PLATELIA CMV IgG 1 destička

PLATELIA™ CMV IgG 1 destička –

96

72810

KVALITATIVNÍ STANOVENÍ IgG PROTILÁTEK PROTI CYTOMEGALOVIRU V LIDSKÉM SÉRU NEBO PLAZMĚ POMOCÍ ENZYMOVÉ IMUNOANALÝZY

881140 – 2013/11

1.

POUŽITÍ

Platelia™ CMV IgG je nepřímá ELISA imunoanalýza určená ke kvantitativnímu stanovení IgG protilátek proti cytomegaloviru v lidském séru nebo plazmě.

2.

KLINICKÝ VÝZNAM

Lidský cytomegalovirus (CMV) je všudypřítomný virus, který se nachází ve všech geografických oblastech světa a ve všech socioekonomických skupinách. CMV je (rodiny)rodu herpetických virů a je přenášen cestou biologických tekutin během úzkých mezilidských kontaktů (moč, sliny, mateřské mléko, krev, slzy, sperma a vaginální sekrety). Po infekci může CMV zůstávat v těle nakaženého pacienta latentní po několik let a poté se může reaktivovat a způsobit opakující se infekce s možným přenosem na ostatní jedince. K primární infekci může dojít různými cestami přenosu a v různých obdobích života (kongenitální infekce, postnatální infekce). Po uplynutí fáze latence může dojít k sekundární infekci buď cestou reinfekce exogenním virem nebo reaktivací latentního viru. 50 až 85 % populace je infikováno před dosažením dospělosti, ale většina infekcí zůstává asymptomatických a pouze u 2 % pacientů se objeví atypické symptomy, jako například horečka, astenie, bolesti svalů či kloubů. CMV infekce však může být závažná, když postihne těhotné ženy, novorozence nebo imunokompromitované hostitele. V průběhu těhotenství je 1 až 3 % žen infikováno CMV a fetální přenos placentární difúzí je pozorován u 40 až 50 % pacientů. 95 % fetálních infekcí není symptomatických, ale u 5 % dochází k velmi závažným komplikacím: hepatosplenomegálie, microcephalus, hydrocephalus, nedonošenost, psychomotorická retardace a úmrtí plodu. U 10 % asymptomatických infekcí se u novorozenců projeví opožděné komplikace, jako například částečná nebo úplná hluchota nebo slepota. U imunokompromitovaných pacientů (AIDS, příjemců transplantovaných orgánů, pacientů s lymfoproliferativními onemocněními či rakovinou) jsou závažné komplikace spojené s diseminovanou anebo viscerální infekcí: splenomegalie, chorioretinitida, hepatitida, pneumonie, myokarditida, encefalitida. U těchto pacient může být infekce smrtelná. Několik týdnů po CMV infekci vede imunitní odpověď k objevení se specifických IgM protilátek, což je o několik dnů později následováno objevením se specifických IgG protilátek. Sérologická diagnóza CMV infekce je prokázána sérokonverzí nebo významným vzestupem titru IgG. Detekce specifických anti-CMV IgG protilátek je užitečná pro diagnózu primární infekce a pro stanovení imunitního stavu pacientů.

3.

PRINCIP

Platelia™ CMV IgG je test k detekci a titraci IgG protilátek proti cytomegaloviru v lidském séru nebo plazmě pomocí nepřímé ELISA imunoenzymatické metody. Inaktivovaný CMV antigen je použit pro potažení mikrodestičky. Polyklonální protilátka značená peroxidázou, která je specifická pro lidské gama řetězce (anti-IgG), je použita jako konjugát. Test probíhá dle následujících kroků: 

Krok 1

Vzorky pacientů, kalibrátor a kontroly se naředí 1:21 a poté se napipetují do jamek v mikrodestičce. V průběhu inkubace trvající 1 hodinu při 37 °C se IgG protilátky přítomné ve vzorku navážou na CMV antigen, kterým jsou potaženy jamky mikrodestičky. Po inkubaci se odstraní nenavázané nespecifické protilátky a ostatní sérové proteiny promytím. 

Krok 2

Konjugát (polyklonální protilátka značená peroxidázou specifická pro lidské gama řetězce) se napipetuje do jamek mikrodestičky. V průběhu této jednohodinové inkubace při 37 °C se značená protilátka váže na sérové IgG navázané na CMV antigen. Nenavázaný konjugát se na konci inkubace odstranění promytím. 

