SEMMELWEIS EGYETEM DOKTORI ISKOLA. Ph.D. értekezések

SEMMELWEIS EGYETEM DOKTORI ISKOLA

Ph.D. értekezések

Dr. Gergely Péter

A támasztó és mozgató szervrendszer muködésének fiziológiája címu program Programvezeto: Dr. Szendroi Miklós, egyetemi tanár Témavezeto: Dr. Poór Gyula, egyetemi magántanár

Mitokondriális és intracelluláris biokémiai sejtparaméterek jelentosége szisztémás lupus erythematosusban

Doktori (Ph.D.) disszertáció Dr. Gergely Péter

A támasztó és mozgató szervrendszer muködésének fiziológiája címu program 2. sz. Doktori Iskola (Klinikai Orvostudományok) Doktori Iskola vezetoje: Dr. Tulassay Zsolt egyetemi tanár Semmelweis Egyetem, Budapest

2003

2

TARTALOMJEGYZÉK ÖSSZEFOGLALÁS ....................................................................................................... 5 BEVEZETÉS ................................................................................................................... 7 CÉLKITUZÉSEK........................................................................................................... 9 IRODALMI HÁTTÉR ................................................................................................. 10 1. REAKTÍV OXIGÉN INTERMEDIEREK , MITOKONDRIÁLIS TRANSZMEMBRÁN POTENCIÁL, INTRACELLULÁRIS P H ÉS

ATP SZEREPE AZ APOPTÓZISBAN ÉS T SEJT AKTIVÁCIÓBAN. 10

2. MOLEKULÁRIS, CELLULÁRIS ÉS CITOKIN ABNORMALITÁSOK SLE- BEN .................... 15 MÓDSZEREK .............................................................................................................. 20 1. BETEGANYAG .......................................................................................................... 20 2. SEJTKULTÚRA ÉS AZ EGYES KEZELÉSEK LEÍRÁSA ..................................................... 20 3. ÁRAMLÁSOS CITOMETRIA ÉS FLUORESZCENS MIKROSZKÓPIA .................................. 21 3.1. Sejthalál vizsgálata.......................................................................................... 22 3.2. Mitokondriális transzmembrán potenciál és reaktív oxigéngyök termelés mérése ..................................................................................................................... 23 3.3. Limfocita szubpopulációk vizsgálata............................................................... 25 3.4. Intracelluláris pH mérése ................................................................................ 25 4. GLUTATION MEGHATÁROZÁS................................................................................... 26 5. INTRACELLULÁRIS ATP MÉRÉS ................................................................................ 26 6. IL-10 TERMELÉS VIZSGÁLATA ................................................................................. 27 7. STATISZTIKAI ANALÍZIS ........................................................................................... 27 EREDMÉNYEK ........................................................................................................... 28 1. SEJTFIZIOLÓGIAI PARAMÉTEREK VIZSGÁLATA STIMULÁLATLAN LIMFOCITÁKBAN... 28 1.1. Gyorsult apoptózis mellett mitokondriális hiperpolarizáció és fokozott reaktív oxigéngyök termelés jellemzo az SLE-s (elsosorban T) limfocitákra..................... 28 1.2. Csökkent redukált glutation(GSH)-szint SLE-s limfocitákban ........................ 29 1.3. Intracelluláris alkalizáció SLE-s limfocitákban.............................................. 29 2. OXIDATÍV STRESSZ HATÁSÁRA BEKÖVETKEZO SEJTHALÁL, ILLETVE ? ?

M

ÉS ROI

TERMELÉS VÁLTOZÁSAINAK VIZSGÁLATA ................................................................... 29

2.1. Limfociták H2 O2 -mediálta sejthalála SLE-ben eltéro módon megy végbe...... 29

3

2.2. Csökkent ROI termelés és mitokondrialis hiperpolarizáció elmaradása H2 O2 kezelés hatására SLE-ben ....................................................................................... 30 3. AZ INTRACELLULÁRIS ATP- SZINT, FO F1-ATP- ÁZ ÉS T SEJT AKTIVÁCIÓ LEHETSÉGES SZEREPÉNEK VIZSGÁLATA............................................................................................ 31

3.1 Csökkent intracelluláris ATP szint SLE-ben..................................................... 31 3.2. Oligomicin-indukálta változások kontroll limfocitákon: az Fo F1 -ATP-áz szerepének vizsgálata.............................................................................................. 32 3.3. CD3/CD28-indukálta változások kontroll limfocitákon: a T sejt aktiváció szerepének vizsgálata.............................................................................................. 32 3.4. CD3/CD28-indukálta változások összehasonlítása SLE-s és kontroll limfocitákon: a T sejt aktiváció szerepének vizsgálata........................................... 33 4. CITOKINEK SZEREPE AZ SLE- S LIMFOCITÁKBAN TAPA SZTALT RENDELLENESSÉGEKBEN ............................................................................................. 34

4.1. Különbözo citokinek hatása a mitokondriális potenciálra .............................. 34 4.2. Az IL-10 központi jelentosége SLE-ben ........................................................... 34 4.3. Az SLE-ben észlelt kóros sejtparaméterek és funkciók részleges normalizálása IL-10 blokkolással .................................................................................................. 35 5. AZ ÉRTEKEZÉS SAJÁT EREDMÉNYEINEK ÖSSZEFOGLALÁSA...................................... 36 MEGBESZÉLÉS .......................................................................................................... 37 KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS ...................................................................................... 45 RÖVIDÍTÉSJEGYZÉK............................................................................................... 47 IRODALOMJEGYZÉK .............................................................................................. 48 KÜLÖNLENYOMATOK............................................................................................ 60

4

ÖSSZEFOGLALÁS

Mitokondriális és intracelluláris biokémiai sejtparaméterek jelentosége szisztémás lupus erythematosusban Dr. Gergely Péter Témavezeto: Prof. Dr. Poór Gyula; Semmelweis Egyetem, Budapest, Doktori Iskola, 2003

Szisztémás lupus erythematosusos (SLE) betegekben a perifériás vér limfocitákra fokozott spontán és csökkent aktiváció-indukálta apoptózis jellemzo. Jelen doktori munka során azt a feltételezést vizsgáltam, vajon az alábbi kulcsfontosságú biokémiai paraméterek döntoen befolyásolják-e a kóros jelátviteli folyamatokat SLE-ben. E paraméterek, a mitokondriális transzmembrán potenciál (? ? m), reaktív oxigén intermedierek (ROI), intracelluláris pH (pHi), az ATP és glutation szint apoptózisban betöltött jelentoségét mostanában ismertük meg. ? ? m, ROI és pHi értékeket magasabbnak találtam SLE-s limfocitákban az egészséges donorokhoz és rheumatoid arthritises betegekhez képest. Az intracelluláris glutation alacsonyabb volt, utalva a redukáló ekvivalensek fokozott felhasználására. H2O2 , egy ROI prekurzor adására a kontrollokban átmeneti ? ?

m

emelkedés,

majd apoptózis jött létre, míg SLE-ben, foként a T sejtekben a hiperpolarizáció elmaradt és apoptózis helyett inkább nekrózist észleltünk. A sejtek ATP tartalma és ATP/ADP aránya, melyeket a sejthalál formáját meghatározó tényezokként ismerünk, SLE-ben csökkent volt és a ??

m

emelkedéssel volt arányos. A kontroll sejtekben mindezt CD3/CD28 kezeléssel

modelleztük, melynek során tranziens hiperpolarizáció, majd ATP depléció, ezt követoen a sejtek fokozott H2 O2-indukálta nekrózisa jött létre. Az Fo F1-ATP-áz-gátló oligomicin szintén hasonló hatású volt. CD3/CD28-indukálta T sejt aktiváció során SLE-ben kisebb mérvu ? ? m, pH és ROI emelkedést találtunk. Az SLE patogenezisében jelentosnek tartott IL-10 kontroll limfocitákban átmeneti hiperpolarizációt okozott, de sejthalált nem, SLE-ben viszont ROI termelést és apoptózist idézett elo, nem befolyásolva a ? ?

m

értékét. IL-10-ellenes neutralizáló

antitest vagy antagonista IL-12 kezelés a stimulálatlan és CD3/CD28-indukált ROI és pHi változásokat normalizálta az SLE-s sejtekben, de a ? ?

m

értékét nem korrigálta. Doktori

munkám alapján elmondható, hogy az emelkedett ? ? m, ROI szint és pH, az ATP depléció és a megváltozott IL-10 érzékenység fontos szerepet játszanak a lupusos sejtek defektusos apoptózisában és T sejt aktivációjában. Ezen adatok nemcsak a betegség patogenezisének megismeréséhez járulhatnak hozzá, de újabb terápiás beavatkozásokra is lehetoséget biztosíthatnak. 5

SUMMARY

The Role of Mitochondrial and Intracellular Biochemical Parameters in Systemic Lupus Erythematosus Dr. Peter Gergely Tutor: Prof. Dr. Gyula Poór; Semmelweis University, Budapest, PhD School, 2003

Peripheral blood lymphocytes (PBL) from sytemic lupus erythematosus (SLE) patients exhibit increased spontaneous and diminished activation-induced apoptosis. In my thesis I tested the hypothesis that key biochemical checkpoints play an important role in the abnormal signaling process in SLE. The significance of these parameters, i. e. mitochondrial transmembrane potential (? ? m), reactive oxygen intermediate (ROI) levels, intracellular pH (pHi), ATP and glutathion levels in apoptosis has recently been identified. ? ? m, ROI production and pHi were elevated in lymphoctes from SLE patients compared to controls including healthy donors and patients with rheumatoid arthritis. Intracellular glutathion contents were diminished in SLE suggesting increased utilization of reducing equivalents. H2O2 , a precursor of ROIs, increased ? ?

m

and caused apoptosis in normal PBL. In contrast,

H2O2-induced apoptosis and elevation of ? ?

m

were diminished, particularly in T cells, and

necrosis was increased instead in SLE. Intracellular ATP content and ATP/ADP ratio, which had earlier been shown to determine the form of cell death, were reduced and correlated with ??

m

elevation in SLE. As a model, CD3/CD28 co-stimulation led to a transient elevation of

the ? ?

m

followed by ATP depletion and sensitization of normal PBLs to H2O2-induced

necrosis. Oligomycin, an inhibitor of F0F1-ATP-ase, had similar effects. CD3/CD28-induced T cell activation in SLE was also blunted as measured by diminished increase in pH, ? ? m, and ROI production. IL-10, a cytokine known to play an important role in the pathogenesis of SLE, led to a transient elevation of ? ?

m

but caused no apoptosis in normal PBL. In contrast,

IL-10 induced ROI production and apoptosis in SLE lymphocytes without affecting ? ? m. IL10 blockade with neutralizing antibodies or antagonistic IL-12 normalized baseline and CD3/CD28-induced changes in ROI production and pH with no impact on ? ?

m

of lupus

PBL. My work conludes that mitochondrial hyperpolarization, increased ROI production, intracellular alkalization and ATP depletion as well as altered IL-10 responsiveness play a crucial role in defective T cell activation and apoptosis in SLE. These findings may not only contribute to the better understanding of the pathogenesis of SLE but may also represent novel targets of pharmacologic intervention. 6

BEVEZETÉS

A szisztémás lupus erythematosus (SLE) akut és krónikus szakaszokkal váltakozó, a szervezet egészét, foként (bár nem kizárólagosan) a szüloképes korú noket érinto autoimmun betegség. Társadalmi és tudományos jelentoségét növeli, hogy incidenciája viszonylag gyakori (1:10 000), és sem etiológiája, illetve kialakulásának pontos mechanizmusa nem ismert, sem a gyógyítása nem teljesen megoldott, bár megfelelo kezelés mellett hosszú tünetmentes periódusok érhetok el. A jelenleg rendelkezésre álló adatok szerint a betegségre hajlamosító gének és bizonyos környezeti tényezok komplex interakciója révén alakul ki az abnormális celluláris és humorális immunválasz. Az így beindult kóros autoimmun folyamat jellegzetessége a többféle, elsosorban sejtmagbeli autoantigén elleni fokozott antitesttermelés, majd az autoantitestek immunkomplexeket alkotva a parenchymás szervekben lerakódnak, gyulladást, majd a szervek súlyos funkciózavarát idézik elo. Az SLE patofiziológiájában tehát genetikai, exogén, humorális és celluláris tényezoknek tulajdonítanak dönto szerepet? a jelen doktori értekezés célja ez utóbbiak, a sejtes defektusok közelebbi vizsgálata. Az SLE-ban zajló sejtszintu patológiás történések központi eleme a T limfociták funkciózavara, mely azután a B sejt klónok elégtelen szuppresszióját és a már említett fokozott autoantitest termelést eredményezi. Mindez a normálistól jelentosen eltéro citokin milioben megy végbe, mely a kóros autoimmunitás oka és következménye egyaránt lehet. A lupusos celluláris abnormalitásokban a nem kelloen szabályozott apoptózisnak lényeges szerepe van. Az apoptózis a programozott sejtha lál fiziológiás folyamata, mely során a szervezet a nemkívánatos sejtektol, így többek között a potenciálisan autoreaktív limfocitáktól, a felesleges B és T sejtektol is megszabadul. Az SLE-s limfociták programozott sejthalála több szempontból is paradox. Leegyszerusítve fokozott spontán és csökkent további (pl. T sejt) aktiváció- indukálta apoptózis észlelheto. A reaktív oxigéngyökök vagy intermedierek (ROI) a klasszikus elképzelés szerint az aerob sejtmuködés toxikus melléktermékei. Ezek ellen többféle biokémiai mechanizmussal is védekezik a sejt, ezek egyik legfontosabb eleme a a redukált és oxidált glutation rendszere. Újabban egyre több adat szól amellett, hogy kontrollált szabadgyök-termelés számos fiziológiás sejtfunkcióhoz, így az apoptózishoz és a T sejt aktivációhoz is szükséges. A szabadgyök-termelés számos transzkripciós faktor

7

aktivitását szintén befolyásolja és így szerepet játszhat az SLE-ben észlelt citokin eltérésekben is. A mitokondriális transzmembrán potenciál (? ? m) és intracelluláris pH állandó értéken tartása elengedhetetlen a sejt homeosztázisában? ebben kiemelt szerephez jut a mitokondriumok

energia

(ATP)-szintetizáló

vagy

bontó

funkcióját

végzo

enzimkomplex, az Fo F1 -ATP-áz. A potenciálkülönbség jelentos csökkenése vagy megszunése a mitokondriumok funkcióvesztéséhez kapcsolható? így a programozott sejthalál során bekövetkezo ? ?

m

csökkenés (megszunés) és acidifikálódás mérésével a

folyamat irreverzibilis fázisa detektálható. Ugyanakkor, a legújabb adatok szerint, az apoptózis korai szakában egy átmeneti de szignifikáns ? ?

m

emelkedés (mitokondriális

hiperpolarizáció) tapasztalható, melyet többféle apoptózis induktor, így hidrogén peroxid-okozta oxidatív stressz során is leírtak. A korai pH átmeneti emelkedése (alkalizáció) szintén egy újonnan megismert jelenség, a T sejt aktiváció során bekövetkezo alkalizáció régebb óta ismert. Vajon mi a patomechanizmusa az SLE-s limfocitákra jellemzo fokozott spontán, ugyanakkor további stimuláció, így T sejt aktiváció által okozott csökkent apoptózisnak?

E

doktori

értekezésben

az

elobbi,

sejtfiziológiai/biokémiai paraméterek vizsgálatával, ill. a

alapveto

fontosságú

T sejt aktiváció, oxidatív

stressz–indukálta apoptózis és bizonyos citokinek hatására bekövetkezo változások tanulmányozásával próbáltam tisztázni a fenti kérdést, kísérletet téve a celluláris defektusok normalizálásra is. A doktori munkám során végzett kísérletek a szigorúan vett alapkutatás tárgykörébe tartoznak, de eredményei közelebb vihetnek az SLE patogenezisének pontosabb megismeréséhez és hozzájárulhatnak a betegség gyógyítása érdekében végzett kutatásokhoz is.

8

CÉLKITUZÉSEK

Az SLE-ben tapasztalható kóros celluláris folyamatok megismerése nemcsak a betegség patogenezisének pontosabb megértését könnyítheti meg, de az immunológiai alapkutatás kulcskérdéseinek tisztázásához is hozzájárulhat. Az SLE-s limfociták apoptózisáról, a sejtaktiváció mechanizmusáról nagymennyiségu irodalmi adat áll rendelkezésre, mégis az adatok sokszor ellentmondóak és hiányosak, így az elobbiekben felsorolt számos, újonnan megismert jelentoségu sejtparaméter és az SLE kapcsolatára vonatkozóan ezidáig alig találtam közléseket. A betegség patogenezisét és a sejtes abnormalitások mibenlétét tovább vizsgálandó, az alábbi kérdésekre kerestem a választ: 1. Van-e eltérés ? ? m, reaktív oxigéngyökök, glutation és intracelluláris pH alapszintekben

SLE-s

betegekbol

szeparált

(kezeletlen)

limfocitákban

rheumatoid arthritises (RA-s) és egészséges limfocitákhoz viszonyítva in vitro? 2. Hogyan jellemezhetok az oxidatív stressz, ill. T sejt aktiváció során létrejövo változások SLE-s, RA-s, ill. egészséges limfocitákban, különös tekintettel a sejthalálra és a fenti sejtfiziológiai/biokémiai paraméterekre? 3. Mi a jelentosége a mitokondriumok és az egész sejt homeosztázisában lényeges szereppel bíró Fo F1 -ATP-áznak és a sejtek ATP szintjének a lupusos celluláris abnormalitásokban? 4. Van-e szerepe az SLE patogenezisében lényegesnek tartott citokineknek a vizsgált biokémiai/sejtfiziológiai paraméterek befolyásolásában egészséges és SLE-s sejtekben? 5. Milyen patomechanizmusok valószínusíthetok az SLE-s limfocitákra jellemzo, a doktori értekezésben újonnan leírt celluláris defektusok mögött? 6. Van-e lehetoség az in vitro észlelt és modellezett kóros sejtparaméterek kísérletes normalizálására SLE-ben?

