fungus partnership? TREE 13(1): 15– 20. Selosse M-A, Richard F, He X, Simard SW (2006): Mycorrhizal networks: des liaisons dangereuses? TREE 21(11): 621–628. Selosse M-A, Weiss M, Jany JL, Tillier A (2002b): Communities and populations of sebacinoid basidiomycetes associated with the achlorophyllous orchid Neottia nidus-avis (L.) L.C.M. Rich. and neighbouring tree ectomycorrhizas. Mol Ecol 11(9): 1831–44. Sesli E (1998): Four interesting records of Pezizales of the macrofungal flora of Turkey. Tr J Bot 22: 289–293. Shaw TM, Dighton J, Sanders FE (1995): Interactions between ectomycorrhizal and saprotrophic fungi on agar and in association with seedlings of lodgepole pine (Pinus muricata). Mycol Res 2: 159–165. Shefferson RP, Taylor DL, Weiss M, Garnica S, McCormick MK, Adams S, Gray HM, McFarland JW, Kull T, Tali K, Yukawa T, Kawahara T, Miyoshi K, Lee YI (2007): The evolutionary history of mycorrhizal specificity among lady's slipper orchids. Evolution 61(6): 1380–1390. Shi L, Guttenberger M, Kottke I, Hampp R (2002): The effect of drought on mycorrhizas of beech (Fagus sylvatica L.): changes in community structure, and the content of carbohydrates and nitrogen storage bodies of the fungi. Mycorrhiza 12: 303–311. Sieber TN (2007): Endophytic fungi in forest trees: are they mutualists? Fungal Biol Rev 21: 75–89. Siller I (1986): Nagygombák cönológiai vizsgálata rezervátum és gazdasági bükkös állományokban. Mikol Közl 2–3: 95–116. Siller I (2004): Hazai montán bükkös erdőrezervátumok (Mátra: Kékes Észak, Bükk: Őserdő) nagygombái. PhD-disszertáció.

141

Siller I, Maglóczky Zs (2002): Mikológiai vizsgálatok. – In: Horváth, Borhidi (eds.): A hazai erdőrezervátum-kutatás célja, stratégiája és módszerei. TermészetBÚVÁR Alapítvány Kiadó: Budapest. pp. 182–202. Simard SW, Perry DA, Jonas MD, Myrold DD, Durall DM, Molina R (1997): Net transfer of carbon between ectomycorrhizal tree species int he field. Nature 388: 579–582. Simon L, Bousquet J, Lévesque RC, Lalonde M (1993): Origin and diversification of endomycorrhizal fungi and coincidence with vascular plants. Nature 363: 67–69. Slankis V (1973): Hormonal relationships in mycorrhizal development. – In: Marks GC, Kozlowski TT (eds.): Ectomycorrhizae: Their ecology and physiology. Academic Press: New York. p 231– 298. Smith ME, Douhan GW és Rizzo DM (2007b): Ectomycorrhizal community structure in a xeric Quercus woodland based on rDNA sequence analysis of sporocarps and pooled roots. New Phytol 174: 847–863. Smith ME, Douhan GW, Rizzo DM (2007a): Intra-specific and intra-sporocarp ITS variation of ectomycorrhizal fungi as assessed by rDNA sequencing of sporocarps and pooled ectomycorrhizal roots from a Quercus woodland. Mycorrhiza 18:15–22. Smith ME, Trappe JM, Rizzo DM (2006): Genea, Genabea and Gilkeya gen. nov.: ascomata and ectomycorrhiza formation in a Quercus woodland. Mycologia 98(5): 699–716. Smith SE, Read DJ (1997): Mycorrhizal Symbiosis. (2nd edn.) Academic Press, San Diego, USA. Smith SE, Smith FA (1990): Structure and function of the interfaces in biotrophic symbioses as they relate to nutrient transport. New Phytol 14: 1–38. Soltis DE, Soltis PS, Chase MW, Mort ME, Albach DC, Zanis M, Savolainen V, Hahn WH, Hoot SB, Fay MF, Axtell M, Swensen SM, Prince LM, Kress WJ, Nixon KC, Farris JS (2000): Angiosperm phylogeny inferred from 18S rDNA, rbcL, and atpB sequences. Bot J Linn Soc 133: 381–461. Southworth D, Carrington EM, Frank JL, Gould P, Harrington CA, Devine WD (2009): Mycorrhizas on nursery and field seedlings of Quercus garryana. Mycorrhiza 19: 149–158. Staden R, Beal KF, Bonfield JK (2000): The Staden package, 1998. Methods Mol Biol 132: 115–130. Stalpers JA (1993): The Aphyllophoraceous fungi I. Keys to the species of the Thelephorales. Stud Mycol 35: 1–168. Stevens PF (2004): Angiosperm MOBOT/research/APweb/

phylogeny

website.

Version

5.

http://www.mobot.org/

Straker CJ (1996): Ericoid mycorrhiza: ecological and host specificity. Mycorrhiza 6: 215–225. Strullu-Derrien C, Strullu D-G (2007): Mycorrhization of fossil and living plants. Cr Rev Palevol 6: 483–494. Swofford DL (2003): PAUP*. Phylogenetic Analysis Using Parsimony (*and Other Methods). Version 4. Sinauer Associates, Sunderland, Massachusetts. –Swofford DL, Olsen GJ, Waddell PJ, Hillis DM (1996): Phylogenetic inference. – In: Hillis DM, Moritz C, Mable BK (eds.): Molecular systematics. Sinauer Associates Inc., Sunderland, Massachusetts. pp. 407–514. –Szodfridt I (1969): Adatok az Őrség erdőinek termőhelyi adottságaihoz. Vasi Szemle 23: 386–394. Tabacchioni S, Chiarini L, Bevivino A, Cantale C, Dalmastri C (2000): Bias caused by using different isolation media for assessing the genetic diversity of a natural microbial population. Microb Ecol 40: 169–176.

142

Tamponnet C, Martin-Garin A, Gonze MA, Parekh N, Vallejo R, Sauras-Yera T, Casadesus J, Plassard C, Staunton S, Norden M, Avila R, Shaw G (2008): An overview of BORIS: Bioavailability of Radionuclides in Soils. J Environ Radioact 99(5): 820–30. Tavaré S (1986): Some probabilistic and statistical problems in the analysis of DNA sequences. Lect Math Life Sci 17: 57–86. Taylor DL, Bruns TD (1997): Independent, specialized invasions of ectomycorrhizal mutualism by two nonphotosynthetic orchids. Proc Natl Acad Sci USA 94: 4510–4515. Taylor DL, Bruns TD, Leake JR, Read DJ (2002): Mycorrhizal specificity and function in mycoheterotrophic plants. - In: Varma A, Hock B (eds.): Mycorrhiza. (2nd edn.) Springer-Verlag, Berlin, Heidelberg. pp. 375–413. Taylor DL, Bruns TD, Szaro TM, Hodges SA (2003): Divergence in mycorrhizal specialization within Hexalectris spicata (Orchidaceae), a nonphotosynthetic desert orchid. Am J Bot 90(8): 1168–1179. Taylor TN, Klavins SD, Krings M, Taylor EL, Kerp H, Hass H (2004): Fungi from the Rhynie chert: a view from the dark side. T Roy Soc Edin-Earth 94: 457–473. Taylor TN, Krings M (2005): Fossil microorganisms and land plants: Associations and interactions. Symbiosis 40: 119–135. Taylor TN, Remy W, Hass H, Kerp H (1995): Fossil arbuscular mycorrhizae from the Early Devonian. Mycologia 87: 560–573. Tedersoo L, Köljalg U, Hallenberg N, Larsson K-H (2003): Fine scale distribution of ectomycorrhizal fungi and roots across substrate layers including coarse woody debris in a mixed forest. New Phytol 159: 153–165. Tedersoo L, Hansen K, Perry BA, Kjøller R (2006a): Molecular and morphological diversity of pezizalean ectomycorrhiza. New Phytol 170: 581–596. Tedersoo L, Jairus T, Horton BM, Abarenkov K, Suvi T, Saar I, Köljalg U. (2008): Strong host preference of ectomycorrhizal fungi in a Tasmanian wet sclerophyll forest as revealed by DNA barcoding and taxon-specific primers. New Phytol 180(2): 263–265. Tedersoo L, Pellet P, Köljalg U, Selosse M-A (2007b): Parallel evolutionary paths to mycoheterotrophy in understorey Ericaceae and Orchidaceae: ecological evidence for mixotrophy in Pyroleae. Oecologia 151(2): 206–217. Tedersoo L, Suvi T, Beaver K, Köljalg U (2007a): Ectomycorrhizal fungi of the Seychelles: diversity patterns and host shifts from the native Vateriopsis seychellarum (Dipterocarpaceae) and Intsia bijuga (Caesalpiniaceae) to the introduced Eucalyptus robusta (Myrtaceae), but not Pinus caribea (Pinaceae). New Phytol 175: 321–333. Tedersoo L, Suvi T, Larsson E, Köljalg U (2006b): Diversity and community structure of ectomycorrhizal fungi in a wooded meadow. Mycol Res 110(6): 734–748. Thind KS, Rattan SS (1971): The Thelephoraceae of India. Part 4. The genus Tomentella. Indian Phytopathol 24: 32–42. Thompson J, van Spaendonk RML, Choudhuri R, Sinden RE, Janse CJ, Waters AP (1999): Heterogeneous ribosome populations are present in Plasmodium berghei during development in its vector. Mol Microbiol 31(1): 253–260. Thompson JD, Gibson TJ, Plewniak F, Jeanmougin F, Higgins DG (1997): The ClustalX windows interface: flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools. Nucl Acid Res 24: 4876–4882. Tibbett M, Sanders FE, Cairney JWG (2002): Low-temperature-induced changes in trehalose, mannitol and arabitol associated with enhanced tolerance to freezing in ectomycorrhizal basidiomycetes (Hebeloma spp.). Mycorrhiza 12: 249–255.

