ELISA-VIDITEST anti-EBNA-1 EBV IgG OD-024 Návod k použití soupravy VÝROBCE: VIDIA spol. s r.o., Nad Safinou II č. 365, Vestec, 252 42 Jesenice, tel.: +420 261 090 565, www.vidia.cz 1. NÁZEV SOUPRAVY: ELISA-VIDITEST anti-EBNA-1 EBV IgG – ELISA souprava pro kvalitativní a semikvantitativní detekci protilátek třídy IgG proti nukleárnímu antigenu-1 (EBNA-1) viru Epsteina a Barrové (EBV) v lidském séru nebo plazmě. 2. POUŽITÍ: Souprava je určena pro diagnostiku chorob vyvolaných nebo asociovaných s EBV jako jsou infekční mononukleóza a chronická aktivní EBV infekce. Test se používá též při diagnostice Burkittova lymfomu, nasofaryngeálního karcinomu, oportunních (oligo- nebo polyklonálních) lymfomů. Najde uplatnění při komplexní charakterizaci chronického únavového syndromu a řady imunodeficientních stavů, kde bývá EBV často aktivován. 3. PRINCIP TESTU: ELISA-VIDITEST anti-EBNA-1 EBV IgG je imunoanalytický test na pevné fázi. Na povrch jamek je navázán specifický rekombinantní antigen, který představuje imunodominantní epitop EBNA-1. Jsou-li v testovaných sérech přítomny příslušné protilátky, navážou se na imobilizovaný antigen. Navázané protilátky pak v dalším kroku reagují s protilátkami proti lidskému IgG značenými křenovou peroxidázou. Množství navázaných značených protilátek se stanoví barevnou enzymatickou reakcí. Negativní séra nereagují, mírná změna v zabarvení jamek je pozadím reakce. 4. OBSAH SOUPRAVY: ELISA dvojstripy v manipulačním rámečku, potažené specifickým rekombinantním antigenem STRIPS Ag 1,3 mL Standardu A=negativní kontrolní sérum, r.t.u. 1) STA/CTRL1,3 mL Standardu D=Standard 1 (kalibrátor), r.t.u. ST D/ST 1 1,3 mL Standardu E=Standard 2 (pozitivní kontrolní sérum) r.t.u. ST E/ST 2 13 mL protilátek proti lidskému IgG značených peroxidázou (konjugát anti-IgG Px) r.t.u. CONJ 55 mL promývacího roztoku 10x konc. WASH 10x 60 mL ředicího roztoku r.t.u. DIL 13 mL chromogensubstrátového roztoku TMB r.t.u. TMB 13 mL stop roztoku r.t.u. STOP Sáček se zipem Návod k použití soupravy Certifikát kontroly kvality 1) r.t.u., ready to use (v pracovní koncentraci)
1
2 x 6 ks 2 lahvičky 2 lahvičky 2 lahvičky 2 lahvičky 2 lahvičky 2 lahvičky 2 lahvičky 2 lahvičky
Chromogensubstrátový roztok TMB r.t.u. je zaměnitelný pouze mezi soupravami ELISAVIDITEST, které obsahují TMB, a NENÍ VZÁJEMNĚ ZAMĚNITELNÝ s ostatními roztoky TMB použitými v jiných soupravách ELISA-VIDITEST TMB-O, TMB-BF. 5. POTŘEBNÝ MATERIÁL NEDODÁVANÝ SE SOUPRAVOU: Destilovaná/deionizovaná voda pro ředění promývacího roztoku, pipetovací zařízení, zařízení pro rozplňování roztoků a promývání stripů, spektrofotometr/kolorimetr. 6. PŘÍPRAVA REAGENCIÍ: a. Vytemperujte všechny složky soupravy na laboratorní teplotu. b. Těsně před vyšetřením důkladně zamíchejte vzorky vyšetřovaných sér a standardy. Testovaná séra řeďte ředicím roztokem 101x (např. 5 L séra + 500L ředicího roztoku). Kontrolní séra (standardy) neřeďte, jsou v pracovní koncentraci (r.t.u., ready to use). c. Připravte pracovní koncentraci promývacího roztoku jeho naředěním 10x ve vhodném objemu destilované/deionizované vody (např. 50 ml promývacího roztoku + 450 ml H2O). Pokud jsou v koncentrovaném roztoku krystaly soli, zahřejte ho na vodní lázni na 32 až 37oC a před naředěním dobře promíchejte. Nespotřebovaný promývací roztok v pracovní koncentraci lze skladovat 1 týden při teplotě 2 až 10oC. d. Konjugát anti-IgG Px, chromogensubstrátový roztok TMB a stop roztok neřeďte, jsou v pracovní koncentraci (r.t.u.). 