9

IRODALMI HÁTTÉR

1. Reaktív oxigén intermedierek, mitokondriális transzmembrán potenciál, intracelluláris pH és ATP szerepe az apoptózisban és T sejt aktivációban Az aerob élet paradoxonja, hogy míg a magasabb fejlettségu eukarióta sejtek és élolények nem létezhetnek oxigén nélkül, az oxigén toxikus a muködésükre. Az oxigén káros volta abból az egyszeru kémiai törvényszeruségbol fakad, hogy minden egyes oxigén atom egy páratlan elektront, a molekuláris oxigén két páratlan elektront tartalmaz a külso héjon, s így reaktív gyöknek tekinthetok. A mitokondriális elektrontranszport- lánc komplex muködése következtében az oxigén tetravalens redukciójával az ártalmatlan (és nélkülözhetetlen) víz keletkezik, viszont részleges (univalens) redukció során létrejönnek a reaktív oxigéngyökök, vagy reaktív oxigén intermedierek (ROI), az aerob élet káros melléktermékei. Ezek, bár több fiziológiás folyamatban is szerepet játszanak (71, 110), oxidatív stressz révén felelosek a fehérjék, lipidek és DNS károsításáért és így számtalan celluláris defektusért (22). Az oxidatív stressz ellen az emberi szervezetben többféle védekezo rendszer alakult ki, melyek lényeges elemei a szervezet által termelt és a táplálékkal felvett anyagokból képzodo redukáló molekulák (E vitamin, C vitamin, szelén, cöruloplazmin, ferritin, ? -karotin, glutation, tioredoxin, mangán, ubiquinon, cink) és enzimek (szuperoxid-dizmutázok, glutation-peroxidáz, glutation-reduktáz és kataláz). A reaktív oxigén intermediereket több betegségben is kóroki tényezoknek tartják, így pl. a daganatos betegségekben, ateroszklerózisban, valamint a gyulladásos betegségek közül a doktori értekezés témáját képezo SLE-ben (22). SLE-ben a ROI-k képzodése által keletkezo metabolitok (szérum lipid peroxidok,

8-oxo-7-hidrodeoxiguanozin,

8-epi-PGF 2? ),

és

az

antioxidáns

mechanizmusok (E vitamin, SOD, kataláz, glutation-peroxidáz) mérésével indirekt módon következtettek a betegségben zajló oxidatív stesszre (8,93,21,4). Ezek alapján vetodött fel a ROI-k szerepe a patogenezisben és vezetett azokra a diétás és terápiás kísérletekre, melyek lényege a szabadgyökök csökkentése a szervezetben (21). Mindemellett a perifériás vér limfociták, melyek az autoimmun folyamat lényeges elemei, direkt ROI termelésének korszeru módszerrel (pl. áramlásos citometriával) történo mérésérol irodalmi adat nem állt rendelkezésre, pedig a ROI-k azért is lényegesek SLE-ben, mivel olyan folyamatokat befolyásolnak, mint az apoptózist és T sejt aktivációt, melyek a betegség kialakulásában fontos szerepet 10

töltenek be (78). Hildeman és munkatársainak vizsgálata alapján humán sejtekben a T sejt aktiváció, majd a késobbi aktiváció- indukált apoptózis során szuperoxid termelés mérheto (48), a szuperoxid-dizmutáz analóg MnTBAP adására pedig a sejthalál kivédheto. Az apoptózis a programozott sejthalál fiziológiás, genetikailag meghatározott folyamata, mely során a szervezet a nemkívánatos sejtektol, így többek között a potenciálisan autoreaktív limfocitáktól, a felesleges B és T sejtektol is megszabadul. A legkülönbözobb ingerek okozhatnak apoptózist, melynek legfobb jellemzoi az ROI termelodés (39, 45, 86), fehérjebontó enzimek (szerin/cisztein proteázok, Granzyme B, kaszpázok) lánceakciószeru aktivációja, majd proteolízis és DNS fragmentáció (125). Leegyszerusítve, a kaszpázok aktivációja alapvetoen kétféle (sokszor egymással kapcsolódó és egymást nem kizáró) úton jöhet létre: a sejt felszínén levo sejthalál receptorokon (pl. Fas/TNF) keresztül, vagy a pro- és antiapoptotikus gének expressziójának megváltozása mitokondriális változásokhoz, citokróm C kiáramláshoz és apoptózist indukáló faktorok felszabadulásához vezet (59, 138). Az apoptózis jellegzetes morfológiai képpel jár: sejt- és sejtmagzsugorodás, a sejtmembrán apoptotikus „bimbóinak” megjelenése és a membrán belsejének kifelé fordulása (foszfatidil-szerin externalizáció), majd apoptotikus testekké fragmentálódás, melyeket végül a makrofág rendszer takarít el. Ennek elégtelensége esetén nekrózis alakul ki (ld. késobb az 1. táblázat). A ROI-k képzodésének fo helye a mitokondrium, mely mind a T sejt aktiváció (48, 137), mind az apoptózis (12, 54) folyamatának lényeges regulátora. Ezek jelátviteli folyamatainak kapcsolatát a Fas és TNF-indukált sejthalál, ill. antigén/CD28 kostimuláció példájával vázolom fel (1. ábra). A Fas/TNF receptorok külso stimulus - a megfelelo ligandok (FasL és TNF) megkötése - után felszabadítják a Fas-associált fehérjét (FADD), ami után a kaszpáz 8 aktiválódik. Ennek oligomerizációja és autoproteolízise után újabb kaszpázok aktiválódnak, melyek az apoptózis fontos végrehajtó bontó enzimei. A kaszpáz–3 által aktivált DN-áz (CAD) a sejt DNS-ét fragmentálja. A TNF receptor a DD-doméneken keresztül a TNF-receptor-asszociált faktorral (TRAF) kerül kölcsönhatásba, ami a nukleáris faktor-?B inhibitor (I? B) kináz (IKK) aktivációjához vezet egy kináz rendszeren keresztül (MAPKKK/ASK1). Az apoptózis szignál reguláló kináz 1 (ASK1) a tioredoxinhoz (TRX) való kötodés révén inaktív formában van, azonban ROI hatására a TRX leválik, és az ASK1 kináz aktivitása megno. Az IKK elosegíti az I?B 11

foszforiláció(P)- mediálta degradációját, és az NF-?B a magba transzlokálódik, ami számos NF-?B-szenzitív gént indukál. 1. ábra. ? ? m, ROI és redox rendszerek kapcsolata apoptózisban és T sejt aktivációban (Kammer et al, 2002 (51) után, módosítva, magyarázatot ld. a szövegben)

A T sejt receptor (TCR) antigén kötése CD28 kostimuláció mellett a PI3K és PTK kinázokat aktiválja, a következményes Ca2+-flux a mitokondriumot is eléri és ROI termelést, valamint NF-? B aktivációt eredményez. A mitokondriális membrán integritásának fenntartását membránstabilizáló Bcl-2 és Bcl-xL, pórusnyitó Bax és BAD molekulák egyensúlya, ill. a mitokondrium redukáló ekvivalenseket (NADPH, GSH és

12

TRX) termelo képessége biztosítja. A BAD foszforilációja a mitokondriumhoz kötött PKA által az antiapoptotikus P-BAD citoszólba jutását eredményezi (49, 53). Az ROI kontrollált szintje és regulált NF-? B termelés a sejtek növekedéséhez szükséges, viszont a fokozott ROI produkció (vagy elégtelen redukció) a mitokondrium membránjának sérüléséhez és a belso membrán két oldala között fennálló feszültség, a mitokondriális transzmembrán potenciál (? ? m) csökkenéséhez vezet. Az ezt követo apoptózis során a kaszpázok vitális fehérjék (PARP, 70k U1 RNP, lamin és aktin) proteolízisét végzik, a CAD DNS fragmentációt okoz, a mitokondriális membrán dezintegrálódik és a citokróm c kiszabadul. A ??

m

csökkenése, majd megszunése az apoptózis irreverzibilis fázisát jelzi,

mérésével az apoptotikus sejtek azonosíthatók. A klasszikus elképzeléssel szemben legújabban Vander Heiden és munkatársai 1997-ben Jurkat T sejtvonalon (131), Banki és munkatársai 1999-ben humán perifériás vér limfocitákon (7) Fas-indukált apoptózis korai szakaszában átmeneti ? ?

m

emelkedést, azaz mitokondriális hiperpolarizációt írtak

le, mely a kaszpázok aktiválódása és a foszfatidil-szerin externelizáció elott történik. A doktori értekezés alapját képezo kísérletek kezdetekor (1998), amikor H2 O2 adására magunk is hasonló hiperpolarizációt észleltünk, ez a jelenség nem volt általánosan elfogadott, többen is vitatták. Késobb ezt többféle induktor, így hidrogénperoxid (105), p53 (69), TNF-? (37), staurosporin (109, 104), magas glükóz koncentráció-okozta oxidatív stressz (106, 133), ciszplatin (97), N(? )- hidroxi- l-arginin (112), oxidált LDL (36), szöveti transzglutamináz (tTG) túltermelés (103), laktacisztin (57) által okozo tt apoptózis esetén is leírták. A ??

m

állandó értéken tartása a sejt homeosztázisának lényeges eleme, és

szabályozásában számos tényezo vesz részt. A mitokondrium negatív töltésu belseje és ehhez képest pozitív töltésu külseje között fennálló potenciálkülö nbség létrehozásában és fenntartásában dönto jelentoségu a NADH-ról molekuláris oxigénre elektronokat szállító elektron transzport lánc és az F0 F1 -ATP-áz (113). Utóbbi az oxidatív foszforiláció során az elektrokémiai grádiens fo rmájában tárolt energia felhasználásával ATP szintetázként muködve ADP-bol ATP-t hoz létre, vagy mint ATP-áz az ATP hidrolízisével nyert energiával protonokat pumpál ki, és így emeli a mitokondriális transzmembrán potenciált. Emellett a ? ?

m

értékét több más faktor is befolyásolja: redox rendszerek

(intracelluláris GSH, NADH/NADPH), az intramitokondriális és intracelluláris pH, az elektrokémiai potenciálgrádiens, a mitokondriális membrán ion-transzporterek (OH-/Pi, 13

K+/H+, Na+/H+, H+/Pi, H+/piruvát, elektrogé n K+ uniporter), a permeabilitást szabályozó pórus komplex (PTCP), melyet a külso membrán VDAC csatornája és a belso membrán ANT transzlokátora szabályoz), a Bcl-2 családba tartozó pro- és antiapoptotikus fehérjék oligomerizációja és intramitokondriális transzlokalizációja. Jelenleg egyértelmu magyarázat nincs arra vonatkozóan, hogy e faktorok közül melyek vesznek részt a mitokondriális hiperpolarizáció létrehozásában. Con A-val indukált T sejt aktiváció során a jelentos Ca2+-flux és intracelluláris pH emelkedés eléri a mitokondriumot (66), de a következményes hiper- és depolarizációt kiegyenlíto mechanizmusok muködése miatt a ? ?

m

konstans sertés

limfocitákban (11). Humán perifériás vér limfociták kezelése Con A-val ? ?

m

emelkedést eredményezett (7), de CD3/CD28 kostimuláció és hiperpolarizáció kapcsolatára vonatkozó irodalmi adat nem áll rendelkezésre. Korábbi

elképzelések

szerint

az

apoptotikus

folyamat

mitokondriális

depolarizációval és a kaszpázok aktivációjához szükséges celluláris acidifikációval jellemezheto (87). Ahogyan az apoptózis során fellépo mitokondriális hiperpolarizáció, úgy az intracelluláris alkalizáció is a reverzibilis korai szak nemrégen megismert eseménye, melyet többféle stimulus esetén leírtak: növekedési faktor megvonás (56), laktacisztin (57), és staurosporin (122). A korai pH emelkedés hátterében a plazmamembrán transzporterek (Na+/H+ antiport, Na+-K+-Cl--csatornák) aktiválódása és a Bax és Bid fehérjék mitokondriális transzlokációja állhat, ami után ? ?

m

változás,

majd citokróm C felszabadulás és sejthalál jöhet létre (122). A T sejt aktiváció során fellépo, CD2- mediálta vagy mitogén lektinek által eloidézett alkalizálódás régebb óta ismert (33, 89). Az F0 F1-ATP-áz/szintetáz nemcsak a ? ?

m

fenntartásában lényeges, de a termelt

ATP az apoptózis aktív folyamatához elengedhetetlen, ennek hiányában a sejtek passzívan, egy meroben más morfológiát mutató formában, primer nekrózisban halnak meg (64). Az apoptózist követo elégtelen eltakarítás esetén is szekunder nekrózis alakul ki. Sokszor az apoptosis és nekrózis, valamint a primer és szekunder nekrózis közötti különbségtétel nehéz, és a folyamatok részletei napjaink egyre intenzívebben kutatott témái közé tartoznak (50). A sejthalál formái közötti különbségeket foglalja össze az 1. táblázat. Az apoptózis és nekrózis mégsem két egymással ellentétes fogalom, hanem inkább

a

sejthalál

két

végpontja,

melyek

transzformálódhatnak (61):

14

az

alábbiak

szerint

egymásba

-

Az apoptózist nekrózis követheti (elégtelen elimináció esetén)

-

Ugyanaz az inger (pl. H2 O2 ) kis dózisban apoptózist, nagyobban nekrózist okoz

-

Patológiás eseményekben (pl. miokadiális infarktus) nekrózis is elofordul

-

Mitokondriális permeabilitásváltozás nekrózisban is lehet

-

Az antiapoptotikus Bcl-2 bizonyos modellekben nekrózis ellen is véd

-

Az intracelluláris ATP szint változtatásával a sejthalál formája befolyásolható

-

Bizonyos ingerek (Bax, Bak, c-Myc expresszió, szérum megvonás, szteroidok) apoptózist okoznak, de kaszpáz-gátló (Z-VAD- fmk) jelenlétében nekrózis jön létre

1. táblázat. A sejthalál különbözo formái Apoptózis - Fiziológiás/patológiás

Primer nekrózis - Extrém (vsz. külso) véletlen inger nyomán, mindig patológiás - Fogékonyság jól regulált - Fogékonyság nem, vagy alig regulált -Sejtmembrán késoi károsodása, - Sejtmembrán korai károsodása de korai PS externalizáció - Sejt elimináció kontrollált, - Elimináció kontrollálatlan makrofágok által - Sejttartalom nem áramlik ki: - Sejttartalom kiáramlik: gyulladás nincs gyulladás - Enzimatikus, ATP-dependens - ATP- independens, nem jól körülírható biokémiai enzimatikus passzív folyamatok folyamatokkal szabályozott nyomán alakul ki - Morfológia: piknózis, - Morfológia: teljes sejt duzzadás, karyorrhexis, endonukleolízis, onkózis, mitokondriális duzzadás kaszpáz-katalizált proteolízis, membrán asszimetria, sejtzsugorodás, nincs mitokondriális duzzadás

Szekunder nekrózis Hasonló, mint a primernél, de apoptózist követoen alakul ki, ha az apoptotikus sejt eliminációja (makrofágok által) elégtelen

2. Molekuláris, celluláris és citokin abnormalitások SLE-ben Az SLE patogenezisének alapját képezo, régóta ismert abnormalitás a B sejtek funkciózavara és a kóros humorális immunválasz, mely a poliklonális hipergammaglobulinémia révén patogén autoantitestek termelésével jár. Az 1970-es évek eleje óta, amikor a lupusos anergiás borreakció hátterében defektusos késoi hiperszenzitivitást és limfocita funkciót igazoltak (108), mind több adat támogatja a többféle celluláris és citokin abnormalitás jelentoségét (101), és egyre inkább a T sejtek különbözo funkciózavarait tartják a betegség patogenezisében dönto szereppel bíró tényezoknek (51, ld. 2. ábra). E doktori értekezés is ezekkel foglalkozik elsosorban.

15

Az SLE-s T sejtek általánosságban csökkent citotoxicitást és proliferatív válaszkészséget mutatnak különbözo antigénekkel és mitogén lektinekkel szemben in vitro (127). A T helper (Th) sejtek aktivitása a citotoxikus /szuppresszor T sejtek rovására megno, s a természetes ölo (NK) sejtek funkciója szintén károsodott (128). A Th1 és Th2 sejtek egyensúlya az utóbbiak javára tolódik el, melynek következtében megno az IL-6 és IL-10 termelés, míg az IL-2 és IFN-? szintje csökken. Az aktivált Th sejtek felszínén fokozódik a TNF családba tartozó CD40L (CD154) expressziója, ami az IL-6 és IL-10 által is stimulált CD40+ B sejtek hiperaktivitásához és az autoantitestek termeléséhez vezet (19). Az antigénprezentáló sejtek (APC) és T limfociták kommunikációja szintén kóros SLE-ben, amint azt a sejtfelszíni receptorok (CD28, B7, LFA-1, HLA-DR) eltéro expressziója is jellemzi (127).

2. ábra. A T sejtek szerepe a normál és az SLE-s immunológiai történésekben EGÉSZSÉGES

Ag

APC

Ag

CD4 Th

CD8 Ts/c Normál T sejtfunkció

Normál adhéziós molekula és cytokinexpresszió

B sejt

Normál immunglobulin termelés

SLE Ag/autoAg

APC

Ag/autoAg

CD4 Th CD8 Ts/c Kóros adhéziós molekula és cytokinexpresszió

B sejt

T sejtes funkciózavarok: - CD4 Th sejt fokozott muködés Hypergammaglobulinémia - CD8 Ts/c sejtek csökkent funkciója és patogének autoantitestek - Csökkent antitestfüggo cytotoxicitás - Th1 és Th2 cytokinek termelésének termelése egyensúlya felbomlik - Csökkent proliferáció mitogénekre és antigénekre Ag: antigén, APC: antigén prezentáló - Fokozott spontán és további indukcióra sejt, Th: T helper sejt, Ts/c: csökkent apoptosis szuppresszor/ cytotoxikus T sejt

16

Az immunkompetens sejtek rendkívül szerteágazó funkcionális abnormalitásai alapján felteheto, hogy az SLE-s, foként a T limfocitákban valamiféle molekuláris defektus van. Az utóbbi évek kutatásai nyomán számos ilyen, jól körülírható, egy adott molekula abnormalitásához kapcsolódó, nem a gyulladásos autoimmun folyamat szekunder jelenségeinek tartott, hanem primer funkciózavart ismerhettünk meg (51). Ezek a sejten belüli folyamat lokalizációja alapján (a sejtmembrántól haladva a sejtmagig) három (proximális, középso és disztális) szakaszra oszthatók, melyeket a 2. táblázat és a 3. ábra szemléltet (Kammer et al, 2002 (51) után, módosítva).

Diszt.