143

Tiedje JM, Asuming-Brempong S, Nüsslein K, Marsh TL, Flynn SJ (1999): Opening the black box of soil microbial diversity. Appl Soil Ecol 13: 109–122. Tímár G, Ódor P, Bodonczi L (2002): Az Őrségi Tájvédelmi Körzet erdeinek jellemzése. Kanitzia 10: 109–136. Timonen S és Kauppinen P (2008): Mycorrhizal colonisation patterns of Tilia trees in street, nursery and forest environments in southern Finland. Urban Forestry & Urban Greening 7: 265–276. Torsvik V, Goksyr J, Daae FL (1990): High diversity in DNA of soil bacteria. Appl Environ Microbiol 56(3): 782–787. Trappe JM (1987): Phylogenetic and ecologic aspects of mycotrophy in the angiosperms from an evolutionary standpoint. – In: Safir GR (ed): Ecophysiology of VA mycorrhizal plants. Boca Raton, FL, USA: CRC Press. pp. 5–25. Trappe JM (2005): A.B. Frank and mycorrhizae: the challenge to evolutionary and ecologic theory. Mycorrhiza 15(4): 277–281. Traub RJ, Monis PT, Robertson ID (2005): Molecular epidemiology: A multidisciplinary approach to understanding parasitic zoonoses. Int J Parasitol 35: 1295–1307. Treseder KK, Turner KM (2007): Glomalin in ecosystems. Soil Sci Soc Am J 71: 1257–1266. Tyler G (1992): Tree species affinity of decomposer and ectomycorrhizal macrofungi in beech (Fagus sylvatica L.), oak (Quercus robur L.) and hornbeam (Carpinus betulus L.) forests. For Ecol Man 47: 269–284. Uhl M (1988): Identifizierung und Charakterisierung von Ektomykorrhizen an Pinus silvestris und von Ektomykorrhizen aus der Gattung Tricholoma. Diss. Univ. München Urban A, Weiss M, Bauer R (2003): Ectomycorrhizas involving sebacinoid mycobionts. Mycol Res 107(1): 3–14. Vajna L, Jakucs E (2003): A gombák ökológiája – In: Jakucs E, Vajna L (eds.): Mikológia. Agroinform Kidó, Budapest. pp. 239–305. Valentine LL, Fiedler TL, Hart AN, Petersen CA, Berninghausen HK, Southworth D (2004): Diversity of ectomycorrhizas associated with Quercus garryana in southern Oregon. Can J Bot 82: 123– 135. Van der Putten WH, Vet LEM, Harvey JA, Wackers FL (2001): Linking above- and belowground multitrophic interactions of plants, herbivores, pathogens, and their antagonists. TREE 16: 547– 554. Van Hees PAW, Rosling A, Lundström US, Finlay RD (2006): The biogeochemical impact of ectomycorrhizal conifers on major soil elements (Al, Fe, K and Si). Geoderma 136: 364–377. Väre H, Vestberg M, Eurola S, (1992): Mycorrhiza and root associated fungi in Spitsbergen. Mycorrhiza 1: 93–104. Verbeken A (1998): Studies in tropical African Lactarius species 5. A sinopsis of the subgenus Lactifluus (Burl.) Hesler & A.H.Sm. emend. Mycotaxon 66: 363–386. Verbeken A, Stubbe D, Nuytinck J (2008): Two new Lactarius species from Cameroon. Cryptogamie Mycol 29(2): 137–143. Vilgalys R, Hester M (1990): Rapid genetic identification and mapping of enzymatically amplified ribosomal DNA from several Cryptococcus species. J Bacteriol 172: 4238–4246. Vincenot L, Tedersoo L, Richard F, Horcine H, Köljalg U, Selosse MA (2008): Fungal associates of Pyrola rotundifolia, a mixotrophic Ericaceae, from two Estonian boreal forests. Mycorrhiza 19(1): 15–25.

144

Visser S (1995): Ectomycorrhizal fungal succession in jack pine stands following wildfire. New Phytol 129: 389–401. Walker JF, Miller OK, Horton JL (2005): Hyperdiversity of ectomycorrhizal fungus assemblages on oak seedlings in mixed forests in the southern Appalachian Mountains. Mol Ecol 14: 829–838. Wallenda T, Kottke I (1998): Nitrogen deposition and ectomycorrhizas. New Phytol 139: 169–187. Waltert B, Wiemken V, Rusterholz H-P, Boller T, Baur B (2002): Disturbance of forest by trampling: Effects on mycorrhizal roots of seedlings and mature trees of Fagus sylvatica. Plant Soil 243: 143–154. Wang B, Qiu Y-L (2006): Phylogenetic distribution and evolution of mycorrhizas in land plants. Mycorrhiza 16: 299–363. Warcup JH (1985): Ectomycorrhiza formation by Glomus tubiforme. New Phytol 99: 267–272. Warcup JH (1988): Mycorrhizal associations of isolates of Sebacina vermifera. New Phytol 110: 227– 231. Watling R (2005): Fungal associates of Salix repens in northern oceanic Britain and their conservation significance. Mycol Res 109(12): 1418–1424. Watrous LE, Wheeler QD (1981): The out-group comparison method of character analysis. Syst Zool 30: 1–11. Weising K, Nyboom H, Wolff K, Meyer W (1995): DNA fingerprinting in plants and fungi. CRC Press Inc., Boca Raton, Florida. Weiss M (1991): Studies on ectomycorrhizae XXXIII. Description of three mycorrhizae synthesized on Picea abies. Mycotaxon 40: 53–77. Weiss M, Oberwinkler F (2001): Phylogenetic relationships in Auriculariales and related groups – hypotheses derived from nuclear ribosomal DNA sequences. Mycol Res 105: 403–415. Weiss M, Selosse MA, Rexer KH, Urban A, Oberwinkler F (2004): Sebacinales: a hitherto overlooked cosm of heterobasidiomycetes with a broad mycorrhizal potential. Mycol Res 108: 1003–1010. Welch BL (1947): The generalization of "student's" problem when several different population variances are involved. Biometrika 34: 28–35. Welsh J, McClelland M (1990): Fingerprinting genomes using PCR with arbitrary primers. Nucl Acids Res 18: 7213–7218. White TJ, Bruns T, Lee S, Taylor J (1990): Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics. – In: Innis MA, Gelfand DH, Sninsky JJ, White TJ (eds.): PCR protocols: a guide to methods and applications. Academic Press, New York. pp. 315–322. Whitfield J (2007): Underground networking. Nature 449: 136–138. Wiemken V (2007): Trehalose synthesis in ectomycorrhizas – a driving force of carbon gain for fungi? New Phytol 174: 228–230. Wiemken V, Ineichen K, Boller T (2001a): Development of ectomycorrhizas in model beech–spruce ecosystems on siliceous and calcareous soil: a 4-year experiment with atmospheric CO2 enrichment and nitrogen fertilization. Plant and Soil 234: 99–108. Wiemken V, Laczko E, Ineichen K, Boller T (2001b): Effects of elevated carbon dioxide and nitrogen fertilization on mycorrhizal fine roots and the soil microbial community in beech–spruce ecosystems on siliceous and calcareous soil. Microb Ecol 42:126–135 Wiemken V, Boller T (2002): Ectomycorrhiza: gene expression, metabolism and the wood-wide web. Curr Op Plant Biol 5: 355–361. Wilcox HE (1983): Fungal parasitism of woody plant roots from mycorrhizal relationships to plant disease. Ann Rev Phytopathol 21: 221–242.

145

Wilkinson DM (2001): Mycorrhizal evolution. TREE 16(2): 64–65. Williams JGK, Kubelik AR, Livak KJ, Rafalski JA, Tingey SV (1990): DNA polymorphism amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers. Nucl Acids Res 18: 6231–6235. Winkelmann G (2007): Ecology of siderophores with special reference to the fungi. BioMetals 20(3– 4): 379–392. Wu C-G, Lin S-J (1997): Endogonales in Taiwan: a new genus with unizygosporic sporocarps and a hyphal mantle. Mycotaxon 64: 179–188. Wurzburger N, Bidartondo MI, Bledsoe CS (2001): Characterization of Pinus ectomycorrhizas from mixed conifer and pygmy forests using morphotyping and molecular methods. Can J Bot 79: 1211–1216 Yamada A, Ogura T, Ohmasa M (2001a): Cultivation of mushrooms of edible ectomycorrhizal fungi associated with Pinus densiflora by in vitro mycorrhizal synthesis I. Primordium and basidiocarp formation in open-pot culture. Mycorrhiza 11: 59–66. Yamada A, Ogura T, Ohmasa M (2001b): Cultivation of mushrooms of edible ectomycorrhizal fungi associated with Pinus densiflora by in vitro mycorrhizal synthesis. II. Morphology of mycorrhizas in open-pot soil. Mycorrhiza 11: 67–81. Ye RW, Wang T, Bedzyk L, Croker KM (2001): Applications of DNA microarrays in microbial systems. J Microbiol Meth 47: 257–272. Yorou NS, Agerer R (2007): Type studies of three tomentelloid species (Basidiomycota, Thelephorales): Tomentella radiosa, Tomentella cinereoumbrina and Tomentella punicea. Nova Hedw 85(3-4): 521–539. Yorou NS, Köljalg U, Sinsin B, Reinhard A (2007): Studies in African thelephoroid fungi: 1. Tomentella capitata and Tomentella brunneocystidia, two new species from Benin (West Africa) with capitate cystidia. Mycol Prog 6(1): 7–18. Yorou NS, Agerer R (2008): Tomentella africana, a new species from Benin (West Africa) identified by morphological and molecular data. Mycologia 100(1): 68–80. Young BW, Massicotte HB, Tackaberry LE, Baldwin QF, Egger KN (2002): Monotropa uniflora: morphological and molecular assessment of mycorrhizae retrieved from sites in the Sub-Boreal Spruce biogeoclimatic zone in central British Columbia. Mycorrhiza 12: 75–82. Yu TEJ-C, Egger KN, Peterson RL (2001): Ectendomycorrhizal associations – characteristics and functions. Mycorrhiza 11: 167–177. Zak B (1973): Classification of ectomycorrhizae. – In: Marks GC, Koslowski TT (eds.): Ectomycorrhizae – their Ecology and Physiology. Academic Press, New York, p. 43–78. Zambonelli A, Iotti M, Amicucci A, Pisi A (1999): Caratterizzazione anatomo-morfologica delle micorrize di Tuber maculatum Vittad. su Ostrya carpinifolia Scop. Micol Ital 28: 29–35. Zambonelli A, Salomoni S, Pisi A (1993): Caratterizzazione anatomomorfologica delle micorrize di Tuber spp. su Quercus pubescenes. Willd. Micol Ital 3: 73–90. Zeleznik R, Hrenko M, Then C, Koch N, Grebenc T, Levanic T, Kraigher H (2007): CASIROZ: Root parameters and types of ectomycorrhiza of young beech plants exposed to different ozone and light regimes. Plant Biology 9(2): 298–308. Zelles L (1999): Fatty acid patterns of phospholipids and lipopolysaccharides in the characterisation of microbial communities in soil: a review. Biol Fertil Soils 29: 111–129. Zimmer K, Hynson NA, Gebauer G, Allen EB, Allen MF, Read DJ (2007): Wide geographical and ecological distribution of nitrogen and carbon gains from fungi in pyroloids and monotropoids (Ericaceae) and in orchids. New Phytol 175: 166–175.

