6. Előadás Oligonukleotidok szintézise, koenzimek, vitaminok
Oligonukleotidok szintézise Elv:
(
) N
HO
O
1. Kondenzáció 5’-OH + H (3’)
O 3’ O
P
OH
(
5’
) N
HO
O
2. Vízmentes közeg 3. Védőcsoportok
OH O O
P
OH
OH
Módszerek 1.
Karbodiimid módszer, oldatban (1955) Tood (Nobel díj 1957), Khorana (Nobel díj 1975) Kapcsoló szer:
DCC/Piridin
8-12 tagszám 2.
Foszfit módszer, szilárd hordozón Beaucage, Caruthers; (1981) (Merrifield Nobel dij, 1984)
1. Szintézis oldatban
Kapcsoló szer:
DCC/Piridin
Védőcsoportok:
acetil, tritil Sir Alexander R. Todd (1907-1997)
1. lépés: Védett komponensek kapcsolása
N-acetil (Ac)
O HN N
6
C
CH3 O
N HN
C
O
N O
C
CH3
N N
4
O
OH
HO
P
N
O
O
O
OH
O
Tritil (Tr)
N
C
C
CH3
O
N
O-acetil (Ac)
N, N – diciklohexil-karbodiimid (DCC)
2. lépés: A védőcsoportok eltávolítása
Ac
A
Tr
O
P
O
1. Lúg 2. Sav Ac C (80% AcOH)
O O
A
HO
O
O
O
O
OH
P
C
O
O
OH OAc OH
Lúg A
Tr
O
O
+
O O
P
O
C O
HO
P
O
T O
OH
OH
OAc OH
3. lépés: Láncnövekedés
Megjegyzések: (alkalmas a ribooligonukleotid sorban is)
Védőcsoportok Bz2
A
MMTr
O
O O
P
OBz OH
OH védelem (Bz)
védelem (MMTr)
CO MeO
C
MMTr = monometoxi-tritil
2. Szintézis szilárd fázison Foszfit módszer
Beaucage, Caruthers (1981)
2.1 Szilárd hordozó: szilika, üveggyöngy, műanyag, cellulóz, papir 3-aminopropanol
szilika
Si
OH
Si
szilika
(CH2)3 NH2
O
1. borostyánkősavanhidrid 2. védett nukleotid Bz2
A
DMTr
O
savérzékeny
szilika
Si
O
(CH2)3 NH
O
O
C (CH2)2
C
O
bázis érzékeny
H+
Bz
A
HO O
szilika
Si
O
(CH2)3 NH
C
O
O (CH2)2
C
O
+ DMTr + λ= 498 nm (karbokation)
2.2 Védőcsoportok
DMTr + Bz2
A
DMTr O Si
(CH2)3 NH
O
OCH 3
O O
+ C
C (CH2)2 C O
szilika OCH 3
OCH 3
NH2 N C
N
HO
O
N N
HO
P
benzoil N-6-benzoil adenin [ABz] N-4-benzoli citozin [CBz]
O OCH 3
CO
OH
4,4’-dimetoxitritil (DMtr)
N-2-isobutil guanin [GIBu] O
a) CH3b) β-CN-CH2-CH2(β-cianoetil)
P
N
C
izopropioil N,N diizopropil
2.3 Aktiválás Bz
DMTr
A
O
H
O
DMTr
N N
ABz
O
O
N N
O
tetrazol
O
P H3CO
P
N
H3CO
N N
N N
diizopropil foszforamidát
2.4 Kapcsolás IBu
G
HO
DMTr
O
Bz
A
O
Bz
DMTr
A
O
O
O O
Szilika
O
P
P H3CO
+ tetrazol
O H3CO
N N
IBu
G
O
O
N N
O Szilika
2.5 Oxidáció: „foszforos sav (foszfonsav)
Bz
Bz
DMTr
A
O
foszforsav”
DMTr
A
O
O
O
I2, H2O kollidin*
O P H3CO
O
IBu
G
O
O
O
P
3
O
IBu
G O
OCH 3 1
O
O Szilika
2 Szilika
*trimetil-piridin
2.6 Hasítás 1. OCH3 eltávolítása (tiofenol) helyette OH 2. Oligonukleotid lehasítása a hordozóról (NH3) 3. Nukleozid bázis védőcsoport (Bz, IBu) eltávolítása (NH4OH + hő)
2.7 Tisztítás
HPLC Elektroforézis
Foszforsavak O
foszforsav (ortofoszforsav) O
HO
P
RO
P OH
OH
O
OH 160 oC
O HO
P
P
O
P OH
RO
P OH
P
OH
O O
P
O O
P
OH
OH
OH
difoszforsav-észter
OH
OH
trifoszforsav
O O
OR 2
- lineáris - ciklusos
metafoszforsav
O
O
OH foszfodiészter
P
P
OH
OH OH difoszforsav
HO
R1O
>300 oC O
O O
OH monoészter
RO
O
O
P
O
OH
P OH
O O
P OH
trifoszforsav-észter
OH
„Sapkázás” (capping): reakció ecetsavanhidriddel, a szabad OH acetilezése
DNS/oligonukleotid szintetizátor
DNS/oligonukleotid chip (csip)
DNS/oligonukleotid analitika (elektroforézis)
Expression levels of 50 genes most highly correlated with the acute lymphoblastic leukemia (ALL) and acute myeloid leukemia (AML).