Középso

Proximális

2. táblázat. Molekuláris defektusok SLE-ben Defektus (lokalizáció az 3. ábrán) - CD45 tirozil foszfatáz defektus (1) - Csökkent/hiányzó TCR ? -lánc homodimer és fokozott tirozil foszforiláció és lck tirozil kináz aktivitás (2) - Fokozott IP3 koncentráció (3) - Fokozott intracelluláris Ca++- flux (4) - Csökkent PKC által katalizált foszforiláció (5) - Csökkent PKA-I aktivitás (6) - Csökkent PKA-II aktivitás (7) - Mitokondriális defektus - Csökkent MEK katalizálta ERK foszforiláció (8) - eIF2? fokozott foszforilációja PKR kináz által (9) - Csökkent Dnmt1 aktivitás (10)

3. ábra. T sejtes jelátviteli defektusok SLE-ben

17

Irodalom - Takeuchi et al, 1997 (123) - Liossis et al, 1998 (70) és Matache et al, 2001(84) - Kammer etal, 2002 (51) - Tsokos és Liossis, 1999 (128) - Tada et al, 1991 (121) - Kammer, 1999 (52) - Mishra et al, 2000 (92) - Jelen doktori értekezés - Deng et al, 2001 (25) - Grolleau et al, 2000 (38) - Deng et al, 2001 (25)

Említésre méltó, hogy ezekben a defektusokban említett molekulák, különbözo kinázok és foszforilázok regulációjában az elobbiekben részletezett ROI képzodés és redox mechanizmusok fontos szerepet játszanak (1), s így ezen abnormalitások összhangban állnak az apoptózis és T sejt aktiváció SLE-ben észlelt zavaraival (51). Az SLE-s limfociták programozott sejthalálának defektusa manapság széles körben elfogadott, és a lupusos sejtek apoptózisa több szempontból is paradoxnak nevezheto (28), ám az irodalom sokhelyütt ellentmondásos. Emlen 1994-ben közölt, mára már klasszikusnak számító tanulmányának megjelenése óta tudjuk, hogy SLE-ben a perifériás vér limfocitái fokozott apoptózist mutatnak in vitro (29), s az ennek nyomán kialakuló fokozott autoantigén felszabadulásnak szerepe lehet az autoimmun reakció kiváltásában/fenntartásában (14). Ugyanakkor az irodalomban van arra vonatkozó adat is, miszerint az SLE-s limfociták spontán és (pl. UV által) indukált apoptózisa nem különbözik az egészségesektol (13). Az T sejt aktiváció- indukálta (CD3- mediálta) apoptózis viszont csökkent, mely az alacsonyabb TNF? szintézis következtében (60) perzisztáló autoreaktív sejtek fokozott túlélése miatt lehet fontos, ami ismét csak az autoimmun reakciót gerjeszti. Míg az apoptózis gének (Fas receptor, Fas ligand) mutációja állatmodellben SLE-szeru tünetet okoz (95, 16), és a Fas receptor genetikai hibája emberben a limfoid rendszer egy ritka defektusát idézi elo (34, 26), humán lupusban a Fas- mediált apoptózis intaktnak tunik (94, 13). Mindemellett a legújabb adatok szerint a T sejtek fokozott apoptózisa a szérum szolubilis Fas (sFas, CD95-Apo-1) szinttel korrelál és a sFas lényeges eleme lehet az aktív SLE-sekben észle lheto apoptózisnak (111). Az apoptózist és az elobbiekben említett redox folyamatokat befolyásoló molekulák, elsosorban a bcl-2 család tagjainak (Bcl- xL, Bax, Bak, BAD) SLE-ben betöltött szerepére vonatkozó irodalmi adatok ellentmondásosak, és nem adnak magyarázatot az SLE-ben észlelt celluláris defektusokra (51). A kóros apoptózis és T sejtaktiváció mediátorai között jelentos szerepet tölt be az SLE jellegzetességének tartott megváltozott citokin milio, mely elobbbi folyamatok okaként és következményeként is szerepelhet. Bár ebben is találunk ellentmondó adatokat az irodalomban, leegyszerusítve elmondható, hogy SLE-ben a TNF-? vagy inkább a TNF-? /szolubilis TNF-? R hányados, TGF-? , és IL-12 szint csökkent (116), míg az IFN-?, IL-2, IL-6 és IL-10 szintek emelkedettek (42, 73). Nemcsak a citokinek termelése, de az egyes sejtek citokinre adott válasza/érzékenysége (így apoptózisa) is

18

eltéro SLE-ben (65). Emellett, ill. ezekkel összefüggésben az SLE genetikai faktorai között több citokin gén polimorfizmust és fogékonyságot is leírtak (129). A kóros citokinmilio a megnövekedett reaktív gyöktermelés miatt megváltozott redox-szenzitív limfokinek expressziójának következtében is kialakulhat. Ebbol a szempontból különös jelentoséggel bír az IL-10, melynek reaktív oxigéngyökök által történt regulációját korábban is leírták (63), és amelynek szintje SLE-ben mind a szérumban (3), mind az in vitro tenyésztett limfociták centrifugálás után nyert szupernatánsában (120, 42) magasabb volt. Az apoptózisban kulcsszerepet betölto Fas receptor (67, 100, 9) és Fas ligand (55) expressziója szintén redox szenzitív. Mindezekkel alapján a fokozott IL-10 termelést (35), megnövekedett Fas ligand felszabadulást (44) és a Fas receptor fokozott expresszióját (76) a limfociták megnövekedett spontán apoptózisával hozták összefüggésbe. Utóbbi hátterében az emelkedett nitrogénoxid-termelést szintén valószínusítik (98, 17).

19

MÓDSZEREK

1. Beteganyag A vizsgálatokba 25 SLE-ben szenvedo beteget vontunk be, melyek mindegyike megfelelt az ACR SLE kritériumainak (124). 23 no- (átlagéletkor ± SD: 39,3 ± 5,3 18 – 63 év közöttiek) és ketto férfibeteget (átlagéletkor ± SD: 44,8 ± 10,2, 25 – 55 év közöttiek) tanulmányoztunk. Kontrollként 25 egészséges, nemben és korban az SLE-s betegekhez illesztett személyt, valamint 10, az ACR kritériumok alapján (5) rheumatoid arthritisben szenvedo beteget (8 no, átlagéletkor ± SD: 51,3 ± 6,7 és 2 férfi, átlagéletkor ± SD: 54,0 ± 0) vontunk be a vizsgálatokba. Egyéb olyan fennálló betegség, mely a vizsgálatok eredményét vélhetoen befolyásolhatta (diabetes mellitus, rosszindulatú daganat, fertozés, hematológiai betegségek) kizáró oknak minosült. Az SLE-s betegek közül 15 részesült szteroid kezelésben (5-50 mg prednizon/nap), és 17 kapott valamilyen immunszuppresszív kezelést (200-400 mg hidroxiklorokvint vagy 50 mg azatioprint naponta, vagy heti 7,5 mg methotrexatot). Az RA-s betegek methotrexat, sulfasalazin, cyclosporin A, leflunomid vagy etanercept terápia valamelyikében részesültek, prednizon kezeléssel kombinálva, vagy anélkül. Az SLE-s betegek aktivitását az SLE Betegségaktivitási Index-szel (SLEDAI) határoztuk meg (10). Eszerint 11 betegnek volt 10 vagy annál kisebb a SLEDAI értéke, oket inaktívnak értékeltük, míg 14 beteg esetében mértünk 10-nél nagyobb SLEDAI értéket, akiket aktívnak határoztunk meg. A vizsgálatokat a State University of New York, Upstate Medical University Etikai Bizottságának jóváhagyásával folytattuk, minden beteg és egészséges véradó részletes tájékoztatást kapott, és beleegyezo nyilatkozatot írt alá.

2. Sejtkultúra és az egyes kezelések leírása Heparinizált perifériás vérbol mononukleáris sejteket izoláltunk Ficoll- Hypaque gradiens technikát alkalmazva. A limfocitákat a monociták eltávolítása révén nyertük, melyet saját szérummal kezelt Petri csészéhez történt kitapasztással végeztünk. Az így szeparált limfocitákat RPMI 1640 médiumban reszuszpendáltuk 10 %-os fötális borjú szérummal, 2 mM-os L- glutaminnal, penicillinnnel (100 IU/ml) és gentamycinnel (100 ? g/ml) kiegészítve. A 106 /ml-es koncentrációjú sejtszuszpenziót muanyag edényben 37?C-on inkubátorban tároltuk, mely 5 %-os CO2 -t tartalmazó párásított levegot

20

tartalmazott. A sejtek számolását és életképességének meghatározását tripánkék festéssel fénymikroszkóp alatt végeztük. Oxidatív stressz vizsgálatánál a sejteket különbözo ideig (20 perc, 1,2,3,16, és 72 óra) inkubáltuk 50 ? M H2 O2 jelenlétében vagy anélkül. A T sejt aktiváció tanulmányozására a sejteket olyan Petri-csészéhez adtuk, melyet 1 órával elotte 37 ?Con OKT3 (CRL 8001, American Type Culture Collection, Rockville, MD, USA) monoklonális antitesttel (1 ? g/ml/csésze) borítottunk be. A CD28 kostimulációt 500 ng/ml

CD28.2

monoklonális

antitest

(PharMingen,

San

Diego,

CA,

USA)

3

hozzáadásával végeztük. A proliferáció mérésére H-timidin inkorporációs tesztet alkalmaztunk. Az Fo F1-ATP-áz komplex aktivitásának szelektív gátlására a sejteket 30 percig elokezeltük 2,5 ? M oligomicinnel (Sigma, St. Louis, MO, USA). A sejtek különbözo ideju in vitro citokin kezelésénél az alábbi citokineket alkalmaztuk: IL-2 (50-500 U/ml), IL-3 (10-100 ng/ml), IL-4 (10-100 ng/ml), IL-6 (5-50 ng/ml), IL-7 (5-50 ng/ml), IL-10 (10-100 ng/ml), IL-12 (5-50 ng/ml), IL-15 (50-500 ng/ml), TNF-? (20 ng/ml), TGF-? 1 (5-50 ng/ml) és IFN-? (500 U/ml). Mindegyik citokin a PeproTech cégtol származott (Rocky Hill, NJ, USA). A kecskébol származó, poliklonális anti- humán IL-10-ellenes neutralizáló antitestet az R? D Systems cégtol rendeltük (Minneapolis, MN, USA), és 25 ? g/ml-es koncentrációban alkalmaztuk.

3. Áramlásos citometria és fluoreszcens mikroszkópia Az egyes fluoreszcens festékekkel jelzett sejtek vizsgálatát Becton Dickinson FACStar Plus (Becton Dickinson, Palo Alto, CA, USA) áramlásos („flow”) citométerrel végeztük, mely 488 nm hullámhosszon 200 mW energiát kibocsátó argon ion lézerrel volt felszerelve.

Az áramlásos citometriás mérések mellett a sejtek vizualizálása

érdekében fluoreszcens mikroszkópiát használtunk (Nikon Eclipse E800 kamera, Nikon, Tokyo, Japán), a különbözo színu képeket digitálisan egymásra vetítettük SPOT software segítségével (Diagnostic Instruments, Sterling Height, MI, USA). A különbözo hullámhossztartományban emittáló festékek fluoreszcenciáját a citométer három csatornáján (FL1, FL2 és FL3) detektáltuk. Az egyidejuleg alkalmazott festéseknél (pl. T sejtek apoptózisának vizsgálatára annexin V-FITC:FL1 és CD3Cy5:FL3) olyan indikátorokat használtunk, melyek emissziós spektruma nem mutatott átfedést a másik festékkel. Így lehetové vált az apoptózis és nekrózis egyideju mérése az adott sejtben, apoptózis vizsgálata különbözo limfocita szubpopulációkban, ? ? m, reaktív oxigéngyökök és apoptózis monitorozása ugyanabban a sejtben. A 3. táblázat a 21

vizsgálatokban alkalmazott festékek emissziós maximumát (nm) tartalmazza. A SNARF-1 esetében két csatornán (FL2 és FL3) egyidejuleg mértük az emissziót pulzus processzált módban, és az FL3/FL2 arányt használtuk a pH mérésére. Az áramlásos citometriás méréseknél nem vettük figyelembe a sejttörmeléket, melyet az elore és oldalra szórt fénnyel jellemzett populáció („forward and side scatter measurements”) alapján a citométer szoftverét használva elektronikus úton kizártunk. Minden mérést legalább 10 ezer sejten végeztünk.

3. táblázat. Az alkalmazott fluoreszcens festékek jellemzoi Alkalmazás

Festék

Emissziós Csatorna maximum (nm)

Sejthalál

Annexin V Konjugált fluorokróm: FITC PE Propidium-jodid (PI) Mitokondriális DiOC6 transzmembrán JC-1 (monomer és dimer) potenciál TMRM CMXRos Reaktív oxigéngyök DHR? Rhodamin 123 HE? Etidium DCF-DA? DCF Membrán potenciál DiBAC 4 (3) pHi SNARF-1 Limfocita CD3, CD4, CD8, CD45RA, szubpopulációk CD45RO Konjugált fluorokróm: FITC Cy5

520 578 636 501 527 és 590 573 599 529 605 529 516 650/580

FL1 FL2 FL2 FL1 FL1 és FL2 FL2 FL2 FL1 FL2 FL1 FL1 FL3/FL2

520 660

FL1 FL3

3.1. Sejthalál vizsgálata A tripánkék festéssel történt viabilitás meghatározás és hozzávetoleges sejtmorfológiai vizsgálat mellett a sejthalál további megítélésére a limfocitákat fluoreszcens indikátorral konjugált annexin V-tel, ill. propidium- jodiddal (PI) festettük, majd áramlásos citometriát és fluorescens mikroszkópiát alkalmaztunk. A festés és a citometria részleteit illetoen utalunk Nicoletti és munkatársainak közleményére (96). Az annexin V az egészséges sejteket nem festi, viszont az apoptózis során bekövetkezo sejtmembrán externalizáció (a sejthártya belsejének a külso tér felé fordulása) miatt kötodik a membrán foszfatidil-szerin (PS) részéhez (83). Indikátorral, fluoreszcein izotiocianáttal (FITC) vagy phycoerythrinnel (PE) konjugált annexin V-tel festve az apoptózis így áramlásos citometriával vagy fluoreszcens mikroszkóppal 22

vizsgálható

(132).

Emellett

az

apoptotikus

sejtek

alaki

sajátságainak,

a

sejtzsugorodásnak és nukleáris fragmentációnak folyamatát is figyelemmel követtük fluoreszcens mikroszkópia segítségével, annexin V-FITC-el (FL1, zöld) és propidium jodiddal (PI, FL2, piros) festve. A nekrózis meghatározása PI festéssel történt, a sejtek morfológiai változásának (sejt- és sejtmagduzzadás és sejttörmelék képzodés, ld. 1. táblázat) megfigyelése mellett. Sem az élo, sem az apoptotikus sejtek nem festodnek PI-dal, a nekrotikus sejtek viszont festodnek annexin V-tel is, így a nekrózis aránya az annexin V–pozitív populáción belüli PI-pozitivitás százalékával megadható. Az apoptózis pedig az egyszerre annexin V-pozitív és PI negatív sejtek arányával fejezheto ki. A PI festés (50 ? g/ml) után szintén fluoreszcens mikroszkópiát és áramlásos citometriát alkalmaztunk.

3.2. Mitokondriális transzmembrán potenciál és reaktív oxigéngyök termelés mérése A

gyöktermelés

dihidrorodamin

123-at

mérésére (DHR),

oxidáció-szenzitív hidroetidint

(HE)

diklorofluoreszcein-diacetátot (DCF-DA) használtunk. A ? ? dihexiloxakarbocianin

jodid

(DiOC6 ),

fluorokróm és m

festékeket

5,6-karboxi-2’,7’meghatározását 3,3’-

5,5’,6,6’-tetrakloro-1,1’,3,3’-tetraetil-

benzimidazolo-karbocianin jodid (JC-1), tetrametilrodamin- metilészter (TMRM) és klorometil- X-rozamin (CMXRos) festések segítségével végeztük. Mindegyik festék a Molecular Probes cég terméke volt (Eugene, OR, USA). A módszerek részletes leírásánál hivatkozunk korábbi közleményekre is (6). A kezeletlen vagy különféleképpen kezelt (H2 O2 , CD3/CD28, oligomicin stb.) sejteket háromszor mostuk 10 mM-os HEPES-sel pufferolt sóoldatban (140 mM NaCl, 2,5 mM CaCl2 , pH: 7,4), majd ugyanebben az oldatban inkubáltuk 0,1 ? M DHR-rel 2 percig, vagy 1 ? M HE-vel 15 percig, ill. 1 ? M DCF-DA- val 15 percig, s utána áramlásos citometriát végeztünk.

Míg az R123, a DHR oxidáció során keletkezo

fluoreszcens terméke (FL1) a mitokondrium belso membránjához tapad, a DCF (FL1) és az etidium (FL2) a citoszólba kerül. Vizsgálataink során a DHR-t és HE-t szenzitívebbnek találtuk, mint a DCF-DA-t, és az eredményeknél csak a két elobbi festékkel mért adatokat közöljük. A mitokondriális transzmembrán potenciál áramlásos citometriás mérésére a sejteket 20 nM DiOC6 -tal festettük 15 percig sötétben 37 ?C-on a fent részletezett HEPES oldatban. A DiOC6 egy kationos, erosen lipofil molekula, melynek 23

fluoreszcenciája (FL1) független az oxidációtól (így a gyöktermelés nem befolyásolja) és arányos a ? ?

m

értékével (102). A mitokondriális potenciált JC-1 festékkel, 0,5 ? M-

os koncentrációban 37?C-on 15 perces inkubálás után szintén mértük. A JC-1 alacsony potenciálon zöld (FL1, emisszió: 527 nm) fluoreszcenciájú monomer formában létezik, viszont magas potenciál esetén úgynevezett J-aggregátumok jönnnek létre, melyek piros színuek (FL2, emisszió: 590 nm). A ? ?

m

tehát az FL2 fluoreszcencia intenzitásával

vagy az FL2/FL1 aránnyal mérheto (114, 18). Mind a gyöktermelés, mind a ? ?

számszerusítésére az átlag fluoreszcenciát

m

(„mean channel fluorescence ? S.E.M.”) használtuk, a különbözo festékekkel mért értékek jobb összehasonlíthatósága érdekében az egészséges donorokból származó sejtek átlagát 100,00-ra normalizáltuk és ehhez hasonlítottuk a többi adatot. A ??

m

mérésére TMRM-et és CMXRos-t is használtunk, melyek a DiOC6 és

JC-1 festékekkel gyakorlatilag megegyezo értékekek adtak, így az ezekkel mért eredményeket külön nem közöljük. Jóllehet a TMRM-et és CMXRos festékek excitációs maximuma távol esik az alkalmazott argon lézer által kibocsátott lézernyaláb 488 nm-es hullámhosszától, megfelelo excitációt és fluoreszcencia intenzitást tapasztaltunk e két festékkel is. A pozitív kontrollként használt protonofór anyaggal (5 ? M karbonilcianid m-klorofenilhidrazon, Sigma) való 15 perces kezelés 37 °C-on mindegyik

potenciometrikus

festékkel

mérve

a

??

m

jelentos

csökkenését

eredményezte, jelezve a mitokondriális potenciálkülönbség kiegyenlítodését. A mitokondriális transzmembrán potenciál értékekben mért különbségek (pl. egészséges és SLE-s limfociták ? ? m-ja) a protonophorral való kezelés után megszuntek, így

a protonophor belso kontrollként is szolgált, esetleges mutermék

(eltéro festékkoncentráció, sejtszám stb) kiküszöbölésére. A ??

m

értéke nem teljesen független a sejtmembrán potenciáltól, azaz a sejt

belso tere és az extracelluláris milio között fennálló potenciálkülönbségtol. Ezen túlmenoen az alkalmazott festékek fluoreszcenciáját a sejtmembrán potenciál is befolyásolhatja. Annak eldöntésére, hogy a mitokondriális transzmembrán potenciál értékekben mért különbségek létrejöttében szerepe van-e a sejtmembrán potenciálnak, az áramlásos citometriás méréseket a membránpotenciált tükrözo DiBAC 4 (3) festéssel is elvégeztük. Az egyes vizsgálati csoportok között nem tapasztaltunk különbséget, tehát a JC-1, DiOC6 , TMRM és CMXRos festékekkel mért különbségek valóban a ? ? értékét tükrözték.

