PLATELIA™ TOXO IgG TMB 96 TESZT
72741
REAGENSKÉSZLET ANTI-TOXOPLASMA GONDII IgG KVALITATÍV, VAGY KVANTITATÍV KIMUTATÁSÁRA HUMÁN SZÉRUMBÓL, VAGY PLAZMÁBÓL ENZIM IMMUNASSAY MÓDSZERREL
In vitro diagnosztikai felhasználásra
A Bio-Rad által gyártott és forgalomba hozott minden termék átfogó minőségbiztosítási rendszerünk szerint készült, a nyersanyag átvételétől kezdve a termék forgalmazásáig. Minden egyes gyártási sorozat minőségét ellenőrizzük, és csak akkor hozzuk forgalomba, ha az megfelel az előre felállított kritériumoknak. Minden sorozat gyártási és minőségellenőrzési jegyzőkönyve megtalálható a Bio-Radnál.
TARTALOMJEGYZÉK
1-
FELHASZNÁLÁS
3
2-
KLINIKAI JELENTŐSÉG
3
3-
ALAPELV
3
4-
CSOMAGOLÁS
4
5-
KEZELÉSI ELŐÍRÁSOK
5
6-
SZÜKSÉGES, DE NEM SZÁLLÍTOTT ESZKÖZÖK
6
7-
A REAGENSEK ELKÉSZÍTÉSE ÉS TÁROLÁSA
7
8-
MINTAVÉTEL, ELŐKÉSZÍTÉS, ÉS TÁROLÁS
7
9-
HASZNÁLATI ÚTMUTATÓ
8
10- SZÁMÍTÁSOK ÉS AZ EREDMÉNYEK KIÉRTÉKELÉSE
9
11- A TESZT TELJESÍTMÉNYE ÉS AZ ALKALMAZÁS KORLÁTAI
11
12- HIVATKOZÁSOK
14
AZ ELJÁRÁS ÖSSZEFOGLALÁSA
15
2
1-
FELHASZNÁLÁS A Platelia™ Toxo IgG TMB in vitro diagnosztikai reagenskészlet a humán szérumban vagy plazmában jelenlevő anti-Toxoplasma gondii IgG kvalitatív és kvantitatív kimutatására.
2-
KLINIKAI JELENTŐSÉG A T. gondii egy protozoon, amely sok emlős és madárfajt megfertőz. Az állatokban és az emberekben egyaránt gyakori toxoplazmózis általában látens. A populáció fertőzöttsége a szerológiai vizsgálatok alapján országtól és korcsoporttól függően változik. A terhesség alatti toxoplazmózis szerepet játszik súlyos veleszületett rendellenességek kialakulásában (különösen a csökkent agyfunkcióéban), s olykor a halvaszületésben is. Amennyiben a fogamzás előtt Toxo IgG ellenanyag mutatható ki az asszonyok szervezetében, akkor nyugodtak lehetünk afelől, hogy a magzat védett a terhesség alatt esetleg bekövetkező toxoplazmózistól. A súlyos toxoplazmózisos fertőzésre való hajlam meglehetősen általános a szerzett immunhiányos tünetegyüttesben (AIDS) szenvedők körében, vagy a más okból immunhiányos betegek között. Ezek a fertőzések zömében a szervezetben található T. gondii ciszták HIV-fertőzés előtti reaktiválódásának tulajdoníthatók. A T. gondii fertőzés specifikus kimutatása nehéz lehet, és a parazita ritkán izolálható. A T. gondii antitest jelenlétének szerológiai igazolása arra utal, hogy a betegben jelen van a parazita. Ezt a vizsgálat módszer az immunstátusz és a fertőzésre való fogékonyság meghatározásának széles körben elfogadott eszköze. Az ellenanyagok többféle izotípusára történő szűrés egyrészt lehetővé teszi a T. gondii fertőzés időpontjának megállapítását, és a közelmúltban bekövetkezett fertőzés esetében megkezdhető a megfelelő terápia. A fertőzés megelőzésére a terhes asszonyokat étkezési higiéniai tanácsokkal kell ellátni, az immunhiányos betegeknél kemoprofilaxis alkalmazható.
3-
ALAPELV A módszer alapja szilárd fázisú indirekt enzim-immunoassay (ELISA) technika., A mikrolemez bevonása membránfehérjékkel dúsított, ultrahanggal feltárt tachyzoite T. gondii antigénnel történt. A konjugát peroxidázzal jelölt, humán gamma láncokra specifikus monoklonális antitest. Első lépés A hígított mintákat bemérjük a mikrolemez T. gondii antigénekkel bevont tesztlyukaiba. Az 1 órán át tartó, 37°C-os inkubálás során a mintában jelenlévő T. gondii antitestek hozzákötődnek a mikrolemez tesztlyukak falához kötött T. gondii antigénekhez. Inkubálás után többszöri mosással távolítjuk el a szabadon maradt antitesteket és a többi szérumfehérjét. Második lépés Peroxidázzal jelölt, humán gamma láncokra specifikus monoklonális antitesteket, konjugátot mérünk be a tesztlyukakba. Egy második, ugyancsak 1 órán át tartó, 37°C-os inkubálás során a jelölt monoklonális antitestek hozzákötődnek a tesztlyukak falához rögzült IgG antitest - T. gondii antigén komplexekhez. A szabadon maradt konjugátot többszöri mosással távolítjuk el. 3
Harmadik lépés Az immunkomplex (T. gondii Ag - anti-T. gondii IgG - anti-IgG konjugát) jelenlétét úgy mutatjuk ki, hogy a peroxidáz szubsztrátját, valamint színreakciót létrehozó kromogént tartalmazó oldatot adunk hozzá. Negyedik lépés Félórás, szobahőmérsékleten történő inkubálás után az enzimreakciót 1 N kénsav (H2SO4) hozzáadásával állítjuk le. Az optikai denzitást spektrofotométerrel 450/620 nm-en olvassuk le. A kapott érték arányos a mintában található T. gondii IgG antitest mennyiségével. Az OD-t standard görbe segítségével számítjuk át IU/ml-re. A kalibráló szérumok (R4a, R4b, R4c) kalibrálása a WHO standardra történt (TOXM 185).