Expressed in ALL
Expressed in AML
Expression levels greater than the mean: red, below the mean: blue.
TR Golub et al Science 286: 531 (1999)
Nukleotid származékok – vírusellenes hatóanyagok
Acyclovir, első vírusellenes hatóanyag, HSV Ganclovir, (Gertrude B. Elion, Nobel-dij, 1988) vírusellenes hatóanyag, CMV
www.pubmed.org
Zidovudin (AZT), retrovírus ellenes
Mechanizmus: antimetabolit típus, foszforileződés, vírus-enzim inhibitor
Nukleotid származékok – tumorellenes hatóanyagok Pirimidin analógok
NH2 OH
F 5
N
N N
N
HO2HC OH
OH
HO
5 - fluoro – uracil ( Cl, Br, I )
OH citozin arabinozid (Ara-C)
OH F
NH2
N
HO2HC
N
N OH
N
HO2HC
OH
N
OH OH 5 - aza - citidin
5 -fluoro - 2' dezoxiuridin Purin analógok
SH
SH N N H
OH
NH N
6-merkapto-adenin
N N H
NH N
NH2
6-merkapto-guanin
Koenzimek
Koenzimek Enzim = apoenzim (fehérje) + koenzim (nem-fehérje)
Szubsztrátspecifitás
Reakciótípus
Típusai
Nukleotid
Fémion (példa) Fe
Egyéb
(citokróm oxidáz)
NAD
Cu
(aszkorbinsav oxidáz)
B1
FAD
Zn
(alkohol dehidrogenáz)
B6
ATP
Mn
(hisztidin ammónia-liáz)
B12
(glutamát mutáz)
folsav
Koenzim A
Co
Ni Mo V Se
(ureáz)
pantoténsav
(xantin oxidáz)
biotin
(nitrát reduktáz) (glutation peroxidáz)
Nukleotid koenzimek 1.
Adenozin mono-, di- és trifoszfát felfedezés: Lohmann, Fiske (1929) NH2
észterkötés
N
O O
-
N
P O
N
O
N
D-ribóz
O
-
OH
OH
β-N-glikozid
Adenozin-monofoszfát (AMP)
ciklusos AMP
NH2 N O HO
P O
O O
P O O
O P
N O
N HO
+ H2O OH
N
N
O
O
NH2
O
O
P O O
P
N O
O
OH
O
OH
ATP
ADP
∆H° = -31 kJ/mol
N N
+
O O P OH O
OH
foszforsav
2. NAD/NADH: oxidáció O
5’
NH2 N
D-ribóz
nikotinamid NH2 N
5’
N
NH
N
adenin nikotinamid-adenin-dinukleotid (NAD+) Példa:
ADH enzim
CH3-CH2-OH +
CH3-COH + acetaldehid
NADH
NAD+ ADH = alkohol dehidrogenáz Mechanizmus H
O
H
H NH2 H
+ N R
NAD+
H
+2e- + H+
H
O
H NH2 H
N R
NADH
H
3. FAD/FADH2: oxidáció oxidált
H
/enzimkötődés/
redukált
Flavin-adenin-dinukleotid (FAD) Flavus (latin), sárga
4. Koenzim-A (CoA) felfedezés: Lipmann, 1946 észter kötés
adenozin-3’,5’-difoszfát
5’
3’ észter kötés
savamid kötés
2,4-dihidroxi-3,3dimetil-vajsav
β-alanin
pantoténsav (vitamin)
ciszteamin
savamid kötés
S-acetil koenzim-A (Ac-CoA) - NH –(CH2)2 - SH
- NH –(CH2)2 - S – CO – CH3
5. Koenzim-Q (ubikinon, CoQ) (eukarióta sejtekben, mitokondriumok)
szemikinon
(Izoprén egységek)
ubikinon
Koenzim Q4, n = 4 Koenzim Q9, n = 9 Koenzim Q10, n = 10
ubikinol
Peter D. Mitchell, 1961 (Nobel díj, kémia, 1978) „for his contribution to the understanding of biological energy transfer through the formulation of the chemiosmotic theory". Később: elektrontranszport lánc koncepció – CoQ10 „protonvonzó”
1920-1992 http://www.q10facts.com/a-brief-history-of-coenzyme-q10-2/
VITAMINOK 1912:
vitamin = vita amines (Casimir Funk)
„Kis mennyiségben kívülről kell felvenni.” Nem vitaminok:
esszenciális aminosavak esszenciális zsírsavak
Provitaminok Antropocentrikus pl. C-vitamin:
ember (tengeri malac) igen
p-amino-benzoesav:
patkány
nem
baktérium
igen
ember
nem
Kémiai szerkezet: heterogén
Felosztás (oldékonyság alapján)
Vízoldékony
Zsírban oldódó
B, C, H és P vitaminok
A, D, E és K vitaminok
- koenzimek is
- bélből szívódnak fel
- felesleg kiürül
- májban raktározódnak 1958: 15-20 féle vitamin
B1 vitamin (tiamin) szerkezet 1934, szintézis 1936
Beriberi
NH 2
H 3C
észter kötés
tiazol
pirimidin
N
piroszőlősav nem bomlik le
O NH 2
CH 3 N
CH 2 CH 2 OH
ATP
N
2
S
H3C
tiamin
N
P
O
P
+ CH 2 CH 2 O S
1
tiamin-pirofoszfát (koenzim) H3C
+
piroszőlősav:
COOH
piroszőlősav-dekarboxiláz
O
O O
NH 2 N
N
N
-
P
O
-
O
CH 3 O
H3C
N
-
P
O
-
+ CH 2 CH 2 O S
HO
O
-
O
CH 3
3
+
N
O
COOH
H 3C
„aktív piruvát” • brit tengerészek (1747) • Ch. Eijkman (1897), F. G. Hopkins [orvosi Nobel-díj (1929)] • C. Funk – vita amin (1912)
O
-
B2-vitamin (riboflavin) izolálás: Richard Kuhn (1933), 4500 liter tejsavóból 1g (természetben 1-foszfát-észter) HO
D-ribóz
(1900- 1967)
„for his work on carotenoids and vitamins„ Nobel-díj, 1938 H 3C
HO
H
HO
H
bőrbántalom
HO
H
növekedés
H
H N
N
O
Izo-alloxazin váz
NH N
H 3C
O
1,3,5,8-tetraazanaftalin (pteridin) B6-vitamin (piridoxál, piridoxin) izolálás: Euler (1937) CHO HO
O
CHO CH 2 OH
HO
CH 2 O
P O
H3C
N
piridoxál (- CHO) piridoxin (- OH)
H 3C
N
5’-foszfát - észter (koenzim) Bőrbántalmak, élesztő
http://www.tankonyvtar.hu/hu/tartalom/tkt/tej-tejtermekek/ch03s05.html
O -
-
Prof. D. Hodgkin, National Portrait Galery, London
B12-vitamin (kobalamin)
korrinváz 5,6-dimetilbenzimidazol CN- vagy HO- vagy H2 0
Szerkezet: D. Hodgkin, Oxford, Nobel díj, 1964 (penicillin is)
Folsav (pteroil-glutaminsav) izolálás: Peterson (1940) •vérszegénység (anémia, leukopénia) O
p-amino-benzoesav O
NH N
O
N
NH O
H 2N
N H
N
O
CHO
O
N
NH
1
H 2N
NH
5 N
4 2
glutaminsav
OH
pteridin O
OH
N H
8 N
O
7
OH OH
5-formil-5,6,7,8-tetrahidrofolsav, folinsav (koenzim) O
methotrexat NH O 2
NH N
N
O NH O
H 2N
N H
N
OH
CH3 OH
C-vitamin (L-aszkorbinsav) felfedezés: 1928 izolálás: Szentgyörgyi A. (1932) •skorbut
OH
O
O
6 3 4
1
HO
2
1
O HO
O
HO
OH
=
H H
HO
OH
6
2-keto-L-gulonsav γ-laktám
CH2OH
L-aszkorbinsav)
H-vitamin (biotin) izolálás: Kögl (1936) 2800 kg tojássárgája → 390 mg 1 tojás 50 g, ebből 17 g sárgája 390 mg = 164 706 db tojás
imidazolidin
* * * tetrahidrotiofén Avidin – biotin
Kd = 10-15
Nikotinsav(niacin)/ B3 vitamin és a nikotinsavamid hiánya: pellagra (pelle agra = durva bőr) O
O
nikotinsavamid
NH 2
OH N
NAD+ (koenzim)
niacin
N
Koleszterin szint szabályozó (?)