Krok 3

Přítomnost imunokomplexů (CMV antigen, IgG protilátky proti CMV, anti-IgG konjugát) se prokazuje napipetováním roztoku chromogenu do každé jamky. 

Krok 4

Po inkubaci při pokojové teplotě (18 – 30 °C) se enzymatická reakce zastaví přidáním 1N roztoku kyseliny sírové. Hodnota optické denzity získaná spektrofotometrem nastaveným na 450/620 nm je úměrná množství IgM protilátek proti CMV přítomných ve vzorku.

1

4.

SLOŽENÍ SOUPRAVY

Dodávaná množství činidel byla vypočtena tak, aby umožnila 96 testů. Všechna činidla jsou určena výhradně pro diagnostické použití in vitro. Označení R1

Složení reagencií

Mikrodestička (hotová k použití): 12 proužků s 8 oddělitelnými jamkami potaženými inaktivovaným CMV antigenem R2 Concentrated Washing Koncentrovaný promývací roztok (20x): ® Solution TRIS-NaCl pufr (pH 7,4), 2 % Tween 20 (x20) Konzervační prostředek: 0,04 % ProClin™ 300 R3 Calibrator 0 Kalibrátor 0: Lidské séru negativní na IgG protilátky proti CMV a negativní na HBs antigen, anti-HIV1, anti- HIV2 a anti-HCV. Konzervační prostředek: 0,15 % ProClin™ 300 R4a Calibrator 0.4 Kalibrátor 0,4 UA/ml: Lidské sérum reaktivní na IgG protilátky proti CMV a negativní na HBs antigen, anti-HIV1, anti- HIV2 a anti-HCV. Konzervační prostředek: 0,15 % ProClin™ 300 R4b Calibrator 1 Kalibrátor 1 UA/ml: Lidské sérum reaktivní na IgG protilátky proti CMV a negativní na HBs antigen, anti-HIV1, anti- HIV2 a anti-HCV. Konzervační prostředek: 0,15 % ProClin™ 300 R4c Calibrator 4 Kalibrátor 4 UA/ml: Lidské sérum reaktivní na IgG protilátky proti CMV a negativní na HBs antigen, anti-HIV1, anti- HIV2 a anti-HCV. Konzervační prostředek: 0,15 % ProClin™ 300 R4d Calibrator 10 Kalibrátor 10 UA/ml: Lidské sérum reaktivní na IgG protilátky proti CMV a negativní na HBs antigen, anti-HIV1, anti- HIV2 a anti-HCV. Konzervační prostředek: 0,15 % ProClin™ 300 R6 Conjugate (51x) Konjugát (51x): Kozí polyklonální protilátka proti lidským gama řetězcům konjugovaná s křenovou peroxidázou. Konzervační prostředek: 0,16 % ProClin™ 300 R7 Diluent Ředicí roztok pro vzorky a konjugát (hotový k použití): Tris-NaCl ® pufr (pH 7,7), hovězí albumin, glycerol, 0,1% Tween 20, fenolová červeň. Konzervační prostředek: 0,15 % ProClin™ 300 R9 Chromogen TMB Chromogen (hotový k použití): 3.3’.5.5’ tetramethylbenzidin (< 0,1%), H2O2 (<1%) R10 Stopping Solution Zastavovací roztok (hotový k použití): 1N roztok kyseliny sírové Podmínky uchovávání a datum exspirace jsou uvedeny v nápisech na krabici.

5.