146

Függelék

Függelék – 1: A felhasznált oldatok összetétele

F–1

Függelék – 2: A filogenetikai elemzések leírása

F–3

Függelék – 3: A filogenetikai elemzések eredményeinek paraméterei

F–4

Függelék – 4: A Humaria és Genea ektomikorrhizák kvantitatív jellemzésének leíró statisztikái

F–6

Függelék – 5: A hazai tomentelloid ektomikorrhiza-morfotípusok gyűjtési adatai

F–7

Függelék – 6: Az ektomikorrhiza-közösség kis abundanciájú, azonosított tagjainak meghatározására számított filogenetikai fák F–8 Függelék – 7: A molekuláris elemzésekbe vont, adatbázisokból letöltött DNS-szekvanciák adatai

F – 14

F–0

Függelék – 1: A felhasznált oldatok összetétele

A felhasznált oldatok összetétele

Glutár-aldehid oldat (2,5%) – 25%-os Glutár-aldehid oldat (SPI-CHEM) – szükséges mennyiségű foszfát-puffer (0,07M) Foszfát-puffer (0,07M, pH=7,2) – 1 g Na2HPO4·2H2O, 80 ml desztillált vízben feloldva – 0,19 g KH2PO4, 20 ml desztillált vízben feloldva – az oldat 7,2 értékű pH-ját a fenti két oldat segítségével állítjuk be Uranil-acetát oldat – 0,05 g uranil-acetát (UO2(CH3COO)2) – 1 ml metanol Ólom-citrát oldat – – –

400 mg ólom-nitrát (Pb(NO3)2) 643 mg nátrium-citrát 15 ml NaOH-oldat (0,16 N)

FEA-oldat – 900 ml etanol-oldat (90%) – 50 ml ecetsav (cc.) – 50 ml formaldehid (cc.) CTAB-oldat – 2 g CTAB (cetil-trimetilammónium-bromid) – 8,2 g NaCl – 5 ml Tris-HCl (2 M, pH=8) – 8 ml EDTA-oldat (0,5 M) – desztillált víz (200 ml végtérfogatra kiegészítéshez) Tris-HCl (2M, pH=8) – – –

60,57 mg Tris 250 ml kétszer desztillált víz az oldat 8,0 értékű pH-ját cc. HCl-val állítjuk be

F-1

Függelék – 1: A felhasznált oldatok összetétele EDTA-oldat (0,5M) – 9,306 g EDTA (etiléndiamin-tetraecetsav) – 250 ml kétszer desztillált víz TBE-oldat (10x töménységű) – 107,8 g Tris – 55 g bórsav (H3BO3) – 9,5 g Na2EDTA – desztillált víz (1000ml végtérfogatra kiegészítéshez) Agaróz gél (1%) – –

1 g agaróz 100 ml TBE-oldat

A PCR-elegy összetétele: – 1/10 térfogatú 10x töménységű, (NH4)2SO4-tartalmú puffer (Fermentas®) – 2μM MgCl2 (Fermentas®) – 200-200 μM dNTP (Fermentas®) – 0,5 μM (5’→3’, “forward”) primer – 0,5 μM (3’→5’, “reverse”) primer – 1 egységnyi Taq-polimeráz enzim (Fermentas®) – szükséges mennyiségű steril desztillált víz – DNS-kivonat A hisztokémiai reakciók reagensei

1. FeSO4- oldat: 1 g FeSO4 10 ml desztillált vízben oldva, néhány csepp cc. H2SO4oldat hozzáadásával; 2. Guajak: 1 g guajak 6 ml 70 %-os etanolban oldva; 3. KOH-oldat: 15 m/v %-os vizes oldat; 4. Tejsav: 85 %-os vizes oldat; 5. Melzer-reagens: 0,5 g I2, 1,5 g KI, 20 ml desztillált víz, 20 ml klorál-hidrát; 6. Szulfo-vanillin: ezt az oldatot a tárgylemezen, a minta lefedése előtt állítjuk elő: néhány vanillin-kristályt helyezünk el a minta közelében, majd egy csepp cc. H2SO4-at cseppentünk rá. A reagensek hozzáadása előtt a köpenypreparátumokról gondosan leitattuk a vizet. A reakciók eredményét fénymikroszkópban, DIC funkcióban vizsgáltuk. F-2

Függelék – 2: A filogenetikai elemzések leírása

A filogenetikai analízis módszere MP Vizsgált nemzetség ill. génszakasz HumariaGenea közös adatkészlet

SSU

Humaria

ITS

Genea

ITS ITS

Pachyphloeus LSU Tomentella

ITS

Clavulina

ITS

Entoloma

ITS

Inocybe

ITS

Sebacina

ITS

Tricholoma

ITS

Tuber

ITS

Lactarius

ITS

NJ 10.000 bootstrapismétlés 10.000 bootstrapismétlés 10.000 bootstrapismétlés 10.000 bootstrapismétlés 10.000 bootstrapismétlés 10.000 bootstrapismétlés 10.000 bootstrapismétlés 10.000 bootstrapismétlés 10.000 bootstrapismétlés 10.000 bootstrapismétlés 10.000 bootstrapismétlés 10.000 bootstrapismétlés 10.000 bootstrapismétlés

heurisztikus keresések száma

bootstrap ismétlések száma

ML

1000 ismétlés, 1000-1000 kereséssel 100 ismétlés, 100-100 kereséssel 100 ismétlés, 100-100 kereséssel 1000 ismétlés, 1000-1000 kereséssel 1000 ismétlés, 100-100 kereséssel 100 ismétlés, 100-100 kereséssel

100 bootstrap ismétlés 100 bootstrap ismétlés 100 bootstrap ismétlés 100 bootstrap ismétlés 100 bootstrap ismétlés 100 bootstrap ismétlés

-

-

-

1.000.000 generáció

-

-

-

500.000 generáció

-

-

-

1.000.000 generáció

-

-

-

750.000 generáció

-

-

-

750.000 generáció

-

-

-

1.000.000 generáció

10.000

100 ismétlés, 100-100 kereséssel

-

2.000.000 generáció

10.000 10.000 10.000 10.000 10.000 10.000

Bayes

500.000 generáció 1.000.000 generáció 500.000 generáció 1.000.000 generáció 1.000.000 generáció 2.000.000 generáció

F–3

Függelék – 3: A filogenetikai elemzések eredményeinek paraméterei

A filogenetikai analízis módszere Vizsgált nemzetség ill. génszakasz

HumariaGenea közös adatkészlet

Humaria

Genea

SSU

ITS

ITS

ITS

Pachyphloeus LSU

Tomentella

Clavulina

Entoloma

ITS

ITS

ITS

MP NJ min. evolution score: 0,05028 min. evolution score: 1,19858 min. evolution score: 2,9735 min. evolution score: 1,09730 min. evolution score: 0,73760

min. evolution score: 1,72763 min. evolution score: 2,00805 min. evolution score: 2,06539

Keresés eredménye - informatív karakter: 4/1008 - 4 sziget - legjobb: 1 db, 4 fával - informatív karakter: 180/800 - 5 sziget - legjobb: 1 db, 42 fával - informatív karakter: 536/717 - 34 sziget - legjobb: 1 db, 2 fával - informatív karakter: 374/651 - 4 sziget - legjobb: 1 db, 12 fával - informatív karakter: 460/839 - 4 sziget - legjobb: 3 db, 214, 1, 1 fával - informatív karakter: 283/636 - 20 sziget - legjobb: 1 db, 96 fával

-

-

Legrövidebb fa adatai hossz: 114 CI = 0,9561 HI = 0,0439 RI = 0,9107 RC = 0,8708

ML

Bayes

logL: -1782.28

- a két futás közti végső különbség: 0,004761 - logLátl: -1850,37 - a két futás közti végső különbség: 0,006405 - logLátl: -3766,56 - a két futás közti végső különbség: 0,006751 - logLátl: -9273,36 - a két futás közti végső különbség: 0,006124 - logLátl: -3274,71 - a két futás közti végső különbség: 0,007593 - logLátl: -4302,91

hossz: 1350 CI = 0,7407 HI = 0,2593 RI = 0,7656 RC = 0,5671

logL: -3804,56

hossz: 2730 CI = 0,5289 HI = 0,4711 RI = 0,8256 RC = 0,4372

logL: -9228,51

hossz: 959 CI = 0,8425 HI = 0,1575 RI = 0,8753 RC = 0,7375

logL: -3248,98

hossz: 1091 CI = 0,6609 HI = 0,3391 RI = 0,8523 RC = 0,5632

logL: -4262,73

hossz: 1748 CI = 0,3879 HI = 0,6121 RI = 0,6615 RC = 0,2566

logL: -6000,08

-

-

-

-

- a két futás közti végső különbség: 0,007629 - logLátl: -6008,24 - a két futás közti végső különbség: 0,016544 logLátl: -4555,73 - a két futás közti végső különbség: 0,007790 logLátl: -6539,75

F-4

Függelék – 3: A filogenetikai elemzések eredményeinek paraméterei

Inocybe

Sebacina

Tricholoma

Tuber

Lactarius

ITS

ITS

ITS

ITS

ITS

min. evolution score: 2,74466 min. evolution score: 1,22342 min. evolution score: 1,28337 min. evolution score: 1,44042 min. evolution score: 0,37724

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

- informatív karakter: 195/682 - 4 sziget - legjobb: 1 db, 4112 fával

hossz: 515 CI = 0,7631 HI = 0,2369 RI = 0,8347 RC = 0,6370

-

- a két futás közti végső különbség: 0,012638 logLátl: -8543,91 - a két futás közti végső különbség: 0,012515 logLátl: -3936,91 - a két futás közti végső különbség: 0,006136 logLátl: -4815,32 - a két futás közti végső különbség: 0,010048 logLátl: -4058,31 - a két futás közti végső különbség: 0,011871 - logLátl: -2519,06

F-5

Függelék – 4: A Humaria és Genea ektomikorrhizák kvantitatív jellemzésének leíró statisztikái A Humaria ill. Genea ektomikorrhizák kvantitatív anatómiai jellemzésének leíró statisztikái. A táblázatban az átlagértékek, a szórás és (zárójelben megadva) a mért adatok száma szerepel. A mért adatok jellemzését l. az Anyag és módszer c. fejezetben. A BP 97489-95 minták a Humaria ektomikorrhizák mért adatai, az ezekből képzett teljes adatkészletből számolt statisztikákat jelöli a ΣHumaria fejlécű oszlop. A BP 92140 minta az “eredeti Genea ektomikorrhiza” mért adatai (G. verrucosa – Jakucs és mts. 1998). A BP 98701 a dolgozatban molekuláris módszerekkel meghatározott (“igazolt”) Genea ektomikorrhiza adatait jelöli. BP 97489