24

m

3.3. Limfocita szubpopulációk vizsgálata A ? ? m, ROI, sejthalál változásait az egyes limfocita szubpopulációkban Quantum Red/Cy5-konjugált monoklonális antitestekkkel (CD3, CD4, CD8, CD45RA, CD45RO) való festés után áramlásos citometriával követtük nyomon. A Cy5 FL3 fluoreszcenciája lehetové tette a FL1 és FL2 festékekkel (3. táblázat) történo egyideju festést. Az egyes kombinációkat az eredményeknél, ill. az ábráknál közöljük.

3.4. Intracelluláris pH mérése A sejtek pH-ját is áramlásos citometriával határoztuk meg karboxiseminaphthorhodafluor-1 (SNARF-1)-acetoximethylészter-acetát indikátor (Molecular Probes, Eugene, OR, USA) segítségével. A mérésekhez Wieder és munkatársainak (136) módszerét használtuk az alábbi módosításokkal. A karboxi-SNARF-1/AM-acetát semleges töltésu észter formájában a sejtbe bediffundál, ahol az intracelluláris észterázok hidrolizáló hatása révén egy erosen poláros molekulává alakul. A belso térben rekedt fluoreszcens tulajdonságokkal bíró molekula emissziós spektruma az intracelluláris pH-tól függoen változik, és a két különbözo emissziós tartományban mért fluoreszcencia- intenzitás hányadosával a pH pontosan mérheto. Az in vitro inkubált limfocitákat (5x106 sejtet) 10 perces centrifugálás (1000 rpm) után foszfát pufferben (“phosphate buffered saline”, PBS) mostuk és PBS-ben reszuszpendáltuk. Ezt követoen 5 ? g/ml karboxi-SNARF-1/AM-acetátot adtunk a szuszpenzióhoz 0,5 mg festék/ml- es dimetilszulfoxidos (DMSO) törzsoldatból és a sejteket 30 percig 37?C-on inkubáltuk. Minden kísérlethez friss karboxi-SNARF-1AM/acetát törzsoldatot készítettünk. Az inkubálás után áramlásos citometriát végeztünk és két emissziós sávban (FL2: 580 nm és FL3: 650 nm) vett fluoreszcencia intenzitás arányát (FL3/FL2) pulzus processzált módban kollektáltuk. Az intracelluláris pH-t az FL3/FL2 arányból számítva, ismert pH-jú oldatokkal készített kalibrációs egyenes segítségével határoztuk meg. A standard egyeneshez magas K+ koncentrációjú pufferbol (120 mM KCl, 30 mM NaCl, 0.5 mM MgSO4 , 1 mM CaCl2 , 1 mM NaHPO4, 5 mM glükóz és 10 mM HEPES) különbözo pH-jú oldatokat készítettünk, majd 5 ? g/ml nigericin (Sigma, St. Louis, MO, USA) adásával kiegyenlítettük az intra és extracelluláris pH-t. Így a referens oldatban levo sejtek intracelluláris pH-ja megegyezett az oldat (ismert) pH-jával.

25

4. Glutation meghatározás A sejtek teljes glutation-tartalmát Tietze enzimatikus módszerével mértük (126). 106 sejtet 50 ? l 4,5 %-os sulfoszalicilsavas oldatban reszuszpendáltunk. A precipitált proteint 4?C-on 10 percig 15 000 g-vel lecentrifugáltuk és a fehérjetartalmat Lowry módszerével határoztuk meg (79). A minták GSH tartalmát az ismert mennyiségu GSHval készített referencia görbe alapján számoltuk ki. A sejtek GSH és GSSG tartalmát reverz- fázisú ioncserélo magas nyomású folyékony kromatográfiás (HPLC) módszerrel határoztuk meg ultraibolya (UV, hullámhossz:365 nm) detektor alkalmazásáva l (30). 106 sejtet deproteinizáltunk 10 %os perklórsavval és 1 mM-os batofenantrolin-diszulfonsavval, majd háromszori fagyasztás és felolvasztás után a mintákat 3 percig 15000 g- vel lecentrifugáltuk. Ezután 500 ? l felülúszóhoz 50 ? l- nyi 100 mM-os monojódecetsavban oldott 0,2 mM m-krezol ibolyát adtunk, majd további 480 ? l 2M KOH és 2,4M KHCO3 adásával neutralizáltuk az oldatot. A mintákat eloször szobahon sötétben 10 percig, majd 1 ml 1 %-os fluorodinitrobenzol adása után 4?C-on 12 óráig inkubáltuk. Centrifugálás és szurés után 100 ? l mintát injektáltunk a HPLC készülékbe (Waters Allience Sys tem, Milford, MA, USA), melyet egy Waters Spherisorb-NH2 oszloppal szereltünk fel. A redukált és oxidált glutation tartalmat ismét ismert mennyiségu GSH és GSSG standardokkal készített referencia görbe segítségével határoztuk meg.

5. Intracelluláris ATP mérés A sejtek ATP tartalmát a luciferin- luciferáz lumineszcencián alapuló módszerrrel mértük (81). Az in vitro 16 óráig inkubált limfocitákat (5x106 sejtet) centrifugálással összegyujtöttük és PBS-ben mostuk, majd a sejteket 50 ? l PBS-ben reszuszpendáltuk és 50 ? l 2,5 %-os triklórecetsavat adtunk hozzá. A mintákat ezután 20?C-on tároltuk, és a különbözo napokon extrahált mintákat egyszerre mértük, így lehetové vált több SLE-s és kontroll minta egyideju vizsgálata. A minták fehérjetartalmát Lowry módszerével határoztuk meg (79). A bioluminescencián alapuló ATP mérés lényege, hogy a luciferáz enzim katalízisével a luciferin szubsztrátból az ATP mennyiségétol függoen oxiluciferin termelodik: ATP + D-luciferin + O2 ? AMP + pirofoszfát + oxiluciferin + CO2 + fény. Megfelelo feltételek mellett a keletkezo fény (fotonok) mennyisége egyenesen arányos az ATP mennyiségével, a fény luminometriás mérésével az ATP tartalom igen pontosan meghatározható, akár nanomólos vagy pikomólos ATP mennyiségek esetén is. 26

A sejtek ATP tartalmát a fenti reakciót felhasználó kit (Molecular Probes) segítségével mértük egy AutoLumat LB953 automata luminometer segítségével (Berthold, Wildbad, Németország), a kitet gyártó cég instrukciói alapján. A sejtek ATP tartalmát ismert mennyiségu ATP standardokkal felvett kalibrációval számítottuk ki. 55000 nM-os tartományban a luminométer által mért fénymennyiség és az ATP tartalom között lineáris összefüggés állt fenn. A kit által összeállított reakcióelegyhez adott minta nem haladta meg a 2 térfogatszázalékot. A sejtextraktumban esetleg jelenlevo nemspecifikus inhibitorok zavaró hatásának kiküszöbölésére belso kontrollként ismert mennyiségu ATP-t adtunk a mintákhoz és az ATP szintet újramértük (80). Az ATP/ADP arány és ADP szint meghatározása ApoGlow kittel történt (Lumitech, Nottingham, UK), mely az elobb leírt biolumineszcencián kívül az ADP-nek enzimatikus úton ATP-vé történo alakításán alapul.

6. IL-10 termelés vizsgálata Az limfociták IL-10 termelését 5 napos in vitro kultúra után mértük a sejtek centrifugálása után kapott felülúszóból ELISA kit segítségével (Endogen, Woburn, MA, USA), a gyártó cég instrukciói alapján.

7. Statisztikai analízis A normál eloszlást mutató változókat Student-féle t-próbával vizsgáltuk meg, hasonló eloszlást mutató értékek közötti kapcsolat számszerusítésére a Pearson- féle korrelációs koefficienst használtuk. Nem Gauss- i eloszlás esetén non-parametrikus Mann-Whitney tesztet alkalmaztunk, a nem normál eloszlást mutató változók közötti összefüggést pedig Spearman- féle korrelációs analízissel számítottuk. A mennyiségek megadásánál az átlag ? S.E.M. értékeket tüntettük fel, ahol az átlag ? S.D.-t adtuk meg, ezt külön jeleztük. Az észlelt különbségeket, változásokat vagy korrelációt akkor tekintettük statisztikailag szignifikánsnak, ha p ? 0,05. A statisztikai számításokhoz a GraphPad Prism 3.0 programot (3.02 verzió) használtuk (GraphPad Software, San Diego, CA, USA).

27

EREDMÉNYEK

1. Sejtfiziológiai paraméterek vizsgálata stimulálatlan limfocitákban

1.1. Gyorsult apoptózis mellett mitokondriális hiperpolarizáció és fokozott reaktív oxigéngyök termelés jellemzo az SLE-s (elsosorban T) limfocitákra A spontán programozott sejthalált 16 órás inkubáció után vizsgáltuk SLE-s, RAs

és

egészséges

egyénekból

szeparált

limfocitákon,

áramlásos

citometriával,

fluorokróm-konjugált annexin V festés segítségével. A korábbi irodalmi adatokkal összhangban (29) az apoptózis mértékét fokozottnak találtuk (8,82 ± 0,69 %), mind az RA-sokhoz (6,29 ± 0,4 %), mind egészségesekhez (6,08 ± 0,34 %) viszonyítva. A SLEDAI értékkel mért aktív (> 10) stádiumban lévo SLE-s betegek apoptózisa (10,25 ± 0,72 %) szignifikánsan magasabb volt az inaktívakénál (7,01 ±1,08 %), míg a gyógyszeres kezelés (szteroid, hidroxiklorokvin, ill. immunszuppresszív terápia) nem volt hatással a sejthalálra [I. közlemény Table 1. ld. különlenyomatok]. A ??

m

korai emelkedése és reaktív oxigéngyöktermelés fontos, újonnan

megismert sejtfiziológiai jelenség számos ágenssel indukált apoptotikus folyamatban. Az annexin V festés mellett olyan ? ? m-t (JC-1 és DiOC6 ) és gyöktermelést méro (DHR és HE) fluoreszcens festékeket alkalmaztunk, melyek emissziós spektruma alkalmas volt az apoptózis és az elobbi sejtfiziológiai paraméterek egyideju tanulmányozására. A ? ? m-t és gyökszintet tükrözo relatív fluoreszcencia értékeket az annexin V-negatív (élo) sejtekben határoztuk meg. Az in vitro mérések szerint nyugalmi helyzetben (külso stimulus nélkül) emelkedett mitokondriális transzmembrán potenciált (azaz nyugalmi hiperpolarizációt) és fokozott reaktív oxigéngyök termelodést tapasztaltunk SLE-s betegekbol származó limfocitákban az egészséges kontrollokhoz vagy RA-s betegekhez képest [I., Table 1.]. A mérések JC-1 és DIOC6 festéssel, illetve DHR és HE festéssel is hasonló eredményt adtak. A ? ? m-t és gyöktermelést tükrözo értékek nem korreláltak az SLE aktivitásával, kortikoszteroid vagy immunszuppresszív kezeléssel [I. Table 1.]. Fluoreszcens mikroszkópiával [I. Fig. 1.] az SLE-s betegekbol származó limfociták mitokondriális hiperpolarizációját (intenzívebb zöld/DiOC6 festodés) és nagyobb mértéku apoptózisát (piros annexin V-PE festodés) demonstráltuk. Figyelemre méltó, hogy az emelkedett ? ?

m

elsosorban az annexin V-negatív (élo) sejteket érinti,

összhangban a korábbi adatokkal, miszerint a hiperpolarizáció korai, az apoptózist megelozo esemé ny (7). 28

Az SLE-seket érinto hiperpolarizáció elsosorban a T sejtekben jött létre [I. Fig. 2.], amint azt a CD3-pozitív sejtek potenciálja és CD3-negatív sejtek potenciálja által képzett hányados tükröz: míg kontrollban a ? ?

m(CD3+)

/??

m(CD3-)

hányados értéke közel

1 (0,97 ± 0,06), addig SLE-ben értéke szignifikánsan nagyobb: (1,34 ± 0,12, p = 0,01). Egyéb (CD4, CD8, CD45RA és CD45RA pozitív) szubpopulációk között további különbség már nem volt, tehát a hiperpola rizáció a lupusos T sejtek mindegyikét egyformán érintette.

1.2. Csökkent redukált glutation(GSH)-szint SLE-s limfocitákban Az oxidatív hatásoktól mentes milio elengedhetetlen a sejt életfunkcióinak biztosításához. Ennek fenntartásában kiemelt jelentoségu a GSH, melynek a ROI-k által okozott sejtkárosítás elleni védelemben tulajdonítanak fontos szerepet. A GSH és oxidált formájának (GSSG) mérését frissen szeparált limfocitákban HPLC módszerrel végeztük. A GSH értéke SLE-ben szignifikánsan alacsonyabb volt (3,6 ± 0,3 ng/? g fehérje) a kontrollokhoz képest (5,11 ± 0,5 ng/? g fehérje, p = 0,016). A GSSGtartalomban nem volt különbség az SLE-sek (1,17 ± 0,09 ng/? g fehérje) és kontrollok (1,13 ± 0,10 ng/? g fehérje) között.

1.3. Intracelluláris alkalizáció SLE-s limfocitákban Fenti redox paraméterek mellett az intracellulláris pH változása is fontos tényezo az apoptózis és T sejt aktiváció folyamatában, elsosorban a korai szakaszban, és az eddig talált abnormalitások után szerepe felmerült az SLE-ben tapasztalható jelátviteli defektusokban is. Ennek vizsgálatára a stimulálatlan limfocitákban áramlásos citometriával mértük a pHi értékét SNARF-1 festést alkalmazva. Az SLE-s betegekbol származó sejtek intracelluláris pH-ját magasabbnak találtuk (7,236 ± 0,021), mint az egészséges (7,151 ± 0,019, p = 0,013) vagy RA-s (7,170 ± 0,02, p = 0,03) donorokét. 2. Oxidatív stressz hatására bekövetkezo sejthalál, illetve ? ?

m

és ROI termelés

változásainak vizsgálata

2.1. Limfociták H2 O2 -mediálta sejthalála SLE-ben eltéro módon megy végbe A reaktív oxigéngyökök alapveto sejtfunkciókat befolyásolnak, és számos olyan jelátviteli folyamatban vesznek részt, melyek a programozott sejthalálban és a T sejt aktivációban bírnak dönto jelentoséggel. A reaktív oxigéngyökök prekurzoraként ismert 29

H2 O2 a T sejt aktivációban fontos mediátor (77), és 50 ? M-os koncentrációban oxidatív stresszt és ennek következtében apoptózist, ill. jóval kisebb mértékben nekrózist okoz limfocitákban in vitro (6). Nagyobb koncentrációban a nekrózis aránya no, 400 ? M-os koncentráció felett gyakorlatilag már csak ezt észlelhetjük. 16 órás 50 ? M H2 O2 expozíció után a fénymikroszkópos kép alapján a lupusos limfocitáknak az egészségesekhez képest nagyobb hányada mutatta nekrózis morfológiai jeleit (sejt- ill. sejtmagduzzzadást, és tripánkék festodést), a sejttörmelék aránya szintén nagyobb volt SLE-ben. A H2 O2 -kezelt sejtek morfológiáját fluoreszcens mikroszkópiával is vizsgáltuk [I. Fig. 3A.]. A nekrotikus és apoptotikus sejtek arányát áramlásos citometriával határoztuk meg egyideju annexin V és PI festés segítségével [I. Fig. 3B.]. Ahogyan korábban is láttuk, a programozott sejthalál a kezeletlen lupusos sejtekben fokozott volt [I. Table 1.]. 16 órás H2 O2-kezelés hatására azonban az apoptotikus (és nem nekrotikus: annexin V-pozitív és egyben PI-negatív) sejtek arányának növekedése szignifikánsan kisebb mértéku volt (10,3 ± 1,1 %) SLE-ben, mint kontrollokban (20,5 ± 0,8 %, p ? 0,001, [I. Fig. 3C.]). A H2 O2-kezelés ugyanakkor a nekrózis arányának (annexin Vpozitív és egyben PI-pozitív sejtek számát tekintve) nagyobb arányú növekedését eredményezte a lupusos sejtekben, (19,0 ± 1,2 %), mint az egészséges donorokéban (4,5 ± 0,8 %, p ? 0,001, [I. Fig. 3D.]). Az RA-s betegek limfocitáinak nekrózisa hasonló volt a kontrollokéhoz (5,2 ± 1,2 %). Úgy tunt, különösen a lupusos T sejtek voltak refrakterek a H2 O2-indukálta apoptózisra (a CD4+ és CD8+ sejtek egyformán), mivel az annexin V-pozitív sejtek között a CD3-pozitívak aránya szignifikánsan kevesebb volt a kezelés után, mint elotte, míg kontrollokban az arány nem változott [I. Fig. 6B.]. Igaz, a H2 O2 és a nekrózis a CD3- festodést is befolyásolhatta.

2.2. Csökkent ROI termelés és mitokondriális hiperpolarizáció elmaradása H2 O2 -kezelés hatására SLE-ben In vitro H2 O2-kezelés maga is ROI termelést eredményez, melynek a következményes apoptózisban van dönto szerepe (40). Saját áramlásos citometriás méréseink szintén azt mutatták, hogy H2 O2 hatására az annexin V-negatív sejtek gyöktermelése nott. A DHR és HE festékekkel mért gyöktermelés és az ezt követo (annexin V-tel monitorozott) apoptózis mértéke között szignifikáns korrelációt találtunk mind a kontroll (r = 0,54, p = 0,04), mind az SLE-s sejtekben (r = 0,70, p = 0,004, [I. 30

Fig. 4A.]). Ezek után nem meglepo, hogy az oxidatív stresszre kisebb mérvu apoptózist mutató lupusos sejtek gyöktermelése is kisebb mértéku volt, mint a kontrolloké [I. Fig. 4B.]. A mitokondriális transzmembrán potenciál tanulmányozására szintén a DiOC6 és JC-1 festékeket használtuk. Az apoptózis korai szakában újonnan leírt (7) mitokondriális hiperpolarizációt H2 O2 -kezelés során saját kísérleteinkben is tapasztaltuk egészséges egyénekbol származó limfocitákon, a ? ?

m

emelkedés maximumát 20 perc

után megfigyelve [I. Fig. 5A. ]. Ugyanakkor a lupusos limfociták (a korábbiak alapján már eleve magasabbnak mért) mitokondriális potenciálja további emelkedést nem mutatott, a kontrollokban észlelt változáshoz képest SLE-ben szignifikánsan kisebb mértéku változást (valójában stagnálást, vagy enyhe csökkenést) mértünk [I. Fig. 5B.]. A 16 órás H2 O2 -kezelés után mind a kontroll, mind az SLE-s limfociták ? ? m-ja jóval a kiindulási érték alá csökkent az apoptózis késobbi szakában fellépo mitokondriális dezintegrációnak megfeleloen, amint azt korábbi közlemények is leírják (117).