Microplate

Množství 1

1 x 70 ml

1 x 0,75 ml

1 x 0,75 ml

1 x 0,75 ml

1 x 0,75 ml

1 x 0,75 ml

1 x 0,4 ml

1 x 80 ml

1 x 28 ml 1 x 28 ml

UPOZORNĚNÍ A BEZPEČNOSTNÍ OPATŘENÍ

Spolehlivost výsledků závisí na správném dodržování následujících pravidel Správné laboratorní praxe: ● Nepoužívejte činidla po datu exspirace. ● Během jednoho cyklu nemíchejte ani nepřidávejte činidla z různých šarží. POZNÁMKA: u promývacího roztoku (R2, označení na štítku: 20x zelené barvy), Chromogenu (R9, označení na štítku: TMB tyrkysové barvy) a zastavovacího roztoku (R10, označení na štítku: 1N červené barvy) je možné použít jiné šarže než ty, které jsou obsaženy v soupravě za předpokladu, že jsou tato činidla zcela stejná a stejné šarže jako ta, která se použijí pro daný běh testu. POZNÁMKA: navíc může být promývací roztok (R2, označení na štítku: 20x zelené barvy) smíchán s 2 jinými promývacími roztoky obsaženými v různých soupravách činidel Bio-Rad (R2, označení na štítku: 10x modré barvy nebo 10 x oranžové barvy), jestliže je správně naředěný a za předpokladu, že je během daného cyklu testu použita pouze jedna směs. ● Před použitím vyčkejte 30 minut, aby činidla dosáhla pokojové teploty (18 – 30° C). ● Činidla pečlivě rozpusťte, nebo nařeďte tak, abyste zamezili jakékoli kontaminaci. ● Neprovádějte test v přítomnosti reaktivních výparů (výpary kyseliny, zásady či aldehydu) nebo prachu, které by mohly změnit enzymovou aktivitu konjugátu. ● Používejte sklo důkladně umyté a opláchnuté deionizovanou vodou nebo nejlépe materiál pro jednorázové použití. 2

● ● ● ● ● ● ●

Promytí mikrodestičky je kritickým krokem pracovního postupu: dodržujte doporučený počet promývacích cyklů a ujistěte se, že všechny jamky byly zcela naplněny a poté zcela vyprázdněny. Nesprávné promytí může způsobit nepřesné výsledky. Nedovolte, aby mikrodestička mezi koncem procesu promývání a pipetování činidla vyschla. Nikdy nepoužívejte stejnou nádobku pro pipetování konjugátu a chromogenu. Enzymatická reakce je velmi citlivá na kov nebo ionty kovu. Proto nedovolte, aby jakýkoli kovový prvek přišel do kontaktu s různými roztoky, které obsahují konjugát nebo chromogen. Roztok chromogenu (R9) musí být bezbarvý. Vznik modré barvy znamená, že se nesmí činidlo použít a musí být vyměněno. Pro každý vzorek použijte novou pipetovací špičku. Zkontrolujte přesnost a správnou funkci pipet a ostatního vybavení.

BEZPEČNOSTNÍ PŘEDPISY A OCHRANA ZDRAVÍ Materiál lidského původu použitý při přípravě činidel byl testován a shledán nereaktivním na povrchový antigen viru hepatitidy B (HBsAg), protilátky proti viru hepatitidy C (anti-HCV) a viru lidské imunodeficience (anti-HIV1 a anti-HIV2). Protože žádná metoda nemůže zcela zaručit nepřítomnost infekčních agens, musí být s činidly lidského původu a vzorky pacientů zacházeno tak, jako by byly potenciálně schopné přenést infekční onemocnění: ● Jakýkoli materiál, včetně promývacích roztoků, který je v přímém kontaktu se vzorky a činidly obsahujícími materiál lidského původu, musí být považován za schopný přenášet infekční onemocnění. ● Při manipulaci se vzorky a činidly noste rukavice na jednorázové použití. ● Nepipetujte ústy. ● Zabraňte rozlití vzorků nebo roztoků obsahujících vzorky. Rozlité vzorky musí být omyty chlornanem sodným naředěným na 10 %. V případě rozlití kyseliny musí být tato nejprve neutralizována hydrouhličitanem sodným a poté omyta chlornanem sodným naředěným na 10 % a vysušena adsorpčním papírem. Materiál použitý k čištění musí být likvidován do nádoby na kontaminovaný odpad. ● Pacientské vzorky, činidla obsahující materiál lidského původu a také kontaminovaný materiál a produkty musí být likvidovány až po dekontaminaci: buď ponořením do chlornanu sodného o konečné koncentraci chlornanu sodného 5 % po dobu 30 minut, nebo autoklávováním při teplotě 121° C po dobu minimálně 2 hodin. POZOR: roztoky, které obsahující chlornan sodný nesmí být vkládány do autoklávu. ● ● ● ●

6. 1. 2. ● ● ● ● ● ● ●

3. 4.