4-
CSOMAGOLÁS Minden reagens kizárólag in vitro diagnosztikai célokra használható. Címke Reagens Mennyiség Mikrolemez: 12 db, egyenként 8, letörthető tesztlyukas 1 lemez R1 Mikrolemez csík, T. gondii antigénekkel (RH törzs) érzékenyítve. Tömény mosóoldat (10x): TRIS-NaCl puffer (pH: 7.4), 1 üveg R2 Tömény 100 ml mosóoldat 1% Tween®20. Tartósítószer: 0.01% Thimerosal. 1 fiola Kalibráló 0: anti-T. gondii antitestre negatív, humán R3 Kalibráló 0 1 ml immunhiány vírus (HIV1 és HIV2) elleni antitestekre, HBs antigénre és hepatitis C (HCV) antitestre negatív humán szérum. Tartósítószer: < 0.01% Thimerosal. 1 fiola R4a Kalibráló 6 Kalibráló 6 IU/ml: TRIS-NaCl puffer (pH: 8 ± 0.2), anti1 ml T. gondii antitestekre pozitív, humán immunhiány vírus (HIV1 és HIV2) antitestekre, HBs antigénre és hepatitis C (HCV) antitestre nem reagáló humán szérum, borjú szérumalbumin, E 102 és E 122 glicerin. Tartósítószer: < 0.01% Thimerosal és < 0.5% Proclin®300. 1 fiola R4b Kalibráló 60 Kalibráló 60 IU/ml: TRIS-NaCl puffer (pH: 8 ± 0.2), 1 ml anti-T. gondii antitestekre pozitív, humán immunhiány vírus (HIV1 és HIV2) antitestekre, HBs antigénre és hepatitis C (HCV) antitestre nem reagáló humán szérum, borjú szérumalbumin, E 102 és E 122 glicerin. Tartósítószer: < 0.01% Thimerosal és < 0.5% Proclin®300. 1 fiola R4c Kalibráló 240 Kalibráló 240 IU/ml: TRIS-NaCl puffer (pH: 8 ± 0.2), 1 ml anti-T. gondii antitestekre pozitív, humán immunhiány vírus (HIV1 és HIV2) antitestekre, HBs antigénre és hepatitis C (HCV) antitestre nem reagáló humán szérum, borjú szérumalbumin, E 102 és E 122 glicerin. Tartósítószer: < 0.01% Thimerosal és < 0.5% Proclin®300. 4
Konjugát: torma peroxidázzal jelölt, humán gamma láncok elleni egér monoklonális antitest. Tömény (50x). Minta- vagy konjugát hígító: TRIS-NaCl puffer (pH: R7 Hígító 7.7 ± 0.15), borjú szérumalbumin, 1% Tween®20 és fenolvörös. Tartósítószer: < 0.01% Thimerosal. R8 TMB szubsztrát Szubsztrát puffer: 0.015% hidrogénperoxidot és 4% dimetilszulfoxidot (DMSO) tartalmazó, pH 4.0 citromsav puffer és nátrium-acetát oldat. Kromogén: tetrametil-benzidint (TMB) tartalmazó oldat. R9 Kromogén: TMB oldat Leállító oldat: 1.5 N kénsav R10 Leállító oldat
R6
Konjugát (50x)
Öntapadó fólia
5-
1 fiola 0.6 ml 2 üveg 80 ml
1 üveg 60 ml 1 üveg 5 ml 1 üveg 28 ml 4
KEZELÉSI ELŐÍRÁSOK Az eredmények minősége azon múlik, hogy betartjuk-e a GLP ajánlásokat. • Ne használjunk lejárt szavatosságú reagenseket. • Azonos vizsgálaton belül ne használjuk különböző gyártási számú kitek reagenseit. Megjegyzés: az alábbi reagensek esetében a kitben levőtől eltérő gyártási számú reagensek is használhatók, de egy vizsgálaton belül azonos sorozatba tartozó terméket kell használni: mosófolyadék (R2, címke felirata: 10x, kék színű), kromogén (R9, címke felirata: TMB oldat, zöld színű) leállító oldat (R10. címke felirata: 1 N, piros színű). Ezek a reagensek néhány más termékünkhez is használhatók. Részletes felvilágosításért forduljanak műszaki szolgálatunkhoz. • Használatbavétel előtt várjunk 30 percet, hogy a reagensek fölvegyék a szobahőmérsékletet. • Figyelmesen oldjuk fel vagy hígítsuk a reagenseket, hogy azok ne szennyeződjenek. • Ne végezzük a vizsgálatot agresszív gőzök (savas, lúgos, aldehid) vagy por jelenlétében, mert megváltoztathatja a konjugát enzimaktivitását. • Alaposan elmosott és ionmentes vízzel öblített üvegárut, vagy egyszerhasználatos eszközöket használjunk. • Ne hagyjuk beszáradni a mikrolemezt a mosás után, a reagensek adagolása előtt. • Az enzimreakció nagyon érzékeny a fémionokra. Ezért vigyázzunk, hogy fémes eszköz ne érintkezhessen a konjugát és szubsztrát oldatokkal. • Az előhívó oldatnak (szubsztrát puffer + kromogén) színtelennek kell lennie. Ha a hígítás utáni percekben kék szín jelenik meg, akkor a reagens nem használható, azt ki kell cserélni. Az előhívó oldat elkészítéséhez tiszta egyszerhasználatos műanyag edényt, vagy olyan üvegedényt használjunk, amelyet előzőleg 1 N sósavval mostunk át és desztillált vízzel alaposan kiöblítettünk, majd megszárítottunk. Ezt az oldatot fénytől védve kell tárolni. • Minden újabb mintához új pipettahegyet használjunk. • A műveletsorozat igen fontos része a tesztlyukak mosása. Nagyon figyeljünk oda, hogy meglegyen a kellő számú mosás, s gondoskodjunk arról, hogy minden tesztlyuk teljesen fel legyen töltve, illetve teljesen ki legyen ürítve. A helytelen mosás pontatlan eredményekhez vezethet. 5
• • •
Sohase használjuk ugyanazt a tartályt a konjugát és az előhívó oldat adagolásához. Ellenőrizzük a pipetták és egyéb berendezések pontosságát és működését. Ne változtassunk az előírt műveleteken.