Pantoténsav/B5 vitamin OH H 3C
pantothen (πάντοθεν): mindenfelől
NH
O
HO CH 3 O
OH
β-alanin α,γ − dihidroxi – β,β- dimetil-vajsav „stressz ellenes” vitamin
koenzim A élesztő
Roger J. Williams 1933
CH3
A-vitamin
CH2=C-CH=CH2 provitamin: β-karotin Kuhn, 1931
világos sárga olaj OH fp.: 136°C (vákuum) A = retinol A vitamin A1 = dehidroretinol 2
halak májából növekedési faktor, farkasvakság
1
7
11 O
„all-transz” retinal
4 11 12
0,5-1 mg/nap
11-cisz-retinal
1 NE = 0,6 mg
O
opszin
H2N-protein
rodopszin
hν
N-protein
N-protein
H2O H2N-protein +
O
R2
R1
1 1 2 1 R 1 C3 1 9 1 1 8 A0 B 7 4 5 6 4
2 3
1 D7 1 1 6
D-vitaminok
5
H 3C
CH 3 H
CH 3 H 3C
20
CH 3
CH 3
CH 3
19 1
CH 3
CH 3
napfény
H HO
3
H
7
5
H
CH 2
hν λ = 270-300 nm
HO
op.: 84-85°C
D3-vitamin (kolekalciferol)
7-dehidrokoleszterin Állati eredetű élelmiszerek Halolaj, máj, tojás, tejtermék
CH 3 CH 3
H 3C H 3C
CH 3
H 3C CH 3
H
CH 3 H
CH 3
hν
CH 3
CH 3
H
H CH 2
HO
HO
ergoszterol Növényi eredetű élelmiszerek Sörélesztő, gombák
D2-vitamin op.: 115-117°C (ergo)kalciferol 1 NE = 0,025 mg
Szerepe: Ca2+- és foszfát felszívódás, csontképződés sziv- és érrendszer védelme, immunhiányos állapot, osztódás Hiánya: angolkór (rickets), csontritkulás, csontosodási zavar Hipervitamiózis: Csontszövet Ca2+- lerakódás, vesekőképződés
E-vitamin (tokoferol) τόκος [tókos], φέρειν [phérein] = születés, hordozni
izolálás 1936 felfedezés 1927 szintézis 1938
R3 R2
H 3C
7
CH 3
5
CH 3
CH 3
O
CH 3
CH 3
R1
kromán váz
C16 lánc
halványsárga olaj
R1=R2=R3=CH3 R1=R3=CH3, R2= H
α-tokoferol (5,7,8-trimetil) β-tokoferol (5,8-dimetil)
R2=R3=CH3, R1= H
γ-tokoferol (7,8-dimetil)
Előfordulás: növényi olajok, napraforgó, oliva, tökmag hús, máj, tojás, tejtermék Szerepe: antioxidáns, gyulladásgátló Hiánya: vérszegénység, izomsorvadás, meddőség (embernél ritka) Hipervitamiózis: Csontszövet Ca2+- lerakódás, vesekőképződés
E-vitamin (tokotrienol) R3 R2
CH 3
H 3C
O R1
CH 3
CH 3
CH 3 CH 3
•antisterilitás (patkány)
K1-vitamin (fillokinon) sárga olaj O
CH 3
CH 3
CH 3
1 2 3 4
CH 3
O H 3C
naftokinon
fitil-csoport
2-metil-3-fitil-1,4-naftokinon
Előfordulás: spenót, káposztafélék, saláta, brokkoli tejtermék, máj Szerepe: antioxidáns, gyulladásgátló, koaguláció Hiánya: vérzékenység (a koaguláció hiánya miatt) Bomlás: fény, hő (100oC felett)
CH 3