BP 97490

BP 97491

BP 97492

BP 97493

BP 97494

BP 97495

ΣHumaria

BP 92140

BP 98701

A külső köpenyréteg sejtjeinek falvastagsága (µm)

0,71 +/- 0,18 (106)

0,94 +/- 0,29 (86)

2,08 +/- 0,64 (77)

1,04 +/- 0,32 (91)

1,11 +/- 0,34 (56)

0,99 +/- 0,28 (90)

0,82 +/- 0,26 (119)

1,05 +/- 0,53 (625)

1,80 +/- 0,40 (80)

0,65 +/- 0,16 (124)

A külső köpenyréteg anguláris sejtjeinek “hossza” (µm)

13,41 +/- 3,82 (38)

17,48 +/- 3,98 (49)

27,38 +/-7,05 (50)

20,12 +/- 9,48 (51)

15,13 +/- 3,59 (40)

15,34 +/- 3,51 (50)

12,82 +/- 4,42 (57)

17,50 +/- 7,34 (335)

26,69 +/- 5,36 (59)

10,71 +/- 2,11 (77)

8,41 +/- 1,79 (39)

11,99 +/- 2,62 (49)

19,49 +/- 4,33 (48)

15,67 +/- 8,25 (55)

10,08 +/- 2,06 (41)

10,59 +/- 2,95 (49)

8,40 +/- 2,67 (56)

12,21 +/- 5,69 (337)

18,08 +/- 3,93 (58)

6,73 +/- 1,71 (77)

1,61 +/- 0,43 (38)

1,49 +/- 0,36 (49)

1,37 +/- 0,24 (50)

1,44 +/- 0,30 (58)

1,46 +/- 0,31 (39)

1,42 +/- 0,25 (47)

1,53 +/- 0,41 (56)

1,47 +/- 0,34 (337)

1,48 +/- 0,29 (58)

1,65 +/- 0,42 (77)

nem értékelhető

16,66 +/- 5,35 (8)

nem értékelhető

15,46 +/- 1,65 (9)

12,13 +/- 1,25 (9)

11,38 +/- 0,86 (7)

11,99 +/- 1,69 (7)

13,63 +/- 3,34 (40)

15,54 +/- 1,02 (6)

nem értékelhető

5,70 +/- 0,99 (20)

7,20 +/- 1,08 (25)

6,34 +/- 0,97 (40)

8,60 +/- 1,05 (18)

5,90 +/- 1,48 (37)

6,66 +/- 1,86 (17)

5,27 +/- 0,63 (27)

6,39 +/- 1,49 (184)

4,67 +/- 0,46 (24)

nem értékelhető

nem értékelhető

2,77 +/- 0,34 (18)

nem értékelhető

2,81 +/- 0,66 (22)

2,79 +/- 0,48 (21)

2,83 +/- 0,77 (16)

2,81 +/- 1,07 (14)

2,80 +/- 0,66 (91)

3,58 +/- 1,64 (17)

nem értékelhető

0,81 +/- 0,21 (18)

1,30 +/- 0,38 (41)

1,29 +/- 0,29 (63)

1,79 +/- 0,53 (27)

1,76 +/- 0,60 (43)

1,48 +/- 0,51 (26)

1,29 +/- 0,42 (50)

1,40 +/- 0,50 (268)

1,34 +/- 0,25 (46)

nem értékelhető

0,71 +/- 0,18 (38)

0,67 +/- 0,17 (54)

0,86 +/- 0,31 (45)

0,61 +/- 0,13 (32)

0,59 +/- 0,11 (43)

0,60 +/- 0,11 (63)

0,53 +/- 0,10 (74)

0,64 +/- 0,19 (349)

0,54 +/- 0,10 (76)

nem értékelhető

30,11 +/12,11 (21)

53,83 +/- 16,76 (15)

67,16 +/- 17,5 (19)

47,12 +/- 19,63 (11)

23,89 +/- 12,48 (17)

25,24 +/- 6,25 (16)

36,82 +/- 12,98 (17)

40,26 +/- 20,76 (116)

44,29 +/- 18,69 (7)

nem értékelhető

A külső köpenyréteg anguláris sejtjeinek “szélessége” (µm) A külső köpenyréteg anguláris sejtjeinek “izodiametrikussága” A kiágazó hifák átmérője a proximális részeken (µm) A kiágazó hifák átmérője a disztális részeken (µm) A kiágazó hifák falvastagsága a proximális részeken (µm) A kiágazó hifák falvastagsága a disztális részeken (µm) A hifát borító szemölcsök átmérője (µm) A kiágazó hifák szeptumtávolsága (µm)

F-6

Függelék – 5: A hazai tomentelloid ektomikorrhiza-morfotípusok gyűjtési adatai

A hazai tomentelloid morfotípusok gyűjtési adatai. Relatív gyakorisági kategóriák: A minor komponens (<10%), B minor kodomináns komponens (10-50%), C major kodomináns komponens (50-90%), D domináns komponens (>90%), n.a.: nincs adat. A publikációk rövidítése: K-2001: Köljalg és mts. (2001), J-2005a: Jakucs és mts. (2005a), J-2005b: Jakucs és mts. (2005b).

Herbáriumi azonosító

Mintaszám

Lelőhely

Gyűjtés időpontja

Gazdanövény

Gyakoriság

Publikáció

GenBank azonosító

BP 92148

HU 130

Tompa

1998.06.02.

Populus alba

B

K-2001

AJ421252

BP 92153

HU 184

Tompa

1998.10.08.

Populus alba

n.a.

K-2001

AJ421250

BP 92154

HU 89

Püspökladány

1998.04.09.

Quercus cerris

n.a.

K-2001

AJ421251

BP 96971

HU 86

Püspökladány

1998.04.08.

Quercus cerris

D

J-2005a

AY635168

BP 96972

HU 125

Tompa

1998.06.02.

Populus alba

B

J-2005a

AY635169

BP 96975

HU 136

Tompa

1998.06.02.

Populus alba

n.a.

J-2005b

AY874389

BP 97486

HU 145

Kelebia

1998.10.08.

Populus alba

A

J-2005b

AY874390

BP 96976

HU 147

Kelebia

1998.10.08.

Populus alba

B

J-2005b

AY874388

BP 96977

HU 161

Kelebia

1998.10.08.

Populus alba

A

J-2005b

AY874386

BP 96981

HU 202

Tompa

1998.10.08.

Populus alba

n.a.

J-2005a

AY635175

BP 96982

HU 211

Püspökladány

1999.06.07.

Quecus robur

n.a.

J-2005b

AY874384

BP 96983

HU 221

Püspökladány

1997.06.07.

Quercus cerris

D

J-2005b

AY874383

BP 96984

HU 224

Kelebia

1997.06.07.

Populus alba

A

J-2005b

AY874387

BP 97487

HU 226

Tompa

1997.06.07.

Populus alba

B

J-2005b

AY874385

BP 96986

HU 231

Tompa

1997.06.07.

Populus alba

B

J-2005b

AY874379

BP 96987

HU 236

Püspökladány

2000.04.24.

Quecus robur

A

J-2005b

AY874380

BP 96988

HU 250

Püspökladány

2000.04.24.

Quecus robur

A

J-2005b

AY874382

BP 96989

HU 282

Püspökladány

2001.06.10.

Quecus robur

A

J-2005b

AY874381

-

HU 194

Kelebia

1998.10.08.

Populus alba

n.a.

-

-

F–7

Függelék – 6: Az ektomikorrhiza-közösség kis abundanciájú, azonosított tagjainak meghatározására számított filogenetikai fák

Cantharellus atratus (AB445115) Cantharellus cibarius (AB453024) HU 349 Clavulina monodiminutiva (DQ056365) 99 1.00

Clavulina caespitosa (DQ056371) 81 –

Clavulina sp. (DQ822798) Clavulina cinerea (EU118616)

NJ Bayes

99 0.99

Clavulina cinerea (AY456339) Clavulina cf. cinerea (EU597083) Clavulina cinerea (AF335456)

60 –

Clavulina cf. rugosa (DQ974712) Clavulina cristata (EU819415) Azonosítatlan ektomikorrhiza (AY534200) 99

98 –

0.99

Clavulina cristata (AJ889929) Clavulina cristata (AJ889938) Clavulina cristata (AY292292)

99 0.98

Azonosítatlan ektomikorrhiza (AM161513) Clavulina cristata (EF559274) Clavulina cf. cristata (DQ974710)

78 – 99 0.96

Azonosítatlan ektomikorrhiza (EF417811) Azonosítatlan ektomikorrhiza (EU645631) HU 627

0.1

Függelék 6/A. A Clavulina-morfotípusok mikobiontáinak filogenetikai helyzetét bemutató NJ-fa. Az egyes ágak felett a NJ-elemzéshez tartozó bootstrap-értékek, alattuk a Bayes-analízis során kapott posterior valószínűségi értékek szerepelnek. (A túl rövid ágak esetén a statisztikai értékeket egy vízszintes vonal fölött ill. alatt tüntettük fel, nyíllal jelölve, hogy mely elágazási pontokhoz tartoznak.) Pirossal jelöltük a mintaterületen gyűjtött ektomikorrhizákból származó szekvenciákat. A GenBankből származó szekvenciák esetében az azonosító számokat zárójelben adtuk meg. (Csak az 50% ill. 0,5 feletti statisztikai értékeket adtuk meg; a mérce 100 bázispárra jutó 10 szubsztitúciónak megfelelő ághosszat jelöl.)