MUNKAVÉDELMI ELŐÍRÁSOK Minden reagens kizárólag in vitro diagnosztikai felhasználásra alkalmas. • A reagensek és a minták kezelésekor viseljünk egyszerhasználatos védőkesztyűt. • Ne pipettázzunk szájjal. • A reagensek előkészítéséhez használt humán eredetű anyagokat bevizsgálták, és negatívnak találták a hepatitis B vírus felületi antigénjére (HbsAg), a hepatitis C vírus elleni (anti-HCV) antitestekre és a humán immunhiányos tünetegyüttest okozó vírus elleni antitestekre (anti-HIV1 és anti-HIV2). Mivel azonban egyetlen módszer sem zárja ki tökéletesen a fertőző ágensek jelenlétét a reagensekben, továbbá minden betegmintát is potenciálisan fertőzőnek kell tekinteni, ezért mindent a szokásos elővigyázattal kell kezelni. • A mintákkal és a humán eredetű reagensekkel közvetlen érintkezésbe került összes eszközt, valamint mosófolyadékot tekintsük fertőzőnek. • Ügyeljünk arra, hogy a minták, vagy a mintákat tartalmazó oldatok ne ömöljenek ki. • Az elszennyeződött felületeket 10%-os hypoval kell megtisztítani. Ha a szennyező folyadék savas kémhatású, akkor először nátrium-bikarbonáttal semlegesítsük a felületet, majd hypoval tisztítsuk meg, és szűrőpapírral szárítsuk fel. A tisztításhoz felhasznált eszközöket speciális, szennyeshulladék-gyűjtő tartályba kell dobni. • Fertőtlenítés után az alábbi módszerekkel ártalmatlanítsuk a mintákat, a humán eredetű reagenseket és az ezellel érintkezésbe került eszközöket és anyagokat: - áztassuk 30 percre fertőtlenítő oldatba úgy, hogy a végső koncentráció 5%-os legyen a nátrium-hipokloritra nézve, - vagy autoklávban sterilezzük 121°C-on legalább 2 óráig. A HIV vírusok és a HB vírusok inaktiválására a legjobb módszer, ha legalább 1 órán át sterilezzük autoklávban 121°C-on. VIGYÁZAT: NÁTRIUM-HIPOKLORITOT TARTALMAZÓ OLDATOT NE TEGYÜNK AUTOKLÁVBA. VIGYÁZAT: Egyes reagensekben található: • Proclin™ 300 < 0.5%: IRRITÁLÓ ANYAG R43 : Bőrre kerülve anaphylaxiás reakciót okozhat. S28-37 : Ha bőrre került, azonnal mossuk le bő vízzel és szappannal. Viseljünk megfelelő védőkesztyűt. • •
A vegyszereket a GLP ajánlásai szerint kell kezelni és ártalmatlanítani. Vigyázzunk, hogy a szubsztrát puffer, a kromogén és a leállító oldat ne kerüljön bőrre és a nyálkahártyákra (mérgezést, irritációt és égési sérüléseket okozhat). Kérésre a biztonságtechnikai adatlapokat megküldjük.
6-
SZÜKSÉGES, DE NEM SZÁLLÍTOTT ESZKÖZÖK • •
Vortex keverő. Mikrolemez leolvasó 450/620 nm-es szűrővel (*). 6
• • • • • • • • • • •
Mikrolemez-inkubátor (*) vagy termosztált vízfürdő, 37±1°C-os (*). Biológiailag veszélyes hulladék gyűjtő tartály. Nátrium-hipoklorit (hypo) és nátrium-bikarbonát. Desztillált, vagy ionmentes víz. 25, 50, 100 és 1000 ml-es osztott mérőhenger. Egyszerhasználatos latex kesztyű Védőszemüveg. Szűrőpapír. Automata vagy félautomata, állítható vagy fix pipetták vagy többcsatornás pipetták 10 1000 µl, és 1, 2 és 10 ml kiméréséhez és adagolásához. Automata, félautomata vagy kézi mikrolemez mosó rendszer (*). Egyszerhasználatos kémcsövek.
(*) A műszaki osztályunk által elfogadott készülékek tárgyában forduljon hozzánk a részletes felvilágosításért.