3. Az intracelluláris ATP-szint, Fo F1 -ATP-áz és T sejt aktiváció lehetséges szerepének vizsgálata

3.1 Csökkent intracelluláris ATP szint SLE-ben Az, hogy a sejtet éro apoptotikus ingerre, így hidrogén-peroxidra programozott sejthalál vagy nekrózis következik-e be, újabb adatok alapján a sejt ATP szintjétol függ. ATP-depletált humán Jurkat limfocitákban olyan dózisú (50-100 ? M) H2 O2 hatására, mely intakt sejtben egyébként apoptózist okozna, inkább nekrózis megy végbe (64). A lupusos sejtek mitokondriumának eleve hiperpolarizált állapota és az a tény, hogy H2 O2 adására további ? ?

m

emelkedés már nem tud végbemenni, mitokondriális

funkciózavarra utal. A legújabb vizsgálatok szerint a mitokondriális hiperpolarizáció és ROI termelés az Fo F1 -ATP-áz komplex protonpumpa funkciójával és ATP deplécióval függ össze (82). Mindezek alapján annak eldöntésére, vajon a lupusos sejtekben észlelt abnormalitások összefüggnek-e a limfociták ATP szintjével, megmértük a sejtek intracelluláris ATP tartalmát a luciferin- luciferáz enzimreakción alapuló luminescens módszert alkalmazva. Az SLE-s betegekbol származó sejtek ATP tartalmát alacsonyabbnak találtuk (15,82 ± 0,5 pmol/ ? g fehérje), mint az egészséges kontrollokét (19,01 ± 0,62 pmol/? g 31

fehérje, p = 0,002), az RA-s betegeké (18,76 ± 1,95 pmol/? g fehérje) nem különbözött a kontrollokétól [I. Fig. 7A.]. Az ADP értéke nem különbözött az egyes csoportokban, így az ATP/ADP arány szintén az SLE-s sejtekben volt alacsonyabb (5,67 ± 0,82), mint a kontrolloké (10,68 ± 2.1, p = 0,014). A lupusos sejtekben észlelt intracelluláris csökkent ATP koncentráció független volt a betegség aktivitásától, ill. a gyógyszeres keze léstol, ugyanakkor fordított arányosságban állt a mitokondriális transzmembrán potenciált tükrözo relatív fluoreszcencia értékekkel [I. Fig. 7B.]. Így az alacsonyabb ATP szint a magasabb mitokondriális potenciálú sejtekben fordult elo, ami valószínuleg inkább az ATP-áz (ATP-hidrolázként muködo) aktivitásának, semmint az alacsony szubsztrát (ADP) szint miatt bekövetkezo csökkent ATP szintézisnek tulajdonítható.

3.2. Oligomicin-indukálta változások kontroll limfocitákon: az Fo F1 -ATP-áz szerepének vizsgálata Az Fo F1 -ATP-áz komplex aktivitása oligomicinnel szelektíven gátolható. Ha elegendo glükóz áll rendelkezésre, az enzimkomplex blokkolása és a a mitokondriális ATP képzodés felfüggesztése után az anaerob glükolízis révén is a normál ATP koncentráció 80 százaléka feletti érték mérheto, így az Fo F1-ATP-áz gátlás hatása vizsgálható. Magas glükózkoncentrációjú médiumban egészséges donorokból szeparált limfocitákon 30 perces oligomicin elokezelés hatására intracelluláris ATP szint csökkenést és ? ?

m

emelkedést mértünk [I. Fig. 8A.], mintegy modellezve a lupusos

limfocitákban tapasztalt jelenségeket.

3.3. CD3/CD28-indukálta változások kontroll limfocitákon: a T sejt aktiváció szerepének vizsgálata Azokban a celluláris abnormalitásokban, melyeket (a szervezetben elo nem forduló) oligomicinnel modelleztünk, valamilyen olyan patofiziológiai stimulusnak kell szerepet játszania, mely ténylegesen okozhatja a lupusos sejtek defektusát. A CD3-T sejt receptoron (TCR) keresztüli kóros jelátviteli folyamatokat régóta központi eredetunek tartják az SLE patogenezisében (23). SLE-s limfociták Fas receptoron keresztül történo apoptózisához mitogén lektinekkel vagy stimuláló anti-CD3 antitesttel való elokezelése szükséges (94, 2). Egészséges limfociták Fas antitesttel vagy concanavalin A-val való kezelése mitokondriális hiperpolarizációt okoz, mely arra utal,

32

hogy a ? ?

m

emelkedése mind az apoptózis, mind a T sejt aktiváció folyamatának

(szükséges) velejárója (7). Eddigi adataink alapján a lupusos sejtek hiperpolarizációja és a H2 O2 -facilitált fokozott nekrózis inkább a T sejteket érintette, az észlelt intracelluláris alkalizálódás szintén a T sejt aktiváció korai fázisának jellemzoje. Mindezek alapján felmerül, hogy az észlelt változások az SLE-ben zajló kóros T sejt aktiváció eredményeképpen jönnek létre. A T sejt aktiváció szerepét vizsgálandó, az egészséges donorok limfocitáit az OKT3 monoklonális (CD3-stimuláló) antitestttel (1 ? g/ml/csésze) borított Petricsészékhez adtuk és 500 ng/ml CD28 monoklonális antitesttel kezeltük, majd vizsgáltuk a ??

m

és ROI termelés és intracelluláris pH változását. A kezelés hatására áramlásos

citometriával (DiOC6 , JC-1, DHR, HE és SNARF-1 festést alkalmazva) már 5 perc után mitokondriális hiperpolarizációt észleltünk, melynek maximumát 1 óra múlva tapasztaltuk [I. Fig. 8A.]. Ugyanakkor az intracelluláris ATP szintje is csökkent, és 4 óra után tért vissza a kiindulási szintre [I. Fig. 8A.], még késobb további ATP koncentráció emelkedést észleltünk. A ROI-k termelése folyamatos növekedést mutatott, a pH már 6 perc után emelkedett és folyamatos alkalizálódás után 72 óra után tért vissza a kiindulási érték alá egészséges sejteken [II. Fig. 1A és B.]. A CD3/CD28-cal vagy oligomicinnel elokezelt kontroll limfociták H2 O2 adásra további ? ?

m

emelkedést már nem mutattak [I. Fig. 8B.], és mindkét elokezelés (és

kisfokú ATP depléció) után a H2 O2 a sejtek fokozott (az elokezelés nélkülihez képest nagyobb arányú) nekrózisát eredményezte [I. Fig. 8C.]. A T sejt aktiváció és az Fo F1 ATP-áz komplex szelektív blokkolása tehát az átmeneti hiperpolarizáció és ATP szint csökkenés révén a lupusos sejtekhez hasonló viselkedést váltott ki az egészséges limfocitákban .

3.4. CD3/CD28-indukálta változások összehasonlítása SLE-s és kontroll limfocitákon: a T sejt aktiváció szerepének vizsgálata Az egészséges T sejtek CD3-TCR komplexen történo aktivációja korai szakában számos olyan jelenség írható le, mely az SLE-s limfocitákra jellemzo. Továbbiakban a lupusos sejtekben bekövetkezo változásokat vizsgáltuk CD3/CD28 aktiváció hatására. A kontrollokban

tapasztalt ? ? m-t és ROI termelés mértékét tükrözo relatív

fluoreszcencia értékekhez képest kisebb emelkedést észleltünk az SLE-s limfocitákban, az RA-s betegekbol származó sejtekben mért értékek az egészségesekéhez voltak 33

hasonlóak [II. Fig. 2A és B.]. Az intracelluláris alkalizáció (? pHi) foka szintén alacsonyabb volt SLE-ben (+0,069 ± 0,019), mint a kontrollokban (+0,155 ± 0,026, p = 0,019, [II. Fig. 2B.]), az RA-s betegekben mért változás a kontrollokéhoz volt hasonló (+0,133 ± 0,019).

4. Citokinek szerepe az SLE-s limfocitákban tapasztalt rendellenességekben

4.1. Különbözo citokinek hatása a mitokondriális potenciálra Az SLE-ben tapasztalható defektusos celluláris folyamatokban, különösen a kóros T sejt aktivációban régóta patogenetikus szerepet tulajdonítanak a megváltozott limfokin milionek (24, 42). A citokinek T sejt apoptózist befolyásoló hatása is ismert (65). A citokineknek - IL-2 (50-500 U/ml), IL-3 (10-100 ng/ml), IL-4 (10-100 ng/ml), IL-6 (5-50 ng/ml), IL-7 (5-50 ng/ml), IL-10 (10-100 ng/ml), IL-12 (5-50 ng/ml), IL-15 (50-500 ng/ml), TNF-? (20 ng/ml), TGF-? 1 (5-50 ng/ml) és IFN-? (500 U/ml) egészséges kontrollokból származó limfociták ? ? m-jára kifejtett hatását áramlásos citometriával az eddig alkalmazott festésekkel (DiOC6 , JC-1) végeztük. Ezek közül az IL-3 (10 ng/ml), IL-10 (10 ng/ml), TGF-? 1 (5 ng/ml) és IFN-? (500 U/ml) okozott különbözo mértéku, de szignifikáns ? ? m-emelkedést a 0-16 óráig tartó inkubálás során [II. Fig. 3.]. Irodalmi adatok alapján az utóbbi két citokin szintje inkább csökkent SLE-ben (90), az IL-3 és a lupus kapcsolatát alátámasztó meggyozo adat nem áll rendelkezésre. Az emelkedett IL-10 szint azonban lényegesnek tunik az SLE patogenezisében (74).

4.2. Az IL-10 központi jelentosége SLE-ben SLE-s betegekbol és egészségesekbol szeparált limfociták 5 napos inkubálás után termelt IL-10 mennyiségét ELISA módszerrel határoztuk meg, s az eddigi irodalmi adatoknak megfeleloen SLE-ben magasabb értéket mértünk (934,7 ? 85,8 pg/ml, mint a kontrollokban (566,1 ? 58,9 pg/ml, p = 0,014). Az SLE-s betegek IL-10 termelése korrelált a betegség (SLEDAI értékkel mért) aktivitásával [II. Fig. 4A.]. Az IL-10 10 ng/ml-es dózisban az elobb leírt mitokondriális hiperpolarizációt okozó hatásán kívül egészséges limfociták gyöktermelését és apoptosát nem befolyásolta. Ugyanakkor meglepo módon a lupusos sejtekben éppen ellenkezo hatást váltott ki: mitokondriális hiperpolarizációt nem okozott, viszont megnott a sejtek ROI termelését tükrözo relatív fluoreszcencia értéke (DHR: +28,8 ? 5,5 %, p = 0,0005, HE: 34

38,4 ? 6,4 %, p = 0,0002). Az IL-10 a gyöktermelés mellett az SLE-s sejtek apoptózisát (és nekrózisát is) növelte [II. Fig. 4B.], mely megfelel a korábbi irodalmi adatoknak (35). Mind az egészséges (? pHi : 0,156 ? 0,026, p = 0,0011), mind a lupusos sejtek (? pHi : 0,069 ? 0,018, p = 0,02) alkalikusabbá váltak IL-10 kezelés hatására [II. Fig. 5.].

4.3. Az SLE-ben észlelt kóros sejtparaméterek és funkciók részleges normalizálása IL-10 blokkolással Az

IL-10

észlelt

hatásai

(egészséges

limfocitákban

mitokondriális

hiperpolarizáció, SLE-s sejtekben fokozott ROI termelés és apoptózis), ill. a lupusos limfociták megnövekedett IL-10 termelése alapján vetodött fel annak gondolata, hogy e citokin blokkolásával a celluláris abnormalitások részben vagy teljesen normalizálhatók. Lupusos limfociták 16 órás neutralizáló IL-10-ellenes antitesttel (25 ? g/ml) történo kezelése a gyöktermelés szignifikáns csökkenését eredményezte (DHR: -19,9 ? 6,9 %, p = 0,017, HE: -19,0 ? 4,0 %, p = 0,0011). Az IL-10 antagonista IL-12 10 ng/ml koncentrációban hasonló hatást gyakorolt (DHR: -15,4 ? 6,8 %, p = 0,02, HE: -24,2 ? 5,4 %, p = 0,005) az SLE-s sejtekre [II. Fig. 5.]. Egyik kezelés sem változtatott az egészséges donorok, ill. RA-s betegek sejtjeinek gyöktermelésén [II. Fig. 5.]. Anti-IL-10 hatására a lupusos sejtek pH-ja csökkent (p = 0,03), IL-12 kezelés hasonló tendenciát mutatott, jóllehet a csökkenés ebben az esetben statisztikailag nem volt szignifikáns (p = 0,056). Egészséges és RA-s, ill. SLE-s alap ? ?

m

értékére egyik

IL-10 blokkoló kezelés sem volt szignifikáns hatással. Szintén vizsgáltuk az IL-10 blokkolásnak a T sejt aktivációra kifejtett hatását. 16 órás anti-IL-10 vagy IL-12 elokezelés hatására a CD3/CD28 stimuláció-okozta intracelluláris alkalizáció és gyöktermelés nem különbözött szignifikánsan a lupusos és kontroll sejtekben [II. Fig. 6.], tehát az IL-10 blokád normalizáló hatású volt. Ezzel szemben az anti-IL-10 vagy IL-12 elokezelés nem volt képes korrigálni sem az SLE-s sejtek fokozott hiperpolarizációját, sem a T sejt aktiváció hatására létrejövo ? ?

m

változást. Az SLE-ben tapasztalható csökkent TGF-? 1-szint ellenére TGF-? 1 adásával nem sikerült korrigálni az abnormális alap- és a CD3/CD28-indukált ROI, pH és ? ? értékeket.

35

m

5. Az értekezés saját eredményeinek összefoglalása

1. Igazoltuk, hogy az SLE-s limfocitában in vitro alaphelyzetben (stimulálatlanul) magasabb mitokondriális transzmembrán potenciál, fokozott reaktív oxigén intermedier termelés és intracelluláris alkalizáció, ugyanakkor csökkent GSH szint mérheto. 2. Megállapítottuk továbbá, hogy oxidatív stresszre vagy T sejt aktivációra az SLEs limfociták mitokondriális hiperpolarizációja, gyöktermelése és pH emelkedése csökkent. 3. A fokozott alaphelyzeti értékek és a stimulációra bekövetkezo a kontrollhoz képest kisebb mértéku változások magyarázhatják a lupusban tapasztalt fokozott spontán apoptózist és T sejt aktivációt, ugyanakkor a sejtek csökkent további válaszkészségét. 4. Igazoltuk, hogy az intracelluláris ATP szintje SLE-ben csökkent, ami ugyancsak az apoptotikus ingerekre való válaszkészség hiányát magyarázza. Ugyanakkor emiatt a sejtek nekrózisa no, ami a betegségben tapasztaltható gyulladásban játszhat szerepet. 5. A jelenségek hátterében felvetettük a mitokondriális potenciált és ATP szintet is befolyásoló FoF1-ATP-áz komplex szerepét, az ezt gátló oligomicinnel egészséges limfocitákban a lupusos abnormalitásokat modelleztük. Fiziológiás stimulusként a T sejt aktiváció is hasonló változásokat okozott. 6. Kimutattuk, hogy az IL-10 részben okozója az észlelt mitokondriális és celluláris abnormalitásoknak SLE-ben, és ennek blokádjával a defektusok részben normalizálhatók.

36

MEGBESZÉLÉS

Jelen doktori munka során több olyan biokémiai/sejtfiziológiai defektust sikerült kimutatnom, melyeknek az SLE-s limfociták kóros apoptózissal és T sejt aktivációval jellemzett celluláris abnormalitásaiban lehet jelentosége (4. táblázat). Megállapítottam, hogy a lupusos sejtek mitokondriális transzmembrán potenciálja és gyöktermelése magasabb, mint az egészségeseké vagy rheumatoid arthritises betegeké, ugyanakkor a gyökök ellen védo hatású GSH szintjét alacsonyabbnak mértem, mely az állandó oxidatív stressz és reaktív oxigéngyökök termelodése miatt szükségszeru fokozott felhasználásra utal.

4. táblázat. Az értekezésben vizsgált paraméterek eltérései SLE-ben

SLE

KONTROLL

Kezelés Stimuláció Oxidatív Sejtnélkül stressz típus Paraméter norm. ?? m korai ? , majd ? ROI norm. ? pH norm. N ATP norm. N Sejthalál ?? m

norm. ?

apoptózis ?

ROI

?

pH

?

kisebb mérvu ? N

ATP Sejthalál

N ? spontán nekrózis apoptózis? aránya ?

T sejt aktiváció

IL-10

IL-10 blokád

?

?

?

? ? korai ? , majd ? N kisebb mérvu ? kisebb mérvu ? kisebb mérvu ? N N

? ? N

? ? N

? ?

? ?

?

?

N

?

N N apoptózis ? apoptózis ?