Zabraňte jakémukoli kontaktu činidel, včetně těch, které nejsou považovány za nebezpečné, s kůží nebo sliznicemi. S chemickým a biologickým odpadem musí být manipulováno a musí být likvidován v souladu s pravidly správné laboratorní praxe. Všechna činidla soupravy jsou určena výhradně pro diagnostické použití in vitro. Doporučení týkající nebezpečí a upozornění v souvislosti s některými komponenty v této testovací sadě najdete na piktogramech uvedených na štítcích a v pokynech na konci návodu k použití. Bezpečnostní list je k dispozici na adrese www.bio-rad.com.

VZORKY Doporučenými typy vzorků jsou sérum nebo plazma (EDTA, heparin nebo citrát). Pro manipulaci, zpracování a uchovávání krevních vzorků dodržujte následující doporučení: Při odběru krevních vzorků dodržujte rutinní bezpečnostní opatření pro venepunkci. U séra ponechte vzorky, aby se před odstředěním zcela srazily. Zkumavky udržujte vždy zazátkované. Po odstředění oddělte sérum nebo plazmu od sraženiny nebo červených krvinek do těsně zazátkované skladovací zkumavky. Bude-li test proveden během 7 dnů, mohou být vzorky uchovávány při teplotě +2 – 8 °C. Nebude-li test dokončen během 7 dnů nebo pro přepravu, zmrazte vzorky na teplotu -20 °C nebo nižší. Nepoužívejte vzorky, které byly rozmraženy více než třikrát. Dříve zmrazené vzorky musí být po rozmrazení před testováním důkladně promíchány (třepačka Vortex). U vzorků obsahujících 90 g/l albuminu nebo 100 mg/l nekonjugovaného bilirubinu, lipemických vzorků obsahujících ekvivalent 36 g/l triglyceridu a hemolyzovaných vzorků obsahujících až 10 g/l hemoglobinu, nejsou výsledky ovlivněny. Vzorky nezahřívejte.

7.

PROVEDENÍ TESTU

7.1

Potřebný materiál, který není součástí dodávky Třepačka Vortex. Spektrofotometr pro mikrodestičky vybavený filtry 450 nm a 620 nm (*). Inkubátor pro mikrodestičky s termostatem nastavitelným na 37  1 °C (*). Automatická, poloautomatická nebo ruční promývačka mikrodestiček (*). Sterilní destilovaná nebo deionizovaná voda. Rukavice na jednorázové použití. Brýle nebo ochranné brýle. Savý papír. Automatické nebo poloautomatické, nastavitelné nebo fixní pipety nebo multipipety k měření a pipetování 10 µl až 1000 µl a 1 ml, 2 ml a 10 ml. Odměrné válce o objemu 25 ml, 50 ml, 100 ml a 1000 ml.

● ● ● ● ● ● ● ● ● ●

3

Chlornan sodný a hydrouhličitan sodný. Nádoba na biologicky nebezpečný odpad. ● Zkumavky na jednorázové použití. (*) Pokud požadujete detailní informace o doporučeném vybavení, kontaktujte naše technické oddělení. ● ●

7.2 ●

●

● ●

Příprava činidel R1: před otevřením sáčku ponechte 30 minut při pokojové teplotě (18 – 30 °C). Vyjměte rámeček, nepoužité stripy okamžitě vraťte do sáčku a zkontrolujte přítomnost pohlcovače vlhkosti. Pečlivě znovu uzavřete sáček a uchovávejte při teplotě 2 – 8 °C. R2: nařeďte promývací roztok R2 destilovanou vodou v poměru 1:20: např. k získání promývacího roztoku hotového k použití smíchejte 50 ml R2 a 950 ml destilované vody. Pro jednu destičku s 12 stripy při ručním promývání připravte 350 ml naředěného promývacího roztoku. R3, R4a, R4b, R4c, R4d: nařeďte ředícím roztokem (R7) v poměru 1:21 (například: 300 µl R7 + 15 µl kalibrátoru). R6+R7: konjugát (R6) je koncentrován 51x a musí být před použitím promíchán. Nařeďte ředicím roztokem (R7) v poměru 1:51. Pro jednu destičku nařeďte 0,5 ml konjugátu (R6) v 25 ml ředicího roztoku (R7). Abyste získali objem potřebný pro jeden proužek, tyto objemy vydělte 10.