7-
A REAGENSEK ELKÉSZÍTÉSE ÉS TÁROLÁSA A kitet +2 - 8°C között kell tárolni a csomagoláson feltüntetett szavatossági ideig. Megjegyzés: felhasználás előtt hagyjuk, hogy a reagensek felvegyék a szobahőmérsékletet (+18-30°C). 1) Felhasználásra kész reagensek •
R1 reagens: mikrolemez. Minden kerethez 12 db, egyenként 8 darab letörhető tesztlyukat tartalmazó tesztcsík tartozik. Minden keret a tesztcsíkjaival együtt hegesztett fóliába van csomagolva. Ollóval vagy szikével nyissuk fel a csomagolást 0.5 -1 cm-rel a vonal fölött. A fel nem használt tesztcsíkokat azonnal tegyük vissza a zacskóba. Gondosan zárjuk vissza a zacskót, és tegyük +2 - 8°C-os hőmérsékletű helyre. Így a csíkok még 1 hónapig stabilak maradnak. • R3 reagens, R4a, R4b, R4c reagens, R10 Reagens: Felnyitás után a +2 - 8°C között, szennyeződéstől védve tárolt reagensek a címkén feltüntetett szavatossági ideig stabilak. 2) Hígítandó reagensek • R2 reagens: 10x töménységű mosóoldat. 1:10 arányban hígítsuk az oldatot desztillált vízzel, s így megkapjuk a felhasználásra kész oldatot (R2d). Kézi mosáskor egy 12-csíkos lemezhez készítsünk 350 ml-t. Hígítás után a mosófolyadékot két hétig tárolhatjuk +2 8°C között. A tömény mosóoldat +2 - 25°C között tárolható. • Konjugát oldat: R6 reagens + R7 reagens. Egy teljes mikrolemezhez szükséges hígított konjugát (R6d) készítéséhez adjunk 0.5 ml tömény (50x) konjugátot 25 ml hígítóhoz (R7). Alaposan keverjük össze. Ennek a térfogatnak a tizedrészét készítsük el egy nyolclyukas csíkhoz. A méréshez előkészített konjugátot (R6d) az előállításától számított 60 percen belül használjuk fel. • Enzim előhívó oldat: R8 reagens + R9 reagens. 1:11 arányban hígítsuk az R9 kromogént az R8 szubsztrát pufferrel (például 1 ml R9 reagens + 10 ml R8 reagens). Az így kihigított reagens még 6 órán át tárolható fénytől védve, szobahőmérsékleten (1830°C).
8-
MINTAVÉTEL, ELŐKÉSZÍTÉS, ÉS TÁROLÁS 1. Az ajánlott minta szérum vagy plazma (EDTA, citrát és heparin). 7
2. A vérminták kezelésekor, feldolgozásakor és tárolásakor tartsuk be az alábbi ajánlásokat: • A rutineljárás szerint vegyük le vénás vérmintákat. • Szérummintánál centrifugálás előtt hagyjuk teljesen megalvadni a vért. • A csöveket mindig tartsuk lezárva. • Centrifugálás után válasszuk el a szérumot vagy a plazmát az alvadt résztől vagy a vörösvérsejtektől és tároljuk szorosan lezárt kémcsőben. • Ha a vizsgálatot 7 napon belül elvégezzük, akkor a minták +2 - 8°C között tárolhatók. • Ha a vizsgálatot nem tudjuk 7 napon belül elvégezni, vagy a mintákat szállítani kell, fagyasszuk le -20°C-on, vagy alacsonyabb hőmérsékleten. • A fagyasztott mintákat legfeljebb háromszor olvsszuk fel. • A korábban lefagyasztott mintákat a felolvasztás után , és a vizsgálat előtt alaposan fel kell keverni. 3. A 90 g/l albumint, 100 mg/l bilirubint, 36 g/l trioleinnek (triglicerid) megfelelő lipidet tartalmazó lipémiás, és max. 10 g/l hemoglobint tartalmazó hemolizált minták nem befolyásolják az eredményt. 4. Ne melegítsük a mintákat.
9-
HASZNÁLATI ÚTMUTATÓ Szigorúan tartsuk magunkat a javasolt tesztprotokollhoz. Minden futtatáshoz használjuk a kalibráló szérumokat, hogy az eredmények érvényesek legyenek. Igazodjunk a GLP-hez. 1. Gondosan készítsük el a a minták pipettázási listáját. 2. Készítsük el a hígított mosófolyadékot (R2d) (l. 7. fejezet). 3. Vegyük ki a keretet és a csíkokat (R1) a védőcsomagolásból. 4. Mossuk át egyszer a csíkokat a hígított mosófolyadékkal (R2d). Fordítsuk le szűrőpapírra a lemezt és finoman kocogtassuk, hogy az összes mosófolyadékot eltávolítsuk. 5. Hígítsuk a vizsgálandó szérumokat: adjunk 10 µl mintát 1 ml hígítóhoz (R7). A 0, 6, 60 és 240 IU/ml-es kalibráló szérumokból (R3, R4a, R4b, R4c) ugyanígy készítsünk 1:101 hígítást. Vortex keverővel keverjük át a mintákat. 6. Kézi bemérésnél mérjünk be 200 µl hígított kalibráló szérumot és betegszérumot a tesztlyukakba az alábbiak szerint: - A1: 200 µl 0 IU/ml-es kalibráló szérum (R3) 1:101 hígításban. - B1: 200 µl 6 IU/ml-es kalibráló szérum (R4a) 1:101 hígításban. - C1: 200 µl 60 IU/ml-es kalibráló szérum (R4b) 1:101 hígításban. - D1: 200 µl 240 IU/ml-es kalibráló szérum (R4c) 1:101 hígításban. - E1, F1, G1 stb.: 200µl minta 1:101 hígításban. 7. Ha lehetséges, fedjük le öntapadó fóliával a mikrolemezt, óvatosan rányomogatva a fóliát az egész felületre, hogy szorosan zárjon. Inkubáljuk a vízfürdőben vagy egy száraz mikrolemez inkubátorban 1 óra ± 5 percig 37±1°C-on. 8. Készítsük el a hígított konjugátot (R6d) 15 perccel az első inkubálási idő vége előtt. 1 mikrolemezhez hígítsunk fel 0.5 ml 50x töménységű konjugátot (R6) 25 ml hígítóval (R7). Alaposan keverjük össze (l. 7. fejezet). 9. Vegyük le az öntapadó fóliát, szívassuk ki a tesztlyukakból azok tartalmát és ürítsük ki egy (nátrium-hipokloritot tartalmazó) szennyesgyűjtő tartályba, majd mossunk 3-szor a hígított mosófolyadékkal (R2d). Fordítsuk le szűrőpapírra a lemezt és finoman kocogtassuk, hogy az összes mosófolyadékot eltávolítsuk a tesztlyukakból (l. 10. fejezet). 8