7. PRACOVNÍ POSTUP: a. Stripy, vakuově zatavené s desikantem, nechte před otevřením sáčku vytemperovat na laboratorní teplotu, aby nedošlo k orosení destičky. Připravte si potřebný počet stripů pro reakci. Nepoužité stripy společně s desikantem dobře uzavřete do sáčku se zipem nebo vakuově zatavte. b. Naplňte jamky po 100 L jednotlivými kontrolními séry a ředěnými testovanými séry takto: První jamku naplňte samotným ředicím roztokem pro stanovení pozadí reakce DIL. Dále naplňte dvě jamky po 100 L Standardem D ST D/ST 1, který slouží jako kalibrátor. Další jamku negativním kontrolním sérem ST A/CTRL- a zbývající jamky naplňte ředěnými testovanými séry (S1, S2. S3, …) - viz Tab 1. Pro kontrolu je vhodné aplikovat také pozitivní kontrolní sérum ST E/ST 2. Každé sérum stačí aplikovat na jednu jamku. Pokud chcete vyloučit případnou laboratorní chybu, aplikujte ST D/ST 1 na tři jamky, vyšetřovaná a kontrolní séra aplikujte po dvou jamkách. Pro ověření správnosti kalibrace, návaznosti a variability testu doporučujeme zahrnout vzorek pozitivního referenčního séra (vaši vnitřní kontrolu) do každého běhu. Inkubujte 30 minut (+/- 2 min.) při laboratorní teplotě. c. Odsajte obsah jamek do pojistné sběrné láhve obsahující vhodný dezinfekční prostředek (viz Bezpečnostní předpisy). Jamky poté 4x promyjte 250 L promývacího roztoku. Vyvarujte se přetékání roztoku ven z jamek. Obsah jamek odsajte a destičku vyklepněte na přířez buničité vaty. d. Důkladně promíchejte lahvičku s konjugátem anti-IgG Px r.t.u. CONJ a napipetujte do jamek po 100 L konjugátu anti-IgG Px r.t.u. Inkubujte 60 minut (+/-5 min.) při laboratorní teplotě. e. Tekutinu z jamek odsajte a promyjte je 4x 250 L promývacího roztoku. Odsajte a vyklepněte. f. Napipetujte do jamek po 100 L chromogensubstrátového roztoku TMB. Inkubujte 10 minut (+/- 30 sec.) v temnu při laboratorní teplotě. Dobu inkubace začněte měřit po napipetování 1. stripu destičky. Dodržujte toto pravidlo, vyvarujete se tak nedodržení časového intervalu. Pipetujte rychle v pravidelném rytmu, případně použijte vhodný dispenzor. Překryjte stripy alobalem, neprůhledným víčkem, nebo je po dobu reakce uložte na temné místo. 2
g. Zastavte reakci přidáním 100 L stop roztoku STOP. Pipetujte ve stejném rytmu jako při rozplňování chromogensubstrátového roztoku TMB, aby enzymatická reakce probíhala ve všech jamkách po stejnou dobu. Zkontrolujte, zda nejsou v jamkách bubliny, pokud ano, jemným poklepem na rámeček destičky je odstraňte. h. Intenzitu barevné reakce změřte na spektrofotometru/kolorimetru při 450 nm nejpozději do 20 minut po zastavení reakce. Doporučujeme použít referenční filtr 620-690 nm. Tab 1.: Schéma aplikace vzorků: a b c d e f g h