N: nem vizsgált, ? : emelkedés, ? : csökkenés, ? : nincs változás A klasszikus elképzelés szerint a sejtek ? ?

m

értéke állandó, és csökkenése, majd

megszunése az apoptózis irreverzibilis fázisát jelzi. Ezzel szemben újabban adatok vannak arra vonatkozóan, hogy a mitokondriális transzmembrán potenciál Fas-(7), és hidrogén peroxid- indukálta (105) apoptózisban emelkedni képes, jóllehet a pontos mechanizmus nem tisztázott. A legújabb vizsgálatok megerosítették a mitokondriális

37

hiperpolarizációra vonatkozó észrevételeket, és további apoptotikus ingerek esetén is beszámoltak hasonló jelenségrol (105, 69, 37, 109, 104, 106, 133, 97, 112, 36, 103, 57). Mindez a kaszpázok aktivációja elott, az apoptózis korai (valószínuleg reverzibilis) fázisában történik. A progresszív mitokondriális gyöktermelés szintén korán elkezdodik, és fontos velejárója a programozott sejthalálnak. A megnövekedett reaktív oxigéngyökök mennyisége miatt megno a H2 O2 , nitrogénoxid, TNF? és Fas által indukált apoptózis (6). Mindezek alapján a fokozott gyöktermelés és a mitokondriális transzmembrán potenciál eleve magas volta dönto szereppel bírhat az SLE-ben észlelt spontán apoptózisban. A szteroid hormonok, hidroxiklorokvin, és citosztatikus szerek timocitákra gyakorolt proapoptotikus és az érett limfociták sejthalálát gyorsító hatására vonatkozóan több adat is rendelkezésre áll (15, 88). A vizsgálatokban bevont betegek legtöbbje az elobbi szerek valamelyikét vagy kombinációját kapta, így felmerülhet az a kérdés, vajon az észlelt defektusok mennyiben tulajdoníthatók magának a betegségnek vagy azok esetleg a gyógyszeres kezelés következményei. A közel hasonló terápiában részesülo rheumatoid arthritises betegeknél nem észleltünk ilyen abnormalitásokat. Ezen túlmenoen a fokozott spontán apoptózis, mitokondriális hiperpolarizáció, intracelluláris alkalizáció, fokozott ROI és IL-10 termelés, és a sejtek csökent ATP és GSH szintje statisztikailag nem különbözött az egyes gyógyszeres csoportokban. A komplementrendszer defektusa régóta ismert SLE-ben. Az immunkomplexek és apoptotikus sejtek elégtelen eliminációja szintén hozzájárulhat a kóros autoimmun reakcióhoz (135). Mindazonáltal az észlelt hiperpolarizáció az annexin V- negatív, nemapoptotikus sejteket érintette és így valószínutlen, hogy komplementdefektus és az apoptotikus testek elégtelen eltakarítása állna a háttérben. Ennek megfeleloen a komplementrendszer muködésére utaló paraméterek nem mutattak összefüggést a hiperpolarizációval. A fokozott spontán apoptózis más betegségekre is jellemzo lehet. Georgescu és mtsai vasculitisben (3 beteg), Wegener-féle granulomatosisban (2 beteg), Takayasu arteritisben (1 beteg) is gyorsult programozott sejthalált talált (35). Szisztémás vasculitises szövodmények SLE-ben is elofordulnak. Az általunk vizsgált 25-bol hat betegnek volt igazolt vasculitise, de sem a ? ? különbözött a többi

m

értékük, sem ATP szintjük nem

SLE-s betegétol, ahogyan más szervi manifesztáció (vese-,

neurológiai szövodmények, stb.) esetén sem találtunk korrelációt. Mindezek alapján 38

tehát valószínu, hogy a talált abnormalitások nem a gyógyszeres kezeléssel, vagy az általános gyulladással függnek össze, hanem elsodlegesen az SLE következményei és a betegség patogenezisének jellemzoit tükrözik. Az SLE kialakulásában fontos szerepet tulajdonítanak az apoptózis, ill. T sejt aktiváció defektusának: mindkét folyamat a gyökök által mediált. Kísérleteinkben exogén H2 O2 adásával modelleztük az oxidatív stresszt, és idéztünk elo gyökképzodést, ill. okoztunk apoptózist. A szervezetben endogén H2 O2 is elofordulhat, gyökökbol, O2 vagy OH--ból a mitokondriumokban jön létre a szuperoxid dizmutáz katalízisével (40). A keletkezett H2 O2 eliminálását ezután a kataláz és a glutation peroxidáz enzimek végzik (85). A külsoleg adott H2 O2 bejutása a sejtbe egyszeru diffuzióval történik. A molekula, szerkezetébol adódóan könnyen átjut a sejtmembránon, viszont önmagában nem gyök (40). Apoptózist okozó hatásához az szükséges, hogy a Fenton reakció révén mitokondriális transzformációval gyökök (OH--) keletkezzenek (40, 113). Kísérleteinkben H2 O2 adására vizsonylag gyors (20 perc után észlelt) mitokondriális hiperpolarizáció és gyöktermelés, majd késobb (16 óra elmúltával tapasztalható) apoptózis következett be egészséges és rheumatoid arthritises betegekbol szeparált limfocitákon. Ezzel szemben SLE-ben a hiperpolarizáció elmaradt és a gyöktermelés kisebb fokú volt, s az utána következo sejthalál formája apoptózis helyett inkább a nekrózis javára tolódott el. Mind a CD3/CD28- indukálta H2 O2 termeléshez, mind a H2 O2 -okozta apoptózishoz mitokondriális gyökképzodés szükséges. A mérések szerint csökkent CD3/CD28-indukálta H2 O2 termelés és H2 O2-indukált apoptózis a mitokondriális muködés biokémiai károsodására enged következtetni SLE-ben. A már alaphelyzetben magas mitokondriális transzmembrán potenciál és fokozott ROI termelés mellett a GSH szintje csökkent volt a lupusos sejtekben. Ez a redukáló ágensek fokozott felhasználására utal, összhangban lupusos sejtekben zajló konstans oxidatív stresszel és létrejöhet a a GSH szintézisének vagy az oxidált forma (GSSG) regenerációjának

zavara miatt. Jelenleg nem ismert, melyik mechanizmus

dominál SLE-ben. A GSH az IL-2-függo T sejtproliferációhoz (41) és a CD2 és CD3 által mediált sejtaktivációhoz (118) is szükséges. Az alacsony GSH szint tehát részben magyarázhatja a lupusban régóta ismert defektusos T sejt aktivációt, és a doktori munka során tapasztalt csökkent CD3/CD28- indukálta gyöktermelést. Ugyanakkor többen is leírták a sejtek fokozott érzékenységét ROI-indukálta sejthalálra GSH hiányban (6, 105, 107). A csökkent H2 O2 -indukált apoptózis és az alacsony GSH szint együtt az SLE-ben zajló redox mechanizmusok súlyos zavarára utal. 39

Az SLE-ben észlelt mitokondriális hiperpolarizáció többféleképpen is létrejöhet. Elegendo ADP hiányában az elektrokémiai grádiens felhasználása (ATP- vé alakítása) csökken, miáltal az ATP szint csökken és ? ?

m

pedig no. A méréseink szerint azonban

az ADP mennyisége nem volt alacsonyabb (inkább magasabbnak adódott, bár nem szignifikánsan), mint a kontrolloké, tehát a hiperpolarizáció és alacsonyabb ATP szint nem az elégtelen mennyiségu ADP miatt alakult ki. Másik lehetoség az F0 F1-ATP-áz komplex gátlásával létrehozható ATP szintézis csökkenés, mely ADP akkumulációval, mitokondriális

hiperpolarizációval

és

természetszeruleg

alacsonyabb

ATP

koncentrációval jellemezheto. Kísérletes körülmények között a komplexet szelektíven gátló oligomicinnel ? ?

m

emelkedést és fokozott ROI termelést mértünk, ill. az oligomicinnel elokezelt egészéges donorok

limfocitáiban

CD3/CD28

stimulációra

és

H2 O2 -kezelésre

csökkent

mitokondriális hiperpolarizációt és fokozott H2 O2-indukált nekrózist észleltünk. Mivel az

oligomicinnel

modellezett

eltérések

megfelelnek

a

lupusos

sejtekben

megfigyelteknek, az SLE-ben észlelt hiperpolarizációt és ATP depléciót inkább az F0 F1 ATP-áz komplex gátlásával magyarázzuk. Ennek megfeleloen SLE-ben a nekrózis és apoptózis mértéke fordított arányosságban állt (p = 0,0038), tehát azokban a sejtekben, melyekben kevés volt az apoptózis, megnott a nekrózis aránya és fordítva. Az intracelluláris ATP és nekrózis aránya között hasonló korreláció volt (p = 0,0026), azaz a nekrózis aránya azokban a lupusos sejtekben volt igazán magas, melyek ATP koncentrációja alacsony volt. Ezek összhangban állnak azzal a csak néhány éve bizonyított felismeréssel, hogy az apoptózis aktív, energiaigényes folyamat, melyhez ATP szükséges, ennek hiányában a sejtek inkább passzívan, nekrózisban halnak meg (64). A mitokondriális transzmembrán potenciál emelkedése és a H+ ionok távozása a mitokondriális mátrixból az elektron transzport lánc citokrómjainak redukciójával jár, amely elosegíti a reaktív oxigéngyökök képzodését (115). Így a mitokondriális hiperpolarizáció

oki

tényezo

lehet

a

lupusos

limfociták

gyöktermelésében és fokozott spontán apoptózisában. A ? ?

m

megnövekedett

emelkedése a T sejt

aktiváció során szintén tapasztalható, mintegy korai és reverzibilis szakaszát jelentve az aktiváció-indukálta sejthalálnak. CD3/CD28 ko-stimuláció hatására magunk is átmeneti hiperpolarizációt észleltünk, mely ebben a korai fázisban ATP deplécióval és fokozott H2 O2-indukálta nekrózissal járt együtt. A lupusos sejtekben in vivo végbemeno repetitív

40

T sejt aktiváció így felelos lehet a tapasztalt mitokondriális hiperpolarizációért és intracelluláris ATP tartalom csökkenésért. A szigorúan szabályozott, átlagosan -200 mV-os potenciálkülönbség 28-32 %-os növekedése hatalmas változást okoz az energiaellátást biztosító mitokondriális folyamatokban, elsosorban az ATP szintézisben (113). Az ATP mind a T sejt aktivációban, mind az apoptózisban alapveto fontosságú (32) - éppen azokban a folyamatokban játszik tehát szerepet, melyek defektusának különös jelentoset tulajdonítanak az SLE patogenezisében. A sejthalál formáját elsodlegesen meghatározó tényezo az intracelluláris ATP koncentráció (64), ennek csökkenése megmagyarázhatja a lupusos limfociták oxidatív stressz hatására in vitro észlelt fokozott nekrózishajlamát. Az apoptózis fiziológiás folyamat, mely sejtmag kondenzációval és a sejtalkotók membránnal határolt egységekre történo felbomlásával jár. A keletkezett apoptotikus maradványokat a fagocitáló sejtek, elsosorban a makrofágok képesek eltakarítani, és így megakadályozzák a gyulladás kialakulását. Ezzel szemben a nekrózis patológiás történé s, mely sejtduzzadás és következményes lízis képében mutatkozik meg, melyet különféle proteázok, oxidáló hatású molekulák, ill. egyéb gyulladáskelto és kemotaktikus faktorok felszabadulása követ. A végeredmény a szövetek károsodása és fokozott autoantigén terhelés - olyan folyamatok, melyek az SLE-s celluláris abnormalitások sajátjai. Néhány közleményben már korábban is említették a lupusos limfociták in vitro nekrózisát és a patogenezisben játszott szerepét felvetették (46), de a nekrózist a makrofágok elégtelen muködése miatt létrejött, az apoptózist követo másodlagos folyamattal magyarázták (47). Kísérleteinkben a perifériás vér limfociták makrofág mentesek voltak mind az SLE-s, mind a kontroll csoportokban, így az észlelt nekrózis inkább a lupusos limfocitákban primeren végbemeno, kóros celluláris folyamatokra utal. Ezen túlmenoen a sejthalál idobeli követése során néhány órával a H2 O2 hozzáadása után a lupusos betegek limfocitáin nekrózis jeleit észleltük, apoptózis viszonylagos hiánya mellett. Az SLE-ben tapasztalható nekrózis in vivo jelentoségérol is vannak adataink: a lupusos csontvelo (75) és nyirokcsomó (58) limfocitáinak nekrózisa korábban is ismert volt, s bár ez az SLE-ben tapasztalható gyulladás része (27), mégsem tulajdonítottak neki különösebb jelentoséget. Adataink szerint a lupusos limfociták nekrózisa a sejtek valamilyen alapveto biokémiai defektusának a következménye és ez szignifikánsan hozzájárulhat a gyulladáshoz. Mindemellett

41

természetesen az eleve fokozott apoptózis, a másodlagos nekrózis, a makrofágok defektusa is szerepet játszhat az SLE-s celluláris defektusokban. A klasszikus, leginkább morfológiai alapokon nyugvó, az apoptózist és nekrózist egymással ellentétes folyamatként szembeállító

elképzeléssel szemben az utóbbi

néhány évben a sejthalálról alkotott elképzeléseink is megváltoztak. Jelen értekezés benyújtásának idején 2003 májusában a Nature Immunology hasábjain Jäättelä és Tschopp összefoglalója a sejthalált klasszikus apoptózisra, apoptózis-szeru és nekrózisszeru csoportokra osztja, leírva az egyes formák morfológiai különbözosége mellett többféle molekuláris mechanizmust és a különféle mediátorokat (50). Az SLE-ben mások és általunk tapasztalt sejthalálbeli eltérések alapján ezen mechanizmusok és mediátorok ígéretes kutatási célpontokként körvonalazódnak. A reaktív oxigéngyökök szintje, mitokondriális transzmembrán potenciál, intracelluláris ATP koncentráció és a sejtek glutation tartalma mellett az intracelluláris pH is fontos tényezo a sejtek homeosztázisában, és változása kulcsfontosságúnak tunik mind az apoptózis, mind a T sejt aktiváció folyamán. Ahogyan a ? ?

m

emelkedése is

újonnan megismert jelenség, az apoptózis során bekövetkezo korai pH növekedést is nemrégen írták le. A régebbi elképzelés szerint az apoptózis a kaszpázok aktivációjához szükséges acidifikálódással jár, ugyanakkor növekedési faktor megvonására korai intracelluláris alkalizációt tapasztaltak (56). A T sejt aktiváció során bekövetkezo citoplazmatikus pH emelkedés régebb óta ismert, ezt saját kísérleteinkben CD3/CD28 hatására is tapasztaltuk. Mindezek alapján nem meglepo, hogy az eddig vizsgált celluláris paraméterek SLE-beli különbözosége után a sejtek intracelluláris pH-ja is eltéro volt, pontosabban a lupusos limfociták alkalikusabbak voltak, mint a rheumatoid arthritises vagy egészséges kontrollok. Az SLE-s sejtek hasonlóan a H2 O2-indukálta csökkent ? ?

m

és ROI szint

változásokhoz, CD3/CD28-aktiváció után is kisebb mérvu intracelluláris alkalizációt mutattak. Mivel a kaszpázok által mediált apoptózis elengedhetelen velejárója a ? ?

m

megszunése és az intracelluláris acidifikáció, a mitokondriális hiperpolarizációt mutató és alkalikus lupusos limfociták inkább egyfajta megváltozott (és repetitív) T sejt aktivációra jellemzo állapotot tükröznek, semmint a fokozott apoptózist. Az SLE-s celluláris defektusokban központi jelentoségu a különféle citokinek megváltozott expressziója és felbomlott egyensúlya. Az általunk észlelt fokozott ROI termelés megmagyarázhatja a redox-szenzitív limfokinek expresszióját. Adataink szerint a CD3/CD28 ko-stimulációhoz hasonlóan egyes citokinek, így az IL-3, TGF-? 1 , 42

IFN-? és IL-10, is képesek átmeneti hiperpolarizációt létrehozni egészséges limfocitákon. Ezen utóbbi citokin termelését a betegség aktivitásával összefüggésben fokozottabbnak találtuk lupusos limfocitákban, emellett exogén IL–10 hatására megnövekedett gyöktermelést és apoptózist észleltünk, míg a normál sejtekben ilyen hatása nem volt. A gyökök hatására az IL-10 mRNS expresszió és IL-10 szekréció no (63, 134), és így létrejöhet az önnfenntartó kör: az aktivált lupusos sejtek gyöktermelése no, mely hatására IL-10 termelodik, ami ismét gyöktermeléshez és apoptózishoz vezet. Ezek alapján az IL-10 blokkolása kulcsfontosságú kérdés. Kísérleteinkben ennek megfeleloen a neutralizáló hatású anti-IL-10 antitesttel vagy az antagonista IL-12-vel egyaránt sikerült a gyöktermelést és az emelkedett pH-t normalizálni az SLE-s sejtekben. Ugyanakkor ezek a kezelések a hiperpolarizációt nem befolyásolták, ahogyan a lupusos limfocitákban az IL-10 a már eleve magas ? ? m-t tovább nem emelte. Ezen túlmenoen az IL-10 szint és ? ?

m

értéke között korrelációt nem találtunk. Mindezek

alapján tehát az IL-10 termelés felelos a gyöktermelésért és alkalizációért, de a mitokondriális hiperpolarizáció valószínuleg ettol függetlenül (és korábban) jön létre. Az IL-10-nek a ? ? m-ra, gyökökre, és sejthalálra gyakorolt hatása tehát az illeto sejttol függ. A lupusos limfociták IL-10 iránt mutatott megváltozott válaszkészsége valószínuleg a végbemeno molekuláris defektusokban rejlik és további vizsgálatokat igényel. Az IL-10 blokkolása a CD3/CD28- indukálta gyöktermelést és citoplazmatikus alkalizációt is normalizálta SLE-ben, így a fokozott IL-10 termelés a kóros T sejtaktivációs mechanizmusokban is lényeges lehet, ahogyan azt korábban is felvetették (35, 62). A TGF-? 1 csökkent szintjének szintén szerepet tulajdonítanak SLE-ben (99), és adataink szerint egészséges limfocitákban a TGF-? 1 befolyásolta a ? ? m-t. Ugyanakkor SLE-ben az alap- és T sejt aktiváció hatására bekövetkezo gyök, ? ?

m

és

pH értékeket ez a citokin nem befolyásolta, s a kóros T sejt aktivációban szerepe így kevéssé valószínu. Feltehetoleg a csökkent TGF-? 1 produkció inkább a lupusos B sejtek fokozott immunglobulin termeléséért lehet felelos ((99). Az SLE-s limfocitákban észlelt állandó mitokondriális hiperpolarizáció okaként felmerül a repetitív T sejt aktiváció, jóllehet a többször alkalmazott, hosszabb távú (1-6 napos) CD3/CD28 kezelés, Fas vagy IL-10 stimuláció után a sejtek ? ?

m

értékét inkább

csökkentnek mértük az aktiváció- indukálta sejthalál következtében, amely megfelel az irodalmi adatoknak (128).

43

A hiperpolarizáció kialakulhat egy intramitokondriális blokk nyomán is, mely számos aktivációs jelátviteli folyamat zavara következtében létrejöhet (5. táblázat). 5. táblázat. Lehetséges jelátviteli mechanizmusok az SLE-s emelkedett ? ?

m

kiváltásában Defektus

Irodalom

?

Protein kináz A (PKA) defektus miatt a Bcl-2 családhoz tartozó Bad fehérje intramitokondriális transzlokációja

?

Mitochondriális membrán ion-transzporterek (OH-/Pi, K+/H+, Na+/H+, H+/Pi, H+/piruvát, elektrogén K+ uniporter) zavara Csökkent ADP import és felborult elektrokémiai potenciálgrádiens a VDAC (külso membrán) vagy az adenin nukleotid transzlokátor (belso membrán) zavara miatt

?

Mishra et al, 2002 (91), Lizcano et al, 2002 (72), Zhou et al, 2002 (139) Skulachev, 1999 (113)

Harris, Thomson, 2000 (43), Ferri et al, 2000 (31)

A mitokondriális hiperpolarizáció miatt a lupusos sejtek prediszponáltak a fokozott gyöktermelésre (115) és a következményes oxidatív stressz hatására egyes transzkripciós faktorok, így az AP-1 és NF-?B aktivációja megváltozik (68). Ennek következtében bizonyos citokinek, foként az IL-2, és IL-10, és TNF? expressziója is módosul, mely a felborult citokinegyensúlyt eredményezi. A megnövekedett IL-10 termelés (és emellett fokozott Fas ligand felszabadulás és Fas expresszió) oki tényezo lehet az SLE-s limfociták gyorsult spontán apoptózisában (35). A doktori munka során a lupusos limfocitákban észlelt celluláris abnormalitások elméleti alapot szolgáltathatnak már folyamatban lévo terápiás próbálkozásokhoz, pl. szabadgyökfogó vegyületek alkalmazásához (119, 20) vagy IL-10 gátláshoz (62), másfelol az eredmények alapján új terápiás célpontok is körvonalazódhatnak, pl. az intracelluláris ATP koncentráció vagy ? ?

m

normalizálása révén.

Adataink szerint az SLE-ben észlelheto mitokondriális hiperpolarizáció, fokozott gyöktermelés, ATP depléció és oxidatív stressz- indukálta nekrózis, valamint a megnövekedett IL-10 termelés és eltéro IL-10 érzékenység fontos szerepet játszanak a kóros apoptózissal és T sejt aktivációval jellemzett celluláris folyamatokban. A sejtes defektusok részleteinek megismerése révén nemcsak a betegség patogenezise válik világosabbá, de a terápiás beavatkozások lehetosége is bovülhet.