F–8

Függelék – 6: Az ektomikorrhiza-közösség kis abundanciájú, azonosított tagjainak meghatározására számított filogenetikai fák

Neohygrophorus angelesianus (DQ494678)

NJ Bayes

Tephrocybe gibberosa (AF357041)

100 1.00

Tephrocybe gibberosa (AF357042)

– 0.96

Asterophora parasitica (AF357038)

54 0.98

Lyophyllum caerulescens (AF357052) Clitocybe candicans (DQ202268)

77 0.96

65 0.51

Clitocybe subditopoda (DQ202269) Clitocybe subditopoda (EU697244)

100 1.00

Clitocybe subditopoda (EU852800)

– 0.86

Tricholoma scalpturatum (AY573536)

51 0.99

100 1.00

Tricholoma portentosum (AF349686) Tricholoma portentosum (EU186273)

Entoloma ameides (EU784199) 99 1.00

100 1.00

Entoloma nitidum (AY228340) Entoloma nitidum (AF335449) 99 1.00

84 – 99 1.00

100 1.00

Entoloma clandestinum (EU784216) Entoloma cetratum (EU784213) Entoloma sp. (DQ974695) Entoloma sericeonitidum (EF421108) Entoloma aprile (EU784203)

90 0.81

Entoloma prunuloides (DQ206983) 73 –

Ektomik orrhizaképző gomba (EU444549) Entoloma rhodopolium (AB301602) HU 339

99 100 1.00

0.95

Entoloma - Mt

HU 345 Azonosítatlan ektomikorrhiza (AJ510276)

98 –

Entoloma caeruleopolitum (EU784211) 65 –

99 0.99

Azonosítatlan ektomik orrhiza (AJ938003) 99 1.00

Entoloma sinuatum (AJ966745) Entoloma sinuatum (DQ486700)

Azonosítatlan ektomikorrhiza (FJ210729) Entoloma crassipes (AB301603) Azonosítatlan bazidiumos gomba (AM902088)

59 0.97

96 0.99

Azonosítatlan Entolomataceae-faj (DQ273383) Entoloma sp. (DQ974694)

0.02

Függelék 6/B. A Entoloma-morfotípus mikobiontáinak filogenetikai helyzetét bemutató NJ-fa. Az egyes ágak felett a NJ-elemzéshez tartozó bootstrap-értékek, alattuk a Bayes-analízis során kapott posterior valószínűségi értékek szerepelnek. (A túl rövid ágak esetén a statisztikai értékeket egy vízszintes vonal fölött ill. alatt tüntettük fel, nyíllal jelölve, hogy mely elágazási pontokhoz tartoznak.) Pirossal jelöltük a mintaterületen gyűjtött ektomikorrhizákból származó szekvenciákat. A GenBankből származó szekvenciák esetében az azonosító számokat zárójelben adtuk meg. (Csak az 50% ill. 0,5 feletti statisztikai értékeket adtuk meg; a mérce 100 bázispárra jutó 2 szubsztitúciónak megfelelő ághosszat jelöl.)

Függelék – 6: Az ektomikorrhiza-közösség kis abundanciájú, azonosított tagjainak meghatározására számított filogenetikai fák Tubaria confragosa (DQ267126) Agrocybe erebia (FJ596810) Azonosítatlan ektomik orrhiza (EU816645)

52 1.00

Inocybe glabripes (AM882902) 84 Inocybe sp. (AM882987) 100 1.00 99 Inocybe - Mt 1. 1.00 1.00 HU 301

NJ Bayes

99 Azonosítatlan ektomik orrhiza (DQ974743) 1.00 Azonosítatlan ek tomikorrhiza (DQ974816) Inocybe subnudipes (AM882809)

100 1.00 85

Inocybe aff. microspora (AM882971) 99 1.00 Inocybe glabripes (AM882807) 95 Inocybe cf. glabripes (AJ889952) 0.96 Inocybe tenebrosa (AM882899)

99 1.00

96 1.00

57 0.74

Inocybe pudica (EU525970)

Inocybe albomarginata (AM882808)

Azonosítatlan ektomik orrhizak épző faj (AB218093) 99 Azonosítatlan ektomik orrhiza (EU816656) – Inocybe - Mt 3. 80 99 HU 355 – – Inocybe sp. (AJ534897) Inocybe sp. (AJ534923) Inocybe cf. fuscidula (AM882935) Inocybe fraudans (AJ889953)

99 1.00

Inocybe lanuginosa (DQ367905) Inocybe maculata (EU525974) 100 Inocybe ochroalba (EU326178) 1.00 99 Inocybe maculata (EU525973) – Inocybe ochroalba (EU326178)

58 –

Inocybe ochroalba (AM882882) Inocybe petiginosa (AM113952)

75 –

Inocybe petiginosa (AJ889956) Azonosítatlan ek tomikorrhiza (AM161520) Inocybe petiginosa (AM882708)

90 –

100 1.00 100 1.00 98 1.00

99 0.92

Azonosítatlan ektomikorrhiza (AM159586) HU 325

Inocybe - Mt 2.

Inocybe jacobi (AM882710)

99 0.83 100 1.00

Inocybe subexilis (AM882711) Inocybe calospora (AM882758) Inocybe calospora (AM882759) Inocybe calospora (AF325665)

Inocybe - Mt 4. 100 HU 374 1.00 Inocybe cf. asterospora (AM882722)

97 1.00

Azonosítatlan ektomik orrhiza (FM993253)

100 Inocybe rennyi (AM882715) 1.00 Inocybe rennyi (AM882716)

66 –

74 0.85

Inocybe petiginosa (AM882707)

66 –

100 Inocybe hirculus (FJ531872) 1.00 Inocybe salicis (AM882724) Inocybe diabolica (AM882903)

100 Inocybe calospora (EU819472) 1.00 Inocybe radiata (EU819490)

77 0.72

Inocybe rufofusca (EF655684)

79 – 99 1.00

99 1.00 79 1.00

100 Inocybe rufofusca (EF655704) 1.00 Inocybe rufofusca (EU326156)

75 Inocybe intricata (EU523561) 98 0.92Azonosítatlan ektomik orrhiza (AB218112) 0.99 Inocybe cf. praetervisa (AM882989) Azonosítatlan gombafaj (EU554704)

64 0.99

100 Inocybe castanea (AM882719) 1.00 Inocybe castanea (AM882718) Inocybe sp. (DQ822809) Inocybe alnea (AM882717)

– 1.00

100 Inocybe cf. hirculus (AM882986) 1.00 Inocybe hirculus (AM882723) Inocybe xanthomelas (AM882721)

0.05

Függelék 6/C. A Inocybe-morfotípusok mikobiontáinak filogenetikai helyzetét bemutató NJ-fa. Az egyes ágak felett a NJ-elemzéshez tartozó bootstrap-értékek, alattuk a Bayes-analízis során kapott posterior valószínűségi értékek szerepelnek. (A túl rövid ágak esetén a statisztikai értékeket egy vízszintes vonal fölött ill. alatt tüntettük fel, nyíllal jelölve, hogy mely elágazási pontokhoz tartoznak.) Pirossal jelöltük a mintaterületen gyűjtött ektomikorrhizákból származó szekvenciákat. A GenBankből származó szekvenciák esetében az azonosító számokat zárójelben adtuk meg. (Csak az 50% ill. 0,5 feletti statisztikai értékeket adtuk meg; a mérce 100 bázispárra jutó 5 szubsztitúciónak megfelelő ághosszat jelöl.)

Függelék – 6: Az ektomikorrhiza-közösség kis abundanciájú, azonosított tagjainak meghatározására számított filogenetikai fák

Tremella foliacea (AF444431) Tremella mesenterica (FJ534885) Tremella globispora (FJ534883) Azonosítatlan ektomik orrhizak épző faj (EU645629) Azonosítatlan Sebacinales k lón (EF030880)

81

Sebacinaceae sp. (AJ534907)

0.90 82 – 0.53

Sebacinoid - Mt 1.

HU 334

0.90

Azonosítatlan Sebacina izolátum (EU668267) Azonosítatlan Sebacinales k lón (EF619766)

– 0.78

Azonosítatlan ek tomikorrhizak épző faj (AB218176)

88

Azonosítatlan mikorrhizaképző faj (AY243528)

0.98

Sebacina sp. (DQ974768)

69

Sebacinaceae sp. (EF372401)

0.93

Azonosítatlan Sebacina izolátum (EU668220)

98 0.99

Azonosítatlan Sebacina izolátum (EU668271) Azonosítatlan Sebacinales klón (EF417803) Azonosítatlan mikorrhiza (EU563483) Azonosítatlan ektomik orrhiza (AY093437) Azonosítatlan ektomik orrhizaképző faj (AB218165) Tremellodendron pallidum (AF384862) Azonosítatlan ek tomikorrhizak épző faj (AB218064)

– 0.89

Azonosítatlan ektomik orrhiza (AY825519)

100

HU 353

1.00

HU 351

– 0.98

NJ Bayes

Sebacinoid - Mt 2.

HU 622 Azonosítatlan mikorrhiza (AY452676) Azonosítatlan mikorrhiza (AF509964)

98 1.00

Azonosítatlan mik orrhiza (AY452680) Sebacina endomik orrhiza (AF440641) Sebacina endomikorrhiza (AF440644) Sebacina endomik orrhiza (AF440643) Azonosítatlan ektomik orrhizaképző faj (EU403107) Sebacina aff. epigaea (AF490393) Azonosítatlan ektomik orrhizak épző faj (FJ389454) 99 0.98

– 0.98

Azonosítatlan ektomik orrhizaképző faj (FJ389451) Sebacina endomikorrhiza (AF440651) Sebacina endomikorrhiza (AF440656) Azonosítatlan mik orrhiza (AY452681) Azonosítatlan ektomik orrhizak épző faj (AB218113)

–

Azonosítatlan Sebacinales klón (EF417824)

0.90

Azonosítatlan ek tomikorrhizaképző faj (EU816650) – 0.98

– 0.65

HU 639

Sebacinoid - Mt 3.

Sebacina endomik orrhiza (AF440659) Azonosítatlan ek tomikorrhiza (EF218815) Sebacina endomik orrhiza (AF440646) Azonosítatlan ek tomikorrhiza (AJ893256) Azonosítatlan ektomik orrhiza (AM161532)

0.05

Függelék 6/D. A Sebacina-morfotípusok mikobiontáinak filogenetikai helyzetét bemutató, Bayes analízissel készült fa. Az egyes ágak felett a NJ-elemzéshez tartozó bootstrap-értékek, alattuk a Bayes-analízis során kapott posterior valószínűségi értékek szerepelnek. (A túl rövid ágak esetén a statisztikai értékeket egy vízszintes vonal fölött ill. alatt tüntettük fel, nyíllal jelölve, hogy mely elágazási pontokhoz tartoznak.) Pirossal jelöltük a mintaterületen gyűjtött ektomikorrhizákból származó szekvenciákat. A GenBankből származó szekvenciák esetében az azonosító számokat zárójelben adtuk meg. (Az igen rövid ághosszak miatt az áttekinthetőség érdekében csak a morfotípusokat tartalmazó kládok 50% ill. 0,5 feletti statisztikai értékeit adtuk meg; a mérce 100 bázispárra jutó 5 szubsztitúciónak megfelelő ághosszat jelöl.)