1 DIL ST D/ST 1 ST D/ST 1 ST A/CTRL S1 S2 S3 S...
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
8. HODNOCENÍ TESTU: Nejdříve odečtěte absorbanci jamky se samotným ředicím roztokem (DIL = pozadí reakce) od hodno kontrolních a testovaných sér. 8.1. Kvalitativní orientační hodnocení 1. Spočítejte průměrnou hodnotu Standardu D ST D/ST 1 ze dvou jamek. 2. Stanovte cut-off hodnotu. Cut-off hodnotu stanovíte tak, že průměrnou hodnotu Standardu D vynásobíte korekčním faktorem. Hodnota korekčního faktoru Standardu D se určuje pro každou šarži soupravy a je uvedena v Certifikátu kontroly kvality dané šarže. 3. Séra s hodnotou OD < 100% cut-off jsou negativní a séra s hodnotou OD > 130% cut-off jsou považována za pozitivní. 8.2. Semikvantitativní hodnocení Stanovte hodnotu indexu pro jednotlivé vzorky sér: 1. Nejdříve stanovte cut-off hodnotu jako v předešlém způsobu hodnocení (čl. 8.1., bod 2). 2. Stanovte hodnotu indexu pro jednotlivé vzorky sér tak, že vydělíte OD testovaného séra cut-off hodnotou. 3. Odečtěte v tabulce (viz HODNOCENÍ VÝSLEDKŮ) odpovídající stupeň reaktivity séra. HODNOCENÍ VÝSLEDKŮ: Hodnota indexu Vyhodnocení < 1,00 Negativní 1,00 - 1,30 +/1,31 - 3,00 + 3,01 - 6,00 ++ > 6,00 +++
3
Příklad: Získaná OD Standardu D Průměrná hodnota OD Standardu D OD vzorku séra Korekční faktor Standardu D Cut-off hodnota Hodnota indexu
= 1,023; 1,101 = 1,062 = 0,800 = 0,18 = 1,062 x 0,18 = 0,191 = 0,800 / 0,191 = 4,19
Pozn.: Hodnocení +/- znamená, že sérum leží v rozmezí šedé zóny. V případě tohoto výsledku test opakujte. Leží-li sérum po opakovaném testování opět v rozmezí šedé zóny, opakujte testování alternativní metodou, nebo použijte sérum odebrané od téhož jedince o 1-2 týdny později. 9. INTERPRETACE VÝSLEDKŮ: VCA IgG + + + + + +
VCA IgM + + + -
+ +
+
VCA IgA + + + + + +
EA (D) IgG + + + +
EBNA-1 EBNA-1 Stadium EBV infekce IgG IgM EBV negativní + Primární EBV infekce + (časná fáze) +/+ Primární EBV infekce (transientní fáze) Primární EBV infekce + (fáze rekonvalescence) + Seropozitivní bez známek aktivní EBV infekce + Reaktivovaná EBV infekce + -
Anomální výsledek anti-EBNA-1 EBV IgG +, anti-EBNA-1 EBV IgM + může mimo jiné ukazovat na autoimunní chorobu. Pro vyšetření protilátek proti dalším antigenům EBV nabízí VIDIA tyto soupravy: ELISA-VIDITEST anti-EBNA-1 EBV IgM; ELISA VIDITEST anti- VCA EBV IgG, IgM a IgA; ELISA VIDITEST anti-EA (D) EBV IgG a IgM; Pro konfirmaci výsledků lze použít IF-VIDITEST anti-VCA EBV IgG a IgM; IF-VIDITEST antiEA EBV (D+R nebo D) IgG.
10. CHARAKTERISTIKY TESTU: 10.1. Platnost testu Hodnota absorbance samotného ředicího roztoku (DIL = pozadí reakce) by měla být < 0,100. Hodnoty OD standardů/ kontrolních sér by měly být v rozmezí uvedeném v Certifikátu kontroly kvality dané šarže. 10.2. Přesnost testu Pro stanovení variability mezi jednotlivými testy - reprodukovatelnosti (interassay) a během testu-opakovatelnosti (intraassay) bylo provedeno srovnání vzorků s různými hodnotami OD.