7.3 Uchovávání a exspirace otevřených a/nebo naředěných činidel Souprava musí být uchovávána při teplotě +2 – 8 °C. Je-li před otevřením souprava uchovávána při teplotě +2 – 8 °C, může být každá složka použita do data exspirace uvedeného na vnějším obalu soupravy. ● R1: po otevření zůstávají stripy stabilní do 8 týdnů, jestliže jsou uchovávány při teplotě +2 – 8 °C ve stejném, pečlivě uzavřeném sáčku (zkontrolujte přítomnost pohlcovače vlhkosti ● R2: po naředění může být promývací roztok uchováván po dobou 2 týdnů při teplotě +2 – 30 °C. Po otevření je koncentrovaný promývací roztok uchovávaný pří teplotě +2 – 30 °C stabilní do data exspirace uvedeného na štítku, pokud nedošlo ke kontaminaci. ● R3, R4a, R4b, R4c, R4d, R6, R7: pokud byla tato činidla po otevření a bez jakékoli kontaminace uchovávána při teplotě +2 – 8 °C, jsou stabilní po dobu 8 týdnů. ● R6+R7: po naředění je pracovní roztok konjugátu stabilní 8 hodin při pokojové teplotě (+18 – 30 °C) nebo 24 hodin při teplotě +2 – 8 °C. ● R9: po otevření a bez jakékoli kontaminace je reagencie uchovávaná při teplotě +2 – 8 °C je stabilní po dobu 8 týdnů ● R10: po otevření a bez jakékoli kontaminace je reagencie uchovávaná při teplotě +2 – 8 °C stabilní do data exspirace uvedeného na štítku. 7.4 Pracovní postup Dodržujte přísně pracovní postup testu a zásady správné laboratorní praxe. Před použitím nechte činidla dosáhnou pokojové teploty (18 – 30 °C). Použití oddělitelných jamek vyžaduje při manipulaci zvláštní pozornost. K ověření výsledků testu použijte při každém cyklu všechny kalibrátory a kontroly. 1. Pečlivě připravte plán rozmístění a identifikace kalibrátorů, kontrol a pacientských vzorků. 2. Připravte naředěný promývací roztok (R2) [viz odstavec 7.2]. 3. Vyjměte rámeček a stripy (R1) z ochranného sáčku [viz odstavec 7.2]. 4. V jednotlivě označených zkumavkách nařeďte kalibrátory R3, R4a, R4b, R4c a R4d a pacientské vzorky (S1, S2…) ředicím roztokem (R7), na ředění 1:21: 300 µl ředicího roztoku (R7) a 15 µl vzorku. Promíchejte naředěné vzorky. 5. Do každé jamky napipetujte 200 µl naředěných kalibrátorů, kontrol a pacientských vzorků přesně podle níže uvedeného pořadí: A B C D E F G H 6.

7. 8.

9. 10.

1 R3 R4a R4b R4c R4d S1 S2 S3

2 S4 S5 S6 S7 S8 S9 S10 S11

3 S12

4

5

6

7

8

9

10

11

12

Mikrodestičku přelepte samolepící fólií pro destičky a poté na destičku silně zatlačte, abyste zajistili těsné uzavření. Mikrodestičku ihned inkubujte v termostatem řízené vodní lázni nebo v suchém inkubátoru 1 hodinu  5 minut při 37 °C  1 °C. Před koncem první inkubační doby připravte pracovní roztok konjugátu (R6+R7) [viz odstavec 7.2]. Na konci první inkubační obdoby odstraňte z destičky přilnavou fólii. Odsajte obsah všech jamek do nádoby na biologicky nebezpečný odpad (obsahující chlornan sodný). Mikrodestičku 4-krát promyjte 350 µl promývacího roztoku (R2). Mikrodestičku otočte a jemně poklepte na adsorpční papír, abyste odstranili zbývající tekutinu. Do všech jamek okamžitě napipetujte 200 µl pracovního roztoku konjugátu (R6+R7). Před použitím musí být roztok jemně protřepán. Mikrodestičku přelepte přilnavou fólií a poté na destičku silně zatlačte, abyste zajistili těsné uzavření. Mikrodestičku ihned inkubujte v termostatem řízené vodní lázni nebo v suchém inkubátoru 1 hodinu  5 minut při 37 °C  1 °C.

4

11.

12. 13. 14. 15.

8.