10. Azonnal mérjünk 200 µl hígított (R6d) konjugátot minden tesztlyukba. Az oldatot felhasználás előtt finoman rázzuk fel. 11. Fedjük le öntapadó fóliával a mikrolemezt, óvatosan rányomogatva a fóliát az egész felületre, hogy szorosan zárjon. Inkubáljuk a vízfürdőben vagy egy száraz mikrolemez inkubátorban 1 óra ± 5 percig 37±1°C-on. 12. Vegyük le az öntapadó fóliát, szívjuk föl a tesztlyukakból azok tartalmát, majd mossuk 4szer a fentiek szerint. Fordítsuk le szűrőpapírra a lemezt és finoman kocogtassuk, hogy az összes mosófolyadékot eltávolítsuk. 13. Azonnal és gyorsan mérjünk be 200 µl homogenizált enzim előhívó oldatot (R8 + R9) minden tesztlyukba. Hagyjuk sötétben és szobahőmérsékleten (18-30°C) 30 percig, hogy lejátszódjék a reakció. Ennél a műveletnél ne rakjunk rá öntapadó fóliát. 14. Állítsuk le az enzimes reakciót: mérjünk be 100 µl leállító oldatot (R10) minden tesztlyukba. Ugyanabban a sorrendben és adagolási sebességgel dolgozzunk, mint az előhívó oldatnál. 15. Óvatosan töröljük le a lemez alját. 450/620 nm-en olvassuk le az optikai denzitást egy lemezleolvasó fotométerrel a reakció leállításától számított 30 percen belül (a leolvasásig óvjuk a tesztcsíkokat a fénytől). 16. Az eredmények kiszámítása előtt ellenőrizzük, hogy a leolvasás eredménye egyezik-e a pipettázási listával.
10- SZÁMÍTÁSOK ÉS AZ EREDMÉNYEK KIÉRTÉKELÉSE 1) A kalibráció részletes ismertetése A T. gondii ellen termelt IgG antitestek jelenlétét és mennyiségét a mintában úgy határozzuk meg, hogy összehasonlítjuk a minta optikai denzitását (OD) a standard tartománnyal. A kittel szállított 6, 60, és 240 IU/ml-es kalibráló szérumokat a WHO standard szérumra kalibráltuk (TOX M 185). Ennek ellenére ugyanazt a mintát különböző szerológiai módszerekkel vizsgálva a titerekben eltérés folrdulhat elő. Ez annak tulajdonítható, hogy a különböző módszerekben alkalmazott T. gondii-ban más-más arányban található az oldódó membrán antigén. 2) Minőségellenőrzés Minden vizsgálathoz használjuk az összes kalibráló szérumot. Az érvényesség megállapításához az alábbi kritériumoknak kell teljesülniük: • Optikai denzitás: - R3 OD ≤ 0.200 - R4c OD ≥ 1,000 • Arány: OD R4a / OD R3 ≥ 2 Ha az eredmények a feltételeket nem elégítik ki, akkor a vizsgálatot meg kell ismételni. 3) A standard görbe felvétele a) A standard görbe felrajzolása Ha magunk számítjuk ki az adatokat, használjunk lineáris léptékű milliméterpapírt. A kalibráló szérumok (R3, R4a, R4b és R4c) OD értékeit a függőleges (y) tengelyen, az ezeknek megfelelő koncentrációkat IU/ml-ben pedig a vízszintes (x) tengelyen vegyük föl. Rajzoljuk be a négy ponthoz legjobban illeszkedő görbét. b) A koncentráció kiszámítása IU/ml-ben Ha a betegminta OD értéke az R4a és R4c OD értéke közé esik, akkor keressük meg az ytengelyen a minta OD értékének megfelelő pontot és húzzunk vízszintes vonalat a kalibrációs 9
görbéig. Ahol az metszi a görbét, onnan húzzunk függőlegesen egy egyenest az x-tengelyig. Az x-tengelynél kapott metszési pontnál olvassuk le a koncentrációt IU/ml-ben. Megjegyzés: Ha az 1:101 arányban hígított minta OD értéke nagyobb az R4c OD értékénél, akkor ezt a mintát 1:1010 arányban kell hígítani az R7 hígítóval, és újra kell mérni. Az így kapott IU/ml értéket ezután 10-zel be kell szorozni. 4) Az eredmények kiértékelése Az anti-T. gondii IgG Platelia™ Toxo IgG TMB-vel történő kimutatásával meg llapítható a betegek immunstátusza. • Titer < 6 IU/ml Ezzel a technikával mérve nem szignifikáns ellenanyagszint = nincs immunitás. • 6 IU/ml ≤ titer ≤ 9 IU/ml Ezzel a technikával mérve nem szignifikáns ellenanyagszint = egyetlen szérummintával kapott eredmény még nem elégséges ahhoz, hogy megállapíthassuk a beteg immunstátuszát a T. gondii-ra nézve. A franciaországban érvényes ajánlások szerint egy második mintát is meg kell vizsgálni, két különböző technikával is. • 9 IU/ml < titer ≤ 240 IU/ml Szignifikáns ellenanyagszint = régóta fennálló immunitás, vagy