Függelék – 6: Az ektomikorrhiza-közösség kis abundanciájú, azonosított tagjainak meghatározására számított filogenetikai fák 100 1.00 92 1.00

97 1.00

Tricholoma saponaceum (EU597087) Tricholoma saponaceum var. saponaceum (DQ370440) Tricholoma saponaceum (AF349695)

100 Tricholoma scalpturatum (EU160596) 1.00 Tricholoma scalpturatum (EU160595) 99 1.00 99 Tricholoma scalpturatum (EU160589)

NJ Bayes

1.00 Tricholoma scalpturatum (EU160588) Tricholoma myomyces var. cystidiotum (AF349699)

100 1.00 Tricholoma myomyces (AF377210) Tricholoma moeseri (AF377211) Tricholoma ustale (AF458436)

91 1.00

Tricholoma portentosum (EU186273) Tricholoma luteomaculosum (AF458446)

100 Tricholoma luteomaculosum (AF458448) 1.00 79 1.00

Tricholoma luteomaculosum (AF458447)

Azonosítatlan ektomikorrhiza (FJ403516)

Tricholoma - Mt 1.

HU 309

99 – Tricholoma lascivum (EU186281) 98 1.00

99 1.00

Tricholoma lascivum (EU186280) Tricholoma lascivum (EU186279) Tricholoma album (AF241516)

100 1.00 Tricholoma portentosum (AF241517) Tricholoma lascivum (AF241513)

100 Tricholoma lascivum (AY573542) 1.00 Tricholoma album (EF493262) Tricholoma inamoenum (AF377246)

100 1.00

99 1.00

Tricholoma bufonium (AY462030) Tricholoma sulphureum (AY462034) Tricholoma bufonium (AY462029)

100 HU 310 1.00

Tricholoma - Mt 2.

Tricholoma sulphureum (AY462035) Tricholoma sulphureum (AY462038) Tricholoma sulphureum (AY462032) Tricholoma sulphureum (AY462036)

Leucopaxillus tricolor (EU819413)

100 Lepista nebularis (DQ149727) 1.00 Lepista nebularis (DQ149728) Panellus stypticus (FJ481038) Mycena galericulata (DQ404392) Mycena plumbea (DQ494677)

0.05

Függelék 6/E. A Tricholoma-morfotípusok mikobiontáinak filogenetikai helyzetét bemutató NJ-fa. Az egyes ágak felett a NJ-elemzéshez tartozó bootstrap-értékek, alattuk a Bayes-analízis során kapott posterior valószínűségi értékek szerepelnek. (A túl rövid ágak esetén a statisztikai értékeket egy vízszintes vonal fölött ill. alatt tüntettük fel, nyíllal jelölve, hogy mely elágazási pontokhoz tartoznak.) Pirossal jelöltük a mintaterületen gyűjtött ektomikorrhizákból származó szekvenciákat. A GenBankből származó szekvenciák esetében az azonosító számokat zárójelben adtuk meg. (Csak az 50% ill. 0,5 feletti statisztikai értékeit adtuk meg; a mérce 100 bázispárra jutó 5 szubsztitúciónak megfelelő ághosszat jelöl.)

Függelék – 6: Az ektomikorrhiza-közösség kis abundanciájú, azonosított tagjainak meghatározására számított filogenetikai fák Helvella elastica (AF335455) Helvella maculata (EU669212) Tuber puberulum (AJ557537) Tuber puberulum (AJ969626) Azonosítatlan ektomikorrhiza (EU816619) Azonosítatlan ektomikorrhiza (AY299228)

99

Azonosítatlan Tuber izolátum (EU668243)

1.00

Tuber puberulum (AJ969625) HU 648

Tuber - Mt.

Azonosítatlan ektomikorrhiza (DQ355258) - Bükk, "Őserdő" Azonosítatlan ektomikorrhiza (DQ355257) - Bükk, "Őserdő"

99

Tuber maculatum (AF003909)

1.00

Tuber borchii (FJ554490) Tuber borchii (FJ554473)

63

Tuber borchii (FJ554481)

0.99

Tuber borchii (FJ554515) 86 1.00

Tuber borchii (EU753267) Tuber borchii (DQ402505) Tuber puberulum (AJ557532)

100 – 100 1.00

Tuber puberulum (AJ557534) Tuber puberulum (AJ557536) Tuber puberulum (AJ557535)

NJ

Tuber whetstonense (AY830855)

Bayes

76 0.97

Tuber scruposum (DQ011845) 99 1.00

Tuber scruposum (DQ011847) Tuber scruposum (DQ011846)

100 0.98

Azonosítatlan ektomikorrhizás faj (EU816687) Azonosítatlan ektomikorrhiza (DQ355245) Azonosítatlan ektomikorrhiza (DQ355246)

99 –

Azonosítatlan ektomikorrhiza (AY634172) Azonosítatlan ektomikorrhizás faj (AB428786)

100 –

93 0.78

Tuber foetidum (AJ557544) Tuber foetidum (AJ557543) Tuber maculatum (AJ278140)

97 0.76 63

Tuber rapaeodorum (EU784429) 100 0.99

0.76

Tuber rapaeodorum (DQ011850) Tuber rapaeodorum (DQ011849)

86 0.89

Tuber rapaeodorum (AJ557521)

Tuber dryophilum (EU784424) 100 1.00

Tuber maculatum (AJ969627) Tuber borchii (EU784422) Tuber borchii (EU784423) Tuber maculatum (AF106889)

0.1

Függelék 6/F. A Tuber-morfotípus mikobiontáinak filogenetikai helyzetét bemutató NJ-fa. Az egyes ágak felett a NJ-elemzéshez tartozó bootstrap-értékek, alattuk a Bayes-analízis során kapott posterior valószínűségi értékek szerepelnek. (A túl rövid ágak esetén a statisztikai értékeket egy vízszintes vonal fölött ill. alatt tüntettük fel, nyíllal jelölve, hogy mely elágazási pontokhoz tartoznak.) jelöltük a mintaterületen gyűjtött ektomikorrhizákból A Humaria-ektomikorrhizák azonosításához letöltöttPirossal szekvenciák adatai származó szekvenciákat. A GenBankből származó szekvenciák esetében az azonosító számokat zárójelben adtuk meg. (Csak az 50% ill. 0,5 feletti statisztikai értékeit adtuk meg; a mérce 100 bázispárra jutó 10 szubsztitúciónak megfelelő ághosszat jelöl.)

Függelék – 7: A molekuláris elemzésekbe vont, adatbázisokból letöltött DNS-szekvenciák adatai A Humaria ektomikorrhizák azonosításához letöltött szekvenciák adatai GenBank azonosító AJ968670

Forrás ektomikorrhiza ektomikorrhiza

FJ147328 FJ348376 FJ348377 AJ968674 AJ969613 EU819538 EU668922 EU668921 FJ403510 DQ200832

ektomikorrhiza ektomikorrhiza ektomikorrhiza ektomikorrhiza ektomikorrhiza ektomikorrhiza ektomikorrhiza ektomikorrhiza termőtest

Lelőhely

(Feltételezett) gazdanövény

Publikáció

Laelatu, Laeaene Co., Észtország

Corylus avellana

Tedersoo és mts. (2006a)

Minnesota, Cedar Creek Natural History Area, USA

Quercus sp.

USA USA Kaerla, Saare Co, Észtország Lille Bogeskov, Dánia: North West Zealand Nyugat-Wisconsin, USA Karla, Észtország Karla, Észtország Swabian Jura, Krahenbachtal Valley, Németország Nordland, Rana, Norvégia

Quercus garryana Quercus garryana Pinus sp.

Avis PG, Dickie I, Dentinger B, McLaughlin D, Reich P, nem publikált Southworth és mts. (2009) Southworth és mts. (2009) Tedersoo és mts. (2006a)

Fagus sylvatica

Tedersoo és mts. (2006a)

Quercus alba Pyrola rotundifolia Pyrola rotundifolia

Palmer és mts. (2008) Vincenot és mts. (2008) Vincenot és mts. (2008) Pena R, Polle A, nem publikált Tedersoo és mts. (2006a)

Fagus sylvatica n.a.

A hazai tomentelloid ektomikorrhizák azonosításához letöltött szekvenciák adatai GenBank azonosító AF272911 AF272901 AY010278 AF272913 AF272937 AF272904 U83483 AF272910 AF272926 AF272915 AF272902 AF272944 AF272920 AJ421254 AF272925 AF272912 AF272943 AF272909 AF272942 AY010275 AF272939 AF272940 AF272941 AJ421256 AJ421255 AF272914 AF272934 AY010274 U83480

Forrás

Lelőhely

T. terrestris, termőtest T. terrestris, termőtest T. sublilacina, ektomikorrhiza T. ellisii, termőtest T. badia, termőtest T. atramentaria, termőtest T. cinerascens, mikorrhiza T. lilacinogrisea, termőtest T. lateritia, termőtest T. cinerascens, termőtest T. stuposa, termőtest T. stuposa, ektomikorrhiza T. umbrinospora, termőtest T. atroarenicolor, termőtest? T. pilosa, termőtest T. botryoides, termőtest T. punicea, termőtest T. ferruginea, termőtest T. fusco-cinerea, termőtest T. subclavigera, ektomikorrhiza T. subclavigera, termőtest T. bryophila, termőtest T. lapidum, termőtest T. subtestacea, termőtest? T. galzinii, termőtest? T. viridula, termőtest T. coerulea, termőtest T. cf. coerulea, ektomikorrhiza T. ramosissima, mikorrhiza

- herbáriumi anyag - herbáriumi anyag -

(Feltételezett) gazdanövény n.a. n.a.

Kenai, Alaska, USA

Picea glauca

- herbáriumi anyag - herbáriumi anyag -

n.a. n.a.

Köljalg és mts. (2000) Köljalg és mts. (2000) Lilleskov EA, Fahey TJ, Horton TR és Lovett GM, nem publikált Köljalg és mts. (2000) Köljalg és mts. (2000)

- herbáriumi anyag -

n.a.

Köljalg és mts. (2000)

Kalifornia, USA

Cephalanthera austinae

Taylor és Bruns (1997)

Publikáció

- herbáriumi anyag -

n.a.

Köljalg és mts. (2000)

- herbáriumi anyag -

n.a.

Köljalg és mts. (2000)

- herbáriumi anyag -

n.a.

Köljalg és mts. (2000)

- herbáriumi anyag -

n.a.

Kenai, Alaska, USA

Picea glauca

Köljalg és mts. (2000) Lilleskov EA, Fahey TJ, Horton TR és Lovett GM, nem publikált

- herbáriumi anyag -

n.a.