Na konci druhé inkubační doby odstraňte přilnavou fólii z destičky. Odsajte obsah všech jamek do nádoby na biologicky nebezpečný odpad (obsahující chlornan sodný). Mikrodestičku 4-krát promyjte 350 µl promývacího roztoku (R2). Mikrodestičku otočte a jemně poklepte na adsorpční papír, abyste odstranili zbývající tekutinu. Rychle do každé jamky mimo dosah přímého světla napipetujte 200 µl roztoku chromogenu (R9). Reakci nechte probíhat ve tmě při pokojové teplotě (+18 – 30 °C) 30  5 minut. V průběhu této inkubace nepoužívejte přilnavou fólii. Enzymatickou reakci ukončete přidáním 100 µl zastavovacího roztoku (R10) do každé jamky.. Zachovejte stejný sled pipetování a časové intervaly jako při pipetování substrátového roztoku. Opatrně otřete dno destičky. Změřte optickou denzitu na spektrofotometru pro mikrodestičky při 450/620 nm do 30 minut po zastavení reakce. Před měřením musí být stripy vždy uchovávány ve tmě. Před nahlášením výsledků zkontrolujte soulad mezi měřením a distribučním plánem destičky a vzorků

INTERPRETACE VÝSLEDKŮ

8.1 Sestrojení standardní křivky Pro měření anti-CMV IgG protilátek není dostupný žádný mezinárodní standardní prostředek. Test Platelia™ CMV IgG je standardizován podle Proposed International Standard Preparation WHO 1995. Přítomnost a koncentrace IgG protilátek proti CMV ve vzorku se stanoví porovnáním optické denzity (OD) tohoto vzorku vůči koncentraci kalibrátorů standardní křivky v arbitrárních jednotkách na mililitr (AU/ml). Sestrojte standardní křivku [OD = funkce (AU/ml)] vynesením hodnot OD kalibrátorů R3, R4a, R4b, R4c a R4d na vertikální (Y) osu a poté vynesením jejich příslušných koncentrací v AU/ml na horizontální (X) osu. Pro každý testovaný vzorek vypočtěte titr anti-CMV IgG protilátky ze sestrojené standardní křivky stanovením odpovídající koncentrace vůči naměřené OD. 8.2 Kontrola kvality Začleňte kalibrátor a kontroly pro každou mikrodestičku a pro každý cyklus a analyzujte získané výsledky. Pro validaci analýzy musí být splněna následující kritéria: ●

Hodnoty optické denzity: OD R4a ≥ 0,150 OD R4b ≥ 0,300 OD R4d > OD R4c

●

Poměry optických denzit: OD R4a / OD R3 ≥ 3,50 OD R4b / OD R4a ≥ 1,50 OD R4c / OD R4b ≥ 1,500

Nejsou-li splněna kritéria kontroly kvality, musí být běh testu opakován. 8.3

Interpretace výsledků Titr anti-CMV protilátek (AU/ml)

Výsledek

Titr < 0,25 AU/ml

Negativní

0,25 AU/ml ≤ titr <0,5 AU/ml

Nejednoznačný

Titr ≥ 0,5 AU/ml

Pozitivní

Interpretace Negativní nebo nejednoznačný výsledek naznačuje nepřítomnost získané imunity, ale nemůže vyloučit akutní infekci. Je-li podezření na akutní infekci pacienta, měl by být testován druhý vzorek asi o dva týdny později. Pozitivní výsledek obvykle ukazuje dřívější infekci. Nemůže však být vyloučena akutní infekce, zvláště když jsou přítomné protilátky anti-CMV IgM.

Je-li podezření na akutní infekci, mohou být k potvrzení diagnózy užitečné jiné sérologické testy, jako například stanovení avidity IgG protilátek. U koncentrací vyšších než 4 AU/ml může být pozorována větší kolísání titrů. Vzorky o koncentraci vyšší než je koncentrace nejvyššího kalibrátoru standardní křivky mohou být naředěny ředicím roztokem R7, aby byl získán výsledek v rozmezí linearity testu. V tomto případě se konečná koncentrace stanoví vynásobením naměřených výsledků poměrem ředění. 8.4 Návod k řešení problémů Nevalidované nebo neopakovatelné reakce jsou často způsobeny: ● Nedostatečným promytím mikrodestičky. ● Kontaminací negativních vzorků sérem nebo plazmou s vysokým titrem protilátek. ● Kontaminací substrátového roztoku chemickými oxidačními činiteli (chlornan sodný, kovové ionty). ● Kontaminací zastavovacího roztoku.

9.