44

KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS

Hálás köszönettel tartozom dr. Perl András professzornak, a SUNY Upstate Medical Univesity, Syracuse, USA Reumatológiai Osztálya vezetojének, aki lehetove tette számomra, hogy az általa irányított laboratóriumban két évig mint a National Institute of Health Fogarty Ösztöndíjasa, majd további egy évig mint kutató reumatológus dolgozhattam. Hálás vagyok neki a türelmes tanításért, az önálló munka lehetoségéért és segítségéért. Onála és otole sajátíthattam el mindazt a tudást és módszereket, melyek segítségével az eredmények, közlemények és jelen értekezés is megszülethettek. Köszönet illeti a laboratórium és a reumatológiai osztály többi munkatársát, akikkel csapatmunkában dolgozva jöttek létre az eredmények: dr. Paul E. Phillips akkori osztályvezeto professzort, dr. Bánki Katalin professzort, dr. Puskás Ferencet, dr. Rudolf Pullmann Jr.-t, dr. Hom Neupanet, dr. Fatme Allamot, Wendy Amidont és Craig Grossmant. Külön köszönöm Brian Nilandnak, hogy foként kutatómunkám elején mindenben segítségemre volt és dr. Nick Gonchoroffnak, hogy nemcsak megismertette, de meg is szerettette velem az áramlásos citometriát. Köszönöm dr. Poór Gyula professzornak, témavezetomnek, hogy az Országos Reumatológiai és Fizioterápiás Intézet-beli klinikusi tevékenységem alatt is lehetoséget bizosított számomra, sarkallt a kutatómunka folytatására és az Amerikában elért eredmények alapján saját PhD témájában jelen értekezést elkészíthettem. Hálával tartozom dr. Bálint Géza foorvosnak, aki reumatológiai pályámon elindított és dr. Csermely Péter professzornak, akinél diákkörösként a laboratóriumi kutatást elkezdhettem. Köszönet illeti dr. Tulassay Zsolt professzort és dr. Szendroi Miklós professzort a lehetoségért, hogy a Semmelweis Egyetem Doktori Iskolájában a „A támasztó és mozgató

szervrendszer

muködésének

fiziológiája”

címu

programban

egyéni

felkészüloként számomra lehetoséget biztosítottak az értekezés elkészítésére és megvédésére. Végül szeretném megköszönni családomnak, feleségemnek és szüleimnek, hogy az ido- és energiaigényes kutatómunka során türelemmel és gondoskodással támogattak.

45

AZ ÉRTEKEZÉS TÉMÁJÁBAN MEGJELENT SAJÁT KÖZLEMÉNYEK ÉS FONTOSABB NEMZETKÖZI ELOADÁSOK

1. Közlemények I.

Gergely P Jr, Grossman C, Neupane H, Allam F, Niland B, Puskas F, Banki K, Phillips PE, Perl A. Mitochondrial hyperpolarization and ATP depletion in patients with systemic lupus erythematosus. Arthritis Rheum, 2002;46:175-190. (IF: 7,389) II. Gergely P Jr, Niland B, Gonchoroff N, Pullmann R, Phillips PE, Perl A. Persistent mitochondrial hyperpolarization, increased reactive oxygen production and cytoplasmic alkalinization characterize altered IL-10 signaling in patients with systemic lupus erythematosus. J Immunol 2002;169:1092-1101. (IF: 7,065) III. Perl A, Gergely P Jr, Puskas F, Banki K. Metabolic switches of T-cell activation and apoptosis. Antioxid Redox Signal 2002;4:427-43. 2. Idézheto eloadások 1.

2.

3.

4.

Gergely P Jr, Grossman C, Neupane H, Allam F, Niland B, Puskas F, Banki K, Phillips PE, Perl A. Hydrogen peroxide- induced changes in mitochondrial transmembrane potential, reactive oxygen intermediate levels and apoptosis in systemic lupus erythematosus. American College of Rheumatology 63rd Annual Scientific Meeting, Nov. 13-17. 1999, Boston, MA, USA (Arthritis Rheum 42, Suppl. 9., 1999). Gergely P Jr, Niland B, Grossman C, Neupane H, Allam F, Puskas F, Banki K, Phillips PE, Perl A. CD3/CD28- induced production of reactive oxygen intermediates and changes in mitochondrial transmembrane potential are aberrant in patients with systemic lupus. The American Association of Immunologists and Clinical Immunology Society Joint Meeting, May 12-17, 2000, Seattle, WA, USA (FASEB Journal, Suppl., 2000). Gergely P Jr, Niland B, Grossman C, Neupane H, Allam F, Puskas F, Banki K, Phillips PE, Perl A. CD3/CD28- induced production of reactive oxygen intermediates and changes in mitochondrial transmembrane potential are aberrant in patients with systemic lupus. American College of Rheumatology 64th Annual Scientific Meeting, Oct. 28-Nov. 2. 2000, Philadelphia, PA, USA (Arthritis Rheum 43, Suppl., 2000). Gergely Jr P, Grossman C, Niland B, Jampala V, Puskas F, Banki K, Phillips PE, Perl A. Mitochondrial hyperpolarization and ATP depletion in patients with systemic lupus erythematosus. American College of Rheumatology 65th Annual Scientific Meeting, Nov. 10-15 2001, San Francisco, CA, USA (Arthritis Rheum 44, Suppl., 2001).

46

RÖVIDÍTÉSJEGYZÉK ??

Mitokondriális transzmembrán potenciál ACR Amerikai Reumatológiai Kollégium ANT Adenin nukleotid transzlokátor APC Antigén prezentáló sejt ASK1 Apoptózis szignál reguláló kináz 1 CAD Kaszpáz-3 által aktivált DN-áz CMXRos klorometil- X-rosamin Con A Concanavalin A Cy5 Indodikarbocianin 5 DCF-DA 5,6-karboxy-2’,7’diklorofluoreszcein-diacetát DHR Dihidrorodamin 123 DiBAC 4 (3) Bisz-1,3-dibutilbarbiturát trimetin oxonol DiOC6: 3,3’-dihexiloxakarbocianin jodid DMSO Dimetil szulfoxid Dnmt1 DNS I. metiltranszferáz EIF2? Eukarióta iniciációs faktor 2 alfa ERK Extracelluláris szignál-regulált kináz FADD Fas-asszociált fehérje FasL Fas ligand FITC Fluoreszcein izotiocianát GSH Glutation GSSG Oxidált glutation HE Hidroetidin HEPES 4-(2-hidroxietil)-1-piperazin etánszulfonsav HPLC Magas nyomású folyékony kromatográfia I? B NF-?B inhibitor IFN Interferon IKK I? B-kináz JC-1 5,5’,6,6’-tetrakloro-1,1’,3,3’tetraetilbenzimidazolokarbocianin jodid LDL Alacsony denzitású lipoprotein m

47

LFA MAPK MEK NF-?B OKT3 PARP PBS PE PGF PI PI3K PKA PKC PKR kináz PS PTCP PTK ROI RPMI medium SLEDAI SNARF-1 SOD TCR TGF-? TMRM TNF TRAF TRX tTG VDAC Z-VADfmk

Leukocita funkció-asszociált antigén Mitogén aktivált protein kináz Mitogén aktivált protein kináz kináz Nukleáris faktor kappa B egér anti-CD3 monoklonális antitest Poli ADP-ribóz polimeráz Foszfát pufferolt sóoldat Fikoeritrin Prosztaglandin F Propidium jodid Foszfatidil- inozitol-3 kináz Protein kináz A Protein kináz C Interferon- indukálta duplaszálú RNS-aktivált protein kináz Foszfatidil-szerin Permeabilitást szabályozó (tranziciós) pórus komplex Protein tirozin kináz Reaktív oxigén intermedier Roswell Park Memorial Institute tápfolyadék SLE Betegségaktivitási Index Karboxi-seminaftorodafluor-1acetoximetilészter-acetát Szuperoxid-dizmutáz T sejt receptor Transzformáló növekedési faktor béta Tetrametilrodamin- metilészter Tumor nekrózis faktor TNF-receptor-asszociált faktor Tioredoxin Szöveti transzglutamináz Feszültségfüggo anion csatorna Benziloxikarbonil-Val-Ala-Aspfluorometilketon

IRODALOMJEGYZÉK

1.

Adler V, Yin Z, Tew KD, Ronai Z. Role of redox potential and reactive oxygen species in stress signaling. Oncogene. 1999; 18:6104-11.

2.

Alderson MK, Armitage RJ, Maraskovsky E, Tough TW, Roux E, Schooley K, et al. Fas transduces activation signals in normal human T lymphocytes. J Exp Med 1993; 178:2231–5.

3.

Al-Janadi M, al-Balla S, al-Dalaan A, Raziuddin S. Cytokine profile in systemic lupus erythematosus, rheumatoid arthritis, and other rheumatic diseases. J Clin Immunol 1993; 13:58–67.

4.

Ames PR, Alves J, Murat I, Isenberg DA, Nourooz-Zadeh J. Oxidative stress in systemic lupus erythematosus and allied conditions with vascular involvement. Rheumatology (Oxford). 1999; 38:529-34.

5.

Arnett FC, Edworthy SM, Bloch DA, McShane DJ, Fries JF, Cooper NS, et al. The American Rheumatism Association 1987 revised criteria for the classification of rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum 1988; 31:315–24.

6.

Banki K, Hutter E, Colombo E, Gonchoroff NJ, Perl A. Glutathione levels and sensitivity to apoptosis are regulated by changes in transaldolase expression. J Biol Chem 1996; 271:32994–3001.

7.

Banki K, Hutter E, Gonchoroff N, Perl A. Elevation of mitochondrial transmembrane potential and reactive oxygen intermediate levels are early events and occur independently from activation of caspases in Fas signaling. J Immunol 1999; 162:1466–79.

8.

Bashir S, Harris G, Denman MA, Blake DR, Winyard PG. Oxidative DNA damage and cellular sensitivity to oxidative stress in human autoimmune diseases. Ann Rheum Dis 1993; 52:659-66.

9.

Bennett M, Macdonald K, Chan S, Luzio JP, Simari R, Weissberg P. Cell surface trafficking of Fas: a rapid mechanism of p53- induced apoptosis. Science 1998; 282:290–3.

10. Bombardier C, Gladman DD, Urowitz MB, Caron D, Chang DH, and the Committee on Prognosis Studies in SLE. Derivation of the SLEDAI: a disease activity index for lupus patients. Arthritis Rheum 1992; 35:630–40. 11. Brand MD, Felber SM. Membrane potential of mitocho ndria in intact lymphocytes during early mitogenic stimulation. Biochem J. 1984; 217:453-9.

48

12. Buttke TM, Sandstrom PA. Oxidative stress as a mediator of apoptosis. Immunol Today 1994; 15:7–10. 13. Caricchio R, Cohen PL. Spontaneous and induced apoptosis in systemic lupus erythematosus: multiple assays fail to reveal consistent abnormalities. Cell Immunol 1999; 198:54–60. 14. Casciola-Rosen LA, Anhalt G, Rosen A. Autoantigens targeted in systemic lupus erythematosus are clustered in two populations of surface structures on apoptotic keratinocytes. J Exp Med 1994; 179:1317–30. 15. Cohen JJ, Duke RC, Fadok VA, Sellins KS. Apoptosis and programmed cell death in immunity. Annu Rev Immunol 1992; 10:267–93. 16. Cohen PL, Eisenberg RA. Lpr and gld: Single gene models of systemic autoimmunity and lymphoproliferative disease. Annu Rev Immunol 1991; 9:243–69. 17. Cooper GS, Dooley MA, Treadwell EL, St. Clair EW, Parks CG, Gilkeson GS. Hormonal, environmental, and infectious risk factors for developing systemic lupus erythematosus. Arthritis Rheum 1998; 41:1714–24. 18. Cossarizza A, Franceschi C, Monti D, Salvioli S, Bellesia E, Rivabene R, et al. Protective effect of N-acetylcysteine in tumor necrosis factor-? -induced apoptosis in U937 cells: the role of mitochondria. Exp Eye Res 1995; 220:232– 40. 19. Crow MK, Kirou KA. Regulation of CD40 ligand expression in systemic lupus erythematosus.Curr Opin Rheumatol 2001; 13:361-9. 20. Das UN. Hypothesis: can glucose- insulin-potassium regimen in combination with polyunsaturated fatty acids suppress lupus and other inflammatory conditions? Prostaglandins Leukot Essent Fatty Acids 2001; 65:109-13. 21. Das UN. Oxidants, anti-oxidants, essential fatty acids, eicosanoids, cytokines, gene/oncogene expression and apoptosis in systemic lupus erythematosus. J Assoc Physicians India. 1998; 46:630-4. 22. Davies KJ. Oxidative stress: the paradox of aerobic life. Biochem Soc Symp. 1995; 61:1-31. 23. Dayal AK, Kammer GM. The T cell enigma in lupus. Arthritis Rheum 1996; 39:23–33. 24. Dean GS, Tyrrell-Price J, Crawley E, Isenberg DA. Cytokines and systemic lupus erythematosus. Ann Rheum Dis. 2000; 59:243-51. 49

25. Deng C, Kaplan MJ, Yang J, Ray D, Zhang Z, McCune WJ et al. Decreased Rasmitogen-activated protein kinase signaling may cause DNA hypomethylation in T lymphocytes from lupus patients. Arthr itis Rheum. 2001; 44:397-407. 26. Drappa J, Vaishnaw AK, Sullivan KE, Chu J, Elkon KB. Fas gene mutations in the Canale-Smith syndrome, an inherited lymphoproliferative disorder associated with autoimmunity. N Engl J Med 1996; 335:1643–9. 27. Eisner MD, Amory J, Mullaney B, Tierney L Jr, Browner WS. Necrotizing lymphadenitis associated with systemic lupus erythematosus. Semin Arthritis Rheum 1996;26:477–82. 28. Elkon KB. Apoptosis in SLE: too little or too much? Clin ExpRheumatol 1994; 12:553–9. 29. Emlen W, Niebur JA, Kadera R. Accelerated in vitro apoptosis of lymphocytes from patients with systemic lupus erythematosus.J Immunol 1994; 152:3685–92. 30. Fariss MW, Reed DJ. High-performance liquid chromatography of thiols and disulfides: dinitrophenol derivatives. Methods Enzymol 1987; 143:101–9. 31. Ferri KF, Jacotot E, Blanco J, Este JA, Kroemer G. Mitochondrial control of cell death induced by HIV-1-encoded proteins. Ann N Y Acad Sci. 2000; 926:14964. 32. Fiers W, Beyaert R, Declercq W, Vandenabeele P. More than one way to die: apoptosis, necrosis and reactive oxygen damage. Oncogene 1999; 18:7719–30. 33. Fischer GF, Holter W, Majdic O,. Cragoe EJ Jr, and Knapp W. T cell stimulation via CD2 molecules is regularly accompanied by an increase in cytoplasmic pH: different effects of lectins and CD3 antibodies. J Immunol 1988; 141:404. 34. Fisher GH, Rosenberg FJ, Straus SE, Dale JK, Middleton LA, Lin AY, et al. Dominant interfering Fas gene mutations impair apoptosis in a human autoimmune lymphoproliferative syndrome. Cell 1995; 81:935–46. 35. Georgescu L, Vakkalanka RK, Elkon KB, Crow MK. Interleukin-10 promotes activation- induced cell death of SLE lymphocytes mediated by Fas ligand. J Clin Invest 1997; 100:2622-33. 36. Giovannini C, Matarrese P, Scazzocchio B, Sanchez M, Masella R, Malorni W. Mitochondria hyperpolarization is an early event in oxidized low-density lipoprotein- induced apoptosis in Caco-2 intestinal cells. FEBS Lett. 2002; 523:200-6.

50

37. Gottlieb E, Vander Heiden MG, Thompson CG. Bcl- XL prevents the initial decrease in mitochondrial membrane potential and subsequent reactive oxygen species production during tumor necrosis factor ? -induced apoptosis. Mol Cell Biol 2000;20:5680–9. 38. Grolleau A, Kaplan MJ, Hanash SM, Beretta L, Richardson B. Impaired translational response and increased protein kinase PKR expression in T cells from lupus patients. J Clin Invest. 2000; 106:1561-8. 39. Gulbins E, Brenner B, Schlottmann K, Welsch J, Heinle H, Koppenhoefer UL, et al. Fas-induced programmed cell death is mediated by a Ras-regulated O2 synthesis. Immunology 1996; 89:205–12. 40. Halliwell B, Gutteridge JM. Role of free radicals and catalytic metal ions in human disease: an overview. Methods Enzymol 1990; 186:1–85. 41. Hamilos DL, Wedner HJ. The role of glutathione in lymphocyte activation. I. Comparison of inhibitory effects of buthionine sulfoximine and 2-cyclohexene1-one by nuclear size transformation. J Immunol 1985; 135:2740–7. 42. Handwerger BS, Luzian I, Da Silva L, Storrer CE, Via CS. Cytokines in the immunopathogenesis of lupus. In: Kammer GM, Tsokos GC, editors. Lupus: molecular and cellular pathogenesis.Totowa (NJ): Humana Press; 1999. p. 321– 40. 43. Harris MH, Thompson CB. The role of the Bcl-2 family in the regulation of outer mitochondrial membrane permeability. Cell Death Differ 2000;7:1182-91. 44. He J, Choe S, Walker R, Di Marzio P, Morgan DO, Landau NR. Human immunodeficiency virus type 1 viral protein R (vpr) arrests cells in the G2 phase of the cell cycle by inhibiting p34cdc2 activity. J Virol 1995; 69:6705–11. 45. Hennet T, Richter C, Peterhans E. Tumor necrosis factor-? induces superoxide anion generation in mitochondria of L929 cells. Biochem J 1993; 289:587–92. 46. Herrmann M, Voll RE, Kalden JR. Etiopathogenesis of systemic lupus erythematosus. Immunol Today 2000; 21:424-6. 47. Herrmann M, Voll RE, Zoller OM, Hagenhofer M, Ponner BB, Kalden JR. Impaired phagocytosis of apoptotic cell material by monocyte-derived macrophages from patients with systemic lupus erythematosus. Arthritis Rheum 1998; 41:1241-50.