szerokonverzió korai fázisa. • Titer > 240 IU/ml Magas ellenanyagszint = közelmúltban bekövetkezett szerokonverzió, vagy állandóan magas immunitás, amely egyes alanyokban megfigyelhető. • Az alkalmazás korlátai A parazita okozta, közelmúltban bekövetkezett fertőzést csak a klinikai és a szerológiai adatok együttes figyelembevételével lehet megállapítani. Egyetlen szérummintával kapott eredmény nem elegendő bizonyíték a közelmúltbeli fertőzés diagnózisának felállításához. A friss fertőzés megállapításához az szükséges, hogy egy vizsgálaton belül szignifikáns növekedéset tapasztaljunk két, legalább három hét időkülönbséggel levett szérumminta anti-T. gondii IgG antitest titere között. Bár ezt inkább a parazita okozta közelmúltbeli fertőzésnek kell tekinteni. A T. gondii ellen termelődő IgM antitest jelenlétét is a gyaníthatóan T. gondii fertőzésben szenvedő egyének szerológiai megfigyelésén belül kell értelmeznünk, mivel az anti-T. gondii IgG ellenanyag kissé később jelenhet meg, mint az anti-T. gondii IgM antitest. 5) Hibaforrások Az érvénytelen, vagy megismételhetetlen reakciókat gyakran az alábbiak okozzák: • A mikrolemez mosása nem megfelelő. • A negatív minták magas antitest titerrel rendelkező szérummal vagy plazmával szennyeződtek. • Az előhívó oldat oxidálószerekkel (hypo, fémionok…) szennyeződött. • A leállító oldat elszennyeződött. 6) Számítási példa Megjegyzés: Az alábbi adatokat csak példaként soroljuk fel, és nem használhatók fel mérési eredményként. •
Eredmények Tesztlyuk tartalma R3 (negatív) R4a R4b R4c
OD (450/620 nm) 0.121 0.615 1.466 2.099
Koncentráció (IU/ml) 0 6 60 240 10
1. szérum (1:101 hígítás) 0.108 2. szérum (1:101 hígítás) 0.675 3. szérum (1:101 hígítás) 0.808 4. szérum (1:101 hígítás) 2.080 5. szérum (1:101 hígítás) 1.283 * Az 1:1010 hígításnál a végső koncentráció = IU/ml x 10. •
Negatív 7 IU/ml 12 IU/ml 231 IU/ml 43 IU/ml
A teszt érvényességének megállapítása - Optikai denzitási értékek - R3 OD ≤ 0.200 - R4c OD ≥ 1.000
- Arány R4a OD / R3 OD ≥ 2
11- A TESZT TELJESÍTMÉNYE ÉS AZ ALKALMAZÁS KORLÁTAI A megbízhatósági vizsgálatokat száraz csőbe, szérum leválasztóval kezelt csőbe, alvadást elősegítő szerrel, vagy különböző véralvadásgátlókkal (EDTA, heparin és citrát) kezelt csőbe vett szérummintákkal végezték el. 1. Megbízhatóság A Platelia™ Toxo IgG TMB alábbiakban összefoglalt megbízhatósági jellemzőit terhes asszonyoktól, immundepresszált betegektől vagy véradóktól származó friss szérummintákkal, valamint ismert pozitív vagy negatív fagyasztott szérummintákkal állapították meg. • Összehasonlító vizsgálatok Terhes asszonyoktól származó, véletlenszerűen kiválasztott, összesen 787 mintát dolgoztak fel a Platelia™ Toxo IgG TMB-vel és más, a kereskedelmi forgalomban kapható EIA teszttel. Direkt agglutinációs vizsgálattal döntöttek az eltérések esetében. A relatív specificitást és érzékenységet, valamint a relatív egyezést célzó számításokból 23 db kétes eredményt produkáló mintát kiejtettünk. Eredmény Más EIA teszt Negatív Pozitív Összesen Relatív specificitás Relatív érzékenység Relatív egyezés
Platelia™ Toxo IgG TMB Negatív 488 5 493
Pozitív 0 271 271
Összesen 488 276 764
A prospektív vizsgálat eredményei (1. helyszín) 488/488 100% (99,0 – 100.0) 271/276 98,2% (95,6 – 99,3) 759/764 99,3% (98,8 – 99,9)
• Specificitási vizsgálatok A Platelia™ Toxo IgG TMB specificitási vizsgálatait két független helyszínen végezték el. A szérumok besorolásához szükséges módszerek kereskedelmi forgalomban kapható EIA tesztek voltak. Az eljárás specificitását ezeknek a méréseknek az alapján állapították meg. Az eltérő eredmények esetében direkt agglutinációs módszerrel döntöttek. A kétes eredményeket kiejtettük az alábbi specificitási számításokból: 11
-
1. helyszín: 2. helyszín: Összesen:
99,8% (403/404) 100% (488/488) 99,9% (891/892)