4
10.2.1. Opakovatelnost (intraassay) Variační koeficient opakovatelnosti je maximálně 5%. Je měřen pro každou šarži minimálně na 12 paralelních jamkách téže destičky. Příklad: (n = počet paralelních jamek na téže destičce) n A σ CV opak. 16 0,614 0,021 3,4 % 16 1,566 0,060 3,9 % 10.2.2. Reprodukovatelnost (interassay) Variační koeficient reprodukovatelnosti je maximálně 15%. Je měřen pro každou šarži porovnáním jamek téhož séra v několika po sobě jdoucích testech. Příklad: (n = počet testů) n A σ 16 0,618 0,059 17 1,071 0,072 16 2,454 0,096 16 1,404 0,062
min – max 0,513 – 0,744 0,965 – 1,214 2,306 – 2,630 1,303 – 1,501
CVrepro 9,5% 6,9% 3,9% 4,4%
10.3. Diagnostická citlivost a specifita testu Stanovení diagnostické citlivosti bylo provedeno testováním vzorků vybraných z populace, kde byl očekáván pozitivní výsledek na IgG proti EBNA-1 EBV (krevní dárci, pacienti po infekční mononukleose). Výsledek byl potvrzen nezávislými komerčními testy. Diagnostická citlivost je 94,7%. Specifita testu byla stanovena ze vzorků krevních dárců, kde byl očekáván EBNA-1 IgG negativní výsledek (krevní dárci, imunodeficientní pacienti, pacienti ve fázi primoinfekce inf. mononukleosy). Výsledná specifita testu z daných vzorků byla 95,6%. 10.4. Správnost testu 10.4.1. Test ředění Vzorky s vysokou, střední a nízkou koncentrací specifických protilátek byly po naředění na pracovní koncentraci dále ředěny 1,5krát, 2,25krát; 3,375krát; a 5,063krát ředicím roztokem a analyzovány. Naměřené hodnoty se odchylují od teoretické hodnoty maximálně o +/- 15%. 10.4.2. Recovery test Naměřené hodnoty recovery se pohybují pro každou šarži v rozmezí 80 až 120% očekávané hodnoty. 10.5. Interference Hemolytické a lipemické vzorky nevykazují žádný vliv na výsledek testu minimálně do 50 mg/mL pro hemoglobin, 5 mg/mL pro bilirubin a 50 mg/mL pro triglyceridy.
5
11. BEZPEČNOSTNÍ PŘEDPISY: Všechny složky soupravy jsou určeny pouze pro laboratorní účely. Lidská séra použitá v soupravě byla testována na nepřítomnost HBsAg, HCV a protilátek antiHIV-1,2. Přesto s nimi nakládejte jako s infekčním materiálem a předměty, které s nimi přišly do styku, autoklávujte 1 hodinu při 121°C, nebo dezinfikujte minimálně 30 minut 3% roztokem chloraminu. Tekuté odpady obsahující stop roztok (roztok kyseliny sírové) před likvidací neutralizujte 4% roztokem hydrogenuhličitanu sodného. Se stop roztokem pracujte opatrně, aby nedošlo k potřísnění kůže nebo sliznice. Stane-li se tak, omyjte postižené místo větším množstvím tekoucí vody. Odpad vzniklý při promývání stripů dezinfikujte v odpadní nádobě pomocí vhodného dezinfekčního roztoku (např. Incidur, Incidin, chloramin, ...) v koncentraci doporučené výrobcem. Při práci nejezte, nepijte a nekuřte. Nepipetujte ústy, ale vhodnými pipetovacími zařízeními. Používejte ochranné rukavice a po práci si důkladně umyjte ruce. Dbejte, aby nedošlo k rozlití vzorků a k tvorbě aerosolu. 12. UPOZORNĚNÍ: a. Promývací roztok, chromogensubstrátový roztok TMB r.t.u., stop roztok r.t.u. a ředicí roztok r.t.u. pro séra jsou vzájemně zaměnitelné mezi jednotlivými soupravami ELISA-VIDITEST, pokud není v návodu uvedeno jinak. b. Pracujte asepticky, aby nedošlo k mikrobiální kontaminaci sér a reagencií. c. Při odebírání, ředění a skladování reagencií postupujte tak, aby nedošlo k jejich vzájemné kontaminaci či kontaminaci látkami inhibujícími enzymatickou aktivitu. d. Kontrolní séra (standardy), ředicí roztok, chromogensubstrátový roztok TMB a konjugát antiIgG Px jsou konzervovány ProClinem 300. e. Chromogensubstrátový roztok TMB nesmí přijít do styku s oxidačními látkami a kovovými povrchy. f. Dodržujte přesně pokyny uvedené v návodu. Nereprodukovatelné výsledky mohou vzniknout zejména: * nedostatečným promícháním reagencií a vzorků před použitím * nepřesným pipetováním a nedodržováním času inkubací uvedených v bodě 7. * špatnou technikou promývání a potřísněním okrajů jamek vzorky nebo konjugátem * použitím stejné špičky při pipetování různých roztoků nebo záměnou uzávěrů * kontaminací pipety, používané pro aplikaci vzorků, kontrol nebo chromogensubstrátového roztoku TMB, Px konjugátem (doporučujeme pro aplikaci konjugátu používat pipetu, vyhrazenou pouze pro tyto účely).