Köljalg és mts. (2000)

Oroszország

n.a.

Köljalg és mts. (2001)

- herbáriumi anyag - herbáriumi anyag - herbáriumi anyag - herbáriumi anyag -

n.a. n.a. n.a. n.a.

Köljalg és mts. (2000) Köljalg és mts. (2000) Köljalg és mts. (2000) Köljalg és mts. (2000)

- herbáriumi anyag -

n.a.

Köljalg és mts. (2000)

Kenai, Alaska, USA

Picea glauca

Lilleskov EA, Fahey TJ, Horton TR és Lovett GM, nem publikált

- herbáriumi anyag -

n.a.

Köljalg és mts. (2000)

- herbáriumi anyag - herbáriumi anyag -

n.a. n.a.

Köljalg és mts. (2000) Köljalg és mts. (2000)

Oroszország

n.a.

Köljalg és mts. (2001)

Finnország - herbáriumi anyag - herbáriumi anyag -

Hercleum n.a. n.a.

Köljalg és mts. (2001) Köljalg és mts. (2000) Köljalg és mts. (2000) Lilleskov EA, Fahey TJ, Horton TR és Lovett GM, nem publikált

Kenai, Alaska, USA

Picea glauca

Kalifornia, USA

Cephalanthera austinae

Taylor és Bruns (1997)

(n.a.: nincs adat; a hivatkozásokat l. a Felhasznált irodalmak közt)

F - 14

Függelék – 7: A molekuláris elemzésekbe vont, adatbázisokból letöltött DNS-szekvenciák adatai A Clavulina-ektomikorrhizák azonosításához letöltött szekvenciák adatai GenBank azonosító

forrás

Lelőhely

(Feltételezett) gazdanövény

Publikáció

EU645631

Azonosítatlan ektomikorrhiza

Kanada

Pseudotsuga menziesii

Outerbridge RA, Trofymow JA és Lalumiere A, nem publikált

EF417811

Azonosítatlan ektomikorrhiza

EF559274

Clavulina cf. cristata termőtest

DQ974710

Clavulina cristata termőtest

DQ056365

Clavulina monodiminutiva termőtest

Sierra Foothill Research and Extension Center (SFREC), Yuba County, Kalifornia, USA Sierra Foothill Research and Extension Center (SFREC) in Yuba County, Kalifornia, USA Sierra Foothill Research and Extension Center (SFREC) in Yuba County, Kalifornia, USA Pakaraima Mountains, Guyana

Quercus wislizeni

Morris és mts. (2008)

Quercus sp.

Smith és mts. (2007a)

Quercus douglasii

Smith és mts. (2007b)

Dicymbe corymbosa

Henkel és mts. (2005)

Az Entoloma-ektomikorrhizák azonosításához letöltött szekvenciák adatai GenBank azonosító AJ510276 DQ486700 AJ966745 AJ938003 EU784211 AB301602

(Feltételezett) gazdanövény Populus tremula x tremuloides

Kaldorf és mts. (2004)

n.a.

n.a.

Matheny és mts. (2006)

Entoloma sinuatum termőtest

Kudjape, Saare Co, Észtország

Pinus sylvestris, Q. robur, Corylus avellana

Tedersoo és mts. (2006b)

Azonosítatlan ektomikorrhiza Entoloma caeruleopolitum herbáriumi termőtest Entoloma rhodopolium termőtest?

Rajhenavski Rog, Szlovénia

Fagus sylvatica

Grebenc, nem publikált

(Kew Royal Botanical Garden herbáriuma)

n.a.

Brock és mts. 2009

Tottori, Japán

n.a.

Maeta és mts. (2008)

Lelőhely

(Feltételezett) gazdanövény

Publikáció

Svédország

n.a.

Ryberg és mts. (2008)

Svédország

n.a.

Ryberg és mts. (2008)

n.a.

Lang C és Polle A, nem publikált

Fagus sylvatica

Kjoller (2006)

Svédország

n.a.

Ryberg és mts. (2008)

Svédország

n.a.

Ryberg és mts. (2008)

Fagus sylvatica

Kjoller (2006)

Fagus sylvatica

Kjoller. nem publikált

Fagus sylvatica

Kjoller (2006)

Svédország

n.a.

Ryberg és mts. (2008)

Jaervselja, Tartu Co, Észtország

Tilia cordata

Tedersoo és mts. (2003)

Jaervselja, Tartu Co, Észtország

Tilia cordata

Tedersoo és mts. (2003)

forrás

Lelőhely

Azonosítatlan ektomikorrhiza Entoloma sinuatum termőtest

Grosshansdorf, Hamburg, Németország

Publikáció

Az Inocybe-ektomikorrhizák azonosításához letöltött szekvenciák adatai GenBank azonosító AM882987 AM882902 EU816645 AM159586 AM882707 AM882708 AM161520 AJ889956 AM113952 AM882710 AJ534897 AJ534923

forrás Inocybe sp. termőtest? Inocybe glabripes termőtest? Azonosítatlan ektomikorrhiza Azonosítatlan Inocybe micélium Inocybe petiginosa, termőtest? Inocybe petiginosa termmőtest? Azonosítatlan ektomikorrhiza Inocybe petiginosa termőtest Inocybe petiginosa termőtest Inocybe jacobi termőtest? Azonosítatlan ektomikorrhiza Azonosítatlan ektomikorrhiza

Hainich Nemzeti Park (Thuringa), Németország Zealand, Lille Bogeskov, Dánia

Zealand, Lille Bogeskov, Dánia Zealand, Lille Bogeskov, Dánia Zealand, Lille Bogeskov, Dánia

F - 15

Függelék – 7: A molekuláris elemzésekbe vont, adatbázisokból letöltött DNS-szekvenciák adatai Az Inocybe-ektomikorrhizák azonosításához letöltött szekvenciák adatai (folytatás) GenBank azonosító EU816656 AM882935 AB218093 AM882722 FM993253

forrás

Lelőhely

(Feltételezett) gazdanövény

Publikáció

Azonosítatlan ektomikorrhiza Inocybe cf. fuscidula termőtest? Azonosítatlan ektomikorrhiza Inocybe cf. asterospora termőtest? Azonosítatlan ektomikorrhiza

Hainich Nemzeti Park (Thuringa), Németország

n.a.

Lang C és Polle A, nem publikált

Svédország

n.a.

Ryberg és mts. (2008)

n.a.

Quercus crispula

Ishida TA, Nara K és Hogetsu T, nem publikált

Svédország

n.a.

Ryberg és mts. (2008)

n.a.

Alnus?

Tedersoo,,nem publikált

Publikáció

A Sebacina-ektomikorrhizák azonosításához letöltött szekvenciák adatai GenBank azonosító

forrás

Lelőhely

(Feltételezett) gazdanövény

EU668267

Azonosítatlan Sebacina

Németország

n.a.

Orange Co., Duke Forest, USA

Pinus taeda

Fango valley, Corsica,

Q. ilex

Richard és mts. 2005

n.a.

Abies homolepis

Ishida TA, Nara K és Hogetsu T, nem publikált

n.a.

Epipactis helleborine var. minor

Weiss és mts. (2004)

n.a.

Tilia sp.

Urban és mts. (2003)

n.a.

Lang C és Polle A, nem publikált

Quercus wislizeni

Morris és mts. (2008)

n.a.

Carpinus japonica

Ishida,T.A., Nara,K. and Hogetsu,T., nem publikált

Melville, Spitzberg Izland

Dryas octopetala

Weiss és mts. (2004)

n.a.

Neottia nidus-avis

Selosse és mts. (2002b)

n.a.

Neottia nidus-avis

Selosse és mts. (2002b)

EF619766 AY825519 AB218064 AY452676 AF509964 EU816650 EF417824 AB218113 AY452681 AF440656 AF440651

Azonosítatlan Sebacina micélium Azonosítatlan ektomikorrhiza Azonosítatlan ektomikorrhiza Azonosítatlan ektomikorrhiza Azonosítatlan ektomikorrhiza Azonosítatlan ektomikorrhiza Azonosítatlan ektomikorrhiza Azonosítatlan ektomikorrhiza Azonosítatlan Sebacina mikorrhiza Azonosítatlan endomikorrhiza Azonosítatlan endomikorrhiza

Hainich Nemzeti Park (Thuringa), Németország Sierra Foothill Research and Extension Center (SFREC), Yuba County, Kalifornia, USA

Bidartondo MI, nem publikált Parrent JL és Vilgalys R (2007)

F - 16

Függelék – 7: A molekuláris elemzésekbe vont, adatbázisokból letöltött DNS-szekvenciák adatai A Tricholoma-ektomikorrhizák azonosításához letöltött szekvenciák adatai GenBank azonosító

forrás

Lelőhely

(Feltételezett) gazdanövény

EU186279

Tricholoma lascivum termőtest

n.a.

n.a.

EU186280

Tricholoma lascivum termőtest?

n.a.

n.a.

EU186281

Tricholoma lascivum termőtest?

n.a.

n.a.

Swabian Jura, Krahenbachtal Valley, Németország

Fagus sylvatica

Olaszország

n.a.

Comandini és mts. (2004)

Dánia

n.a.

Comandini és mts. (2004)

Németország

n.a.

Comandini és mts. (2004)

Dánia

n.a.

Comandini és mts. (2004)

Dánia

n.a.

Comandini és mts. (2004)

Lelőhely

(Feltételezett) gazdanövény

Publikáció

Abaliget, Magyarország

n.a.

Halász és mts. (2005)

n.a.

Tedersoo és mts. (2006a)

n.a.

Lang C és Polle A, nem publikált

Souilly, kísérleti telep, Franciaország

F. sylvatica

Buée és mts. (2005)

Anglia

n.a.

Bidartondo és Read (2008)

Suserup: South Zealand, Dánia

n.a.

Tedersoo és mts. (2006a)

„Őserdő”, Bükk, Magyarország

F. sylvatica

Kovács és Jakucs (2006)

„Őserdő”, Bükk, Magyarország

F. sylvatica

Kovács és Jakucs (2006)

FJ403516 AY462029 AY462036 AY462032 AY462038 AY462035

Azonosítatlan ektomikorrhiza Tricholoma bufonium termőtest? Tricholoma sulphureum termőtest? Tricholoma sulphureum termőtest? Tricholoma sulphureum termőtest? Tricholoma sulphureum termőtest?