• Érzékenységi vizsgálatok A Platelia™ Toxo IgG TMB érzékenységi vizsgálatait két független helyszínen végezték el. A szérumok besorolásához szükséges módszerek kereskedelmi forgalomban kapható EIA assay-k voltak. Az eljárás specificitását ezeknek a méréseknek az alapján állapították meg. Az eltérő eredmények esetében direkt agglutinációs módszerrel döntöttek. A kétes eredményeket kiejtettük az alábbi érzékenységi számításokból: - 1. helyszín: 100% (196/196) - 2. helyszín: 98,2% (271/276) Összesen: 98,9% (467/472) A szerokonverziós (1. és 2. helyszín) vagy a posztinfekciós (1. helyszín) panelek az alábbiakból álltak: • 33 terhes asszonytól származó 84 szérumminta (1. helyszín), • 14 terhes asszonytól származó 48 szérumminta (2. helyszín). Ezeket a paneleket vizsgálták a Platelia™ Toxo IgG TMB-vel. A szérumok besorolásához szükséges módszerek kereskedelmi forgalomban kapható EIA tesztek voltak. Az eltérő eredmények esetében direkt agglutinációs módszerrel döntöttek. Az 1. helyszínen 5 esetben a Platelia™ Toxo IgG TMB korábban adott pozitív eredményt, mint a másik EIA teszt. A 2. helyszínen egy másik, az 1. helyszínen használttól eltérő EIA teszt 6 esetben korábban produkált pozitív eredményt, mint a Platelia™ Toxo IgG TMB. • Elterjedtség Az anti-T. gondii IgG antitest pozitivitás elterjedtsége nagyon eltér egymástól a különböző országokban. A párizsi régióban (Franciaország) a pozitív esetek aránya 67,6% a feltehetően egészséges véradók körében:
12
2. Pontosság •
Teszten belüli ismételhetőség:
3 pozitív és 1 negatív mintát mértek le 30-szor ugyanazon vizsgálati sorozatban Minta Negatív Pozitív 1 Pozitív 2 Pozitív 3 Arány Titer IU/ml-ben Átlagérték 0.25 11 38 110 Standard 0.02 0.83 1.35 9.53 deviáció Variációs 6.29 7.57 3.55 8.64 koefficiens •
Tesztek közötti ismételhetőség: 3 pozitív és 1 negatív mintát mért le két technikus 5 különböző napon. Minta Negatív Pozitív 1 Pozitív 2 Arány Titer IU/ml-ben Átlagérték 0.22 11.8 39.2 Standard 0.08 1.65 5.14 deviáció Variációs 34.11 13.90 13.10 koefficiens
Pozitív 3 127.5 14.13 11.08
3. Zavaró tényezők Az alábbi, nem specifikus reakciókat okozni képes jellemzőkkel rendelkező 141 mintát vizsgáltak. Specificitás = 99.29% (140/141). Pozitív minta Reagált Megjegyzés második vizsgálat negatív CMV IgG 5 1 CMV IgM 5 0 VZV IgM 10 0 VZV IgG 9 0 Mumps IgG 7 0 Mumps IgM 3 0 Kanyaró IgG 7 0 Kanyaró IgM 7 0 EBV IgG 8 0 EBV IgM 9 0 Rubeola IgG 5 0 Rubeola IgM 5 0 HSV IgG 5 0 HSV IgM 5 0 HIV 15 0 Myeloma 8 0 RF 15 0 ANA 10 0 HAMA 3 0 Összesen 141 1
13
12- HIVATKOZÁSOK 1. ANDERSON S.E. and REMINGTON J.S. : The diagnosis of toxoplasmosis. Southern Med. J. 1975; 68, 1433-1443 2. BELANGER F., DEROUIN F., GRANGEOT-KEROS L., MEYER L. and the HEMOCO and SEROCO Study Groups : Incidence and risk factors of toxoplasmosis in a cohort of Human immunodeficiency virus-infected patients (1988-1995). Clinical Infectious Diseases 1999; 28, 575-581 3. BULLOCK S.L., and WALLS, K.W. : Evaluation of some of the parameters of the enzymelinked immunospecific assay. J. Inf. Dis. (Suppl.) 136: 2, S279-S285 4. DAFFOS, FORESTIER F., CAPELLA-PAVLOVSKY M., THULLIEZ P., AUFRANT C., VALENTI D. and COX L. : Prenatal management of 746 pregnancies at risk for congenital toxoplasmosis. New Eng. J. Med. 1988; 318, 271-275 5. DECOSTER A., DARCY F., CARON A., VINATIER D., HOUZE DE L’AULNOIS D., VITTU G., NIEL G., HEYER F., LECOLIER B., DELCROIX M., MONNIER J.C., DUHAMEL M. and CAPRON A. : Anti-P30 IgA antibodies as prenatal markers of congenital Toxoplasma infection. 1992; 87, 310-315 6. DEROUIN F., LEPORT C., PUEYO S., MORLAT P., LETRILLART B., CHENE G., ECOBICHON J.L., LUFT B., AUBERTIN J., HAFNER R., VILDE J.L., SALAMON R. and ANRS 005/ACTG 154 Trial Group Predictive value of Toxoplasma gondii antibody titres on the occurrence of toxoplasmic encephalitis in HIV-infected patients.AIDS 1996; 10, 1521-1527 7. DESMONTS G., COUVREUR J., THULLIEZ Ph., SAINT JOIGNY G. and COLIN J. : Sérodiagnostic de la Toxoplasmose, des méthodes simples, pour des questions précises. Le concours médical 1985; 107-03, 227-234 8. DUBEY J.P. and BEATTIE C.P. : Toxoplasmosis of animal and man. CRC Press (1988) 9. JENUM P.A., STRAY-PEDERSEN B., MELBY K.K., KAPPERUD G., WHITELAW A., ESKILD A. and ENG J. : Incidence of Toxoplasma gondii infection in 35 940 pregnant women in Norway and pregnancy outcome for infected women. J. Clin. Microbiol. 1998; 36, 2900-2906 10.JENUM P.A. and STRAY-PEDERSEN B. : Development of specific immunoglobulins G, M, and A following Toxoplasma gondii infection in pregnant women in Norway and pregnancy outcome for infected women. J. Clin. Microbiol. 1998; 36, 2907-2913 11.JENUM P.A., STRAY-PEDERSEN B. and GUNDERSEN A.G. : Improved Diagnosis of primary Toxoplasma gondii infection in early pregnancy by determination of antiToxoplasma immunoglobulin G avidity. J. Clin. Microbiol. 1997 ; 35, 1972-1977 12.LAPPALAINEN M., KOSKELA P., KOSKINIEMI M., AMMALA P., HILESMAA V., TERAMO K., RAIVIO K.O., REMINGTON J.S., HEDMAN K.: Toxoplasmosis acquired during pregnancy: improved serodiagnosis based on avidity of IgG. J. Infect. Dis. 1993; 41, 155158 13.LECOLIER B. and PUCHEU : Usefulness of IgG avidity analysis for the diagnosis of toxoplasmosis. Path. Biol. 1993; 42, 2 155-158 14.LEBECH M., JOYNSON D.H.M., SEITZ H.M. THULLIEZ P., GILBERT R.E., DUTTON G.N., OVLISEN B. and PETERSEN E., : Classification system and case definition of Toxoplasma gondii infection in immunocompetent pregnant women and their congenitally infected offspring. Eur. J. Microbiol. Infect. Dis. 1996; 15, 799-805 15.LUFT B.J. and REMINGTON J.S. : Toxoplasmic encephalitis. Clinical Infectious Diseases 1992; 15, 211- 222 14