6
13. SKLADOVÁNÍ A EXPIRACE: a. Soupravu a její složky skladujte v suchu a temnu při teplotě 2 až 10°C. Za těchto podmínek je expirační doba celé soupravy uvedena na centrálním štítku na obalu soupravy, expirace jednotlivých složek je uvedena na jejich obalu. b. Nespotřebované stripy vložte zpět do obalu a zatavte, nebo dobře uzavřete do sáčku se zipem společně s desikantem. c. Soupravy se přepravují chlazené v termotaškách, doba přepravy do 72 hodin nemá na exspiraci vliv. Jestliže po obdržení soupravy zjistíte vážné poškození obalu jakékoliv složky soupravy, ihned informujte výrobce. d. Nespotřebovaná testovaná séra uchovávejte v neředěném stavu rozplněná na alikvoty a zmrazená při teplotě -18 až -28°C. Časté zmrazování a rozmrazování se nedoporučuje. Pokud skladujete séra při teplotě 2 až 10°C, pak je spotřebujte do jednoho týdne. e. Roztoky testovaných sér v pracovní koncentraci nelze skladovat. Připravujte je vždy čerstvé.
7
14. TESTOVACÍ SCHÉMA: Krok 1.
Připravte reagencie a testovaná séra v pracovním ředění
Krok 2.
Aplikujte Standardy a testovaná séra (100 L / jamku) Inkubujte 30 minut při laboratorní teplotě 4x promyjte (250 L / jamku), vyklepněte
Krok 3.
Aplikujte konjugát anti-IgG Px r.t.u. (100 L / jamku) Inkubujte 60 minut při laboratorní teplotě 4x promyjte (250 L / jamku), vyklepněte
Krok 4.
Aplikujte chromogensubstrátový roztok TMB (100 L / jamku) Inkubujte 10 minut v temnu při laboratorní teplotě
Krok 5.
Aplikujte stop roztok (100 L / jamku)
Krok 6.
Změřte absorbanci při 450 / 620-690 nm do 20 minut
Doporučená literatura: Dillner J. et al.: Antibodies against a synthetic peptide identify the Epstein-Barr virus nuclear antigen, Proc. Natl. Acad..Sci.U.S.A. 81: 4652–4656, 1984. Geltosky J.E. et al.: Use of synthetic peptide-based ELISA for the diagnostic of infectious mononucleosis, J. Clin. Lab. Analysis 1: 153–162, 1986. Rumpold H. et al.: The glycine-alanine repeating region is the major epitope of the Epstein-Barr nuclear antigen-1, J. Immunol. 138: 593–599, 1987. Smith R.S. et al.: A synthetic peptide for detections antibodies to Epstein-Barr virus nuclear antigen in sera from patients with infectious mononucleosis, J. Infect. Dis. 154: 885–889, 1986. Roubalová K., Horáček J., Němeček V. et al: Doporučené metody ve virologické diagnostice; Acta Hygien Epidemiol. Microbiol 2000;1, 11-12 Sumaya CV: Serologic and virologic epidemiology of Epstein Barr virus: Relevance to chronic fatigue syndrom. Rev.Infect.Dis.1991;13 (Suppl): 19-25
Souprava byla vyvinuta za finanční podpory ze státních prostředků poskytnutých prostřednictvím Ministerstva průmyslu a obchodu. Datum poslední verze tohoto návodu: 02/2015 8