Publikáció Portugal A, Bidartondo M és Rodriguez-Echeverria S, nem publikált Portugal A, Bidartondo M és Rodriguez-Echeverria S, nem publikált Portugal A, Bidartondo M és Rodriguez-Echeverria S, nem publikált Pena R és Polle A, nem publikált

A Tuber-ektomikorrhizák azonosításához letöltött szekvenciák adatai GenBank azonosító AJ557537 AJ969626 EU816619 AY299228 EU668243 AJ969625 DQ355258 DQ355257

forrás Tuber puberulum termőtest Tuber puberulum termőtest Azonosítatlan ektomikorrhiza Azonosítatlan ektomikorrhiza Azonosítatlan Tuber izolátum Tuber puberulum termőtest Azonosítatlan ektomikorrhiza Azonosítatlan ektomikorrhiza

Bromme Plantage: South Zealand , Dánia Hainich Nemzeti Park, Thuringa, Németország

(n.a.: nincs adat; a hivatkozásokat l. a Felhasznált irodalmak közt)

F - 17

Függelék – 7: A molekuláris elemzésekbe vont, adatbázisokból letöltött DNS-szekvenciák adatai

A Lactarius ektomikorrhizák azonosításához letöltött szekvenciák adatai

GenBank azonosító

forrás

DQ658874

L. subdulcis termőtest

AJ889966

L. subdulcis termőtest

AM087257

L. subdulcis ektomikorrhiza

AJ889964

L. subdulcis termőtest

EU346875

L. subdulcis ektomikorrhiza?

AY331016

L. subdulcis termőtest

AJ889963

L. subdulcis termőtest

AJ889965

L. subdulcis termőtest

AF096989

L. hebaticus termőtest?

AM161524 AY299216 DQ377385 FJ188351

azonosítatlan ektomikorrhiza azonosítatlan ektomikorrhiza azonosítatlan ektomikorrhiza azonosítatlan ektomikorrhiza

Lelőhely Lahnberge, Marburg, Németország Sjaelland, Lille Boegeskov, Dánia North East Zealand, Gribskov, Dánia Sjaelland, Lille Boegeskov, Dánia Thuringia, Hainich National Park, Németország Herbarium Universitatis Gandavensis (GENT) Bromme Plantage, Zealand, Dánia Sjaelland, Lille Boegeskov, Dánia

(Feltételezett) gazdanövény

Publikáció

F. sylvatica

Nygren és mts. (2007)

F. sylvatica

Kjøller, nem publikált

F. sylvatica

Fons és Kjøller, nem publikált

F. sylvatica

Kjøller, nem publikált

n.a.

Naumann A, Schuetzenduebel A, Lang C, Pena R és Polle A, nem publikált

F. sylvatica

Nuytinck és mts. (2003)

F. sylvatica

Kjøller, nem publikált

F. sylvatica

Kjøller, nem publikált

n.a.

n.a.

Marin M, Ibarra M, Garcia L. és Ferrer S, nem publikált

Zealand, Lille Bogeskov, Dánia

F. sylvatica

Kjøller (2006)

Souilly kísérleti erdőterület, Franciaország Duke Forest, Észak-Karolina (USA) Catoira, Spanyolország

F. sylvatica

Buée és mts. (2005)

Pinus taeda

Parrent JL, Morris WF és Vilgalys R

Pinus pinaster

Nieto és Carbone (2009)

(n.a.: nincs adat; a hivatkozásokat l. a Felhasznált irodalmak közt)

F - 18

a)

b)

c)

d)

e)

f)

1. tábla. A Humaria ektomikorrhiza-minták anatómiája. a) A köpeny legkülső rétege, b) a külső, anguláris köpenyréteg, vastag falú, anasztomizáló sejtekkel, c) a kiágazó hifák eredése, d) a belső köpenyréteg szerkezete. e), f) A köpeny szerkezetét, a Hartig-hálót és a gyökérsejtek BP97493 mintában megfigyelhető intracelluláris kolonizációját bemutató hosszmetszeti felvételek (a nyilak a szeptált, kolonizáló hifákra mutatnak). (a-d: Nomarski-DIC, mérce: 20 μm, e-f: PhC, mérce: 50 μm.)

60a

a)

b)

d)

e)

g)

h)

c)

f)

i)

2. tábla. A Pachyphloeus-Amylascus leszármazási vonalba tartozó ektomikorrhizák anatómiája. Az egyes morfotípusok esetében különböző falvastagsággal jellemezhető és különböző színű, pszeudoparenchimatikusanguláris szerkezetű külső köpenyréteg (P-Mt 1.: a, P-Mt 2.: d, P-Mt 3.: g); a vékony (P-Mt 1.: b) ill. vastag falú (P-Mt 2.: e) hifákból, valamint gömb alakú sejtek lazán kapcsolódó soraiból (P-Mt 3.: h) álló felszíni hálózat és a kiágazó hifák (P-Mt 1.: c, P-Mt 2.: f, P-Mt 3.: i) szerkezete. (Nomarski-DIC, mérce: 20 μm.)

72a

a)

b)

c)

d)

e)

f)

g)

3. tábla. Az ektomikorrhiza-közösség azonosított, kisebb gyakoriságban jelen levő tagjainak anatómiája I. Clavulina – Mt 1. (HU 349): a) köpenyszerkezet; Clavulina – Mt 2. (HU 627): b) külső köpenyréteg, c) belső köpenyréteg szerkezete, d) kiágazó hifák; Entoloma – Mt.: e) rizomorfa (HU 345), f) köpenyszerkezet (HU 345), g) kiágazó hifák és szerveződő rizomorfa (HU 339). (Nomarski-DIC, mérce: 20 μm.)

85a

b)

a) c)

d)

e)

f)

g)

h)

4. tábla. Az ektomikorrhiza-közösség azonosított, kisebb gyakoriságban jelen levő tagjainak anatómiája II. Inocybe – Mt 1. (HU 301): a) külső ill. c) belső köpenyréteg szerkezete, b) a felszíni hifahálózat (kis képen egy cisztídium); Inocybe – Mt 3. (HU 355): d) felszíni hifahálózat; Inocybe – Mt 4. (HU 374): e) felszíni hifahálózat, anasztomizáló fihákkal (nyíllal jelölve). Tuber – Mt. (HU 648): f) külső ill. h) belső köpenyréteg szerkezete; g) a cisztídiumok anatómiája (belső képen alapi sejtjük ill. gömb alakú csúcsi részük). (Nomarski-DIC, mérce: 20 μm.)

91a

a)

b) c)

d)

e)

f)

g)

h) 5. tábla. Az ektomikorrhiza-közösség azonosított, kisebb gyakoriságban jelen levő tagjainak anatómiája III. Sebacina – Mt 1. (HU 334): a) köpenyszerkezet, b) a cisztídiumok; Sebacina – Mt 2.: c) külső ill. d) belső köpenyréteg szerkezete (HU 353), e) és f) a kiágazó hifák (e: HU 622, f: HU 353); Sebacina – Mt 3. (HU 639): g) köpenyszerkezet, h) kiágazó hifák.(HU 345). (Nomarski-DIC, mérce: 20 μm.)

94a

a)

b)

c)

e)

d)

f)

g)

6. tábla. Az ektomikorrhiza-közösség azonosított, kisebb gyakoriságban jelen levő tagjainak anatómiája IV. Tricholoma – Mt 1. (HU 309): a) külső és b) belső köpenyréteg szerkezete, c) a köpeny középső rétege párhuzamosan rendeződő hifákkal, d) rizomorfa (belső képeken nagyméretű csatok ill. anasztomózisok); Tricholoma – Mt 2. (HU 310): e) köpenyszerkezet, f) kiágazó hifák, g) rizmorfaszerkezet. (Nomarski-DIC, mérce: 20 μm.)

97a

a)

b)

1 mm

c)

0,5 mm

d)

20 μm

e)

20 μm

f)

20 μm

20 μm

7. tábla. A másodlagosan kolonizált Lactarius-ektomikorrhiza morfológiája és anatómiája. Sztereomikroszkópos felvételek a mikorrhiza-rendszerről (a) és egy mikorrhizavégről (b). (A b) ábrán a nyilak a köpenyt elhagyó idegen hifákat jelölik.) A külső (c), középső (d) és belső (e) köpenyrétegek szerkezete. A d) ábrán a nyíl egy tejcsövet jelöl, melyben még látszanak a tejnedvcseppek. f) A rhizomorfa szerkezete; a jobb felső kis kép a könyökszerű kiemelkedéseit mutatja (nyíllal jelölve), a bal alsó kis kép a rhizomorfa hifáinak eredését. (Nomarski-DIC felvételek.)

99a

a)

b)

Th

Th Hh 20 μm

20 μm

anguláris réteg

plektenchimatikus réteg

c)

20 μm

d)

50 μm

Hh

e)

- köpeny

- kéreg

Hh

50 μm

- központi henger

8. tábla. A másodlagosan kolonizált Lactariusektomikorrhizából készült félvékony metszetek. Radiális hosszmetszet a teljes mikorrhizából (e); a gombaköpenyből (a); a köpenyből és a gyökérkortexből (b). A Hartig-háló szerkezete (c). Tangenciális hosszmetszet a köpeny plektenhimatikus rétegéből (d). Th: tejhifa; Hh: Hartig-háló. (a-c: anilinkékkel festett preparátumok; d, e: PhC)

102a

a)

c)

II. h. 20 μm

b)

20 μm 20 μm

e)

d)

II. h.

I. h.

I. h. 20 μm

II. h. 20 μm

f)

g)

20 μm

50 μm

9. tábla. A másodlagosan kolonizált Lactarius-ektomikorrhizában megfigyelt gomba anatómiája. A köpenyt áttörő (a) és a köpenyen kívül található (b) hifa. (A nyíl az áttörés helyét mutatja.) c)-f) Az I. (I.h.) és II. (II.h.) típusú hifák a gyökér kérgi sejtjeiben. (c-e: hossz-, f: keresztmetszet; a jelöletlen nyilak a behatolás helyét mutatják.) g) Keresztmetszet a mikorrhizált gyökérből; az endodermiszig megtaláljuk a kolonizáló hifákat. (a, b: Nomarski-DIC; c, e-g: PhC; d: anilinkékkel festett preparátum)

105a

b)

a)

I. h.

II. h.

3,3 μm

2,0 μm

I. h.

c)

3,8 μm

Intrah.

d)

1,6 μm

e)

666 nm

10. tábla. A másodlagosan kolonizált Lactarius-ektomikorrhiza elektronmikroszkópos anatómiája. a) A Hartig-hálóval körbevett kéregsejt; b-c), e) másodlagosan kolonizáló gomba hifái a kéregsejt belsejében; d) intrahifális hifa átmetszete a kolonizáló hifában. (I. h.: I. típusú, II. h.: II. típusú hifa; Intrah.: intrahifális hifa)

105b