16.NAESSENS A., HEUNINCKX W., FOULON W. and LAUWERS S. : Evaluation of seven commercially available enzyme immunoassays for immunoglobulin G and M antibody detection of Toxoplasma gondii. Immunol. Infect. Dis. 1993; 3, 258-262 17.PETITHORY J.C., REITER-OWONA I., BERTHELOT F., MILGRAM M., DE LOYE J. and PETERSEN E. : Performance of European laboratories testing serum samples for Toxoplasma gondii. Eur. J. Microbiol. Infect. Dis. 1996; 15, 45-49 18.REMINGTON J.S. and DESMONTS G. : Toxoplasmosis in infectious disease of the fetus and newborn infant. JS Remington and JO Klein, eds. WB Saunders Co., Philadelphia 1976; 191-332 19.SABIN A.B., and FELDMAN H.A. : Dyes as microchemical indicators of a new immunity phenomenon affecting a protozoan parasite (Toxoplasma), Science 1948; 108: 660 - 663 20.SANTORO F., AFCHAIN D., PIERCE J.R., CESBRON J.Y., OVLAQUE G. and CAPRON A. : Serodiagnosis of Toxoplasma infection using a purified parasite protein P30. Clin. Exp. Immunol. 1885; 62, 262-269 21.SHARMA S.D., MULLENAX J., ARAUJO F.G., ERLICH H.A. and REMINGTON J.S. : Western Blot analysis of the antigens of Toxoplasma gondii recognized by human IgM and IgG antibodies. J. Immunol. 1983; 131: 977-983 22.SULHANIAN A., NUGUES C., GARIN J.F., PELLOUX H., LONGUET P., SLIZEWICZ B. and DEROUIN F. : Serodiagnosis of toxoplasmosis in patients with acquired or reactivating toxoplasmosis and analysis of the specific IgA antibody response by ELISA, agglutination and immunoblotting. Immunol. Infect. Dis. 1993; 3, 63-69 23.SULZER A.J. and HALL EC. : Indirect fluorescent antibody tests for parasitic diseases : IV Statistical study of variation in the indirect fluorescent antibody (IFA) test for toxoplasmosis. Amer. J. Epidemiol. 1967; 86: 401-407 24.WILSON M., REMINGTON J.S., CLAVET C., VARNEY G., PRESS C., WARE D. and the FDA TOXOPLASMOSIS AD HOC WORKING group : Evaluation of six commercial kits for detection of human immunoglobulin M. antibodies to Toxoplasma gondii. J. Clin. Microbiol. 1997; 35, 3112-3115 25.WONG S.Y. and REMINGTON J.S. : Biology of Toxoplasma gondii. AIDS 1993; 7, 299316
AZ ELJÁRÁS ÖSSZEFOGLALÁSA 1. 2. 3. 4. 5. 6. A B C D E F G H
Állítsuk a inkubátor szabályozóját 37±1°C-ra. 1:11 arányban hígítsuk az R9 kromogént az R8 szubsztrát pufferrel (enzim előhívó oldat). 1:10 arányban hígítsuk az R2 10x töménységű mosóoldatot desztillált vízzel. Mossuk át 1-szer a tesztlyukakat a hígított mosófolyadékkal (R2d). Hígítsuk a kalibráló szérumokat és a mintákat 1:101 arányban R7-tel. Mérjünk be 200 µl hígított kalibráló szérumot és a mintát a tesztlyukakba az alábbi kiosztás szerint: 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 R3 M5 R4a M6 R4b M7 R4c M8 M1 M9 M2 M10 M3 M11 M4 M12 15
7. Inkubáljuk 1 órán át, 37°C-on. 8. Készítsük el a hígított konjugátot (R6+R7). 9. Szívassuk ki a folyadékot a tesztlyukakból, majd mossuk 3-szor mosófolyadékkal (R2d). 10. Mérjünk be 200 µl hígított konjugátot minden tesztlyukba. 11. Inkubáljuk 1 órán át, 37°C-on. 12. Szívassuk ki a folyadékot a tesztlyukakból, majd mossuk 4-szer mosófolyadékkal (R2d). 13. Mérjünk be 200 µl enzim előhívó oldatot (R8+R9) minden tesztlyukba. 14. Inkubáljuk 30 percig szobahőmérsékleten (+18-30°C), sötétben. 15. Mérjünk be 100 µl leállító oldatot (R10) minden tesztlyukba. 16. Olvassuk le az abszorbanciát spektrofotométerrel, 450/620 nm-en.
a
hígított
a
hígított
- CE jelzés (Európai direktíva 98/79/CE az in vitro diagnosztikai célú orvosi eszközökről) - Csak in vitro diagnosztikai felhasználásra!
- Katalógusszám
- Gyártó
- Meghatalmazott Képviselet
- Gyártási szám
- Szavatossági idő
- Tárolási hőmérsékleti határok
- Lásd a használati utasítást
A tesztleírás az Európai Direktíva által előírt egyéb idegen nyelveken a Bio-Rad helyi képviseleteinél megtalálható.
Bio-Rad 3, boulevard Raymond Poincaré 92430 Marnes-la-Coquette France Tel. : +33 (0) 1 47 95 60 00 Fax.: +33 (0) 1 47 41 91 33
0459
05/2006 code: 881002
16