51

48. Hildeman DA, Mitchell T, Teague TK, Henson P, Day BJ, Kappler J, et al. Reactive oxygen species regulate activationinduced T cell apoptosis. Immunity 1999; 10:735–44. 49. Hockenberry DM, Oltvai ZN, Yin X, Milliman CL, Korsmeyer SJ. Bcl-2 functions in an antioxidant pathway to prevent apoptosis. Cell 1993; 75:241–51. 50. Jaattela M, Tschopp J. Caspase- independent cell death in T lymphocytes. Nat Immunol. 2003; 4:416-23. 51. Kammer GM, Perl A, Richardson BC, Tsokos GC. Abnormal T cell signal transduction in systemic lupus erythematosus. Arthritis Rheum. 2002; 46:113954. 52. Kammer GM. High prevalence of T cell type I protein kinase A deficiency in systemic lupus erythematosus. Arthritis Rheum 1999; 42:1458-62. 53. Kane DJ, Sarafian TA, Anton R, Hahn H, Gralla EB, Valentine JS, et al. Bcl-2 inhibition of neural death: decreased generation of reactive oxygen species. Science 1993; 262:1274–7. 54. Kasahara Y, Iwai K, Yachie A, Ohta K, Konno A, Seki H, et al. Involvement of reactive oxygen intermediates in spontaneous and CD95 (Fas/APO-1)-mediated apoptosis of neutrophils. Blood 1997; 89:1748–53. 55. Kasibhatla S, Genestier L, Green DR. Regulation of Fas ligand expression during activation-induced cell death in T lymphocytes.J Biol Chem 1999; 274:987–92. 56. Khaled AR, Reynolds DA, Young HA, Thompson CA, Muegge K, and Durum SK. IL-3 withdrawal induces an early increase in mitochondrial membrane potential unrelated to the bcl-2 family: roles of intracellular pH, ADP transport, and F0F1-ATPase. J Biol Chem 2001; 276:6453-9. 57. Kim JM, Bae H, Park B, Lee J, Ahn H, Rho J et al. Early mitochondrial hyperpolarization and intracellular alkalinization in lactacystin- induced apoptosis of retinal pigment epithelial cells. J Pharmacol Exp Ther. 2003 (in press). 58. Ko YH, Dal Lee J. Fine needle aspiration cytology in lupus lymphadenopathy: a case report. Acta Cytol 1992; 36:748–51. 59. Korsmeyer SJ. Regulators of cell death. Trends Genet 1995; 11:101–5. 60. Kovacs B, Vassilopoulos D, Vogelgesang SA, Tsokos GC. Defective CD3mediated cell death in activated T cells from patients with systemic lupus

52

erythematosus:

role

of

decreased

intracellular TNF-? . Clin Immunol

Immunopathol 1996; 81:293–302. 61. Kroemer G, Dallaporta B, Resche-Rigon M. The mitochondrial death/life regulator in apoptosis and necrosis. Annu Rev Physiol. 1998; 60:619-42. 62. Lauwerys BR,, Garot N, Renauld JC, and Houssiau FA. Interleukin-10 blockade corrects impaired in vitro cellular immune responses of systemic lupus erythematosus patients. Arthritis Rheum 2001; 43:1976-81. 63. Le Moine O, Louis H, Stordeur P, Collet JM, Goldman M, Deviere J. Role of reactive oxygen intermediates in interleukin 10 release after cold liver ischemia and reperfusion in mice. Gastroenterology 1997; 113:1701–6. 64. Leist M, Single B, Castoldi AF, Kuhnle S, Nicotera P. Intracellular adenosine triphosphate (ATP) concentration: a switch in the decision between apoptosis and necrosis. J Exp Med 1997; 185:1481–6. 65. Lenardo M, Chan KM, Hornung F, McFarland H, Siegel R, J. Wang et al. Mature T lymphocyte apoptosis- immune regulation in a dynamic and unpredictable antigenic environment. Annu Rev Immunol 1999; 17:221-9. 66. Lewis RS. Calcium signaling mechanisms in T lymphocytes. Annu Rev Immunol 2001; 19:497-521. 67. Li D, Yang B, Mehta JL. Ox-LDL induces apoptosis in human coronary artery endothelial cells: role of PKC, PTK, bcl-2, and Fas. Am J Physiol 1998; 275:568–76. 68. Li N, and Karin N. Is NF-?B the sensor of oxidative stress? FASEB J 1999; 13:1137-42. 69. Li P, Dietz R, and von Harsdorf R. p53 regulates mitochondrial membrane potential through reactive oxygen species and induces cytochrome c- independent apoptosis blocked by bcl-2. EMBO J 1999; 18:6027-32. 70. Liossis SN, Ding XZ, Dennis GJ, Tsokos GC. Altered pattern of TCR/CD3mediated protein-tyrosyl phosphorylation in T cells from patients with systemic lupus erythematosus. Deficient expression of the T cell receptor zeta chain. J Clin Invest. 1998; 101:1448-57. 71. Lipton SA, Choi Y, Pan Z, Lei SZ, Chen HV, Sucher NJ, et al. A redox-based mechanism for the neuroprotective and neurodestructive effects of nitric oxide and related nitroso-compounds. Nature 1993; 364:626–31.

53

72. Lizcano JM, Morrice N, and Cohen P. Regulation of BAD by cAMPdependent protein kinase is mediated via phosphorylation of a novel site, Ser155. Biochem J 2002; 349:547. 73. Llorente L, Richaud-Patin Y, Wijdenes J, Alcocer-Varela J, Maillot MC, Durand-Gasselin I, et al. Spontaneous production of interleukin-10 by B lymphocytes and monocytes in systemic lupus erythematosus. Eur Cytokine Network 1993; 4:421-8. 74. Llorente L, Zou W, Levy Y, Richaud-Patin Y, Wijdenes J, Alcocer-Varela J, et al. Role of interleukin 10 in the B lymphocyte hyperactivity and autoantibody production of human systemic lupus erythematosus. J Exp Med 1995; 181:839. 75. Lorand-Metze I, Carvalho MA, Costallat LT. Morphology of bone marrow in systemic lupus erythematosus. Pathologe 1994; 15:292–6. 76. Lorenz H-M, Grunke M, Hieronymus T, Herrmann M, Kuhnel A, Manger B, et al. In vitro apoptosis and expression of apoptosisrelated molecules in lymphocytes from patients with systemic lupus erythematosus and other autoimmune diseases. Arthritis Rheum 1997; 40:306–17. 77. Los M, Droge W, Stricker K, Bauerle PA, Schulze-Osthoff K. Hydrogen peroxide as a potent activator of T lymphocyte functions. Eur J Immunol 1995; 25:159–65. 78. Los M, Schenk H, Hexel K, Baeuerle PA, Droge W, and Schulze-Osthoff K. IL2 gene expression and NF-?B activation through CD28 requires reactive oxygen production by 5- lipoxygenase. EMBO J 1995; 14:3731. 79. Lowry OH, Rosebrough NJ, Farr AL, Randall RJ. Protein measurement with the Folin phenol reagent. J Biol Chem 1951; 193:265–75. 80. Lundin A. ATP extractants neutralised by cyclodextrins. In: Campbell AK, Kricka LJ, Stanley PE, editors. Bioluminescence and Chemiluminescence. Chichester: John Wiley & Sons; 1994. p.399–402. 81. Lundin A. Use of firefly luciferase in ATP-related assays of biomass, enzymes, and metabolites. Methods Enzymol 2000; 305:346–70. 82. Machida K, Tanaka T. Farnesol- induced generation of reactive oxygen species dependent

on

mitochondrial

transmembrane

potential

hyperpolarization

mediated by F(0)F(1)-ATPase in yeast.FEBS Lett 1999; 462:108–12. 83. Martin SJ, Re utelingsperger CPM, McGahon AJ, Rader JA, van Schie CAA, LaFace DM, et al. Early redistribution of plasma membrane phosphatidylserine 54

is a general feature of apoptosis regardless of the initiating stimulus: inhibition by overexpression of bcl-2 and Abl. J Exp Med 1995; 182:1545–56. 84. Matache C, Onu A, Stefanescu M, Tanaseanu S, Dragomir C, Dolganiuc A, Szegli G. Dysregulation of p56lck kinase in patients with systemic lupus erythematosus. Autoimmunity. 2001; 34:27-38. 85. Mayes P. The pentose phosphate pathway and other pathways of hexose metabolism. In: Murray R, Granner D, Mayes P, Rodwell V, editors. Harper’s Biochemistry. Norwalk (CT): Appleton &Lange; 1993. p. 201–11. 86. Meier B, Radeke HH, Selle S, Younes M, Sies H, Resch K, et al. Human fibroblasts release reactive oxygen species in response to interleukin-1 or tumor necrosis factor-? . Biochem J 1989; 263:539–45. 87. Meisenholder GW, Martin SJ, Green DR, Nordberg J, Babior BM, and Gottlieb RA. Events in apoptosis: acidification is downstream of protease activation and BCL-2 protection. J Biol Chem 1996; 271:16260. 88. Meng XW, Feller JM, Ziegler JB, Pittman SM, Ireland CM. Induction of apoptosis in peripheral blood lymphocytes following treatment in vitro with hydroxychloroquine. Arthritis Rheum 1997; 40:927–35. 89. Mills GB, Cheung RK, Cragoe EJ Jr, Grinstein S, and Gelfand EW. Activation of the Na+/H+ antiport is not required for lectin- induced proliferation of human T lymphocytes. J Immunol 1986; 136:1150-6. 90. Mishra N, Brown DR, Olorenshaw IM, and Kammer GM. Trichostatin A reverses skewed expression of CD154, interleukin-10, and interferon-? gene and protein expression in lupus T cells. Proc Natl Acad Sci USA 2001; 98:2628-35. 91. Mishra N, Khan IU, Tsokos GC, and Kammer GM. Association of deficient type II protein kinase A activity with aberrant nuclear translocation of the RII ? subunit in systemic lupus erythematosus T lymphocytes. J Immunol 2002; 165:2830-5. 92. Mishra N, Khan IU, Tsokos GC, Kammer GM. Association of deficient type II protein kinase A activity with aberrant nuclear translocation of the RII beta subunit in systemic lupus erythematosus T lymphocytes. J Immunol. 2000; 165:2830-40. 93. Mohan IK, Das UN. Oxidant stress, anti-oxidants and essential fatty acids in systemic lupus erythematosus. Prostaglandins Leukot Essent Fatty Acids. 1997; 56:193-8. 55

94. Mysler E, Bini P, Drappa J, Ramos P, Friedman SM, Krammer PH, et al. The apoptosis-1/Fas protein in human systemic lupus erythematosus. J Clin Invest 1994; 93:1029–34. 95. Nagata S, Golstein P. The Fas death factor. Science 1995; 267:1449–56. 96. Nicoletti I, Migliorati G, Pagliacci MC, Grignani F, Riccardi C. A rapid and simple method for measuring thymocyte apoptosis by propidium iodide staining and flow cytometry. J Immunol Methods 1991; 139:271–9. 97. Nowak G. Protein kinase C-alpha and ERK1/2 mediate mitochondrial dysfunction, decreases in active Na+ transport, and cisplatin- induced apoptosis in renal cells. J Biol Chem. 2002; 277:43377-88. 98. Oates JC, Christensen EF, Reilly CM, Self SE, Gilkeson GS. Prospective measure of serum 3-nitrotyrosine levels in systemic lupus erythematosus: correlation with disease activity. Proc Assoc Am Physicians 1999; 111:611–21. 99. Ohtsuka K, Gray JD, Stimmler MM, Toro B, and Horwitz DA. Decreased production of TGF-? by lymphocytes from patients with systemic lupus erythematosus. J Immunol 1998; 160:2539-45. 100. Orlinick JR, Vaishnaw A, Elkon KB, Chao MV. Requirement of cysteine-rich repeats of the Fas receptor for binding of the Fas ligand. J Biol Chem 1997; 272:28889–94. 101. Perl A, Banki K. Molecular mimicry, altered apoptosis, andimmunomodulation as mechanisms of viral pathogenesis in systemic lupus erythematosus. In: Kammer GM, Tsokos GC, editors.Lupus: molecular and cellular pathogenesis. Totowa (NJ): Humana Press; 1999. p. 43–64. 102. Petit PX, O’Connor JE, Grunwald D, Brown SC. Analysis of the membrane potential of rat- and mouse- liver mitochondria by flow cytometry and possible applications. Eur J Biochem 1990; 194:389–97. 103. Piacentini M, Farrace MG, Piredda L, Matarrese P, Ciccosanti F, Falasca L et al. Transglutaminase overexpression sensitizes neuronal cell lines to apoptosis by increasing mitochondrial membrane potential and cellular oxidative stress. J Neurochem. 2002; 81:1061-72. 104. Poppe M, Reimertz C, Dussmann H, Krohn AJ, Luetjens CM, Bockelmann D et al. Dissipatio n of potassium and proton gradients inhibits mitochondrial hyperpolarization and cytochrome c release during neural apoptosis. J Neurosci. 2001; 21:4551-63. 56

105. Puskas F, Gergely P Jr, Banki K, Perl A. Stimulation of the pentose phosphate pathway and glutathione levels by dehydroascorbate, the oxidized form of vitamin C. FASEB J 2000; 14:1352–61. 106. Russell JW, Golovoy D, Vincent AM, Mahendru P, Olzmann JA, Mentzer A, Feldman EL. High glucose- induced oxidative stress and mitochondrial dysfunction in neurons. FASEB J. 2002; 16:1738-48. 107. Salvemini F, Franze A, Iervolino A, Filosa S, Salzano S, Ursini MV. Enhanced glutathione levels and oxidoresistance mediated by increased glucose-6phosphate dehydrogenase expression. J Biol Chem 1999; 274:2750–7. 108. Sams WM Jr, Logan WS. The skin as a reflector of immunologic change. Rheumatology 1973; 4:98-143. 109. Scarlett JL, Sheard PW, Hughes G, Ledgerwood EC, Ku H, Murphy MP. Changes in mitochondrial membrane potential during staurosporin- induced apoptosis in Jurkat cells. FEBS Lett 2000; 475:267–72. 110. Sen CK, and Packer L. Antioxidant and redox regulation of gene transcription. FASEB J 1996; 10:709-14. 111. Silvestris F, Grinello D, Tucci M, Cafforio P, Dammacco F. Enhancement of T cell apoptosis correlates with increased serum levels of soluble Fas (CD95/Apo1) in active lupus. Lupus 2003; 12:8-14. 112. Singh R, Pervin S, Chaudhuri G. Caspase-8-mediated BID cleavage and release of mitochondrial cytochrome c during Nomega- hydroxy-L-arginine- induced apoptosis in MDA-MB-468 cells. Antagonistic effects of L-ornithine. J Biol Chem. 2002; 277:37630-6. 113. Skulachev VP. Mitochondrial physiology and pathology; concepts of programmed death of organelles, cells, and organisms. Mol Aspects Med 1999; 20:139–184. 114. Smiley ST, Reers M, Mottola-Hartshorn C, Lin M, Chen A, Smith TW, et al. Intracellular heterogeneity in mitochondrial membrane potentials revealed by a J-aggregate-forming cation JC-1. Proc Natl Acad Sci U S A 1991; 88:3671–5. 115. Stryer L. Biochemistry. 3rd edition. New York: WH Freeman; 1988. 116. Studnicka-Benke A, Steiner G, Petera P, Smolen JS. Tumour necrosis factor ? and its soluble receptors parallel clinical disease and autoimmune activity in systemic lupus erythematosus. Br J Rheumatol 1996; 35:1067–4.

57

117. Susin SA, Zamzami N, Castedo M, Daugas E, Wang H, Geley S, et al. The central executioner of apoptosis: multiple connections between protease activation and mitochondria in Fas/Apo-1/CD95- and ceramide- induced apoptosis. J Exp Med 1997; 186:25–37. 118. Suthanthiran M, Anderson ME, Sharma VK, Meister A. Glutathione regulates activation-dependent DNA synthesis in highly purified normal human T lymphocytes stimulated via the CD2 and CD3 antigens. Proc Natl Acad Sci U S A 1990; 87:3343–7. 119. Suwannaroj S, Lagoo A, Keisler D, McMurray RW. Antioxidants suppress mortality in the female NZB x NZW F1 mouse model of systemic lupus erythematosus. Lupus 2001; 10:258-65. 120. Swaak AJ, van den Brink HG, Aarden LA. Cytokine production

(IL-6 and

TNF? ) in whole blood cell cultures of patients with systemic lupus erythematosus. Scand J Rheumatol 1996; 25:233–8. 121. Tada Y, Nagasawa K, Yamauchi Y, Tsukamoto H, Niho Y. A defect in the protein kinase C system in T cells from patients with systemic lupus erythematosus. Clin Immunol Immunopathol. 1991; 60:220-31. 122. Tafani M, Cohn JA, Karpinich NO, Rothman RJ, Russo MA, Farber JL. Regulation of intracellular pH mediates Bax activation in HeLa cells treated with staurosporine or tumor necrosis factor-alpha. J Biol Chem. 2002; 277:49569-76. 123. Takeuchi T, Pang M, Amano K, Koide J, Abe T. Reduced protein tyrosine phosphatase (PTPase) activity of CD45 on peripheral blood lymphocytes in patients with systemic lupus erythematosus (SLE).Clin Exp Immunol. 1997; 109:20-6. 124. Tan EM, Cohen AS, Fries JF, Masi AT, McShane DJ, Rothfield NF, et al. The 1982 revised criteria for the classification of systemic lupus erythematosus. Arthritis Rheum 1982; 25:1271–7. 125. Thompson CB. Apoptosis in the pathogenesis and treatment of disease. Science 1995; 267:1456–62. 126. Tietze F. Enzymic method for quantitative determination of nanogram amo unts of total and oxidized glutathione: applications to mammalian blood and other tissues. Anal Biochem 1969; 27:502–22. 127. Tsokos GC, Kammer GM. Molecular aberrations in human systemic lupus erythematosus. Mol Med Today 2000; 6:418-24. 58

128. Tsokos GC, Liossis SC. Immune cell signaling defects in lupus: activation, anergy and death. Immunol Today 1999; 20:119–24. 129. Tsuchiya N, Ohashi J, Tokunaga K. Variations in immune response genes and their associations with multifactorial immune disorders. Immunol Rev 2002; 190:169-81. 130. Um HD, Orenstein JM, Wahl SM. Fas mediates apoptosis in human monocytes by a reactive oxygen intermediate dependent pathway. J Immunol 1996; 156:3469–77. 131. Vander Heiden M, Chandel NS, Williamson EK, Schumaker PT, Thompson CB. Bcl-XL regulates the me mbrane potential and volume homeostasis of mitochondria. Cell 1997; 91:627–37. 132. Vermes I, Haanen C, Steffens-Nakken H, Reutelingsperger C. A novel assay for apoptosis: flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on early apoptotic cells using fluorescein labelled annexin V. J Immunol Methods 1995; 184:39–51. 133. Vincent AM, Brownlee M, Russell JW. Oxidative stress and programmed cell death in diabetic neuropathy. Ann N Y Acad Sci. 2002; 959:368-83. 134. Virdee K, Parone PA, and Tolkovsky AM. Phosphorylation of the pro-apoptotic protein BAD on serine 155, a novel site, contributes to cell survival. Curr Biol 2002; 10:1151-7. 135. Walport MJ. Advances in immunology: complement. N Engl J Med 2001; 344:1140–4. 136. Wieder ED, Hang H, and Fox MH. Measurement of intracellular pH using flow cytometry with carboxy-SNARF-1. Cytometry 1993; 14:916-21. 137. Williams MS, Henkart PA. Role of reactive oxygen intermediates in TCRinduced death of T cell blasts and hybridomas. J Immunol 1996; 157:2395–4027. 138. Xiang J, Chao DT, Korsmeyer SJ. BAX- induced cell death may not require interleukin 1? -converting enzyme- like proteases. Proc Natl Acad Sci U S A 1996; 93:14559–63. 139. Zhou XM, Liu Y, Payne G, Lutz RJ, and Chittenden T. Growth factors inactivate the cell death promoter BAD by phosphorylation of its BH3 domain on Ser155. J Biol Chem 2002; 275:25046-51.

59

KÜLÖNLENYOMATOK

60