ÚČINNOST

Účinnost testu Platelia™ CMV IgG byla hodnocena na 2 pracovištích při použití celkem 1096 vzorků od těhotných žen a dárců krve.

5

9.1 Prevalence Prevalence anti-CMV IgG protilátek pomocí Platelia™ CMV IgG byla stanovena na panelu 300 vzorků od těhotných žen z oblasti Paříže (Francie). 145 vzorků bylo pozitivních na anti-CMV IgG protilátky. Prevalence měřená testem Platelia™ CMV IgG je stanovena na 48,3% (145/300). 9.2 Specificita Relativní specificita byla odhadnuta pomocí panelu 490 vzorků ze 2 pracovišť situovaných ve Francii a rozdělených následovně: ● 61 sér od dárců krve ● 429 sér od těhotných žen Výsledky byl porovnány s těmi, které byly získány pomocí komerčního EIA testu, který je považován za referenční. Testovaná populace / pracoviště

Počet sér

Negativní

Nejednoznačné

Pozitivní

Těhotné ženy

81

81

0

0

Dárci krve

61

61

0

0

Těhotné ženy

348

348

0

0

490

490

0

0

Místo 1

Místo 2

Celkem

Specificita 100,0 % (81/81) [96,3 %-100,0 %] 100,0 % (61/61) [95,2 %-100,0 %] 100,0 % (348/348) [99,1 %-100,0 %] 100,0 % (490/490) [99,4 %-100,0 %]

[IS 95 %] = 95 % interval spolehlivosti. 9.3 Citlivost Relativní citlivost byla stanovena na panelu 606 vzorků ze 2 míst situovaných ve Francii a rozdělených následovně: ● 136 sér od dárců krve ● 470 sér od těhotných žen Výsledky byl porovnány s těmi, které byly získány pomocí komerčního EIA testu, který je považován za referenční. Testovaná populace / pracoviště

Počet sér

Negativní

Nejednoznačné

Pozitivní

Těhotné ženy

123

0

2

121

Dárci krve

136

3

1

132

Těhotné ženy

347

0

4

343

606

3

7

596

Místo 1

Místo 2

Celkem

Specificita 98,4 % (121/123) [94,2 %-99,8 %] 97,1 % (132/136) [92,6 %-99,2 %] 98,8 % (343/347) [97,1 %-99,7 %] 98,4 % (596/606) [97,0 %-99,2 %]

*Pro výpočet specificity byly nejednoznačné výsledky hodnoceny jako pozitivní. [IS 95 %] = 95 % interval spolehlivosti. 9.4 Zkřížená reaktivita Panel 103 vzorků včetně 77 vzorků pozitivních na toxoplazmózu, zarděnky, EBV, HSV, VZV, příušnice, spalničky a HIV a 26 vzorků pozitivních na revmatoidní faktor, autoprotilátky a heterofilní protilátky bylo testováno pomocí Platelia™ CMV IgG a komerčním EIA testem na screening protilátek anti-CMV IgG. Mezi těmito vzorky bylo nalezeno 37 negativních a ve shodě se soupravou EIA, která byla použita pro porovnání čímž byla potvrzena nepřítomnost potenciálních zkřížených reakcí. 9.5 Správnost ● Opakovatelnost: V průběhu stejného běhu testu byly 30-krát testovány jeden negativní a tři pozitivní vzorky pro hodnocení opakovatelnosti. U každého pozitivního vzoru k byla stanovena koncentrace (AU/ml). Výsledky pro negativní vzorek byly vyjádřeny poměrem. Průměrná koncentrace a poměr, směrodatná odchylka (SO) a variační koeficient (% VK) pro každý ze čtyř vzorků jsou v níže uvedené tabulce:

6

Přesnost během cyklu (opakovatelnost) N=32

Negativní vzorek

Průměr SO % VK

Poměr (OD vzorku/OD R4a) 0,11 0,01 6,6 %

Slabě pozitivní vzorek

Pozitivní vzorek

Silně pozitivní vzorek

Koncentrace (AU/ml) 1,87 0,10 5,1 %

3,53 0,18 5,1 %

4,78 0,30 6,3 %

● Reprodukovatelnost: K hodnocení reprodukovatelnosti byly testovány čtyři vzorky (jeden negativní a tři pozitivní) v duplikátu ve dvou cyklech za den v během 20-ti denního období. Pro každý pozitivní vzorek byla stanovena koncentrace (AU/ml). Výsledky negativního vzorku byly vyjádřeny poměrem. Průměrná koncentrace a poměr, směrodatná odchylka (SO) a variační koeficient (%VK) pro každý ze čtyř vzorků jsou v níže uvedené tabulce:

Přesnost mezi cykly (reprodukovatelnost) N=80

Negativní vzorek

Průměr SO % VK

Poměr (OD vzorku/OD R4a) 0,10 0,02 16,0 %

Slabě pozitivní vzorek

Pozitivní vzorek

Silně pozitivní vzorek

Koncentrace (AU/ml) 1,44 0,19 13,4 %

3,10 0,40 13,0 %

4,22 0,76 18,0 %

9.6 Linearita Rozmezí linearity testu Platelia™ CMV IgG bylo definováno mezi 0 a 4 AU/ml po provedení studií pomocí ředění na 5 pozitivních vzorcích.

10. OMEZENÍ TESTU Diagnóza CMV infekce může být stanovena pouze na základě kombinace klinických a biologických údajů. Výsledek jednoho testu stanovení protilátek anti-CMV IgG není dostatečný průkaz pro diagnózu akutní infekce cytomegalovirem.

11. KONTROLA KVALITY PROVÁDĚNÁ VÝROBCEM Všechny vyráběné reagencie jsou připravovány podle našeho systému kvality jakosti, počínaje převzetím surovin až po finální komercionalizaci výrobku. Každá šarže je podrobena kontrole kvality a je propouštěna na trh pouze tehdy, pokud odpovídá stanoveným kritériím. Dokumentace týkající se výroby a kontroly každé jednotlivé šarže je uchovávána u společnosti Bio-Rad.

12. LITERATURA

1. 2. 3. 4. 5. 6. 7.

Alford C.A., Stagno S., Pass R.F., Britt W.J. 1990. Congenital and perinatal cytomegalovirus infection. Rev. Infect. Dis. 12: S745-S753. Demmler G.J. 1991. Summary of a workshop on surveillance for congenital cytomegalovirus disease. Rev. Infect. Dis. 13: 315-329. Fowler K.B., Stagno S., Pass R.F., Britt W.J., Boll T.J., Alford C.A. 1990. The outcome of congenital and cytomegalovirus in relation to maternal antibody status. N. Engl. J. Med. 326: 663667. Gaytant M.A., Rours I.G., Steegers E.A., Galama J.M., Semmekrot B.A. 2003. Congenital cytomegalovirus infection after recurrent infection: case reports and review of the literature. Europ. J. Pediatr. 162: 248-253. Grangeot-Keros L., Mayaux M.J., Lebon P., and al. 1997. Value of cytomegalovirus (CMV) IgG avidity index for the diagnosis of primary CMV infection in pregnant women. J. Infect. Dis. 175: 944-946. Lazzarotto T., Guerra B., Spezzacatena P., Varani S., Gabrielli L., Pradelli P., Rumpianesi F., Banzi C., Bovicelli L., Landini M.P. 1998. Prenatal diagnosis of congenital cytomegalovirus infection. J. Clin. Microbiol. 36: 3540-3544. Macé M., Sissoef L., Rudent A., Grangeot-Keros L. 2004. A serological testing algorithm for the diagnosis of primary CMV infection in pregnant women. Prenat. Diagn. 28: 861-863.

7

8. 9. 10

Munro S.C., Hall B., Whybin L.R., Leader L., Robertson P., Maine G.T., Rawlinson W.D. 2005. Diagnosis of and screening for cytomegalovirus infection in pregnant women. J. Clin. Microbiol. 43: 4713-4718. Revello M.L., Gerna G. 2002. Diagnosis and management of human cytomegalovirus infection in the mother, fetus and newborn infant. Clin. Microbiol. Rev. 15: 680-715. Stagno S., Pass R.F., Dworsky M.E., and al. 1982. Congenital cytomegalovirus infection: the relative importance of primary and recurrent maternal infections. N. Engl. J. Med. 306: 945-949.

8

9

1.

Bio-Rad 3, boulevard Raymond Poincare 92430 Marnes-la-Coquette - France Tel. : +33 (0) 1 47 95 60 00 Fax : +33 (0) 1 47 41 91 33 www.bio-rad.com

2013/11 881140

10